轉基因動物中生物纖絲的生產的製作方法

2024-02-29 23:14:15

>克隆的基因主要壺膠腺(產生拖絲)次要壺膠腺(產生輔助纖維)鞭毛狀腺(產生膠絲)聚集腺(產生膠絲)圓柱腺(產生繭絲)ADF-1-主要---ADF-2----次要ADF-3主要-次要次要-ADF-4主要----ADF-1的序列(Araneusdiadematus絲心蛋白)是68％聚(A)5(即AAAAA；SEQIDNO:9)或(GA)2-7(SEQIDNO:10)，和32％GGYGQGY(SEQIDNO:11)；ADF-2是19％聚(A)8(SEQIDNO:12)和81％[GGAGQGGY(SEQIDNO:13)和GGQGGQGGYGGLGSQGA(SEQIDNO:14)]；ADF-3是21％ASAAAAAA(SEQIDNO:15)和79％[(GPGQQ)n』其中n=1-8(SEQIDNO:16)和GPGGQGPYGPG(SEQIDNO:17)]；ADF-4是27％SSAAAAAAAA(SEQIDNO:18)和73％[GPGSQGPS(SEQIDNO:19)和GPGGY(SEQIDNO:20)]。本領域熟知的許多方法中的任一種，都可用於用Nephila和Araneus的已知核酸序列克隆額外的生物纖絲編碼基因，且技術人員將對這些方法加以常規利用以獲得所需基因。可類似地分離Nephila和Araneus基因的全長克隆。這種獲得生物纖絲編碼基因序列的方法之一是，用由Nephilaclavipesspidroin1基因序列(Arcidiacono等，應用微生物學生物技術學49:31-38,1998)產生的寡核苷酸探針，去篩選蛛形綱或昆蟲cDNA或基因組DNA文庫以搜索與探針雜交的序列。本領域技術人員熟知雜交技術，並例如由Ausubel等及Sambrookt(如前)所述。製備cDNA或基因組DNA文庫也為本領域技術人員所述。來自各種物種的大量製備cDNA核酸文庫可商購。寡核苷酸探針是用本文所述序列及標準技術很容易地設計的。此寡核苷酸探針可基於編碼spidroin1基因產物的DNA任一鏈的序列。此寡核苷酸探針例如是簡併探針(即編碼N.clavipesspidroin1蛋白的所有可能序列的混合物)。Ⅱ、蜘蛛絲生成及吐絲在蜘蛛腹部特異腺體內產生絲或絲心蛋白單體，並以20-30％濃度保存在腹腔內。當在乾燥下應用張力時，此物質將聚合。由於此絲非常細，乾燥過程迅速，絲由交替的晶體或非晶體區組成。主導晶體是β摺疊片晶體，其與絲纖維的長軸平行排列。在Bombyxmori(蠶)中，形成晶體的結構域是六肽(GAGAGS(SEQIDNO:1))結構域，其與非晶體結構域交替。胺基酸G,A和S組成高於85％的蠶繭絲絲心蛋白。絲的交替Ala或Ser和Gly殘基伸至所給定β片層的相反側，如此伸自一個β片層的Ala側鏈充分貼於那些相鄰片層之間，Gly側鏈也如此。相鄰β片層的Gly側鏈是相接觸的，Ala和Ser的側鏈也如此。結果，片層間間隔的交替值為3.5埃和5.7埃，如對Nephila拖絲的X光衍射研究所測定。此間隔等同於合成的聚L-丙氨酸肽在其β片層構象中的間隔。對Araneusdiadematus拖絲的X射線衍射研究表明有大約7.5埃的較大片層間間隔(Gosline等，生物模擬物材料的設計與加工，PP:237-261,eds.SarikayaandAksay,Amer,Inst.ofPhysics.1995)。在Nephila中，主要壺腹腺(MA腺)產生拖絲。目前克隆的NephilaMA腺產生的基因(spidroin1和spidroin2)的C-末端部分具有以下序列34個胺基酸長的重複基序(形成非晶體結構域和晶體生成結構域)；47個胺基酸長的共有序列(Xu和Lewis,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:7120-7124,1990；BeckwittandArcidiacono,J.Biol.Chem.269:6661-6663,1994)。Nephilaspidroin1的34個胺基酸長的重複基序(形成非晶體結構域和晶體生成結構域)具有以下序列AGQGGYGGLGSQGAGRGGLGGQGAGAAAAAAAGG(SEQIDNO:2)。在SEQIDNO:2的C-末端終端有聚丙氨酸區(AAAAAAA)，以及許多甘氨酸模序形成非晶體結構域(兩個甘氨酸殘基被3個胺基酸分隔；如GGLGG)。Nephilaspidroin2的47個胺基酸長的共有序列具有以下序列CPGGYGPGQQCPGGYGPGQQCPGGYGPGQQGPSGPGSAAAAAAAAAA(SEQIDNO:3)。絲在單獨的腺體內分泌，當對分泌進行剪切力及機械延伸時，聚丙氨酸(生成晶體)區段經過螺旋成為β-片層過渡物，形成β-晶體穩定其結構。甘氨酸模序列被稱為形成非晶體多肽鏈部分，散布在晶體區之中。生物纖絲在具有極特異解剖學適應性變化和基因進化的某些昆蟲和蛛形綱動物中已進化。在蜘蛛中，絲由一系列腹部腺體產生。晶體的形成與大小可依於一級胺基酸序列的組成。大部分絲的產生和分泌發生在主要壺腹腺(MA腺)，鞭毛狀(FL)腺，圓柱(CY)腺中，其分別產生拖絲，膠絲和繭絲。應知本文所述轉基因動物，及用於產生這種動物的構建體，可產生任一這些生物纖絲，或其任何變體，如此產生的生物纖絲片層間間隔在3.5～7.5埃之間。