鼠神經生長因子的製備方法和注射用鼠神經生長因子的製備方法

2023-10-12 00:22:49 3

專利名稱：：鼠神經生長因子的製備方法和注射用鼠神經生長因子的製備方法
技術領域：
：本發明涉及一種鼠神經生長因子的製備方法和注射用鼠神經生長因子的製備方法，尤其涉及一種使用新型的病毒滅活法製備鼠神經生長因子的方法。
背景技術：
：鼠神經生長因子(NGF)是從小鼠頜下腺中分離純化的神經生長因子的凍幹製品，其傳統製備工藝為將小鼠頜下腺組織勻漿，得勻漿上清液；然後將勻漿上清液離心、去沉澱後，上離子交換層析I，收集流穿液；流穿液進行酸化解離、離心，得酸解上清液；酸解上清液上離子交換層析，收集目標蛋白峰，即得神經生長因子原液；再加入賦形劑甘露醇和穩定劑人血白蛋白，經除菌過濾後，分裝，凍幹得製品。由於鼠神經生長因子來源於小鼠，因而該製品存在生物安全性問題，主要是鼠源性病毒對原材料頜下腺的汙染或潛在性汙染。為了保證該製品的安全性，在控制供體鼠飼養環境和原材料頜下腺質量的同時，研究生產過程中去除或滅活病毒工藝對製品的安全性起著十分重要的作用。對於血液製品來說，國內外較成熟的病毒滅活/去除工藝方法有巴氏消毒法、乾熱法、有機溶劑/去汙劑法、納米膜過濾法、光化學法等，但對於動物源性生化提取製品尤其是規模化生產量的鼠神經生長因子的病毒滅活工藝，國內外報導很少。有機溶劑/去汙劑法是利用有機溶劑和去汙劑的配伍，破壞病毒的脂質包膜，使其失去傳染性，從而達到滅活病毒的目的。但該方法對非脂包膜病毒沒有去除作用，並且人為引入了有機溶劑和去汙劑，而徹底清除有機溶劑和去汙劑有很大難度，因而加大了產品汙染的風險;納米膜過濾法主要利用病毒顆粒和蛋白分子的大小差異通過納米級的濾膜把病毒除去，適用於分子量較小(直徑較小)的蛋白，不適於較大直徑蛋白製品的病毒去除,且納米膜價格昂貴;光化學法是利用某些光敏劑對病毒表面及病毒核酸結構有強烈的親和性，在適當波長的光照下易激活，從而通過光化學作用破壞與其接觸的病毒結構，但是光化學法對神經生長因子蛋白的活性損傷較大；巴氏消毒法屬熱力處理滅活病毒方法，即通過熱量使病毒蛋白變性，破壞病毒結構進而滅活病毒，對脂質膜病毒及非脂質膜病毒均能有效去除，臨床記錄顯示巴氏消毒法是目前病毒滅活方法中最可靠的方法。但熱力也常使蛋白製品變性或生物學活性降低。如何能既保持神經生長因子活性，又能徹底地去除病3毒，這是目前尚待解決的問題。
發明內容本發明的目的是提供一種鼠神經生長因子的製備方法，以解決現有技術中的上述問題。本發明中的鼠神經生長因子的製備方法在傳統工藝中加入100KD和5KD超濾膜過濾和巴氏消毒工藝，可有效過濾大分子病毒，同時通過巴氏消毒法進一步滅活偽狂犬病毒(PRV)、Sindbis病毒、腦心肌炎(EMC)病毒等潛在病毒，既不引入任何外來有機溶劑和去汙劑等汙染物，又能保持鼠神經生長因子注射液的高純度、高比活及高安全性。本發明還有一個目的是提供一種注射用鼠神經生長因子的製備方法。本發明採用的技術方案如下一種鼠神經生長因子的製備方法，將小鼠頜下腺組織勻漿，反覆凍融破碎細胞，離心去沉澱，得勻漿上清液；勻漿上清液去除細胞碎片後上陽離子交換層析I,收集流穿液，流穿液進行酸化解離、離心，得酸解上清液；將酸解上清液上陽離子交換層析II,收集目標蛋白峰，得蛋白收集液，其特徵在於將蛋白收集液進行超濾結合巴氏消毒法去除病毒，再經超濾濃縮，除菌過濾後製得。前述鼠神經生長因子的製備方法中，將蛋白收集液進行100KD超濾膜過濾後，將100KD超濾膜濾下液用注射用水或注射用生理鹽水稀釋至140pg/ml，在5565'C水浴中恆溫1~12小時，然後經5KD超濾膜和除菌過濾製得神經生長因子原液。100KD超濾膜過濾可去除液體中的大分子病毒；在5565'C水浴中恆溫112小時，可有效滅活偽狂犬病毒(PRV)、Sindbis病毒、腦心肌炎(EMC)病毒等潛在病毒，並保持所製得的鼠神經生長因子的生物學活性；5KD超濾膜過濾可在濃縮樣品的同時轉換緩衝液。