延時作用的醯化胰島素化合物的製作方法

2024-04-14 21:22:05 1

延時作用的醯化胰島素化合物
1.本發明屬於治療糖尿病和/或高血糖症的領域。具體而言，本發明涉及降低血糖的化合物、含有這樣的化合物的藥物組合物以及這樣的化合物的治療用途。
2.用於糖尿病患者的胰島素替代療法在理想情況下應儘可能接近地與健康個體中的內源性胰島素分泌模式相似。對胰島素的生理需求可以分為兩個階段：(a)營養吸收階段，其需要胰島素脈衝來處理膳食相關的血糖激增，也被稱作「膳食」胰島素，和(b)吸收後階段，其需要持續遞送胰島素以調節肝葡萄糖輸出以維持最佳空腹血糖，也被稱作「基礎」胰島素。
3.用於患有糖尿病的人的有效胰島素療法通常可能涉及兩種類型的外源性胰島素製劑的聯合使用：快速起效的進餐時膳食胰島素，以及每天施用一次或兩次以控制各餐之間的血糖水平的長效基礎胰島素。可能需要效仿的內源性胰島素的一個或多個特徵包括對人胰島素受體的結合親和力、相對於人igf-1受體而言對人胰島素受體的優先結合、人胰島素受體的磷酸化和血液中的葡萄糖降低。
4.合乎需要的外源性基礎胰島素還應該提供延時作用—也就是說，它將控制血糖水平優選24小時或更久，且最優選168小時或更久，而沒有顯著的低血糖風險。一些基礎胰島素具有24小時或更久的作用持續時間。具有延時作用特徵(在此期間有效性沒有顯著變化)的化合物可能降低夜間低血糖的風險，並允許在不增加患者的低血糖風險的情況下實現每日給藥次數的更大可變性。因此，每周施用是非常合乎需要的。可能需要的外源性基礎胰島素的特徵包括減弱的受體結合，這可以導致降低的從血流中的清除率，和/或在多個濃度下的化學穩定性，這將促進延長的儲存期穩定性和/或在濃縮製劑中的穩定性，這將允許在多劑量裝置中使用。
5.存在對患者中的糖尿病和/或高血糖症的替代治療的需要。一些醯化胰島素化合物是已知的，參見，例如，美國專利號7,615,532、美國專利號10,400,021、u.s.9,045,560、u.s.9,018,161，但仍然需要另外的替代治療。
6.本發明提供了可用於在有此需要的患者中治療糖尿病、降低血紅蛋白a1c和/或降低血糖水平的延時作用的醯化胰島素化合物。本發明的化合物具有以下期望特徵中的任一種：比已知的醯化胰島素(例如德谷胰島素(insulin degludec))更慢的清除率、增強的生物利用度、隨著時間推移在人中更穩定的藥代動力學特徵和/或化合物在體內的增加的作用持續時間。此外，本發明的化合物表現出低化學降解速率，這表明它們具有增加的化學穩定性和/或可以實現比已知的醯化胰島素更長的儲存期。
7.本發明提供了式i的化合物或其藥學上可接受的鹽：
其中x選自下組：-lys-gly-、-lys-(2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸)-和-εlys-gly-。
[0008]
因此，式i的化合物是經修飾的人胰島素或其藥學上可接受的鹽，其由以下組成：seq id no:1的a鏈，其中在位置a14的天然酪氨酸胺基酸殘基突變為穀氨酸胺基酸殘基；和seq id no:2的b鏈序列，其中在位置b16的天然酪氨酸胺基酸殘基突變為組氨酸胺基酸殘基，在位置b25的天然苯丙氨酸胺基酸殘基突變為組氨酸胺基酸殘基，和在位置b30的天然蘇氨酸胺基酸殘基被刪除；其中：一個二硫鍵存在於在seq id no:1的位置6的半胱氨酸和在seq id no:1的位置11的半胱氨酸之間，一個二硫鍵存在於在seq id no:1的位置7的半胱氨酸和在seq id no:2的位置7的半胱氨酸之間，且一個二硫鍵存在於在seq id no:1的位置20的半胱氨酸和在seq id no:2的位置19的半胱氨酸之間；且其中在位置b29的賴氨酸胺基酸殘基通過賴氨酸側鏈的ε-氨基基團與ho2c-(ch2)
18-co-γglu-γglu-γglu-lys-gly-、ho2c-(ch2)
18-co-γglu-γglu-γglu-lys-(2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸)-或ho2c-(ch2)
18-co-γglu-γglu-γglu-εlys-gly-的綴合而被化學修飾。
[0009]
根據本發明的一個優選實施方案，x是-lys-gly-；或其藥學上可接受的鹽。
[0010]
根據本發明的另一個優選的實施方案，x是-lys-(2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸)-；或其藥學上可接受的鹽。
[0011]
根據本發明的一個進一步優選的實施方案，x是-εlys-gly-；或其藥學上可接受的鹽。
[0012]
本發明的一個更優選的實施方案，x是-lys-gly-；或其藥學上可接受的鹽。
[0013]
本發明的一個優選實施方案提供了如下化合物：其為由seq id no:1的a鏈、seq id no:3的b鏈組成的式i的化合物或其藥學上可
接受的鹽，其中在b鏈的位置29的賴氨酸側鏈的ε-氨基基團通過與ho2c-(ch2)
18-co-γglu-γglu-γglu-lys-gly-綴合而被化學修飾。
[0014]
優選地，本發明提供了如下化合物：其為由seq id no:1的a鏈、seq id no:4的b鏈組成的式i的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中在b鏈的位置29的賴氨酸側鏈的ε-氨基基團通過與ho2c-(ch2)
18-co-γglu-γglu-γglu-lys-(2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸)-綴合而被化學修飾。
[0015]
優選地，本發明包括如下化合物：其為由seq id no:1的a鏈、seq id no:5的b鏈組成的式i的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中在b鏈的位置29的賴氨酸側鏈的ε-氨基基團通過與ho2c-(ch2)
18-co-γglu-γglu-γglu-εlys-gly-綴合而被化學修飾。
[0016]
根據本技術的另一個方面，提供了一種藥物組合物，其包含式i的化合物或其藥學上可接受的鹽和一種或多種藥學上可接受的賦形劑。
[0017]
本技術的另一個方面提供了一種治療患者中的i型和/或ii型糖尿病的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用有效量的根據本發明的式i的化合物或其藥學上可接受的鹽或包含式i的化合物的藥物組合物。
[0018]