A．拖絲MA腺以3∶2比率產生兩種蛋白質，富含甘氨酸，丙氨酸和脯氨酸。這些蛋白質形成拖絲，其是生命線，支架絲，及蜘蛛網的框架，拖絲是高硬度纖維，並具有類似於尼龍的性質。拖絲含有20-30％(體積)晶體，並具有以下特性堅硬(初始Young’s模數為10GPa)，牢固(抗張強度為1.5GPa)，和堅韌(所需破壞能量為150MJm-3)。B．膠絲由FL腺產生的膠絲形成蜘蛛網的粘性螺旋，目前還未鑑定出編碼膠絲的基因。含有少於5％(體積)晶體的膠絲在其自然狀態下是彈性的，並具有類似於Lycra的性質。其具有以下特性類似於輕度交聯的橡膠(如斯潘德克斯彈性纖維)的機械性，低硬度(初始Young’s模數為3MPa)，和高度可伸展性。C．繭絲CY腺產生繭絲，其類似於由蠶繭(B.mori)產生的繭絲。Ⅲ．生物纖絲基因的合成由於在克隆天然絲基因中遇到難度，合成的基因可被克隆及表達。目前克隆的cDNA序列在完整結構及序列保守區內共同具有相似性。共有重複富含甘氨酸和穀氨酸，聚(Ala)區整合入較大重複單位。為論述之目的，候選基因將由N.clavipes主要拖絲基因之一，spidrion1代表(Arcidiaocono等，微生物生物技術應用49:31-38,1998)。這些基因的高重複性提高了基因的穩定性及重組的可能性。基於例如由Arcidiacono等在應用微生物學生物技術學49:31-38,1998；Fahnestock和Irwin(如前)所提供的建議，此重複可被避免。另外，用相似策略(Fahnestock和Irwin，應用微生物學生物技術學47:23-32,1997)可產生一系列構建體，產生4～20(或更多)個連續重複，並可在轉基因動物產生前在細胞系中測試。構建合成重複的模序，它們具有不同的大小並含有非編碼序列(如酪蛋白或免疫球蛋白基因的內含子)，以促進編碼的生物纖絲的轉錄及增強表達。此模序可用頭-尾構建策略而交替(McGrath,K.P.,博士論文，UniversityofMassachusettsatAmherst,1991；Ferrari等,U.S.P.N.5,243,038)。密碼子選擇也可被設計以使表達最大化，因為如果基因含有較多由細胞中低豐度存在的tRNA物種識別的密碼子則可發生提前終止(Rosenberg等，J.Bacteriol,175？716-722,1993,Manley,J.Mol.Biol,125:406-432,1978)。設計要表達的基因，並用被表達組織中有利的密碼子合成(即乳腺中酪蛋白基因；膀胱中uroplakins)。鑑於生物纖絲蛋白中高頻率的丙氨酸殘基，希望的是用額外的丙氨酸和/或甘氨酸補加細胞系的細胞培養基，以防止AlatRNA和/或GlytRNA集合體在生產生物纖絲蛋白的限速步驟中耗竭。Ⅳ、表達載體組裝可產生真核表達載體，其驅動在轉基因動物的乳汁或尿液中合成和分泌蛋白質(如生物纖絲蛋白)，此動物用編碼這種蛋白的核酸分子轉基因。根據標準分子生物學技術製備這些載體。合成的核酸分子可具有編碼附著的附加表位的序列，以易於鑑別和/或純化編碼的多肽。這種純化可通過如附加表位的親和層析而完成。可在序列中加入位點特異性蛋白酶解或化學試劑，以在已附加表位的多肽純化後促進附加表位的除去(Saitot，生物化學101:123,1987)。優選地，在附加表位與生物纖絲蛋白的連接處或其附近，位點特異性蛋白酶解劑進行裂解。本領域已知許多化學切割劑及其識別位點(以單遼字母密碼表示)，並包括以下所示羥胺(N或G)；甲酸(D或P)，溴化氰(M)；或乙酸(D或P)。例如溴化氰(CNBr)可用於切割在附加表位與生物纖絲蛋白之間導入的Met(M)殘基。或者，可使用天然或合成的蛋白酶。這些酶(及其識別位點)例如包括腸激酶(DDDK；SEQIDNO:5)；因子Xa(IEGR；SEQIDNO:6)；糜蛋白酶(W和Y和F)；腎素(YIHPFHLL；SEQIDNO:7)；胰蛋白酶(R和K)；凝血酶(RGPR；SEQIDNO:8)。例如附加表位可通過凝血酶識別位點附著於生物纖絲。在含有附加表位的蛋白質親和層析純化之後，由於生物纖絲一般對蛋白酶解有抗性，附加表位用凝血酶經蛋白酶切割可輕易除去。表達盒包括在所需真核細胞中適當轉錄，翻譯，及分泌所必需的元件(即啟動子，分泌信號序列，內含子序列及聚腺苷酸化信號)，許多乳汁或尿液特異性啟動子可與其信號序列或與絲和/或絲心蛋白基因信號序列一起使用。在前者情況中，編碼生物纖絲的核酸分子應不含有其自身翻譯起始密碼子，更確切地應與信號序列的3』末端同一讀框。編碼生物纖絲的核酸分子的3』末端可含有其自身聚腺苷酸化信號，或可含有通常在用作啟動子和/或信號序列的基因上發現的3』未翻譯序列。例如編碼生物纖絲的核酸分子可以包括在具有均來自同樣酪蛋白基因的啟動子，信號序列，和3』未翻譯序列的表達載體盒中。所使用的真核表達構建體可包括一或多種以下基本組分。A)轉錄起始調節區的啟動子這些序列可異源於待修飾的細胞，並可包括合成及天然病毒序列(如人巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子；猴病毒40(SV40)早期啟動子；Rous肉瘤病毒(RSV)；或腺病毒主要晚期啟動子)，其賦予它們可操縱連接的核酸分子以強轉錄水平。