一種基於OCTS技術的淋系白血病CAR‑T治療載體及其構建方法和應用與流程

2024-04-01 17:27:05 1

本發明屬於醫學生物領域，具體涉及一種載體，尤其涉及一種基於octs技術的淋系白血病car-t治療載體。此外，本發明還涉及該載體的構建方法和應用。
背景技術：
：腫瘤免疫治療的理論基礎是免疫系統具有識別腫瘤相關抗原、調控機體攻擊腫瘤細胞(高度特異性的細胞溶解)的能力。1950年代，burnet和thomas提出了「免疫監視」理論，認為機體中經常會出現的突變的腫瘤細胞可被免疫系統所識別而清除，為腫瘤免疫治療奠定了理論基礎[burnetfm.immunologicalaspectsofmalignantdisease.lancet,1967；1:1171-4]。隨後，各種腫瘤免疫療法包括細胞因子療法、單克隆抗體療法、過繼免疫療法、疫苗療法等相繼應用於臨床。2013年一種更先進的腫瘤免疫療法---car-t療法成功用於臨床，並表現了前所未有的臨床療效。car-t，全稱是chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy，嵌合抗原受體t細胞免疫療法。該療法是通過轉基因的手段，將啟動子、抗原識別區、共刺激因子、效應區等共同組成的嵌合分子，導入t細胞基因組內，從而使t細胞對靶細胞的識別、信號轉導、殺傷等功能融為一體，實現了對靶細胞的特異性殺傷[eleanorj.cheadle,etal.cartcells:drivingtheroadfromthelaboratorytotheclinic.immunologicalreviews2014.vol.257:91–106]。car-t療法在臨床上最領先的有諾華的clt019，採用clt019治療復發難治急性淋巴細胞白血病患者，六個月的腫瘤無進展生存率達到67％，其中最長的應答時間達到兩年多。總部位於中國上海的上海優卡迪生物醫藥科技有限公司與醫院合作，截止到2017年2月，共治療復發難治急性淋巴細胞白血病患者36例，其中完全24例，緩解比例達到66.6％。這是抗癌研究的顛覆性突破。car-t細胞療法可能是最有可能治癒癌症的手段之一，並被《science》雜誌評為2013年度十大科技突破之首。car-t目前在治療b-淋巴細胞白血病等幾種類型的血液腫瘤方面療效顯著，但是也存在一些局限性，目前一個嵌合抗原受體只能識別一種抗原靶標，腫瘤細胞是個複雜的群體，含有相應抗原的腫瘤細胞被清除以後，不含相應抗原的腫瘤細胞會迅速增殖，一段時間後導致腫瘤復發。那麼要使car-t識別能同時識別兩種抗原，就有兩個方案可選：一是將兩組嵌合抗原受體構建進入一個慢病毒轉基因載體，一次性將兩組嵌合抗原受體轉導進入原代t淋巴細胞；二是用兩個慢病毒轉基因載體分兩次轉導，將兩組嵌合抗原受體分別轉導進入原代t淋巴細胞。方案一的缺點在於佔用慢病毒轉基因載體的寶貴容量，不利於裝載其它功能元件；轉基因載體包裝效率低；基因轉導效率非常低，很難轉導進入原代t淋巴細胞內。方案二的缺點在於需要經過兩次轉導，兩次轉導的綜合效率較低，轉導周期時間長，原代細胞容易衰老，導致增殖能力衰退，殺傷功能下降，影響腫瘤清除療效。人b-lymphocyteantigencd19，又稱為cd19，是一種由人cd19基因編碼的蛋白質。cd19主要表達在濾泡樹突狀細胞和b細胞表面。cd19在造血幹細胞表面不表達，它存在於pro-bcell到memorybcell的發育階段，消失於漿細胞(plasmacell)表面。cd19在大多數b細胞惡性腫瘤表面表達，包括慢性淋巴細胞白血病(cll)，b急性淋巴細胞白血病(b-all)，瀰漫大b細胞淋巴瘤(dlbcl)，濾泡性淋巴瘤(fl)套細胞淋巴瘤(mcl)。因此，cd19是一個良好的腫瘤細胞免疫治療的靶點[scheuermannrh,racilae.cd19antigeninleukemiaandlymphomadiagnosisandimmunotherapy.leukemia&lymphoma.1995,18(5-6):385–97.]。cd22是主要在成熟b淋巴細胞表達的ⅰ型跨膜蛋白，在b細胞信號傳導中起重要作用。cd22作為b細胞受體(bcr)的一個共受體，通過抗原引起cd22與bcr交聯，觸發cd22磷酸化，主要使下遊信號蛋白去磷酸化和失活，抑制bcr信號傳導。cd22普遍存在於正常b細胞和b細胞惡性腫瘤中。cd20作為一種信號轉導複合物的成分對b淋巴細胞的生長有調節作用，並且cd20特異性表達在prebcell到maturebcell的分化階段，尤其是大多數淋巴瘤細胞表面(mohamed-rachidboulasselandahmedgalal.immunotherapyforb-cellneoplasmsusingtcellsexpressingchimericantigenreceptors.sultanqaboosuniversitymedj,august2012,vol.12,iss.3,pp.273-285.)。cd30屬於腫瘤壞死因子受體家族，在淋巴細胞的凋亡和增殖中起重要作用，幾乎在所有的霍奇金淋巴瘤和部分非霍奇金淋巴瘤表面都有表達，目前在臨床作為霍奇金淋巴瘤和間變性大細胞淋巴瘤診斷的重要標誌(carlosa.ramos,etal.chimerict-cellsfortherapyofcd30+hodgkinandnon-hodgkinlymphomas(hl&nhl).biologyofbloodandmarrowtransplantation,2016,22(3):s145-s146.)。cd123是人白介素3受體的alpha鏈，在大多數的急性髓系白血病(aml)細胞和很多造血細胞表面均有表達，cd123是一個非常好的免疫治療靶點，因為即使在cd123表達很少的細胞裡，它的表達會隨時間增長逐漸增強，並且急性髓系白血病很可能是由於處於白血病前期的造血幹細胞經過克隆演化而來，以cd123為靶點，則可以起到清髓的作用(saargill,carlh.juneetal.preclinicaltargetingofhumanacutemyeloidleukemiaandmyeloablationusingchimericantigenreceptor-modifiedtcells.blood.2014；123(15):2343-2354.)。il-6受體(il-6r)由一個il6受體亞單位和兩個gp130信號轉導亞單位組成，主要分布於肝細胞、中性粒細胞、單核、巨噬細胞以及淋巴細胞表面；另外還有一種可溶性受體(sil-6r)，這種受體缺乏跨膜成分和胞質成分，在信號轉導中，活化的sil-6r與膜結合gp130亞單位結合，發揮其作用[rosejs,schellerj,elsong,etal.interleukin-6biologyiscoordinatedbymembrane-boundandsolublereceptors:roleinin-flammationandcancer.jleukocbiol,2006,80:227-236]。car-t細胞治療中的細胞因子風暴(crs)就與il-6信號通路的過度活化相關，阻斷封閉il-6r，有利於阻斷il-6信號通路的過度激活，從而控制crs反應。目前，尚未有克服上述缺點針對cd19以及選自cd22、cd20、cd30、cd123中的任意一種抗原組成的雙抗原的car-t治療的相關報導。技術實現要素：本發明要解決的技術問題之一是提供一種基於octs技術的淋系白血病car-t治療載體。首先，其僅需要一次轉導，轉導效率高，不影響car-t治療的療效；其次，其不佔用慢病毒轉基因載體的寶貴容量，利於裝載其它功能元件。第三，能有效封閉il6r，阻斷il6信號通路，防止炎症因子風暴(crs)升級。本發明要解決的技術問題之二是提供該載體的構建方法。本發明要解決的技術問題之三是提供該載體的應用。