本技術的另一個方面提供了一種治療患者中的高血糖症的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用有效量的根據本發明的式i的化合物或其藥學上可接受的鹽或包含式i的化合物的藥物組合物。
[0019]
本技術的另一個方面也提供了用於療法中的式i的化合物或其藥學上可接受的鹽。
[0020]
本技術進一步提供了用於治療糖尿病和/或治療高血糖症的式i的化合物或其藥學上可接受的鹽。
[0021]
使用下文所述的新穎的中間體化合物製備本發明的化合物。
[0022]
根據本技術的另一個方面，提供了具有下式的化合物a：本技術也提供了具有下式的化合物b：本技術也提供了具有下式的化合物c：本發明的另一個方面提供了使用選自化合物a、b和c中的任一種的化合物製備式i的化合物的方法。
[0023]
本技術的另一個方面提供了式i的化合物或其藥學上可接受的鹽中的任一種在製備藥物中的用途，所述藥物用於治療i型和/或ii型糖尿病和/或高血糖症。
[0024]
本技術進一步提供了化合物a、b或c中的任一種在製備或製造式i的化合物或其藥學上可接受的鹽中的用途。
[0025]
本文中使用的術語「治療」是指對患有糖尿病或高血糖症或被建議為其施用胰島素的其它病症的患者的管理和護理，其目的是對抗或減輕那些病症的症狀和併發症。要治療的患者是動物，並且優選地是人類。
[0026]
本文中使用的術語「有效量」是指這樣的本發明的化合物或含有本發明的化合物的藥物組合物的量或劑量：其在向患者或對象施用單次或多次劑量後，將引起研究人員、獸醫、醫生或其它臨床醫師正在尋求的組織、系統、動物、哺乳動物或人的生物學或醫學響應或對組織、系統、動物、哺乳動物或人的期望的治療效果。劑量可以包括較高的初始負荷劑量，然後是較低的劑量。
[0027]
術語「患者」、「對象」和「個體」在本文中可互換地使用並是指動物。優選地，所述術語是指人。在某些實施方案中，所述患者、優選人進一步特徵在於具有將受益於降低血液中
的葡萄糖水平的疾病或障礙或病症。
[0028]
可以將包含本發明的化合物的藥物組合物胃腸外地施用給需要這樣的治療的患者。可以藉助於注射器、任選筆狀注射器或機械驅動的注射器通過皮下、肌肉內或靜脈內注射進行胃腸外施用。可替換地，可以藉助於輸液泵進行胃腸外施用。
[0029]
本發明的實施方案提供了適用於向患者施用、優選每周施用的藥物組合物，包括向有此需要的患者施用治療有效量的本發明的化合物和一種或多種藥學上可接受的賦形劑。使用本領域眾所周知的用於藥物產品的常規賦形劑，通過多種技術中的任一種可以製備這樣的藥物組合物(remington’s pharmaceutical sciences，第21版,university of the sciences in philadelphia,philadelphia,pa,usa(2006))。
[0030]
要求保護的化合物可以與一種或多種可用於治療糖尿病和/或與糖尿病相關的病症的另外的治療劑同時、分別或相繼組合使用。可以與要求保護的化合物組合的另外的治療劑的非限制性例子包括：胰島素或胰島素類似物；雙胍類；磺醯脲類；噻唑烷二酮類；二肽基肽酶-4(「dpp-4」)抑制劑；鈉依賴性的葡萄糖轉運蛋白(sglt2)抑制劑；腸促胰島素化合物諸如胰高血糖素-樣-肽-1(glp-1)或glp-1類似物、胃抑制性多肽(gip)或gip類似物、胃泌酸調節素或胃泌酸調節素類似物；或任何前述藥劑的組合。要求保護的化合物和另外的一種或多種治療劑可以通過相同遞送途徑和裝置諸如單個藥丸、膠囊劑、片劑或可注射製劑一起施用；或在分開的遞送裝置或途徑中同時分別施用；或依次施用。
[0031]
本文中使用的「bhi」意指生物合成的人胰島素，「tfa」意指三氟乙酸，「boc」意指叔丁基氧基羰基，「tbu」意指叔丁基，「pybop」意指苯並三唑-1-基-氧基三吡咯烷子基鏻六氟磷酸鹽，「dmf」意指二甲基甲醯胺，「diea」意指二異丙基乙胺，「dcm」意指二氯甲烷，「hfip」意指六氟異丙醇，「acn」意指乙腈，「fmoc」意指芴基甲氧羰基，「dmso」意指二甲亞碸，「tci」意指雙鏈胰島素，「sci」意指單鏈胰島素，「tis」意指三異丙基矽烷，「tstu」意指(o-(n-琥珀醯亞胺基)-n,n,n
′
,n
′‑
四甲基脲鎓四氟硼酸鹽，「su」意指琥珀醯亞胺基，「cpb」意指羧肽酶-b，「rp-hplc」意指反相hplc，「hr」意指小時，「min」意指分鐘，「edta」意指乙二胺四乙酸，「bsa」意指牛血清白蛋白，「hsa」意指人血清白蛋白，「c20-oh」意指二十烷二酸，「γglu」意指通過其側鏈γ羧基基團連接的l-穀氨酸，「lys」意指l-賴氨酸，「εlys」意指通過其側鏈ε-氨基基團連接的l-賴氨酸，且gly意指甘氨酸。
[0032]
式i含有胰島素a鏈和b鏈的胺基酸殘基的標準單字母胺基酸代碼，但b鏈的殘基29除外，其為賴氨酸，其中該胺基酸殘基的結構已被擴展。c20-otbu是co-(ch2)
18-co
2-叔丁基或也被稱作20-叔丁氧基-20-氧代-二十烷酸，γglu(otbu)是l-穀氨酸α-叔丁基酯，lys(boc)是l-賴氨酸ε-氨基叔丁氧基羰基。a14e,b16h,b25h,desb30-人雙鏈胰島素(tci；a14e,b16h,b25h,desb30-bhi)是指經修飾的人胰島素，其中在a鏈的位置14的酪氨酸胺基酸殘基突變為穀氨酸胺基酸殘基，在b鏈的位置16的天然酪氨酸胺基酸殘基突變為組氨酸胺基酸殘基，在b鏈的位置25的天然苯丙氨酸胺基酸殘基突變為組氨酸胺基酸殘基，且在位置b30的天然蘇氨酸胺基酸殘基被刪除。
[0033]
2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸、γglu和εlys的結構。
[0034]
實施例1是式i的化合物，其可以通過用接頭-脂肪酸中間體對在b鏈的位置29的賴氨酸的ε-氨基基團的選擇性醯化而產生，所述接頭-脂肪酸中間體是：c20-otbu-γglu(otbu)-γglu(otbu)-γglu(otbu)-lys(boc)-gly-oh，其中c20-otbu是20-叔丁氧基-20-氧代-二十烷酸，γglu(otbu)是通過其側鏈γ羧基基團連接的l-穀氨酸α-叔丁基酯，lys(boc)是l-賴氨酸ε-氨基叔丁氧基羰基，且gly是甘氨酸。
[0035]
實施例2是式i的化合物，其可以通過用接頭-脂肪酸中間體對在b鏈的位置29的賴氨酸的ε-氨基基團的選擇性醯化而產生，所述接頭-脂肪酸中間體是：c20-otbu-γglu(otbu)-γglu(otbu)-γglu(otbu)-lys(boc)-(2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸)-oh，其中c20-otbu是20-叔丁氧基-20-氧代-二十烷酸，γglu(otbu)是通過其側鏈γ羧基基團連接的l-穀氨酸α-叔丁基酯，lys(boc)是l-賴氨酸ε-氨基叔丁氧基羰基。