也可通過非重要序列的缺失，和/或加入序列如增強子(例如增強子元件CMV,SV40或RSV)，或串聯重複這種序列，對啟動子加以修改，加入強增強子元件可將轉錄提高10-100倍。從以上鑑別的病毒啟動子中的表達是組成性的(即在沒有明顯外部刺激下發生表達)。或者，為在乳汁中表達，例如啟動子區可以是反芻動物乳腺特異性基因天然存在的。例如包括αS1-酪蛋白(PCT申請WO91/08216和WO93/25567),αS2-酪蛋白，β-酪蛋白(Rosen,J.M.,U.S.P.N.5,304,489；Lee等，核酸研究16:1027-1041,1988)，k-酪蛋白，β-乳球蛋白，和α-乳白蛋白(Vilotte等,Eur.J.Biochem.186:43-48,1989；PCT申請WO88/01648)。這些啟動子可驅動許多蛋白以組織和哺乳特異性方式高水平表達。B)內含子包涵含有內含子(即基因組克隆)的基因比不含內含子的基因表達水平高。由此，內含子位於轉錄起始位點和翻譯起始密碼子之間位於翻譯終止密碼子的3』，或位於編碼生物纖絲基因的編碼區內，可引起更高水平的表達。內含子序列包括5』剪接位點(供體位點)和3』剪接位點(受體位點)。在這兩個位點之間發現至少100鹼基對的序列。這些內含子序列的起源將衍生自所用啟動子，或衍生白天然基因(Ichimura和Mita,J.Mol.Evol.35:123-130,1992)並位於絲或絲心蛋白基因編碼序列的5』。由於構建體的高重複性提高了基因的穩定性及重複序列重組的可能性問題，它們可通過插入來自使用啟動子的基因的內含子而被破壞。此內含子可以類似於在Bombyxmori的絲心蛋白中存在的方式而定位。(Tsujimoto和Suzuki，細胞18:591-600,1979；Tsujimoto和Suzuki，細胞16:425～436,1979)。此策略除提高基因穩定性外，還提高表達水平。C)信號(前導)序列每個表達載體都將含有信號序列，其引導乳腺或尿道上皮細胞分泌表達的基因產物。此信號序列存在於任何天然分泌的基因中。可使用相關絲心蛋白基因的信號序列(如B.mori重及輕絲心蛋白基因，P25和ssp160)，特異於表達組織的基因的信號序列(如酪蛋白或uroplakin基因)，或一般信號序列(如人鹼性磷酸酶，mellitin和CD33信號肽的信號序列)。另外，用於分泌的信號序列可在哺乳動物/昆蟲基因之間互換；例如可使用mellitin，酪蛋白的信號序列，或天然絲(來自蛛形綱動物)或絲心蛋白(來自昆蟲)基因的序列。D)終止區核酸構建物的轉錄終止區可含有衍生5』啟動子區的基因的3』末端和聚腺苷酸化信號。例如，牛αS1酪蛋白基因。或者，核酸構建物的3』末端將包含轉錄終止和聚腺苷酸化信號，已知其調節轉錄後mRNA穩定性，如那些衍生自牛生長激素，β-球蛋白基因或SV40早期區的轉錄終止和聚腺苷酸化信號。E)表達載體的其它特徵為轉移基因而設計的表達載體還包含一為在E-coli中增殖的複製起點，SV40複製起點，氨苄青黴素抗性基因，為在真核細胞中選擇的新黴素抗性基因，和/或擴增顯性可選擇標記的基因(即二氫葉酸還原酶基因)，加上相應基因。另外，表達載體在其5』和3』末端可含有適當側翼序列，其增強轉導細胞中整合率(ITR序列Lebkowski等，Mol,Cell,Biol,8:3988-3996,1988)。另外，通過使用自主複製序列(轉導的，環形核酸在哺乳動物中作為質粒複製)(即，Epstein-Barr病毒的EBNA-1和oriP)，可達到體外絲或絲心蛋白的延長表達。為克隆與增殖DNA的大區段，選擇粘粒載體。儘管質粒載體在理論上可攜帶大插入體，但所得重組子轉化E-coli非常低效。粘粒具有增殖大外源DNA片段的能力(Royal等，自然279:125,1979)。用於生產轉基因動物的表達載體可在轉化細胞之前，通過限制性內切核酸酶消化而線性化。在此方法的一種變化方案中，只有例如來自牛酪蛋白或生長激素序列的包括編碼5』末端調節序列(如啟動子)和3』末端調節序列(如3』未翻譯區)的消化片段，將用於轉化細胞。因此，用這種片段轉化的細胞將不含有任何只為質粒在細菌中增殖所必需的序列(如，細胞不含E.coli複製起點，或編碼用於選擇原核細胞的抗生素抗性蛋白(如氨苄青黴素抗性蛋白)的核酸分子。在此方法的另一種變化方案中，用於轉化細胞的消化片段將包括編碼區，5』和3』調節序列，和編碼能授與抗生素(如新黴素或嘌呤黴素)抗性用於選擇真核細胞的蛋白質的核酸分子(包括啟動子和3』未翻譯區)。對相應的生物纖絲基因的5』未翻譯區(VTR)，其3』UTR，和/或其編碼N-末端區可做修飾，以更優選地改進表達。或者，可使編碼生物纖絲的核酸分子的編碼序列內的序列缺失或突變，以由於例如存在內質網(ER)保留信號或其它分選抑制信號而在細胞內提高基因產物的分泌和/或避免基因產物的保留。另外，轉基因構建體可含有具有染色質開放區活性的序列，如此它們授與連鎖的轉基因的組織特異性表達可重複活化。(Ellis等，PCT申請WO95/33841；Chung和Felsenfield,PCT申請WO96/04390)。Ⅴ、表達載體的測試與定性裝配的構建體通過對二種DNA通過連接而融合在一起的區域測序而部分定性。部分限制酶譜將提供關於編碼生物纖絲核酸分子的連接的調節序列的正確方向的信息。