為解決上述技術問題，本發明採用如下技術方案：在本發明的一方面，提供一種基於octs技術的淋系白血病car-t治療載體，包括慢病毒骨架質粒、人ef1α啟動子、octs嵌合受體結構域和il6r單鏈抗體；所述慢病毒骨架質粒包括：用於目的菌株大量擴增的含氨苄青黴素抗性基因ampr序列，如seqidno.1所示；用於質粒複製的原核複製子pucori序列，如seqidno.2所示；用於增強真核細胞內的複製的病毒複製子sv40ori序列，如seqidno.3所示；用於慢病毒包裝的慢病毒包裝順式元件；zsgreen1綠色螢光蛋白，如seqidno.11所示；ires核糖體結合序列，如seqidno.12所示；用於增強轉基因的表達效率的ewpre增強型土撥鼠B肝病毒轉錄後調控元件，如seqidno.13所示；所述人ef1α啟動子的序列如seqidno.14所示；所述octs嵌合受體結構域包括：如seqidno.15所示的cd8leader嵌合受體信號肽、兩組單鏈抗體：第一組選自以下四組單鏈抗體的任意一組：如seqidno.18所示的cd20單鏈抗體輕鏈vl、如seqidno.19所示的cd20單鏈抗體重鏈vh；如seqidno.20所示的cd22單鏈抗體輕鏈vl、如seqidno.21所示的cd22單鏈抗體重鏈vh；如seqidno.22所示的cd30單鏈抗體輕鏈vl、如seqidno.23所示的cd30單鏈抗體重鏈vh；如seqidno.24所示的cd123單鏈抗體輕鏈vl、如seqidno.25所示的cd123單鏈抗體重鏈vh；第二組為如seqidno.16所示的cd19單鏈抗體輕鏈vl以及如seqidno.17所示的cd19單鏈抗體重鏈vh；如seqidno.26所示的抗體內鉸鏈inner-linker、如seqidno.27所示的單鏈抗體間鉸鏈inter-linker、如seqidno.28所示的cd8hinge嵌合受體鉸鏈、如seqidno.29所示的cd8transmembrane嵌合受體跨膜區、如seqidno.32所示的tcr嵌合受體t細胞激活域以及嵌合受體共刺激因子區域；所述嵌合受體共刺激因子區域選自4-1bb、icos、cd27、ox40、cd28、myd88、il1r1、cd70、tnfrsf19l、tnfrsf27、tnfrsf1od、tnfrsf13b、tnfrsf18、cd134等腫瘤壞死因子超家族(tumornecrosisfactorreceptorsuperfamily，tnfrsf)中的任意一種或多種的組合。所述慢病毒包裝順式元件可以採用第二代慢病毒載體，也可以採用第三代慢病毒載體。所述慢病毒包裝順式元件採用第二代慢病毒載體包括：如seqidno.5所示的慢病毒5terminalltr、如seqidno.6所示的慢病毒3terminalself-inactivatingltr、如seqidno.7所示的gag順式元件、如seqidno.8所示的rre順式元件、如seqidno.9所示的env順式元件、如seqidno.10所示的cppt順式元件。所述慢病毒包裝順式元件採用第三代慢病毒載體包括：如seqidno.5所示的慢病毒5terminalltr、如seqidno.6所示的慢病毒3terminalself-inactivatingltr、如seqidno.7所示的gag順式元件、如seqidno.8所示的rre順式元件、如seqidno.9所示的env順式元件、如seqidno.10所示的cppt順式元件，以及如seqidno.4所示的rsv啟動子。本發明優選採用第三代慢病毒載體。優選的，所述兩組單鏈抗體採用串聯連接方式或者轉角連接方式；如圖4所示：當兩組單鏈抗體為cd20單鏈抗體和cd19單鏈抗體時，所述串聯連接方式具體為：cd20單鏈抗體輕鏈vl與cd19單鏈抗體輕鏈vl採用單鏈抗體間鉸鏈inter-linker連接，cd20單鏈抗體輕鏈vl與cd20單鏈抗體重鏈vh採用抗體內鉸鏈inner-linker連接，cd19單鏈抗體輕鏈vl與cd19單鏈抗體重鏈vh採用抗體內鉸鏈inner-linker連接，即pocts2019s(見圖4a、圖4c)；所述轉角連接方式具體為：cd19單鏈抗體輕鏈vl與cd19單鏈抗體重鏈vh採用抗體內鉸鏈inner-linker連接，cd20單鏈抗體輕鏈vl與cd19單鏈抗體重鏈vh採用單鏈抗體間鉸鏈inter-linker連接，cd20單鏈抗體重鏈vh與cd19單鏈抗體輕鏈vl採用單鏈抗體間鉸鏈inter-linker連接，即pocts2019t(見圖4b、圖4c)；當兩組單鏈抗體為cd30單鏈抗體和cd19單鏈抗體時，所述串聯連接方式具體為：cd30單鏈抗體輕鏈vl與cd19單鏈抗體輕鏈vl採用單鏈抗體間鉸鏈inter-linker連接，cd30單鏈抗體輕鏈vl與cd30單鏈抗體重鏈vh採用抗體內鉸鏈inner-linker連接，cd19單鏈抗體輕鏈vl與cd19單鏈抗體重鏈vh採用抗體內鉸鏈inner-linker連接，即pocts3019s(見圖4a、圖4c)；所述轉角連接方式具體為：cd19單鏈抗體輕鏈vl與cd19單鏈抗體重鏈vh採用抗體內鉸鏈inner-linker連接，cd30單鏈抗體輕鏈vl與cd19單鏈抗體重鏈vh採用單鏈抗體間鉸鏈inter-linker連接，cd30單鏈抗體重鏈vh與cd19單鏈抗體輕鏈vl採用單鏈抗體間鉸鏈inter-linker連接，即pocts3019t(見圖4b、圖4c)；當兩組單鏈抗體為cd22單鏈抗體和cd19單鏈抗體時，所述串聯連接方式具體為：cd22單鏈抗體輕鏈vl與cd19單鏈抗體輕鏈vl採用單鏈抗體間鉸鏈inter-linker連接，cd22單鏈抗體輕鏈vl與cd22單鏈抗體重鏈vh採用抗體內鉸鏈inner-linker連接，cd19單鏈抗體輕鏈vl與cd19單鏈抗體重鏈vh採用抗體內鉸鏈inner-linker連接，即pocts2219s(見圖4a、圖4c)；所述轉角連接方式具體為：cd19單鏈抗體輕鏈vl與cd19單鏈抗體重鏈vh採用抗體內鉸鏈inner-linker連接，cd22單鏈抗體輕鏈vl與cd19單鏈抗體重鏈vh採用單鏈抗體間鉸鏈inter-linker連接，cd22單鏈抗體重鏈vh與cd19單鏈抗體輕鏈vl採用單鏈抗體間鉸鏈inter-linker連接，即pocts2219t(見圖4b、圖4c)；當兩組單鏈抗體為cd123單鏈抗體和cd19單鏈抗體時，所述串聯連接方式具體為：cd123單鏈抗體輕鏈vl與cd19單鏈抗體輕鏈vl採用單鏈抗體間鉸鏈inter-linker連接，cd123單鏈抗體輕鏈vl與cd123單鏈抗體重鏈vh採用抗體內鉸鏈inner-linker連接，cd19單鏈抗體輕鏈vl與cd19單鏈抗體重鏈vh採用抗體內鉸鏈inner-linker連接，即pocts12319s(見圖4a、圖4c)；所述轉角連接方式具體為：cd19單鏈抗體輕鏈vl與cd19單鏈抗體重鏈vh採用抗體內鉸鏈inner-linker連接，cd123單鏈抗體輕鏈vl與cd19單鏈抗體重鏈vh採用單鏈抗體間鉸鏈inter-linker連接，cd123單鏈抗體重鏈vh與cd19單鏈抗體輕鏈vl採用單鏈抗體間鉸鏈inter-linker連接，即pocts12319t(見圖4b、圖4c)。優選的，所述il6r單鏈抗體的序列如seqidno.33所示。優選的，所述ewpre增強型土撥鼠B肝病毒轉錄後調控元件有6個核苷酸的增強突變，具體為：g.396g>a、g.397c>t、g.398t>c、g.399g>a、g.400a>t、g.411a>t。優選的，由所述人ef1α啟動子啟動整個octs結構基因表達，所述cd8leader嵌合受體信號肽位於octs編碼序列的n端，用於引導octs蛋白定位於細胞膜；所述兩組單鏈抗體組合成雙抗原識別區，用於識別相應靶抗原；所述cd8hinge嵌合受體鉸鏈用於將scfv錨定於細胞膜外側；所述cd8transmembrane嵌合受體跨膜區用於將整個嵌合受體固定於細胞膜上；所述cd28嵌合受體共刺激因子用於刺激t淋巴細胞體外激活和體內腫瘤細胞殺傷作用；所述cd134嵌合受體共刺激因子用於促進t淋巴細胞增殖和因子分泌，增強腫瘤免疫，有利於記憶t細胞的長期存活；所述tcr嵌合受體t細胞激活域用於激活下遊信號通路的表達；所述il6r單鏈抗體分泌到細胞外，封閉il6r，阻斷il6信號通路，防止炎症因子風暴升級；當抗原識別區域與靶抗原結合時，信號通過嵌合受體傳遞至細胞內，從而產生t細胞增殖、細胞因子分泌增加、抗細胞凋亡蛋白分泌增加、細胞死亡延遲、裂解靶細胞等一系列生物學效應。優選的，所述嵌合受體共刺激因子區域採用如seqidno.30所示的cd28嵌合受體共刺激因子以及如seqidno.31所示的cd134嵌合受體共刺激因子組合。優選的，所述cd19單鏈抗體輕鏈vl、cd19單鏈抗體重鏈vh、cd20單鏈抗體輕鏈vl、cd20單鏈抗體重鏈vh、cd30單鏈抗體輕鏈vl、cd30單鏈抗體重鏈vh、cd123單鏈抗體輕鏈vl、cd123單鏈抗體重鏈vh、il6r單鏈抗體均經過人源化改造。在本發明的第二方面，提供一種上述基於octs技術的淋系白血病car-t治療載體的構建方法，包括以下步驟：(1)將如seqidno.1所示的含氨苄青黴素抗性基因ampr序列、如seqidno.2所示的原核複製子pucori序列、如seqidno.3所示的病毒複製子sv40ori序列、用於慢病毒包裝的慢病毒包裝順式元件、如seqidno.11所示的zsgreen1綠色螢光蛋白、如seqidno.12所示的ires核糖體結合序列、如seqidno.13所示的ewpre增強型土撥鼠B肝病毒轉錄後調控元件存儲於慢病毒骨架質粒上；(2)將如seqidno.14所示的人ef1α啟動子、所述octs嵌合受體結構域以及如seqidno.33所示的il6r單鏈抗體組合成octs嵌合受體設計方案，經過酶切、連接、重組反應克隆至慢病毒骨架質粒中，得到第三代octs設計的重組慢病毒質粒；(3)將得到的重組慢病毒質粒分別與慢病毒包裝質粒ppac-gp、ppac-r以及膜蛋白質粒penv-g共同轉染hek293t/17細胞，在hek293t/17細胞中進行基因轉錄表達後，包裝成功重組慢病毒載體會釋放到細胞培養上清中，收集包含的重組慢病毒載體的上清液；(4)將得到的重組慢病毒上清採用抽濾、吸附、洗脫的柱純化方式進行純化，分別得到重組慢病毒載體。