[0036]
實施例3是式i的化合物，其可以通過用接頭-脂肪酸中間體對在b鏈的位置29的賴氨酸的ε-氨基基團的選擇性醯化而產生，所述接頭-脂肪酸中間體是：c20-otbu-γglu(otbu)-γglu(otbu)-γglu(otbu)-εlys(boc)-gly-oh，其中c20-otbu是20-叔丁氧基-20-氧代-二十烷酸，γglu(otbu)是通過其側鏈γ羧基基團連接的l-穀氨酸α-叔丁基酯，εlys(boc)是通過其側鏈ε-氨基基團連接的l-賴氨酸α氨基叔丁氧基羰基，且gly是甘氨酸，隨後除去酸不穩定的boc和tbu保護基團。
[0037]
式i的化合物的產生可以在三個主要階段期間發生：1)a14e、b16h、b25h、desb30-bhi的產生，2)接頭-脂肪酸中間體的合成，和3)醯化、去保護、純化和鹽交換以分離式i的化合物。
[0038]
通過本領域技術人員已知的多種技術，諸如通過使用重組dna技術產生前體蛋白分子，可以製備本發明的化合物的胰島素部分。所述dna(包括cdna和合成的dna)可以是雙鏈的或單鏈的。編碼如本文描述的前體蛋白分子的編碼序列可能因為遺傳密碼的冗餘或簡併性而變化。為了產生本發明的前體蛋白，可以將所述dna引入宿主細胞中。用用於產生前體蛋白的表達系統瞬時地或穩定地轉染或轉化適當的宿主細胞。所述宿主細胞可以是細菌細胞諸如大腸桿菌的k12或b菌株、真菌細胞諸如酵母細胞或哺乳動物細胞諸如中國倉鼠卵巢(「cho」)細胞。
[0039]
表達載體作為附加體或作為宿主染色體dna的組成部分在宿主生物體中通常是可以複製的。通常，表達載體將含有選擇標誌物，例如，四環素、新黴素和二氫葉酸還原酶，以允許選擇被期望的dna序列轉化的那些細胞。
[0040]
通過本領域已知的多種程序以及下文描述的那些方法，可以製備本發明的化合物。所描述的每種途徑的具體合成步驟可以以不同的方式組合，以製備本文描述的化合物。以與實施例1類似的方式製備實施例2和3。
[0041]
式i的醯化胰島素的製備實施例1
實施例1是式i的化合物，其由seq id no:1的a鏈、seq id no:3的b鏈組成，其中在b鏈的位置29的lys通過與ho2c-(ch2)
18-co-γglu-γglu-γglu-lys-gly-綴合而被化學修飾。
[0042]
實施例1的合成的概述：通過對成熟的生物合成的a14e,b16h,b25h,desb30-人雙鏈胰島素(tci；a14e,b16h,b25h,desb30-bhi)在b鏈的位置29的賴氨酸的ε-氨基基團的選擇性醯化，或通過用指定為化合物a(c20-otbu-γglu(otbu)-γglu-(otbu)-γglu(otbu)-lys(boc)-gly-oh)的接頭-脂肪酸中間體對單鏈胰島素(sci；前胰島素原a14e,b16h,b25h,desb30-bhi)構建體的b鏈的位置29處的賴氨酸的類似ε-氨基基團的直接醯化，產生實施例1。優選的方法是前胰島素原sci構建體的醯化。由於胰島素分子的a1和b1氨基端分別被c-肽和前導序列封閉，該方法提供在b鏈的位置29的賴氨酸的ε-氨基基團的更高醯化效率。通過用cpb和胰蛋白酶進行酶消化，隨後進行醯化和tfa去保護步驟，得到實施例1的完全成熟的雙鏈產物。儘管sci構建體的n端的醯化確實發生，導致雙醯化副產物，但是前導序列的酶促除去也將該物質轉化為期望的產物。
[0043]
分子的產生發生在三個主要階段期間：1)單鏈前胰島素原構建體(sci)的大腸桿菌表達和純化：這可以用於優選的醯化方法，或者可以將它酶促加工成成熟的雙鏈胰島素類似物(tci,a14e,b16h,b25h,desb30-bhi)；2)接頭脂肪酸中間體(化合物a)的合成；和3a)tci的醯化、去保護，或3b)sci的醯化、去保護和酶消化，隨後純化和鹽交換以產生實施例1。
[0044]
開發了一種新的表達載體並將其用於大腸桿菌發酵中以產生sci胰島素構建體；它由以下序列(seq id no:7)構成：
[0045]
其中，殘基1-34構成前導肽，殘基35-63構成b-鏈(desb30t)，殘基64-97構成經修飾的c-肽(使用天然胰島素原編號慣例的des64k)，且殘基98-118構成a-鏈。二硫鍵對應於天然胰島素二硫鍵連接。二硫鍵是在c41和c104之間；c53和c117之間；以及c103和c108之間。用cpb和胰蛋白酶進行酶消化後，產生完全成熟的tci類似物：
[0046]
二硫鍵是在c7(seq id no:1)和c7(seq id no:8)之間；c20(seq id no:1)和c19(seq id no:8)之間；以及c6(seq id no:1)和c11(seq id no:1)之間。應當指出，sci和tci構建體都通過標準rp-hplc柱進行純化，並在醯化反應前凍幹為固體tfa鹽。使用固相合成產生接頭脂肪酸分子。該分子可以僅使用溶液相方法產生，或與固相方法結合產生。
[0047]
由於基於boc/tbu保護的胺基酸的接頭脂肪酸的溶解度，在乾燥的有機溶劑(dmso)中進行接頭脂肪酸與tci或sci a14e,b16h,b25h,desb30-bhi的綴合。但是，可以設計替代性的保護/去保護方案以使接頭脂肪酸可溶於水溶液中以最小化有機溶劑的使用。同樣，使用三氟乙酸(tfa)除去boc/tbu保護基團的酸性化學轉化可以通過替代方式實現。
[0048]
使用固相合成產生接頭脂肪酸分子化合物a通過固相肽合成產生化合物a(c20-otbu)-γglu(otbu)-γglu(otbu)-γglu(otbu)-lys(boc)-gly-oh。在10ml dmf中將fmoc-lys(boc)-oh(769mg,1.6mmol，相對於樹脂為1.5當量)與pybop(849mg,1.6mmol,相對於樹脂為1.49當量)和diea(1520ul,8.7mmol,8當量)混合2分鐘，然後轉移至含有h-gly-2-氯三苯甲基氯樹脂(1.1g,0.99mmol/g,1.1mmol；peptides international rhg-1160-pi)的反應容器，所述樹脂在dcm中預膨脹並用dmf預洗滌。將所述漿混合1.5h，過濾，然後將樹脂用dmf充分洗滌(kaiser試驗為陰性)。通過用20％哌啶/dmf(10ml,30min)處理樹脂，除去fmoc保護基團。在用dmf(40ml)洗滌樹脂以後，kaiser試驗為陽性，終產物為h-lys(boc)-gly-2-氯三苯甲基氯樹脂(理論值1.1mmol)。
