新型生理物質nesfatin及其相關物質、以及它們的用途的製作方法

2023-05-20 03:17:01 2

專利名稱：新型生理物質nesfatin及其相關物質、以及它們的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及得到與攝食調節和/或體重調節相關的因子的新方法。本 發明還涉及由該方法得到的與攝食調節和/或體重調節相關的多肽、編碼 該多肽的核酸分子、以及使用它們進行的與攝食抑制和/或體重增加抑制 相關的疾病的治療、預防、診斷方法。本發明又涉及使用抑制該多肽或 基因的作用的物質進行與食慾亢進和/或體重增加亢進相關的疾病的治 療、預防、診斷的方法。本發明又涉及由抑制該多肽、該基因或它們的 活性的物質得到的與攝食調節和/或體重調節相關的疾病的動物模型、以 及利用該動物模型進行的調節該多肽的作用或表達的化合物的篩選方 法。本發明又涉及通過該篩選方法篩選的化合物、以及利用該化合物的 疾病的診斷方法、治療劑。
背景技術：
肥胖是指體重、特別是白色脂肪組織過剩的狀態，通常根據身體質 量指數(Body Mass Index, BMI) >25 kg/m2進行分類，也可以根據體 脂肪率、即成年男性為25%以上、成年女性為30%以上進行分類。現代 社會中，以高脂肪飲食為中心的飲食生活或運動不足使得分類為肥胖的 人的比例日益增加。2000年日本厚生勞動省進行的國民營養調查結果 中，在對男性的十年和二十年比較中，分類為肥胖的人確實增加，在40 歲-69歲人口中，約30%的人被分類為肥胖。女性中，在60歲-69歲 中的約30%被分類為肥胖。
過去只是將肥胖作為美容方面的問題考慮，但是現在比起肥胖本 身，與其相伴隨的(可伴隨的)的健康障礙成為臨床上的很大問題，成 為肥胖的預防或治療的醫學根據。鑑於上述狀況，日本肥胖學會將肥胖 症定義為"並發起因於肥胖或與肥胖相關的健康障礙，或者臨床上可預 測該並發，醫學上必須進行減量的病態"，提倡將其作為疾病處理。這 裡所述的健康障礙除了 II型糖尿病或糖耐量異常之外，還包括高血壓、 高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心腦血管疾病、睡眠呼吸暫停症候群、 變形性關節病等整形外科疾病、月經異常等(松澤佑次日本臨床抹式會社曰本臨床社發行2003年7月28日61巻增刊號6"月巴満症"5 - 8頁)。 起因於肥胖的疾病還有惡性肺瘤，特別有報告指出肥胖與乳癌、子宮 癌、結腸癌、腎癌、食道癌、胰癌、肝癌、膽嚢癌的發病有關，是危險 因素(松澤佑次日本臨床抹式會社日本臨床社發行2003年7月28日61 巻增刊號6 "肥満症"5 - 8頁;Abu - Abid等,Journal of medicine (美 國)2002年l月1日33巻1-4號，73 - 86頁；以及Nair等Hepatology (美國)2002年7月1日36巻1號150 - 155頁)。並且近年來有人 提出一種被稱為代謝症候群的、使動脈硬化性疾病(心肌梗塞、腦梗塞 等)的危險性提高的複合型危險症候群，在日本，腦血管障礙、心血管 障礙佔總死亡率的30%,這也受到了人們的重視。因此，日本肥胖學會、 曰本動脈硬化學會、日本糖尿病學會、日本高血壓學會、日本循環器官 學會、日本腎臟學會、日本血栓止血學會、日本內科學會聯合規定了其 診斷標準，於2005年4月8日在日本內科學會舉行記者會，發表了該 標準。根據該標準，內臟肥胖(內臟脂肪蓄積)佔據危險的中心，除了 男性腰圍為85cm以上、女性90cm以上之外，具有血清脂質異常(甘 油三酯值為150 mg/dL以上、HDL膽固醇值低於40 mg/dL的任意一方 或兩方)、血壓高值(收縮期血壓130 mmHg以上、舒張期血壓為85 mmHg 其中一方或兩方)、高血糖(空腹時血糖值為110mg/dL以上)中的兩 種以上的危險時，則診斷為代謝症候群(日本內科學會雜誌代謝症候群 診斷標準檢討委員會2005年4月號94巻794 - 809頁)。有報導稱， 採用該標準，在接受體檢的290名成人男子中，被診斷為肥胖症的人有 61人(21%),而被診斷為代謝症候群的有27人(9%),不在肥胖症 之列而被診斷為代謝症候群的人還有9人(3%)(醫學o歩^高橋和男、 齋藤康2005年213巻6號549 - 554頁)。
可以認為肥胖基本上是由於攝取的能量(卡路裡)的量持續地高於 消耗的能量(卡路裡)的量，因此，對於肥胖或肥胖症的人，為了降低 體重、特別是體脂肪率，提倡進行飲食療法或運動療法等。但是，對於 這些療法的持續進行會引起食慾的增進、對生活習慣變化的適應、在運 動負荷方面產生很多應激，持續進行上述療法必須克服很多困難。並且 在飲食療法中，降低攝取卡路裡時，會發生可見腸道的營養吸收率增加 或身體能量代謝降低等現象的所謂的反彈現象，因此常見到中斷飲食療 法的情況。在肥胖症的內科治療中存在中樞性食慾抑制藥、熱量代謝促進藥、消化吸收抑制藥、脂肪合成抑制藥等，但是在目前日本的保險診 斷醫療中可以使用的藥物只有被分類為中樞性食慾抑制劑的馬巧l咮。並 且，馬吲哚是與興奮劑類似的化合物，有興奮、焦躁、心血管負荷增加、 排尿困難等其它副作用，使用期限定在三個月以內等，並不能說是容易
使用的藥物(乂乂Vkr 4 7 7 7 — T製備"馬吲哚片0.5 mg"說明書)。
相對於肥胖，過度的體重低(所謂"消瘦")或攝食低下(所謂的"食 欲不振")作為由於機體防禦(免疫)反應低下而引起的易感染、造血 系統障礙、無月經或月經失調、不孕症、精神性障礙、末梢神經麻痺、
骨質疏鬆症等的原因，成為問題。通常，BMK18.5Kg/n^時、或者體脂 肪率男性為10%以下、女性為15%以下時被分類為消瘦。在加00年曰 本厚生勞動省的國民營養調查中，女性中BMK18.5 kg/m2的人口比例在 20歲-39歲的範圍內在十年和二十年之間確實增加，在20 -29歲的人 口中約24%被分類為"消瘦"。這其中可能有年輕女性為了保持體形而有 意調節攝食量所導致。但是，在這個年齡段多發的中樞性攝食異常症中 的神經性食欲不振(厭食症)等中，也有由於食慾本身極度低下、營養 狀態惡化、因全身衰竭而死亡的情況。另外，包括以往被稱為胃下垂、 胃張力缺乏、神經性胃炎等概念的食慾低下的疾病中，有被稱為功能性 消化不良的疾病，該疾病顯示進食後早期飽腹感、食慾低下等症狀 (Talley等，Gut (England) 1999年45巻Suppl 2: 1137- 1142頁)。 並且引起食欲不振的原因有癌症、炎症性疾病、垂體.曱狀腺.腎上腺 等功能低下、手術後過度應激等，這些狀態下的長時間食欲不振的持續 會引起身體的衰竭。
在上述狀況中，近年來對調節攝食的機體內因子的研究日益發展， 對於痩素(Leptin)、脂聯素(adiponectin) 、 Ghrelin等因子與攝食調 節的相關性也進行了研究。但是，目前對於是什麼樣的因子對攝食調節 和/或體重調節發揮中心性作用尚未得出結論，另外上述因子尚未達到可 用於實際治療的程度。其中，痩素作為與攝食調節和體重調節相關的因 子受到人們的關注，也曾嘗試重組痩素的臨床應用，但是見效果的只是 肥胖患者中的極少一部分(松田守弘、下村伊一郎日本臨床株式會社曰 本臨床社2003年7月28日發行61巻增刊號6 "月巴満症"325 - 328頁)。 另外，肥胖患者中有很多對瘦素顯示抗性的患者，為了表達其藥效，必 須大量施與瘦素，另外，施與的效果也由於患者的個體差異而有很大不同(Heymsfield等,Journal of American Medical Association (美國)1999 年，282巻1568 - 1575頁)。並且，近年來發現瘦素的作用不是特異性 的攝食調節和體重調節，而具有很多生理作用，瘦素的施與可能產生血 壓升高作用、血小板聚集作用、氧化應激增大作用等，從而對心血管系 統產生副作用，除此之外還參與了腎臟或肝臟的纖維化，並且顯示出與 致癌的關係，提示了作為治療劑使用時的很多問題(Concidine等 Seminars in Vascular Medicine )(美國)2005年，5巻1號15 - 24頁； 以及小川佳宏、管波孝祥adiposcience 7 ^ > r 4力乂L出版2005年2 巻2號118-12)。
因此，人們希望能夠鑑定在攝食調節和/或體重調節中發揮中心性作 用的因子，並將其應用於肥胖或肥胖症的治療中。但是，報導的與攝食 調節和/或體重調節相關的因子很少，例如，作為糖尿病治療劑廣泛使用 的PPARY激動劑並未見其與攝食調節和/或體重調節直接相關的報導。 另 一方面，NEFA (Nuclear EF - hand acidic )也被稱為核結合素II
(Nucleobindin II) ( NUCB2 ) ， NEFA基因所編碼的多肽具有4丐結合 結構域(EF結構域)和DNA結合結構域(Barnikol - Wstanabe等， Biological chemistry Hoppe - Seyler ( Germany) 1994年375巻8號497
-512頁)。NEFA與核結合素的同源性高，可以認為是具有鈣反應性 的、被稱為EF手超家族中的DNA結合因子的一員(Karabinos等， Molecular biology and evolution(美國)1996年13巻7號990- 998頁)。 對實際的NEFA中的鈣結合能力、或與細胞增殖控制因子Necdin的結 合性等進行了研究(Kroll等，Biochemical and biophysical research communications (美國)1999年260巻1號1 - 8頁；以及Taniguichi 等，The Journal of biological chemistry(美國)2000年275巻41號31674
-37681頁)，但對於詳細的生理學作用並未有報告。另外，還有人研 究了 NEFA是眼科疾病烏斯赫爾症候群或胃癌的病因基因的可能性
(DeAngelis等，Biochimica et biophysica acta (荷蘭)1998年407巻1 號84 - 91頁；以及Line等，British journal of cancer (英國)2002年86 巻ll號1824 - 1830頁)。並且，NEFA多肽在其氨基末端一側具有信 號序列，顯示了分泌到細胞外的可能性(醫學0歩^高橋和男、齋藤康 2005年213巻6號549 - 554頁)，^a對於通過分泌到細胞外而產生的 生理、藥理學作用則完全沒有報告。另外，也沒有顯示NEF與攝食調節和/或體重調節有關的報告。

發明內容
本發明要解決的課題在於提供與攝食調節和/或體重調節相關的因 子的新的獲得方法；以及提供由該方法得到的基因、該基因編碼的多 肽、或者將由該基因編碼的多肽的信息得到的新型多肽作為攝食障礙和 /或體重調節相關的疾病的治療、控制、診斷的手段。還提供將抑制該基 因或多肽的作用的物質用作攝食調節和/或體重調節相關的疾病的治 療、控制、診斷的手段。又提供由抑制該基因或多肽或者它們的活性的 物質得到的攝食調節和/或體重調節相關的疾病的動物模型。還提供利用 它們的、調節該多肽的作用或表達的化合物的篩選方法、由該篩選方法 篩選的化合物、以及利用該化合物進行的疾病的診斷手段、治療劑。
本發明人為了開發與攝食調節和/或體重調節相關的因子的新的獲
得方法而進行了深入的研究，結果發現通過使用具有PPARY激動劑活 性的p塞唑烷二酮類，可以獲得與攝食抑制和/或體重減少相關的基因和多 肽。還發現由該方法得到的因子是目前對功能沒有報導的NEFA，並 將該多肽性的因子命名為NESFATIN。對NESFATIN進行研究，結果發 現在以往的報導中並未揭示其功能結構域的部分序列顯示了對攝食抑 制和/或體重減少的活性，並公開了新型的多肽NESFATIN - 1、 NESFATIN - 1M30 、 NESFATIN - 1M16 、 NESFATIN - 1M14和 NESFATIN-1M10M。還發現，在與NEFA/NESFATIN的胺基酸序列以 及基因的鹼基序列的同源性高、屬於相同家族的核結合素(Nucleobindin
I， NUCB1)中，NUCB1的相當於NESFATIN - 1M30的部位NUCB1
-M30也顯示同^^羊的活性。
本發明又發現與NESFATIN、NESFATIN - 1或NESFATIN - 1M30
結合的抗體對攝食亢進和體重增加具有活性，並確認了抑制 NESFATIN、 NESFATIN - 1或NESFATIN - 1M30的活性對於攝食亢進
和體重增加有效果。
即，本發明提供以下內容。
(1)得到攝食調節和/或體重調節相關因子的方法，該方法包含以 下步驟使具有PPARY激動劑活性的噻唑烷二酮類的化合物作用於哺乳 類細胞的步驟；和對由該化合物誘導表達的基因進行鑑定的步驟。(2) (l)的方法，其中，上述噻唑烷二酮類的化合物是曲格列酮。
(3) (1)或(2)的方法，其中，哺乳類的細胞是非小細胞肺癌 細胞抹、脂肪細胞或來自腦神經的細胞。
(4) (1)、 (2)或(3)的方法，其中，攝食調節和/或體重調節
是抑制攝食和/或抑制體重增加。
(5) 多肽，該多肽含有SEQ ID N0.65 - 73或107-115中任一個
所示的胺基酸序列。
(6 )多肽，該多肽含有SEQ ID NO.39 - 41或101 - 103中任一個
所示的胺基酸序列。
(7)多肽，該多肽含有SEQIDN0.13-15所示的胺基酸序列。 (8 )多肽，該多肽具有攝食抑制和/或體重增加抑制活性，含有SEQ
IDN0.3、 6或9所示的胺基酸序列。
(9) 多肽，該多肽含有以下胺基酸序列與SEQIDN0.13-15、 39-41、 65 - 73、 101 - 103或107 - 115中任一個所示的胺基酸序列的 任一個具有至少60%以上的同源性的胺基酸序列；或者SEQ ID N0.13 -15、 39-41、 65 - 73、 101 - 103或107 - 115中任一個所示的胺基酸 序列中的任一個有部分胺基酸缺失、插入或置換的胺基酸序列；該多肽 具有攝食抑制和/或體重增加抑制活性。
(10) 多肽，該多肽含有與SEQ ID NO.3、 6或9所示的胺基酸序 列的任一個具有至少60%以上同源性的胺基酸序列；或者在SEQ ID N0.3、 6或9所示的胺基酸序列的任一個有部分胺基酸缺失、插入或置 換的胺基酸序列，具有攝食抑制和/或體重增加抑制活性，在SEQ ID N0.3、 6或9的相當於胺基酸編號82- 162的胺基酸序列中，含有至少
一個生物體內含有的切割酶的識別部位。
(11 ) (5) - (10)中任一項的多肽， 附加至少一個以上的胺基酸。
(12) (5) - (10)中任一項的多肽
基被化合物或肽修飾。
(13) (5) - (12)中任一項的多肽
活性是抑制體脂肪增加的活性。
(14) 核酸分子，該核酸分子編碼(5) - (l3)中任一項的多肽。
(15) 核酸分子，該核酸分子含有SEQ ID N0.74 - 82或116-124
其中，在N末端或C末端 ,其中，至少一個胺基酸殘 ,其中，上述體重增加抑制中任一個所示的石威基序列。
(16) 核酸分子，該核酸分子含有SEQ ID N0.44 - 46或104-106 中任一個所示的鹼基序列。
(17) 核酸分子，該核酸分子含有SEQ ID N0.18-20所示的鹼基序列。
U8)核酸分子，該核酸分子含有SEQIDNO.IO、 11或12所示的 鹼基序列，編碼具有攝食抑制和/或體重增加抑制活性的多肽。
(19) 核酸分子，該核酸分子與SEQ IDNO.10-12、 18-20、 44 -46、 74- 82、 104 - 106、 116 - 124所示的鹼基序列或其部分序列在嚴 格(strigent)條件下雜交，且編碼具有攝食抑制和/或體重增加抑制活性 的多肽。
(20) (14) - (19)中任一項的核酸分子，其中，上述體重增加
抑制活性是抑制體脂肪增加的活性。
(21) 載體，該載體含有(l4) - (20)中任一項的核酸分子。
(22) (21)的載體，其中，核酸分子在控制該核酸分子表達的調 節性核酸分子的控制下功能性地與載體結合。
(23) 轉化體，該轉化體含有(14) - (20)中任一項的核酸分子。
(24) (23 )的轉化體，該轉化體表達上述核酸分子的轉錄產物。 (25 ) ( 23 )或(24)的轉化體，該轉化體表達上述核酸分子所編
碼的多肽。
(26) (23 )、 (24)或(25)的轉化體，其中，轉化體是微生物。
(27) (2。的轉化體，其中微生物是大腸桿菌。
(28) ( 23 ) 、 (24)或(25)的轉化體，其中，轉化體是哺乳類細胞。
(29 ) ( 23 ) 、 (24)或(25)的轉化體，其中，轉化體是植物細胞。
(30 )用於抑制攝食和/或抑制體重增加的藥物組合物，該藥物組合 物含有(5) - (l3)中任一項的多肽或含該多肽的胺基酸序列的一部 分的肽、(21)或(22)的載體、或(23 ) - (29)中任一項的轉化體
作為有效成分。
(31) (30)的藥物組合物，其中，上述抑制體重增加是抑制體脂 肪增力口。(32 ) ( 30 )或(31)的藥物組合物，該藥物組合物用於選自肥胖、 糖尿病、高血壓、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臟病、腦血管疾 病、睡眠呼吸暫停症候群、整形外科疾病、月經異常和惡性腫瘤中的疾 病的患者。
(33 ) ( 30)或(31)的藥物組合物，其中，惡性肺瘤是乳癌、子 宮癌、結腸癌、腎癌、食道癌、胰癌、肝癌或膽嚢癌中的任一種。
(34) ( 30 ) - ( 33 )中任一項的藥物組合物，該藥物組合物含有 藥學上可接受的添加劑。
(3"抗體，該抗體與(5) - (l3)的任一項的多肽結合。 (36 ) ( 35 )的抗體，該抗體與含有SEQ ID N0.24、 32所示氨基 酸序列的肽結合。
(37)抑制(5) - (13)中任一項的多肽的活性或生成的物質。 (38 ) ( 37 )的物質，該物質通過與上述多肽結合，抑制該多肽的活性。
(39 ) ( 37)的物質，其中，抑制上述多肽的活性的物質是(35) 或(36)的抗體。
(40) 抑制編碼(5) - (13)的多肽的基因表達的物質。
(41) (40)的抑制基因表達的物質，其中，上述抑制基因表達的
物質是反義寡核苷酸分子。
(42) (41)的抑制基因表達的物質，其中，反義寡核苷酸分子含 有SEQ ID N0.31所示的鹼基序列。
(43 ) (40)的抑制基因表達的物質，其中，抑制基因表達的物質 是RNAi分子。
(44) 載體，該載體含有下述核酸分子，所述核酸分子含有與(41 ) 或(42)的反義寡核苷酸分子或(43)的RNAi分子的核酸序列互補的 鹼基序列，該載體用於製備所述反義寡核苷酸分子或所述RNAi分子。
(45) 用於使食慾亢進或體重增加亢進的藥物組合物，該藥物組合 物含有(37) - ( 43 )中任一項的物質或(44)的載體。
(46) (45 )的藥物組合物，該藥物組合物含有藥學上可接受的添
力口劑。
(47) 轉基因非人生物，該轉基因非人生物含有(14) - (20)中 任一項的核酸分子或者(21) - (22)中任一項的載體。(48) (47)的轉基因非人生物，其中，該轉基因非人生物表達(14) -(20)中任一項的核酸分子。
(49) (47)或(48)的轉基因非人生物，該轉基因非人生物中導 入了 ( 23 ) - ( 28 )所述轉化體的任一種。
(50) (47) 、 (48)或(49)的轉基因非人生物，該轉基因非人 生物是顯示攝食抑制狀態或體重增加抑制狀態的轉基因非人動物。
(51) (47) 、 (48)或(49)的轉基因非人生物，其中，上述轉 基因非人生物是轉基因植物。
(52) 轉基因非人動物，該轉基因非人動物中導入了 (35)或(36) 的抗體、(37) - ( 39)中任一項的抑制物質、(40) - (43 )的抑制 基因表達的物質或(44)的載體，顯示食慾亢進或體重增加亢進。
(53) 敲除非人動物，該敲除非人動物是使含有SEQ ID NO.10-12、 18-20、 44-46、 74 - 82、 104- 106、或者116-124中任一個所 示的鹼基序列的基因的全部區域或部分缺損。
(54 ) ( 53 )的敲除非人動物，該敲除非人動物顯示食慾亢進或體 重增力口。
(55) 。2) 、 (53)或(54)的非人動物，該非人動物可以用作 選自肥胖、糖尿病、高血壓、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臟病、 腦血管疾病、睡眠呼吸暫停症候群、整形外科疾病、月經異常和惡性肺 瘤中的疾病的動物模型。
。6) (5) - (13)中任一項的肽的製備方法，該製備方法是通 過無細胞蛋白質合成法或化學合成法進行。
(57) (5) - (13)中任一項的肽的製備方法，該製備方法是使 用(23 ) - ( 29)中任一項的轉化體、(47) - (51)中任一項的轉墓 因非人生物、或(52 ) - ( 55 )中任一項的非人動物進行。
(58) ( 56)或(57)的製備方法，該製備方法包含通過上述肽與 (35)或(36)的抗體的脫結合進行純化的步驟。
(59 ) ( 56 )或(57)的製備方法，該製備方法包含使上述肽以 GHT融合蛋白的形式表達，使用結合穀胱甘肽的載體進行純化的步驟。
(60) ( 56 )或(")的製備方法，該方法包含使上述肽以His標 籤融合蛋白的形式表達，並使用金屬離子螯合劑載體進行純化的步驟。
(61) 。6)或(57)的製備方法，該方法包含以下步驟使上述肽以FLAG標籤融合蛋白的形式表達，使用結合有抗FLAG標籤抗體的 載體進行純化的步驟。
(62)用於預測或診斷攝食亢進或體重增加狀態的鑑定方法，該方 法包含以下步驟檢測哺乳類動物的生物體試樣中含有SEQ ID NO.IO -12、 18-20、 44-46、 74 - 82、 104 - 106、或116-124中任一個所 示的鹼基序列的核酸分子，或者含有SEQIDN0.3、 6、 9、 13-15、 39 -41、 65 - 73、 101 - 103或107-115中任一個所示的胺基酸序列的多 肽的含量的步驟。
(63 ) ( 62 )的鑑定方法，該方法包含以下步驟將哺乳類動物生 物體試樣中的上述核酸分子或上述多肽的含量與正常個體的生物體試
樣進行比較的步驟。
(64) ( 62)或(63)的筌定方法，該方法包含以下步驟將哺乳 類動物生物體試樣中的上述核酸分子或上述多肽含量降低的狀態判斷 為攝食亢進或體重增加的狀態的步驟。
(65 ) ( 62) - (64)中任一項的鑑定方法，該鑑定方法包含以下 步驟將哺乳類動物生物體試樣中的上述核酸分子或上述多肽含量降低 的狀態判斷為選自肥胖、糖尿病、高血壓、高脂血症、高尿酸血症、月旨 肪肝、心臟病、腦血管疾病、睡眠呼吸暫停症候群、整形外科疾病、月 經異常和惡性胂瘤中的疾病發病或有其可能性的步驟。
(66) ( 62)或(63)的鑑定方法，該鑑定方法包含以下步驟將 哺乳類動物生物體試樣中上述核酸分子或上述多肽含量增加的狀態判 斷為攝食抑制狀態或體重增加抑制狀態的步驟。
(67) (62) - ( 66)中任一項的鑑定方法，該鑑定方法是使用(35) 或(36)的抗體進行上述多肽含量的檢測。
(68) ( 62) - ( 66)中任一項的鑑定方法，該鑑定方法是使用用 於檢測含有SEQ ID NO.10 - 12、 18-20、 44 -46、 74 — 82、 104-106 或116-124中任一個所示鹼基序列的核酸分子的PCR引物、探針或 DNA晶片的至少一種檢測上述核酸分子的含量。
(69 ) ( 62 ) - ( 68 )中任一項的鑑定方法中使用的鑑定試劑盒， 該鑑定試劑盒含有用於檢測含SEQIDNO.IO-12、 18-20、 44-46、 74 -82、 104- 106或116- 124中任一個所示鹼基序列的核酸分子的PCR 引物，探針或DNA晶片；或者識別含SEQ ID N0.3、 6、 9、 13-15、39-41、 65 - 73、 101 - 103或107 - 115所示胺基酸序列的多肽的抗體、 標準肽或結合竟爭反應用肽修飾物中的至少一種。
(70 )具有抑制攝食和/或抑制體重增加的效果的治療劑或預防劑的 篩選方法，該方法包含以下步驟使試驗物質與哺乳類細胞接觸的步 驟；以及檢測該細胞中含有SEQ ID NO.10-12、 18-20、 44 -46、 74 -82、或104 - 106、 116-124中任一個所示鹼基序列的基因表達量的 增加、或者該細胞內含有的或分泌到細胞外的含有SEQIDN0.3、 6、 9、 13-15、 39-41、 65 - 73、 101 - 103或107 - 115所示胺基酸序列的多 肽的量的增加的步驟。
(71) (70)的篩選方法，其中，哺乳類細胞中導入了調節性核酸
分子和報導基因的核酸分子，其中所述調節性核酸分子控制含有SEQ ID NO.10-12、 18 — 20、 44-46、 74 — 82、 104 — 106或116 — 124中任一 個所示鹼基序列的基因的表達；通過報導基因的誘導表達來檢測含有 SEQ ID NO. 10 - 12、 18-20、 44 -46、 74- 82、 104 - 106或116 - 124 中任一個所示鹼基序列的基因的誘導表達。
(72 )具有抑制攝食和/或抑制體重增加效果的治療劑或預防劑的篩 選方法，該方法包含以下步驟將試驗物質施與哺乳動物的步驟；以及 檢測該試驗動物生物體試樣中含有SEQ ID NO.10-12、 18-20、 44-46、 74 - 82、 104 - 106或116-124中任一個所示鹼基序列的基因的表 達亢進，或者含有SEQIDN0.3、 6、 9、 13-15、 39-41、 65 - 73、 101 -103或107-115中任一個所示胺基酸序列的多肽的生成亢進的步 驟。
(73 )具有抑制攝食和/或抑制體重增加效果的治療劑或預防劑的篩 選方法，該方法包含以下步驟將試驗物質施與(47) - ( 50)中任一 項的轉基因非人生物或(52 ) - ( 55 )中任一項的非人動物的步驟；以 及檢測該轉基因非人生物或非人動物中攝食抑制或體重增加抑制的步驟。
(74) (70)-(")中任一項的篩選方法，其中，具有上述抑制
攝食和/或抑制體重增加效果的治療劑或預防劑是針對選自肥胖、糖尿 病、高血壓、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臟病、腦血管疾病、
睡眠呼吸暫停症候群、整形外科疾病、月經異常和惡性肺瘤中的疾病的
治療劑或^"貞防劑。(75 )具有抑制攝食和/或抑制體重增加效果的治療劑或預防劑，其 由(70) - ( 74)中任一項的方法得到。
(76) (75)的治療劑或預防劑，其中，上述具有抑制攝食和/或抑 制體重增加效果的治療劑或預防劑是針對選自肥胖、糖尿病、高血壓、 高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臟病、腦血管疾病、睡眠呼吸暫停 症候群、整形外科疾病、月經異常和惡性腫瘤中的疾病的治療劑或預防 劑。
(77 )具有攝食亢進和/或體重增加亢進效果的治療劑或預防劑的篩 選方法，該方法包含以下步驟使試驗物質與哺乳類細胞接觸的步驟； 以及檢測該細胞中含有SEQIDNO.10-12、 18-20、 44 -46、 74 - 82、 104 - 106或116-124中任一個所示鹼基序列的基因表達量的減少；或 者該細胞內含有的或分泌到細胞外的含有SEQIDN0.3、 6、 9、 13 - l5、 39-41、 65 - 73、 101 - 103或者107 - 115中任一個所示胺基酸序列的 多肽量的減少的步驟。
(78) ( 77)的篩選方法，其中，哺乳類細胞中導入了調節性核酸 分子和報導基因的核酸分子，其中所述調節性核酸分子控制含有SEQ ID NO.10-12、 18-20、 44 — 46、 74 — 82、 104 — 106或116 - 124中任一 個所示鹼基序列的基因的表達；通過報導基因的表達抑制來檢測含有 SEQ ID NO. 10-12、 18-20、 44 — 46、 74- 82、 104 — 106或116 - 124 中任一個所示鹼基序列的基因的的表達抑制。
(79 )具有攝食亢進和/或體重增加亢進效果的治療劑或預防劑的篩 選方法，該方法包含以下步驟將試驗物質施與哺乳動物的步驟；以及 檢測該試驗動物生物體試樣中的含有SEQ ID NO.10-12、 18-20、 44 -46、 74- 82、 104 - 106或116-124中任一個所示鹼基序列的基因的 表達抑制，或者檢測含有SEQIDN0.3、 6、 9、 13-15、 39-41、 65-73、 101 - 103或者107- 115中任一個所示胺基酸序列的多肽的生成抑 制的步驟。
(80 )具有攝食亢進和/或體重增加亢進效果的治療劑或預防劑的篩 選方法，該方法包含以下步驟將試驗物質施與(47) - ( 50)中任一 項的轉基因非人生物或(52) - ( 55 )中任一項的非人動物的步驟；以 及檢測該轉基因非人生物或該非人動物的攝食亢進或體重增加亢進的 步驟。(81 )具有攝食亢進和/或體重增加亢進效果的治療劑或預防劑，其
由(77) - ( 80)中任一項的方法得到。