前述鼠神經生長因子的製備方法中，所述IOOKD超濾膜濾下液優選用注射用水或注射用生理鹽水稀釋至530叫/ml，特別優選用注射用生理鹽水稀釋至20pg/ml。前述鼠神經生長因子的製備方法中，所述2(Hig/ml100KD超濾膜濾下液優選在60'C土rc水浴中恆溫IO小時，從而可最大程度地保持鼠神經生長因子生物學活性。前述鼠神經生長因子的製備方法中，將陽離子交換層析II經Tris-HCl流洗後用Tris-HCl-NaCl溶液洗脫，收集目標蛋白峰，得蛋白收集液。前述鼠神經生長因子的製備方法中，陽離子交換層析I流穿液優選用pH4.0的醋酸緩衝液進行酸化解離io分鐘。前述鼠神經生長因子的製備方法中，陽離子交換層析柱I的介質為Qt"Cellulose52或CM-S印haroseFF，陽離子交換層析柱II的介質為CM~Cellulose52或CM-S印haroseFF。一種注射用鼠神經生長因子的製備方法,在注射用生理鹽水中加入前述方法中製得的神經生長因子原液中加入賦形劑和穩定劑，除菌過濾後分裝凍幹得製品。前述注射用鼠神經生長因子的製備方法中，賦形劑優選為甘露醇，穩定劑優選為人血白蛋白。本發明中的新型的鼠神經生長因子的製備方法在傳統工藝中加入100KD、5KD超濾膜過濾和巴氏消毒工藝，可有效過濾大分子病毒，同時通過巴氏消毒法進一步滅活偽狂犬病毒(PRV)、Sindbis病毒、腦心肌炎(EMC)病毒等潛在病毒，從而在不引入任何外來有機溶劑和去汙劑等汙染物的基礎上，保持鼠神經生長因子的生物學活性，得到高純度、高比活及高安全性的鼠神經生長因子產品。具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步的描述，但不構成對本發明的任何限制。實施例l將小鼠頜下腺組織勻漿，反覆凍融破碎細胞，離心去沉澱，得勻漿上清液；勻漿上清液去除細胞碎片後上CM"Cellulose52柱，收集流穿液，流穿液進行透析、用pH4.0的醋酸緩衝液進行酸化解離IO分鐘、離心，得酸解上清液；將酸解上清液上CM"Cellulose52柱，經Tris-HCl流洗後用Tris-HC1-NaCl溶液洗脫收集目標蛋白峰，得蛋白收集液。用IOOKD超濾膜對蛋白收集液進行超濾，以去除大分子病毒；100KD超濾膜濾下液用注射用水稀釋至5ng/ml，在6CTC水浴中恆溫10小時，然後經5KD超濾膜超濾及過濾除菌，即得鼠神經生長因子原液；鼠神經生長因子的檢測數據如表1所示。實施例2與實施例1的不同之處在於將100KD超濾膜濾下液用注射用水稀釋至lOpg/ml,在55'C水浴中恆溫12小時，然後經5KD超濾膜超濾及過濾除菌，即得鼠神經生長因子原液。鼠神經生長因子的檢測數據如表1所示。實施例3與實施例1的不同之處在於將100KD超濾膜濾下液用注射用生理鹽水稀釋至20ng/ml，在60'C水浴中恆溫10小時，然後經5KD超濾膜超濾及過濾除菌，即得鼠神經生長因子原液。鼠神經生長因子的檢測數據如表1所示。實施例4與實施例1的不同之處在於將100KD超濾膜濾下液用注射用生理鹽水稀釋至30嗎/ml，在65'C水浴中恆溫1小時，然後經5KD超濾膜超濾及除菌過濾，即得鼠神經生長因子原液。鼠神經生長因子的檢測數據如表1所示。實施例5用注射用水配製生理鹽水，加入鼠神經生長因子原液至終濃度為18lig/ml或30ug/ml，並加入檢定合格的人血白蛋白使其終含量為1%，甘露醇終濃度為5%，經混勻、除菌過濾後，分裝、凍幹，得注射用鼠神經生長因子凍幹製品。本申請人對實施例14中製得的鼠神經生長因子(中間品)巴氏消毒法滅活病毒前後的質量指標進行測定對比，結果表明在5~30pg/ml濃度下，鼠神經生長因子經55'C65'C處理112小時後，其pH值、蛋白含量、比活性和紫外掃描光譜均維持穩定。而當濃度大於40叫/ml的鼠神經生長因子經過55'C65'C處理10小時後，其蛋白含量、比活性、紫外掃描光譜均發生較大變化或偏離。