裝配的構建體的其它功能鑑定包括將其轉染入建立的乳腺上皮細胞系(如MAC-Ts)(見Turner和Huyrh,U.S.P.N.5,227,301；Huynh等，Exp.Cell.Res.197:191-199,1991；Stampter等,U.S.P.N.4,423,145)，和鑑別分泌產物。用於本發明的重組DNA法是分子生物學領域技術人員熟知的標準步驟，並例如由Sambrook,Fritsch和Maniatis，在分子克隆實驗手冊(2nded),ColdSpringHarborPress,1989；Ausubel等在分子生物學通用方案，JohnWileySons,NewYork,NY,1994；和Perbal,B.V.,分子克隆實用指南(2nded)JohnWileySons,NewYork,NY,1988中所述。只為闡述之目的，以下實施例所用生物纖絲基因是由Arcidiaconot等在應用微生物學生物技術學49:31-38,1998中闡述並克隆的1.5kbNcDS-1插入體。以下實施例以舉例說明而非限制本發明。實施例1酪蛋白啟動子在以下實施例中，構建物的設計包括在酪蛋白基因5』和3』末端同一讀框中使用山羊β-酪蛋白啟動子(Ebert，生物/技術12:699-701,1993)，後接其自身表達信號序列，後接含絲克隆的1.5kb插入體(Arcidiancono等，如前)。此構建體的模式圖如圖1A所示。將編碼生物纖絲的核酸分子(如絲或絲心蛋白基因，或其片段)融入酪蛋白啟動子，並通過來自衍生啟動子的基因或被表達的生物纖絲核酸分子的信號序列驅動生物纖絲蛋白的分泌。終止序列可衍生自生物纖絲基因自身，或衍生自啟動子基因。另外，可產生一雜合基因以提高表達水平。為此，可將絲或絲心蛋白基因(或其片段)插入山羊β-酪蛋白基因(Ebert等，生物/技術12:699-701,1993)的外顯子2(ATG的上遊)和外顯子7(終止密碼子的下遊)之間。由於構建體的高重複性導致了基因的穩定性和重複序列的重組可能性的問題，通過插入酪蛋白的內含子(內含子3-7)將它們中斷。由於終構建體的大規格，載體的構建可在粘粒載體(supercos)中進行，或質粒的骨架可由含有在E.coli宿主(Sambrook等，如前)擴增所必需序列的任何已知細菌載體(優選接受大規格DNA的載體)組成。實施例2乳清酸性蛋白(WAP)構建體本實施例說明了雜合基因的產生，此雜合基因由WAP基因啟動子，其信號序列，1.5kb編碼拖絲的cDNA(Arcidiacono等，文獻如前)，後接WAP基因的3』末端(Velander等，美國科學院院刊89:12003-12007,1992)組成。其構建詳細過程參見以下描述和圖1B。乳清酸性蛋白(WAP)是嚙齒類動物中的主要乳清蛋白，其在妊娠後期和哺乳期僅在乳腺中高水平表達(Hobbs等，J.Biol.Chem.257:3598-3605,1982)。基因組鼠WAP基因由2.6kbp(千鹼基對)的5』側翼啟動子序列，3.0kbp編碼序列(外顯子和內含子)，和16kbp3』側翼DNA組成(見圖1B)(Velander等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:12003-12007,1992；Velander等，Ann.N.Y,AcadSci.665-391-403.1992)。在一實施例中，可構建由WAP基因啟動子和編碼拖絲的cDNA組成的雜合基因。通過將相應基因或核酸分子(此例為編碼拖絲的cDNA)插入鼠WAP啟動子和在5』末端的5』序列(核苷酸位-949～+33)，及在3』末端的WAP3』序列(843bp；部分外顯子3，後30個鹼基及所有內含子C，外顯子4，和70bp的3』UTR)之間，產生雜合的編碼拖絲基因(Campbell等，核酸研究12:8685～8697,1984)。在此實施例中，信號序列來自天然絲基因。還可使用包括5』末端額外56bp的WAP基因信號序列(-949～+89位)。在另一實施例中，通過插入編碼鼠WAP基因的部分5』非翻譯區和19個胺基酸信號序列(Hennighausen等，核酸研究10:3733-3744,1982)的核苷酸序列(核苷酸+1～+90)，並通過用含有編碼側翼為KpnJ限制酶識別位點的信號序列的90bp(鹼基對)序列的引物，擴增1.5kb(千鹼基)絲蛋白基因(NsDS-1；Arcidiacono等，文獻如前)，而產生雜合基因。進行擴增以保持正確讀框，3′引物在基因3』末端產生KpnI限制酶識別位點。然後在WAP第一個外顯子的KpnI位點插入此PCR產物。此雜合基因可用EcoRI限制酶經消化而從載體切下(見圖1B)，並純化以微注射。實施例3Uroplakin啟動子在這些試驗中，uroplakinⅡ啟動子(Lin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92:679-683,1995；Sun,T.,PCT申請WO96/39494)用於驅動轉基因動物尿道上皮中絲心蛋白或絲蛋白基因的表達。將絲心蛋白或絲蛋白基因插入鼠uroplakinⅡ(UPⅡ)基因的3.6kb5』側翼序列(Lin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92:679-683,1995)的下遊。將含有鼠精蛋白-1(Mp-1)基因的部分外顯子1和所有內含子1和外顯子2的序列，置於基因的3』末端，以提供外顯子/內含子剪接位點和聚腺苷酸化信號。