優選的，步驟(4)中，所述抽濾步驟要控制上清體積在200ml～2000ml，控制真空度在-0.5mpa～-0.9mpa，防止由於堵孔帶來的載體損失；所述吸附步驟要控制溶液的ph值在6～8，防止ph的變化導致載體失活；所述洗脫步驟要控制洗脫液的離子強度在0.5m～1.0m，防止離子強度的變化導致洗脫不完全或者載體失活。在本發明的第三方面，提供所述的載體在製備治療淋系白血病的藥物中的應用。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：本發明所採用的octs-car-t技術，是在目前傳統car-t細胞治療的基礎上，通過對嵌合抗原受體(car)結構的優化改造，使得嵌合抗原受體能夠識別兩種抗原，大大拓展了car-t細胞的識別範圍，針對腫瘤群體的清除更徹底，療效更持久；避免分批培養car-t細胞，大大節約成本；避免患者多次回輸不同靶向car-t細胞，節約了患者的經濟支出，降低復發的機率，間接提高患者生存質量。僅需要一次轉導，轉導效率高，不影響car-t治療的療效；不佔用慢病毒轉基因載體的寶貴容量，利於裝載其它功能元件，轉基因載體包裝效率高，基因轉導效率高。octs的全稱是onecarwithtwoscfvs，通過串聯octs(seriesocts)或者轉角octs(turnocts)的連接方式，將兩段scfv與整合成一個嵌合分子(如圖1所示)，賦予t淋巴細胞hla非依賴的方式識別兩種腫瘤抗原的能力，相對於傳統的car-t細胞能夠識別更廣泛的目標，進一步擴大了腫瘤細胞的清除範圍。octs的基礎設計中包括兩個腫瘤相關抗原(tumor-associatedantigen，taa)結合區(通常來源於單克隆抗體抗原結合區域的scfv段)，一個胞外鉸鏈區，一個跨膜區，兩個胞內信號轉導區和一個效應元件區。scfv區域對於octs的特異性、有效性以及基因改造t細胞自身的安全性來說是關鍵的決定因素。隨著octs-car-t的即將進入臨床研究階段標誌著car-t細胞治療即將進入2.0時代。本發明所採用的載體骨架可以應用於第三代慢病毒載體結構上，也可以應用於第二代慢病毒載體結構上。第二代和第三代慢病毒載體在結構上的區別如圖2b所示。本發明優選第三代慢病毒載體(如圖2a所示)，3’sinltr去除了u3區域，消除了慢病毒載體自我複製的可能性，大大提高了安全性；增加了cppt和wpre元件，提高了轉導效率和轉基因的表達效率；採用rsv啟動子保證了慢病毒載體包裝時核心rna的持續高效轉錄；採用人自身的ef1α啟動子，使car基因能夠在人體內長時間持續表達。本發明所述的cd19單鏈抗體輕鏈vl、cd19單鏈抗體重鏈vh、cd20單鏈抗體輕鏈vl、cd20單鏈抗體重鏈vh、cd22單鏈抗體輕鏈vl、cd22單鏈抗體重鏈vh、cd30單鏈抗體輕鏈vl、cd30單鏈抗體重鏈vh、cd123單鏈抗體輕鏈vl、cd123單鏈抗體重鏈vh、il6r單鏈抗體均經過人源化改造，能有有效減少體內人抗鼠抗(humananti-mouseantibodies，hama)的產生，延長scfv的半衰期和作用效果，增加octs-car-t細胞的存在時間。本發明中使用的共刺激因子的一種或若干種組合，能夠增加轉導後細胞的增殖速率、存活時間、殺傷效率、免疫記憶等特性。本發明採用的octs-car-t細胞由gmp級別的車間生產後，可用於人體臨床實驗。本發明的重組慢病毒載體可以實現在人t淋巴細胞上表達cd19、cd20、cd22、cd30、cd123等組合的雙靶向嵌合抗原受體，引導並激活t淋巴細胞對cd19、cd20、cd22、cd30、cd123等陽性細胞的殺傷作用，在臨床上可用於治療b淋巴細胞白血病、b淋巴瘤的治療。本發明通過重組慢病毒載體骨架、octs結構域、白介素-6受體(il6r)的singlechainantibody(單鏈抗體)構建形成重組慢病毒載體，該方式得到的重組慢病毒載體可以實現在人t淋巴細胞內表達il-6r的單鏈抗體，能有效封閉il6r，阻斷il-6信號通路，臨床上可用於緩解細胞因子釋放綜合症(cytokinereleasesyndrome，crs)，保障細胞治療過程中患者的生命安全。可見，本發明所述的octs-car-t細胞將給腫瘤細胞治療提供可靠的保障。附圖說明圖1是本發明所述的octs嵌合受體的示意圖，包含了串聯octs(seriesocts)和轉角octs(turnocts)示意圖；圖2本發明所述的慢病毒載體結構示意圖；其中圖2a是本發明採用的第三代慢病毒載體結構示意圖，圖2b是第二代和第三代慢病毒載體結構比較示意圖；圖3為本發明實施例1中構建本發明所述的重組慢病毒載體的構建流程圖。其中，(a)圖是慢病毒骨架質粒plenti-3gbasic的結構示意圖；(b)圖是8個octs質粒的示意圖；(c)圖是ppac-gp質粒的結構示意圖；(d)圖是ppac-r質粒的結構示意圖；(e)圖是penv-g包裝質粒的結構示意圖；圖4是本發明實施例1中octs結構的元件順序示意圖，其中，a圖是串聯octs(seriesocts)的結構示意圖，b圖是轉角octs(turnocts)的結構示意圖，c圖是octs結構的質粒編號(octssymbol)的列表示意圖；圖5是本發明實施例1中重組慢病毒質粒pocts12319s、pocts2219s、pocts2019s、pocts3019s、pocts12319t、pocts2219t、pocts2019t、pocts3019t的酶切預測及酶切瓊脂糖凝膠電泳圖；其中圖5a是pocts12319s的酶切預測示意圖，圖5b是pocts12319s的酶切瓊脂糖凝膠電泳圖；圖5c是pocts2219s的酶切預測示意圖，圖5d是pocts2219s的酶切瓊脂糖凝膠電泳圖；圖5e是pocts2019s的酶切預測示意圖，圖5f是pocts2019s的酶切瓊脂糖凝膠電泳圖；圖5g是pocts3019s的酶切預測示意圖，圖5h是pocts3019s的酶切瓊脂糖凝膠電泳圖；圖5i是pocts12319t的酶切預測示意圖，圖5j是pocts12319t的酶切瓊脂糖凝膠電泳圖；圖5k是pocts2219t的酶切預測示意圖，圖5l是pocts2219t的酶切瓊脂糖凝膠電泳圖；圖5m是pocts2019t的酶切預測示意圖，圖5n是pocts2019t的酶切瓊脂糖凝膠電泳圖；圖5o是pocts3019t的酶切預測示意圖，圖5p是pocts3019t的酶切瓊脂糖凝膠電泳圖；圖5a中的lane1是1kbdnaladdermarker：條帶從上到下依次為：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；圖5a中的lane2是pocts12319s的bamhi酶切預測：條帶從上到下依次為：11384bp、818bp；圖5b中的lane1是1kbdnaladdermarker的電泳結果；圖5b中的lane2是pocts12319s的bamhi酶切電泳結果；圖5c中的lane1是1kbdnaladdermarker：條帶從上到下依次為：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；圖5c中的lane2是pocts2219s的kpni酶切預測：條帶從上到下依次為：7824bp、4322bp；圖5d中的lane1是1kbdnaladdermarker的電泳結果；圖5d中的lane2是pocts2219s的kpni酶切電泳結果；圖5e中的lane1是1kbdnaladdermarker：條帶從上到下依次為：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；圖5e中的lane2是pocts2019s的apali酶切預測：條帶從上到下依次為：4883bp、3931bp、1726bp、1246bp、497bp；圖5flane1是1kbdnaladdermarker的電泳結果；圖5flane2是pocts2019s的apali酶切電泳結果；圖5g中的lane1是1kbdnaladdermarker：條帶從上到下依次為：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；圖5g中的lane2是pocts3019s的bamhi酶切預測：條帶從上到下依次為：10268bp、1197bp、818bp；圖5h中的lane1是1kbdnaladdermarker的電泳結果；圖5h中的lane2是pocts3019s的bamhi酶切電泳結果；圖5i中的lane1是1kbdnaladdermarker：條帶從上到下依次為：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；圖5i中的lane2是pocts12319t的sali酶切預測：條帶從上到下依次為：6934bp、5389bp；圖5j中的lane1是1kbdnaladdermarker的電泳結果；圖5j中的lane2是pocts12319t的sali酶切電泳結果；圖5k中的lane1是1kbdnaladdermarker：條帶從上到下依次為：