表l鼠神經生長因子(中間品)巴氏消毒法滅活病毒後主要參數測定結果檢定項目檢定結果原數值實施例l實施例2實施例3實施例4pH值7.17,07.07.07.0±0.2蛋白含量(mg/ral)0.0050.0100.0200,030/比活性(AU/mg)1.0*1061.0*1061.0*1061.0*1061.0*106紫外掃描光譜(nm)280279280280280±3中國藥品生物製品檢定所在實施例3巴氏消毒法滅活病毒前加入指示病毒偽狂犬病毒(PRV)，對病毒滅活效果做了驗證，病毒滴定方法採用96孔細胞病變法，計算按Karber法，驗證結果如表2所示表2巴氏法滅活鼠神經生長因子中PRV指示病毒的效果處理時間殘餘偽狂犬病毒PRV滴度(LgTCIDM/0.lml)(小時)S20040201S20040202S2004020306.506.626.880.25《-O.50《-O.50《-0.500.5《-0.50《-0.50《-0.501《-O.50《-0.50《-0.502《-0.50《-0.50《-0.506tableseeoriginaldocumentpage7注本試驗樣本中病毒最低檢測限為-0.50LgTCIDso/O.lml。驗證結果三批鼠神經生長因子採用實施例3中的生產工藝，在5961'C進行10小時加熱處理後，可滅活所加入指示病毒PRV分別為S20040201批》6.50LgTCID5。/0.lml,S20040202批>6.62LgTCIDw/0.lml，S20040203批>6.88LgTCID5。/0.lml。中國藥品生物製品檢定所在實施例3巴氏消毒法滅活病毒前加入指示病毒Sindbis病毒，對病毒滅活效果做了驗證，病毒滴定用BHK-21細胞，方法採用6孔盤蝕斑法。驗證結果如表3所示表3巴氏法滅活鼠神經生長因子中Sindbis指示病毒的效果處理時間殘餘Sindbis病毒滴度(LgTCID5。/0.lml)(小時)S20040201S20040202S20040203tableseeoriginaldocumentpage7驗證結果三批鼠神經生長因子採用實施例3中的生產工藝，在5961'C進行10小時加熱處理後，可滅活所加入指示病毒Sindbis分別為S20040201批>6.49LgPFU/ml，S20040202批》6.45LgPFU/ml,S20040203批》6.60LgPFU/ml。中國藥品生物製品檢定所在實施例3巴氏消毒法滅活病毒前加入指示病毒腦心肌炎(EMC)病毒，對病毒滅活效果做了驗證，病毒滴定用VERO細胞，96孔微量病變法。驗證結果如表4所示表4巴氏法滅活鼠神經生長因子中EMC指示病毒的效果處理時間殘餘腦心肌炎(EMC)病毒滴度(LgTCIDs。/0.lml)(小時)S20040201S20040202S2004020304.755.505.600.5《0.50《0.50《0.50tableseeoriginaldocumentpage8驗證結果三批鼠神經生長因子採用實施例3中的生產工藝，在596rC進行10小時加熱處理後，可滅活所加入指示病毒EMC分別為S20040201批>4.25LgTCID5。/0.lml，S20040202批>5.00LgTCID5。/0.lml,S20040203批》5.13LgTCID5。/0.lral。病毒滅活驗證結論根據中國藥品生物製品檢定所檢定的結果，可以認為本方法是有效的鼠源病毒去除方法。為有效保證注射用鼠神經生長因子的質量及其安全性，按本發明實施例3工藝連續生產的三批鼠神經生長因子原液，S04、S05、S06，檢測結果見表5;按本發明實施例5工藝連續生產三批註射用鼠神經生長因子產品，批號20040504、20040505、20040506,委託中國藥品生物製品檢定所進行檢測，檢測結果見表6:表5三批鼠神經生長因子原液檢測結果匯總表tableseeoriginaldocumentpage8表6三批註射用鼠神經生長因子成品檢測結果匯總表檢測項目標準批次200405042004050520040506外觀白色疏鬆體，加水溶解，