也可通過在外顯子3的59位胺基酸讀框中，插入編碼絲或絲心蛋白的基因或其片段(僅成熟蛋白)，而使用uroplakinⅡ基因的信號序列。此構建體如圖1C所示。實施例4DNA改組(shuffling)產生編碼生物纖絲基因盒的另一方法是通過DNA改組。DNA改組是一種重組和突變法，其通過隨機片段化相關基因的集合體，隨後再通過無引物PCR將片段再裝配而進行(Stemmer,W.P.,自然370:389～391,1994；Stemmer,W.P.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91:10747-10751,1994)。DNA改組的目的是使基因的功能最佳化，而不用首先測定哪種基因產物是速率限制的。基因可自身「改組」或來自不同物種(即spidroin1和2及ADF1-4)。另外，一個物種內的不同重複(如ADF3的GGAGQGGY(SEQIDNO:4))可被「改組」(例如用ADF1,2和4的重複)，並表達以測定產生有利特徵的組合。除點突變之處，應用許多突變機制如多核苷酸缺失，插入，和倒位以及整合與切除可產生多樣性。一旦由此產生了多樣性，可將編碼生物纖絲的核酸分子插入在乳汁或尿液中分泌的表達盒中，並用於轉化哺乳動物細胞。實施例5表達二個基因的構建體為表達二種基因(如拖絲由ADF3和4按比例組成)，可產生二個分離的構建體，或將二個基因克隆入具有間插核糖體進入位點(IRES)插入體的相同表達盒中(Jang等,J.Virol.62:2636-2643,1988)。將二個基因克隆入相同表達盒的優點是只需一個構建體就可以產生轉基因動物。實施例6嵌合或雜合生物纖絲的合成合成嵌合分子，其包括與膠原或原纖蛋白的一或多個結構域同框的絲的融合體(含有晶體或非晶體結構域)，這可提高交聯，穩定性或彈性。這種嵌合體特別用作外科生物材料。實施例7乳腺上皮或尿道上皮細胞系中生物纖絲的產生在同源的生物學相關細胞培養系統中，產生本發明編碼生物纖絲的合成的核酸分子。在對轉基因動物的研究開始之前，合成基因的遺傳穩定性，分泌能力，及產生的生物纖絲的性質可非常有效地評估。根據標準技術(參見Ausubel等，文獻如前)，用各自質粒轉染乳腺上皮及產尿細胞系(如將含有乳汁特異性啟動子的表達構建體轉染乳腺上皮細胞)。在一實施例中，為證實產生的蜘蛛絲的分泌，從穩定細胞系(分化24-96小時後的乳腺上皮細胞)中收穫培養基，並經SDS-PAGE解離，用抗蜘蛛絲抗體(商購自Monsanto,St.Louis.MO)，或用抗具有同源於SEQIDNOS:1-4的序列的肽的抗體進行Western印跡分析。在MAC-Ts中表達和分泌可溶的ADF-3單體或亞單位進行以下處理以在MAC-T細胞中表達和分泌ADF-3。用構建體特異性引物(引物1CGTACGAAGCTTACGCACGAGCCGGATCTG，引物2ATTAACTCGAGCAGCAAGGGCTTGAGCTACAGA)，經PCR擴增ADF-3的2.0kbcDNA克隆(Guerette等，1996，科學vol.272；112)。然後將PCR產物用SfiI和XhoI限制，並與哺乳動物表達載體pSecTag(Invitrogen；圖1)連接，該載體也用SfiⅠ和XhoⅠ限制。此表達載體含有一強啟動子(CMV，巨細胞病毒)，一信號序列(鼠Ig-kappa)和在構建體3』末端的「TAG」(myc和His序列)。由SV40啟動子驅動的潮黴素B抗性基因存在於構建體的骨架中。表達自pSecTag的蛋白在N末端融合用於蛋白質分泌鼠Ig-kappa鏈前導序列，在C-末端融合用於檢測及純化的含c-myc表位及6個串聯組氨酸殘基的肽。通過脂轉染將表達構建體(pSecTag/ADF-3)轉染入MAC-T(乳腺上皮細胞，專利號5,227,301)，並用「TAG」特異性抗體(抗myc抗體，Invitrogen)測試條件培養基中ADF-3存在與否。簡而言之，將牛乳腺上皮細胞以5×105個細胞/100mm盤的密度種植。在第二天，將細胞用pSecTag/ADF-3質粒，或用不含ADF-3cDNA的對照載體轉染。將10μg的質粒DNA稀釋入0.25mlDMEM中，並與等體積的脂轉染胺(0.25mlDMEM中20μg脂質)混合。將混合物旋轉10秒鐘，並在室溫下30分鐘以形成複合物。用DMEM將體積增至4ml，將脂質-DNA混合物施用於細胞，並在37℃培養16-20小時。然後將細胞在含10％FCS和5μg/ml胰島素的新鮮培養基中再培養24小時。隨後，在含50μg/ml潮黴素B的相同培養基中選擇細胞。14天後分離抗性克隆。在無血清培養基中培養24小時後，從MAC-T/ADF-3轉染物中收穫條件培養基，與Ni-NTi瓊脂糖珠(Qiagen)保溫，其選擇性地結合於在蛋白質COOH端的(His)6』並從培養基中純化蛋白質。將洗脫自瓊脂糖珠的蛋白質物質加樣於10％SDS-PAGE凝膠，電泳，轉移至硝基纖維素膜上，並用單克隆抗myc抗體(1∶5000稀釋度)印跡。結果用pSecTag/ADF-3轉染的MAC-T培養基的Western印跡分析揭示存在與myc抗體強交叉反應的條帶，正好遷移在78KDa分子量的標記之下。這是ADF-3融合蛋白的期望大小(677a；60.8KDa)。myc抗體的應用也揭示了用myc表位標記的陽性對照蛋白質(陽性對照；2泳道)期望大小條帶在～40KDa。