圖1是使用NEFA探針進行的RNA印跡圖像，表示由曲格列酮誘 導NEFA基因在人腦髓瘤抹細胞HBT185細胞和SQ - 5細胞中的表達， 以及NEFA基因在分化為脂肪前體細胞的3T3-Ll細胞中恆定表達。
圖2A是表示NEFA基因所編碼的多肽的結構域結構示意圖、和抗 NESFATIN抗體製備中使用的NAP肽的序列的圖。圖2B是使用由NAP 肽製作的多克隆抗體進行的蛋白質印跡圖像，表示在大鼠的腦提取物中 存在NEF A基因所編碼的多肽。
圖3是使用NAP肽的多克隆抗體進行的免疫組織染色圖像，表示 在大鼠腦的下丘腦，NEFA基因在與攝食調節相關的部位弓狀核(Ar c )、 室旁核(PVN)、視上核(SON)和外側區(LH)表達。
圖4A是使用NAP肽的多克隆抗體進行的蛋白質印跡圖像，表示 GST與小鼠成熟型NESFATIN結合的形式的GST - NEFA的表達和純化 過程。圖4A中，泳道1 - 4分別表示泳道標誌、前誘導細菌(preinduced bacteria)、超聲處理後顆粒(Post - sonicated pellet)和純化GSTNAP。 圖4B是使用抗NESFATIN抗體進行的蛋白質印跡圖像，表示用凝血酶 切割GST-NEFA進行純化的過程。圖4B中，泳道1表示標記，泳道2 表示純化前的樣品，泳道3-6表示洗滌樣品，泳道7表示純化樣品。
圖5是表示通過向大鼠第三腦室內施與重組NESFATIN,大鼠的攝 食行為受到抑制的圖。圖5中，*和**分別表示與對象組的顯著差異 PO.05和P<0.01。
圖6是表示向大鼠第三腦室內施與抗NESFATIN抗體，大鼠的攝食 行為亢進的圖。圖6中，承表示與對照IgG的顯著差異PO.OOl。
圖7是腦組織的原位雜交圖像，表示大鼠下丘腦的NESFATIN基因 的表達通過使其絕食而降低，或者通過使其再度攝食而恢復表達。圖7 中，A表示對象組，B表示絕食組，C表示再度攝食組，上部表示100 倍圖像，下部表示400倍圖像。
圖8是使用抗NESFATIN抗體的免疫組織染色圖像，表示大鼠下丘 腦的NESFATIN表達因使大鼠絕食而降低。圖8中，A表示對象組，B表示絕食組。(C)表示使用抗C-Fos抗體的免疫組織染色圖像，表示 絕食時NESFATIN表達降低是由於食慾亢進導致的。圖8中，上部表示 室旁核(PVN),下部表示弓狀核(Arc)。
圖9A是表示人、小鼠和大鼠NESFATIN胺基酸序列和推測的激素 原轉化酶切割部位。Y表示預想的激素原轉化酶切割部位。
圖9B是表示可認為由激素原轉化酶產生的Nesfatin-1、 Nesfatin —2 、 Nesfatin - 3 、 Nesfatin — 2/3 、以及用於製備Nesfatin — 1 、 Nesfatin -2/3 、 Nesfatin - 3的抗體的肽在NESFATIN中的位置的示意圖。
圖9C是蛋白質印跡圖，表示Nesfatin - 1和Nesfatin - 3的抗體與 目標抗原結合。圖9C中，左圖示使NESFATIN - 1肽電泳，通過Nesfatin -1 IgG進行蛋白質印跡的結果；右圖示使NESFATIN-3肽電泳，通過 Nesfatin - C2 IgG進行蛋白質印跡的結果
圖10是使用抗NESFATIN - 1抗體和抗PC - 1/3抗體或抗PC - 2 抗體進行的雙重免疫組織染色圖像，表示在大鼠腦內存在同時表達 NESFATIN - 1和激素原轉化酶(PC - 1/3或PC - 2 )的細胞。圖10A的 ①和②表示大鼠下丘腦組織的免疫組織化學圖像中Nesfatin-1 IgG的 染色圖像，圖10B的①表示PC-1/3的螢光圖像，圖10B的②表示PC -2的螢光圖像。
圖11是表示向大鼠第三腦室內施與NESFATIN-1,大鼠的攝食行 為受到抑制，但施與NESFATIN - 2或NESFATIN - 3其攝食行為未見 變化的圖。
圖12是表示向大鼠第三腦室內連續施與NESFATIN-1,攝食行為 持續受到抑制(A),以及體重增加持續受抑制(B)的圖。
圖13A是表示向大鼠的腦室內施與NESFATIN- 1的抗體，大鼠的 食慾亢進的圖。圖13A中，*和**分別表示與對照IgG施與組的顯著差 異PO.05和P<0.001。
圖13B是表示向大鼠腦室內施與未從NESFATIN中切取NESFATIN - 1的變異體時相對於NESFATIN未引起攝食亢進的圖。
圖14是表示向大鼠腦室內連續施與NESFATIN的反義RNA,攝食 行為受到抑制(A)和體重增加受到抑制(B)的圖。圖14中，*和**
分別表示與錯義的顯著差異p〈o.os和po.01。
圖15是表示向Lean和瘦素抗性肥胖動物模型Zucker大鼠的腦室內施與NESFATIN - 1的攝食量測定結果圖。對於Zucker大鼠，與Lean (正常動物)同樣，向腦室內施與NESFATIN- 1則可見攝食抑制效果。 圖15中，*和**分別表示與生理食鹽水施與組的顯著差異P<0.05和 P<0.001。白色方框和斜線方框分別表示生理食鹽水和NESFATIN - 1施與組。圖16是表示向小鼠腹腔內施與NESFATIN- 1時對攝食量的影響的 圖。對於小鼠，腹腔內施與也可見NESFATIN- 1的攝食抑制活性(A)。 還表示了對肥胖模型小鼠Agouti - yellow小鼠及其對象小鼠腹腔內施與 NESFATIN — 1時的結果的圖。對於對象小鼠(B )和Agouti - yellow小 鼠(C) , NESFATIN-1的腹腔施與具有同樣的效果。圖17是表示向小鼠腹腔內和皮下施與NESFATIN- l對攝食量的影 響的圖。NESFATIN-1在腹腔內施與(ip)和皮下施與(sc )時均可見 攝食抑制效果，但皮下施與時有效果緩慢表達的傾向。圖17中，*和** 分別表示與生理食鹽水施與組的顯著差異P<0.05和P<0.005。圖18A是表示向小鼠腹腔內施與NESFATIN - IN" 、 NESFATIN -1M30、 NESFATIN-1C29對攝食量的影響的圖。NESFATIN - 1的部分 肽中，只有NESFATIN-1ND0顯示了攝食抑制效果。圖1SA中，*表示 與生理食鹽水施與組的顯著差異P<0.02。圖18B是表示人、小鼠和大鼠的NESFATIN-l胺基酸比對結果和 NESFATIN - 1N23、 NESFATIN - 1M30和NESFATIN - 1C29的部位的 圖。NESFATIN - 1M30的部位在種間胺基酸序列高度保存。圖19A - 1是表示測定NESFATIN或NESFATIN - 1試樣中濃度的 竟爭EIA系統的標準曲線圖(A-1)、以及表示脊髓液中的測定結果的 表(A-2)。校正曲線的公式Y=D+ (A-D) /1+ (Log (X) /CAB )。 Plot#l (標準值濃度值相對於測定值)。A=8.4672E - 001 ， B=4.3850E+000， C=3.5938E+000, D= - 2.8957E - 001 ， RA2=0.9998。圖19A - 2是表示測定NESFATIN或NESFATIN - 1試樣的濃度的 竟爭EIA系統的標準曲線的圖(A-l),以及表示脊髓液中的測定結果 的表(A-2)。圖19B是通過HPLC對由下丘腦組織和脊髓液提取的肽樣品進行分 級，通過竟爭EIA系統測定其級分的NESFATIN - 1的圖(b - 1和b -2)。圖20是表示向小鼠腹腔內施與NESFATIN - 1M30的部分肽對攝食 量的影響圖。在施與NESFATIN - 1M16 (M16) 、 NESFATIN - 1M10M (M10M)或NESFATIN-M14 ( M14 )的所有的情況下均得到了攝食 抑制效果。圖20中，*和**分別表示與生理食鹽水施與組的顯著差異 PO.02和PO麓。圖21A是表示向小鼠腹腔內施與人NESFATIN - 1M30和小鼠 NUCB1-M30對攝食調節的影響。與小鼠NESFATIN - 1M30 (小鼠 /NESFATIN - 1M30 )同樣，人NESFATIN - 1M30 (人/NESFATIN -1M30 )和小鼠NUCB1 - M30 (小鼠NUCB1 )也有攝食抑制效果。圖20 中，g表示與生理食鹽水施與組的顯著差異P0.02。圖21B是表示人、大鼠、小鼠的NESFATIN和人、大鼠、小鼠的 NUCB1的胺基酸序列比對結果和相當於NESFATIN - 1的部位以及相當 於NESFATIN - 1M30的部位的圖。在各種NESFATIN和NUCB2的相 當於NESFATIN - 1的部位、特別是相當於NESFATIN - 1M30的部位，顯示胺基酸序列的保守性高。圖21C是表示人、大鼠、小鼠的NESFATIN和人、大鼠、小鼠的 NUCB1的胺基酸序列的比對結果以及相當於NESFATIN- 1的部位和相 當於NESFATIN - 1M30的部位的圖，是圖21B的續圖。圖22是表示使用各組織的NEFA探針進行的原位雜交圖像。圖22A 表示含有室旁核(PVN)和視上核(SON)的組織切片，圖^B表示含 有未定帶區(Zi)和弓狀核(Arc)的組織切片，圖表示含有丘腦 外側區(LHA)的組織切片。圖23A是表示向大鼠第三腦室內施與重組NESFATIN,大鼠的攝食 量受到抑制的圖。圖23B是表示向大鼠第三腦室內施與5 pmol NESFATIN的施與組(斜線框)和對象組(0 pmol NESFATIN,空白框) 在0 - 1小時、1 - 3小時、3 - 6小時和6- 12小時的攝食量的圖。圖23A 中，氺表示相對於0pmol的顯著差異p0.01。圖"B中，*表示相對於0 pmol的顯著差異p<0.05, **表示顯著差異p<0.01。圖24A表示通過原位雜交法的圖像分析，對自由攝食組(對照組) 和絕食組大鼠的下丘腦區域的弓狀核(Arc)、室旁核(PVN)、外側 區(LHA)和視上核(SON)各部位的NESFATIN mRNA表達進行定量 的結果。圖24B表示通過竟爭EIA法的圖像分析對自由攝食組(對照組工白框)和絕食組(斜線框)大鼠的下丘腦區域中室旁核的NESFATIN -1肽的表達進行定量的結果。圖25是表示向大鼠第三腦室內施與5 pmol的NESFATIN- 1施與 組(斜線框)和對象組(0 pmol的NESFATIN- 1,空白框)在0 - 1小 時、1-3小時、3-6小時和6-12小時的攝食量。*表示對於0 pmol 的顯著差異pO.Ol。圖26是從左依次表示向大鼠腦室內只施與生理食鹽水的對象組 (NESFATIN — 1 IgG/NESFATIN — 1/痩素-/ - / -)、只施與NESFATIN -1的組(NESFATIN-1 IgG/NESFATIN-1/痩素-/+/-)、施與 NESFATIN - 1和抗NESFATIN - 1抗體的組(NESFATIN - 1 IgG/NESFATIN - 1/痩素+/+/ -)、施與瘦素組(NESFATIN - 1 IgG/NESFATIN - 1/瘦素-/-/+)、施與瘦素和抗NESFATIN - 1抗體 組(NESFATIN-1 IgG/NESFATIN-1/瘦素+/-/+)後1小時的攝食 量的圖。*表示與對象組的顯著差異p<0.01。圖27A表示使用由大鼠腦提取的蛋白質提取液，通過抗NESFATIN -1抗體進行蛋白質印跡的圖像。圖27B表示使抗NESFATIN - 1抗體與各種肽預先反應，然後進行 蛋白質印跡時，在47.5 kd附近的條帶附近的圖像。圖27B中，與抗 NESFATIN-1抗體反應的肽的種類在圖27B的上部由左至右表示無 肽、NAP1-Ab肽(關連肽)、瘦素、aMSH、 CART,圖27B的下部由 左至右表示無肽、NAP1 - Ab肽(關連肽)、NPY、 MCH、開胃素A( Orexin -A)。圖28A表示使用含有延髓的腦組織中的NAP肽抗體進行的免疫組 織化學染色圖像。圖2SB表示使NAP肽的抗體預先與NAP肽(關連肽) 反應，然後進行免疫組織染色的圖像。圖29A是表示分別對正常大鼠(Lean)和Zucker fa/fa大鼠(Zucker) 分為攝食含有曲格列酮的伺料的組(TGZ: +)和攝食不含曲格列酮的 飼料的組(TGZ:-)的體重的圖。圖2兆是表示分別對正常大鼠(Lean)+ )和攝食不含曲;各列酮的飼料的:(VgZ:-)的5血';^瘦素濃度的圖。 圖29C是表示分別對正常大鼠(Lean)和Zucker fa/fa大鼠(Zucker) 分為攝食含有曲格列酮的飼料的組(TGZ: +)和攝食不含曲格列酮的飼料的組(TGZ:-)的腦內Nesfatin濃度的圖。圖29中，*和**分別 表示正常大鼠(Lean)與攝食不含曲格列酮的祠料的組(TGZ:-)的 顯著差異p<0.05和p<0.01。圖29中，#和##分別表示Zucker fa/fa大鼠 (Zucker )與攝食不含曲格列酮的飼料的組(TGZ:-)的顯著差異p<0.05 和p<0.01。的級分編號45的蛋白質印跡圖像。圖30B表示通過HPLC將來自大鼠 下丘腦的肽提取物進行分級得到的級分編號43 -47的蛋白質印跡圖像 中，在9.7kb附近的分子量部分的圖像。圖31A表示在含有大鼠腦的弓狀核的組織切片中通過抗NESFATIN -1抗體進行免疫組織化學染色的結果，以及使抗NESFATIN - 1抗體 與各種肽預先反應後進行免疫組織化學染色的結果。圖31A中，a-l 表示用抗NESFATIN - 1抗體進行的免疫染色圖像，a-2至a-6分別表 示使抗NESFATIN - 1抗體預先與NESFATIN - 1肽(a - 2 )、瘦素(a -3) 、 aMSH (a-4) 、 CART (a-5) 、 NPY (a-6)反應時的免疫 染色圖像。圖31B表示在含有大鼠腦室旁核的組織切片中通過抗NESFATIN-1抗體進行免疫組織化學染色的結果，以及使抗NESFATIN - 1抗體與 各種肽預先反應後進行免疫組織化學染色的結果。B中，b-1表示抗 NESFATIN-1抗體的免疫染色圖像，b-2至b-6分別表示使抗 NESFATIN - 1抗體預先與NESFATIN - 1肽(b - 2 )、瘦素(b - 3 )、 aMSH (b-4) 、 CART (b-5) 、 NPY ( b — 6 )反應時的免疫染色圖j象。圖32是表示由10天內只施與NESFATIN- 1或生理食鹽水的大鼠 獲得的腹部皮下脂肪組織(A)、附睪脂肪組織(B)、腸繫膜脂肪組織 (C)、腹膜後脂肪組織(D)、褐色脂肪組織(E)和腓腸肌(F)的 組織重量與各個體重量的比(組織重量/體重mg/g)的結果圖。圖32中， *和**分別表示與生理食鹽水施與組的顯著差異p<0.05和p<0.005。圖33是表示向小鼠腹腔內只施與NESFATIN - 1或生理食鹽水時的 攝食量、血液葡萄糖含量、總膽固醇含量、甘油三酯含量的測定結果圖。 圖33中，空白框和斜線框分別表示生理食鹽水和Nesfatin - 1施與組。本發明通過使用PPARy激動劑，可以得到與攝食和體重調節相關的 因子。另夕卜，通過使用NESFATIN、 NESFATIN- 1、 NESFATIN- 1M30、NESFATIN - 1M16、 NESFATIN - 1M14、 NESFATIN - 1M10M、 NUCBl -M30、 NUCBl-M16、 NUCBl - Ml 4、 NUCBl - Ml 0M，可以預防或 治療與肥胖或肥胖症、神經性過食症等代謝攝食障礙相關的疾病、II型 糖尿病、糖耐量異常、高血壓、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臟 病、腦血管疾病、睡眠呼吸暫停症候群、變形性關節病等整形外科疾病、 月經異常、惡性肺瘤等與肥胖症相關的疾病。並且，通過使用抗體等抑 制NESFATIN、 NESFATIN - 1或NESFATIN - 1M30的活性的物質，可 以預防或治療手術後和/或癌症患者的食欲不振或厭食症等營養、攝食障 礙的相關疾病。
具體實施方式
本發明涉及攝食調節和/或體重調節的相關因子的獲得方法，該方法 包含以下步驟使具有PPARy激動劑活性的噻唑烷二酮類化合物作用於 哺乳類細胞的步驟；以及鑑定由該化合物誘導表達的基因的步驟。本發明中，"攝食調節"是指一定期間內動物攝食或人的飲食(以下 合併稱為攝食等)量的調節，或一定期間內通過攝食等攝取的卡路裡總 量的調節。攝食調節也包括對食慾、飽腹感的調節等對成為攝食等的動 機的情況進行的調節。這裡，"攝食抑制"是指與未進行攝食調節時相比，攝食等的量或者 通過攝食等攝取的卡路裡的總量減少的狀態，或者與未進行攝食調節的 狀況相比較，攝食等的量或通過攝食等攝取的卡路裡總量增大的傾向受 到抑制的狀態。另外，攝食抑制也包含食慾減退、飽腹感亢進等狀態。這裡，"攝食亢進"是指與未進行攝食調節時相比較，攝食等的量或 者通過攝食等攝取的卡路裡的總量增加的狀態，或者與未進行攝食調節 的狀況比較，攝食等的量或者通過攝食等攝取的卡路裡的總量下降的傾 向受到抑制的狀態。食慾亢進還包括食慾增大、飽腹感受抑制等。"體重調節"是指調節人或動物的體重絕對值、體格指數(使用體重 和身長作為指標)或體脂肪率。這裡，"體重增加抑制"是指與未進行體 重調節時相比較，體重絕對值、體格指數或體脂肪率降低或保持的狀態，或者與未進行體重調節的狀況相比較，體重絕對值、體格指數或體 脂肪率增加的傾向受到抑制的狀況。本說明書中，"抑制體脂肪增加"是指與未進行體重調節時比較，體 脂肪率降低或保持的狀態，或與未進行體重調節的狀況比較，體脂肪率增加的傾向受到抑制的狀況。另外，"體重增加亢進"是指與未進行體 重調節時比較，體重絕對值、體格指數或體脂肪率增加或保持的狀態， 或者與未進行體重調節的狀況比較，體重絕對值、體格指數或體脂肪率 的增加傾向受到抑制的狀況，本說明書中，也稱為"抑制體重減少"。對人來講，體格指數的代表性的計算是使用身長BMI ( body mass index, 身體質量指數)，其計算是體重(kg) +身長(m) +身長(m),單位 以kg/m2表示。因此，體重增加抑制或體重增加亢進的效果可以以上述 BMI為指標表示。另外，體脂肪率是以體脂肪的重量佔體重的比例表 示，其測定可以通過體密度法、體水分法、體內鉀量測定法、阻抗法、 雙能X射線吸收法、中子活化法、近紅外分光法、皮下脂肪厚度法、圖 像法等進行(日本臨床61巻增刊號6第357 - 400頁2003年日本臨床 社發行)。本發明中，"具有PPARy激動劑活性的噻唑烷二酮類化合物"例如包括曲格列酮、吡格列酮、羅格列酮和利格列酮(y求夕'!J夕、/乂 )等，其中，曲格列酮是最早臨床應用的物質。本發明中，作為在獲取攝食調節和/或體重調節相關因子中使用的哺 乳類細胞，有非小細胞肺癌細胞株、脂肪細胞和來自腦神經的細胞等， 只要是表達PPARY的細胞均可，沒有特別限定。使上述化合物作用於哺乳類細胞作用的方法例如如下所述，有在該 化合物的刺激下培養上述細胞的方法(Satoh等，Oncogene (England) 2002年21巻2171 -2180頁)。對於上述由該化合物誘導表達的基因的鑑定，例如可以使用扣除法因進行鑑定(Satoh等,Oncogene ( England )2002年21巻2171-2180 頁)。另外，為了從所得的通過PPAR丫的活化而被特異性誘導的基因中 選擇編碼分泌到細胞外的因子的基因，可以分析該基因的鹼基序列，通 過是否編碼分泌信號肽來選擇。並且，由這些基因中選擇攝食調節和/ 或體重調節相關基因的方法還有以下方法使用含有人或動物下丘腦的 腦試樣、以及與由該基因編碼的多肽結合的抗體的組織提取物免疫學檢 測(實施例3)或組織化學方法(實施例4和9)等的方法；使用原位雜交(in situ hybridization:實施例8 )或RT - PCR法等確認在下丘腦 的表達的方法。可以通過分析所得的與攝食調節和/或體重調節相關的基因的鹼基 序列來鑑定所編碼的多肽的胺基酸序列。所得多肽的胺基酸序列或含有 其部分胺基酸序列的肽或多肽可以使用基因工程或合成化學的方法制 備。可以將上述得到的多肽或以在生物體內表達的形式導入的、編碼該 肽的核酸分子局部或整個導入試驗動物中，通過研究該動物的攝食量和 /或體重的變化，從所得多肽或編碼該多肽的基因中選擇與攝食調節和/ 或體重調節相關的多肽或基因。作為其它方法，可以將與所得多肽結合 的抗體、或可抑制編碼該多肽的基因表達的反義寡核苷酸分子或RNAi 分子等局部或整個導入試驗動物，通過研究該動物的攝食量和/或體重的 變化，從所得多肽或編碼該多肽的基因中選擇與攝食調節和/或體重調節 相關的多肽或基因。本發明涉及由上述方法得到的、具有攝食抑制和/或體重增加抑制活 性的多肽。作為這種多肽，可列舉至今未鑑定功能的NESFATIN基因所 編碼的多肽，該多肽具有上述功能，這是本發明首次發現的。本發明發 現，NESFATIN基因在被認為控制食慾的下丘腦表達(實施例4、 8、 9、 24和26)，通過將NESFATIN多肽施與動物的腦內，可以引起動物才聶 食量和體重的降低(實施例6和25)。並且，通過抑制NESFATIN多 肽的功能或抑制NESFATIN基因的表達，引起動物攝食亢進和體重增加 (實施例7和實施例15)。作為NESFATIN多肽的例子，可列舉含有SEQ ID N0.3、 6和9所 示胺基酸序列的多肽。含有人的信號肽的前體NESFATIN多肽如SEQ ID N0.2所示。前體NESFATIN多肽在分泌到細胞外時，信號肽被切割， 實質上顯示活性的人成熟型NESFATIN多肽形成如SEQ ID NO.3所示的 形式。本說明書中，NESFATIN多肽也簡稱為NESFATIN。本發明中，對上述具有攝食抑制和/或體重增加抑制活性的 NESFATIN多肽進行了深入的研究，結果發明了具有攝食抑制和/或體重 增加抑制活性的新型結構的多肽。該新型結構的多肽的發現是由於設想26NESFATIN多肽分泌到細胞外時可能會因蛋白質分解酶而被分解，從而 對來自NESFATIN多肽的各種肽進行研究而得到的。結果發現，具有 SEQ ID N0.5所示的相當於NESFATIN多肽的胺基酸編號第25 - 106號 的序列的含有82個胺基酸的多肽顯示攝食抑制和/或體重增加抑制活 性，並且使體脂肪率降低(實施例12、實施例13和實施例34)，並且， 發現通過阻礙NESFATIN-1多肽的功能的抑制，引起動物攝食亢進。 由此，將該多肽命名為NESFATIN-1 (SEQ ID NO. 14) 。 NESFATIN 多肽在其結構內具有鈣結合性和DNA結合性的結構域等，但是 NESFATIN- 1多肽是不含有這些已知結構域結構的序列，獲得該 NESFATIN-1多肽是不能由現有技術所預期到的。另外，已知在生物 體內的肽激素中，以前體蛋白質的形式表達、然後通過蛋白質分解酶切 割的形式的例子有很多，還報導了很多在其作用中與激素原轉化酶
(Prohormone Convertase或Proprotein Convertase: PC)相關的例子。 SEQ ID NO.2的人全長NESFATIN多肽、SEQ ID NO.5的小鼠前體 NESFATIN多肽和SEQ ID NO.8的大鼠前體NESFATIN多肽中存在可能 被激素原轉化酶的亞型PCI/3 (EC 3.4.21.93, Seidah等，DNA and Cell Biology ( USA) 9巻19卯年415 - 424頁)或PC2 ( EC 3.4.21.93， Seidah 等，DNA and Cell Biology ( USA) 9巻1990年415 - 424頁)切割的共 通部位(參照實施例10 ),顯示了 SEQ ID NO.13 - 15所示的NESFATIN
- 1肽被切割的可能性。
將向通過激素原轉化酶切割的部位導入變異的NESFATIN (Mut) 施與大鼠腦室內時，得到了未見攝食抑制效果這樣意外的結果(實施例 14)。這表明NESFATIN-1多肽可能為生物體內與攝食調節和/或體重 調節相關的功能分子，同時表明NESFATIN多肽要發揮功能，被激素原 轉化酶等生物體內含有的蛋白酶加工的過程是很重要的。
由上可知，NESFATIN/NEFA會象胰島素原那樣發揮激素前體功 能，這是完全未知的，本發明中，對NESFATIN/NEFA的表達部位、或 表達PCI/3以及PC2的細胞中的NESFATIN/NEFA的表達進行分析，對 活性和結構進行了深入研究，結果首次發現上述功能。另外，即使存在 激素原轉化酶的識別部位Arg - Arg或Lys - Arg序列也存在不被 PCI/3 、 PC2加工的分泌蛋白，由此可知類推出由NESFATIN/NEF切取 NESFATIN- 1可顯示攝食抑制和/或體重增加抑制活性是不容易的。由上可知，本發明涉及SEQ ID N0.13 - 15所示的NESFATIN- 1 多肽。如前所述，該NESFATIN-1多肽具有攝食抑制和/或體重增加抑 制活性。小鼠的NESFATIN-1多肽的胺基酸序列如SEQ ID N0.14所 示。具有這種序列的NESFATIN - 1多肽可以通過將SEQ ID N0.14的 NESFATIN多肽用激素原轉化酶切割，通過反相色譜等方法純化，或者 通過進行與NESFATIN - 1多肽的抗體的結合和游離的步驟獲得。
進一步對NESFATIN - 1多肽的結構和攝食抑制和/或體重增加抑制 活性進行深入研究，結果發現具有相當於SEQ ID N0.14所示的 NESFATIN多肽的胺基酸編號第24 - 53號的序列的、含30個胺基酸的 新型多肽顯示攝食抑制和/或體重增加抑制活性(實施例20)，將該多 肽命名為NESFATIN - 1M30 ( SEQ ID N0.41 ) 。 NESFATIN - 1M30多 肽的發現顯示，即使在NESFATIN多肽或NESFATIN - 1多肽被生理或 人工切割或分解的情況下，如果存在含有相當於NESFATIN - 1M30的 部分的多肽，則該多肽保有攝食抑制和/或體重增加抑制活性。
並且，對含有30個胺基酸長度的NESFATIN - 1M30的結構的具有
攝食抑制活性的部位的活性進行了研究。結果，該部分肽的、含有16 個胺基酸長度的NESFATIN - 1M16、含有14個胺基酸長度的NESFATIN
- 1M14、含有10個胺基酸長度的NESFATIN - 1M10M保有攝食抑制和 /或體重增加抑制活性(實施例22)。
將上述SEQ IDN0.13、 SEQ IDN0.14或SEQ IDNO.15所示的含有 82個胺基酸的NESFATIN- 1的序列與已知的具有攝食調節作用的因子
的胺基酸序列的同源性進行分析，結果未發現具有強同源性的序列，因 此，由現有技術是不可能預測到這些NESFATIN-1M30、 NESFATIN-1M16、 NESFATIN-1M14、 NESFATIN - 1M10M顯示攝食抑制和/或體 重增加抑制活性的。另外，還了解到，即使是不顯示活性的、來自人的 NESFATIN和NESFATIN - 1,相當於NESFATIN - 1M30、 NESFATIN
- 1M16、 NESFATIN - 1M14、 NESFATIN - 1M10M的多肽也具有活性。
即，本發明涉及SEQ ID N0.39-41所示的NESFATIN - 1M30多 肽，SEQ ID N0.65、 68或71所示的NESFATIN - 1M16多肽，SEQ ID N0.66、 69或72所示的NESFATIN - 1M14多肽，或SEQ ID N0.68、 70 或73所示的NESFATIN- 1M10M多肽。如前所述，該NESFATIN - 1M30 多肽、NESFATIN - 1M16多肽、NESFATIN - 1M14多肽、和NESFATIN-1M10M多肽具有攝食抑制和/或體重增加抑制活性。另外，人的 NESFATIN-1M30多肽的胺基酸序列如SEQ IDN0.39所示。這裡，除 了具有SEQIDNO,3、 SEQIDN0.6、 SEQIDN0.9、 SEQIDN0.13、 SEQ ID N0.14或SEQ ID N0.15所示的序列的多肽之外，在含有SEQ ID N0.39、 SEQ ID NO.40或SEQ ID NO.41所示的胺基酸序列的多肽中， 具有攝食抑制和/或體重增加抑制活性的多肽也包含在NESFATIN -1M30多肽中。作為這種多肽的例子，可列舉在NESFATIN多肽或 NESFATIN - 1多肽被生理或人工切割或分解的多肽中含有相當於 NESFATIN - 1M30的序列的多肽。
在與NEFA/NESFATIN的胺基酸序列和基因的鹼基序列的同源性 高、屬於同一家族的核結合素I (NUCB1)中，對於NUCB1的相當於 NESFATIN - 1M30的部位NUCB1 - M30是否也顯示同樣的活性進行了 研究。結果表明，NUCB1-M30也具有攝食抑制和/或體重增加抑制活 性(實施例23)。另外，將人、大鼠、小鼠的NESFATIN進行比較， 發現各個種的NESFATIN和NUCB1的相當於NESFATIN - 1的部位、 特別是相當於NESFATIN - 1M30的部位，胺基酸序列的保守性 (保存性)高。由以上可以推測，與NESFATIN-1M16多肽、NESFATIN -1M14多肽、NESFATIN - 1M10M多肽同樣，NUCB1的含16個氨基 酸長度的NUCB1 - M16、含14個胺基酸長度的NUCB1 - M14、含10 個胺基酸長的NUCB1-M10M也保有攝食抑制和/或體重增加抑制活 性。
即，本發明涉及SEQ ID NO.101 - 103所示的NUCB1 -M30多肽、 SEQ IDNO.107、110或113所示的NUCB1 -M16多肽、SEQ IDNO.108、 lll或114所示的NUCB1-M14多肽、或SEQ ID NO.109、 112或115 所示的NUCB1 -M10M多肽。如前所述，該NUCB1 -M30多肽、NUCB1 -M16多肽、NUCB1 - M14多肽、和NUCB1 - M10M多肽具有攝食抑
制和/或體重增加抑制活性。
本發明還涉及含有與SEQIDN0.13 - 15、 39-41、 65 - 73、 101-103或107 - 115所示的胺基酸序列的任意一個具有至少60%以上同源性 的胺基酸序列的、具有抑制攝食和/或抑制體重增加活性的多肽。與SEQ IDN0.13-15、 39-41、 65 - 73、 101 - 103或107 - 115所示的胺基酸 序列的同源性優選為70%以上，進一步優選80%以上。作為其代表性例子，可列舉人以外的動物種的NESFATIN-1M30多肽。例如，作為含 有與人的NESFATIN - 1M30多肽的胺基酸序列(SEQ ID N0.39 )具有 60%以上同源性的胺基酸序列的、具有攝食抑制和/或體重增加抑制活性 的多肽的例子，可列舉小鼠NESFATIN-1M30多肽(SEQ ID N0.41 )、 以及大鼠NESFATIN - 1M30多肽(SEQ ID NO.40 )等，但並不限於此。
含有與SEQ ID NO. 13 - 15、 39 -41、 65 - 73、 101 - 103或107- 115 所示的胺基酸序列的任一個具有至少60%以上同源性的胺基酸序列的 多肽中，對於具有攝食抑制和/或體重增加抑制活性的多肽的選擇可通過 將該多肽或編碼該多肽的核酸分子局部或整個導入試驗動物，選擇抑制 該動物的攝食量和/或體重的多肽來進行。作為其它方法將上述多肽的 抗體或可抑制編碼該多肽的基因表達的反義寡核苷酸分子或RNAi分子 等局部或整個導入試驗動物，通過選擇抑制該動物的攝食量和/或體重的 多肽來進行。以下，將這樣的多肽稱為NESFATIN - 1M30變體、 NESFATIN - 1M16變體、NESFATIN - 1M14變體、NESFATIN - 1M10M 變體、NUCB1-M30變體、NUCB1-M16變體、NUCB1 - M14變體和 NUCB1 -M10M變體等。
本發明還涉及含有SEQ ID NO. 13 - 15、 39 — 41、 65 — 73、 101 — 103 或107-115所示胺基酸序列的任一序列中，有一部分胺基酸缺失、插 入或置換得到的胺基酸序列的，具有攝食抑制和/或體重增加抑制活性的 多肽。上述多肽例如可以在SEQIDN0.13 - 15、 39-41、 65 - 73、 101 -103或107- 115所示的胺基酸序列中，通過將一個以上的胺基酸殘基 置換為與該胺基酸在化學性狀或結構上類似的胺基酸來獲得。上述在化 學性狀或結構上類似的胺基酸的置換、即保守性高的胺基酸的置換的具 體方案是本領域技術人員所廣泛已知的。例如，甘氨酸(Gly)與脯氨 酸(Pro)、丙氨酸(Ala)和纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)與異亮氨 酸(lie)、穀氨酸(Glu)與穀氨醯胺(Gin)、天冬氨酸(Asp)與天 冬醯胺(Asn)、半胱氨酸(Cys)與蘇氨酸(Thr) 、 Thr與絲氨酸(Ser) 和Ala、賴氨酸(Lys)與精氨酸(Arg)在化學性狀或結構上類似。另 外一種方法是參照將胺基酸置換的容易程度以行列表示的胺基酸矩 陣、例如PAM (Wilbur, Molecular biology and evolution (USA) 1985 年2巻434 - 447頁)或BLOSUM( Henikoff等，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America ( USA) 1992年89巻10915 - 10919頁)等，考慮其得分的高低，進行胺基酸的置換，這 是本領域技術人員容易進行的。
含有SEQ IDNO.13 - 15、 39-41、 65 - 73、 101 - 103或107 - 115 所示的胺基酸序列的任一序列中有部分胺基酸缺失、插入或置換的氨基 酸序列的多肽中，具有攝食抑制和/或體重增加抑制活性的多肽的選擇可 以與上述NESFATIN變體的選擇同樣進行。以下，將這樣的多肽也稱為 NESFATIN - 1M30變體等。
本發明進一步涉及含有與SEQ ID N0.3、 6或9所示胺基酸序列的 任一序列具有至少60%以上同源性的胺基酸序列；或者含有在SEQ ID N0.3、 6或9所示的胺基酸序列的任意序列中有一部分胺基酸缺失、插 入或置換所得的胺基酸序列，具有攝食抑制和/或體重增加抑制活性的多 肽。可以將該多肽與上述變體同樣，在以下稱為NESFATIN變體。該 NESFATIN變體與上述NESFATIN - 1M30變體等同樣，與SEQ ID N0.3 、 6或9所示胺基酸序列的同源性優選為70%以上，進一步優選80% 以上。
如上所述，由本發明可知，為了使NESFATIN多肽發揮功能，通過
激素原轉化酶等生物體內所含的蛋白酶進行加工的過程是重要的。因 此，該NESFATIN變體優選為在生物體內可以生成NESFATIN-1、 NESFATIN - 1M30、 NESFATIN - 1M16、 NESFATIN - 1M14、 NESFATIN -1M10M、 NUCB1—M30、 NUCB1—M16、 NUCB1—M14或NUCB1 -M10M (含有SEQ IDNO.13 - 15、 39-41、 65 - 73、 101 - 103或107 -115所示胺基酸序列的多肽)或它們的變體的多肽。上述NESFATIN 變體在其胺基酸序列中必須具有生物體內所含的蛋白質酶等切割酶的
識別部位。上述切割酶例如有激素原轉化酶(前體蛋白轉化酶PC)等， 上述激素原轉化酶例如有弗林蛋白酶(furin) 、 PCI (也作為PC3已 知)、PC2、 PACE4、 PC4、 PC6 (也作為PC5已知)、LPC (也作為 PC7或PC8已知)等(The FASEB Journal, 1216, 17巻，2003年7月)。 只要是在末梢或腦室內產生NESFATIN- 1等的即可，對於蛋白酶的種 類沒有特別限定。
根據同樣的理由，對於該切割酶的識另ll部位的位置也沒有特別限 定，如果是NESFATIN變體，衝艮據來自小鼠的NESFATIN - 1 、NESFATIN -2、 NESFATIN - 3和NESFATIN - 2/3的實驗結果(實施例10 )，設定為在產生NESFATIN- 1的激素原轉化酶的識別部位SEQIDN0.3、 6 或9的胺基酸編號第82 . 83、和來自小鼠的NESFATIN中所含的另一 處激素原轉化酶的識別部位SEQIDN0.3、 6或9的第163 . 164胺基酸 之間，即，在相當於SEQ ID N0.3、 6或9的胺基酸編號第82 - 162號 的胺基酸序列中含有至少 一個生物體內所含的切割酶的識別部位，這對 可產生的多肽的活性沒有影響，因此優選。
包括對該變體是否具有在生物體內被切割的活性，以及是否具有攝 食抑制和/或體重增加抑制活性的確認，可以與上述NESFATIN - 1M30 變體等的選擇同樣，將該多肽或編碼該多肽的核酸分子局部或整個導入 試驗動物，通過選擇抑制該動物的攝食量和/或體重的多肽來進行。作為 其它方法將上述多肽的抗體或可抑制編碼該多肽的基因的表達的反義 寡核苷酸分子或RNAi分子等局部或整個導入試驗動物，通過選擇抑制 該動物的攝食量和/或體重的多肽來進行。
本發明的NESFATIN多肽、NESFATIN-1多肽、NESFATIN-1M30、 NESFATIN-1M16、 NESFATIN - 1M14、 NESFATIN - 1 Ml 0M、 NUCB1-M30、 NUCB1-M16、 NUCB1 - M14或NUCB1 - M10M也包 括在N末端或C末端附加至少一個以上胺基酸所得的多肽。上述 NESFATIN多肽等中例如包括在SEQ ID N0.3 、 SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.9的胺基酸序列的N末端附加曱硫氨酸殘基、乙醯基或焦穀氨酸等 所得的多肽，以及在N末端或C末端附加適當的標籤序列(典型的是組 氨酸標籤或FLAG標籤)所得的多肽。具有上述結構的NESFATIN多肽 等具有使用金屬螯合劑載體(金屬年k一h擔體)或抗體的純化容易進 行的優點。另外，NESFATIN在生物體內被激素原轉化酶加工時，認為 可產生NESFATIN- 1的C末端附加了激素原轉化酶識別部位的多肽， 這樣的多肽也包括在本發明的多肽中。
本發明的NESFATIN多肽、NESFATIN-1多肽、NESFATIN-1M30、 NESFATIN-1M16、 NESFATIN - 1 Ml 4、 NESFATIN - 1 Ml 0M、 NUCB1-M30、 NUCB1-M16、 NUCB1 - M14或NUCB1 - M10M也包 括至少一個胺基酸殘基被化合物或肽修飾所得的多肽。上述NESFATIN 多肽等包括例如採用？>知的方法(Hermanson等，Bioconjugate techniques (USA) 1996年發行Academic Press ),使NESFATIN多肽等以外的肽 或螢光物質等與SEQIDN0.3、 SEQIDN0.6或SEQIDN0.9所示的序列等酶或化學締合得到的多肽，例如有附加來自水母的螢光蛋白或分 泌型鹼性磷酸酶的胺基酸序列所得的多肽(所謂的融合蛋白)。例如， 與來自水母的螢光蛋白形成的融合蛋白通過測定其螢光強度，與分泌型
鹼性磷酸酶形成的融合蛋白通過測定使該酶與其底物反應產生的顯 色、發光或螢光的強度，可以容易地檢測出這些融合蛋白的存在。上述
NESFATIN多肽等通過實施例6的方法等試驗其活性，可以鑑定其對4聶 食調節和/或體重調節的作用。
本發明還涉及用於抑制攝食和/或抑制體重增加的藥物組合物，該藥 物組合物含有NESFATIN多肽、NESFATIN-1多肽、NESFATIN-1M30、 NESFATIN-1M16、 NESFATIN - 1M14、 NESFATIN - 1M10M、 NUCB1-M30、 NUCB1—M16、 NUCB1 — M14或NUCB1 - M10M或它 們的變體(以下總稱為"NESFATIN多肽等")中的任何一種、或者含有 所述NESFATIN多肽等的胺基酸序列的一部分的肽作為有效成分。含有 所述NESFATIN多肽等的胺基酸序列的一部分的肽是指在保持攝食抑 制和/或體重增加抑制活性的限度下使該多肽的 一 部分胺基酸序列缺失 所得的肽。