無異物符合規定符合規定符合規定PH值6.5—7.56.76.86.8水份《3.0%0.78%0.83%0.81%生物活性CAU/支)》9000180001800018000蛋白含量《18ug±20%-7.06%-2.67%-10.5%無菌試驗無菌生長符合規定符合規定符合規定熱原試驗符合藥典規定符合規定符合規定符合規定異常毒性符合藥典規定符合規定符合規定符合規定注射劑檢査可見異物符合藥典規定符合規定符合規定符合規定裝量差異符合藥典規定符合規定符合規定符合規定結果表明鼠神經生長因子原液和鼠神經生長因子凍幹製品全部質量指標均符合標準規定。上述三批註射用鼠神經生長因子成品經穩定性考察,結果顯示用本方法製備的注射用鼠神經生長因子在28'C條件下保存42個月質量穩定。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化,均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。權利要求1、一種鼠神經生長因子的製備方法，將小鼠頜下腺組織勻漿，反覆凍融破碎細胞，離心去沉澱，得勻漿上清液；勻漿上清液去除細胞碎片後上陽離子交換層析I，收集流穿液，流穿液進行酸化解離、離心，得酸解上清液；將酸解上清液上陽離子交換層析II，收集目標蛋白峰，得蛋白收集液，其特徵在於將蛋白收集液進行超濾結合巴氏消毒法去除病毒，再經超濾濃縮，除菌過濾後製得。2、根據權利要求l中所述的鼠神經生長因子的製備方法，其特徵在於將蛋白收集液進行100KD超濾膜過濾後，將100KD超濾膜濾下液用注射用水或注射用生理鹽水稀釋至l~40ng/ml,在5565'C水浴中恆溫112小時，然後經5KD超濾膜和除菌過濾製得神經生長因子原液。3、根據權利要求2中所述的鼠神經生長因子的製備方法，其特徵在於100KD超濾膜濾下液用注射用水或注射用生理鹽水稀釋至530pg/ml。4、根據權利要求2中所述的鼠神經生長因子的製備方法，其特徵在於IOOKD超濾膜濾下液優選用注射用生理鹽水稀釋至20ng/ml。5、根據權利要求4中所述的鼠神經生長因子的製備方法，其特徵在於所述20pg/raliookd超濾膜濾下液優選在60'c±ix:水浴中恆溫10小時。6、根據權利要求3中所述的鼠神經生長因子的製備方法，其特徵在於將陽離子交換層析II經Tris-HCl流洗後用Tris-HCl-NaCl溶液洗脫，收集目標蛋白峰，得蛋白收集液。7、根據權利要求3中所述的鼠神經生長因子的製備方法，其特徵在於陽離子交換層析I流穿液優選用PH4.0的醋酸緩衝液進行酸化解離10分鐘。8、根據權利要求3中所述的鼠神經生長因子的製備方法，其特徵在於陽離子交換層析柱I的介質為CM-Cellulose52或CM-S印haroseFF，陽離子交換層析柱II的介質為CM-Cellulose52或CM-S印haroseFF。9、一種注射用鼠神經生長因子的製備方法，在注射用生理鹽水中加入權利要求1~8中任一項製得的鼠神經生長因子原液中加入賦形劑和穩定劑，除菌過濾後分裝、凍幹得製品。10、根據權利要求9中所述的注射用鼠神經生長因子的製備方法，其特徵在於賦形劑優選為甘露醇，穩定劑優選為人血白蛋白。全文摘要本發明公開了一種鼠神經生長因子(NGF)的製備方法和注射用鼠神經生長因子的製備方法。本發明中的鼠神經生長因子的製備方法在傳統工藝中加入100KD和5KD超濾膜過濾和巴氏消毒工藝，可有效過濾大分子病毒，同時通過巴氏消毒法進一步滅活偽狂犬病毒(PRV)、Sindbis病毒、腦心肌炎(EMC)病毒等潛在病毒，既不引入任何外來有機溶劑和去汙劑等汙染物，又能保持鼠神經生長因子的高純度、高比活及高安全性。文檔編號C07K1/34GK101613394SQ20081007131公開日2009年12月30日申請日期2008年6月27日優先權日2008年6月27日發明者任宏偉,朗孫,楊佑瑤,熊玲媛,陳遠志,馬凌燕申請人:熊玲媛;任宏偉;廈門北大之路生物工程有限公司