未交叉反應條帶如期在用作陰性對照(3泳道)的攜帶載體(pSecTag)的細胞的培養基的泳道中觀測到。大規模生產可溶的ADF-3亞單位為生產重組ADF-3蛋白質，將上述實施例1穩定細胞系通過Western分析篩選最高表達子。選擇最高表達子克隆並用於接種二個中空纖維生物反應器。一個是0.5m2中空纖維反應器，另一個是具有3.25m2反應器的Cell-PharmSystem2000。簡而言之，將含70％鋪滿率MAC-T/ADF-3細胞的102三聯燒瓶胰蛋白酶化，並用於接種3.25m2反應器(8×108個細胞)。以相似方式但用2×108個細胞接種0.5m2反應器。通過Western印跡分析5μl體積的培養基並示出存在ADF-3蛋白條帶，我們已示出在每天連續從0.5m2反應器收穫的物質中ADF-3的產生與分泌稠度。這些培養基可用於純化至少mg量的可溶亞單位。用Ni-NTA柱從細胞培養基中純化ADF-3蛋白質親和純化將衍生自分泌ADF-3物質的MAC-T細胞的培養基，通過在BioRadBiologicLP機器上的Ni-NTASuplerflow樹脂純化。簡而言之，將培養基結合於柱上以捕捉ADF-3蛋白質。用緩衝液A(Tris-HCl50mMpH8.0和NaCl0.3M)衝洗此樹脂。用另加入250mM或100mM咪唑的緩衝液A洗脫結合蛋白質。純化的ADF-3物質的鑑定銀染色將洗脫自Ni-NTA柱的蛋白質組分在4～20％Tris-甘氨酸凝膠(Novex)上分離，並隨後用衍生自Merril等(1981)的方法的Bio-Rad銀染試劑盒染色。通過混合1μg此物質與12M尿素至終濃度為6M，及含10％β-疏基乙醇的加樣緩衝液，在加樣之前在95℃加熱5分鐘。分子量為～61KDa的ADF-3純化物純度為80％以上。Western印跡通過在8～16％Tris-甘氨酸凝膠(Novex)上分離洗脫自親和柱的物質，隨後經電轉移至HybondECL硝基纖維素膜(Amersham)，並與抗myc肽的單克隆抗體(1/5000稀釋度；Invitrogen,cat.no.R950-25)反應，以進行Western印跡分析。用與辣根過氧化物酶(HRP)綴合的抗鼠IgG顯示免疫複合物。具有分子量為～61KDa的強交叉反應條帶顯而易見。這與由ADF-3的cDNA序列推導的分子量相一致。實施例Ⅴ由乳汁特異啟動子鼠乳清酸性蛋白(WAP)驅動的ADF-3的表達使ADF-3乳汁特異表達的表達載體已經被構建。此表達由乳清酸性啟動子(WAP,4.4KB；Dr.L.Henninghausen)驅動。此表達盒還包括絕緣子元件的二個拷貝(來自雞β球蛋白基因座；自然1990,Vol.348pg.749；)。為產生表達載體，進行以下步驟步驟1絕緣子序列的PCR擴增用絕緣子特異引物(引物1TTTTGCGGCCGCTCTAGACTCGAGGGGACAGCCCCCCCCCAAAG，引物2TTTTGGATCCGTCGACGCCCCATCCTCACTGACTCCGTCCTGGAGTTG)，經雞DNA的PCR擴增，衍生絕緣子片段。將PCR產物在二個獨立反應中加以限制，一是用NotⅠ和XhoⅠ，另一是用BamHⅠ和SalⅠ。然後將此二個限制的片段連接一起，產生在每個末端具有NotⅠ和BamHⅠ位點的2kb絕緣子片段。步驟2WAP3』非編碼序列的PCR擴增用鼠DNA及以下引物將WAP3』末端進行PCR擴增引物1TTTCTGATAACCCTTCAGTGAGCAGCCGGC；引物2AATTGGTACCAGCGGCCGCTCTAGAGGAACTGAAGCAGAGACCATGC。然後將PCR產物用PmeⅠ和NotⅠ加以限制。步驟3連接WAP4.4kb啟動子序列與絕緣子片段將bluescript質粒中4.4kbWAP啟動子用SacⅡ和NotⅠ限制，並插入接頭(引物1ggactagttgatcagcggccgctataggatcc；引物2ggcctggatcctatagcggccgctgatcaactagtccgc)，產生具有4.4kbWAP啟動子及額外限制位點(SacⅡ,SpeⅠ,BclⅠ,NotⅠ和BamHⅠ)的載體。然後將此新載體用NotⅠ和BamHⅠ限制，並與絕緣子片段(見步驟1)連接。步驟4連接WAP3』非編碼序列與ADF-3序列將bluescript載體用KpnⅠ和SacⅡ限制，並插入接頭(引物1ggacgcggtgttaacgatatctctagagcggccgct，引物2ccggagcggccgctctagagatatcgttaacaccggtccgc)，以產生額外的限制位點(KpnⅠ,NotⅠ,XbaⅠ,EcoRⅤ,HpaⅠ,AgeⅠ,和SacⅡ)。然後將此載體用EcoRV限制，並將ADF-3片段(圖1，用NcoI限制的pSecTag/ADF-3)進行平端化，並連於此載體。隨後將新載體用PmeⅠ和NotⅠ限制，並插入1.6kb3』WAP基因的PCR產物(見步驟2)。然後將此載體用SacⅡ和AgeⅠ限制，以線性化ADF-3基因的上遊，與含絕緣子和WAP啟動子的6.8kb片段連接在一起，此6.8kb片段是通過用SacⅡ和AgeⅠ限制步驟3的載體而產生的。最終構建體含有二聚化的雞β球蛋白絕緣子，後接WAP4.4kb啟動子，ADF-3基因和WAPl.6kb3』非編碼區(pWAP/ADF-3)。