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；圖5k中的lane2是pocts2219t的ecori酶切預測：條帶從上到下依次為：10626bp、1399bp、311bp；圖5l中的lane1是1kbdnaladdermarker的電泳結果；圖5l中的lane2是pocts2219t的ecori酶切電泳結果；圖5m中的lane1是1kbdnaladdermarker：條帶從上到下依次為：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；圖5m中的lane2是pocts2019t的psti酶切預測：條帶從上到下依次為：9231bp、2554bp、617bp；圖5n中的lane1是1kbdnaladdermarker的電泳結果；圖5n中的lane2是pocts2019t的psti酶切電泳結果；圖5o中的lane1是1kbdnaladdermarker：條帶從上到下依次為：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp；圖5o中的lane2是pocts3019t的sacii酶切預測：條帶從上到下依次為：11652bp、887bp；圖5p中的lane1是1kbdnaladdermarker的電泳結果；圖5p中的lane2是pocts3019t的sacii酶切電泳結果；圖6是本發明實施例1中重組慢病毒載體的滴度檢測結果示意圖；圖7為本發明實施例1中所述的octs-car-t細胞構建的步驟流程圖，包含分離培養、激活、基因轉導、octs-car-t細胞鑑定等階段；圖8是本發明實施例2中octs-car-t細胞的支原體檢測結果示意圖，其中，lane1為dl2000marker，從上到下條帶條帶從上到下依次為：2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp；lane2為陽性對照；lane3為陰性對照；lane4為pbs；lane5為裂解液；lane6為octs12319s-car-t細胞；lane7為octs2219s-car-t細胞；lane8為octs2019s-car-t細胞；lane9為octs3019s-car-t細胞；lane10為octs12319t-car-t細胞；lane11為octs2219t-car-t細胞；lane12為octs2019t-car-t細胞；lane13為octs3019t-car-t細胞；圖9為本發明實施例2中流式檢測octs-car-t細胞的轉導效率以及免疫分型結果示意圖；其中，圖9a表示octs12319s-car-t細胞的轉導效率結果；圖9b表示octs12319s-car-t細胞的免疫分型結果；圖9c表示octs2219s-car-t細胞的轉導效率結果；圖9d表示octs2219s-car-t細胞的免疫分型結果；圖9e表示octs2019s-car-t細胞的轉導效率結果；圖9f表示octs2019s-car-t細胞的免疫分型結果；圖9g表示octs3019s-car-t細胞的轉導效率結果；圖9h表示octs3019s-car-t細胞的免疫分型結果；圖9i表示octs12319t-car-t細胞的轉導效率結果；圖9j表示octs12319t-car-t細胞的免疫分型結果；圖9k表示octs2219t-car-t細胞的轉導效率結果；圖9l表示octs2219t-car-t細胞的免疫分型結果；圖9m表示octs2019t-car-t細胞的轉導效率結果；圖9n表示octs2019t-car-t細胞的免疫分型結果；圖9o表示octs3019t-car-t細胞的轉導效率結果；圖9p表示octs3019t-car-t細胞的免疫分型結果；圖10為本發明實施例3中不同效靶比條件下，octs-car-t細胞對靶細胞殺傷效率柱狀圖；其中，圖10a表示octs12319s-car-t細胞和octs12319t-car-t細胞對不同靶細胞的殺傷結果；圖10b表示octs2219s-car-t細胞和octs2219t-car-t細胞對不同靶細胞的殺傷結果；圖10c表示octs2019s-car-t細胞和octs2019t-car-t細胞對不同靶細胞的殺傷結果；圖10d表示octs3019s-car-t細胞和octs3019t-car-t細胞對不同靶細胞的殺傷結果。具體實施方式下面結合具體實施例進一步闡述此發明。應理解的是，在此描述的特定實施方式通過舉例的方式來表示，並不作為對本發明的限制。在不偏離本發明範圍的情況下，本發明的主要特徵可以用於各種實施方式。材料1、慢病毒骨架質粒plenti-3gbasic，慢病毒包裝質粒ppac-gp、ppac-r以及膜蛋白質粒penv-g，hek293t/17細胞，同源重組酶，oligoannealingbuffer，支原體檢測試劑盒，內毒素檢測試劑盒，cd19+k562、cd20+k562、cd22+k562、cd30+k562、cd123+k562、cd19+cd123+k562、cd19+cd20+k562、cd19+cd22+k562、cd19+cd30+k562、k562細胞購自世翱(上海)生物醫藥科技有限公司；慢病毒骨架質粒plenti-3gbasic的具體製備方法已經公開在發明名稱為「一種基於複製缺陷性重組慢病毒的car-t轉基因載體及其構建方法和應用」，專利申請號為201610008360.5的專利申請說明書中；2、人新鮮外周血由健康供者提供；3、octs12319s、octs2219s、octs2019s、octs3019s、octs12319t、octs2219t、octs2019t、octs3019tdna序列組合由上海優卡迪公司設計(參見圖4c)，交給上海捷瑞生物工程有限公司合成，並以寡核苷酸乾粉或者質粒形式保存；4、工具酶clai、psti、sacii、sali、ecori、bamhi、apali、kpni、t4dna連接酶均購自neb公司；5、0.22μm-0.8μmpes濾器購自millipore公司；6、d-pbs(-)、0.4％臺盼藍、篩網、各類型細胞培養皿、培養袋、培養板均購自corning公司；7、opti-mem、pen-srep、hepes、fbs、aim-v、rpmi1640、dmem、lipofectamine3000購自invitrogen公司；8、biotinylatedproteinl購自genescript公司；9、ldh檢測試劑盒購自promega公司；10、ficoll淋巴細胞分離液購自ge公司；11、20％人血白蛋白注射液購自傑特貝林公司；12、cryopremium凍存液、分選緩衝液來自上海優卡迪公司；13、ril-2，ril-7，，ril-15，ril-21購自peprotech公司；14、cd3單克隆抗體，cd28單克隆抗體，cd3/cd28磁珠cd4/cd8磁珠購自德國miltenyi公司；15、冷凍離心機(美國thermoscientific公司；16、facs流式細胞儀購自thermo公司；17、螢光倒置顯微鏡購自olympus公司；18、cd4-fitc、cd8-apc購自biolegend公司；19、0.9％生理鹽水購自今邁公司；20、proteinlmagneticbeads購自biovision公司；21、primestar、retronectin購自takara公司；22、phycoerythrin(pe)-conjugatedstreptavidin購自bdbioscience公司；23、質粒抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自mn公司；24、感受態細胞top10購自tiangen公司；25、nacl、kcl、na2hpo4.12h2o、kh2po4、trypsin、edta、cacl2、naoh、peg6000均購自上海生工；26、dneasy試劑盒購自上海捷瑞公司；27、sa-hrp購自上海翊聖公司；28、引物：根據引物設計原則設計擴增dna片段和靶位點所需的引物，該引物由上海生物公司合成，具體為：ef1α-f：5』-attcaaaattttatcgatgctccggtgcccgtcagt-3』(seqidno.34)ef1α-r：5』-tcacgacacctgaaatggaaga-3』(seqidno.35)octs-f：catttcaggtgtcgtgaggatccgccaccatggcgctgccggtgac(seqidno.36)octs-r：ggggagggagaggggcttagcgcggcggcagcg(seqidno.37)ires-f：gcccctctccctccccc(seqidno.38)ires-r：attatcatcgtgtttttcaaaggaa(seqidno.39)il6rscab-f：aaaacacgatgataatgccaccatgaactccttctccacaagcg(seqidno.40)il6rscab-r：aatccagaggttgattgtcgacgaattctcatttgcccgggctcag(