[0049]
在10ml dmf中使用diea作為鹼(1520μl,8.7mmol,8.0當量)將fmoc-glu-otbu(701mg,1.6mmol,1.5當量)用pybop(845mg,1.6mmol,1.49當量)預活化(2min)，並轉移至樹脂。將所述漿混合3小時，過濾，並將樹脂用dmf充分洗滌(kaiser試驗為陰性)。通過用20％哌啶/dmf(10ml,30min)處理樹脂，隨後用dmf洗滌樹脂(40ml,kaiser試驗為陽性)，除去fmoc保護基團。通過使用1.5小時偶聯時間重複上述條件，將第二個和第三個fmoc-glu-otbu殘基偶聯至樹脂。
[0050]
除去最後的fmoc保護基團以後，在10ml dmf中使用diea作為鹼(1520μl,8.7mmol,8.0當量)用pybop(845mg,1.6mmol,1.49當量)預活化(2min)20-叔丁氧基-20-氧代-二十烷酸(660mg,1.60mmol,1.5當量)，並轉移至樹脂。將所述漿混合3小時，過濾，並將樹脂用dmf充分洗滌(kaiser試驗為陰性)。從樹脂裂解：通過與30％hfip/dcm(20ml)混合1小時，從樹脂裂解受保護的接頭-脂肪酸。將樹脂濾出並用dcm充分衝洗。將合併的濾液在真空中蒸發成油。將殘餘的油用acn(15-20ml)稀釋並再次在真空中蒸發成油。將樣品用acn(15-20ml)再次溶解並在真空中蒸發以形成油。輕柔的氮氣流蒸發殘餘的acn以產生2.3克粗製的無定
形固體(理論收率＝1.4克)。
[0051]
純化:將粗製的樣品溶解在2mldmf和20mlacn(包括燒瓶洗液)中。加入水，這產生35ml的渾濁溶液。10ml另外的acn產生澄清溶液(總體積等於45ml(33％含水的))。通過將樣品負荷到半製備型氰基rp-hplc柱(silachrom xdb1-cn；10μm,2.1x 25cm)上進行純化。歷時71min使用40-75％b梯度，15ml/min，在60℃(a-緩衝液＝0.15％的在水中的tfa和b-緩衝液＝acn)洗脫樣品。將通過分析型rp-hplc確定的含有期望的產物的級分合併，冷凍並凍幹以產生696mg作為白色無定形固體的化合物a(理論值的52％；通過rp-hplc確定91％純度；觀察到的mw＝1239.6道爾頓；理論mw＝1239.65道爾頓)。
[0052]
基本上如用於合成化合物a的程序所述來製備化合物b(c20-otbu)-γglu(otbu)-γglu(otbu)-γglu(otbu)-lys(boc)-(2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸)-oh，但是把起始樹脂改成h-(2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸)-2-氯三苯甲基氯樹脂(1.8g,0.62mmol/g,1.1mmol；peptides international rhx-11074-pi)。通過rp-hplc將化合物b分離為白色無定形固體。觀察到的mw＝1327.5道爾頓；理論mw＝1327.73道爾頓。
[0053]
基本上如用於合成化合物a的程序所述製備化合物c(c20-otbu)-γglu(otbu)-γglu(otbu)-γglu(otbu)-εlys(boc)-gly-oh，但是將fmoc-lys(boc)-oh結構單元改成boc-l-lys(fmoc)-oh。通過rp-hplc將化合物c分離為白色無定形固體。觀察到的mw＝1239.5道爾頓；理論mw＝1239.65道爾頓。
[0054]
醯化、去保護、純化和鹽交換以分離實施例1醯化:將化合物a((c20-otbu)-γglu(otbu)-γglu(otbu)-γglu(otbu)-lys(boc)-gly-oh)(60.8mg；0.0437mmol；1.2當量；上述合成)和tstu(12.04mg 0.040mmol；1.1當量)溶解在200μl二甲亞碸(dmso)中。將二異丙基乙胺(diea,25.3μl；0.145mmol；4當量)加入該溶液並將得到的混合物在室溫溫育30分鐘以產生在dmso中的化合物a-osu酯並直接使用。
[0055]
向雙鏈胰島素a14e,b16h,b25h,desb30-bhi(tfa鹽；205mg；0.0364mmol)溶解在2ml乾燥二甲亞碸(dmso)中的溶液中加入1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯(dbu；81.6μl 0.546mmol,15當量，sigma-aldrich目錄33482)，並在這之後立即加入上述在乾燥dmso中的化合物a-osu酯。將反應混合物在環境溫度攪拌12分鐘並加入乙醚/dcm/tfa(30:10:0.2v/v；40ml體積)的混合物中。將得到的白色沉澱物通過離心進行分離並與乙醚一起研磨一次。
[0056]
去保護(除去boc和otbu基團):將上述乙醚潤溼的白色沉澱物用tfa/三異丙基矽烷(tis)/水(92.5:5.0:2.5v/v；5ml)的混合物處理20分鐘。加入乙醚(40ml)，並將得到的沉澱物通過離心進行收集，用乙醚洗滌一次，並乾燥。反相(rp)-hplc分析顯示去保護步驟將要完成(9％未反應的a14e,b16h,b25h,desb30-bhi；61％b29-醯化產物；13％a1,b29-二-醯化產物)。
[0057]
純化:將上述粗產物溶解在20mm tris hcl,ph 8/acn(60:40v/v；15ml)中。使用試紙測量的ph顯示在2至3的酸性ph。通過添加2ml的1m tris hcl(ph 8)來調節水平，使溶液也達到ph 8。使用a-緩衝液:20mm tris hcl,ph 8/acn(60/40v/v)和b-緩衝液:含有0.5nacl的20mm tris hcl,ph 8/acn(60/40v/v)，用ge source 30q陰離子交換柱(2.6x10cm)進行陰離子交換色譜作為初始純化步驟。將樣品加載到柱上並用a-緩衝液洗滌
直到達到穩定的uv基線。將樣品用多步梯度洗脫：0-8％b歷時1min，然後8-50％b歷時59min，最後90％b保持12min。流速設置為10ml/分鐘，在225nm和280nm進行uv監測，並將級分收集時間設置為0.5分鐘。將具有waters x select csh c18,4.6x50mm柱的分析型rp-hplc用於鑑定含有期望的產物的級分。將期望的級分合併(～80ml總體積)並用milli-q水稀釋至200ml。
[0058]