本發明涉及用於治療或預防由於攝食或體重增加亢進而出現問題 的疾病的的藥物組合物，該藥物組合物含有上述NESFATIN多肽等中的 任何一種、或者含該NESFATIN多肽等的胺基酸序列的一部分的肽作為 有效成分。
本發明的NESFATIN多肽等的藥理學效果通過將NESFATIN多肽 施與大鼠第三腦室內(實施例6和25)、將NESFATIN-1多肽施與大 鼠第三腦室內(實施例12、 13、 27和34)、將NESFATIN-1多肽施 與小鼠腹腔內或皮下(實施例18和實施例19)、將NESFATIN - 1M30 多肽施與小鼠腹腔內(實施例20)等所例舉的結果證明。另外，通過將 NESFATIN-1多肽施與顯示瘦素抗性的動物模型Zucker ( fa/fa)大鼠 的第三腦室內(實施例17)，可例示在病態動物模型中的藥理學效果， 還可例示對於在人的肥胖中也成為問題的瘦素抗性病態的藥理學效 果。並且，通過Agouti yellow小鼠的施與實驗(實施例18)，從藥理 學上顯示經由與已知的攝食調節相關的因子一一黑素皮質素系不同機理進行攝食控制的可能性。由這些例舉的事實證明，NESFATIN多肽等 可以用作治療或預防攝食或體重增加亢進成為問題的疾病的藥物組合物。
攝食或體重增加亢進成為問題的疾病例如有肥胖、糖尿病、高血 壓、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臟病、腦血管疾病、睡眠呼吸 暫停症候群、整形外科疾病、月經異常和惡性腫瘤等。肥胖也包括並發 起因於肥胖或與肥胖相關的健康障礙、或者臨床上預測可能並發時必須 進行醫學減量的病態-肥胖症。整形外科的疾病包括由於體重超重而導 致的變形性關節病、腰推病(變形性脊推炎)、腰痛(腰部劇痛)等。 另外，惡性腫瘤包括乳癌、子宮癌、結腸癌、腎癌、食道癌、胰癌、肝 癌和膽嚢癌。
本發明的藥物組合物可以含有藥學上可接受的任何添加劑。使用藥 學上可接受的添加劑製劑可按照文獻"REMINGTON:THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY第20版(University of the Sciences in Philadelphia)著Williams&Wilkins公司2000年12月15日發行，，所述 方法實施。上述藥物組合物的一個形態可以是以溶解、懸浮或乳化於無 菌的水性液體或油性液體中製備的液體製劑的形式供給。作為這種溶 劑，如果是水性液體，則可列舉注射用蒸餾水、生理食鹽水等，除此之 外還可以添加滲透壓調節劑(例如D -葡萄糖、D -山梨醇、D -甘露醇、 氯化鈉等)，或並用適當的溶解助劑例如醇(例如乙醇)、多元醇(例 如丙二醇、聚乙二醇)、非離子性表面活性劑(例如聚山梨酯80、聚氧 乙烯氫化蓖麻油50)等。有時使用油性液體作為溶劑，則該油性液的例 子有芝麻油、大豆油等，作為溶解助劑可以並用苯曱酸苄酯、苄醇等。 上述液體製劑中，可以適當使用緩衝劑(例如磷酸鹽類緩衝劑、乙酸鹽 類緩衝劑)、止痛劑(例如苯扎氯銨、鹽酸普魯卡因等)、穩定劑(例 如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存劑(例如抗壞血酸、異抗壞血酸 以及它們的鹽等)、著色劑(例如銅葉綠素、卩-胡蘿蔔素、紅色2號、 藍色l號等)、防腐劑(例如對羥基苯甲酸酯、苯酚、氯化苄乙銨、苯 扎氯銨等)、增稠劑(例如羥丙基纖維素、羧甲基纖維素及它們的鹽等)、 穩定劑(例如人血清白蛋白、甘露醇、山梨醇等)、矯味劑(例如薄荷 醇、柑橘香精等)等添加劑。其它的藥物組合物(為了與上述幾種"藥 物組合物"的表述統一)的形式有散劑、片劑、顆粒劑、膠嚢劑、丸劑、栓劑、含片等固體製劑。以口服製劑的形式施與的固體製劑中，添加劑 可以使用賦形劑(例如結晶性纖維素、乳糖、澱粉等)、潤滑劑(例如 硬脂酸鎂、滑石粉等)、粘合劑(羥丙基纖維素、羥丙曱基纖維素、聚 乙二醇等)、崩解劑(例如澱粉、羧曱基纖維素鈣等)等。還可根據需 要使用防腐劑(例如千醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸曱酯、對羥基苯曱酸 丙酯等)、抗氧化劑、著色劑、甜味劑等添加劑。其它的形式還有黏膜 用藥物組合物，該製劑中，以賦與對黏膜的吸附性、滯留性為主要目的， 添加劑可含有粘著劑、粘著增強劑、增稠劑、稠化劑等(例如粘蛋白、 瓊脂、明膠、果膠、卡拉膠、藻酸鈉、刺槐豆膠、黃原膠、黃蓍膠、阿
拉伯膠、脫乙醯殼聚糖、普魯蘭、蠟狀澱粉(waxy starch)、硫糖鋁、 纖維素及其衍生物(例如羥丙曱基纖維素、聚甘油脂肪酸酯、丙烯酸(甲 基)丙烯酸烷基酯共聚物或它們的鹽、聚甘油脂肪酸酯等))。但是， 供給生物體的藥物組合物的形態和溶劑或添加劑並不限於此，可以由本 領域技術人員適當選擇。
為了改善症狀，上述藥物組合物可以口服或非口服施與。口服施與 時，可以選擇顆粒劑、散劑、片劑、膠嚢劑、溶液劑、糖漿劑、乳劑或 混懸劑、酏劑等劑型。非口服施與時例如可以製成經鼻製劑，也可以選 擇溶液製劑、混懸劑、固體製劑等。其它非口服的形式還可以是注射劑， 注射劑可選擇皮下注射劑、靜脈注射劑、輸液注射劑、肌肉注射劑、腦 室內注射劑或腹腔內注射劑等。其它非口服施與中使用的製劑還有栓 劑、舌下劑、經皮劑、經鼻劑以外的經黏膜施與劑等。並且能夠以包含 或塗布於支架或血管內栓塞劑的方式局部施與血管內。
上述藥物組合物的給藥量根據患者的年齡、性別、體重、症狀、治 療效果、給藥方法、處理時間或該藥物組合物中含有的活性成分的種類 等而不同，通常成人每人每次在0.1mg- 500mg的範圍、優選以0.5 mg -200mg的範圍給藥。但是，給藥量因各種條件而變動，因此也有比上 述給藥量少的量即足夠的情形，還有需要超過上述範圍的給藥量的情 形。
編碼NESFATIN多肽等的基因可以以基因治療的方式使用。該基因 治療是指例如將該基因導入生物體內達到治療效果。將編碼可產生治療 效果的蛋白質的基因導入生物體內，使其表達，從而治療疾病的方法是 公知的(金田著日本藥理雜誌2001年發行1H巻299- 306頁)。還可以通過施與導入編碼NESFATIN多肽等的基因的任一種、表達 該多肽的形式的轉化體、優選使用可移植到要導入的種中的宿主的轉化 體，通過由該轉化體生成的NESFATIN多肽等進行治療。
<編碼具有攝食抑制和/或體重調節抑制活性的多肽的核酸分子〉
本發明進一步涉及編碼上述NESFATIN多肽等中的任何一個的核 酸分子。編碼上述NESFATIN多肽的核酸分子有含有編碼人前體 NESFATIN多肽的基因的鹼基序列的核酸分子(SEQ ID NO.l )、含有 編碼小鼠前體NESFATIN多肽的基因的鹼基序列的核酸分子(SEQ ID NO.4)、含有編碼大鼠前體NESFATIN多肽的基因的鹼基序列的核酸 分子(SEQ ID NO.7)、含有編碼除去了信號肽部分的成熟型人 NESFATIN多肽的基因的鹼基序列的核酸分子(SEQIDNO.10)、含有 編碼小鼠成熟型NESFATIN多肽的基因的鹼基序列的核酸分子(SEQ ID NO.ll)、或含有編碼大鼠成熟型NESFATIN多肽的基因的鹼基序列的 核酸分子(SEQIDNO.12)等。
編碼上述NESFATIN - 1多肽的核酸分子有編碼人NESFATIN - 1 多肽的核酸分子(SEQ ID NO.18 )、編碼小鼠NESFATIN - 1多肽的核 酸分子(SEQ ID NO.19 )、以及編碼大鼠NESFATIN - 1多肽的核酸分 子(SEQIDNO.20)等。
編碼上述NESFATIN- 1M30多肽的核酸分子有編碼人NESFATIN -1M30多肽的核酸分子(SEQ ID N0.44 )、編碼小鼠NESFATIN - 1M30 多肽的核酸分子(SEQ ID N0.46 )、編碼大鼠NESFATIN - 1M30多肽 的核酸分子(SEQIDN0.45)等。
編碼NESFATIN - 1M16多肽的核酸分子有編碼人NESFATIN -1M16多肽的核酸分子(SEQIDN0.74)、編碼小鼠NESFATIN - 1M16 多肽的核酸分子(SEQ ID NO.80)、以及編碼大鼠NESFATIN-1M16 多肽的核酸分子(SEQIDN0.77)等。
編碼NESFATIN - 1M14多肽的核酸分子有編碼人NESFATIN -1M14多肽的核酸分子(SEQIDN0.75)、編碼小鼠NESFATIN - 1M14 多肽的核酸分子(SEQ ID NO.81)、以及編碼大鼠NESFATIN - 1M14 多肽的核酸分子(SEQ ID NO.78)等。
編碼NESFATIN - 1M10M多肽的核酸分子有編碼人NESFATIN-1M10M多肽的核酸分子(SEQ ID N0.76)、編碼小鼠NESFATIN-1M10M多肽的核酸分子(SEQIDNO,82)、和編碼大鼠NESFATIN-1M10M多肽的核酸分子(SEQIDN0.79)等。
編碼NUCB1 - M30多肽的核酸分子有編碼人NUCB1 - M30多肽 的核酸分子(SEQIDNO.104)、編碼小鼠NUCB1 - M30多肽的核酸分 子(SEQIDNO.106)、編碼大鼠NUCB1 - M30多肽的核酸分子(SEQ ID NO. 105)等。
編碼NUCB1-M16多肽的核酸分子有編碼人NUCBl-M16多肽 的核酸分子(SEQIDNO.116)、編碼小鼠NUCB1 - M16多肽的核酸分 子(SEQ ID N0.122 )、和編碼大鼠NUCB1 - M16多肽的核酸分子(SEQ IDNO.119)等。
編碼NUCB1-M14多肽的核酸分子有編碼人NUCB1-M14多肽 的核酸分子(SEQIDNO.117)、編碼小鼠NUCB1 - M14多肽的核酸分 子(SEQ ID NO. 123 )、以及編碼大鼠NUCB1 - M14多肽的核酸分子(SEQ ID NO. 120)等。
編碼NUCB1-M10M多肽的核酸分子有編碼人NUCB1 - M10M 多肽的核酸分子(SEQIDNO.118)、編碼小鼠NUCB1-MIOM多肽的 核酸分子(SEQIDN0.124)、以及編碼大鼠NUCB1 - M10M多肽的核 酸分子(SEQIDNO.121)等。
如上所述，本發明的NESFATIN多肽等也包括在N末端或C末端 附加至少 一個以上胺基酸所得的肽，以及至少 一個胺基酸殘基被化合物 或肽修飾所得的肽。作為編碼上述NESFATIN多肽等的核酸分子，例如 以NESFATIN多肽為例，編碼SEQ ID NO.3、 SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.9序列的N末端附加任意的多肽所得的多肽的核酸分子可以通過在 SEQIDNO,IO、 SEQIDNO.ll或SEQIDNO.12的5，末端具有ATG鹼 基序列，在其後附加下述鹼基序列獲得，所述鹼基序列連綴了編碼要附 加的胺基酸序列的密碼子。另外，編碼在NESFATIN多肽等的胺基酸序 列的N末端和/或C末端附加激素原轉化酶等蛋白酶識別(切割)序列 所得的多肽的核酸分子也包括在本發明的核酸分子中，但並不限於此。
除此之外，也包括含有下述鹼基序列的核酸分子，所述鹼基序列為 例如將編碼來自水母的螢光蛋白或分泌型鹼性磷酸酶的基因序列以翻 譯成各蛋白質的胺基酸序列的形式與編碼含有SEQ ID N0.3、 SEQ IDN0.6或SEQ ID N0.9所示胺基酸序列的多肽的基因序列的5，或3'末端 結合而成的鹼基序列。
編碼上述NESFATIN等變體的核酸分子包括編碼含有與SEQ ID N0.3、 6、 9、 13-15、 39-41、 65 - 73、 101 - 103或107 - 115所示的 胺基酸序列中的任一個具有至少60%以上同源性的胺基酸序列、並具有 攝食抑制和/或體重增加抑制活性的多肽的核酸分子，優選該同源性為 70%以上，進一步優選80%以上。其代表性的例子有以NESFATIN-1M30多肽為例，可列舉人以外的動物種的NESFATIN- 1M30多肽等。 例如，作為編碼含有與人的NESFATIN - 1M30多肽的胺基酸序列(SEQ IDN0.39)具有60%以上同源性的胺基酸序列、具有攝食抑制和/或體重 增加抑制活性的多肽的核酸分子，可列舉編碼小鼠NESFATIN - 1M30 多肽的核酸分子(SEQIDN0.46)、編碼大鼠NESFATIN - 1M30多肽 的核酸分子(SEQIDN0.45)、編碼人的NUCBl - M30多肽的核酸分 子(SEQIDNO.104)、編碼小鼠NUCB1-M30多肽的核酸分子(SEQ ID NO.106)以及編碼大鼠NUCBl-M30多肽的核酸分子(SEQ ID NO.105)等，但並不限定於這些核酸分子。
另外，編碼上述NESFATIN等變體的核酸分子也包括編碼含有在 SEQIDN0.6、 9、 13 — 15、 39-41、 65 - 73、 101 — 103或107 — 115所 示的胺基酸序列的任一個中有部分胺基酸缺失、插入或置換所得的氨基 酸序列，並具有攝食抑制和/或體重增加抑制活性的多肽的核酸分子。
並且，本發明還涉及與SEQIDN0.4、 7、 11、 12、 18、 19、 20、 44 -46、 74 - 82、 104 - 106或116-124所示的鹼基序列或該鹼基序列的 部分序列在嚴格(strigent)條件下雜交，且編碼具有攝食抑制和/或體重 增加抑制活性的多肽的核酸分子。這樣的核酸分子可通過使用SEQ ID N0.4、 7、 10、 11、 12、 18、 19、 20、 44 -46、 74 - 82、 104- 106或116 -124所示的鹼基序列或該鹼基序列的部分序列的雜交法獲得。具體來 說，將插入了來自任意生物種的cDNA或基因組DNA片段等的質粒載 體或噬菌體載體導入大腸桿菌等宿主中，製備文庫，將其在含有適當選 擇試劑的瓊脂培養基板上培養。然後，將生成的重組大腸桿菌克隆或噬 菌體克隆轉印硝基纖維素膜等，在含有鹼或表面活性劑的狀態下溶解菌 體或噬菌體，將其中所含的DNA固定在膜上，將膜上的含有SEQ ID N0.4、 7、 11、 12、 18、 19、 20、 44 -46、 74- 82、 104 - 106或116-124所示的鹼基序列或該鹼基序列的部分序列的DNA用"P等標記，與
膜;x2SSC等洗滌，l去多餘的探針，然'後在^"嚴格(ltrigenl)^件下、 例如x0.1 SSC、 65°C,或者中等程度的嚴格(strigent)條件例如x0.5 SSC、 65。C的條件下洗滌，將該膜在暗處與X射線膠片接觸，使其感光。在低 溫冷藏箱等中感光數小時至數天，使X射線膠片顯影，檢測感光的斑 點，收集對該膜進行了轉印的原有的板上所對應位置的大腸桿菌或噬菌 體克隆進行培養，然後進行插入到載體中的基因序列的分析，可以獲得 與NESFATIN基因、NESFATIN - 1基因或NESFATIN - 1M30基因的同 源性高的基因。另外使用該基因序列進 一 步進行cDNA或基因組文庫的 雜交，取得克隆或通過引物延伸法等鑑定周邊序列，由此解析編碼蛋白 質的基因結構，荻得與NESFATIN、 NESFATIN- 1 、 NESFATIN - 1M30、 NESFATIN - 1M16、 NESFATIN - 1M14、 NESFATIN - 1M10M、 NUCB1 -M30、 NUCB1-M16、 NUCB1 - M14或NUCB1 - M10M具有同源性 的分子的核酸分子。並且，在與SEQIDN0.4、 7、 10、 11、 12、 18、 19、 20、 44 -46、 74 - 82、 104 - 106或116 - 124所示的鹼基序列或該鹼基 序列的部分序列在嚴格(strigent)條件下雜交的核酸分子中選擇編碼具 有攝食抑制和/或體重增加抑制活性的多肽的核酸分子，可通過將該核酸 分子所編碼的多肽、或者將該核酸分子局部或整個導入試驗動物，選擇 抑制該動物的攝食量和/或體重的核酸分子進行。作為其它方法，可以是 將與該核酸分子所編碼的多肽結合的抗體、或者可抑制該核酸分子的基 因的表達的反義寡核苷酸分子或RNAi分子等局部或整個導入試驗動 物，通過選擇抑制該動物的攝食量和/或體重的核酸分子來進行。

本發明還涉及含有編碼上述NESFATIN多肽等中的任意多肽的核 酸分子的載體。使用上述含有編碼NESFATIN多肽等的核酸分子的載 體，向微生物等宿主細胞中導入NESFATIN多肽等的基因等，製備重組 體，由此可以穩定地保存或複製該基因。整合到具有在宿主細胞內複製 的功能的載體中的、編碼NESFATIN多肽等的基因可如下製備將重組 體細胞在適當的培養基中培養，通過細胞增殖或擴增細胞內導入基因的 拷貝數，可以大量地製備該基因的核酸分子。該核酸分子也可以在控制該核酸分子表達的調節性核酸分子的控
制下功能性地結合。控制該核酸分子表達的調節性核酸分子例如有編
碼調節序列的核酸分子等，所述調節序列用於在宿主細胞內表達整合了 啟動子序列、增強子序列等的基因，本領域技術人員可適當選擇。編碼
制下整合，在任意的宿主細胞(例如微生物、哺乳類細胞、昆蟲細胞等)
中可大量生產NESFATIN多肽等。
作為可在本發明中使用的載體，可列舉在要表達的基因上遊保有啟 動子、在下遊具有聚腺苷酸化位點和轉錄終止序列等的表達載體。脊稚 動物的上述表達載體例如有保有SV40的初期啟動子的pSV2dhfr( Mol. Cell. Biol., 854, 1981 ) 、 pcDNA3.1 ( + ) (Invitrogen)以及pCAGGS (Gene, 108， 193 - 200, 1991 )等，但並不限於此，本領域技術人員 可適當選擇。為了進行抑制攝食或抑制體重增加的治療，上述載體可以 導入到哺乳類細胞中。
使用大腸桿菌作為宿主時，例如可使用pBR322及其改良載體等， 但並不限於此，可以利用公知的各種菌抹和載體。啟動子例如有大腸杆 菌乳糖(lac)、大腸桿菌trp等的啟動子，但並不限於此。該啟動子均 被特性化，為本領域技術人員所熟知，可以合成或者由已知的質粒組 衣。
具體的例子有在實施例5中顯示，通過將編碼NESFATIN多肽的 核酸分子整合到載體中，製備大腸桿菌的重組體，可以製備保持攝食抑 制和/或體重增加抑制活性的NESFATIN多肽。另夕卜，實施例16中顯示， 使SEQ ID N0.13 - 15的胺基酸序列以與穀胱甘肽-S -轉移酶(GST) 等的融合蛋白的形式表達，通過與固定有穀胱甘肽的擔載體的吸附或脫 吸附反應進行純化，然後切割GST部分，進行純化，由此通過基因重組 法製備NESFATIN- 1肽。並且在實施例16中還顯示，將編碼NESFATIN -1多肽的核酸分子整合到載體中，製備大腸桿菌的重組體，可以製備 保持攝食抑制和/或體重增加抑制活性的NESFATIN - 1多肽。
為了抑制攝食和/或抑制體重增加，通過將本發明的載體採用基因療 法導入到哺乳類細胞中，可以實現治療效果。將編碼帶來治療效果的蛋 白質、即NESFATIN多肽等的基因導入到哺乳類動物中使其表達，由此 治療疾病，該方法是公知的(金田著日本藥理雜誌2001年發行117巻299 - 306頁)。

本發明涉及含有編碼上述NESFATIN多肽等的任意多肽的核酸分 子的轉化體。上述轉化體可通過將編碼該多肽的基因導入到宿主細胞中 進行轉化獲得。轉化方法可以為生物學方法、物理學方法、化學方法等。 生物學方法例如有利用使用病毒載體的方法、利用特異性受體的方 法、細胞融合法(HVJ (仙臺病毒))、聚乙二醇(PEG)、電細胞融 合法、微核融合法(移入染色體)。物理學方法有使用微量注射法、電 穿孔法、基因槍(gene gun)的方法。化學方法有磷酸鈣沉澱法、脂質 體法、DEAE葡聚糖法、原生質體法、紅細胞影法(赤血球^一7卜法)、 紅細胞膜影法(赤血球膜^一7 h法)、微膠嚢法，本領域技術人員可 適當選擇實施。另夕卜，所得轉化體可按照常規方法培養，生成NESFATIN
多肽等。培養所使用的培養基可以根據所採用的宿主細胞適當採用常用 的各種，其培養也可以在適合宿主細胞生長發育的條件下實施。
作為在真核細胞中表達目標蛋白質的方法，已知其本身在該領域有 很多體系。例如，在酵母中表達的體系有日本特開昭57- 159489號公 報所記載的"酵母中蛋白質的表達"，在植物細胞中表達的體系有日本特 許2517813號公報所記載的"用於將生物學物質導入活細胞的改良的方 法和裝置"或日本特開2003 -274953號記載的"向植物細胞導入基因的 方法和導入基因用的植物細胞處理裝置"，在昆蟲細胞中表達的體系如 日本特開昭60 - 37988號公報所記載的"重組杆狀病毒表達載體的製備 方法"，在哺乳類動物細胞中表達的體系有日本特開平2-171198號公 報所記載的"真核性表達的改良"，當然除此之外還有很多。
轉化中使用的宿主細胞可以使用真核宿主細胞和原核宿主細胞的 任意細胞。真核宿主細胞包含脊推動物、酵母、植物細胞和昆蟲細胞等。 植物細胞可以是雙子葉或單子葉植物的組織片或由組織分離的細胞、或 者來自由組織形成的愈傷組織的細胞等。脊推動物例如有CHO細胞、 293T細胞和COS7細胞等。原核宿主細胞有大腸桿菌、枯草桿菌和鏈黴 菌等，例如大腸桿菌常使用大腸桿菌K12菌林。使用脊推動物作為宿主 細胞時，為了通過細胞療法治療攝食抑制或體重增加抑制，所得轉化體 可以導入到哺乳類動物中。該轉化體優選已經確認導入的、編碼200680022622.8
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NESFATIN多肽等的基因表達的轉化體。另外，在施與該轉化體時，該 轉化體優選分散於各種緩衝劑、生理食鹽液等中施與(日本特開2003 -342201號公報)。

本發明涉及與上述NESFATIN多肽等中任 一個結合的抗體。上述抗 體可以使用本領域技術人員所周知的方法獲得。本發明中使用的抗體可 以是多克隆抗體或單克隆抗體(Milstein等，Nature (英國)1983年10 月6日發行305巻5934號537- 540頁)。例如NESFATIN多肽、 NESFATIN-1多肽、NESFATIN — 1M30多肽、NESFATIN - 1M16、 NESFATIN-1M14、 NESFATIN - 1M10M、 NUCB1-M30、 NUCB1 -M16、 NUCB1 -M14或NUCB1 - M10M的多克隆抗體可以由用抗原致 敏的哺乳動物的血清等中回收。作為其它例子，還可以是由用具有含 NESFATIN多肽等的部分序列的序列的肽致敏的哺乳類動物的血清等中 回收。更具體的例子如實施例3所示，將相當於SEQIDN0.8的胺基酸 編號第141-152號的序列的肽(SEQIDN0.24)與載體蛋白結合，以 其作為抗原對動物免疫，由此可以得到與NESFATIN多肽等結合的抗 體。另外，該抗體施與動物時，顯示該動物攝食亢進和體重增加的效果 (實施例7)。另外的具體例子還有將相當於SEQIDN0.8的胺基酸 編號第48 - 62號的序列的肽(SEQ ID N0.32)與載體蛋白結合，以其 作為抗原對動物免疫，由此可以得到與NESFATIN多肽等結合的抗體 (實施例10 )。該SEQ ID N0.32的多肽含有人、小鼠、大鼠的NESFATIN 多肽、NESFATIN - 1多肽和NESFATIN - 1M30多肽中共通的胺基酸序 列，因此所得的抗體可以與所有這些多肽結合。該抗體施與動物時，顯 示該動物4聶食亢進和體重增加的效果(實施例14)。除此之外還可以是 由公開的NESFATIN多肽等的序列製備適合作為抗原的肽，製備抗體。
上述NESFATIN多肽等的單克隆抗體可以是從抗原致敏的哺乳動 物中取出免疫細胞，與骨髓瘤細胞等進行細胞融合，將所獲得的雜交瘤 進行克隆，由該培養物中回收。
上述抗體可以進行適當標記，用於上述NESFATIN多肽等的檢測。 還可以不標記該抗體，而是標記與該抗體特異性結合的物質例如蛋白A 或蛋白G，用於間接性的檢測。具體的檢測方法可例舉ELISA法。為獲得本發明的抗體而使用的抗原例如可如下獲得將編碼上述
NESFATIN多肽、NESFATIN — 1多肽、NESFATIN - 1M30、 NESFATIN -1M16、 NESFATIN-1M14、 NESFATIN - 1M10M、 NUCB1-M30、 NUCB1 - M16、 NUCB1 -MM或NUCBl - M10M或它們的變體的核酸 分子或者其一部分整合到表達載體中，將其導入適當的宿主細胞，製備 轉化體，培養該轉化體，使重組蛋白表達，從培養體或培養上清中純化 表達的重組蛋白。或者，化學合成含有由該基因編碼的胺基酸序列、或 由全長cDNA編碼的胺基酸序列的部分胺基酸序列的低聚肽，作為免疫 原使用。被免疫的動物可以使用小鼠、大鼠、兔、山羊、馬、豚鼠等， 本領域人員可適當選擇。
本發明的研究中，製備與NESFATIN多肽、NESFATIN-1多肽和 NESFATIN- 1M30多肽結合的抗體，施與動物的腦內，可見這些動物的 攝食量亢進(實施例7和實施例14)。通過將抑制NESFATIN基因表 達的反義RNA(寡核苷酸)施與動物的腦內，可見該動物攝食量亢進或 體重增加(實施例15)。這顯示NESFATIN多肽、NESFATIN - 1多肽 或NESFATIN- 1M30多肽在腦內實際上發揮了攝食調節和/或體重調節 的功能。並且，NESFATIN多肽、NESFATIN-1多肽或NESFATIN-1M30多肽在末梢(血液)或者腦內濃度的升高顯示抑制攝食和/或抑制 體重增加，抑制該多肽活性或表達的物質的作用顯示攝食亢進和/或體重 增加亢進，由此證明，NESFATIN多肽、NESFATIN- 1多肽和/或 NESFATIN- 1M30多肽是在生物體內在攝食調節和/或體重調節中擔負 著中心作用的因子。與此同時，抑制NESFATIN多肽、NESFATIN-1 多肽和/或NESFATIN - 1M30多肽的活性或者抑制其表達的物質本身可 以用作攝食減少或體重降低成為問題的疾病或症狀、例如厭食症、功能 性胃腸病(機能性消化不良)、或者癌症、炎症性疾病、垂體.甲狀腺*腎 上腺等功能降低、手術後或者過度應激等導致的攝食抑制和/或體重增加 抑制狀態的治療、診斷、治療劑的篩選等。
即，本發明涉及抑制NESFATIN多肽、NESFATIN- 1多肽、 NESFATIN - 1M30多肽、NESFATIN — 1M16 、 NESFATIN - 1M14 、 NESFATIN-1M10M、 NUCB1—M30、 NUCB1-M16、 NUCB1 - M14或NUCB1-M10M的活性或生成的物質。更進一步優選涉及該物質是 顯示攝食亢進和/或體重增加亢進活性的物質。作為抑制NESFATIN多 肽等的活性的物質，包括具有與NESFATIN多肽等結合的特徵的物質、 以及未必與這些多肽結合的物質。前者的例子有NESFATIN多肽等的抗 體，抗體可以使用上述抗體。後者的例子有NESFATIN多肽等的顯性陰 性多肽等。這裡，顯性陰性是指相對於野生型在量和質方面都優先作 用、抑制野生型功能的變異體。顯性陰性可通過使野生型胺基酸的一部 分缺失或置換製備。
本發明還涉及抑制編碼NESFATIN多肽、NESFATIN-1多肽、 NESFATIN - 1M30多肽、NESFATIN — 1M16 、 NESFATIN — 1M14 、 NESFATIN- 1M10M、 NUCB1-M30、 NUCB1-M16、 NUCB1 - M14 或NUCB1 -MIOM的基因表達的物質。上述物質例如有反義寡核苷酸、 RNAi分子等。這裡，編碼NESFATIN多肽等的基因是指含有編碼 NESFATIN多肽等的核酸分子的鹼基序列的全體或 一部分作為連續或非 連續單元的核酸分子。基因的表達包括由該基因轉錄編碼NESFATIN多 肽等的核酸分子的過程；使轉錄的核酸分子穩定的過程；通過翻譯，由 轉錄的核酸分子生成NESFATIN多肽等的過程。因此，抑制基因的表達 是指抑制編碼NESFATIN多肽等的基因的轉錄、穩定化、翻譯的任意過 程。
上述反義寡核苷酸例如可通過使用編碼NESFATIN多肽的基因序 列來設計。上述反義寡核苷酸有具有SEQ ID N0.31結構的乇^水^ 乂型反義寡核苷酸。該反義寡核苷酸例如如實施例15所示，通過施與 動物，顯示該動物的攝食尤進或體重增加的亢進作用。已知反義寡核苷 酸為了避免在細胞內的分解而採取各種修飾或結合方式，本領域技術人 員可以選擇適當的反義寡核苷酸的結構(Curreck等，Europian Journal of Biochemistry (英國)2003年270巻1628 - 486頁)。其結構可例舉天 然型(D -低聚)、硫代磷酸酯型(S -低聚)、磷酸曱酯型(M -低聚)、 氨基磷酸脂型(A -低聚)、2， - O -曱基型D -低聚、嗎啉酸酯型(Mo -低聚)、聚醯胺核酸等。還可以使用長度為10個鹼基至70個鹼基、 優選15個鹼基至30個鹼基的寡核苷酸。
RNA幹涉(RNAi, RNA interference)是指21-23個殘基的雙糹連 RNA分解含有相同序列的靶RNA，由此強烈抑制其表達的現象。因此，含有下述雙鏈結構的RNA可用於抑制NESFATIN多肽等的基因表達， 所述雙鏈結構具有與編碼NESFATIN多肽等的基因的mRNA相同的鹼 基序列。為了獲得RNAi效果，優選使用具有至少20個以上連續的鹼基 序列的雙鏈結構RNA。雙鏈結構可以由不同的鏈構成，也可以是由一個 RNA的莖-環結構而產生的雙鏈。通過使各鏈的3'—側具有兩個鹼基 的突出端，可以增強基因表達抑制作用。RNAi的設計中使用的序列和 長度或結構可以由本領域技術人員嘗試各種改變，使基因表達抑制作用 強的RNAi實現最佳化(Milhavet等，Pharmacological Review (美國) 2003年55巻629 - 648頁)。
上述反義寡核苷酸分子和RNAi分子可如下製備將含有與該分子 的核酸序列互補的鹼基序列的核酸分子整合到載體中，將其導入宿主細 胞，轉化，通過培養轉化體製備。所使用的宿主細胞和轉化的方法如上 述中所述，可以由本領域技術人員適當選擇。另外，作為其它
方法，反義寡核苷酸分子和RNAi分子可通過化學合成法製備。

本發明還涉及用於使食4夂亢進或體重增加亢進的藥物組合物，該藥 物組合物含有抑制NESFATIN多肽等活性或生成的物質、或抑制編碼 NESFATIN多肽等的基因的表達的物質作為有效成分。該藥物組合物可 應用於攝食或體重增加受到抑制成為問題的疾病或症狀。攝食或體重增 加受到抑制成為問題的疾病或症狀例如有厭食症、功能性胃腸病(機能 性消化不良)、或者癌症、炎症性疾病、垂體 甲狀腺 腎上腺等功能 降低、手術後或過度應激導致的攝食抑制和/或體重增加抑制狀態等。
本發明的藥物組合物可以含有藥學上可接受的任何添加劑。使用藥 學上可接受的添加劑製成的製劑可以按照"REMINGTON:THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY第20版(University of the Sciences in Philadelphia)著Williams&Wilkins公司2000年12月15日 發行"所述方法實施。上述藥物組合物的一個形態可以是以溶解、懸浮 或乳化於無菌的水性液體或油性液體中製備的液體製劑的形式供給。作 為這種溶劑，作為水性液體則可以是注射用蒸餾水、生理食鹽水等，除 此之外還可以添加滲透壓調節劑(例如D-葡萄糖、D-山梨醇、D-甘 露醇、氯化鈉等)，或結合使用適當的溶解助劑例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子性表面活性劑(例如聚山梨 酯80、聚氧乙烯氳化蓖麻油50)等。有時作為溶劑使用油性液體，作 為該油性液體的例子有芝麻油、大豆油等，溶解助劑可以並用苯曱酸節 酯、千醇等。上述液體製劑中，可以適當使用緩衝劑(例如磷酸鹽類緩 衝劑、乙酸鹽類緩衝劑)、止痛劑(例如苯扎氯銨、鹽酸普魯卡因等)、 穩定劑(例如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存劑(例如抗壞血酸、 異抗壞血酸以及它們的鹽等)、著色劑(例如銅葉綠素、卩-胡蘿蔔素、
紅色2號、藍色l號等)、防腐劑(例如對羥基苯甲酸酯、苯酚、氯化
卡乙銨、苯扎氯銨等)、增稠劑(例如羥丙基纖維素、羧甲基纖維素及 它們的鹽等)、穩定劑(例如人血清白蛋白、甘露醇、山梨醇等)、矯 味劑(例如薄荷醇、柑橘香精等)等添加劑。其它的藥物組合物(為了 與上述幾種"藥物組合物"的表述統一)的形式有散劑、片劑、顆粒劑、 膠嚢劑、丸劑、栓劑、含片等固體製劑。以口服製劑的形式施與的固體 製劑中，添加劑可以使用賦形劑(例如結晶性纖維素、乳糖、澱粉等)、 潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石粉等)、粘合劑(羥丙基纖維素、羥丙甲 基纖維素、聚乙二醇等)、崩解劑(例如澱粉、羧曱基纖維素鈣等)等。 還可根據需要使用防腐劑(例如苄醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸曱酯、對 羥基苯甲酸丙酯等)、抗氧化劑、著色劑、甜味劑等添加劑。
其它的形式還有黏膜用藥物組合物，該製劑中，以賦與對黏膜的吸 附性、滯留性為主要目的，添加劑可含有粘著劑、粘著增強劑、增稠劑、 稠化劑等(例如粘蛋白、瓊脂、明膠、果膠、卡拉膠、藻酸鈉、刺槐豆 膠、黃原膠、黃蓍膠、阿拉伯膠、脫乙醯殼聚糖、普魯蘭、蠟狀澱粉、 硫糖鋁、纖維素及其衍生物(例如羥丙甲基纖維素、聚甘油脂肪酸酯、 丙烯酸(曱基)丙烯酸烷基酯共聚物或它們的鹽、聚甘油脂肪酸酯等))。 但是，供給生物體的藥物組合物的形態和溶劑或添加劑並不限於此，可 以由本領域技術人員適當選擇。
為了改善症狀，上述藥物組合物可以口服或非口服施與。口服施與 時，可以選擇顆粒劑、散劑、片劑、膠嚢劑、溶液劑、糖漿劑、乳劑或 混懸劑、酏劑等劑型。非口服施與時例如可以製成經鼻製劑，也可以選 擇溶液製劑、混懸劑、固體製劑等。其它非口服的形式還可以是注射劑， 注射劑可選擇皮下注射劑、靜脈注射劑、輸液注射劑、肌肉注射劑、腦 室內注射劑或腹腔內注射劑等。其它非口服施與中使用的製劑還有栓劑、舌下劑、經皮劑、經鼻劑以外的經黏膜施與劑等。並且能夠以包含 或塗布於支架或血管內栓塞劑的方式局部施與血管內。
上述藥物組合物的給藥量根據患者的年齡、性別、體重、症狀、治 療效果、給藥方法、處理時間或該藥物組合物中含有的活性成分的種類
等而不同，通常成人每人每次在0.1mg- 500mg的範圍、優選以0.5 mg -200mg的範圍給藥。但是，給藥量因各種條件而變動，也有比上述給 藥量少的量即足夠的情形，還有需要超過上述範圍的給藥量的情形。
上述反義寡核苷酸或RNAi分子等可以以整合到適當的啟動子序列 下遊，以可帶來反義寡核苷酸或RNAi效果的RNA表達載體的形式施 與。將該表達載體以到達作為對象的患者腦內的形式導入，由於這些基 因的反義寡核苷酸或RNAi效果，表達抑制該基因表達的多核苷酸，通 過該基因的表達水平的降低，可以對攝食抑制和/或體重增加抑制的狀態 達到治療效果。