通過轉染及在HCll細胞(鼠乳腺上皮細胞)中誘導，已示出此構建體的功能。簡而言之，將HCll細胞以5×105個細胞/100mm培養盤的密度種植。在第二天，用WAP/ADF-3質粒或用無ADF-3cDNA的載體轉染此細胞。將10μgWAP/ADF-3質粒DNA稀釋入0.25mlDMEM中，並與等體積的脂轉染胺(0.25mlDMEM中20μg脂質)混合。將此混合物旋轉10秒鐘，並在室溫下30分鐘以形成複合物。用DMEM將體積增至4ml，並將此脂質-DNA施用於細胞，並在37℃培養16～20小時。然後將細胞在含10％FCDS和5μg/ml胰島素和10ng/ml鼠EGF的新鮮培養基(培養基A)中再培養24小時。隨後，在含50μg/ml潮黴素B的相同培養基中選擇細胞。7天後集合抗性克隆。為從WAP啟動子中誘導表達，細胞需分化。接著進行以下步驟。將細胞的穩定集合以3×105個細胞/6孔培養盤的密度鋪板於覆蓋一薄層matrigel的培養盤中。在培養基A中達到鋪滿度後(2天後)，通過從培養基中移出EGF將細胞引發，並在48小時後向培養基中加入催乳素(即0.1μM地塞米松和1μg/ml綿羊泌乳刺激素)。48小時後，移出激素處理的培養基，用Ni-NTA瓊脂糖珠(Qiafen)保溫，此珠選擇性地與蛋白質COOH末端的(His)6結合，並從培養基中純化蛋白質。將洗脫自瓊脂糖珠的蛋白質物質加樣於8～16％Tris-甘氨酸凝膠(NOVEX)上，電泳，轉移至硝基纖維素膜上，並用單克隆抗myc抗體(1∶5000稀釋液)印跡。將所有試驗以一式三份進行。作為對照，相似孔在沒有催乳素的相同條件下培養。另外，將用無ADF-3的WAP載體轉染的細胞用作陰性對照。催乳素的存在刺激ADF-3在matrigel上從WAP啟動子表達，並增進乳腺特異表達盒的功能。陰性對照組如期觀測到無交叉反應條帶。實施例8．產生在乳汁或尿中表達生物纖絲的轉基因動物WAP/ADF-3轉基因小鼠的產生根據標準技術，將上述構建體用於產生轉基因小鼠。經PCR分析7隻創始者(3隻雌性，4隻雄性)被鑑別為陽性。用AmersharmPharmaliaReady-to-GoPCR珠，將10μl每種引物(引物1GTTGTATCGGCCCTGGTATCTAT，引物2ATGTTCTCTCTGGATCCAGGAGTGAGAGG)以1μM濃度與5μ1DNA(含100ng)混合，並置於模塊溫度為10℃的PCR機上。在每個試管中加入一個Ready-to-GoPCR珠，將試管蓋帽並開始循環、，循環如下步驟l95℃10秒鐘；步驟260℃30秒鐘；步驟372℃30秒鐘；步驟4重複步驟1～3,34個循環。步驟572℃7分鐘。步驟64℃。在PCR循環末期，將樣本在2％瓊脂糖凝膠上電泳，分析309bpPCR產物的存在與否。在一些轉基因方法中，將轉基因導入受精卵細胞的前核中。對一些動物如小鼠而言。受精是在體內進行的，且受精卵是經外科手術取出的。在其它動物中，卵細胞可移自活的或剛剛死去(如屠宰場)的動物，並體外受精。一般通過微注射(Ogata等，U.S.P.N.4,873,292)導入轉基因。將微注射的受精卵轉移至適當雌性動物，當轉基因是整合的時，依於發育時期，得到轉基因或嵌合動物。嵌合動物可被繁殖以形成真正種系轉基因動物。或者，轉基因可被導入胚胎幹細胞(ES細胞)。可通過電穿孔，微注射，或任何其它本領域已知轉染細胞的技術，將轉基因導入這種細胞中。將轉化的細胞與其所起源的動物的胚泡組合。此細胞定居胚胎，且在一些胚胎中，這些細胞形成所得嵌合動物的種系(Jaenisch,R,科學240:1468-1474,1988)。或者，ES細胞可用作核源，以移植入去核的受精卵，這樣產生轉基因動物。乳汁中生物纖絲的產生在一實施例中，將蜘蛛絲基因亞克隆入含有酪蛋白基因啟動子的表達載體中，由此蜘蛛絲基因的表達由酪蛋白基因啟動子控制。這種表達載體之一是基於Rosen,J.M.(U.S.P.N.5,304,489)及Meade和Lonberg(U.S.P.N.4,873,316)所述載體的酪蛋白表達載體。在另一實施例中，將WAP/絲蛋白基因雜合片段(EcoRⅠ)片段，如實施例2所述)純化，並微注射入受精小鼠卵細胞中，其然後被植入養母中。根據本領域熟知方法，通過對尾DNA(分離自尾組織的DNA)的Southem印跡分析，鑑定WAP/絲基因的存在。然後將陽性創始動物回交，以產生用於研究轉基因表達的半合動物。尿中生物纖絲的產生蜘蛛絲基因，例如可被亞克隆入表達載體中，由此蜘蛛絲基因在uroplakin啟動子的轉錄控制下(Lin等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:679,1995)。尿液具有附加優勢，即其PH值及鹽組分可通過摻入某些組分而被調節，可影響在最天然結構中絲的形成。實施例9在乳汁及尿液中均產生生物纖絲的「雙轉基因」動物的產生可產生在其尿液和乳汁中均產生生物纖絲蛋白(如蜘蛛絲)的轉基因動物。構建這種動物的一種方法是用二種構建體轉化動物胚胎細胞，一構建體中，編碼生物纖絲的核酸分子的表達由一能從產乳細胞中表達和分泌生物纖絲的啟動子驅動；另一構建體中，編碼生物纖絲的核酸分子的表達由另一啟動子引導，此啟動子能從產尿細胞中表達和分泌生物纖絲。在此方法中，將雙轉化的細胞用於產生轉基因動物。