通過rp-hplc純化：將上述稀釋的級分加載到kromasil c18柱(2.1x 25cm)上，並使用標準的tfa/水/acn梯度進一步純化。緩衝液-a＝0.15％tfa/水，且緩衝液b＝acn。將樣品用多級梯度洗脫：0-10％b歷時1min，然後10-45％b歷時71min，流速為15ml/min，級分收集時間設置為0.5分鐘，且柱溫為50℃。在225nm和280nm進行uv監測。將具有waters x select csh c18,4.6x 50mm柱的分析型rp-hplc用於鑑定含有期望的產物的級分。將期望的級分合併(～113ml總體積；99.8％，通過rp-hplc)。
[0059]
鹽交換、轉化為hcl鹽:用於鹽hcl轉化的洗脫緩衝液是a
1-緩衝液:0.1m氯化銨水溶液和a
2-緩衝液:0.01％hcl與緩衝液b:acn。將上述合併的級分用水稀釋至200ml並重新加載到kromasil c18柱(2.1x 25cm)hplc柱上。將所述柱用三個柱體積的a
1-緩衝液洗滌，隨後用三個柱體積的a
2-緩衝液洗滌。使用0-10％(a
2-b)的梯度歷時1min，然後使用10-70％(a
2-b)的梯度歷時71min洗脫樣品，並在225nm和280nm進行uv監測。將含有期望的產物的級分通過分析型rp-hplc(柱：waters x select csh c18,4.6x50mm)進行鑑定，合併，冷凍，並凍幹以產生作為白色粉末的實施例1的化合物(153mg,0.023mmol；64％總收率)。通過分析型rp-hplc確認純度並發現為98.9％。esms解卷積譜:觀察到的mw:6531.2道爾頓；理論mw:6,533.4道爾頓。
[0060]
sci的醯化的替代方法：將化合物a((c20-otbu)-γglu(otbu)-γglu(otbu)-γglu(otbu)-lys(boc)-gly-oh)(584.6mg；0.424mmol；3.5當量)和tstu(125.6mg 0.417mmol；3.4當量)溶解在1.0ml乾燥dmso中。加入diea(168.3μl；0.966mmol；8當量)，並將得到的混合物在室溫溫育30分鐘以產生在dmso中的化合物a-o-(n-琥珀醯亞胺基酯(化合物a-osu酯)並直接使用。
[0061]
向sci-a14e,b16h,b25h,desb30-bhi(tfa鹽；1587mg；0.121mmol)溶解在16ml乾燥dmso中的溶液中，加入1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯(dbu；452μl 3.02mmol,25當量，sigma-aldrich目錄33482)，隨後對於每個部分以大約10min間隔逐份加入在dmso中的化合物a-osu酯(1.11當量，0.4當量，0.4當量，0.7當量，0.4當量)。通過分析型rp-hplc監測反應的進展。將反應混合物在環境溫度攪拌共60分鐘以後，將它分成2個相等的50ml部分，裝入乙醚/dcm/tfa(30:10:0.2v/v；40ml體積)的混合物。將得到的白色沉澱物通過離心分離並洗滌和與30ml乙醚一起研磨兩次。
[0062]
去保護(除去boc和otbu基團):將上述乙醚潤溼的白色沉澱物各自用tfa/三異丙基矽烷(tis；aldrich)/水(92.5:5.0:2.5v/v；10ml)的混合物處理30分鐘。向每份混合物中加入乙醚(40ml)，並將得到的沉澱物通過離心進行收集並用乙醚洗滌一次。將收集的沉澱物徹底乾燥以除去殘餘的乙醚並壓碎成細粉末。rp-hplc分析表明去保護步驟結束(4％未反應的sci-a14e,b16h,b25h,desb30-bhi；51％b29-醯化產物；38％n端,b29二-醯化產物)。
[0063]
酶消化(除去前導序列和c-肽):將乾燥的粉末狀粗產物完全溶解在0.1m tris hcl ph 8(600ml)中。向該溶液中，加入6.0ml的0.1m cacl2溶液、6.363ml的羧肽酶-b儲備
溶液(2.9mg/ml在水中)和1.587ml的胰蛋白酶儲備溶液(1.0mg/ml在水中)。將溶液在室溫溫育120min。分析型rp-hplc和lc-ms分析證實實施例1的成熟化合物(ifa-197)的完全產生。將溶液用45ml冰醋酸酸化(通過ph試紙確定ph 2-3)。
[0064]
通過製備型rp-hplc分離消化產物：在一系列製備型rp-hplc純化運行中分離在上述酸化的消化溶液中所含的期望的產物。通常，將期望的產物使用線性水/acn梯度(含有0.05％tfa)從rp-hplc柱洗脫，將含有期望的產物的級分合併，冷凍，並凍幹。如果在該步驟中達到期望的純度，可以省略陰離子交換(aex)色譜。
[0065]
通過製備型aex色譜進行的初始純化步驟(任選的):使用a-緩衝液:20mm tris hcl,ph 8/acn(60/40v/v)和b-緩衝液:含有0.5nacl的20mm tris hcl,ph 8/acn(60/40v/v)，用ge source 30q陰離子交換柱(2.6x 11.5cm)進行aex，以除去任何殘餘的c-肽或前導序列。將兩批凍乾粉末用12mm tris,ph 8/40％acn(具有另外的1m tris hcl,ph 8緩衝液，以達到ph 8)溶解。隨後將每份溶液加載到用100％a-緩衝液平衡的aex柱上，並用a-緩衝液洗滌直到達到穩態uv基線。將樣品如下洗脫：0-50％b的線性梯度歷時60min和100％b保持12min。流速設置為10ml/分鐘，在225nm和280nm進行uv監測，並將級分收集時間設置為0.5分鐘。
[0066]
使用具有waters xselect csh c18,4.6x 50mm柱的分析型rp-hplc鑑定含有期望的產物的級分。將期望的級分合併(225ml總體積)並在4℃儲存直到脫鹽/hcl轉化步驟。
[0067]
鹽交換；轉化為hcl鹽：用a
1-緩衝液:0.1m氯化銨水溶液和a
2-緩衝液:0.01％hcl與緩衝液b:acn，使用phenomenex luna c18(2)柱(2.1x 25cm,5μm,)通過製備型rp-hplc同時實現脫鹽和轉化為hcl鹽形式。將來自aex純化步驟的合併溶液分成三等份(各75ml)。將每份用75ml的milli-q水和1.5ml冰醋酸稀釋。將每份溶液(～151ml)加載到用a
1-緩衝液平衡的rp-hplc柱上，用2柱體積的a
1-緩衝液、2柱體積的a
2-緩衝液洗滌。在55℃，以15ml/min，用線性梯度5-10％(a
2-b)歷時1min，然後10-40％(a