本發明還涉及含有編碼上述NESFATIN多肽等的基因、或者含這些
基因的載體的轉基因非人動物。更具體地說，涉及該基因全身性、優選 在下丘腦的表達強度升高、顯示攝食抑制狀態或體重增加抑制狀態的轉 基因非人動物。使編碼上述多肽的基因的表達水平人為地增強的轉基因 非人動物可以用作顯示攝食抑制和/或體重增加抑制的動物模型。
本發明還涉及導入了抑制具有上述攝食抑制和/或體重調節抑制活 性的多肽的活性或表達的物質(例如抗體、反義寡核苷酸、RNAi分子 等)、並顯示食慾亢進或體重增加亢進的轉基因非人動物。導入編碼上 述物質的基因而產生的轉基因非人動物可用作攝食和體重增加亢進的 動物模型。另外，該轉基因非人動物還可用作肥胖、糖尿病、高血壓、 高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臟病、腦血管疾病、睡眠呼吸暫停 症候群、變形性關節病等整形外科疾病、月經異常或惡性腫瘤等疾病的 動物模型。
以特定的基因作為對象獲得轉基因動物的方法是公知的。即，可通 過基因與卵混合、用磷酸4丐處理的方法；在相位差顯微鏡下，用微量移 液管向前核期卯細胞的核中直接導入基因的方法(顯微注射法、美國專 利第4873191號)；使用胚胎幹細胞(ES細胞)的方法等可獲得轉基因動物。除此之外，人們還開發了向反轉錄病毒中插入基因，感染卵的
方法；還有經由精子將基因導入卵的精子載體法等。精子載體法是通過
將外來基因附著於精子、或通過電穿孔等方法攝入到精子細胞內，然後
使卵子受精，由此導入外來基因的基因重組方法(Lavitranoet M等人， Cell ( 1989) 57, 717- 723 )。
作為在表達載體中使用的啟動子，如果使用通過適當的試劑等物質 進行轉錄調節的啟動子，則通過施與該物質，可以調節抑制轉基因動物 中編碼外源性NESFATIN多肽等的基因或該多肽的活性或表達的物質 的表達水平。
並且，本發明還涉及使編碼NESFATIN多肽等的基因的全部區域或 一部分缺損的敲除動物。將該基因用別的基因置換得到的敲除動物也包 含在本發明中。例如，NESFATIN多肽等的基因的敲除動物可用作顯示 攝食亢進和/或體重增加亢進的動物模型。
本發明還涉及施與了上述NESFATIN多肽等本身、非人動物的攝食 和/或體重增加受到抑制的動物模型；或者施與了抑制該多肽活性或表達 的物質本身、非人動物的攝食和體重增加亢進的動物模型。攝食和體重 增加亢進的非人動物可用作肥胖、糖尿病、高血壓、高脂血症、高尿酸 血症、脂肪肝、心臟病、腦血管疾病、睡眠呼吸暫停症候群、變形性關 節病等整形外科疾病、月經異常或惡性腫瘤等疾病的動物模型。
作為本發明的動物模型使用的動物種類可以利用人以外的所有脊 推動物製作。具體可以通過在小鼠、大鼠、兔、小型豬、山羊、綿羊、 猴、狗、貓、或牛等脊推動物中通過導入基因或施與物質製備動物模型。

本發明還涉及使用使編碼上述NESFATIN多肽等的基因表達的上 述轉化體、或含有編碼該多肽的基因、或者含這些基因的載體的上述轉 基因非人動物、以及轉基因植物製備該多肽的方法。
本發明的上述多肽的製備方法中，為了適合在轉化體或轉基因非人 動物中的表達、轉錄、翻譯等，可以對上述DNA序列、質粒和病毒等 進行較多的修飾或變更。例如，根據遺傳密碼(喑號)的同義性，可以 使蛋白質密碼區整體進行核苷酸的置換。這樣的序列可以由NESFATIN 多肽等的胺基酸序列或編碼該多肽的基因的鹼基序列推定，按照以下的以往合成方法組裝。上述合成方法可實質上按照Itakura等人的方法 (Itakura等，Science 198， 1056， 1977)以及Crea等人的方法(Crea 等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA75， 5765， 1978 )進行。因此，在本發明 的多肽的製備方法中使用的編碼上述NESFATIN多肽等的基因並不限 於利用特別例舉的鹼基序列、質粒和病毒的基因。
使用轉化體製備上述多肽的方法可通過培養該轉化體實現。培養中 使用的培養基可以根據所釆用的宿主細胞，適當選擇常用的各種培養 基，其培養也可以在適合宿主生長發育的條件下實施。
上述多肽在轉化體的細胞內、細胞外或細胞膜上生成。其它的使用 編碼NESFATIN多肽等的基因製備多肽的方法還有通過無細胞體系蛋 白質合成的方法，代表性的例子有體外翻譯反應系統。該體外翻譯反應 系統中，在編碼NESFATIN多肽等的基因的5'上遊附加控制轉錄調節的 序列、優選SP6啟動子、T3啟動子、T7啟動子等，將該基因在細胞內 或體外轉錄，由此製備編碼NESFATIN多肽等的RNA分子，可使用由 小麥胚芽、大腸桿菌、網狀紅細胞等製備的用於體外轉錄反應的細胞提 取物進行。其一個例子可根據澤崎等蛋白質.核酸.酵素2003年48 巻549 - 554記載的方法等實施。由上述轉化體或無細胞體系蛋白質合 成生產的多肽可根據需要、利用其物理學性質、化學性質等進行各種分 離操作[參照日本生化學會編"生化學r一夕:/y夕II"第l版第1次印 刷、抹式會社東京化學同人1980年6月23日發行II75-l259頁； Amkawa等，Biochemistry(USA)1986年12月16日發行25巻25號8274 - 8277 ( 1986) ; Langley等Europian Journal of Biochemistry (德國) 1987年3月2日發行163巻2號313-321頁等],進行分離純化。該 方法具體例如有通常的再構成處理、通過蛋白質沉澱劑進行的處理(鹽 析法)、離心分離、滲透壓衝擊法、超聲波破碎、超濾、凝膠過濾、吸 附色譜、離子交換色譜、親和層析、高效液相色譜(HPLC)等各種液 體色譜、透析法、它們的組合等。利用與上述多肽的親和性進行的純化 例如可使用與上述多肽結合的抗體，通過使該多肽與該抗體脫吸附進 行。
本發明的上述多肽的製備方法中，可使轉化體或轉基因非人動物生 產在該多肽上融合親和性標籤的蛋白質，然後通過分離純化該親和標籤 融合蛋白質進行。如果使該親和標籤融合蛋白表達，則可以實施利用該標籤的親和純化。該親和標籤有穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)、聚 組氨酸標籤(His標籤，Sisk等，Journal of Virology (美國)1994年2 月發行68巻2號766 - 775頁)和FLAG標籤(H叩p等，Biotechnology 1988年發行6巻1204 - 1210 )。
採用GST與上述多肽融合得到的GST融合蛋白時，通過使用固定 有穀胱甘肽的載體，採用GST與該穀胱甘肽結合載體的吸附、脫吸附反 應進行純化，然後從GST融合蛋白中切除GST部分而純化，由此可以 製備上述多肽。
採用His標籤融合蛋白時，使用金屬離子螯合劑載體，採用His標 籤與該金屬離子螯合劑載體的吸附、脫吸附反應進行純化，然後從His 標籤融合蛋白中切除His標籤部分，進行純化，可以製備上述多肽。
採用FLAG標籤融合蛋白時，通過使用結合了抗FLAG標籤抗體的 載體，利用FLAG標籤與該金屬離子螯合劑載體的吸附、脫吸附反應進 行純化，然後從FLAG標籤融合蛋白中切除FLAG標籤部分純化，由此 可以製備上述多肽。
NESFATIN- 1多肽可以如下製備將由上述方法得到的NESFATIN 多肽用蛋白轉化酶等蛋白質分解酶處理，將其分解物通過反相色譜分 級，通過質量分析等確認含有NESFATIN- 1多肽的級分並回收。 NESFATIN - 1變體也可以同樣製備。
這樣得到的本發明的NESFATIN多肽等可以在翻譯後對其N末端 進行修飾，本發明中也包含上述修飾的多肽分子。例如，N末端轉換為 焦穀氨醯胺的多肽可如下獲得使上述本發明的NESFATIN多肽等表 達，使N末端為穀氨醯胺殘基，將所得多肽在5-10%乙酸溶液等酸性 條件下處理(Park等，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of america (美國)1991年3月發行22046 — 2050頁)。 另夕卜，N末端被乙醯化的肽可如下製備使本發明的NESFATIN多肽等 表達，使N末端為具有a氨基的任意的胺基酸殘基，通過sulfo-NHS -Acetate或無水乙酸進行處理。上述多肽在翻譯後進行N末端修飾的 方法在本技術領域中廣泛已知。除此之外，本發明的NESFATIN多肽等 也可以用螢光物質等化合物處理並修飾(Hermanson等，Bioconjugate techniques (美國)Academic Press 1996年發行)。
可以使用轉基因非人動物製備上述NESFATIN多肽等。該方法例如可以是從含有編碼上述NESFATIN多肽等的基因、或含這些基因的載 體的轉基因非人動物中採集器官、組織、血液、乳汁等、或將它們切細、 粉碎、分級得到的加工物等，以分離出固體成分得到的液體成分、或者 使用水性溶劑或有機溶劑提取的液體成分的形式，從上述採集的物質中 回收含有目標肽的級分。目標多肽可以通過上述利用物理學性質、化學 性質等的各種分離操作，由該級分中分離、純化。
還可以是使用轉基因植物製備上述NESFATIN多肽的方法。該方法 例如可參照日本特開2003 - 116385號"含有編碼日本腦炎疫苗的基因的 轉基因植物"的公報等實施。關於轉基因植物的製備方法，也可以參照 曰本特開2002 - 17186號公報等的"轉基因植物"製備。從上述轉基因植 物的葉、莖、根、果實、果皮、芽、種子和花瓣等組織或由這些組織誘 導的愈傷組織等中，以及根據情況從將該組織切細、剝皮、粉碎、壓縮 得到的加工物等中，將目標多肽回收到使用水性溶劑或有機溶劑得到的 提取液、或通過壓榨採集的壓榨汁、或油中，還可以通過利用上述物理 學性質、化學性質等的各種分離操作，將該多肽進行分離、純化。
本發明的上述多肽也可以化學合成獲得。這種情況下，可以利用固 相合成法或液相合成法等通常使用的肽合成法。對於肽合成中的縮合法 或胺基酸殘基的保護、以及合成後的保護基團的脫離均可以利用公知的 方法(泉谷等，肽合成的基礎和實驗丸善抹式會社1975年發行；矢島 等一日本生化學會編生化學實驗講座1蛋白質的化學IV東京化學同 人林式會社1977年發行)。可以將多肽的肽序列全體一次性合成，也 可以採用將該蛋白質的部分肽分別合成，將這些部分肽縮合的方法(日 本生化學會編新生化學實驗講座蛋白質IV合成和表達東京化學同 人抹式會社1991年發行)。
肽合成中使用的胺基酸的a胺通常被tBoc基團或Fmoc基團保護， 最終所得的肽上可以帶有這些保護基團，或者是脫保護的形式。還可以 是根據需要，將該肽的脫保護的氨基的末端用焦穀氨酸、乙醯基、甲醯 基或螢光物質等進行酶修飾或化學修飾的形式(Hermanson等， Bioconjugate techniques (美國)Academic Press, 1996年發行)。具體 的例子可以是在上述本發明多肽的N末端以具有穀氨醯胺的形式合 成，將該肽通過用5-10%乙酸溶液等稀酸進行的處理使其環化，可以 變化成焦穀氨酸(Park等，Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America (美國)1991年3月發行22046 - 2050頁)。
還可以根據需要，製備在合成後的多肽的C末端附加醯氨基或螢光 物質等形式的合成肽。例如，為了通過固相合成法獲得在C末端導入了 醯氨基的合成肽，在進行從固相載體(樹脂)中切割肽的反應時，可以 通過使用C末端被醯胺化的形式的市售的樹脂來實施。另外，對C末端 進行螢光物質等的修飾的方法也可按照7〉知的方法進行(Hermanson 等，Bioconjugate techniques (美國)Academic Press ,1996年發^亍)。
<用於預測或診斷攝食調節和/或體重調節狀態的鑑定方法〉
本發明涉及哺乳類動物的與攝食調節和/或體重調節相關疾病的判 定、重症度、病態進展的監控、預測、預後、或者判斷是否施與上述藥 物組合物等中使用的診斷的方法。即，本發明涉及使用來自受試哺乳類 動物的試樣，將試樣中所含的編碼NESFATIN的核酸分子(含有SEQ ID NO.10—12、 18-20、 44-46、 74 — 82、 104 — 106或116 — 124中任一 個所示的鹼基序列的核酸分子)、或NESFATIN多肽等(含有SEQ ID N0.3、 6、 9、 13-15、 39 — 41、 65 — 73、 101 - 103或107 — 115中任一 個所示的胺基酸序列的多肽)的含量與來自正常個體的試樣進行比較， 由此預測或診斷攝食調節和/或體重調節狀態的方法。正常個體是指正常 的或未經處理的個體。
具體來說，本發明涉及用於預測或診斷攝食調節和/或體重調節狀態 的鑑定方法，該方法包含以下步驟將來自受試哺乳類動物生物體的試 樣中的含有SEQ IDNO.10-12、 18 — 20、 44 — 46、 74 — 82、 104-106 或116-124中任一個所示鹼基序列的核酸分子的含量與正常個體的生 物體試樣比較，檢測該基因表達的降低狀態或亢進狀態的步驟。
所使用的生物體試樣有血液、尿、腦脊髓液、唾液、由活體解剖 採集的腦組織等，其中優選血液。作為試樣使用的血液可以是全血、或 由全血得到的血漿或血清。這些生物體試樣的採集方法是公知的。還可 以使用這些生物體試樣的溶胞產物等製備物作為試樣。或者，如果從制 備物中糹是取mRNA,則可製成用於測定與上述核酸分子對應的mRNA 的試樣。生物體試樣的溶胞產物或mRNA的提取利用市售的試劑盒較為 便利。或者，對於血液、腦脊髓液等液體狀生物體試樣，可以根據需要用緩衝液等稀釋，製成用於測定蛋白質或基因的試樣。
哺乳類動物的生物體試樣中的含有SEQIDNO.10-12、 18-20、 44 -46、 74 - 82、 104- 106或116-124中任一個所示的鹼基序列的核酸
分子的含量可如下測定將含有該核酸分子的鹼基序列的多核苷酸、或 者含有與其互補鏈互補的鹼基序列的至少18個鹼基長度的寡核苷酸作 為PCR引物、探針使用，進行測定。這種情況下，本領域技術人員可以 使用各種電腦程式，設計適合用途的引物或探針。上述多核苷酸或寡 核苷酸可以根據測定形式，結合適當的標記；或者固定在適當的支撐體 上。上述PCR引物和探針可以重組性、合成性地製備，或者通過本領域 技術人員可利用的任何方式製備。例如，本發明中可使用的PCR引物 有SEQIDN0.22 (正向引物)和SEQIDNO,23 (反向引物)等，沒 有特別限定。本發明中可使用的探針例如有使用上述引物，使用SEQ IDN0.21的DNA序列作為模板，通過對擴增的片段進行標記獲得等(參 照實施例2),並沒有特別限定。
含有SEQ ID NO.10-12、 18-20、 44 -46、 74 - 82、 104 - 106或 116- 124中任一個所示的鹼基序列的核酸分子表達水平的測定值可通 過公知方法進行校正。通過進行校正，可以在受試生物體試樣和正常個 體生物試樣之間，對含有SEQIDNO.10 - 12、 18-20、 44 -46、 74- 82、 104 - 106或116-124中任一個所示的石威基序列的核酸分子表達水平進 行比較。測定值的校正可以是在生物體試樣的各細胞中，根據表達水平 沒有較大變動的基因(例如管家基因)的表達水平的測定值進行。表達 水平沒有較大變動的基因的例子有卩-疫苗、GAPDH等。
使用mRNA測定含有SEQ ID NO.10-12、 18-20、 44-46、 74-82、 104 - 106或116-124中任一個所示的鹼基序列的核酸分子表達水 平時，可以適當通過與該診斷方法相適應的形式實施。例如使用從生物 體組織中提取的mRNA時，可以選擇RT - PCR法、DNA印跡法等；使 用組織標本時，可以選擇原位雜交法等。例如在實施例8中公開了通 過原位雜交法顯示對於由於絕食而使食慾亢進的大鼠，NESFATIN基因 的表達受到抑制、在由於攝食而使食慾受到抑制的狀態下NESFATIN基 因表達亢進的例子。
將受試試樣的含有SEQIDNO.10-12、 18-20、 44 -46、 74 - 82、 104- 106或116- 124中任一個的石鹹基序列的基因表達量與來自正常個體的生物體試樣比較，檢測出該基因的表達處於低下狀態時，可以預測 或診斷為攝食亢進或體重增加的狀態，並且可以預測或診斷選自肥胖、 糖尿病、高血壓、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臟病、腦血管疾 病、睡眠呼吸暫停症候群、整形外科疾病、月經異常和惡性肺瘤的疾病 的發病。而檢測出該基因的表達呈現亢進狀態時，則受試哺乳類動物處 於攝食抑制狀態或體重增加抑制狀態，並且可以預測或診斷由於厭食 症、功能性胃腸病(機能性消化不良)、或者癌症、炎症性疾病、垂體.甲 狀腺.腎上腺等功能低下、手術後或過度應激等導致的攝食抑制和/或體 重增加抑制狀態等病態的狀態。
本發明還涉及預測或診斷攝食調節和/或體重調節的狀態的方法，該
方法包含將哺乳類動物生物體試樣中的NESFATIN多肽等(含有SEQ ID N0.3、 6、 9、 13 — 15、 39-41、 65 - 73、 101 — 103、或107—115中任 一個所示的鹼基序列的多肽)的含有量與正常個體生物體試樣比較，檢 測含有該多肽的低下狀態或上升狀態的步驟。該方法可通過測定 NESFATIN多肽等進行。
所使用的生物體試樣有血液、尿、腦脊髓液、唾液、由活體解剖 採集的腦組織等，其中優選血液。作為試樣使用的血液可以是全血、或 由全血得到的血漿或血清。這些生物體試樣的採集方法是公知的。還可 以使用這些生物體試樣的溶胞產物等製備物作為試樣。生物體試樣的溶 胞產物的製備利用市售的試劑盒較為便利。或者，對於血液、腦脊髓液 等液體狀生物體試樣，可以根據需要用緩衝液等稀釋，製成用於測定蛋 白質的試樣。
NESFATIN多肽等的測定可以採用該多肽的免疫學測定方法，該免 疫學測定中，可以使用與NESFATIN多肽等結合的抗體。所述抗體有上 述的抗體，具體有用在實施例3和實施例10中獲得的來自NESFATIN 多肽的肽進行免疫獲得的抗體；或者用來自NESFATIN-1多肽或 NESFATIN - 1M30多肽的肽進行免疫獲得的抗體。並不限於這些抗體， 只要是NESFATIN多肽等的多克隆抗體或單克隆抗體均可無限定地使
用。
者該抗體可以根據測定形式固定在適當的支撐體上。使用血液試樣或生物體組織的溶胞產物等時，可以選擇ELISA法、RIA 法、蛋白質印跡法等；使用組織標本時，可以選擇免疫組織化學方法等。 更具體的例子有實施例所示的蛋白質印跡法、實施例4和11所示的 免疫組織化學方法等，另外還可以使用抗體構建適當的NESFATIN多肽 等的測定系統。例如有實施例3中的蛋白質印跡的例子，實施例4和9 中免疫組織化學的方法的例子，實施例21中的ELISA(竟爭EIA)的例 子。
將試驗試樣的NESFATIN多肽等的含量與正常個體的生物體試樣 比較，檢測出該多肽的含量處於低下狀態時，則可以預測或診斷攝食亢 進或體重增加亢進的狀態，並且可以預測或診斷選自肥胖、糖尿病、高 血壓、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臟病、腦血管疾病、睡眠呼 吸暫停症候群、整形外科疾病、月經異常和惡性腫瘤的疾病的發病。另 一方面，檢測出該多肽的含量處於上升狀態時，可以預測或診斷攝食抑 制和體重增加抑制的狀態，並且可以預測或診斷厭食症、、功能性胃腸 病(機能性消化不良)、或者癌症、炎症性疾病、垂體*甲狀腺 腎上 腺等功能低下、手術後或者過度應激等導致的攝食抑制和/或體重增加抑 制的病態的狀態。
<用於預測或診斷攝食調節和/或體重調節狀態的鑑定方法中使用的試劑
^^〉
本發明還涉及在預測或診斷上述攝食調節和/或體重調節狀態的方 法中使用的試劑盒，作為所述試劑盒可列舉用於檢測編碼NESFATIN 等的基因(含有SEQIDNO.10-12、 18-20、 44 -46、 74 - 82、 104-106或116-124中任一個所示的鹼基序列的基因)表達量的試劑盒；或 者用於測定NESFATIN多肽等(含有SEQIDN0.3、 6、 9、 13-15、 39 -41、 65 - 73、 101 - 103或107-115中任一個所示的胺基酸序列的多
肽)的含量的試劑盒等。
編碼NESFATIN等的基因的表達量檢測試劑盒中含有至少一個用 於檢測該基因的PCR引物、探針或DNA晶片。
本發明的試劑盒中含有的PCR引物是指編碼NESFATIN等的基因 的鹼基序列、或含有與該互補鏈互補的鹼基序列的至少18個鹼基長度 的寡核苷酸，本領域技術人員可根據本說明書中記載的編碼NESFATIN等的基因的鹼基序列適當製備。例如，本發明的試劑盒中含有的PCR
引物可以是SEQIDN0.22 (正向引物)和SEQ ID N0.23 (反向引物) 等，但並不限於此。作為本發明的試劑盒中所含的探針，例如可以使用 上述引物，使用SEQIDN0.21的DNA序列作為模板，通過標記擴增的 片段獲得等，但並不限於此。本發明的試劑盒中所含的DNA晶片可以 通過將上述探針固定在玻璃等基板上製備。
除此之外，本發明的試劑盒可以作為附加要素含有用於稀釋試劑或 生物體試樣的緩衝液、陽性對照、陰性對照、用於測定標記的底物、反 應容器、記載測定方法的說明書等。這些要素可根據需要預先混合。還 可以根據需要向各要素中加入保存劑、防腐劑。
測定NESFATIN多肽等含量的試劑盒中含有至少一種識別該多肽 的抗體、標準肽或結合竟爭反應用肽修飾物。
是識別NESFATIN多肽等的抗體即可，沒有特別限定。
本發明的試劑盒中含有的標準肽是用於製備顯示上述抗體與 NESFATIN多肽等的數量相關性的結合力的標準校正曲線的肽。所述標 準多肽例如有NESFATIN多肽等識別上述抗體的多肽。
本發明的試劑盒中含有的結合竟爭反應用肽修飾物是通過上述抗 體識別的肽，是指具有拮抗作為測定對象的生物體試樣中的NESFATIN 多肽等與該抗體結合的作用的肽。另外，該結合竟爭反應用肽修飾物通 常是適當標記後使用。
含有這些的本發明的試劑盒例如可以通過(1)在上述結合竟爭反 應用肽修飾物存在下製備由標準肽和上述抗體得到的標準校正曲線； (2)在上述結合竟爭反應用肽修飾物存在下向生物體試樣中添加上述 抗體；(3)通過標準校正曲線測定結合竟爭反應用肽修飾物與抗體的 結合量；由此可以測定生物體試樣中含有的NESFATIN多肽等的含量。
還可以使用兩種互相不阻礙結合的識別NESFATIN多肽等的抗 體，測定該多肽的含量。此時，通常第一抗體是固定為固相，第二抗體 可適當標記使用。
含有上述成分的本發明的試劑盒例如可通過(1)向固定化的第一 抗體中添加標準肽進4於反應，然後添加標記的第二抗體，製備標準4交正 曲線；(2)同樣地向固定化的第一抗體中添加生物體試樣進4亍反應，然後添加標記的第二抗體；(3)通過標準校正曲線測定生物體試才羊的 反應中的第二抗體結合量；由此可以測定生物體試樣中含有的 NESFATIN多肽等多肽的含量。
除此之外，本發明的試劑盒還可以作為附加要素含有用於稀釋試劑 或生物體試樣的緩衝液、陽性對照、陰性對照、用於測定標記的底物、 反應容器、記載測定方法的說明書等。這些要素可根據需要預先混合。 還可以根據需要向各要素中加入保存劑或防腐劑。

本發明涉及具有攝食調節和/或體重調節效果的、用於治療或預防與 攝食調節和/或體重調節相關的疾病或症狀的候選化合物的篩選方法。
即，本發明涉及具有攝食抑制和/或體重增加抑制效果的治療劑或預 防劑的篩選方法，該方法包含以下步驟使受試物質與哺乳類細胞接觸 的步驟；以及檢測該細胞中編碼NESFATIN等的基因(含有SEQ ID NO.10-12、 18 —20、 44-46、 74 — 82、 104 - 106或116 - 124中任一 個所示的鹼基序列的基因)的誘導表達、或該細胞內含有的或分泌到細 胞外的NESFATIN多肽等(含有SEQ ID N0.3、 6、 9、 13-15、 39-41、 65 - 73、 101 - 103或107-115中任一個所示的胺基酸序列的多肽)的 量增加的步驟。在肥胖、糖尿病、高血壓、高脂血症、高尿酸血症、月旨 肪肝、心臟病、腦血管疾病、睡眠呼吸暫停症候群、整形外科疾病、月 經異常和惡性腫瘤中需要抑制攝食或抑制體重增加。通過上述篩選方法 可以獲得針對所述疾病的治療劑或預防劑。
另一方面，本發明還涉及具有攝食亢進和/或體重增加亢進效果的治 療劑或預防劑的篩選方法，該方法包含以下步驟使受試物質與哺乳類 細胞接觸的步驟；以及檢測編碼該細胞中NESFATIN等的基因的表達抑 制、或者該細胞內含有的或分泌到細胞外的NESFATIN多肽等的量的減 少的步驟。厭食症、功能性胃腸病(機能性消化不良)、或者癌症、炎 症性疾病、垂體.甲狀腺.腎上腺等功能低下、手術後或者過度應激等 導致的攝食抑制和/或體重增加抑制狀態中，必須使攝食亢進或體重增加 亢進。通過上述篩選方法，可以獲得針對所述疾病的治療劑或預防劑。
使該多肽或編碼該多肽的基因的表達水平升高或降低的化合物是 促進性或抑制性地作用於基因的轉錄、穩定或翻譯，或者蛋白質的分泌、活性表達或穩定化的任意階段的化合物。本發明中，使基因的表達 水平降低的化合物是對上述的任意階段具有抑制性作用的化合物。
本發明的攝食調節和/或體重調節相關疾病或症狀的治療候選化合 物的篩選方法可以在體內進行也可以在體外進行。例如在體內進行時，
該篩選可按照以下步驟實施
(1) 將候選化合物施與受試動物的步驟；
(2) 測定上述受試動物生物體試樣中NESFATIN多肽等或者編碼 該多肽的基因的表達強度的步驟；
(3) 與未施與候選化合物的對照比較，選擇使NESFATIN多肽等 或者編碼該多肽的基因的表達強度升高的化合物或降低的化合物的步驟。
使NESFATIN多肽等生成尤進、或者使編碼該多肽的基因的表達強
度升高的化合物是抑制攝食和/或體重增加的治療劑的候選物。具有上述 活性的物質有PPARy激動劑等，但並不限於此。另一方面，使NESFATIN
多肽等的生成受到抑制、或者使編碼該多肽的基因的表達強度降低的化 合物是使攝食和/或體重增加亢進的治療劑的候選物。具有上述活性的物 質有與NESFATIN多肽等結合的抗體、編碼該多肽的基因的反義寡核 苷酸、PPARY拮抗劑等，但並不限於此。
本發明的篩選方法中使用的受試動物可以使用正常動物，也可以適 當使用與攝食調節和/或體重調節相關的疾病的病態動物模型等。所述病 態動物模型的例子有Agouti yellow( C57BL/6J - Ay/a )肥胖小鼠或Zucker -fa/fa肥胖大鼠等，還可以使用本發明的轉基因動物或施與了抑制 NESFATIN多肽等或編碼該多肽的基因的活性或表達的物質的動物模型等。
NESFATIN多肽等或編碼該多肽的基因的表達強度的測定可通過免 疫學測定方法或測定mRNA等實施。免疫學測定方法中，可以通過與測 定目的或生物體試才羊相適應的形式實施。例如，生物體試才羊-使用血液試 樣或生物體組織的溶胞產物等時，可以選擇ELISA法、RIA法、蛋白質 印跡法等；使用組織標本時，可以選擇免疫組織化學方法等。測定mRNA 時，可以通過與測定目的和生物體試樣相適應的形式實施。例如4吏用由 生物體組織提取的mRNA時，可以選擇RT-PCR法、RNA印跡法等； 使用組織標本時，可以選擇原位雜交法等。體外篩選的例子可按照以下的步驟實施
(1) 使候選化合物與來自哺乳動物的細胞或組織接觸的步驟；
(2) 測定上述細胞或組織試樣中NESFATIN多肽等、或編碼該多 肽的基因的表達強度的步驟；
(3) 與未接觸候選化合物的對照相比較，選擇使NESFATIN多肽 等、或編碼該多肽的基因的表達強度升高的化合物或降低的化合物的步 驟。
這種情況下，使NESFATIN多肽等生成亢進、或使編碼該多肽的基 因的表達強度升高的化合物可作為抑制攝食和/或體重增加的治療劑的 候選物。具有上述活性的物質有PPARy激動劑，但並不限於此。使 NESFATIN多肽等的生成受到抑制、或者使編碼該多肽的基因的表達強 度降低的化合物是使攝食和或體重增加亢進的治療劑物的候選物。具有 上述活性的物質有與NESFATIN多肽等結合的抗體、編碼該多肽的基 因的反義寡核苷酸、或者PPARY拮抗劑等，但並不限於此。
本發明的篩選方法中使用的受試細胞如果採用來自動物的細胞，可 以是由動物中適當分離的細胞、或建立的細胞抹等。其例子有非小細胞 肺癌細胞抹、脂肪細胞、來自腦或神經的細胞、或者細胞抹等。來自動 物的組織可使用由動物中適當取出的器官或組織等，作為其例子，可以 使用包括下丘腦的形式的腦組織切片等實施。
關於NESFATIN多肽等、或編碼該多肽的基因的表達強度的測定， 可通過免疫學測定方法或mRNA等的測定實施。免疫學測定方法中，可 以通過與其測定目的或生物體試樣相適應的形式實施。例如，試樣由來 自動物的細胞時，可以採用流式細胞計數法或細胞免疫染色等；使用來 自動物的組織作為試樣時，也可以選擇免疫組織化學方法等。使用來自 試樣的溶胞產物等的製備物時，免疫學測定方法可以選擇ELISA法、 RIA法、蛋白質印跡法等。測定mRNA時，可以通過與測定目的和生物 體試樣相適應的形式實施。例如，對於來自動物的細胞或組織的試樣直 接保持其形態使用時，可以選擇原位雜交法等，使用由該試樣提取的 mRNA時則可以選擇RT-PCR法、RNA印跡法等。
本發明中，公開了 PPARY激動劑使NESFATIN多肽等以及編碼該多 肽的基因的表達升高。因此，在上述步驟的"使候選化合物與來自哺乳 動物的細胞或組織接觸的步驟"中，在使候選化合物與試樣接觸的同時、或先後的時間使曲格列酮等PPARY與試樣接觸，可以篩選抑制表達 升高的NESFATIN多肽等或編碼該多肽的基因表達的化合物，可以篩選 不經由PPARy的機理而使該多肽或編碼該多肽的基因的表達升高的化合物。
通過測定NESFATIN多肽等與細胞作用時產生的細胞反應，也可以 篩選化合物。上述篩選的例子包含以下步驟
(1 )使候選化合物與來自哺乳動物的細胞或組織接觸的步驟； (2 )使NESFATIN多肽等與上述細胞或組織的試樣接觸的步驟； (3 )與未接觸候選化合物的對照比較，測定NESFATIN多肽等產 生的細胞反應性的有無或強度的步驟。
這種情況下，使NESFATIN多肽等產生的細胞反應強度升高的化合 物可作為抑制攝食和/或體重增加的治療劑的候選物。另外，使 NESFATIN多肽等產生的細胞反應強度降低的化合物可作為使攝食和/ 或體重增加亢進的治療劑的候選物。具有後者活性的物質有與 NESFATIN多肽等結合的抗體，但並不限於此。
受試細胞為來自動物的細胞時，可以是由動物適當分離的細胞或建 立的細胞林等。其例子有非小細胞肺癌細胞林、脂肪細胞、來自腦或神 經的細胞或細胞抹等。來自動物的組織可以使用從動物中適當取出的器 官或組織等，其例子可以是使用包含下丘腦的形式的腦組織切片等實 施。
上述細胞的反應是指NESFATIN多肽等作用於細胞引起的物理 學、化學變化，例如有細胞的形態、膜電位、細胞的增殖、細胞內鈣濃 度、遊走反應、細胞內第二信使分子(cAMP、 cGMP等)濃度等的變化等。
本發明的篩選方法還可以是獲得控制NESFATIN基因的基因組上 控制該基因表達的轉錄調節區域，利用報導測定系統，該報導系統利用 了該轉錄調節區域的核酸分子。報導測定系統是指以配置於轉錄調節區 域下遊的報導基因的表達量為指標，篩選作用於該轉錄調節區域的轉錄 調節因子的測定系統。
上述篩選的例子包含下述(1 ) - (3)的步驟 (1)使候選化合物與導入了含有編碼NESFATIN多肽的基因的轉 錄調節區域、和在該轉錄調節區域控制下的報導基因的載體的細胞接觸的步驟；
(2) 測定上述報導基因的活性的步驟；
(3) 與未接觸候選化合物的對照比較，選擇使上述報導基因的表 達水平降低的化合物或升高的化合物的步驟。
這種情況下，使報導基因的表達強度升高的化合物可作為抑制攝食 和/或體重增加的治療劑的候選物。具有上述活性的物質有PPAR、/激動 劑等，但並不限於此。另外，使報導基因的表達強度降低的化合物可作 為使攝食和/或體重增加亢進的治療劑的候選物。具有上述活性的物質 有與NESFATIN多肽等結合的抗體、編碼該多肽的基因的反義寡核苷 酸、PPARy拮抗劑等，但並不限於此。
轉錄調節區域有啟動子、增強子，通常啟動子區域可見的CAAT 盒、或TATA盒等。作為報導基因，可以利用CAT(氯黴素乙醯轉移酶) 基因、螢光素酶基因、生長激素基因等。
作為導入了報導基因載體的細胞，可以列舉由動物分離或建立的細 胞抹、或者酵母等非動物細胞等。
作為將報導基因載體導入宿主的方法，可以列舉生物學方法、物理 方法、化學方法等。生物學方法有使用病毒載體的方法、利用特異性 受體的方法、細胞融合法(HVJ (仙臺病毒))、聚乙二醇(PEG)、 電細胞融合法、微核融合法(染色體移入)。物理學方法有使用顯微注 射法、電穿孔法、基因槍的方法。化學方法有磷酸鈣沉澱法、脂質體法、 DEAE葡聚糖法、原生質體法、紅細胞影法、紅細胞膜影法、微膠嚢法。
在上述本發明的各種篩選方法中，可預先組合必須的多核苷酸、抗 體、細胞抹或動物模型製成試劑盒。這些試劑盒作為附加要素可以含有 用於檢測標記的底物化合物、用於細胞培養的培養基或容器、陽性或陰 性標準試樣、或記載有試劑盒的使用方法的說明書等。這些要素可根據 需要預先混合，也可以根據需要在各要素中加入保存劑或防腐劑。
以下，根據實施例進一步詳細說明本發明，這些實施例並不限定本 發明。以下實施例中，如沒有特別說明，各操作可以按照"Molecular Cloning" (Sambrook, J., Fritsch, E.F.以及Maniatis, T.著,Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989年發行)所述的方法進行，或者在使用市售 的試劑或試劑盒時按照市售品的說明書使用。使用動物的實驗中，如果 沒有特別說明，動物(雄性大鼠)是以上午6點至下午6點的12個小時為光照期，下午6點至第二天早晨6點的12個小時為暗期的周期照 明下、在22。C的條件下進行飼養，實驗是在日本群馬大學動物實驗設施 的許可下進行。
實施例
實施例1 通過PPARy激動劑刺激誘導的基因的克隆
為了從表達受到PPARY調節的基因中筌定作用於攝食和/或體重調 節的基因，對用PPARY激動劑刺激SQ - 5細胞(主要來自人肺癌細胞) 時被特異性誘導的基因進行克隆，並從其中篩選具有發揮分泌性因子作 用的可能性的基因。
獲得通過PPARy在非小細胞肺癌中表達被特異性誘導的基因的方 法可按照Satoh (佐藤)等，Oncogene (England) 2002年21巻2171 -2180頁的方法進行。以下簡單敘述該方法。將SQ-5(理研生物資源 中心(理研乂《吖才y 乂一7i 乂夕、—)RBC0110)在用10 —4mppary激 動劑之一的曲格列酮(三共抹式會社)刺激48小時下進行培養，從培 養所得細胞以及未用曲格列酮刺激的SQ-5細胞中分別製備Poly (A) +RNA( mRNA),通過反轉錄反應製備雙鏈cDNA。使用所得雙鏈cDNA, 從由曲格列酮刺激的細胞製備的cDNA (受試方)中減去用在未刺激的 細胞中表達的細胞的cDNA (驅動方)共通表達的基因，實施扣除法。 扣除法是使用將受試方和驅動方的cDNA用限制酶Rsal切割所得的片 段，通過CLONTECH公司的PCR - based克隆試劑盒，按照所附說明書 進行。在扣除的反應中殘留的cDNA使用TAE緩衝液(40 mM Tris -乙 酸鹽、1 mMEDTA)在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，然後回收cDNA長 度相當於0.5-2.0kb的長度的片H用pGEM(R)-T Easy Vector System 1(/口乂力'公司，產品編號A1360),按照所附說明書與pGEM(R) -T Easy載體進行連接。將連接的載體導入到大腸桿菌DH5a抹中，在用含 有50嗎/ml的氨千青黴素的LB培養基製備的瓊脂培養基上形成菌落， 挑取所得菌落，得到了含有由曲格列酮刺激而特異性誘導表達的基因的 cDNA的克隆。
各克隆的鑑定是通過分析克隆的cDNA的鹼基序列進行。將所得各 克隆的大腸桿菌在含有50 pg/ml氨千青黴素的10 ml LB培養基上培養 過夜，使用QIAGEN公司的QIA prep(R) Spin Miniprep試劑盒，按照所附:說明書由該菌體製備質粒。
對於所得各克隆的質粒，使用T7引物(Promega公司，產品編號 Q5021 )和T :/ ， 4卜"《4才、> 只r厶7>司的BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction試劑盒(產品編號4303149 )，按照所附 說明書，製備用於分析鹼基序列的反應物，使用ABI377型DNA測序儀 (Perkin-Elmer公司)進行鹼基序列的分析。
以該克隆的cDNA的鹼基序列作為詢問序列(query)，與EMBL 和Genbank核酸序列資料庫上的序列進行BLAST法，獲得了已知的全 長cDNA序列。
為了從通過以上步驟獲得了全長cDNA序列選擇分泌性因子，通過 Signal P軟體進行分析，分析編碼具有信號肽的蛋白質的cDNA。