seqidno.41)wpre-qpcr-f：5』-cctttccgggactttcgcttt-3』(seqidno.42)wpre-qpcr-r：5』-gcagaatccaggtggcaaca-3』(seqidno.43)actin-qpcr-f：5』-catgtacgttgctatccaggc-3』(seqidno.44)actin-qpcr-r：5』-ctccttaatgtcacgcacgat-3』(seqidno.45)29、本發明中，所述seqidno.1，seqidno.2，seqidno.3，seqidno.4，seqidno.5，seqidno.6，seqidno.7，seqidno.8，seqidno.9，seqidno.10，seqidno.11，seqidno12，seqidno.13，seqidno.14，seqidno.15，seqidno.16，seqidno.17，seqidno.18，seqidno.19，seqidno.20，seqidno.21，seqidno.22，seqidno.23，seqidno.24，seqidno.25，seqidno.26，seqidno.27，seqidno.28，seqidno.29，seqidno.30，seqidno.31，seqidno.32，seqidno.33所示dna片段由上海捷瑞生物工程有限公司根據本發明人提供的序列合成。實施例1octs-car-t細胞構建一、重組慢病毒載體lvocts12319s、lvocts2219s、lvocts2019s、lvocts3019s、lvocts12319t、lvocts2219t、lvocts2019t、lvocts3019t的構建、純化、檢測方法。參見圖3，本發明所述重組慢病毒載體的構建方法如下：1、將人ef1α啟動子(seqidno.14)、octs結構【如seqidno.15所示的cd8leader嵌合受體信號肽、兩組單鏈抗體：第一組選自以下四組單鏈抗體的任意一組：如seqidno.18所示的cd20單鏈抗體輕鏈vl、如seqidno.19所示的cd20單鏈抗體重鏈vh；如seqidno.20所示的cd22單鏈抗體輕鏈vl、如seqidno.21所示的cd22單鏈抗體重鏈vh；如seqidno.22所示的cd30單鏈抗體輕鏈vl、如seqidno.23所示的cd30單鏈抗體重鏈vh；如seqidno.24所示的cd123單鏈抗體輕鏈vl、如seqidno.25所示的cd123單鏈抗體重鏈vh；第二組為如seqidno.16所示的cd19單鏈抗體輕鏈vl以及如seqidno.17所示的cd19單鏈抗體重鏈vh；如seqidno.26所示的抗體內鉸鏈inner-linker、如seqidno.27所示的單鏈抗體間鉸鏈inter-linker、如seqidno.28所示的cd8hinge嵌合受體鉸鏈、如seqidno.29所示的cd8transmembrane嵌合受體跨膜區、如seqidno.30所示的cd28嵌合受體共刺激因子、如seqidno.31所示的cd134嵌合受體共刺激因子、如seqidno.32所示的tcr嵌合受體t細胞激活域。octs12319s、octs2219s、octs2019s、octs3019s、octs12319t、octs2219t、octs2019t、octs3019t，結構詳見圖4】、il6r單鏈抗體(seqidno.33)組合成octs嵌合受體設計方案，經過酶切、連接、重組反應克隆至慢病毒骨架質粒plenti-3gbasic中，分別得到重組慢病毒質粒pocts12319s、pocts2219s、pocts2019s、pocts3019s、pocts12319t、pocts2219t、pocts2019t、pocts3019t，元件順序和編號如圖4c所示。(1)將慢病毒骨架質粒plenti-3gbasic使用clai和ecori限制性內切酶進行雙酶切，產物經過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認5823bp的片段v1，並割膠回收置於eppendorf管內，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，並測定產物的純度和濃度；1、溶膠按200μlnti/100mggel比例加入溶膠液，50℃水浴放置5-10分鐘。2、結合dna11000g離心30秒，棄去濾液。3、洗膜加入700μlnt3，11000g離心30秒，棄去濾液。4、洗膜重複第三步一次5、晾乾11000g離心1分鐘，換新的收集管，室溫放置1分鐘。6、洗脫dna加入15-30μlne，室溫放置1分鐘，11000g離心1分鐘，收集濾液。表1瓊脂糖凝膠回收步驟(2)用引物ef1α-f和ef1α-r以合成的人ef1α啟動子(seqidno.14)為模板，使用表2中的體系，pcr循環條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃2min)*35cycle，72℃10min。產物經過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認1208bp的片段a，並割膠回收置於eppendorf管內，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，並測定產物的純度和濃度；試劑體積(μl)h2o32.55×buffer(withmg2+)10dntp(各2.5mm)4primer1(+)(10μm)1primer2(－)(10μm)1template1primestar0.5表250μlpcr反應體系(3)用引物octs-f和octs-r以合成的octs12319s為模板，使用表2中的體系，pcr循環條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產物經過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認2363bp的片段b，並割膠回收置於eppendorf管內，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，並測定產物的純度和濃度；(4)用引物octs-f和octs-r以合成的octs2219s為模板，使用表2中的體系，pcr循環條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產物經過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認2369bp的片段c，並割膠回收置於eppendorf管內，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，並測定產物的純度和濃度；(5)用引物octs-f和octs-r以合成的octs2019s為模板，使用表2中的體系，pcr循環條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產物經過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認2381bp的片段d，並割膠回收置於eppendorf管內，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，並測定產物的純度和濃度；(6)用引物octs-f和octs-r以合成的octs3019s為模板，使用表2中的體系，pcr循環條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產物經過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認2381bp的片段e，並割膠回收置於eppendorf管內，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，並測定產物的純度和濃度；(7)用引物octs-f和octs-r以合成的octs12319t為模板，使用表2中的體系，pcr循環條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產物經過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認2390bp的片段f，並割膠回收置於eppendorf管內，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，並測定產物的純度和濃度；(8)用引物octs-f和octs-r以合成的octs2219t為模板，使用表2中的體系，pcr循環條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產物經過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認2399bp的片段g，並割膠回收置於eppendorf管內，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，並測定產物的純度和濃度；(9)用引物octs-f和octs-r以合成的octs2019t為模板，使用表2中的體系，pcr循環條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產物經過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認2411bp的片段h，並割膠回收置於eppendorf管內，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，並測定產物的純度和濃度；(10)用引物octs-f和octs-r以合成的octs3019t為模板，使用表2中的體系，pcr循環條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產物經過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認2424bp的片段i，並割膠回收置於eppendorf管內，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，並測定產物的純度和濃度；(11)用引物ires-f和ires-r以合成的ires核糖體結合序列(seqidno.12)為模板，使用表2中的體系，pcr循環條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產物經過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認575bp的片段j，並割膠回收置於eppendorf管內，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，並測定產物的純度和濃度；(12)用引物il6rscab-f和il6rscab-r以合成的il6r單鏈抗體(seqidno.33)為模板，使用表2中的體系，pcr循環條件為：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃30sec)*35cycle，72℃5min。產物經過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，確認1569bp的片段k，並割膠回收置於eppendorf管內，用mn公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，並測定產物的純度和濃度；(16)將重組慢病毒質粒dna片段組合(見表3)以5μl總體積且摩爾比1:1:1:1的比例加入eppendorf管內，加入同源重組酶反應液15μl，混勻後在42℃孵育30分鐘，轉移至冰上放置2-3分鐘，將反應液加入50μltop10中，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30分鐘，將管放到預加溫到42℃的恆溫水浴鍋中熱激90秒，快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻2-3分鐘，每管加900μllb培養液，然後將管轉移到37℃搖床上，溫育1小時使細菌復甦，取100μl的轉化菌液塗布於amplb瓊脂平板上，倒置平皿，於恆溫培養箱中37℃培養，16小時。表3重組慢病毒質粒dna片段組合挑取克隆進行菌落pcr鑑定，鑑定正確的克隆即為重組慢病毒質粒pocts12319s、pocts2219s、pocts2019s、pocts3019s、pocts12319t、pocts2219t、pocts2019t、pocts3019t，對正確的克隆進行酶切鑑定(見圖5)，並送測序覆核結果。2、重組慢病毒載體lvocts12319s、lvocts2219s、lvocts2019s、lvocts3019s、lvocts12319t、lvocts2219t、lvocts2019t、lvocts3019t的包裝。(1)完全培養基：取出預熱好的新鮮培養基，加入10％fbs+5mlpen-srep，上下顛倒混勻即可；(2)1xpbs溶液：稱量nacl8g，kcl0.2，na2hpo4.12h2o3.58g，kh2po40.24g置於1000ml燒杯中，加入900mlmilli-qgrade超純水溶解，溶解完成後，使用1000ml量筒定容至1000ml，121℃高溫溼熱滅菌20min；(3)0.25％trypsin溶液:稱量trypsin2.5g，edta0.19729g置於1000ml燒杯中，加入900ml1xpbs溶解，溶解完成後，使用1000ml量筒定容至1000ml，0.22μm過濾除菌，長期使用可保存至-20℃冰箱；(4)0.5mcacl2溶液：稱量36.75gcacl2用400mlmilli-qgrade超純水溶解；用milli-qgrade超純水將總體積定容至500ml，混勻；0.22μm過濾除菌，分裝保存到50ml離心管中，每管45ml左右，4℃保存。(5)2xhbs溶液：稱量4.09gnacl，0.269gna2hpo4，5.96ghepes，用400mlmilli-qgrade超純水溶解；校準ph儀後，用2mnaoh溶液將hbs溶液的ph調到7.05。調整每瓶hbs的ph消耗2mnaoh為3ml左右；(6)從液氮罐中取出凍存的hek293t/17細胞，迅速轉移到37℃水浴中，1～2min後轉移到超淨臺中，無菌操作將凍存管中的液體全部轉移至10cm2培養皿中，補足含10％fbs的dmem至8ml/10cm2dish，24h後顯微鏡觀察細胞，細胞匯合的程度大於80％進行傳代；(7)選擇細胞狀態良好、無汙染的hek293t/17細胞，每2-6個培養皿為一組，將細胞胰酶消化後，用電動移液器吸取4-12ml完全培養基，向每個消化後的培養皿中加2ml，避免培養皿變幹；使用1ml移液器將所有細胞吹打成單細胞懸液，轉移到培養基瓶中；(8)將上述2-6個培養皿中的剩餘細胞轉移到培養基瓶中，並用培養基再衝洗一便培養皿；(9)蓋緊培養基瓶蓋，上下顛倒10次左右充分混勻細胞懸液，將細胞傳到8-24個10cm2培養皿中，每皿的細胞密度應當約4×106個/10ml完全培養基左右。如果細胞密度和預期的相差較大，則需要對細胞進行計數，然後按照4×106個/皿的量接種；(10)每6個培養皿整理為一摞，注意保持上下皿之間的配合。將培養皿左右，前後晃動數次，使細胞充分鋪開，然後放入5％co2培養箱。剩餘細胞做同樣處理；(11)檢查所傳代細胞，細胞匯合度應當為70-80％，輪廓飽滿，貼壁良好，在細胞培養皿中均勻分布；(12)為細胞換液，將培養基替換為新鮮完全培養基,每皿9ml，並將培養箱的co2濃度設定值提高到8％；(13)按照n+0.5配dna/cacl2溶液。每皿hek293t/17細胞轉染質粒量按照下列比例使用：重組慢病毒質粒(20μg),ppac-gp(15μg)，ppac-r(10μg),penv-g(7.5μg)。取一個新的5ml離心管，加入0.5mcacl2：0.25ml，重組慢病毒質粒20μg：ppac-gp15μg：ppac-r10μg：penv-g7.5μg，補充超純水至0.5ml蓋上蓋子，充分混勻；(14)另取一支5ml離心管，加入0.5mldna/cacl2溶液。打開渦旋振蕩器，一隻手拿住5ml離心管的上端，使管底接觸振蕩頭，使液體在管壁上散開流動，另一隻手拿一把1ml移液槍，吸取0.5ml2×hbs溶液，緩慢滴加進入離心管，控制流速，以半分鐘滴完為宜。2×hbs加入後，繼續振蕩5秒鐘，停止振蕩，可直接加入需要轉染的細胞中；(15)取一皿細胞，將離心管中的1ml鈣轉液滴加進去，儘可能使鈣轉試劑分布到整個培養皿中；(16)鈣轉液加入後，在皿蓋上做好標記，將培養皿放還到另一個5％co2培養箱中。確保培養皿水平放置，每摞培養皿不要超過6個。在5％co2培養箱中放置(6–8h)；(17)將第一個培養箱的co2濃度設定值調回到5％；(18)24小時後，檢查細胞狀態。細胞匯合度應當為80–85％左右，狀態良好。將培養基吸走，更換10ml新鮮的dmem完全培養基；(19)48小時後，觀察轉染效率。絕大多數細胞仍然是貼壁的。可以看到超過95％細胞都會帶有綠色螢光。將同一個病毒包裝上清液收集到一起，並向培養皿中繼續添加10ml新鮮培養基；(20)72小時後，再次將同一個病毒上清液收集到一起，兩次收集的病毒可以放在一起，丟棄培養皿；此時收集的上清裡包含了重組慢病毒載體lvocts12319s、lvocts2219s、lvocts2019s、lvocts3019s、lvocts12319t、lvocts2219t、lvocts2019t、lvocts3019t。