2-b)歷時71min，將樣品洗脫。通過rp-hplc(柱：waters xselect csh c18,4.6x50mm)鑑定含有期望的產物的級分，合併，冷凍，並凍幹以產生作為白色無定形粉末的實施例1-hcl鹽(354mg,0.054mmol；45％總收率)。通過分析型rp-hplc確認純度並發現為99％。esms:解卷積譜:觀察到的mw:6531.2道爾頓；理論mw:6,533.4道爾頓。
[0068]
實施例2實施例2是由seq id no:1的a鏈、seq id no:4的b鏈組成的式i的化合物，其中在b鏈的位置29的lys側鏈的ε-氨基基團通過與ho2c-(ch2)
18-co-γglu-γglu-γglu-lys-(2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸)-綴合而被化學修飾。
[0069]
基本上如實施例1的程序所描述製備實施例2，除了在醯化步驟中使用((c20-otbu)-γglu(otbu)-γglu(otbu)-γglu(otbu)-lys(boc)-(2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸)-oh)(化合物b)。esms:解卷積譜:觀察到的mw:6620.1道爾頓；理論mw:6,621.5道爾頓。
[0070]
實施例3實施例3是由seq id no:1的a鏈、seq id no:5的b鏈組成的式i的化合物，其中在b鏈的位置29的lys側鏈的ε-氨基基團通過與ho2c-(ch2)
18-co-γglu-γglu-γglu-εlys-gly-綴合而被化學修飾。
[0071]
基本上如實施例1的程序所描述製備實施例3，除了在醯化步驟中使用((c20-otbu)-γglu(otbu)-γglu(otbu)-γglu(otbu)-εlys(boc)-(gly)-oh)(化合物c)。esms解卷積譜:觀察到的mw:6532.0道爾頓；理論mw:6,533.4道爾頓。
[0072]
體外受體親和力使用膜在人胰島素受體(hir)和人igf-1受體(higf-1r)閃爍迫近測定(spa)競爭性放射性配體結合測定中試驗了實施例1、2和3和對照化合物(生物合成的人胰島素(bhi)和胰島素-樣生長因子1(igf-1))，所述膜使用差速離心步驟從過表達重組hir-a、hir-b或higf-1r的穩定轉染的293hek細胞製備。
[0073]
通過使用pcdna3.1表達質粒將受體cdna亞克隆進人胚胎腎(hek)293細胞中，隨後用遺傳黴素選擇，製備穩定轉染的細胞系。產生的細胞系是人ir-a、含有c端c9標籤(tetsqvapa(seq id no:6))的人ir-b、人igf-1r和含有c-端c9標籤(tetsqvapa)的大鼠ir-a。使細胞在5％co2增溼環境生長。通常，根據受體，將第6至12代的細胞沉澱物冷凍以製備膜。
[0074]
將冷凍的細胞沉澱物在冰冷的勻漿化/再懸浮緩衝液(50mm tris-hcl,ph 7.5)中融化，所述緩衝液在每50ml緩衝液中含有一個蛋白酶抑制劑片劑與edta(roche diagnostics)。將細胞用頂置式馬達驅動的特氟隆-玻璃potter-elvehjem勻漿器使用15至20次衝擊進行勻漿化，隨後在4℃在1100x g離心10分鐘。將上清液保存在冰上，並將沉澱物如前所述勻漿化，並在4℃在1100x g離心10分鐘。將所有上清液合併，並隨後在4℃在35,000x g離心60分鐘。將沉澱物再懸浮於含有蛋白酶抑制劑的緩衝液中(4至5ml/g起始細胞糊狀物)，並在-80℃貯存之前在液氮中快速冷凍。使用二喹啉甲酸(bca)試劑盒(thermoscientific)用bsa作為標準品確定蛋白濃度。
[0075]
用人重組(3-[
125
i]-碘酪氨醯-a14)-胰島素(2200ci/mmol)或人重組[
125
i]-胰島素-樣生長因子-1(1853ci/mmol)(二者均得自perkin elmer)從競爭性放射性配體結合測
定確定受體結合親合力(ki)。使用聚乙烯基甲苯(pvt)麥胚凝集素偶聯的spa珠子(perkin elmer)用閃爍迫近測定(spa)方法進行測定。測定緩衝液(50mm tris-hcl,ph 7.5,150mm nacl)含有0.1％(w/v)無脂肪酸的bsa、0.001％(w/v)np-40(4-壬基苯基-聚乙二醇)或0.1％(w/v)無脂肪酸的hsa，並用於所有化合物試驗和試劑製備。使用freedom/evo機器人在測定緩衝液中製備使用試驗樣品或對照的3倍系列稀釋的10-點濃度響應曲線。將五十μl化合物稀釋液用temo機器人加入96-孔白色透明底微量培養板(corning)中，隨後加入放射性配體(50μl)、膜(50μl)和spa珠子(50μl)，都使用multiflo f/x(biotek)大體積分配儀器加入。放射性配體的終濃度是～40pm，且加入的spa珠子的量是0.15mg/孔。
[0076]
基於等式ki＝ic
50
/(1+l*/kd)從ic
50
值計算親和常數(ki)，其中l*等於在實驗中使用的放射性配體的濃度，且kd等於從飽和結合分析確定的放射性配體對各受體的平衡結合親和常數。
[0077]
幾何平均值,ki＝10
(logki值的算術平均值)
使用delta方法計算誤差，其中sem＝幾何平均值x((log10ki值的標準差)/(n的平方根))xln10。
[0078]
表1a、b、c：人胰島素受體亞型a和b(hir-a和hir-b)和人胰島素-樣生長因子-1受體(higf-1r)結合親和力，ki值是幾何平均值，且sem是使用delta方法計算的誤差。
[0079]
表1a:0.1％(w/v)bsa
[0080]
表1b:0.001％(w/v)np-40
[0081]
表1c:0.1％(w/v)hsa
11965-084)(含有0.1％bsa)中以60,000個細胞/孔鋪板在96-孔聚-d-賴氨酸包被的板(biocoat 354461)中。接著將細胞在組織培養箱中在37℃溫育過夜。還將96-孔elisa板用在20mm碳酸鈉緩衝液(ph 9.6)中的3.5μg/ml抗-胰島素受體抗體83-14(對於ira測定)或2.0μg/ml抗-c9抗體(對於irb測定)包被，並在4℃溫育過夜。
[0087]
次日，將elisa板用200μl洗滌緩衝液(含有0.1％的tbs-t)洗滌3次，並用在tbs-t中的1％bsa封閉至少一小時。用在含有高葡萄糖且無丙酮酸鈉的dmem中的0.1％酪蛋白製備測定介質。將下述化合物在測定介質中稀釋至各種濃度：人胰島素至200nm，實施例至60μm，higf-1至20μm，和aspb10至200nm。將化合物以1:3稀釋度連續稀釋。將細胞板用50μl測定介質衝洗兩次，然後將50μl測定介質和50μl稀釋的化合物轉移至細胞板的各個孔。轉移200nm bhi。將板在37℃溫育1小時。