使用由曲格列酮刺激的SQ - 5細胞獲得的cDNA,用未經曲格列酮 刺激的SQ-5細胞的cDNA進行扣除，所得的克隆是596個克隆。其中， 與EMBL和Genbank的核酸序列中的登記序列可見顯著同源性的是213 個克隆。並且，通過信號肽的分析，顯示9個克隆具有信號肽序列。該 9個克隆之一是功能尚未鑑定的人NEFA基因(SEQIDNO.l)。
實施例2 通過PPARy激動劑刺激，誘導NEFA基因在培養細胞林中表 達
為了確認曲格列酮對NEFA基因的誘導，使用表達PPARy的細胞抹 HTB185和SQ5以及月旨肪細胞抹3T3 - LI ，通過RNA印跡法進行NEFA
基因的表達分析。
SQ-5(理研生物資源中心RBC0110)使用以含有10%胎牛血清(>f >匕'卜口 ^、工7 — GIBGO /〉司)的RPMI1640培養基(O匕'卜口 -工
BIL公司，產品編號11875 - 085 )繼代培養所得。人腦髓母細胞瘤 抹HTB185細胞(D283 Med: ATCC HTB185 )和由胰島素.地塞米 松.IBMX誘導分化的小鼠胚胎成纖維細胞林(前體脂肪細胞林)3T3 -LI細胞(ATCC CL - 173 )使用以含有10%胎牛血清的DMEM培養 基(O匕'卜口-工歹-GIBCO公司，產品編號11995 - 040 )繼代培 養所得。將懸浮於10 ml培養基中的106個各細胞細胞接種於10 cm的培養皿中，使細胞附著於基質，然後只將DMSO (對照)添加到培養基 中，或將曲格列酮(三共林式會社)添加到培養基中，使曲格列酮濃度
為1(T4M、 1(T45M、 1(T5M,在37。C、 5%C02的條件下培養24小時或 48小時。對各實驗組，將在5個培養皿處理的細胞在特定的時間後由基 質剝離收集，使用ISOGEN ( -少求>^一>公司，產品編號317-02503 )，按照其說明方法提取並回收總RNA。
用於檢測NEFA基因的探針的製備是使用SEQ ID N0.21的565 bp 長度的DNA片段，使用SP6聚合酶進行體外轉錄，進行標記製備。首 先，以由小鼠腦cDNA文庫(Invitrogen公司，產品編號10655 - 25 )提 取的質粒為模板，以0.25 jiM的濃度使用以下引物，以94。C、 1.5分鐘 變性，58"、 1分鐘退火，72°C、 2分鐘擴增為一個反應循環，共進行 35個循環，製備擴增DNA(使用Takara Bio公司製備的Takara Ex TaqTM 聚合酶，產品編號RR001A2.5U)。
製備NEFA探針的PCR引物 正向引物5 -CCAGTGGAAAATGCAAGGAT— 3 ( SEQ ID NO.22 ) 反向引物5 — TCTTTGCTTCCGGGATGATTA— 3 ( SEQ ID N0.23 )
所得擴增DNA產物是通過使用TAE緩衝液的2%瓊脂糖凝膠電泳 確認產物的純度後，使用pGEM(R' -TEasy載體系統I( 7° 口 >力'公司， 產品編號A1360 )，按照所附說明書，在pGEM") - TEasy載體中進行 亞克隆，導入到大腸桿菌DH5a中，在用含有50 pg/ml氨苄青黴素的LB
培養基製備的瓊脂培養基上形成菌落。分別挑取所得的數個菌落，將該 大腸桿菌在含有50 pg/ml氨苄青黴素的10 ml LB培養基上培養過夜， 使用QIAGEN公司的QIA prep(R) Spin Miniprep試劑盒，按照所附說明 書，由該菌體製備質粒。使用T7引物(Promega公司，產品編號Q5021 ) 或SP6引物(Promega公司，產品編號Q5011)、以及7 7° ， 4卜、、"4 才^;^於厶公司的 BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction試劑盒(產品編號4303149),按照說明書製備鹼基序列分析 用反應物，使用ABI377型DNA測序儀(Perkin - Elmer公司)進行鹼 基序列的分析。將具有與預想序列一致的序列、來自NEFA的擴增基因 5'—側與載體的T7啟動子一側相對的克隆作為獲得製備探針用的質粒 的克隆。將該克隆用含有50 pg/ml氨苄青黴素的10 ml LB培養基培養 過夜，用QIAGEN公司的質粒微型試劑盒，按照說明書，由該菌體製備質粒。製備的質粒用限制酶NcoI切割，通過苯酚提取、苯酚/CIAA提取 進行純化，在進行乙醇沉澱後，以1 pg/ml溶解於不含有RNA分解酶的 TE緩沖液(lOmMTris-HC1、 lmMEDTA, pH 8.0 ),將所得作為制 備探針用的模板質粒DNA使用。標記RNA探針是使用Promega公司的 Riboprobe (R)系統-SP6，使用2.5 jiM的[a - 32P]UTP ( Amersham Bioscience,產品編號PB10203, 3000 d/mM, 10 mci/ml)和20U RNA 合成酶SP6 (試劑盒中含有)，按照試劑盒所附的說明書，由l嗎模板 質粒DNA製備。
RNA印跡用的電泳是使用以含有0.66M去離子化甲醛的MOPS緩 衝液(20 mM3 - (N -嗎啉代)-丙磺酸、5 mM乙酸鈉、0.5 mM EDTA ) 製備的1.2%瓊脂糖凝膠，用含有曱醛的MOPS緩衝液對由各細胞得到 的總RNA進行100V/2小時電泳。使用10倍濃度的SSC( 150mMNaCl、 15 mM乙酸鈉)，將RNA從電泳後的凝膠轉印至尼龍膜(Perkin-Elmer, Gene Screen Plus (R) Hybridization Transfer Membrane )。 轉印的 尼龍膜是使用Stratagene公司的Stratalinker，通過UV進行RNA的固 定。然後，尼龍膜用預雜交液(0.25MNaCl、 20 mM Tris - HC1, pH7.5、 2.5 mM EDTA、 1%SDS、 0.5%牛血清白蛋白、0.5%聚乙烯吡咯烷酮、 0.5%Ficoll、 50%去離子化甲醯胺)在43。C下進行3小時的預雜交，再 在含有1,000,000 cpm/ml標記RNA探針的雜交液(0.25 M NaCl、 20 mM Tris-HCl, pH7.5、 2.5mMEDTA、 1%SDS、 0.5%牛血清白蛋白、0.5% 聚乙烯吡咯烷酮、0.5%Ficoll、 50%去離子化甲醯胺、10%硫酸葡聚糖) 中、在43。C下雜交一夜。雜交後的尼龍膜用2倍濃度的SSC清洗，然 後分別在60。C的含有0.1%SDS的0.2倍濃度SSC中各進行兩次嚴格 (strigent)的清洗，每次30分鐘。在增感屏(Cronex, Lightning Plus ) 存在下，清洗後的尼龍膜在X射線膠片(Kokak, XAR膠片)上曝光過 夜，檢測雜交的標記化RNA探針。

通過RNA印跡法，在曲格列酮(TGZ)刺激的細胞抹中，對NEFA 基因的誘導進行分析，結果如圖1所示。圖1的泳道1 - 4是使用表達 PPARY的人腦髓母細胞胂瘤抹HTB185細胞進行研究的結果。泳道1和 3是使用未用TGZ刺激HTB185細胞的狀態下培養的細胞的RNA(分別為培養24小時、48小時)、泳道2和4是使用10 —"M曲格列酮分別刺 激24小時和48小時的細胞的RNA檢測NEFA基因表達的結果。結果， 未進行TGZ刺激的細胞中，只見到微量的NEFA基因的表達(泳道1 和3),而用TGZ刺激48小時的細胞中可見顯著的誘導(泳道4)。圖 的泳道5和6是使用表達PPAR丫的SQ - 5進行研究的結果。泳道5是使 用未用TGZ刺激的狀態下培養的SQ - 5細胞的RNA (培養24小時)、 泳道6是使用1(T4M TGZ刺激24小時的細胞的RNA,觀察NEFA基因 的表達。結果，在未經TGZ刺激的細胞中，可見低水平的表達(泳道5 ), 在經TGZ刺激並培養24小時的細胞中可見誘導顯著的NEFA基因的表 達(泳道6)。並且圖1的泳道7-IO是使用表達PPAR丫的小鼠胚胎成 纖維細胞林(前體脂肪細胞株)3T3 - Ll進行研究的結果。泳道7是使 用未經TGZ刺激的狀態下培養的3T3 - Ll細胞的RNA(培養48小時)、 泳道8-IO是使用以TGZ分別以10_5M、 l(T4 5M、 10"M對3T3-Ll 細胞刺激48小時所得的細胞的RNA,分別表示檢測NEFA基因表達的 結果。結果，未用TGZ對該細胞進行刺激時也可見NEFA基因有很大 的表達量(泳道7)，該表達與用10」M至10 —4M TGZ刺激時得到同 樣的結果，由此可見，NEFA基因在脂肪細胞中與PPARy的刺激無關， 可以恆定表達。
實施例3 NEFA抗體的製備和在大鼠腦內的表達的驗證
有人提出了 一種腦-脂肪細胞系(The Brain - Adipose Axis )，即， 在脂肪細胞中表達的分泌蛋白也可能在腦中表達，並可能具有攝食調節 作用(森昌朋肥胖研究2004年10巻117-119頁；Shimizu H和 Mori M: Nutritional Nuerosci 8:7-20， 2005 )。因此，製備在脂肪細胞 和腦肺瘤細胞中表達的NEFA的抗體，研究NEFA在下丘腦中表達的局 部存在性。
為了製備NEFA的抗體，抗原是使用在大鼠前體NEFA多肽的氨基 酸序列(SEQIDN0.8)中第141號His至第152號Ser的序列上、在C 末端部位附加Cys得到的合成肽(SEQ ID N0.24:林式會社ATP合成) (以下將該肽稱為NAP肽)。NAP肽N - HisLeuAsnHisGlnAsnProAsp ThrPheGluSerCys - C ( SEQ ID N0.24 )
該合成NAP肽是使用PIERCE公司的Imject(R)馬來醯亞胺活化海洋養歹直匙孑L血藍蛋白(Maleimide Activated Maricultuke Keyhole Limpet Hemocyanin)，按照所附的說明書，將肽綴合在KLH ( Keyhole Limpet Hemocyanin,匙孔血藍蛋白)上。將所得綴合物以每隻兔子0.2 mg作為 一次免疫的量。免疫是將0.25 ml綴合物溶液(綴合物濃度1 mg/ml)與 等量的弗氏完全佐劑H-37 Ra (和光純藥-Difco/^司，產品編號528 -00031 )混合，以各50jil向剃毛的紐西蘭白色系列的兔(購自今井動 物實驗場)的背部皮內注射八處。每隔兩周進行同樣的免疫，再進行四 次。然後最終免疫一周後採集部分血液，通過使用免疫的肽綴合物的 ELISA法確認該血清中的抗體效價，第二天殺死動物採集全血。由所得 血液製備血清，使用DEAE瓊月旨糖EF (Amersham Bioscience,產品編 號17-0709 - 10)，按照常規方法從該血清中純化兔IgG。對於純化的 兔IgG，使用lmgNAP肽，採用通過SulfoLink試劑盒(PIERCE公司， 產品編號44895 )製備的固定肽的柱，按照試劑盒所附的說明書進行親 和純4匕。
使用所得NAP肽的抗體(抗NAP多克隆抗體)，通過蛋白質印跡 法對大鼠腦中NEFA多肽的表達進行分析。
來源於大鼠腦的蛋白質提取液如下製備用5 ml提取緩衝液(50 mMTris-HClpH8.0、 150mMNaCl、 5mMEDTA、 1%乙基苯基聚乙 二醇(Nonidet P - 40 ))將8周齡的Wistar系大鼠(日本千X —》夂.>j A—)的下丘腦(1.7g)進行勻漿製備。所得大鼠的腦溶胞產物與等量 的SDS-聚丙烯醯胺電泳(SDS-PAGE)用的含5%卩-巰基乙醇的 Laemmli樣品緩衝液(BIO-RAD公司，產品編號161 - 0737)等量混 合，在10(TC下加溫5分鐘，然後在常溫下通過微量離心機、以l5,000 rpm 離心10分鐘，回收上清。將20pl該上清用聚丙烯醯胺凝膠(BI0-RAD 公司，kr 4 一y/k 10-20%,產品編號161 - J390V)，用Tris-甘氨 酸/SDS緩衝液(25 mMTris、 192mM甘氨酸、0.1% SDS， pH 8.3 )在 100V下電泳1小時，轉印硝基纖維素膜。將該膜用3。/o明膠/PBS在室溫 下封閉1小時，用TBS-0.05%吐溫清洗三次，再用TBS清洗一次。然 後在含有1昭/ml抗NAP多克隆抗體的1。/。明膠/TBS溶液中，在室溫下 反應過夜。第二天，用TBS-0.05%吐溫清洗三次，用TBS清洗一次， 使其與以約1昭/ml的濃度稀釋於P/o明膠/TBS溶液中的抗兔IgG山羊 多克隆抗體過氧化物酶綴合物(Cappel公司，產品編號6743")在室溫下反應1小時。接著用TBS-0.05。/。吐溫清洗三次，用TBS清洗兩次， 用HRP顯色試劑盒(BIO-RAD公司，產品編號170 - 64631 )在室溫 下顯色5分鐘，檢測條帶。

NEFA多肽的結構模式圖和抗體製備中使用的肽的序列在NEFA上 的位置如圖2A所示，以用NAP肽免疫製備的多克隆抗體使用大鼠腦的 蛋白質提取液進行蛋白質印跡的結果如圖2B所示。由NAP肽製備的多 克隆抗體中，使用大鼠腦的蛋白質提取液進行蛋白質印跡時，在約47.5 kd分子量處可見單一條帶(圖2B)。由此表明NAP的抗體可識別全 長NEFA,並且NEFA在大鼠的腦內表達。
實施例4 大鼠的下丘腦中NESFATIN表達部位的研究
為了對與攝食調節相關的大鼠下丘腦中的NEFA表達部位進行分 析，實施了使用大鼠腦切片的免疫組織化學分析。向8周齡的Wistar系 大鼠(購自日本SLC)的腹腔內注射40 mg/kg戊巴比妥鈉，進行麻醉， 開胸，由心臟注入50ml生理食鹽水(0.85。/。NaCl),接著用400 ml的 蠕動泵注入含4%多聚甲醛的PBS( 20 mM磷酸緩衝液、150 mMNaCl pH 7.2)並使之循環，由此灌流固定腦。然後摘除腦，切取含有下丘腦的部 分，用含有4%多聚甲醛的PBS在4。C下固定過夜。固定的腦試樣在4 。C下在含有10%蔗糖的PBS中浸泡4小時，在含有15%蔗糖的PBS中 浸泡4小時，在含有20%蔗糖的PBS中浸泡過夜。然後腦試樣浸泡在 OCT混合物(OCT compound)中，用幹水-丙酮進行冷凍，製作包埋 塊。使用冷凍切片機，在-2(TC下，由製備的塊製作6 iam厚的切片， 放在矽烷塗層的載玻片("T 、7大；、製造，MAS塗層載玻片)上風乾。放 在載玻片上的組織切片用3%過氧化氳水處理5分鐘，用PBS清洗5分 鍾，共清洗兩次。再將組織切片用10%山羊正常血清(抹式會社二f k 4,產品編號426042)在室溫下處理10分鐘進行封閉，使其與在含有 0.5%BSA的PBS中稀釋的1 |ug/mlNAP肽的多克隆抗體(實施例3 )在 室溫下反應1小時(Ab組)。將載玻片用PBS清洗，然後與匕只卜7 7 O .少歹:/^7f O大鼠MAX-PO (才朱式會社二f k 4,產品 編號414181)反應，用PBS清洗5分鐘，共清洗三次，然後使用、〉歹4 > DAB溶液(抹式會社-f k >f ,產品編號415172)進行 顯色。將顯色後的載玻片進行水洗，然後用Mayer蘇木精(武藤化學藥 品，產品編號3000)進行染色，進行水洗、醇脫水、二曱苯透明，然後 使用非水溶性封片劑(抹式會社二f k^f，產品編號415141 )蓋上蓋玻 片，封片。使用封片後的腦切片，在顯微鏡下觀察。

圖3表示大鼠下丘腦和第三腦室(3V)區域的組織切片中抗NAP 肽抗體的組織免疫化學染色顯微鏡圖像(200倍)。圖中，在下丘腦的 Arc:弓狀核、PVN:室旁核、LH:外側區、SON:視上核可見特異性 染色，這些部位均顯示了 NEFA的表達，由以上顯示，NEFA多肽在大 鼠的下丘腦、特別是弓狀核、室旁核、視上核和外側區表達。
由該結果可見，由NEFA基因編碼的NEFA多肽在與下丘腦的與攝 食調節相關的部位表達，因此將該多肽命名為NESFATIN。
實施例5 重組NESFATIN的製備
為了確認在與攝食相關的下丘腦神經核表達的NESFATIN的性 狀，通過大腸桿菌製備重組NESFATIN。採用了以下方法以在小鼠成 熟型NESFATIN多肽(SEQ ID NO.6 )的N末端結合有GST (穀胱甘肽 -S -轉移酶)的融合蛋白(重組小鼠GST - NEFA: SEQ ID N0.25 )的 形式表達，將該融合蛋白用蛋白酶處理，由此純化重組成熟型小鼠 NESFATIN ( SEQ ID N0.26 )。大鼠NESFATIN與小鼠NESFATIN的氨 基酸水平的同源性為96.5%，非常高。
重組小鼠GST-NEFA表達用的基因的製備如下首先，以由小鼠 腦cDNA文庫(Invitrogen公司，產品編號10655 - 25 )提取的質粒為模 板，使用以下引物(各0.25 nM)，變性是在94。C下進行1.5分鐘的變 性反應，然後以94。C、 0.5分鐘變性，60°C、 0.5分鐘退火，72°C、 2 分鐘延伸為一個反應循環，進行五個循環，然後以94。C下0.5分鐘的變 性、分別為72'C下2分鐘的退火和擴增反應為一個反應循環，共進行30 個循環，製備擴增DNA(使用Stratagene公司，PfuTurdo (R)聚合酶， 產品編號600250)。
重組成熟型小鼠NEFA cDNA製備PCR用引物正向引物5 — TTGGATCCGTTCCTATCGATGTGGACAAGAC— 3 ( SEQ ID NO.27 ) 反向引物5 — TTGCGGCCGCTTATGTGTGTGGCTCAAACTTCAG- 3 ( SEQ ID N0.28 )
所得PCR產物用QIAGEN公司的MinElute PCR純化試劑盒純化， 用限制酶BamHI和Notl切割，再通過2%瓊脂糖凝膠-TAE電泳切取 1.3 kb左右的條帶，回收DNA片段(QIAGEN公司，MinElute凝膠提 取試劑盒，產品編號28604)。將該1.3kb的DNA片段用限制酶BamHI 和NotI切割，與pGEM-11Zf ( + )載體(Promega公司，P2411)連接， 轉化大腸桿菌DH5a菌林(TakaraBio公司，產品編號9057),在用含 有50昭/ml氨千青黴素的LB培養基製備的瓊脂培養基上形成菌落。
挑取數個所得菌落，使用pUC/M13正向引物(Promega公司，產品 編號Q5391、 pUC/M13反向引物(Promega公司，產品編號Q5401 )、 由小鼠NEFA基因內的序列得到的兩種引物mSQl ( 5 -CCTGAACCACCAGAATCC - 3 : SEQ ID NO.29 )和mSQ2 ( 5 -AGACTGATGGATTGGACC-3: SEQ ID NO.30 ),對由各克隆製備的 質粒進行鹼基序列分析，通過7 7° ， 4卜"《4才、〉7 r厶公司的BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction {式齊'J盒(產品糹扁號 4303149 )和ABI377型DNA測序儀(Perkin - Elmer)進行鹼基序列分 析。通過鹼基序列分析將顯示具有與SEQ ID NO.ll —致的鹼基序列的 克隆在含有50 jig/ml氨苄青黴素的10 ml LB培養基中培養過夜，使用 QIAGEN公司的QIA prep (R) Spin Miniprep試劑盒，按照所附說明書， 由菌體製備質粒。
將該質粒用限制酶BamHI和Notl切割，通過2%瓊脂糖TAE凝膠 進行電泳，切取1.2kb大小的條帶，回收DNA。回收的DNA片段與用 限制酶BamHI和Notl切割的pGEX - 4T - 1載體(77、〉弋厶乂《4才廿 工7隻，產品編號27 - 4580 - 01 )進行連接，使用Gene Pulser Xcell 電穿孔系統(BIO-RAD,產品編號l65 -2660J1)對大腸桿菌BL21菌 抹(7*7 、〉 \厶乂《4才廿>f工7隻，產品編號27 - 1542-01 )進行轉化， 再在由含有50昭/ml氨千青黴素的LB培養基製備的瓊脂培養基上形成 菌落。由轉化得到的重組大腸桿菌通過使用pGEX5'測序引物和pGEX3' 測序引物(77-〉弋厶乂《4才廿^f工^義，產品編號27- 1410-01和 27- 1411-01 )的PCR確認是否插入，再通過使用在實施例2中使用的製備NEFA探針的PCR用的引物組的PCR確認是否插入了 NEFA基因。 成熟型NEFA cDNA是使用已確認插入到pGEX - 4T - 1載體中的克隆 進行重組小鼠GST-NEFA蛋白質的表達。使用10 ml含有100 |ug/ml 氨千青黴素的LB培養基，在37。C下振蕩培養過夜，將其中的5ml加入 到500 ml含有100 |Lig/ml氨千青黴素的LB培養基中，在37。C下振蕩培 養，直至600nm波長的吸光度為0.6(將一部分菌取樣前誘導菌體)。 在該培養基中加入IPTG (異丙基-卩-D -硫代吡喃半乳糖苷Gibco BRL公司)，使終濃度為1 mM,再在37。C下振蕩培養3小時。培養後， 將含有菌體的培養基以5000 g、 4。C下離心15分鐘，回收菌體，懸浮於 25ml的PBS中。懸浮液在-80。C下冷凍1小時左右，然後在37。C下迅 速解凍，在水上實施超聲波處理30秒x5次，由此破碎菌體。然後以10,000 g在4。C下離心30分鐘，回收其上清(對沉澱級分取樣超聲後顆粒)。 上清是使用AKTA - FPLC液相色譜系統(7 t少Y厶"4才廿4 工7義)，過用PBS平衡的5 ml GSTrapFF柱(7 7 、二 \厶乂《才廿 工>只，產品編號17-5131-01)，然後用50ml的PBS清洗柱(流速 1 ml/分鐘)。然後以1 ml/分鐘的流速流入洗脫緩衝液(10 mM還原型 穀胱甘肽、0.4MTris-HClpH8.0、 0.2MNaCl),級分以lml回收， 通過280 nm的吸光度回收含有蛋白質的級分(280 nm吸光度最高的級 分純化GST-NEFA)。將前誘導菌體級分、超聲後顆粒級分、純化 GST - NEFA級分的一部分溶解於含有5%卩-巰基乙醇的Laemmli樣品 緩衝液(BIO-RAD公司，產品編號161 - 0737),在IO(TC下處理5 分鐘，然後通過孩i量離心才幾、以15,000 rpm離心5分鐘，將所得上清用 聚丙烯醯胺凝膠(BIO-RAD公司，！^亍、、一y^ 10-20%,產品編號 161-J390V),用Tris-甘氨酸/SDS緩衝液以100 V電泳1小時，用考 馬斯亮藍染色液(BIO-RAD公司，Bio-Safe CBBG- 250,產品編號 161 - 0786 )進行染色。純化GST-NEFA級分的大部分是通過使用經 PBS平衡的HITr叩Desalting柱(7* ^ 、二 \厶/《才廿 久，產品編號17-1153 - 01 )，然後以1 ml/分鐘的 流速用緩衝液A清洗(按每1 ml回收級分清洗樣品)。使用緩衝液A 和緩衝液B (20mM雙-TrispH6.5、 O.lMNaCl， 0.1%CHAPS)，以 緩衝液B為0-50%/60分鐘的直線濃度梯度的形式，對清洗的柱以0.5 ml/分鐘的流速進行洗脫。此時，取各0.5ml級分，以280nm波長的吸 光度回收含有蛋白質的級分(純化樣品)。將在該純化步驟中得到的樣 品(純化前樣品、清洗樣品、純化樣品)各取一部分，與含有5%卩-巰 基乙醇的Laemmli樣品緩衝液等量混合，在100°C下加溫5分鐘，然後 與實施例3的方法同樣地進行蛋白質印跡。將該級分用PBS透析，得到 純化的成熟型小鼠NEFA多肽。

圖4A表示使GST-NEFA融合蛋白在重組體大腸桿菌中表達、用 GSTrapFF柱純化GST - NEFA融合蛋白，使用該過程中的樣品進行的 SDS - PAGE的染色圖像。圖4B是表示通過凝血酶由GST - NEFA融合 蛋白中切取成熟小鼠NEFA多肽，並用HiTrap Q HP柱進行純化，該過 程中樣品中的抗NAP多克隆抗體的蛋白質印跡結果。由圖4可見，泳 道3的IPTG誘導表達後在破碎菌體的超聲後顆粒，相對於泳道2的前 誘導菌體，可見分子量65 kd的產物顯著增加。另外，在用GSTrapFF 柱純化的級分(純化樣品)中，可見65kd的主要產物，因此顯示重組 體大腸桿菌中表達重組小鼠GST-NEFA融合蛋白。根據圖4B,在純化 前的樣品(純化前樣品)中檢測出分子量為47.5 kd的被凝血酶切割的 成熟型小鼠NEFA多肽和分子量約為65 kd的重組小鼠GST - NEFA融 合蛋白的條帶，除此之外還可見多條條帶。而在純化樣品中只可見分子量為47.5 kd的主要條帶和65 kd的弱條帶，顯示得到了幾乎純粹的重組
成熟型小鼠NEFA多肽。
實施例6 通過腦室內施與NESFATIN研究其對攝食行為的作用
為了驗證所得重組NESFATIN對動物攝食行為的作用，進行了在無 麻醉下向大鼠第三腦室腦內施與的實驗。
大鼠使用Wistar系大鼠(購自日本SLC ),以購入後上午6點至下 午6點的12小時為光照期、下午6點至第二天早晨6點的12小時為暗 期，按照該周期施與粉末飼料(日本夕UT公司，CE-2),在22。C下 飼養，實驗期間也在同樣條件下繼續飼養。實驗是從雄性8-9周齡 Wistar系大鼠內選擇體重200 - 250 g之間的個體使用。將生理食鹽水(對 照)、或者將實驗例5中製備的重組NESFATIN以每5 pl生理食鹽水溶 解lpmol、 4pmo1、 20pmo1，每隻個體分別使用5 |il (每組N=5 )。大 鼠每1 kg體重腹腔內施與40mg戊巴比妥鈉進行麻醉，除去頭部的毛之 後固定於腦定位固定裝置(David Kopf公司，型號1962),切開頭皮， 留置固定"G針(導向插管(力V卜"力二二一 1/))固定，使其達到第 三腦室(前囟點後方2.5mm、表面9.5mm)。在該導向插管固定一周 後進行各實驗。手術恢復後，在進入攝食活動亢進的暗期之前，在無麻 醉下用29G的注入用插管插入到導向插管中，以l秒鐘lpl的速度施與 5 |il生理食鹽水或溶解於生理食鹽水的成熟型小鼠NESFATIN溶液，在 施與後將插管固定2-3分鐘左右，然後拔出注入用插管，送回單體籠 中。之後在1小時後、3小時後、6小時後測定祠料的重量變化，記錄 攝食量，以此作為攝食行為的指標。顯著差異檢驗是採用方差分析。

在向第三腦室內施與0(只含PBS) 、 1、 4、 20pmo1重組NESFATIN 時，施與後O-第1小時期間的攝食量如圖5A所示，第1-第3小時期 間的攝食量如圖5B所示，第3 -第6小時期間的攝食量如圖5C所示。 與在0-l小時、1-3、 3-6小時的任意期間只施與生理食鹽水的大鼠 比較，在施與了重組NESFATIN的組中，可見攝食量施與量相關性地降 低。特別是在施與20 pmol的重組NESFATIN的組中，在0 - 1小時/1 -3小時/3 - 6小時(各P<0.01 )的任意期間，它們的攝食量與對照組相比都可見顯著的攝食抑制作用。由這些結果顯示，NESFATIN在腦內具 有抑制攝食行為的作用。
實施例7腦室內施與抗NESFATIN抗體對攝食行為的作用的研究
為了進一步驗證NESFATIN的攝食調節作用，對第三腦室內施與 NESFATIN的抗體對攝食行為的作用進行了研究。
抗體使用實施例4中製備的抗NAP肽抗體(NAP IgG),將5 pi 用生理食鹽水稀釋的抗體施與大鼠(施與量5昭)。作為對照，與由未 經免疫的兔純化的IgG (對照IgG)以相同的濃度進行等量施與。大鼠 使用Wistar系大鼠(購自日本SLC ),與實施例6同樣地進行飼養，在 雄性8-9周齡Wistar系大鼠中選取體重200 - 250 g之間的個體使用。 施與時期是在進入攝食行為少的光照期之前進行，施與的方法與實施例 6的方法同樣地實施。測定腦室內施與後-3小時-6小時-9小時期間 粉末祠料的攝食量。顯著差異檢驗採用方差分析。