3、離子交換色譜法純化重組慢病毒載體；(1)將收集的上清液使用thermo真空泵，經0.22μm-0.8μm的pes濾器抽濾，除去雜質；(2)按1:1～1:10的比例往上清中加入1.5mnacl250mmtris-hcl(ph6-8)；(3)將2個離子交換柱串聯放置，用4ml1mnaoh、4ml1mnacl、5ml0.15mnacl25mmtris-hcl(ph6-8)溶液依次過柱；(4)將步驟2中獲得的溶液通過蠕動泵以1-10ml/min的速度給離子交換柱上樣；(5)全部上清液過柱後，使用10ml0.15mnacl25mmtris-hcl(ph6-8)溶液清洗一遍；(6)根據上樣量使用1-5ml1.5mnacl25mmtris-hcl(ph6-8)進行洗脫，收集洗脫液；(7)將洗脫液分成25到50μl一管，凍存到-80℃冰箱，進行長期保存；4、重組慢病毒載體滴度測定；(1)取24孔板接種293t細胞。每孔細胞為5×104個，所加培養基體積為500ul,不同種類的細胞生長速度有所差異，進行病毒感染時的細胞融合率為40％-60％；(2)準備3個無菌ep管，在每個管中加入90ul的新鮮完全培養基(高糖dmem+10％fbs)接種細胞24小時後，取兩個孔的細胞用血球計數板計數，確定感染時細胞的實際數目，記為n；(3)取待測定的病毒原液10ul加入到第一個管中，輕輕混勻後，取10ul加入到第二個管中，然後依次操作直到最後一管；在每管中加入410ul完全培養基(高糖dmem+10％fbs),終體積為500ul；(4)感染開始後20小時，除去培養上清，更換為500μl完全培養基(高糖dmem+10％fbs)，5％co2繼續培養48小時；(5)72小時後，觀察螢光表達情況，正常情況下，螢光細胞數隨稀釋倍數增加而相應減少,並拍照；(6)用0.2ml0.25％胰酶-edta溶液消化細胞，在37℃放置1分鐘。用培養基吹洗整個細胞面，離心收集細胞。按照dneasy試劑盒的說明抽提基因組dna。每個樣品管中加入200μl洗脫液洗下dna並定量；(7)準備目的dna檢測qpcrmix總管ⅰ(qpcr引物序列為seqidno.42---seqidno.43)：n＝numberofreactions.例如：總反應數為40，將1ml2×taqmanuniversalpcrmastermix，4μlforwardprimer，4μlreverseprimer，4μlprobe和788μlh2o混和。震蕩後放在冰上；(8)準備內參dna檢測qpcrmix管ⅱ(qpcr引物序列為seqidno.44---seqidno.45)：2×taqmanmastermix25μl×n10×rnasepprimer/probemix2.5μl×nh2o17.5μl×nn＝numberofreactions.例如：總反應數為40，將1ml2×taqmanuniversalpcrmastermix，100μl10×rnasepprimer/probemix和700μlh2o混和。震蕩後放在冰上；(9)在預冷的96孔pcr板上完成pcr體系建立。從總管ⅰ中各取45μl加入到a-d各行的孔中，從總管ⅱ中各取45μl加入到e-g各行的孔中。(10)分別取5μl質粒標準品和待測樣品基因組dna加入到a-d行中，每個樣品重複1次。另留1個孔加入5μl的水做為無模板對照(no-templatecontrol)。(11)分別取5μl基因組標準品和待測樣品基因組dna加入到e-g行中，每個樣品重複1次。另留1個孔加入5μl的水做為無模板對照(no-templatecontrol)。(12)所使用定量pcr儀為abiprism7500定量系統。循環條件設定為：50℃2分鐘，95℃10分鐘，然後是95℃15秒，60℃1分鐘的40個循環。數據分析：測得的dna樣品中整合的慢病毒載體拷貝數用基因組數加以標定，得到每基因組整合的病毒拷貝數。滴度(integrationunitsperml，iuml-1)的計算公式如下：iuml-1＝(c×n×d×1000)/v其中：c＝平均每基因組整合的病毒拷貝數n＝感染時細胞的數目(約為1×105)d＝病毒載體的稀釋倍數v＝加入的稀釋病毒的體積數(13)重組慢病毒載體lvocts12319s、lvocts2219s、lvocts2019s、lvocts3019s、lvocts12319t、lvocts2219t、lvocts2019t、lvocts3019t的滴度結果(如圖6所示)；二、octs-car-t細胞構建參見圖7，本發明所述octs-car-t細胞的構建方法如下：1、分離pbmc。(1)抽取健康供者新鮮外周血50ml；(2)將採血袋噴拭酒精兩遍，並擦乾。(3)用50ml注射器將袋中的血細胞吸出來移至新50ml管中。(4)400g，20℃離心10min。(5)將上層血漿移到新的50ml離心管中，56℃，30min滅活血漿，恢復至室溫，2000g，離心30min，取上清到50ml離心管中待用。(6)用d-pbs(-)補至50ml，擰緊蓋子，顛倒混勻。(7)取2個新50ml離心管，每管加入15mlficoll淋巴細胞分離液。(8)向每管ficoll上小心加入血細胞稀釋液25ml。800g，20℃離心20min。(9)離心管中液體分為四層，從上至下分別為：黃色的血漿層(回收待用)、白膜層、無色透明的ficoll層、紅黑色的混合細胞層。(10)小心吸取白膜層到新50ml離心管中，補加d-pbs(-)至50ml，顛倒混勻後500g，20℃離心10min。(11)加入25ml5％人血白蛋白並重懸細胞，400g，20℃離心10min。(12)棄上清，加入25ml5％人血白蛋白重懸細胞沉澱，並過70um篩網，計數。(13)取1份含1.25x108cells用於激活；剩餘細胞懸液400g，20℃離心10min，加cryopremium並凍存。2、cd4/cd8陽性t細胞分選。(1)將獲得的pbmc計數，以80ul/107cells的比例加入分選緩衝液，重懸細胞沉澱。(2)再以20ul/107cells的比例加入cd4/cd8磁珠，吹打混勻後放入4℃中孵育15min。(3)取出磁珠-細胞混合液，以2ml/107cells的比例加入分選緩衝液，顛倒混勻後，250g，4℃離心10min。(4)以500ul/108cells的比例加入分選緩衝液，重懸細胞沉澱。(5)用鑷子夾取ls分離柱到磁力架上。(6)同時準備2個15ml離心管，分別標記：cd4-/cd8-細胞液(a管)、cd4+/cd8+細胞液(b管)。(7)用3ml分離緩衝液潤洗ls,並用a管接緩衝液。(8)加入細胞-磁珠混合液，滴完後加入3ml緩衝液衝洗柱子(每次無液體殘留時再加入新的液體)，總共三次，收集得到cd4/cd8-細胞。(9)ls分離柱與磁力架分離，用b管接細胞懸液，加入5ml緩衝液，將並用柱子內塞稍用力衝洗，收集為cd4+/cd8+細胞，取樣計數。(10)按1x106/ml-4x106/ml的細胞密度用aim-v培養基重懸細胞沉澱，並加入2×105～1×106u/lifn-γ因子。3、t細胞激活。(1)提前一天將1×103ug/l～1×104ug/lcd3單克隆抗體和1×103ug/l～1×104ug/lcd28單克隆抗體加入24孔板，封口膜封口，4℃過夜包被。(2)取出包被的t75瓶，倒掉包被液，用d-pbs(-)洗滌一次，並將分選得到的細胞懸液接種到t75瓶中，搖勻，放入37℃、5％co2培養箱中培養。4、car基因轉導及octs-car-t細胞誘導培養。(1)提前一天包被1×103ug/l～1×104ug/lretronectin於24孔板內，封口膜封口，4℃過夜包被。(2)往24孔板中，根據每孔5×105細胞量，按moi＝5～20的量，分別加入lvocts12319s、lvocts2219s、lvocts2019s、lvocts3019s、lvocts12319t、lvocts2219t、lvocts2019t、lvocts3019t慢病毒轉基因載體，同時添加含2×105～5×105u/lril-2，5×103ng/l～1×104ng/lril-7，5×103ng/l～1×104ng/lril-15，5×103ng/l～1×104ng/lril-21和含10％自體血清的aim-v培養基37℃、5％co2繼續培養。5、octs-car-t細胞體外擴增。(1)每2天等量補加含2×105～5×105u/lril-2，5×103ng/l～1×104ng/lril-7，5×103ng/l～1×104ng/lril-15，5×103ng/l～1×104ng/lril-21和含10％自體血清的aim-v培養基，使ph值維持在6.5～7.5之間，細胞密度維持在5×105～2×106/ml之間，37℃、5％co2繼續培養10-14天。(2)第7天左右，凍存培養的octs-car-t細胞用於後續檢測。實施例2octs-car-t細胞病原檢測和表達檢測。一、內毒素檢測；(1)、內毒素工作標準品為15eu/支；(2)、鱟試劑靈敏度λ＝0.25eu/ml，0.5ml/管(3)、內毒素標準品稀釋：取內毒素標準品一支，分別用bet水按比例稀釋成4λ和2λ的溶解，封口膜封口，震蕩溶解15min；稀釋時每稀釋一步均應在漩渦混合器上混勻30s；(4)、加樣：取鱟試劑若干支，每支加入bet水0.5ml溶解，分裝至若干支無內毒素試管中，每管0.1ml。