一種標準化、高精度、通用的功能模塊構建方法
2023-10-27 05:16:32 1
一種標準化、高精度、通用的功能模塊構建方法
【專利摘要】本發明公開了一種標準化、高精度、通用的功能模塊構建方法，包括如下步驟：（1）將源基因添加標準化位點形成基因元件，將基因元件連入質粒pLD-Blunt中形成帶有基因元件的質粒，進行序列驗證；（2）從帶有基因元件的質粒中調取基因元件，連入模塊工具質粒中的如下缺口：終止子1-啟動子-AATG-缺口-TAAA-終止子2；構建出不同的功能模塊的質粒；（3）從不同的功能模塊的質粒中調取不同的功能模塊，與經過酶切的酵母質粒載體共轉化釀酒酵母，構建出標準化、高精度、通用的功能模塊，存放於質粒中；本發明具有通用性、標準化、高精度、自由選擇性。
【專利說明】一種標準化、高精度、通用的功能模塊構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及合成生物學領域，尤其涉及一種功能模塊構建方法。
【背景技術】
[0002] 功能模塊在合成生物學研究中有著至關重要的作用。人工優化重構內源代謝路 徑、改造底盤細胞基因組、快速拼裝多個外源基因元件、人工設計構建新生命功能，這些過 程均需依託於功能模塊。因此，設計一套標準化、高精度、通用的功能模塊構建及拼裝方法， 使得其能夠快速高效地獲取所需模塊，已經成為合成生物學迫切需要的瓶頸技術。
[0003] 合成生物學亟需的、比較理想的功能模塊構建方法，應該具備如下顯著特點：1)對 任意基因元件，無需位點預修飾。2)在構建過程中，始終維持DNA序列的保真性。3)能高 效快速將多個模塊組合拼裝在一起。4)能自由決定模塊起止、強度、組合順序。目前已有的 一些方法各有其顯著優點，同時也存在著明顯的不足。各個方法的簡介如下：
[0004] Biobrick方法是iGEM國際遺傳工程機器設計大賽所採用的模塊構建方法。其特 點為：預先對基因元件進行位點修飾，去除EcoRl，Xbal，Spel，Pstl這四個酶切位點。將帶 有EcoRl，Xbal與Spel，Pstl酶切位點的標準化序列添加到每個基因元件兩側形成標準化 位點。對基因元件均採用四種酶的合理搭配進行酶切連接，兩個相鄰的元件會以Xbal與 Spel切出的同尾粘口連接形成"鎖死位點"，不會再被切開，從而將兩個小元件連成一個新 的大元件，繼續連接形成功能模塊。
[0005] CPEC方法是利用PCR擴增為基因元件添加同源臂，同時以PCR擴增質粒載體，所 有的PCR產物混在一個體系中，高溫失活使得PCR產物充分裂解為單鏈DNA。在合適的溫 度下退火，單鏈DNA互搭，一定概率形成功能模塊的質粒的單鏈雛形，在Phusion等高保真 PCR酶擴增下，以互搭處的DNA序列為引物，擴增出雙鏈模塊質粒。
[0006] SLIC方法是利用3'核酸外切酶將多個元件或模塊的PCR片段從3'端消化出一段 單鏈DNA，PCR片段主體部分仍為雙鏈形式。這些相互同源互補的單鏈DNA臂在合適的溫度 下會退火互搭，在配套功能酶的作用下將多消化的單鏈部分補全，轉化形成完整的質粒。
[0007] Gibson方法與SLIC方法原理是完全一致的，只是Gibson方法採用的是5'核酸外 切酶消化各個高濃度PCR片段，在同源互補構成質粒後無需擴增直接轉化大腸桿菌，獲得 拼裝的完整質粒。
[0008] DNA Assembler方法主要用於拼裝單順反子形式的單個片段，即每個片段是一個 完整的"同源臂-啟動子-基因元件-終止子-同源臂" PCR產物形式，各個片段與線性化 的酵母質粒載體一步轉化釀酒酵母，獲得完整的多模塊質粒。
[0009] Golden Gate Assembly方法需要對每個待拼裝的PCR片段進行位點預修飾，去除 所使用的位點如Bsal、BsmBl等。在Golden Gate酶切作用下，各個片段露出4個鹼基的 一一互補粘性末端，所有片段以唯一的順序連入空質粒載體，形成多模塊質粒。