月^室內施與對照IgG或抗NESFATIN抗體(NAP IgG)的大鼠中， 在0 - 3小時期間的攝食量如圖6A所示，3-6小時期間的攝食量如圖 6B所示，6-12小時期間的攝食量如圖6C所示。在腦室內施與抗 NESFATIN抗體的個體中，在光照期的0 - 3小時(圖6A) 、 3 - 6小時
(圖6B)的攝食量與施與對照IgG的個體相比，統計學上顯著促進(各 PO.001)。對於該抗NESFATIN抗體施與組攝食量的增加，0-3小時
(圖6A)是對照IgG施與組的約9倍，3-6小時是約IO倍左右。但是， 6-9小時期間為暗期，對照IgG施與組的攝食行為開始，因此未見顯著 差異。這樣，通過施與抗NESFATIN抗體，可見大鼠的攝食量的亢進， 因此顯示抗NESFATIN抗體抑制內源性NESFATIN的作用，NESFATIN 與攝食行為相關。
咒
絕食是否使內源性NESFATIN基因的表達發生變化，這通過原位雜 交法進行研究。腦組織中的原位雜交用的探針使用實施例2中製備的、製備NEFA 探針用的質粒。使用1 iig用限制酶NcoI切割並純化的該質粒，使用洋 地黃毒苷(DIG) RNA標記試劑盒(口 、乂 、> 二 .夕、'V 7少V 7亍,、乂夕只 公司，產品編號1175025 )，通過SP6-RNA轉錄酶的反應製備DIG標 記的cRNA探針。SP6-RNA轉錄酶的反應是在40。C下進行2小時，反 應後向20 iul反應液中加入2 |ul 0.2 M的EDTA (pH 7.0),終止反應， 向其中加入2.5 iul 3 MLiCl和75 pi冷卻至-20。C的乙醇並混合，然後在 -2(TC下靜置過夜。第二天，將反應物用設定為4。C的微量離心機以 l5,000 rpm離心20分鐘，除去上清，向沉澱中加入50 70%乙醇，再 次進行離心，除去該上清，使沉澱乾燥。沉澱溶解於DEPC處理水(二 少求^;^一7公司，產品編號314 - 90205 )，通過瓊脂糖凝膠電泳定量 RNA的量，用DEPC處理水稀釋，使RNA的濃度大約為0.1mg/ml。為 了縮短所得cRNA探針的長度(約等於450個鹼基)，向該10 ^ 0.1 mg/ml 濃度的RNA溶液中加入10 pl DEPC處理水和40 pl碳酸鹽緩衝液(60 mM碳酸鈉、40mM碳酸氫鈉，pH10.2)並混合，在60。C下反應30分 鍾。向反應物中加入60 jal中和溶液(3M乙酸鈉、1%乙酸，pH6.0), 再加入360 jil冷卻至-20。C的乙醇，混合，然後在-7(TC下冷卻30分 鍾，用設定為4。C的微量離心機以15,000 rpm離心20分鐘，除去上清， 得到沉澱。沉澱是加入100^170%乙醇(-2(TC),再次進行離心，除 去該上清，使沉澱乾燥。千燥的沉澱溶解於lOOitdDEPC處理水，通過 瓊脂糖凝膠電泳進行濃度測定。所得探針的濃度約為50pg/ml。將這樣 得到的DIG標記NEFA cRNA探針用於原位雜交。
將約8周齡的雄性Wistar系大鼠(購自日本SLC )(體重220 - 250 g)分為可自由攝食粉末飼料的個體(正常)、48小時不施與飼料只施 與飲料水祠養的個體(飢餓)、36小時不施與祠料祠養後再使其可自由 攝食伺料12小時的個體(再度攝食)進行飼養，與實施例5的方法同 樣，用含有4%多聚甲醛的PBS灌流固定，取出腦。取出的腦切取含有 下丘腦的部分，再用含有4%多聚甲醛的PBS在4。C下固定過夜。與實 施例4的方法同樣地，將固定的腦組織用切片機製作10 pm厚度的切 片，放置在矽烷塗層的載玻片上。將載有腦組織切片的載玻片放在恆溫 箱中，在5(TC下處理2分鐘，然後將切片在室溫下乾燥30分鐘。切片 再用含有4o/。多聚甲醛的PBS在室溫下處理7分鐘，固定，用PBS清洗3分鐘，用2倍濃度的SSC清洗5分鐘，共清洗兩次。
鋪原位雜交液(4倍濃度SSC、 10%硫酸葡聚糖、1倍濃度的 Denhardt's液、2mMEDTA、 50%去離子化曱醯胺、500 pg/ml鱒魚精子 DNA)，使其覆蓋載玻片上的腦組織切片，在37。C下預雜交1小時。預 雜交結束後，除去覆蓋的液體，鋪含有200 ng/ml濃度的DIG標記NEFA cRNA探針的原位雜交液，使其覆蓋組織，在溼潤箱中、37t:下雜交16 小時。載有雜交後的腦組織切片的載玻片在37t:下用2倍濃度的SSC 清洗5分鐘，然後在37。C下用含有60%曱醯胺的0.2倍濃度的SSC分別 清洗5分鐘，清洗三次，再在室溫下用2倍濃度的SSC清洗5分鐘，清 洗兩次。
清洗後的腦組織中，雜交了的探針是使用DIG核酸檢測試劑盒(口 7 、〉 - '夕'4 T夕、、乂 7 r 4少夕只，產品編號11175041 )進行檢測，該 方法概要如下。將載有腦組織的載玻片用含有150mMNaCl的100 mM Tris-HCl (pH7.5)緩衝液在室溫下清洗5分鐘，然後使用試劑盒中含 有的、使封閉試劑飽和的該緩衝液(封閉緩衝液)，在室溫下進行30 分鐘的封閉。在該載玻片上覆蓋試劑盒中含有的、將抗DIG抗體鹼性磷 酸酶綴合物用封閉緩衝液稀釋成1/加0的濃度的溶液，在室溫下反應2 小時。反應後的載玻片用含有150mMNaCl的100 mM Tris - HC1 ( pH 7.5)緩衝液清洗5分鐘，清洗兩次，然後用檢測緩衝液(100 mM Tris -HClpH7.5、 100mMNaCl、 50 mM MgCl2 )清洗10分鐘。然後覆蓋 含有0.18 mg/ml BCIP和0.34 mg/ml NBT的檢測緩衝液，在室溫下反應 16小時，進行顯色反應。該載玻片用含有lmMEDTA的lOmMTris-HC1 (pH8.0)清洗5分鐘，終止顯色反應。
該載玻片進一步用蒸餾水清洗5分鐘，用1%的亞甲氯染色5分鐘， 然後用蒸餾水清洗，進行醇脫水、二曱苯透明化，用非水溶性封固劑(抹 式會社-千I^4,產品編號415141 )覆蓋在蓋玻片上進行封片，然後通
過光學顯微鏡進行觀察。 <結果〉
與圖7A所示的對照組比較，圖7B所示的48小時絕食時，室旁核 (PVN)中NESFATIN的mRNA表達顯著減少，如圖7C所示，絕食後 恢復攝食，則顯示NESFATINmRNA基因的表達恢復。這些結果表明，內源性NESFATIN與攝食調節有關。
實施例9 飢餓狀態下大鼠腦內的NESFATIN表達的研究
通過免疫組織染色法研究絕食狀態下內源性NESFATIN的變化。 使用約8周齡的雄性Wister系大鼠(購自日本SLC )(體重220 -250 g)分為可自由攝食粉末祠料的對照組和進行24小時絕食的絕食 組，製作這些大鼠的腦組織切片，通過使用抗NESFATIN抗體的免疫組 織化學進行分析。組織切片的製備和免疫組織染色的方法與實施例4的 方法同樣進行。另外，為了研究與攝食相關的腦區域神經細胞活化狀 態，使用c-Fos抗體實施絕食組腦組織中的免疫組織化學分析。方法是 使用稀釋為500倍的c - Fos ( K - 25 )抗體(Santa Cruz Biotechnology 公司，sc - 253 )代替抗NESFATIN抗體，與上述同樣進行。

對照組下丘腦中抗NESFATIN抗體(NAP Ab )的免疫組織化學染 色顯微鏡圖像(200倍)如圖8A所示，絕食組下丘腦中抗NESFATIN 抗體的免疫組織化學染色顯微鏡圖像(與A相同倍率)如圖8B所示， 絕食組下丘腦的抗c-Fos抗體的免疫組織化學染色圖像(與A相同倍 率)如圖8C所示。圖的上部分表示室旁核的圖像，下部分表示弓狀核 的圖像。與對照組比較，在絕食組的下丘腦，室旁核(圖8B上部分) 和弓狀核(圖8B下部分)的染色性顯著減少，顯示絕食使NESFATIN 表達降低。在食慾亢進的狀態下可見c-Fos蛋白質的表達。由此可以認 為，在因絕食導致食慾亢進的狀態下，被認為顯示食慾抑制效果的 NESFATIN表達降低，進行了食慾的調節。
實施例10 NESFATIN- 1 、 NESFATIN - 2 、 NESFATIN - 3和NESFATIN - 2/3肽的製備以及NESFATIN - 1肽的抗體、NESFATIN - 3和 NESFATIN - 2/3抗體的製備
實施例3 - 9中，顯示NESFATIN在下丘腦表達並對攝食和體重調 節發揮作用。該NESFATIN在其前體中具有信號肽，因此顯示分泌到細 胞外的可能性。已知有些活性蛋白質在翻譯後加工中被激素原轉化酶 (PC )切割。因此，對激素原轉化酶的切割部位的序列Arg - Arg或Lys-Arg序列是否存在於小鼠、大鼠和人的NEFA序列中進行了分析。結 果表明，在小鼠、大鼠和人的序列中，在由N末端的第107號和第108 號胺基酸序列的位置、以及在199號和第200號的位置都存在Lys-Arg 的序列，並且在第188號和第189號的胺基酸序列的位置都存在Arg-Arg的序列(圖9A)。因此，NESFATIN序列中，將相當於胺基酸編號 第25號-第106號的82個殘基的肽命名為NESFATIN - 1 ( SEQ ID N0.15),將胺基酸編號第109-第187號的79個殘基的肽命名為 NESFATIN - 2 ( SEQ ID N0.16 ),將含有胺基酸編號第190 -第420號 的231個殘基的肽命名為NESFATIN - 3 ( SEQ ID N0.17 )。此時，已 知的結構域結構一DNA結合區(胺基酸編號171 - 223 )形成被 NESFATIN - 2和NESFATIN - 3分割的形式，柄蛋白結合區(胺基酸編 號213 -420)、鈣結合區(胺基酸編號254 -265和306 - 317)以及富 Asp/Glu區(胺基酸編號306 - 317 )是含在NESFATIN - 3的序列內， 在NESFATIN-l序列中不含有已知的結構域結構(圖9B)。因此，將 由NESFATIN-2和NESFATIN - 3的序列形成的肽的部分命名為 NESFATIN-2/3 (SEQ ID N0.47 )。大鼠NESFATIN - 1肽(SEQ ID N0.15)和NESFATIN-2肽(SEQ ID NO.16)的合成委託(抹)矢內 原研究所，通過固相合成進行合成，通過反相液相色譜純化。NESFATIN -3肽(SEQIDN0.17)使用由大鼠腦製備的cDNA,使用SEQIDN0.48 和SEQIDN0.49的引物，獲得擴增的DNA ( SEQ ID NO.50 )，使用該 DNA,由Post Genome Institute Co. LTD ( Shimizu Y等人Nature Biotech 19:751 - 755， 2001 )通過無細胞蛋白質合成法製備。
所使用的PCR引物 正向引物5， -ATGGAATATTTAAAAACGCTGAGTGAG-3， ( SEQ ID N0.48 ) 反向引物5' -TTATGTGTGTGGCTCAAACTTCA-3' ( SEQ ID N0.49 )
由該方法製備的NESFATIN - 3形成N末端結合有Met形式的序列 (SEQIDN0.51)。
同樣，NESFATIN - 2/3 ( SEQ ID N0.47 )是使用SEQ ID N0.52和 SEQ ID NO.53的引物，獲得由來自大鼠腦的cDNA擴增的DNA( SEQ ID N0.54),通過無細胞蛋白質合成法製備。
使用的PCR引物 正向引物5' -ATGCAAGAAGTAGGAAGACTGAGAA-3' (SEQIDN0.52)反向引物5' -TTATGTGTGTGGCTCAAACTTCA-3， (SEQIDN0.53)
由該方法製備的NESFATIN - 2/3形成N末端結合有Met的形式的 序列(SEQIDN0.55)。
為了製備與實施例3中製備的抗NAP肽抗體針對不同區域的抗 體，製備了 NAP1肽中相當於胺基酸編號24- 38 ( SEQIDN0.5的小鼠 前體NEFA多肽中相當於胺基酸編號48 - 62 )序列的C末端上附加Cys 的序列(NAP - lAb: SEQ ID N0.32 )， 相當於NAP - 3胺基酸編號1 -9的序列(SEQ ID N0.5的小鼠前體NEFA多肽中相當於胺基酸編號 190 - 198 )、以及相當於NAP-3肽中胺基酸編號136 - 149的序列(SEQ ID N0.5的小鼠前體NEFA多肽序列中相當於胺基酸編號325 - 338 )的 C末端附加Cys的序列(各NAP - CI Ab: SEQ ID N0.33和NAP - C2 Ab: SEQIDN0.34)。
NAP-lAb : N-ProAspThrGlyUuTyrTyrAspGluTyrUuLysGlnVallleC ys-C (SEQ ID NO. 3 2 ) NAP-CI Ab : N-GluTyrLeuLysThrLeuSerGlu GluCys-C ( SEQ ID NO. 3 3 )
NAP-C2 Ab : N-LysGluPheLeuGluProAspSerTrpGluThrLeuAspGlnCy s-C ( SEQ ID NO. 3 4 )
NAP - 1 Ab、 NAP - CI Ab、 NAP - C2 Ab各肽的製備委託才朱式會社 ATP,通過固相合成進行合成，通過反相液相色譜純化。與實施例3的 方法同樣，製備所得NAP - 1 Ab、 NAP - CI Ab、 NAP - C2 Ab各肽與 KLH的綴合物，免疫兔，製備含有各肽的抗體的血清。使用DEAE柱， 按照規定方法從各血清中純化兔IgG，分別製成NAP-1 IgG(Nesfatin
-1 IgG ) 、 NAP - CI IgG (Nesfatin - CI IgG) 、 NAP - C2 IgG (Nesfatin
-C2IgG)。
上述製備的NESFATIN - 1肽和NESFATIN - 3肽分別通過SDS -聚丙烯醯胺凝膠(12%)電泳進行泳動，然後按照與實施例3同樣的方 法，分別使用Nesfatin - 1 IgG和NesfatinC2 IgG抗體對各肽進行蛋白質 印跡。
通過固相合成法合成並通過反相色譜純化的NESFATIN-1肽、 NESFATIN - 2肽、NESFATIN - 3肽和NESFATIN - 2/3肽通過分析用 C18反相色譜，被純化為幾乎顯示單一峰的純度，分取該峰，通過MAS 譜分析法(NESFATIN - 1和NESFATIN - 2 )或SDS -聚丙烯醯胺凝膠 (12%凝膠)電泳法(NESFATIN-3和NESFATIN - 2/3 )進行分析， 顯示合成了預想的、被認為是NESFATIN- 1 、NESFATIN - 2、NESFATIN -3和NESFATIN-2/3各肽的分子量的肽。另夕卜，在用NAP-1Ab、 NAP-ClAb、 NAP-C2 Ab各肽與KLH綴合物免疫的兔中，可見分別 對全部三種肽的抗體效價均上升，得到了各肽的抗體(IgG)。
將NESFATIN - 1肽進行電泳，用Nesfatin- 1 IgG進行蛋白質印 跡，結果在9.7 kd處可見條帶；將NESFATIN - 3肽進行電泳，用Nesfatin -C2IgG進行蛋白質印跡，結果在27.9kd處可見條帶(圖9C)。由此 顯示，Nesfatin - 1 IgG和Nesfatin - C2 IgG各抗體分別與NESFATIN - 1 肽和NESFATIN-3 ( NESFATIN - 2/3 )結合。
實施例11 通過NAP- 1 IgG和抗PC抗體進行免疫組織化學分析
為了驗證由NESFATIN加工NESFATIN - 1 ，首先，用實施例10中 製備的NAP - 1 IgG ( Nesfatin - 1 IgG)和抗激素原轉化酶抗體(抗PC ) 的抗體對大鼠下丘腦進行雙重免疫組織染色，由此分析NESFATIN和 PC的局部存在。
腦組織切片的製作按以下方法進行。向8周齡的Wister系大鼠(購 自日本千y —/kX . >j w— )的腹腔內注射40 mg/kg戊巴比妥鈉進行麻 醉，開胸，由心臟注入50ml生理食鹽水(0.85。/。NaCl),接著用400 ml 蠕動泵注入含有4%多聚甲醛的PBS(20mM磷酸緩衝液、150mMNaCl pH7.2),並使其循環，對腦進行灌流固定。之後摘除腦，切取含有下 丘腦的部分，用含有4%多聚曱醛的PBS在4。C下固定過夜。固定的腦 試樣在4'C下在含有10%蔗糖的PBS中浸泡4小時，再在含有15%蔗糖 的PBS中浸泡4小時，再在含有20%蔗糖的PBS中浸泡過夜。然後將 腦試樣浸泡在OCT混合物中，用幹水-丙酮進行冷凍，製作包埋塊。 使用冷凍切片機，在-2(TC下，由製備的塊製作6 pm厚的切片，放在 矽烷塗層載玻片(^ 、_/大；、製造，MAS塗層載玻片)上風乾。放在載玻 片上的組織切片用3%過氧化氫水處理5分鐘，用PBS清洗5分鐘，共清洗兩次。
再將放置有腦組織切片的載玻片用10%山羊正常血清(抹式會社-f1^4,產品編號426042)在室溫下處理10分鐘進行封閉，使其與用 含有0.5% BSA的PBS稀釋為1/500的NAP - 1 IgG ( Nesfatin - 1 IgG: 實施例10)在室溫下反應1小時。與抗體反應的載玻片用PBS清洗5 分鐘，共清洗三次，然後與匕7卜770.、>> r 4 乂大鼠
MAX-PO(抹式會社-千k 4,產品編號414181 )反應，用PBS清洗， 然後通過4-氯-1-萘酚(ICN公司，產品編號980611: 4 -氯-l-萘酚穩定色原 ) 進行顯色。 將顯色後的載玻片用PBS清洗5分鐘，共清 洗3次，然後將載玻片在0.1 M甘氨酸緩衝液(pH 2.2 )中浸泡1.5小時 (每30分鐘更換緩衝液)，然後用PBS清洗5分鐘，共清洗3次。在 將載玻片用10%山羊正常血清(抹式會社二f X,產品編號426042) 在室溫下處理10分鐘進行封閉。將經上述處理的載玻片分成兩組，一 組是將識別激素原轉化酶的亞型PC1和PC3的抗體(PC - 1/3: Chemicon 公司，產品編號AB1260)在含有0.5BSA的PBS中稀釋，製成抗體液， 另一組是將識別激素原轉化酶的亞型PC2的抗體(PC-2: Chemicon 公司，產品編號AB1262)在含有0.5BSA的PBS中稀釋，製成抗體液， 均在室溫下反應1小時。之後，將載玻片用PBS清洗5分鐘，清洗3次， 將該載玻片在室溫下與用含有0.5% BSA的PBS稀釋成1/200的山羊抗 兔IgG - Alexa 594綴合物(Molecular Probes，產品編號Al 1008 )反應 30分鐘。然後將載玻片用PBS清洗5分鐘，共清洗3次，輕輕風乾後 用甘油和蓋玻片封片。將蓋玻片的周圍用透明指甲油密封，製作標本。 標本通過共焦點雷射顯微鏡(Bio - Rad公司，MRC - 1024共焦點雷射 掃描設備+尼康公司製造的Eclipse E800正置顯微鏡)，以4 -氯-1 -萘酚的染色作為相位差圖像，Alexa594的螢光用氪-氬雷射(波長568 nm)的激發光以使用605土30nm的帶通濾波器的螢光圖像的形式觀察。

在大鼠下丘腦組織的免疫組織化學圖像中，Nesfatin - 1 IgG的染色 圖像如圖10A的①和②所示，PC-1/3的焚光圖像如圖10B的①所示， PC-2的螢光圖像如圖10B的②所示。圖10A的①和圖10B的②、圖 10A的②和圖10B的②呈現的是同一視野下的顯色圖像和萸光圖像。如圖10A的①和②所示，由Nesfatin - 1 IgG染色的細胞在大鼠下丘腦細胞 中可見。這些很多的細胞中，抗PC-1/3抗體和抗PC-2抗體的染色圖 像與Nesfatin - 1 IgG陽性細胞一致。由此顯示，在表達NESFATIN的細 胞中，激素原轉化酶PC1/3和PC2共表達。這顯示NESFATIN被激素原 轉化酶加工的可能性。
實施例12 腦內施與NESFATIN — 1 、 NESFATIN — 2、 NESFATIN — 3 和NESFATIN - 2/3對攝食量調節的作用研究
驗證NESFATIN的哪一個部位具有攝食抑制活性。 用於腦室內施與的施與試樣是只將生理食鹽水(Vehicle組)、或 者將實施例10中製備的NESFATIN-1、 NESFATIN-2、 NESFATIN-3或NESFATIN - 2/3分別用生理食鹽水溶解，每一隻個體以25 pmol在 暗期之前施與到第三腦室內。大鼠使用Wistar系大鼠(購自日本SLC ), 與實施例6同樣祠養。雄性8-9周齡Wistar系大鼠中選擇體重為200 -250 g之間的個體使用(N=5)。大鼠的腦室內施與的實驗方法和關於 撮食量的測定與實施例6的方法同樣進行。攝食量的測定是將施與後的 1小時(0-1小時)和施與1小時後的2小時(第1 -第3小時)期間
的伺料減少量作為攝食量進行測定。
在與上述同樣的條件下，作為試樣，只將NESFATIN-1在進入暗 期之前每隻大鼠個體以1、 5或25pmol施與第三腦室內進行實驗。該實 驗中，測定施與後的1小時(O-第1小時)的攝食量。

如圖11 A所示，與對照組(Cont)比較，腦室內施與NESFATIN -2、 NESFATIN - 3和NESFATIN - 2/3,未見攝食量有顯著變化(0 -第1小時圖IIA的a-1、第1-第3小時圖IIA的a-2)。而腦 室內施與25 pmol的NESFATIN- 1則可見顯著的攝食抑制效果。如圖 IIB所示，每隻大鼠個體腦室內施與1、 5或25 pmol NESFATIN-1時， 與只施與生理食鹽水的情形(O)相比，可見隨著NESFATIN-1施與量 的增加、攝食量降低的現象，特別是施與5pmol或25pmol時，可見顯 著的攝食減少。由該結果表明，NESFATIN的攝食抑制活性局部存在於 NESFATIN - 1中。實施例13 腦室內連續施與NESFATIN - 1時的攝食量與體重的變化
進一步對於腦室內連續施與NESFATIN - 1時對攝食和體重變化的 影響進行研究。
施與NESFATIN - 1是通過滲透壓泵連續IO天腦室內施與。動物是 從8周齡Wistar系雄性大鼠(購自日本SLC )中選4奪體重在200 - 250 g 範圍的使用。每l kg體重大鼠中腹腔內施與40 mg戊巴比妥鈉進行麻 醉，頭部去毛，然後固定在腦定位固定裝置(DavidK叩f,型號1962)， 切開頭皮，留置固定23G針(導向插管)，使其先端到達第三腦室(前 自門後方25 mm，表面9.5 mm)，在固定該導向插管1周後進行各實驗。 滲透壓泵使用Alzet/^司的型號12002，將溶解於用0.22 pm Millex GV 濾器(Millipore)滅菌的生理食鹽水中的NESFATIN - 1 (NESFATIN-1施與組)、或只將無菌生理食鹽水(對照組)在使用之前注入到滲透 壓泵中，從使用的前一天開始，浸泡在無菌生理食鹽水中啟動 y夕、、)。注入了各試樣的滲透壓泵與導管連接，該導管上連 接有注入用插管，通過預先埋入的導向插管，將注入用插管的先端插入 大鼠的第三腦室進行固定。在該狀態下使用，則可以以24小時12^1的 速度向第三腦室注入試樣，在NESFATIN-1施與組中，每天腦室內施 與5 pmol的NESFATIN-1。確認埋入了滲透壓泵的大鼠從麻醉中清 醒，再放入單體籠中，在可以自由攝取粉末飼料和飲料水的條件下進行 飼養。攝食量的測定是從埋入了插管和滲透壓泵的第二天起，測定每天 上午9點時殘留的飼料的重量，求出與前一天飼料重量的差，計算一天 (24小時)的攝食量。另外，從開始施與6天後起，在測定攝食量時測 定體重，對其體重變化進行記錄。
<結果〉
如圖12A所示，在NESFATIN-1施與組中，開始施與後第一天即 可見攝食量減少，測定期間中與對照組相比，保持了攝食量降低。如圖 12B所示，關於體重增加速度，NESFATIN-1施與組與對照組相比顯 著減小。
實施例14 腦內施與抗NESFATIN - 1抗體或抗NESFATIN - 3抗體以及腦內施與變異型NESFATIN的攝食調節研究
實施例12和13中，發現了腦內施與NESFATIN - 1肽導致的攝食 量降低效果。為了進一步確認該事實，將識別NESFATIN - 1的NAP -1 IgG( Nesfatin - 1 IgG )、或識別NESFATIN - 3的NAP - CI IgG( Nesfatin -CI IgG)、或NAP - C2 IgG ( Nesfatin - C2 IgG)施與大鼠腦室內，研 究對攝食量的影響。另外，為了調查NESFATIN被激素原轉化酶切割， 從而產生NESFATIN - 1與攝食調節的關係，將SEQ ID N0.26序列內相 當於胺基酸編號84號和85號的Lys'Arg序列置換為Ala'Ala序列，製備 變異體(KR-AA變異體Mut),研究施與大鼠腦內時的效果。
用於腦室內施與的施與試樣是由使用生理食鹽水、未免疫的兔純 化的IgG (對照組)，或者將實施例11中製備的NAP - 1 IgG ( Nesfatin -1 IgG ) 、 NAP - CI IgG (Nesfatin - CI IgG)或NAP - C2 IgG ( Nesfatin -C2 IgG)分別溶解於生理食鹽水，每隻個體以5 ^ (5 pg)施與第三 腦室內。大鼠是使用Wistar系大鼠(購自日本SLC ),與實施例6同樣 飼養。從雄性8 - 9周齡Wistar系大鼠中選擇體重在200 - 250 g之間的 個體使用。大鼠的腦室內施與實驗的方法和攝食量的測定與實施例7的 方法同樣進行。攝食量的測定是以施與後的3小時(0-3小時)和施與 3小時後的3小時(3-6小時)期間飼料的減少量作為攝食量測定。
KR-AA變異體的製備可通過改變實施例5中獲得的成熟型小鼠 NESFATIN基因並使其表達來實施。實施例5中獲得的成熟型小鼠 NESFATIN基因是使用克隆到pGEM-llZf ( + )的質粒，通過PCR法 製備兩種片段。第一種DNA片段是使用5 ng該質粒，通過mNucB2-F360 [Sac2Thr]引物和mNucB2 [KR - AA]R583引物組進行PCR製備。
mNucB2-F360[Sac2Thr] : 5' -GGTTCCGCGGGTCTGGTTCCGCGTGGTTCTGT TCCTATCGATGTGGACAAGACCAA-3'( SEQ ID NO. 5 6 )
mNucB2[KR-AA]R583 : 5' -CTTCTTGAGCAGCCAGCTCATCCAGTCTCGTCCTC A-3， ( SEQIDNO. 5 7 )
反應條件是在9(TC下進行1分鐘變性反應，接著在98。C變性10秒、 6(TC退火30秒、68。C延伸l分鐘，將該反應循環進行20個循環，製備 擴增DNA(使用Stratagene公司，PfuTurdo(R)聚合酶，產品編號600250 )。第二種DNA片段與第 一種DNA片段同樣，使用5 ng該質粒的DNA 片段，以mNucB2[KR - AA]F612引物和mNucB2 - R1527 [Notl]引物的 組進行PCR製備。
mNucB2[KR-AA]F612 : 5' -GAGCTGGCTGCTCAAGAAGTAGGAAGACTGCGGAT GCT-3'( SEQIDNO. 5 8 )
mNucB2-R1527[Notl] : 5' -GGTTGCGGCCGCACTTTATGTGTGTGGCTCAAAC TTCAG-3，( SEQIDNO. 5 9 )
PCR條件與第 一種DNA片段的擴增同樣。
為了製備兩種DNA片段，將上述兩種PCR反應後的樣品添加到反 應液中,每50 jal各添加5 通過各0.25 (iM His — Thr - For [Spel]引物 和上述的mNucB2-R1527 [Notl]引物，在1倍濃度的Pfu緩衝液、2.5 單位的PfuTurbo DNA聚合酶(以上為Stratagene公司)和0.2 mM dNTPs (Promega公司C1141)的反應液，在9(TC下變性反應1分鐘，之後 進行98。C變性10秒、6(TC退火30秒、68。C延伸1分鐘，將該反應循環 進行20個循環，製備擴增DNA。
His-Thr-For[SpeI] : 5' -GGTTACTAGTGGTTCTGGTCATCACCATCACCATC ACTCCGCGGGTCTGGTTCCGCGT-3' ( SEQ ID NO. 6 0)
所得PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳回收擴增條帶，使用QIAEX -II試劑盒(QIAGEN^^司)純化。回收的擴增DNA用限制酶Spel和 Notl消化，與同樣用限制酶Spel和Notl消化的pET41a( + )載體(Novagen 公司)進行連接(快速DNA連接試劑盒(New England BioLab公司))， 進行克隆。與實施例5同樣，對克隆的DNA進行DNA鹼基序列分析， 獲得導入的變異部分及其它鹼基序列沒有差異的克隆，可得到KR-AA 變異體表達用的載體。對於表達、純化，按照與實施例5同樣的方法實 施。所得KR-AA變異體的胺基酸序列如SEQIDN0.61所示。另外， Wt (正常的NESFATIN )使用實施例5中所製備的。按照與實施例6同 樣的方法，將各5 pmol所得到的KR-AA變異體(Mut)和正常的NESFATIN (Wt)各多肽施與大鼠的第三腦室內。施與1小時後、3小 時後、6小時後和12小時後測定飼料的重量變化，計算攝取量，作為攝 取行為的指標。

在向第三腦室內施與了對照IgG、 NAP - 1 IgG ( Nesfatin - 1 IgG )、 NAP - CI IgG ( Nesfatin - CI IgG)或NAP - C2 IgG ( Nesfatin - C2 IgG ) 的各組中，施與後0-第3小時期間的攝食量如圖13A的a-l所示，第 3-第6小時期間的攝食量如圖13A的a-2所示，第6-第9小時期間 的攝食量如圖13A的a - 3的圖所示。在0 -第3小時(圖13A的a - 1 )、 第3 -第6小時(圖13A的a-2)中，與施與對照IgG的大鼠比較，在 施與了 NAP- 1 IgG( Nesfatin - 1 IgG )的個體中可見攝食量顯著增加(在 0-第3小時中PO.001,第3-第6小時中P<0.05),但在施與NAP-CI IgG ( Nesfatin - CI IgG)或NAP - C2 IgG ( Nesfatin - C2 IgG)的組 中，相對於Vehicle組未見攝食量的顯著差異。在第6 -第9小時的結果 中，對照IgG組、NAP-1 IgG (Nesfatin-1 IgG)組、NAP - CI IgG (Nesfatin - CI IgG)組、和NAP - C2 IgG (Nesfatin - C2 IgG)組的各 組中，均未見顯著的攝食量差異。由該結果顯示，由於NESFATIN-1 的抗體，內源性NESFATIN-1的功能受到抑制，攝食量增加。由此顯 示，通過實施例13的驗證，腦室內施與NESFATIN - 1肽顯示攝食抑制 作用，除此之外，抑制NESFATIN-1功能的物質具有攝食量增大的效 果。
將5 pmol將重組小鼠NESFATIN ( Wt)和將相當於胺基酸編號第 84號和85號的Lys'Arg序列置換為Ala'Ala的序列的變異體(Mut)施 與大鼠腦室內時，研究對其攝食量的影響，結果如圖13B所示。圖13B 中，b-l表示施與後0-第l小時的攝食量，b-2表示第l-第3小時 的攝食量，b-3表示第3-第6小時的攝食量。如b-l至b-3所示， 在施與了 5 pmol Wt (正常的NESFATIN)的大鼠中，在各時間段均可 見顯著的攝食抑制活性，而對於在通過激素原轉化酶切割的部位引入變 異的NESFATIN (Mut)則未見攝食抑制效果。由此顯示，為了使 NESFATIN發揮功能，NESFATIN- 1被激素原轉化酶等進行加工的過 程是很重要的。實施例15 連續腦室內施與NEFA基因的反義RNA對攝食和體重的影 響的研究
為了進一步詳細研究NESFATIN (NEFA)基因的表達與攝食和體 重調節的關係，連續地向第三腦室內施與抑制NESFATIN基因表達的反 義RNA,對其影響進行研究。
NESFATIN基因的反義RNA使用夾有翻譯起始位點(translating start site )的序列，即以下序列的乇》水A 乂 RNA 。
NESFATIN反義RNA 5 — ATGGTCCTCCACCTCATCTTCAGAG — 3 ( SEQ ID N0.31 )
NESFATIN反義RNA的施與是通過滲透壓泵連續12天腦室內施 與。動物是選擇約8周齡Wistar系雄性大鼠(購自日本SLC )中體重為 200-250 g範圍的大鼠使用。每1 kg體重大鼠腹腔內施與40 mg戊巴比 妥鈉進行麻醉，頭部去毛之後固定在腦定位固定裝置上(DavidKopf公 司，型號1962)，切開頭皮，留置23G針(導向插管)固定，深度達 第三腦室(前囟點後方2.5mm、表面9.5mm)。在該導向插管固定一 周后供於各實驗。滲透壓泵使用Alzet公司的型號12002，從使用的前 一天開始，浸泡於滅菌生理食鹽水中啟動，將用0.22 pm Millex GV濾 器滅菌的NESFATIN反義RNA溶解於生理食鹽水中，所得溶液為反義 施與組(Antisense施與組)，或者將同樣滅菌的錯義RNA (ATCGTGCTCCACGTCATCTACACAG )溶解於滅菌生理食鹽水中， 所得溶液為對照組，在使用之前將上述溶液注入到滲透壓泵中。注入了 各試樣的滲透壓泵與導管連接，該導管上連接有注入用插管，通過預先 埋入的導向插管，將注入用插管的先端插入大鼠的第三腦室進行固定。 在該狀態下使用，則可以以24小時12 |ul的速度向第三腦室注入試樣， 每天分別注入40 jig反義RNA和錯義RNA。確認埋入了滲透壓泵的大 鼠從麻醉中清醒，再放入單體籠中，在可以自由攝取粉末飼料和飲料水 的條件下進行飼養。攝食量的測定是從埋入了插管和滲透壓泵的第二天 起，測定每天上午9點時殘留的飼料的重量，求出與前一天飼料重量的 差，計算一天(24小時)的攝食量。另外，從開始施與6天後起，在測
定攝食量時測定體重，對其體重變化也進行記錄。
施與開始後第12天，將各組的個體殺死，取出下丘腦，使用提取的試樣，通過Nesfatin - 1Ab的蛋白質印跡法確認NESFATIN的表達。 蛋白質印跡按照與實施例3和12同樣的方法進4亍。由於蛋白質印跡的 顯色而進行了染色的條帶是通過光密度計測定條帶的濃度。