其中2支為陰性對照管，加入bet水0.1ml；2支為陽性對照管，加入2λ濃度的內毒素工作標準品溶液0.1ml；2支為樣品陽性對照管，加入0.1ml含2λ內毒素標準品的樣品溶液(稀釋20倍的待測樣品1ml+4λ的內毒素標準品溶液1ml＝2ml含2λ內毒素標準品的稀釋40倍樣品)。樣品管中加入0.1ml樣品，稀釋比例見表4，37±1℃水浴(或培養箱)保溫60±1min；表4內毒素稀釋比例及對應內毒素含量(5)、octs-car-t細胞的內毒素檢測結果(如表5所示)，所有細胞的內毒素含量均小於2.5eu/ml，符合《中華人民共和國藥典》中小於10eu/ml的標準；表5二、支原體檢測；(1)在實驗前三日，細胞樣品用無抗生素培養基進行培養；(2)收集1ml細胞懸浮液(細胞數大於1*105)，置於1.5ml離心管中；(3)13000g離心1min，收集沉澱，棄去培養基；(4)加入500ulpbs用槍頭吹吸或渦旋振蕩，重懸沉澱。13000g離心5min；(5)步驟4重複一次；(6)加入50μlcelllysisbuffer，用槍頭吹吸，充分混勻後,在55℃水浴中孵育20min；(7)將樣品置於95℃中加熱5min；(8)13000g離心5min後，取5μl上清作為模板，25μlpcr反應體系為：ddh206.5μl、mycomix1μl、2xtaqplusmixmaster(dyeplus)12.5μl、模板5μl；pcr循環條件為：95℃30sec，(95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec)*30cycle，72℃5min。(9)支原體檢測結果顯示(如圖8所示)，octs-car-t細胞中均不含支原體。三、octs基因轉導效率檢測及免疫分型檢測；(1)收集經病毒轉導後的t細胞，用含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重懸細胞並調整為1×106/ml。(2)向離心管中加入含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液1ml並混勻，350g離心5min，棄上清。(3)重複步驟2一次。(4)用0.2ml的含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重懸細胞，並向離心管中加入1ul的1mg/ulproteinl，5ulcd4-fitc，5ulcd8-apc，混勻，4℃孵育45min。(5)向離心管中加入1ml含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液並混勻，350g離心5min，棄上清。(6)重複步驟5兩次。(7)用0.2ml含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重懸細胞，並向離心管中加入0.2ulpe-sa，混勻，37℃避光孵育15min。(8)向離心管中加入1ml含1～4％人血白蛋白的d-pbs(-)溶液重並混勻，350g離心5min，棄上清。(9)用1mld-pbs(-)溶液重懸細胞沉澱，350g離心5min，棄上清。(10)重複步驟9兩次。(11)用0.4mld-pbs(-)溶液重懸細胞沉澱，流式細胞儀進行檢測。(12)octs基因轉導效率及免疫分型檢測的檢測結果如圖9所示，製備的octs-car-t細胞的感染效率大多數位於30％～40％之間，cd4陽性細胞和cd8陽性細胞的比例位於1∶3～3∶1之間，可以進行後續功能檢測。實施例3octs-car-t細胞的功能檢測。一、靶細胞殺傷效果評估。(1)分別培養靶細胞[cd19+k562、cd20+k562、cd22+k562、cd30+k562、cd123+k562、cd19+cd123+k562、cd19+cd20+k562、cd19+cd22+k562、cd19+cd30+k562、k562細胞]和效應細胞[octs-car-t細胞]；(2)收集靶細胞4x105cells和octs-car-t細胞2.8x106cells，800g，6min離心，棄上清；(3)用1mld-pbs(-)溶液分別重懸靶細胞和效應細胞，800g，6min離心，棄上清；(4)重複步驟3一次；(5)用700ul培養基(aim-v培養基+1～10％fbs)重懸效應細胞，用2ml培養基(aim-v培養基+1～10％fbs)重懸靶細胞；(6)設置效靶比為1∶1、5∶1、10∶1的實驗孔，效應細胞分別與單靶細胞和雙靶細胞共孵育的分組情況如表6所示，並設置對照組(k562細胞)，每組3個復孔；表6效應細胞靶細胞1靶細胞2靶細胞3octs12319s-car-tcd123+k562cd19+k562cd19+cd123+k562octs2219s-car-tcd22+k562cd19+k562cd19+cd22+k562octs2019s-car-tcd20+k562cd19+k562cd19+cd20+k562octs3019s-car-tcd30+k562cd19+k562cd19+cd30+k562octs12319t-car-tcd123+k562cd19+k562cd19+cd123+k562octs2219t-car-tcd22+k562cd19+k562cd19+cd22+k562octs2019t-car-tcd20+k562cd19+k562cd19+cd20+k562octs3019t-car-tcd30+k562cd19+k562cd19+cd30+k562(7)250g，5min平板離心；(8)37℃，5％co2培養箱中培養4小時；(9)250g，5min平板離心；(10)取每個孔的50ul上清到新96孔板中，並且每孔加入50ul底物溶液(避光操作)；(11)避光孵育25min；(12)每孔加入50ul終止液；(13)酶標儀檢測490nm吸光度；(14)將3個復孔取平均值；將所有實驗孔、靶細胞孔和效應細胞孔的吸光值減去培養基背景吸光值的均值；將靶細胞最大值的吸光值減去體積校正對照吸光值的均值。(15)將步驟14中獲得的經過校正的值帶入下面公式，計算每個效靶比所產生的細胞毒性百分比。結果如圖10所示，octs-car-t對各自的單靶細胞和雙靶細胞均有較好的殺傷效果，turnocts結構的car-t細胞對靶細胞的殺傷效率略高於seriesocts結構的car-t細胞；殺傷效率＝(實驗孔-效應細胞孔-靶細胞孔)/(靶細胞最大孔-靶細胞孔)x100％(16)上述實驗結果表明，通過對傳統car結構中抗原識別區的改造形成的octs結構，能夠顯著提高octs-car-t細胞識別並殺傷靶細胞的範圍，因此octs-car-t細胞將在未來的cd19陽性/cd22陽性/cd20陽性/cd123陽性/cd30陽性/cd19、cd22雙陽性/cd19、cd20雙陽性/cd19、cd123雙陽性/cd19、cd30雙陽性的b淋巴細胞白血病、b淋巴瘤等惡性腫瘤的細胞治療中發揮巨大的作用。序列表上海優卡迪生物醫藥科技有限公司一種基於octs技術的淋系白血病car-t治療載體及其構建方法和應用hj17-1334845patentinversion3.51861dna人工序列1atgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcct60gtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgca120cgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgcccc180gaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcc240cgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttg300gttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaatta360tgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatc420ggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgcctt480gatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatg540cctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagct600tcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgc660tcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtct720cgcggtatcattgcagcactggg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