[0088]
將蛋白酶抑制劑(pierce a32965)和原釩酸鈉(2mm的終濃度)加入裂解緩衝液(50mm tris ph 7.4,150mm nacl,和1％np40)。1小時溫育以後，將細胞板首先用100μl冷dpbs洗滌並在100μl裂解緩衝液中在4℃裂解15min。將細胞裂解物板混合，並將300μl的bhi處理過的細胞裂解物從用bhi半處理的細胞板轉移至稀釋板的第一列。將200μl裂解緩衝液加入該稀釋板的其它十一列，並如下將裂解物以1:3連續稀釋十一次：將100μl裂解物轉移至200μl裂解緩衝液並重複十一次。將10μl裂解物從用化合物處理過的細胞板轉移至稀釋板，並將190μl裂解緩衝液加入每個孔。將elisa板如前所述洗滌，然後將100μl稀釋的裂解物轉移至適當的elisa板。將板在振蕩器上在室溫溫育一小時。
[0089]
將板如前所述洗滌，並將100μl在tbst(含有蛋白酶抑制劑和40μm原釩酸鈉)中1:5000稀釋的二級抗體加入每個板。將板在振蕩器上在室溫溫育一小時。將板如前所述洗滌，並將50μl tmb加入板以顯色約2分鐘。用50μl 2n硫酸停止tmb反應，並在450nm讀板。
[0090]
將功能效能報告為，相對於陽性對照人胰島素的最大有效濃度(100nm)(hir-a和hir-b磷酸化測定)或陽性對照higf-1的10nm(higf-1r磷酸化測定)，引起半數最大響應的濃度(ec
50
)。從4-參數邏輯非線性回歸分析(ngr screener 13)確定ec
50
值。如果必要的話，將曲線頂或底參數分別設定至100或0。
[0091]
將報告的ec
50
值顯示為幾何平均值，並使用delta方法計算平均值標準誤差(sem)，其中獨立測定的數目用「n」指示(表2)。
[0092]
表2:人胰島素受體亞型a和b(hir-a和hir-b)活化幾何平均值(sem,n)
[0093]
表2中的數據表明，實施例1、2和3結合併刺激人胰島素受體a和b。
[0094]
在1型糖尿病的大鼠模型中的體內效能的評價在鏈脲黴素(stz)處理的大鼠糖尿病模型中研究了實施例1、2和3的葡萄糖降低和藥代動力學。400-425克體重的雄性sprague-dawley大鼠得自envigo,indianapolis,indiana。適應新環境大約一周以後，將大鼠用異氟烷麻醉並給予zanosar(89256,teva parenteral medicines,40mg/kg，iv)的單次注射。在注射zanosar以後3天，將大鼠用在研究中；在這些研究中僅使用具有400-550mg/dl的非禁食血糖的動物。
[0095]
將大鼠分組以提供血糖和體重的可比較差異；將大鼠隨機化。使用accu-chek aviva血糖儀(roche)測量血糖。
[0096]
基於在給藥的第1天在早8點(0800)的動物體重給藥試驗物質(肽溶液；1ml/kg；皮下；在給藥階段的第1天單次劑量)或媒介物(10mm tris,19mg/ml甘油,3.15mg/ml間甲酚,ph 7.6；1ml/kg；皮下；在給藥階段的第1天單次劑量)。通過尾巴放血收集用於葡萄糖測量的血液樣品。動物在整個試驗中自由獲取食物和水。將來自這些研究的血漿樣品用於分析化合物水平。
[0097]
在給藥後0、1、2、4、6、8、10、12、18、24、36、48、60、72、84、96、108和120小時，收集全血使用血糖儀用於測定全血葡萄糖。一式兩份地記錄值，除非值相差超過30mg/dl。如果這種情況發生，記錄一式三份值。如果大鼠降低至低於35mg/dl葡萄糖，給整個組口服給藥2ml的50％右旋糖，但是在相同組中》100mg/dl的大鼠除外。觀察挽救的大鼠，並在右旋糖負荷以後每2至4小時測量血糖。在觀察期期間，如果大鼠降低至低於35mg/dl葡萄糖，給整個組口服給藥2ml的50％右旋糖，但是在相同組中》100mg/dl的大鼠除外。繼續觀察，並在右旋糖負荷以後每2至4小時測量血糖。如果給大鼠口服給藥2ml的50％右旋糖，所有隨後記錄的葡萄糖值被排除在研究計算之外。即使動物被挽救，對它們仍繼續進行研究以收集pk時間點，因為pk不受右旋糖大劑量(bolus)的影響。
[0098]
免疫親和力-lc/ms大鼠血漿測定：為了表徵實施例的pk，通過免疫沉澱隨後是lc/ms分析對血漿樣品(10μl等分試樣)進行分析以得到完整胰島素濃度。使用實施例在100％對照大鼠血漿中製備標準品和空白樣品，並將穩定的同位素標記的抗體(與實施例無關)加入所有標準品和樣品作為內部標準品。對於免疫沉澱，將生物素標記的抗-人鼠抗體
(fitzgerald,10r-i134e)用作捕獲試劑，其隨後被dynal m-280鏈黴親和素包被的磁珠(invitrogen 60210)結合。將磁珠固定化的樣品用0.1％chaps洗滌，隨後用pbs洗滌，並將實施例用含有20％acn、2％甲酸水溶液和20％invitrosol(invitrogen,46-5553)的溶液洗脫。在0.01至5.3μg/ml(1.6至802nm)的範圍內，使用thermo q/exactive plus質譜儀定量血漿樣品。
[0099]
使用phoenix winnonlin v8.1進行非房室藥代動力學分析。對於大鼠pk分析，在消除半衰期的估計中使用的濃度取自以下的平均值：對於50nmol/kg劑量組在施用後44至120小時，對於100nmol/kg劑量組在施用後32至120小時，對於200nmol/kg劑量組在施用後18至120小時，和對於400nmol/kg劑量組在施用後18至120小時。
[0100]
表3a、3b：實施例1在鏈脲黴素(stz)處理的大鼠糖尿病模型中的葡萄糖降低(3a)和藥代動力學影響(3b)。表3a:在50、100、200或400nmol/kg的實施例1的單次皮下施用以後，實施例1在stz處理的雄性sprague-dawley大鼠中的葡萄糖降低
*
沒有測量高於601的值，因為那是在血糖儀上的高讀數
[0101]
表3b:在單次皮下施用50、100、200或400nmol/kg的實施例1以後，實施例1在stz處理的雄性sprague-dawley大鼠中的平均藥代動力學參數
[0102]
表4a:在單次皮下施用50、100、200或400nmol/kg的實施例2以後，實施例2在stz處理的雄性sprague-dawley大鼠中的葡萄糖降低
＊
沒有測量高於601的值，因為那是在血糖儀上的高讀數
[0103]
表4b:在單次皮下施用50、100、200或400nmol/kg的實施例2以後，實施例2在stz處理的雄性sprague-dawley大鼠中的平均藥代動力學參數.