食量變化如圖14:所示，體重變化如圖14B所示。4聶食^ (圖14A): 對照組相比，在反義施與組中，開始後第1天即可見攝食量增加，該攝 食量在測定期間(至施與開始第12天)總是高於對照組。另外，在體 重的變化(圖14B)中，施與開始後第6天的體重在對照組和反義施與 組中未見差異，但在施與第7天以後，反義施與組與對照組相比可見顯 著的體重增加(P<0.05)，該差異在由第9天至第11天的測定期間進一 步擴大。使用第12天殺死的大鼠下丘腦進行的NESFATIN-1的蛋白質 印跡分析中，與對照組(光密度計測定的條帶強度為14.3±1.2 AU)比 較，在反義施與組(光密度計測定的條帶強度為8.5±0.7 AU)中， NESFATIN - 1的表達顯著減少。由該結果可見，腦室內施與NESFATIN 反義RNA，可以抑制NESFATIN-1的表達，發揮使攝食量和體重增加 亢進的效果。
實施例16 通過重組體製備重組NESFATIN - 1
為了更大量製備NESFATIN - 1 ，對於使用重組體製備重組 NESFATIN - 1的方法進行了研究。
獲得編碼小鼠NESFATIN - 1的基因，在其N末端結合GST (穀胱 甘肽-S-轉移酶)和組氨酸標籤的基因，構建表達載體，使翻譯後的 蛋白質中，組氨酸標記的胺基酸序列和小鼠NESFATIN - 1胺基酸序列 之間存在凝血酶切割部位(-Leu - Val - Pro - Arg - Gly - Ser -)。小 鼠NESFATIN - 1基因的獲得是使用小鼠腦cDNA ( Clontech公司)， 進行兩次PCR(嵌套式PCR )。第 一次PCR使用以下的正向引物(mNucB2 -F337: SEQ ID N0.35 )和反向引物(mNucB2 — R712: SEQ ID N0.36 ) 各100 pM的濃度、Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio (林)，R005A)、 所附加的反應緩衝液和dNTP，按照所附說明書進行反應。PCR反應是 在9(TC反應1分鐘之後，將98°C10秒、68°C1分鐘的溫度循環進行30個循環，然後在68。C下反應2分鐘。
正向引物(mNucB2-F337) :5， -GCACGCTGAC CGCTC TGGAAG-3' ( SEQ ID N0.35 )
反向引物(mNucB2-R712) : 5' -CAAATGTGTT AGGAT TCTGGTG GTTCA-3' (SEQ ID N0.36)
使用0Jiul所得PCR產物，第二次的PCR是使用100pM以下的正 向(mNucB2 — N3[SacI - Thr])和反向(mNucB2 — R389[Notl])引物， 與第 一次PCR同樣，使用Pyrobest DNA聚合酶進行PCR反應。PCR反 應是在9(TC反應1分鐘，接著將98。C10秒、6(TC30秒、68。Cl分鐘的 溫度循環進行20個循環，然後在68t:下反應2分鐘。
正向引物 (mNucB2-N3[SacII-Thr]) : 5' -GGTTCCGCGGGTCTG GTTCCGCGTGGTTCTCCTATCGATGTGGACAAGACCAA -3'( SEQ ID NO. 3 7)
反向引物(mNucB2-R589[Not1]) : 5' -GGTTGCGGCCGCTTACCT CT TCAGCTCATCCAGTCTCG-3'( SEQ ID NO. 3 8)
進行了第二次PCR的PCR反應樣品通過用苯酚/氯仿提取來純化， 然後用限制酶SacII和NotI切割，進行瓊脂糖凝膠電泳，切取相當於約 300 bp長度的條帶，通過QIAEX - II試劑盒(QIAGEN公司)進行純化。 純化的約300 bp的PCR產物使用快速DNA連接試劑盒(New Enland Bio Lab公司)連接到用限制酶SacII和NotI切割的pET41a ( + )質粒載體 (Novagen公司)上。進行了連接的載體導入大腸桿菌J409菌株，對所 得的8個轉化體以小規模進行質粒提取，使用7 :/ ， 4卜'A 4才、〉久r 厶乂7>司的BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction i式劑 盒和ABI377型DNA測序儀(Perkin - Elmer公司)，對使用所得的質 粒整合的NESFATIN - 1基因的序列進行鹼基序列分析。結果得到了整 合了具有正確的NESFATIN-1序列的基因的表達載體，將其命名為 pET41a ( + ) GST - His - LVPRGS - mNAPl 。
將所得pET41a ( + ) GST-His-LVPRGS-mNAPl導入大腸桿菌 BL21 (DE3)Codon Plus RIPL,使其表達，從而進行GST '組氨酸標籤-凝 血酶切割序歹'J ' NESFATIN - 1融合蛋白(GST - His - LVPRGS -mNAPl )的表達。將該pET41a ( + ) GST - His - LVPRGS - mNAPl導 入大腸桿菌BL21 ( DE3 ) Codon Plus RIPL中，將用含有卡那黴素的LB 培養基選擇得到的克隆在含有10 ml卡那黴素的LB培養基上、在37°C 下培養。在該培養液在600 nm波長下的吸光度達到0.8時停止培養。將 3 ml該培養液接種於含有100 ml卡那黴素的LB培養基，再在37。C下培 養，在該培養液在600 nm波長下的吸光度達到0.8時加入1 ml 100 mM 的IPTG，誘導蛋白質的表達。添加IPTG後，進一步在37。C下振蕩培養 3小時。將該培養液以8000 rpm離心20分鐘(4°C ),回收大腸桿菌的 菌體。
由所得大腸桿菌的菌體中提取GST - His - LVPRGS - mNAPl融合 蛋白，使用鎳螯合柱(Ni-NTA瓊脂糖)進行純化。將菌體懸浮於含有 20 ml 1 4咅濃度的Complete — EDTA free ( 口少；i> 二 .夕'4 7夕、、乂義r 4 夕只/>司)和0.5倍濃度的BugBuster (爿》夕乂>司Novagen,產品編 號70584)的超聲緩衝液(50mMKH2PO4、 50mMNaCl、 2mMDTT、 pH7.5),在冰水中通過IO分鐘的超聲波進行破碎。超聲波處理後的樣 品以15,000 rpm離心20分鐘，回收該上清。將10ml所得上清過用Lysis 緩衝液(50 mMNaH2P04、 300 mMNaCl、 10mM咪唑，pH 8.0 )平衡 的1 ml Ni - NTA瓊脂糖柱，再用10 ml清洗緩衝液(50 mM NaH2P04、 300 mMNaCl、 20mM咪哇，pH 8.0 )清洗兩次。將清洗後的柱用2.5 ml 的洗脫緩衝液(50mMNaH2PO4、 300 mMNaCl、 250 mM咪唑，pH 8.0 ) 洗脫兩次，回收含有洗脫的GST - His - LVPRGS - mNAP 1融合蛋白的 級分。對由殘餘菌體提取的上清也同樣處理，回收含有GST-His-LVPRGS - mNAPl融合蛋白的級分。
由GST - His - LVPRGS - mNAPl融合蛋白中除去GST和組氨酸標 籤的部分，進一步純化，同時，為了除去發揮炎症性物質作用的來自大 腸桿菌的脂多糖(LPS ) , GST - His - LVPRGS - mNAPl融合蛋白在與 GST樹脂結合的狀態下通過凝血酶處理和反相色譜進行純化。這以後的 處理中的緩衝液均使用確認不含有LPS的緩衝液。將7.2 ml通過Ni-NTA瓊脂糖柱純化得到的含GST - His - LVPRGS - mNAPl融合蛋白的 級分用1倍濃度的GSTBind/清洗緩衝液(> A夕/^司Novagen,產品編 號70571 )清洗，最終添加到用3 ml GST Bind/清洗緩衝液懸浮的GST 樹脂中(>/"夕/>司Novagen,產品編號70541 )(相當於7.2 ml),在2(TC下輕輕攪拌1小時。通過離心回收樹脂，然後將該樹脂用36 ml GSTBind/清洗緩衝液清洗兩次。向清洗後的樹脂中加入3.6 ml將20單 位/ml凝血酶溶解於PBS所得的物質，進行懸浮，在20。C下、在弱的攪 拌狀態下反應20小時。反應後的樹脂以各1.8 ml分注到帶有孔徑0.22 的濾器的杯子(Millipore )中，以3,000卬m離心2分鐘，回收過濾 的、經凝血酶處理後的樣品。向450|11所得的凝血酶處理後的樣品中加 入50iil乙酸，製成C18反相色譜的樣品。反相色譜是在0.1%三氟乙酸 存在下，採用乙腈的梯度洗脫法，該梯度是設定為10%乙腈:10分鐘/10 -20%乙腈梯度:60分鐘/30 - 40%乙腈梯度:40分鐘/40 - 60%乙腈梯度:5 分鐘進行。通過測定波長280 nm的吸光度監測由柱洗脫的蛋白質。對 通過乙腈梯度洗脫的級分，通過SDS - PAGE法和蛋白質印跡法進行研 究，表明NESFATIN-1是在乙腈濃度36.2%處洗脫。因此，回收該級 分進行冷凍乾燥，然後再次溶解於注射用蒸餾水中，通過測定吸光度了 解蛋白質濃度，通過工乂卜'只、一、；一(生化學工業)了解LPS的含量。

由100 ml培養液通過Ni - NTA -瓊脂糖純化的粗純化GST - His -LVPRGS - mNAPl約為7 mg，通過凝血酶處理和C18反相色譜高度純 化的NESFATIN - 1的回收量是472.5昭。另夕卜，高度純化的NESFATIN -1中含有的LPS的量是1 |ig NESFATIN - 1約為4 pg。並且按照與實 施例13同樣的方法，將高度純化的NESFATIN- 1施與大鼠腦室內時， 可見大鼠的攝食抑制和體重增加抑制的效果。由此顯示，通過使用重組 體進行的表達和純化，可以製備具有活性的NESFATIN - 1。
實施例17 對Zucker fa/fa大鼠第三腦室內施與NESFATIN - 1對攝食 量調節的作用的研究
如以往的技術所述，在肥胖和/或肥胖症患者中，可見很多顯示瘦素 抗性的例子，這成為病態或治療的問題。因此，使用瘦素抗性病態動物 模型Zucker fa/fa大鼠(Michael等，Nature Genetics 1996年13巻18 -19頁)研究了 NESFATIN - 1對攝食量調節的效果。
大鼠是採用8周齡的雄性Zucker fa/fa ( Zucker)系大鼠和作為對照 動物的Zucker+/+ (Lean)系大鼠，購自日本f弋一^義'卩乂《一，購入後以上午6點至下午6點的12個小時作為光照期，以下午6點至第 二天早晨6點的12個小時作為暗期，按此周期施與粉末祠料(日本夕 k7公司公司CE-2)，在22。C下飼養，實驗期間也以同樣的條件繼續 祠養。購入的大鼠進行一周以上預備祠養後，由9-IO周齡的個體中選 取200 - 250 g的個體進行實驗。
施與中所使用的試樣是使用將實施例16中製備的重組小鼠 NESFATIN - 1以每5 pi PBS含有5 pmol的形式溶解所得，對照試樣只 使用生理食鹽水(Saline )。製備的試樣是將Zucker大鼠和Lean大鼠各 5隻組成一組(Zucker/NESFATIN - 1組、Lean/NESFATIN - 1組、 Zucker/Saline組、Lean/Saline組)，分別向各大鼠的第三腦室內施與5 pl。施與時期是在進入t聶食行為亢進的暗期之前進^f於。施與方法與實施 例6的方法同樣實施。
施與腦室內之後，通過測定各大鼠在0-第1小時、第l-第3小 時和第3-第6小時期間粉末飼料的減少重量來測定攝食量。顯著差異 檢驗採用方差分析。

向Lean大鼠施與NESFATIN - 1的組(Lean/NESFATIN - 1組)和 施與生理食鹽水的組(Lean/Saline組)的攝食量測定結果如圖15A所示， 向Zucker大鼠施與NESFATIN - 1的組(Zucker/NESFATIN - 1組)和 施與生理食鹽水的組(Zucker/Saline組)的攝食量的測定結果如圖15B 所示。在對照動物的Lean大鼠的結果(圖15A)中，施與後O-第l小 時和第1 -第3小時的攝食量與Saline組比較，在NESFATIN - 1施與 組中可見降低(PO.OOl)。另外，在第3-第6小時的攝食量未見差異。 對於瘦素抗性動物模型Zucker,與Lean同樣，在施與後0 -第1小時、 第1 -第3小時期間與Saline組比較，NESFATIN- 1施與組可見顯著的 攝食量降低(PO.OOl),在第3-第6小時中也可見顯著降低(P0.05) (圖15B)。由此顯示，NESFATIN - 1的抑制攝食的作用不經由痩素的 作用即可發揮功能，這解釋了即使在瘦素抗性的狀態下也具有效果。
實施例18 小鼠腹腔內施與NESFATIN- l對攝食量調節的作用的研究 通過大鼠腦室內施與的實驗顯示了 NESFATIN和NESFATIN - 1與攝食量的調節有關，為了對在除此以外的動物種類的效果進行研究，進 行了施與小鼠的實驗。另外，考慮到作為藥物的實際應用性，末梢施與 也顯示效果這一點是很重要的，因此施與途徑選擇了腹腔施與。並且，
對由於Agouti蛋白質過量表達而導致的MC3R/MC4R攝食抑制功能受 到阻礙的肥胖動物才莫型——Agouti - yellow ( C57BL/6Z - Ay/a )小鼠也 進行了施與實驗。
試驗動物是由日本SLC (抹)購入7周齡的雄性ICR系小鼠，以購 入後上午6點至下午6點的12個小時作為光照期，以下午6點至第二 天早晨6點的12個小時作為暗期，按此周期使其自由攝食顆粒飼料(曰 本夕I^7公司，CE-2)，在22。C下飼養，在實驗期間也按照相同條件 繼續祠養。購入的小鼠進行一周以上預備祠養後，由8-9周齡的個體 中選取體重35 - 40 g的個體用於實驗。
施與中使用的試樣是將實施例16中製備的重組小鼠NESFATIN- 1 以每200 jul生理食鹽水分別含有2 nmol、 10 nmol或50 nmol的量的形 式溶解所得，對照試樣只使用生理食鹽水(Saline)。試樣是用帶有 注射針的結核菌素注射筒對各小鼠(每組5隻)的腹腔內單次施與200
施與的時間是在進入暗期之前(下午6點)。
在肥胖動物模型的實驗中，使用C57BL/6J系小鼠作為對照組，還 使用Agouti - yellow小鼠作為肥胖動物模型，這些動物均購自日本f Y 一/k夂.卩A— (JacksonLab.)。飼養條件、使用小鼠的周齡等與ICR 小鼠同樣，但對象組的小鼠是選擇體重25 - 28 g的個體，Agouti - yellow 小鼠選擇31 - 38 g的個體使用。施與中所使用的試樣可以使用將重組的 小鼠NESFATIN- 1以每200 fil生理食鹽水中含有10 nmol的量的形式 溶解所得，對照試樣只使用生理食鹽水(Saline)(每組16隻)。其它 條件與上述同樣進行。
進行了施與的各小鼠分別裝入單體籠，在施與後的0-第3小時期 間通過測定減少的顆粒飼料的重量來測定攝食量。顯著差異檢驗採用方 差分析。

向IGR小鼠的腹腔內施與NESFATIN- 1或生理食鹽水時，在施與 後0-第3小時的攝食量的測定結果如圖16A所示。圖WA的結果中，以每隻小鼠2 nmol、 10 nmol和50 nmol施與NESFATIN - 1 ，它們與對 照(Saline組)比較，可見攝食量降低，特別是在10 nmol ( p<0.05 )和 50 nmol ( p<0.005 )中，可見統計學顯著的攝食量降低。由此顯示， NESFATIN-1不僅是對大鼠，對小鼠也顯示攝食抑制，因此可知在 很多種中都與攝食的調節作用相關，另外，不僅施與腦內，即使施與腹 腔等末梢也對攝食抑制作用有效。另夕卜，腹腔內施與NESFATIN - 1時， 在施與後早期即可顯示攝食抑制的效果。
在肥胖模型小鼠的實驗中，對對象組小鼠(C57BL/6J)施與生理食 鹽水(Cont)或NESFATIN -1(10 pmol)時的攝食量測定結果如圖16B 所示，對於肥胖模型小鼠的Agouti - yellow小鼠施與生理食鹽水(Cont) 或NESFATIN - 1 ( 10 pmol)時的攝食量測定結果如圖16C所示。結果， 對於對象組小鼠、Agouti-yellow小鼠，腹腔內施與NESFATIN - 1的 小鼠與對照相比攝食量均顯著降低。Agouti - yellow小鼠是由於Agouti 蛋白質的過量表達而導致MC3R/MC4R的配體——黑素皮質素 (melanocortin)的攝食抑制不發揮作用的肥胖模型，因此在小鼠的施與 實驗中顯示，在實施例17的Zucker (fa/fa)大鼠的結果是在顯示瘦素 抗性的模型中也顯示藥理活性，同樣通過與已知的Agouti/黑質素系的攝 食抑制不同的獨立的機理進行攝食調節。
實施例19 小鼠腹腔內施與和皮下施與NESFATIN- l對攝食量調節的 作用的研究
實施例18中表明，小鼠的腹腔內施與NESFATIN- 1也對抑制攝食 作用有效，作為另外的末梢施與的例子，對於皮下施與NESFATIN-1 的效果也進行了研究。
施與中使用的試樣是將實施例16中製備的重組小鼠NESFATIN - 1 以每200 iul生理食鹽水中含有10nmol的量的形式溶解使用，對照試樣 只使用生理食鹽水(Saline)。試樣是用帶有25G注射針的結核菌素注 射筒對各小鼠的腹腔或背部皮下單次施與各200 pi,施與的時間是在進 入暗期之前(下午6點)，其它條件與實施例18同樣進行。

向小鼠腹腔內(ip)或皮下(sc)施與NESFATIN-1 (10 nmol)或生理食鹽水(O)時，施與0-3小時的攝食量測定結果如圖17A所示， 0-14小時的攝食量如圖17B所示。圖17A中，相對於生理食鹽水施與 組(0)，在腹腔內(ip)和皮下(sc)施與10 nmol NESFATIN - 1的 組中可見攝食量有降低傾向，特別是腹腔內施與可見統計學的顯著
(PO.O5)降低。圖nB中也同樣，相對於生理食鹽水施與組(0), 腹腔內(ip)和皮下(sc)施與10 nmol NESFATIN-1的組中，攝食量 可見顯著降低傾向，但在施與腹腔內(ip)的組中，其攝食量的降低未 見顯著差異，在皮下(sc)施與的組中，相對於生理食鹽水施與組可見 顯著降低(PO.005 )。在圖17A和B的結果中，腹腔內施與NESFATIN
-1在早期均可見攝食抑制效果，皮下施與則效果稍稍遲緩，但仍可見 效果。由此顯示，在末梢施與中，不僅是腹腔內施與，即使是皮下施與， NESFATIN - 1對攝食抑制作用也有效。對於在腦中作用的藥物來說， 末梢施與是否可獲得效果，這在實際應用上是很重要的，從這點上來 講，由實施例18和19的結果顯示，NESFATIN - 1具有作為藥物使用 的有用性。
實施例20 小鼠腹腔內施與NESFATIN - 1的部分多肽(NESFATIN -1N23、 NESFATIN-1M30、 NESFATIN - 1C29 )對攝食調節的作用的研
咒
實施例10和12中，由NESFATIN的激素原轉化酶切割部位發明了 NESFATIN-1。但是，在分析NESFATIN-1的功能的基礎上對該多肽 的功能部位進行確定是很重要的，另外，在藥物的應用中，該肽的氨基 酸長度越短則在製備、施與量、抗原性等方面有利。因此，為了對該含 有82個胺基酸長度的NESFATIN- 1的結構中具有攝食抑制活性的部位 進行進一步詳細研究，製備了 NESFATIN-1的部分肽，進行了將其施 與小鼠腹腔內時測定攝食量的實驗。
來自小鼠NESFATIN序列的小鼠NESFATIN - 1的胺基酸序列(SEQ ID N0.14)中，將由氨基末端起的胺基酸編號1-23的序列命名為 NESFATIN - 1N23, 24 - 53的序列命名為NESFATIN - 1M30, 54 - 82 的序列命名為NESFATIN - 1C29。NESFATIN-1N23 : ValProIleAspValAspLysThrLysValHisAsnThrGluP roValGluAsnAlaArglleGluPro ( SEQ ID NO. 4 2)
NESFATIN-1M30 : ProAspThrGlyLeuTyrTyrAspGluTyr"uLysGlnValI leGluValLeuGluThrAspProHisPheArgGluLysLeuGlnLys ( SEQ ID NO. 4 1 )
NESFATIN-1C29 : AlaAspIleGluGluIleArgSerGlyArgLeuSerGlnGluL euAspLeuValSerHisLysValArgThrArgUuAspGluLeu ( SEQ ID NO. 4 3)
NESFATIN — 1N23、 NESFATIN — 1M30、 NESFATIN — 1C29的各多 肽委託抹式會社A]才口^力製備，使用通過HPLC法以95%以上的純 化度製備的合成肽。各多肽分別使用以每200 pl生理食鹽水中含有50 nmol的形式溶解的多肽作為試樣，對照是只將生理食鹽水(Vehicle) 作為試樣使用。試樣是用帶有25G注射針的結核菌素注射筒向各小鼠 (每組5隻)的腹腔內單次施與200 pi,施與的時間是在進入暗期之前 (下午6點)進行。小鼠使用雄性ICR系小鼠(日本SLC ),祠養和實 驗條件與實施例18同樣。
進行了施與的各小鼠分別裝入到單體籠中，通過測定施與後0-3 小時期間減少的顆粒祠料的重量來測定攝食量。顯著差異檢驗採用方差 分析。
也通過對人、大鼠和小鼠NESFATIN - 1胺基酸序列比對進行了比 較。使用人NESFATIN - 1 ( SEQ ID NO. 13 )、小鼠NESFATIN - 1 ( SEQ ID N0.14 )和大鼠NESFATIN - 1 ( SEQ ID N0.15 )的胺基酸序列，通 過CLUSTAL - W法(Higgins等人，Nucleic Acids Research 1994年22 巻4673 - 4680頁)進行比對。

小鼠腹腔內施與生理食鹽水(Vehicle) 、 NESFATIN - 1N2 3 (-N23 ) 、 NESFATIN - 1M30 ( - M30 )和NESFATIN - 1C29 ( - C29 ), 對各組施與後O-第3小時的攝食量的測定結果如圖18A所示。與施與 生理食鹽水的對照組(Vehicle)比較，施與了 NESFATIN - 1M30的組 (N - lb)中可見攝食量顯著降低(P<0.02)。但是，在施與NESFATIN- 1N23的組(N - la)和施與NESFATIN - 1C29的組(N - lc )中未見 攝食量的顯著降低或亢進。由此顯示，NESFATIN - 1M30對於 NESFATIN - 1 (以及NES FATIN)的攝食抑制活性來說是最重要的功 能部位。另外，腹腔內施與NESFATIN-1M30也可見攝食抑制活性， 由此顯示了該多肽應用於藥物的可能性。
另外，人、小鼠和大鼠的NESFATIN- 1胺基酸比對結果和 NESFATIN - 1N23、 NESFATIN - 1M30和NESFATIN - 1C29的部位如 圖18B所示。NESFATIN-1M30的部位顯示胺基酸序列種間保守性高。
實施例21 EIA系的構建和下丘腦組織中NESFATIN - 1肽的才企測
實施例11中，在大鼠下丘腦的細胞中，由NESFATIN-1的抗體 (Nesfatin - 1 IgG)和激素原轉化酶(PCI/3和PC2 )抗體的結果顯示， NESFATIN和激素原轉化酶在同一細胞中表達，可能生成NESFATIN -1。為了對其進一步進行研究，構建檢測NESFATIN或NESFATIN-1 的竟爭EIA系統，並通過反相色譜HPLC將由大鼠下丘腦組織提取的樣 品進行分級，對所得的圖譜和合成製備的NESFATIN-1圖譜進行比 較。
竟爭性EIA系統是使用實施例10中製備的Nesfatin - 1 IgG和進行 了生物素標記的NESFATIN - 1肽製備。將Nesfatin - 1 IgG溶解於10 pg/ml的PBS中，將所得以50 inl/孔分注到96孔的ELISA板(住友f卜MS- 8596F),用板密封物(plate seal)密封，在4。C下靜 置過夜，固定抗體。對於固定有抗體的板用PBS清洗各孔，然後將含有 10%牛血清白蛋白(BSA)的PBS以250 nl/孔分注，在室溫下方文置2小 時。然後將板的各孔用PBS清洗三次，製備抗體固定化板。
為了製備標記的NESFATIN - 1,製備在NESFATIN - 1的C末端附 加有半胱氨酸殘基形式的NESFATIN-1 (NESFATIN-lCys: SEQ ID NO.62)。製備方法與實施例16同樣，用於獲得編碼NESFATIN - lCys 的核酸的PCR通過以下引物組進^f亍。正向引物r 5， -GGTTCCGCGGGTCTGGTTCCGCGTGGT丁CTCCTATCG ATGTGGACAAGACCAA-3，( SEQ ID NO. 6 3)
反向引物..5' - GGTTGCGGCCGCTTAACACCTCTTCAGCTCATCCAG TCTCG-3'( SEQ ID NO. 6 4 )
將與實施例16的方法同樣地進行了表達、純化的NESFATIN- ICys 溶解於含有50 Mm 2 -巰基乙醇胺、1 mM EDTA的0.1 M磷酸緩衝液
(pH6.0),在37。C下處理90分鐘，然後加入三氟乙酸(TFA),使濃 度為0.1%,上Sep-PakC18柱(Waters),將柱用0.1%TFA、 10%乙 腈水溶液10ml清洗，然後用3 ml 0.1%TFA、 60%乙腈水溶液洗脫。洗 脫物冷凍乾燥後溶解於0.1 M磷酸緩衝液(pH 7.0)，使達到5 mg/ml， 向其中加入用1/40容量的二甲基甲醯胺(DMF)溶解的20 mg/ml生物 素(長臂)馬來醯亞胺(VECTOR Lab),在室溫下反應3小時。向進 行了生物素(長臂)馬來醯亞胺反應的NESFATIN - ICys中加入TFA， 使達到0.1%，過安裝了反相C18柱(大力，4 .亍義夕公司，COSMOSIL
(註冊商標)5C18 - AR - 300 20.0 mml.D.x150 mm )的HPLC，在210 nm 波長下檢測吸光度，同時用0.1。/。TFA水溶液、接著用含有0.1%TFA的 20%乙腈水溶液進行清洗，直至洗脫物的吸光度無法確認，然後使20-60%乙腈的梯度水溶液流過，分取210 nm下的吸光度顯示最大峰的級 分。所得級分進行冷凍乾燥，然後溶解於PBS，將其作為標記化 NESFATIN - 1使用。
標記化NESFATIN - 1溶解於含有2% BSA的PBS,使達到1 |ug/ml。 標準曲線的製作是將實施例16中製備的重組NESFATIN- 1用含有2% BSA的PBS稀釋，使濃度為6000 ng/ml，將其以2倍公比、用含有2% BSA 的PBS稀釋(標準試樣6000、 3000、 1500、 750.0、 375.0、 187.5、 93.8 ng/ml)。將各50 製備的標記化NESFATIN-1和標準試樣加入到微 量試管中進行混合，以各50 pl分注到抗體固定化板的孔中。另外，作 為生物試樣的例子，是將由大鼠採集的脊髓液直接或者用含有2% BSA 的PBS稀釋為2倍得到的試樣50 |il，與50 fxl標記化的NESFATIN - 1 溶液在微量試管內混合，將各50 )il分注到抗體固定化板的孔中(作為 檢樣)。分注後的抗體固定化板在室溫下靜置1小時後，棄去孔內的反應試樣，用含有0.2。/。吐溫20的PBS清洗三次。然後將用含有2。/。BSA 和0.2%吐溫20的PBS稀釋為1/1000的抗生物素蛋白-過氧化物酶
(Sigma公司，A7419-2ML)向各孔中分注50iul，在室溫下靜置30分 鍾。反應後除去各孔的溶液，用含有0.2Q/。吐溫20的PBS清洗四次，然 後用TBS (50mMTris-HC1、 0.15MNaCl、 pH8.0)清洗兩次。向清洗 後的抗體固定化板的各孔中加入50 pl過氧化物酶底物的TMB( PIERCE 公司1 - Step (註冊商標)TurboTMB ),在室溫下反應30分鐘。然後 向各孔中加入50 ili1的0.5N硫酸，中止反應，通過吸光板讀數儀測定 450 nm波長的吸收和620 nm波長的吸收，從450 nm波長的吸光度中減 去620 nm波長的吸光度(450 ( A620 ) nm )作為測定值。
下丘腦NESFATIN- 1表達的分析是將由組織提取的肽作為試樣， 通過HPLC進行分級。由8隻大鼠腦中切取下丘腦，使用Teflon (註冊 商標)勻漿器，在4 ml 0.P/。TFA水溶液中進行勻漿，以10,000 rpm離 心IO分鐘，回收該上清。回收的上清用0.45 pm孔徑的濾器(Millipore) 過濾，然後過Set-PakC18柱(Waters公司)，將該柱用5ml0.1%TFA 水溶液清洗。然後用3 ml60。/。乙腈水溶液洗脫該柱，將該洗脫物通過旋 轉蒸發器千燥。將該乾燥物溶解於0.8ml0.iy。TFA水溶液中，以10,000 rpm離心10分鐘，將500 pl該上清注射到安裝有C18反相色譜柱(大 力，' r 7夕公司，COSMOSIL %C18 — AR - II， 4.6 mml.DX250 mm ) 的HPLC裝置中。注射試樣後， 一邊用224 nm的波長對洗脫物監測吸 光度， 一邊以1 ml/分鐘的流速通入O.P/oTFA水溶液，清洗柱。清洗後， 以上述流速直接、或者在0.P/qTFA存在下，用0 - 60%的乙腈濃度梯度
(Al。/。/分鐘)送液，按照每1 ml級分回收洗脫物。將所得級分在-80 。C下冷凍，進行冷凍乾燥，千燥後的樣品溶解於各含有200 |Lil 2%BSA 的PBS中，通過竟爭EIA法測定NESFATIN、 NESFATIN-1。同樣， 將600 (il由8隻大鼠回收的脊髓液千燥，由該試樣製備肽樣品，通過 HPLC進行分級，通過竟爭EIA系統對洗脫的級分進行研究。另外，作 為對照，將80昭實施例16中製備的重組NESFATIN- 1肽溶解於100 |Lil 的0.1%TFA水溶液，注入HPLC, 檢測洗脫出NESFATIN - 1的級分。

通過竟爭EIA系統對標準試樣進行測定，所得標準反應曲線如圖19A- 1所示。反應的NESFATIN - 1的濃度上升，則標記化NESFATIN - 1的結合受到竟爭性抑制，450 ( A620) nm的吸光度減小，顯示由該 系統可以測定試樣中NESFATIN- 1的濃度。該系統的靈敏度相當於4.6 ng/管(93 ng/ml)的NESFATIN-1。通過該竟爭EIA系統測定脊髓液 中的NESFATIN - 1 (NESFATIN)濃度的結果如圖19A - 2所示。脊髓 液直接或者是稀釋為1/2測定(測定後按稀釋率換算)的值顯示大致相 同的值，顯示約存在230 ng/ml的NESFATIN-1 (NESFATIN)。
將由大鼠下丘腦提取的肽樣品通過HPLC進行分級，通過竟爭EIA 測定該級分中的NESFATIN- 1的存在，結果如圖19B的b- 1所示，對 由大鼠的脊髓液提取的肽樣品進行同樣的研究，結果如圖19B的b-2 所示。圖19B的b - 1和圖19B的b-2兩者均可見在第44號至第45號 的級分中被認為是NESFATIN-1的竟爭EIA系統的反應峰。將重組 NESFATIN-1用HPLC在同樣的條件下進行分級時，結果，仍然是第 44號級分中NESFATIN- 1被洗脫，可以認為下丘腦和脊髓液的HPLC 分級中，通過竟爭EIA系統顯示存在的因子是NESFATIN - 1。
實施例22 小鼠腹腔內施與NESFATIN - 1M30部分多肽(NESFATIN -1M16、 NESFATIN-1M14、 NESFATIN - 1M10M )對攝食調節的作 用的研究
實施例20中，從對來自NESFATIN - 1的部分肽的攝食抑制作用的 研究中發明了 NESFATIN-1M30。並且為了進一步詳細研究該含有30 個胺基酸長度的NESFATIN - 1M30的結構中具有攝食抑制活性的部 位，製備了 NESFATIN-1M30的部分肽，在將其施與小鼠腹腔內時進
行了測定攝食量的實驗。
小鼠NESFATIN - 1M30的部分肽，即含有16個胺基酸長度的 NESFATIN - 1M16、含有14個胺基酸長度的NESFATIN - 1M14、含有 10個胺基酸長度的NESFATIN - 1M10M是以下序列委託林式會社,4 才口 、-力製備，是用HPLC法以95%以上的純化度製備的合成肽。NESFATIN-皿6 : N-ProAspThrGlyLeuTyrTyrAspGluTyrUuLysGlnVa
llleGlu-C ( SEQIDNO. 7 1 )
NESFATIN-1M14 : N-ValUuGluThrAspProHisPheArgGluLysLeuGl由
s-C ( SEQIDNO. 7 2 )
NESFATIN-1M10M : N-LysGlnValIleGluValLeuGluThrAsp-C (SEQIDNO. 7 3 )
將製備的各肽溶解於生理食鹽水中，使每100 fil溶解有10 pmol, 將其作為施與用的試樣，對照(Cont)只使用生理食鹽水。作為對照的 生理食鹽水和製備的肽試樣是每隻小鼠分別腹腔內施與100 pl(各組 n=6)。小鼠使用雄性IGR系小鼠(日本SLC),伺養和實驗條件與實 施例18同樣進行。
將進行了施與的各小鼠分別裝到單體籠中，通過測定施與後0-3 小時期間減少的顆粒飼料重量來測定攝食量。顯著差異檢驗採用方差分 析。

向小鼠腹腔內施與NESFATIN- 1M30的部分肽，即NESFATIN-1M16 (M16) 、 NESFATIN-1M10M (M10M)或NESFATIN - 1M14 (M14)時，在施與後O-3小時的攝食量如圖20所示。與只施與生理 食鹽水的對照組(Cont)比較，在施與NESFATIN-1M16 ( M16 )、 NESFATIN-1M10M (M10M)或NESFATIN-M14 ( M14 )的組中， 均見到顯著的攝食抑制效果。
實施例23 人NESFATIN - 1M30和小鼠NUCB1 - M30對4聶食調節的 作用的研究
實施例20中，顯示了小鼠的NESFATIN - 1M30具有抑制攝食的作 用。由此製備人的NESFATIN - 1M30,對施與小鼠時對攝食行為的作用 進行研究。另夕卜，Nucleobindin - 1 (NUCB1 )是形成與NEFA/NESFATIN 在肽的胺基酸序列和在基因的鹼基序列方面同源性高的家族的因子。因 此，製備NUCB1的相當於NESFATIN - 1M30的部位，即NUCB1 -M30,施與小鼠，研究其對攝食的作用。
人的NESFATIN - 1M30 ( SEQ ID N0.39 )和小鼠NUCB1 - 1M30 委託,《4才口-力(抹)通過化學合成方法合成，獲得了純化為95%以 上的純化品。
人NESFATIN-1M30 : N-ProAspThrGlyLeuTyrTyrAspGluTyrLeuLysGlnValIleAspValLeuGlu
ThrAspLysHisPheArgGluLysLeuGlnLys-C ( SEQ ID NO. 3 9) 小鼠露B1-M30 :
N-ProAspThrGlyLeuTyrTyrHisArgTyrLeuGlnGluValIleAsnValLeuGluT hrAspGlyHisPheArgGluLysLeuGlnAla-C ( SEQ ID NO. 1 0 3)
將製備的人NESFATIN - 1M30和小鼠NUCB1 - M30以10 pmol含 在lOOpl中的形式溶解於生理食鹽水中，作為施與試樣。可見攝食抑制 活性的小鼠NESFATIN - 1M30使用實施例20中製備的，以與 NESFATIN - 1M30和NUCB1 - M30同樣的量使用，以此作為比較試 樣，作為對照(Vehicle),只使用生理食鹽水作為試樣。
每隻小鼠腹腔內分別施與100 pi (每組11=6)作為對照的生理食鹽 水和製備的肽試樣。小鼠使用雄性ICR系小鼠(日本SLC)，祠養和實 驗條件與實施例18同樣。
進行了施與的各小鼠分別裝到單體籠中，通過測定施與後0-3小 時期間減少的顆粒祠料的重量來測定攝食量，顯著差異檢驗採用方差分 析。
進行人、大鼠、小鼠的NESFATIN與人、大鼠、小鼠的NUCBl的 胺基酸序列的比對。方法是使用SEQ ID N0.2、 SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.8的各人、大鼠、小鼠的NESFATIN胺基酸序列，以及SEQ ID N0.84、 SEQIDN0.88和SEQIDN0.92的各人、大鼠、小鼠的NUCBl 的胺基酸序列，通過ClustalW法進行分析。

施與人NESFATIN - 1M30 (人/NESFATIN - 1M30 )、小鼠NESFATIN - 1M30 (小鼠/NESFATIN - 1M30 )或小鼠NUCB 1 - M30 (小 鼠NUCB1)時，施與後0-3小時攝食量的測定結果如圖21A所示。圖 21A中，與只施與生理食鹽水的對照組(Vehicle)比較，在施與了人 NESFATIN - 1M30 (人/NESFATIN - 1M30 )、小鼠NESFATIN - 1M30 (小鼠/NESFATIN — 1M30 )或小鼠NUCB1 - M30 (小鼠NUCB1 )的組 中，均可見顯著的攝食抑制效果。
人、大鼠、小鼠NESFATIN和人、大鼠、小鼠NUCB1的胺基酸序 列比對結果，以及相當於NESFATIN - 1的部位和相當於NESFATIN -1M30的部位如圖21B-21C所示。各個種的NESFATIN和NUCB2的相 當於NESFATIN - 1的部位、特別是相當於NESFATIN - 1M30的部位 中，均顯示胺基酸序列的保守性高。
實施例24 大鼠下丘腦的NESFATIN基因表達部位的研究
實施例8中，通過原位雜交法對下丘腦的NESFATIN mRNA的表達 進行了分析，為了進一步詳細分析NESFATIN基因表達部位，通過使用 放射性同位素探針的原位雜交法進行了研究。
使用在可自由攝食狀態下飼養的8周齡雄性正常Wistar系大鼠(購 自日本SLC)(體重220-250 g),在光照期對大鼠用戊巴比妥進行深 度麻醉，由心臟回流溶解於水冷卻的O.IM硼酸緩衝液(pH9.5)的4% 多聚甲醛，固定腦。從大鼠中取出腦，在含有10%蔗糖和4%多聚曱醛 的0.1 M硼酸緩衝液(pH 9.5)中浸泡兩天。固定的腦用千冰-丙酮冷 凍，用冷凍切片機製備20 pm厚度的切片，放在載玻片上(松浪玻璃制 MAS塗層載玻片S-9116)。
放射性同位素標記探針的製備如下將實施例2中使用的製備 NEFA探針用的質粒用限制酶NcoI切割並純化，使用O.liug該質粒，在 19 jil含有36 mM Tris鹽酸緩衝液(pH 7.5 ) 、 6 mM氯化鎂、2 mM亞 精胺、8 mM二硫蘇糖醇、25 mM腺苷三磷酸/鳥苷三磷酸/胞嘧啶三磷 酸、5 mM尿嘧p定三石粦酸和5 mM [a - 35S]-尿嘧^定三石粦酸、以及1 U RNAsin Ribonuclease Inhibitor (Promega公司N2111)的溶液的條件下 加入20 U ( 1 fil) SP6 RNA聚合酶(7° 口 >方、公司，P1085 ),在37°C 下反應60分鐘，製備35S標記化NEFAcRNA探針。反應後，加入20 TNE緩衝液(lOmMTris-Cl， pH8.0、 0.5MNaCl、和0.25mMEDTA、pH8.0),終止反應，使用NENSORB1M PREP Nucleic Acid Purification Cartridges ( PerkinElmer, Inc. NLP028001 EA),按照所附說明書進行探 針的純化。
製備的切片標本的載玻片在進行雜交之前在真空下乾燥過夜，然後 用含有10|ug/ml蛋白酶K (Sigma公司，P2308 )的PBS在37。C下處理 30分鐘，然後用PBS清洗兩次，再用含有0.25。/o乙酸肝的0.1M三乙胺 -鹽酸緩衝液(pH8.0)在室溫下浸泡IO分鐘，進行處理，然後用2倍 濃度的SSC清洗兩次。清洗後的切片標本按照75%乙醇、95%乙醇、99% 乙醇的順序依次進行脫水，然後風乾，再在真空下乾燥。
千燥的切片標本的載玻片上鋪原位雜交液(10 mM Tris鹽酸緩衝液 pH8.0、 30mMNaCl、 10%硫酸葡聚糖、1倍濃度Denhardt，s液，12 mM EDTA、 50%去離子化曱醯胺、0.5 mg/ml酵母tRNA),使其覆蓋腦組 織切片，在65。C下進行1小時的預雜交。除去預雜交液，然後在載玻片 上鋪含有80 pi 106 cpm/ml的35S標記化NEFA cRNA探針和10 mM 二 硫蘇糖醇的雜交液，蓋上蓋玻片，放入溼潤箱中，在6^C下雜交過夜。 雜交後的載玻片用4倍濃度的SSC清洗四次，然後用含有20 ^g/ml RNAaseA的TNE緩衝液(10 mM Tris - Cl pH 8.0、0.5 M NaCl和0.25 mM EDTA pH 8.0)在37。C下處理30分鐘，在室溫下用2倍濃度的SSC清 洗兩次，再在65。C下用0.1倍濃度的SSC清洗30分鐘，共清洗兩次。 洗滌後的載玻片依次用75%乙醇、95%乙醇、99%乙醇進行脫水，然後
浸泡在用水稀釋為2倍的感光乳液(Kodak公司，、NTB3 )中i光i周， 感光後，水洗載玻片，通過硫堇進行染色，通過顯微鏡觀察感光產生的 黑色斑點。
大鼠腦中各部位置的鑑定是按照Paxinos G和Watoson C著的The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates ( Academic Press出版)(美國)1986
年進行。