這樣，用兩種核酸片段微注射(或共微注射)哺乳動物(如反芻動物)受精卵一種片段在乳汁啟動子控制下表達生物纖絲蛋白，另一種片段在尿液特異啟動子影響下表達生物纖絲蛋白。所產生的轉基因動物將在其乳汁及尿液中均分泌/產生生物纖絲。這將提高每單位轉基因動物生產生物纖絲的總產量。生產這種在其乳汁和尿液中均能產生生物纖絲的動物的第二種方法是分別產生攜帶能在產乳細胞中表達和分泌生物纖絲的構建體的胚胎幹細胞，和攜帶能在產尿細胞中表達和分泌生物纖絲的構建體的胚胎幹細胞。然後將此二種轉化的ES細胞與起源它們的動物的胚泡組合，以產生嵌合動物，然後可將其繁殖至純合性。這類雙表達的動物有許多優點。首先，兩種性別的動物從其出生即持續在其尿中生產生物纖絲，且雌性動物然後在成熟後哺乳時，在其乳汁中還能生產生物纖絲蛋白。其次，由任何單獨雌性動物生產的生物纖絲的數量，根據生物纖絲變化所需，可提高(通過誘導哺乳)或降低(不誘導哺乳)。實施例10共表達且可從二單體中裝配生物纖絲蛋白的轉基因動物的產生可生產一種轉基因動物，其產生二種蛋白質，這二種蛋白質均為在其乳汁，尿液或二者中正確裝配生物纖絲蛋白之所需。例如，Araneusdiadematies拖絲由ADF3和4組成。構建這種動物的一種方法是用二種構建體轉化動物胚胎細胞，每個構建體表達兩種蛋白之一。這些蛋白質可在尿液或乳汁，或二者中表達。另一種方法可應用實施例5中所述的編碼多順信息的構建體。此構建體可在乳汁，尿液或二者中分泌其產物。一旦在相同液體中存在二種蛋白(即均在乳汁中或均在尿液中)，可將它們正確裝配並純化。權利要求1.一種核酸分子，包括(ⅰ)編碼生物纖絲的核酸序列，(ⅱ)在產乳細胞或產尿細胞中指導多肽表達的啟動子，所述啟動子可操縱地與所述序列連接，及(ⅲ)前導序列，其使得能通過所述產乳或產尿細胞分別在哺乳動物乳汁或尿液中分泌所述生物纖絲。2.哺乳動物胚胎，其細胞核包括權利要求1的核酸分子。3.一種雌性哺乳動物，其中所述雌性哺乳動物乳腺組織的基因組包括權利要求1的核酸分子，其中所述啟動子是產乳細胞特異的。4.權利要求3的哺乳動物，其中所述哺乳動物選自齧齒動物，反芻動物，及山羊。5.一種動物，其中在所述動物中產生尿液的細胞的基因組包括權利要求1的核酸分子，其中所述啟動子是產尿細胞特異的。6.權利要求5的動物，其中所述動物是哺乳動物。7.權利要求1的核酸分子，其中所述生物纖絲是蜘蛛絲。8.權利要求7的核酸分子，其中所述蜘蛛絲是拖絲。9.權利要求1的核酸分子，當分泌物經剪切力作用及機械延伸而進行分泌時，所述生物纖絲具有多丙氨酸區段，其螺旋為β片層過渡物，所述過渡物形成β-結晶，穩定所述生物纖絲的結構。10.權利要求1的核酸分子，其中所述生物纖絲具有一非晶體結構域，形成β-摺疊片，由此β片層間間隔在3和8埃之間。11.權利要求1的核酸分子，其中所述生物纖絲具有包括非晶體結構域和晶體形成結構域的C末端胺基酸基序，所述基序具有至少50％相同於SEQIDNO:2的序列。12.權利要求1的核酸分子，其中所述生物纖絲具有至少50％相同於SEQIDNO:3的共有序列。13.一種生產生物纖絲的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供一種用編碼生物纖絲的核酸分子轉染的胚胎細胞，其表達所述生物纖絲並引起所述生物纖絲從衍生自所述轉染的胚胎細胞的細胞中分泌；(b)培養所述胚胎細胞，以產生一種含有生物纖絲表達和分泌細胞的動物；(c)從所述動物的生物纖絲表達和分泌細胞中分離所述生物纖絲。14.一種生產生物纖絲的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供一種用核酸分子轉染的動物細胞，此核酸分子包含(ⅰ)編碼生物纖絲的核酸序列，(ⅱ)在動物細胞中指導多肽表達的啟動子，(ⅲ)能導致通過所述細胞分泌所述生物纖絲的前導序列；(b)培養所述轉染的細胞；(c)從所述培養的轉染細胞的培養基中分離所述生物纖絲。15.權利要求13或14的方法，其中所述生物纖絲是蜘蛛絲。16.權利要求15的方法，其中所述蜘蛛絲是拖絲。17.權利要求13或14的方法，其中當分泌物經剪切力作用及機械延伸而進行分泌時，所述生物纖絲具有多丙氨酸區段，其螺旋為β片層過渡物，所述過渡物形成β-結晶，穩定所述生物纖絲的結構。18.權利要求13或14的方法，其中所述生物纖絲具有形成β摺疊片的非晶體結構域，由此，β片層間間隔在3和8埃之間。19.權利要求13或14的方法，其中所述生物纖絲具有包括非晶體結構域和晶體形成結構域的C末端胺基酸基序，所述基序具有至少50％相同於SEQIDNO:2的序列。20.權利要求13或14的方法，其中所述生物纖絲具有至少50％相同於SEQIDNO:3的共有序列。21.權利要求13或14的方法，其中所述動物是哺乳動物。全文摘要本發明公開了用轉基因動物和轉基因細胞重組生產生物纖絲如蜘蛛絲或昆蟲絲心蛋白的方法,所述轉基因動物在其乳汁和/或尿液中分泌生物纖絲,所述轉基因細胞將生物纖絲分泌入培養基。這種方法可用於生產大量生物纖絲材料。本發明還公開了用於產生如此轉基因動物的核酸分子。文檔編號C07K14/435GK1301299SQ99806291公開日2001年6月27日申請日期1999年3月12日優先權日1998年3月17日發明者科斯塔斯·N·卡拉察斯,傑弗裡·D·特納,安圖拉-拉扎瑞斯·卡拉察斯申請人:耐克西亞生物技術公司