[0104]
表5a:在單次皮下施用50、100、200或400nmol/kg的實施例3以後，實施例3在stz處理的雄性sprague-dawley大鼠中的葡萄糖降低
＊
沒有測量高於601的值，因為那是在血糖儀上的高讀數
[0105]
表5b:在單次皮下施用50、100、200或400nmol/kg的實施例3以後，實施例3在stz處理的雄性sprague-dawley大鼠中的平均藥代動力學參數
表3b、4b、5b的縮寫：auc
0-inf
＝從0至無窮大的曲線下面積，cl/f＝清除率/生物利用度，tmax＝至最大濃度的時間，cmax/d＝每劑的最大血漿濃度，t
1/2
＝半衰期[數據是平均值
±
sd(n＝5)。
[0106]
表3a、4a和5a中的數據表明了所有三個實施例在體內穩健的劑量依賴性的葡萄糖降低效果。表3b、4b和5b中的數據表明了所有三個實施例的體內作用的持續時間。
[0107]
在1型糖尿病的豬模型中的藥物清除率的評價本研究的目的是研究在3.6nmol/kg的單次皮下劑量後實施例在患糖尿病的yucatan小型豬中的葡萄糖降低和藥代動力學。在給藥後168小時內收集血液樣品。
[0108]
將患糖尿病的(四氧嘧啶誘導的)、閹割的、雄性yucatan小型豬(平均年齡23個月，平均體重44kg)單獨圈養，在所有時間隨意獲取淡水，並每天飼餵兩餐的圈養餐。動物每天兩次接受適當的維持性基礎和膳食胰島素以在不進行研究時管理它們的糖尿病病況。將動物隨機置於治療組並返回它們的圍欄。將實施例配製成在六聚體製劑(hexameric formulation)中的400u/ml(19mg/ml甘油,4zn/hex,3.15mg/ml間甲酚,10mm tris,ph 7.6)。
[0109]
在研究前一天，給豬飼餵它們每日定量的一半，並在它們的早晨維持施用中接受0.2u/kg humalog mix 75/25。在預定的試驗劑量施用前大約12小時，給豬飼餵它們每日定量的一半，並且僅接受0.2u/kg的humalog。所有動物都保持禁食，直到已經收集了24小時樣品以後。
[0110]
在研究的早晨，將所有動物置於吊索中以進行約束，並接入它們的血管接入口(配備用於血液取樣)並檢查通暢性。將動物隨機置於治療組(n＝6)並返回其各自的圍欄。收集前兩個施用前樣品，用u100胰島素注射器在脅腹中給動物皮下注射(0min)試驗物質0.6u/kg/3.6nmol/kg(基於400u/ml胰島素濃度，平均體積為7單位/豬)。在剩餘的血液收集階段中，所有研究動物隨意獲取乾淨的淡水。
[0111]
在以下時間點從每隻動物收集系列血液樣品(各4.0ml)並置於含有k3edta抗凝血劑的試管中：在皮下(sc)給藥後-0.5、0、1.5、3、6、12、18、24、36、42、48、54、60、72、96、120、144和168小時。
[0112]
給動物飼餵300克s-9飲食，並在24和60小時樣品後皮下施用0.2u/kg humalog。在72小時樣品以後，動物恢復它們的正常維持胰島素和飼養方案。在早餐和維持胰島素施用之前收集所有樣品。
[0113]
將全血樣品在收集後立即保持在溼冰上。然後通過離心(在～4℃～3000rpm至少15min)分離血漿並分成兩個等分試樣，並在大約-20℃(對於葡萄糖分析)或-70℃(對於pk
分析)儲存冷凍。
[0114]
使用自動化的beckman au480臨床化學分析儀(beckman coulter,brea,ca)測定血糖濃度，並用graphpadprism 8繪圖。
[0115]
免疫親和力-lc/ms豬血漿測定：為了表徵試驗實施例的pk，通過免疫沉澱接著是lc/ms對血漿樣品(100μl等分試樣)進行分析以得到其完整的實施例濃度。使用試驗實施例在100％對照豬血漿中製備標準品和空白樣品，並將穩定的同位素標記的抗體(與所述實施例無關)加入所有標準品和樣品作為內部標準品。對於免疫沉澱，將生物素標記的抗-人鼠抗體(fitzgerald，目錄號10r-i134e)用作捕獲試劑，其隨後被dynal m-280鏈黴親和素包被的磁珠(invitrogen 60210)結合。將磁珠固定化的樣品用0.1％chaps洗滌，隨後用pbs洗滌，並將試驗實施例和它的內部標準品用含有20％acn、2％甲酸水溶液和20％invitrosol(invitrogen,46-5553)的溶液洗脫。在0.1至52.3ng/ml(0.016至8.0nm)的範圍內，使用thermo q/exactive plus質譜儀定量血漿樣品。
[0116]
藥代動力學分析：使用phoenix winnonlin v8.1進行非房室藥代動力學分析。對於pk分析，在消除半衰期的估計中使用的濃度取自在給藥後50至160小時的平均值(對應於皮下3.6nmol/kg)。
[0117]
表6a：葡萄糖降低數據
[0118]
表6b：在單次皮下劑量以後實施例1、2、3在雄性糖尿病-誘導的yucatan豬中的平均pk參數
縮寫：t
1/2
＝半衰期，t
max
＝至最大濃度的時間，c
max
＝最大血漿濃度，auc
0-inf
＝從0至無窮大的曲線下面積，cl/f＝清除率/生物利用度(n＝6，對於試驗實施例)。
[0119]
表6a和6b中的數據表明所有三個實施例在1型糖尿病的豬模型中在體內穩健的和延長的葡萄糖降低效果。
[0120]
序列seq id no：1經修飾的胰島素a-鏈(a14e)；式i的a-鏈giveqcctsicsleqlenycnseq id no：2經修飾的胰島素b-鏈(b16h,b25h,desb30)；式i的b-鏈fvnqhlcgshlvealhlvcgergfhytpk其中在位置29處的lys通過lys側鏈的ε-氨基基團與ho2c-(ch2)
18-co-γglu-γglu-γglu-x-的綴合而被化學修飾，其中x是-lys-gly-、-lys-(2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸)-或-εlys-gly-。seq id no：3實施例1的b-鏈fvnqhlcgshlvealhlvcgergfhytpk其中在位置29處的lys通過lys側鏈的ε-氨基基團與ho2c-(ch2)
18-co-γglu-γglu-γglu-lys-gly-的綴合而被化學修飾。seq id no：4實施例2的b-鏈fvnqhlcgshlvealhlvcgergfhytpk其中在位置29處的lys通過lys側鏈的ε-氨基基團與ho2c-(ch2)
18-co-γglu-γglu-γglu-lys-(2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸)-的綴合而被化學修飾。seq id no：5實施例3的b-鏈fvnqhlcgshlvealhlvcgergfhytpk其中在位置29處的lys通過lys側鏈的ε-氨基基團與ho2c-(ch2)
18-co-γglu-γglu-γglu-εlys-gly-的綴合而被化學修飾。seq id no：6c-端c9表位tetsqvapaseq id no：7單鏈胰島素
seq id no：8經修飾的胰島素b-鏈(b16h,b25h,desb30)fvnohlcgshlvealhlvcgergfhytpk