[0010] Standardized Assembly of Transcriptional Units 方法是米用 Golden Gate 酶 構建單個酵母表達盒的方法，目前尚不涉及多個模塊的拼裝。對單表達盒的構建，啟動子、 基因 ORF、終止子元件均來自庫存序列100%正確的質粒，經過一步酶切連接入工具質粒載 體，快速構建出任一啟動子與終止子搭配的單個基因模塊。
[0011] ΦΒΤ1整合酶拼裝方法是採用ΦΒΤ1、Φ031等噬菌體整合酶構建的一套模塊拼裝 方法。拼裝單元仍為PCR產物，通過在每個PCR片段兩段添加點突變的不同att片段，實現 不同片段以唯一順序特異性的拼裝，形成最終質粒。
[0012] 表1 :現有各個方法的優缺點對比如下：(優點用加粗加下劃線表示）
[0013]
【權利要求】
1. 一種標準化、高精度、通用的功能模塊構建方法，包括如下步驟： (1) 將源基因添加具有酶識別與切割功能的標準化位點形成基因元件，將基因元件連 入質粒pLD-Blunt中形成帶有基因元件的質粒，進行序列驗證； (2) 設計需要組合發揮功能的基因元件先後順序，按照設計的先後順序從帶有基因元 件的質粒中利用所述標準化位點調取基因元件，利用Bsal酶切割不同的模塊工具質粒，形 成如下缺口；終止子1-啟動子-AATG-缺口 -TAAA-終止子2 ;將調取的不同的基因元件連 入缺口，構建出不同的功能模塊的質粒；所述不同的模塊工具質粒是由不同的模塊工具序 列與空質粒PRS425K構成；所述模塊工具序列為終止子1-啟動子-AATGGGAGACC-紫色英光 蛋白基因amilCP的表達盒-GGTCTCCTAAA-終止子2 ; (3) 用下述兩種方式之一種進行： 方式一：從所述不同的功能模塊的質粒中利用酶切調取不同的功能模塊，與經過酶切 的酵母質粒載體共轉化釀酒酵母，使不同的功能模塊組合在一起，構建出標準化、高精度、 通用的功能模塊，存放於質粒中； 方式二：從所述不同的功能模塊的質粒中利用酶切調取不同的功能模塊，在第一個功 能模塊之前設置有左側同源臂，在倒數第一個功能模塊之後設置有右側同源臂，共轉化釀 酒酵母，使不同的功能模塊一同整合入酵母基因組，構建出標準化、高精度、通用的功能模 塊，其存放於基因組中。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵是所述源基因是從天然生物中克隆的基因或人 工合成的基因。
3. 根據權利要求2所述的方法，其特徵是所述從天然生物中克隆的基因為釀酒酵母基 因Xksl，畢赤酵母基因切11，畢赤酵母基因Xyl2。
4. 根據權利要求2所述的方法，其特徵是所述人工合成的基因為SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 所示。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特點是所述具有酶識別與切割功能的標準化位點 是；GGTCTCN+AATG......基因......TAAA+NGAGACC ;所述 GGTCTCN 與 NGAGACC 是 Bsal 酶的識別 位點。
6. 根據權利要求1所述的方法，其特點是所述不同的模塊工具序列中的終止子1，啟動 子和終止子2的分組選取如表2 : 表2 :
【文檔編號】C12N15/66GK104419716SQ201310377238
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月27日 優先權日:2013年8月27日
【發明者】元英進, 劉奪, 李炳志, 王霞, 申明華, 胡夢龍, 杜昊星, 蘇皖, 宋田青, 翟芳, 郭雪嬌, 郭睿 申請人:天津大學