圖22A中表示含有室旁核(PVN)和視上核(SON)的組織切片、 圖22B表示包含未定帶區(Zi)和弓狀核(Arc)的組織切片、圖 表示包含丘腦外側區(LHA)的組織切片的原位雜交圖像。在PVN、SON、 Zi、 Arc、 LHA各區域內均可見通過放射性同位素標記NEFA cRNA 探針雜交而感光的斑點，可見NEFA基因的表達。
實施例25 大鼠腦室內施與NESFATIN對攝食行為的作用的研究
實施例6中，研究了施與大鼠NESFATIN後0 - 1小時/1 - 3小時/3 -6小時的攝食量，又進一步研究了施與後6- 12小時對攝食行為的作用。
實驗中，為了顯示實施例6的再現性，與實施例6同樣，在第三腦 室內施與重組NESFATIN各0 (只含PBS) 、 1、 4、 20 pmol時，測定 了施與後0-第1小時期間的攝食量。按照與實施例6同樣的方法，在 大鼠腦室內施與5 pmol NESFATIN後，測定0 - 1小時/1 - 3小時/3 - 6 小時和6-12小時的攝食量。對照組採用只施與生理食鹽水(Opmol) 的組。顯著差異檢驗使用方差分析。

如圖23A所示，腦室內施與4 pmol或20 pmol NESFATIN時，與對 照組(0 pmol)相比，0-1小時的攝食量可見顯著的攝食量降低 (p<0.01)。另外如圖23B所示，腦室內施與5 pmol NESFATIN的個體 與對照組(Opmol)比較，在0 - 1小時(p<0.01 ) 、 1 - 3小時(p<0.05 )、 3-6小時(p<0.001)可見顯著的攝食量降低。但是，對於6-12小時 期間攝食量，施與5 pmol NESFATIN的組與對照組相比未見差異。
實施例26 對々幾餓狀態下大鼠下丘腦部位的NESFATIN mRNA與 NESFATIN - 1肽表達量的研究
為了研究飢餓狀態下NESFATIN基因的表達，對自由攝食和絕食的 大鼠腦下丘腦區域進行原位雜交，由該組織中測定弓狀核、室旁核、外 側區、視上核的NESFATIN的mRNA量的增減。同樣，為了測定絕食 下室旁核NESFATIN- 1肽的表達量，切取自由攝食和絕食的大鼠下丘 腦區域，通過竟爭EIA系統對提取的肽進行定量。
與實施例8同樣，大鼠使用可以自由攝食粉末飼料的個體(對照 組)、48小時不施與飼料只用飲料水進行伺養的個體(絕食組)。下丘 腦各部位的NESFATIN的mRNA表達量的定量如下進行按照與實施例24同樣的方法製備組織切片，進行原位雜交，在X射線膠片上感光，
將所得圖像通過圖像分析儀(Imaging Research Inc. MCIDTMElite )測定 (Imaki等，Brain Researh)(荷蘭)1993年623巻223 - 228頁)。 測定弓狀核、室旁核、外側區、視上核部位的感光圖像的濃度，將該值 按照由白到黑的256色階的灰度，以比色數值的形式數值化，通過以下 算式，數值化為比色濃度(Relative Optical Densities,相對光學密度)， 作為mRNA表達的相對值。
相對光學密度二log 10 (256/比色數值)
弓狀核、室旁核、外側區、視上核各部位的鑑定按照Paxinos G和 Watoson C著的The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates ( Academic Press 出版)(美國)1986年進行。
大鼠腦室旁核中的NESFATIN-1肽的定量如下進行。與上述同 樣，將自由攝食和絕食的大鼠斷頭殺死，立即將腦用幹水-乙醇冷凍， 用冷凍切片機製備60pm厚的切片。將組織進行尼氏染色，在實體顯微 鏡下切取相當於腦兩側的室旁核的部分並回收。回收的組織在1.5 ml的 微管中、在100 pi 0.1 N鹽酸中，用Microtube pestle( Scientific Specialties 公司，1005 - 39)進行勻漿。勻漿的溶液用微離心機以15,000 rpm離心 20分鐘，回收該上清，冷凍乾燥，除去溶劑。冷凍乾燥的樣品溶解於 100 pi PBS，通過實施例21記載的竟爭EIA測定法、在50 pl/孔的條件 下對NESFATIN - 1肽進行定量。

圖24A是通過原位雜交法的圖像分析對自由攝食組(對照組)和絕 食組大鼠下丘腦區域的弓狀核(Arc)、室旁核(PVN)、外側區(LHA) 和視上核(SON)各部位NESFATIN mRNA表達進行定量的結果。弓 狀核、外側區、視上核中，相對於自由攝食組(對照組)的NESFATIN mRNA的表達值(比色濃度)，絕食組的NESFATIN mRNA的表達值 未見差異。與此相對，在室旁核中，絕食組的NESFATIN mRNA的表 達值與自由攝食組(對照組)相比顯著降低。
圖24 B是表示通過竟爭EIA法的圖像分析對自由攝食組(對照組) 和絕食組大鼠下丘腦區域的室旁核的NESFATIN- 1肽表達進行定量的 結果。相對於自由攝食組(對照組)，絕食組室旁核的NESFATIN-1肽的表達顯著降低。
以上結果顯示，由於絕食，對於攝食調節很重要的下丘腦的室旁核
中NESFATIN (NEFA)基因和NESFATIN - 1的表達顯著降低。
實施例27 大鼠腦室內施與NESFATIN- 1對攝食行為的影響的研究
實施例12中，施與NESFATIN部分肽的實驗中顯示只有NESFATIN -1的部分具有攝食抑制活性。為了進一步驗證該實驗，對施與後不同 時間內的攝食抑制活性進行了研究。
實驗條件與實施例12同樣，在暗期開始之前向大鼠第三腦室內施 與5 pmol NESFATIN - 1,測定施與後的1個小時(0 -第1小時)、施 與1個小時後的2個小時(第1-第3小時)、施與3個小時後的3個 小時(第3-第6小時)和施與6個小時後的6個小時(第6-第12小 時)期間的飼料減少量(攝食量)作為攝食量。對照組是測定只施與生 理食鹽水的個體的攝食量。

圖25表示向大鼠第三腦室內施與5 pmol NESFATIN - 1時，在0-第1小時、第1 -第3小時、第3-第6小時和第6-第12小時期間的 攝食量。相對於對照組，在施與NESFATIN-1的組中，可見在O-第1 小時、第1-第3小時和第3-第6小時攝食量顯著降低(p0.01)。與 此相對，在第6-第12小時中，與對照組相比較，在施與NESFATIN-1的組中可見攝食量的增加(p<0.01)。由以上結果顯示，腦室內施與 NESFATIN - 1時，對4聶食的抑制是暫時性的，隨著時間的延長 NESFATIN - 1的藥理效果消失，可見由此導致的攝食恢復。
實施例28 大鼠腦室內施與抗NESFATIN- 1抗體對攝食亢進作用的特 異性研究
實施例14中，在向大鼠腦室內施與NESFATIN - 1的抗體時，可見 攝食亢進作用。為了驗證該作用是通過抑制NESFATIN - 1的作用而產 生的效果，在腦室內施與NESFATIN - 1時，同時施與抗NESFATIN - 1 抗體，研究由此是否阻礙攝食抑制。
實驗條件與實施例12同樣進行，在向進入暗期之前的大鼠第三腦室內只施與5 pmol NESFATIN - 1的組、施與5 pmol NESFATIN - 1和8 lug抗NESFATIN - 1抗體(Nesfatin- 1 IgG)的組中，測定施與後1小 時的攝食量，與對照組(只施與生理食鹽水)進行比較。也對單獨施與 (1 pg)已知腦室施與具有攝食抑制活性的瘦素(大鼠瘦素R&D Systems公司，598 -LP-01M)或施與瘦素和抗NESFATIN - 1抗體的 組對攝食的作用進行了研究。

圖26是表示對大鼠腦室內只施與NESFATIN - 1的組(NESFATIN -l IgG/NESFATIN - l/瘦素-/+/ -)、施與NESFATIN - 1和抗
NESFATIN - 1抗體的組(NESFATIN - 1 IgG/NESFATIN - 1/瘦素+/+/ -)、施與瘦素的組(NESFATIN - 1 IgG/NESFATIN - 1/痩素-/-/+)、
施與瘦素和抗NESFATIN - 1抗體的組(NESFATIN - 1 IgG/NESFATIN -1/瘦素+/-/+),在施與後1小時的攝食量的圖。與對照組(NESFATIN - 1 IgG/NESFATIN - 1/瘦素-/ - / -)相比，在只施與NESFATIN的
組中，攝食量顯著減少(p<0.01)，而在施與NESFATIN-1和抗
NESFATIN-1抗體的組中，攝食量可見與對照組同程度的亢進。與此
相對，在施與瘦素的組中，攝食量減少，但是在施與瘦素和抗NESFATIN -l抗體的組中，未見瘦素的使攝食量抑制亢進的效果。由該結果可以
認為，抗NESFATIN-1抗體的攝食亢進作用是由於特異性地抑制了
NESFATIN - 1的效果。
實施例29 抗NESFATIN - 1抗體的結合特異性研究
實施例28中，對於在腦內施與抗NESFATIN - 1抗體，特異性抑制 NESFATIN-1的作用進行了研究，並且通過使用大鼠腦提取物的蛋白 質印跡法，對於與目前已知的具有攝食調節作用的因子的結合性進行了 研咒。
蛋白質印跡分析是在實施例3所示的方法中，通過將一次抗體由抗 NAP多克隆抗體置換為抗NESFATIN- 1抗體的方法進行。研究抗 NESFATIN-1抗體的結合特異性的實驗是在蛋白質印跡法中，在與膜 反應之前，將抗NESFATIN - 1抗體與NAP1 - Ab肽(實施例10 )、以 及已知具有攝食調節作用的瘦素(大鼠瘦素R&DSystem公司，598 -LP-01M) .aMSH(促黑激素抹式會社肽研究所4057 - v) .CART (大鼠古柯鹼-苯丙胺調節轉錄物(Rat Coaine - and Amphetamine -
Regulated Transcript ) 55 - 102:林式會社肽研究所，4351 -s) ' NPY (人、大鼠神經肽Y:抹式會社肽研究所，4158-v) .MCH(人黑素 -濃縮激素抹式會社肽研究所，4369 -v).開胃素A(人、大鼠、
小鼠、牛開胃素A:抹式會社肽研究所，4346 -s)的各種肽按照每1叱
抗NESFATIN- 1抗體添加5 pg,在室溫下反應1小時，然後按照上述
方法進行蛋白質印跡，觀察條帶是否消失。

圖27 A表示使用由大鼠腦提取的蛋白質提取液，通過抗NESFATIN -1抗體進行蛋白質印跡的圖像。結果，在相當於分子量47.5 kd的 NESFATIN多肽的分子量處可見條帶。圖27B是表示抗NESFATIN - 1 抗體與各種肽預先反應，然後與上述同樣地進行蛋白質印跡時在47.5 kd 附近的條帶圖像。使抗NESFATIN - 1抗體與NAP1 - Ab反應時，47.5kd 的條帶消失，這顯示NESFATIN - 1抗體由於先與NAP1 - Ab肽反應， 與NESFATIN的結合部位被封閉。與此相對，與瘦素、aMSH、 CART、 NPY、 MCH、開胃素A反應時，以及不使肽與抗NESFATIN-1抗體反 應時，47.5kd的條帶均不消失。該結果顯示，抗NESFATIN-1抗體與 NESFATIN特異性結合，但不與瘦素、aMSH、 CART、 NPY、 MCH、 Orexin - A等其它攝食相關的肽反應。
實施例30 大鼠延髓中NESFATIN表達部位的研究
實施例4中，通過免疫組織化學分析，對大鼠下丘腦附近的表達進 行了研究，為了進一步研究大鼠延髓附近NESFATIN的表達，同樣實施 免疫組織化學分析。
使用8周齡的Wistar系大鼠(購自日本SLC )，由與實施例4同樣
製備的標本中製備含有延髓的部分的腦組織切片。免疫組織化學染色的 方法也與實施例4同樣進行。並且向NAP肽的抗體(1 pg/ml)中添加 NAP肽(實施例3 ),使達到100 pg/ml，在室溫下反應1小時，然後使 用該抗體實施免疫組織化學染色的實驗。<結果〉
圖28A表示含有延髓的腦組織的免疫組織化學染色圖像。含有延髓 的組織的免疫組織染色中，在STN:孤束核中可見染色，可見NEFA多 肽的表達。圖28B是表示將NAP肽的抗體預先與NAP肽反應，然後進 行免疫組織染色的圖像。將抗NAP肽抗體預先與NAP肽反應，則在圖 28A中見到的染色消失，由此顯示該免疫組織染色中，NEFA多肽被 特異性染色。由該結果顯示，被稱為內臟感覺神經核、與攝食調節機理 相關的孤束核也表達NESFATIN。
實施例31 向正常和痩素抗性肥胖大鼠施與曲格列酮對血液中瘦素以 及腦內NESFATIN表達的影響
實施例2中，對於作為糖尿病治療劑使用的PPARY激動劑曲格列酮 對培養細胞中的NESFATIN (NEFA)基因的誘導進行了研究。為了進 一步研究曲格列酮對NESFATIN表達的誘導，向大鼠施與曲格列酮，對 腦內NESFATIN的誘導進行研究。還同樣研究了已知為攝食調節因子的 瘦素的血液濃度。研究是使用正常Zucker大鼠(Zucker+/+: Lean)和 痩素抗性肥胖動物模型Zucker fa/fa進行。
動物使用8周齡的雄性Zucker fa/fa (Zucker)系大鼠和作為對照動 物的Zucker+/+ (Lean)系大鼠，購自日本f y—乂k乂 ' ！J 乂《一，購入 後以上午6點至下午6點的12個小時作為光照期，下午6點至第二天 早晨6點的12個小時作為暗期，按照該周期施與粉末飼料(日本夕k 7公司CE-2)，在22。C下祠養。購入的大鼠進行一周以上的預伺養之 後，從9-IO周齡的個體中選擇體重為200-250 g的個體，每組6隻用 於實驗。曲格列酮(TGZ:三共抹式會社)的施與是以0.2%的含量混合 在粉末飼料中，使其自由攝食。作為未施與曲格列酮的對照，使用只通 過通常的粉末祠料進行飼養的大鼠。用含有曲格列酮的飼料或通常的祠 料連續10天進行伺養，測定動物體重，然後殺死，採集全血。由採集 的大鼠血液中分離血清，使用市售的ELISA試劑盒(抹式會社矢內原研 究所，YK050 ),按照所附說明書測定瘦素濃度。再從殺死的大鼠取出 腦，按照與實施例3同樣的方法進行蛋白質印跡，通過圖像分析儀 (Imaging Research Inc. MCIDTMBasic )分析該條帶的濃度，將該條帶的 顯色程度以相對值(Units)表示。
圖29A是表示使正常大鼠(Lean)和Zucker fa/fa大鼠(Zucker) 攝食含有曲格列酮的飼料的組(TGZ: +)和攝食不含曲格列酮的飼料 的組(TGZ:-)的體重的圖。正常大鼠或Zucker fa/fa大鼠中，未見施 與曲格列酮導致的體重的顯著差異。另外，與施與曲格列酮與否無關， Zucker fa/fa大鼠相對於正常大鼠，體重均顯著增加(p<0.01)。
圖29B是表示使正常大鼠(Lean)和Zucker fa/fa大鼠(Zucker) 攝食含有曲格列酮的飼料的組(TGZ: +)和攝食不含曲格列酮的祠料 的組(TGZ:-)的血液中瘦素濃度的圖。正常大鼠或Zucker fa/fa大鼠 中，由於施與曲格列酮，血液中瘦素濃度均顯著(p<0.05)降低。另夕卜， 與施與曲格列酮與否無關，Zucker fa/fa大鼠相對於正常大鼠，血液中瘦 素濃度顯著高(p<0.01)。
圖29C是由使正常大鼠(Lean)和Zucker fa/fa大鼠(Zucker)攝 食含有曲格列酮的祠料的組(TGZ: +)和攝食不含曲格列酮的祠料的 組(TGZ:-)製備腦的蛋白質提取樣品，將通過蛋白質印跡得到的條 帶的濃度以相對值表示的圖。對於正常大鼠，在使其攝食含有曲格列酮 的飼料的組(TGZ: +)和攝取不含曲格列酮的祠料的組(TGZ:-)之 間，在腦中表達的NESFATIN的表達量未見差異。與此相對，在Zucker fa/fa大鼠中，通過施與曲格列酮，腦內NESFATIN表達量顯著增加 (p<0.01)。另外，與施與曲格列酮與否無關，Zucker fa/fa大鼠相對於 正常大鼠，腦內的NESFATIN表達量高(p<0.01)。
由以上結果可以認為，作為糖尿病治療劑使用的曲格列酮在正常動 物體內不誘導腦內的NESFATIN,但在顯示瘦素抗性病態的動物模型中 可誘導腦內NESFATIN的表達。與此相對，通過施與曲格列酮在正常動 物、病態動物中瘦素的血液濃度均未升高，相反血液濃度下降。
實施例32 下丘腦組織提取物的HPLC級分中NESFATIN - 1肽的檢測 實施例21中，以由下丘腦組織提取的肽作為試樣，進行HPLC的 分級，再使用該級分，通過竟爭EIA測定系統檢測NESFATIN - 1的存 在。為了進一步研究在該級分中檢測出的肽是相當於NESFATIN - 1的 分子，通過蛋白質印跡法分析下丘腦組織提取物的HPLC級分。下丘腦組織提取物的HPLC級分的製備與實施例21同樣進行，將 其級分編號(級分#) 43 -47的級分進行冷凍乾燥。冷凍千燥後的樣品 溶解於100 fil PBS，使用其中的20 pl進行12%聚丙烯醯胺凝膠的SDS -PAGE,按照與實施例3同樣的方法，使用抗NESFATIN - 1抗體進行 蛋白質印跡。

圖30A表示大鼠下丘腦的肽提取物通過HPLC進行分級得到的級分 編號45的蛋白質印跡圖像。在蛋白質印跡中檢測出的條帶是約9.7 kd 分子量，其與通過重組製備的NESFATIN - 1肽的分子量幾乎一致(實 施例10、圖9C)。圖30B是大鼠下丘腦的肽提取物通過HPLC分級得 到的級分編號43 -47的蛋白質印跡圖像中9.7 kd附近的分子量部分的 圖像。9.7 kd的條帶在級分編號45中最強，該結果與實施例21中通過
定量時的圖譜(圖19B的b-l) L致。 "、 、-
由以上結果顯示，大鼠下丘腦存在相當於NESFATIN-1的分子， 通過實施例21的方法進行分級，通過竟爭EIA法和/或蛋白質印跡法進 行檢測，可以檢測出相當於NESFATIN - 1的分子。
實施例33 大鼠下丘腦區域免疫組織化學染色的特異性研究
在實施例4中，為了分析與攝食調節相關的大鼠下丘腦中的NEFA 表達部位，使用大鼠腦切片實施了免疫組織化學分析。為了研究該染色 是否為NESFATIN特異性染色，考慮^^知具有攝食調節作用的肽與抗體 的結合性，再次進行了免疫組織化學分析。
按照與實施例4同樣的方法，用分別含有大鼠腦弓狀核和室旁核的 組織切片進行免疫組織染色， 一次抗體使用抗NESFATIN- 1抗體 (NESFATIN - 1 IgG:實施例10)代替抗NAP多克隆抗體。在一次 抗體與組織標本反應之前，將抗NESFATIN-1抗體與NESFATIN-1 肽(實施例10)、以及已知具有攝食調節作用的瘦素(大鼠瘦素R&D Systems公司，598 - LP - 01M) . aMSH (促黑激素抹式會社肽研究 所4057-v) . CART (大鼠古柯鹼-苯丙胺調節轉錄物55 - 102:抹式 會社肽研究所，4351 -s) .NPY(人、大鼠神經肽Y:林式會社肽研究所，4158-v)的各種肽按照每l fig抗NESFATIN-1抗體添加5貼， 在室溫下反應l小時，然後用於免疫組織化學染色，驗證抗體反應的特 異性。

1抗體進行免疫組織化學染色的結果，以及將一次抗體預先與各種肽反 應，然後進行免疫組織化學染色的結果。圖31A的a-1顯示大鼠腦弓 狀核被抗NESFATIN - 1抗體免疫染色，a - 2表示抗NESFATIN - 1抗 體預先與NESFATIN- 1肽反應時其染色消失，因此顯示抗NESFATIN -1抗體檢測出在弓狀核中表達的NESFATIN。與此相對，抗NESFATIN -1抗體在瘦素(圖31A的a - 3 ) 、 aMSH (圖31A的a - 4 ) 、 CART (圖31A的a-5) 、 NPY (圖31 A的a-6)中，弓狀核的免疫染色均 不消失，顯示這些肽不與抗NESFATIN-1抗體結合，在免疫組織化學 染色中顯示了該抗體不與這些肽反應。
圖31B表示在含有大鼠腦室旁核的組織切片中通過抗NESFATIN-1抗體進行免疫組織化學染色的結果，和將一次抗體預先與各種肽反應 後進行免疫組織化學染色的結果。圖31B的b - 1表示大鼠腦弓狀核被 抗NESFATIN - 1抗體免疫染色，b - 2中，在抗NESFATIN - 1抗體預 先與NESFATIN-1肽反應時其染色消失，由此顯示，抗NESFATIN-1 抗體檢測出在室旁核中表達的NESFATIN。與此相對，將抗NESFATIN -1抗體分別在瘦素(圖31B的b-3)、 aMSH(圖31B的b - 4 ) 、 CART (圖31B的b-5) 、 NPY (圖31B的b-6)中，則弓狀核的免疫染色 均不消失，顯示這些肽不與抗NESFATIN - 1抗體結合，這些肽在免疫 組織化學染色中顯示不與該抗體反應。
由以上結果顯示，在使用抗NESFATIN - 1抗體的免疫組織化學染 色中，可特異性檢測出NESFATIN的表達，在大鼠腦內、至少在下丘腦 區域的弓狀核和室旁核表達NESFATIN。
實施例34 向大鼠腦室內連續施與NESFATIN - 1對脂肪組織重量的作 用的研究
為了研究NESFATIN - 1對脂肪組織量的影響，向大鼠腦室內持續施與NESFATIN-1,分析脂肪組織等的重量變化。
將NESFATIN-1 (每天5 pmol)或只將生理食鹽水(對照組)用 滲透壓泵向大鼠的第三腦室內連續施與IO天(每組使用5隻和4隻大 鼠)。通過滲透壓泵向大鼠腦室內的施與按照與實施例13同樣的方法 進行。
施與NESFATIN-1或只施與生理食鹽水IO天后，殺死各大鼠，解 剖，將腹部皮下脂肪組織、附睪脂肪組織、腸繫膜脂肪組織、腹膜後脂 肪組織(以上為白色脂肪組織)、肩胛骨間的褐色脂肪組織全部切取， 測定重量。還採集兩側後腿腓腸肌組織，測定重量。由測定的組織重量 求出與各個體體重的比(組織重量/體重mg/g)。顯著差異檢驗採用方 差分析。

圖32表示由施與10天NESFATIN - 1或只施與生理食鹽水的大鼠 獲得的各脂肪組織(A-E)和腓腸肌(F)的重量與體重的重量比的結 果圖。腹部皮下脂肪組織(圖32A)、附睪脂肪組織(圖32B)、腸系 膜脂肪組織(圖32C)中，與只施與生理食鹽水的對照組相比，施與了 NESFATIN-1的組中可見單位體重的組織重量比顯著降低。腹膜後脂 肪組織(圖32D)與對照組比較，NESFATIN-1施與組的單位體重的 組織重量比有降低傾向，但未見顯著差異。在褐色脂肪組織(圖32E) 和腓腸肌(圖32F)中，對照組與NESFATIN - 1施與組之間未見單位 體重的組織重量比的顯著差異。
由以上結果顯示，NESFATIN-1具有使白色脂肪組織的單位體重 的組織重量比、即體脂肪率降低的效果。另外，對於褐色脂肪組織或肌 肉組織，對單位體重的組織重量比沒有影響。
實施例35 向小鼠腹腔內施與NESFATIN - 1對血液生化學參數的影響 的研究
對於NESFATIN-1所示的攝食抑制活性、體重增加抑制活性、脂 肪組織量降低活性是否與血糖(血液葡萄糖值)或脂質相關參數(膽固 醇值、甘油三酯值)的變動相伴進行了研究。
試驗動物使用7周齡的雄性C57BL/6J系小鼠，購自日本夕k 7公司(抹)，購入後由上午6點至下午6點的12個小時作為光照期，下
午6點至第二天早晨6點的12個小時作為暗期，按此周期使其自由攝 食顆粒飼料(日本夕I^7公司CE-2),在22。C下進行飼養。
對於C57BL/6Z小鼠腹腔內，將實施例16中製備的重組的小鼠 NESFATIN- 1以100 pl生理食鹽水10 nmol的量溶解於生理食鹽水使 用，對照試樣只使用生理食鹽水(Saline)。試樣是用帶26G注射針的 結核菌素注射筒向各小鼠(每組5隻)的腹腔內單次施與IOOjliI,施與 時間是在進入暗期之前(下午6點)。
施與後的各小鼠分別裝入單體籠中，測定施與後0-第3小時期間 減少的顆粒飼料的重量來測定攝食量。施與3小時後，將各小鼠斷頭殺 死，進行全血採血，分取血清，對於該血清使用市售的測定試劑測定葡 萄糖含量、總膽固醇含量、甘油三酯含量(協和MEDEX Determiner L GLUII、 Determiner-LTCII、 Determiner - L TGII)。
顯著差異檢驗使用方差分析。

圖33是表示小鼠腹腔內施與NESFATIN- l或只施與生理食鹽水時 攝食量、血液葡萄糖含量、總膽固醇含量、甘油三酯含量的測定結果的圖。
通過施與NESFATIN-1，攝食量與對照組相比顯著降低。與此相 對，表示血糖值的血液葡萄糖含量(圖中葡萄糖)、脂質相關的參數即 總膽固醇量(圖中膽固醇)、甘油三酯含量(圖中甘油三酯)中，NESFATIN -1施與組與對照組幾乎均未見差異。
由以上結果顯示，NESFATIN-1的作用顯示攝食抑制活性、體重 增加抑制活性、脂肪組織量降低活性，而不會引起血糖值或血液中脂質 相關參數的變動。
產業實用性
根據本發明，通過使用PPARY激動劑可以獲得與攝食和體重調節相 關的因子。通過使用NESFATIN 、 NESFATIN-1和/或NESFATIN-1M30,可以預防或治療肥胖或肥胖症、神經性過食症等代謝攝食障礙相 關的疾病、II型糖尿病、糖耐量異常、高血壓、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臟病、腦血管疾病、睡眠呼吸暫停症候群、變形性關節病等 整形外科疾病、月經異常、惡性腫瘤等肥胖症的相關的疾病。並且，通
過使用抗體等抑制NESFATIN、 NESFATIN - 1或NESFATIN - 1M30的 活性的物質，可以預防或治療手術後和/或癌症患者的食欲不振或厭食症 等營養、攝食障礙的相關疾病。
權利要求
1.攝食調節和/或體重調節相關因子的獲得方法，該方法包含以下步驟使具有PPARγ激動劑活性的噻唑烷二酮類的化合物作用於哺乳類細胞的步驟；對由該化合物誘導表達的基因進行鑑定的步驟。
2. 多肽，該多肽含有SEQ ID N0.13 - 15、 39-41、 65 -73、 101 -103或107-115所示的胺基酸序列。
3. 多肽，該多肽具有攝食抑制和/或體重增加抑制活性，含有SEQ IDN0.3、 6或9所示的胺基酸序列。
4. 多肽，該多肽含有以下胺基酸序列與SEQIDN0.13-15、 39 -41、 65 - 73、 101 - 103或107-115中任一個所示的胺基酸序列具有 至少60%以上的同源性的胺基酸序列；或者在SEQ IDN0.13-15、 39 -41、 65 - 73、 101 - 103或107-115中任一個所示的胺基酸序列中有部分胺基酸缺失、插入或置換的胺基酸序列；該多肽具有攝食抑制和/ 或體重增加抑制活性。
5. 多肽，該多肽是含有與SEQIDN0.3、 6或9所示胺基酸序列的 任一個具有至少60%以上同源性的胺基酸序列；或者在SEQ ID N0.3、 6或9所示胺基酸序列的任一個中有部分胺基酸缺失、插入或置換的氨 基酸序列；且具有攝食抑制和/或體重增加抑制活性的多肽，在SEQ ID N0.3、 6或9的相當於胺基酸編號80 - 162的胺基酸序列中，含有至少1個生物體內含有的切割酶的識別部位。
6. 權利要求3、 4或5所述的多肽，其中，上述體重增加抑制活性是體脂肪增加抑制活性。
7. 核酸分子，該核酸分子編碼權利要求2-6中任一項所述的多肽。
8. 核酸分子，該核酸分子含有SEQIDN0.18-20、 44-46、 74-82、 104- 106、 116-124中任一個所示的鹼基序列。
9. 核酸分子，該核酸分子含有SEQ ID NO.IO、 11或12所示的鹼 基序列，編碼具有攝食抑制和/或體重增加抑制活性的多肽。
10. 核酸分子，該核酸分子與SEQIDNO.10- 12、 18-20、 44-46、 74 - 82、 104- 106、 116 - 124所示的鹼基序列或其部分序列在嚴格條件 下雜交，且編碼具有攝食抑制和/或體重增加抑制活性的多肽。
11. 權利要求7-10中任一項所述的核酸分子，其中，上述體重增 加抑制活性是體脂肪增加抑制活性。
12. 載體，該載體含有權利要求7-11中任一項所述的核酸分子。
13. 轉化體，該轉化體含有權利要求7-11中任一項所述的核酸分子。
14. 用於抑制攝食和/或抑制體重增加的藥物組合物，該藥物組合物 含有權利要求2-6中任一項所述的多肽或其部分肽、權利要求12所述 的載體、或權利要求13所述的轉化體作為有效成分。
15. 權利要求14所述的藥物組合物，其中，上述抑制體重增加是抑制體脂肪增加。
16. 抗體，該抗體與權利要求2-6中任一項所述的多肽結合。
17. 物質，該物質抑制權利要求2-6中任一項所述的多肽的活性 或生成，或抑制編碼該多肽的基因的表達。
18. 用於使食慾亢進和/或體重增加亢進的藥物組合物，該藥物組合 物含有權利要求17所述的物質。
19. 轉基因非人生物，該轉基因非人生物中導入了權利要求7-11 中任一項所述的核酸分子。
20. 權利要求19所述的轉基因非人生物，該轉基因非人生物是顯 示攝食抑制狀態或體重增加抑制狀態的轉基因非人動物。
21. 食慾亢進或體重增加亢進的轉基因非人動物，該轉基因非人動 物中導入了權利要求16所述的抗體、或權利要求17所述的抑制物質。
22. 敲除非人動物，該敲除非人動物是使含有SEQIDNO.10-12、 18-20、 44-46、 74 - 82、 104 - 106、 116 - 124所示鹼基序列的基因的 全部區域或一部分缺損。
23. 權利要求2-6中任一項所述的多肽的製備方法。
24. 用於預測或診斷攝食亢進或體重增加狀態的鑑定方法，該方法 包含以下步驟檢測哺乳類動物的生物體試樣中含有SEQ ID NO.10-12、 18-20、 44-46、 74- 82、 104 - 106、或116-124中任一個所示 鹼基序列的核酸分子；或者含有SEQIDN0.3、 6、 9、 13-15、 39-41、 65 - 73、 101 - 103或107- 115中任一個所示胺基酸序列的多肽的含量 的步驟。
25. 權利要求24所述的鑑定方法中使用的鑑定試劑盒，該鑑定試 劑盒含有用於檢測含SEQIDNO.IO-12、 18-20、 44 -46、 74- 82、 104 -106或116-124中任一個所示的鹼基序列的核酸分子的PCR引物，探針或DNA晶片；或者識別含SEQIDN0.3、 6、 9、 13-15、 39-41、 65 - 73、 101-103或107-115中任一個所示胺基酸序列的多肽的抗 體、標準肽或結合竟爭反應用肽修飾物中的至少一種。
26. 具有攝食抑制和/或體重增加抑制效果的治療劑或預防劑的篩選 方法，該方法包含以下步驟使試驗物質與哺乳類細胞接觸的步驟；以及檢測細胞中的含有SEQIDNO.10-12、 18-20、 44 -46、 74 - 82、 或104- 106、 116-124中任一個所示鹼基序列的基因表達量的增加； 或者該細胞內含有的或分泌到細胞外的、含有SEQIDN0.3、 6、 9、 13 -15、 39-41、 65 - 73、 101 - 103或107 - 115任一個所示胺基酸序列 的多肽的量的增加的步驟。
27. 具有攝食抑制和/或體重增加抑制效果的治療劑或預防劑的篩選 方法，該方法包含以下步艱《將試驗物質施與哺乳動物的步驟；以及檢測該試驗動物的生物體試樣中含有SEQIDNO.10 - 12、 18-20、 44 -46、 74 - 82、 104 - 106或116 - 124中任一個所示鹼基序列的基因 的表達亢進，或者含有SEQIDN0.3、 6、 9、 13-15、 39-41、 65 - 73、 101 - 103或107- 115中任一個所示胺基酸序列的多肽的產生亢進的步驟。
28. 具有攝食抑制和/或體重增加抑制效果的治療劑或預防劑的篩選 方法，該方法包含以下步驟將試驗物質施與權利要求19-22所述的 非人動物的步驟；以及檢測該非人動物中攝食抑制或體重增加抑制的步驟。
29. 具有抑制攝食和/或抑制體重增加效果的治療劑或預防劑，該藥 物由權利要求26 - 28中任一項所述的篩選方法得到。
30. 具有攝食亢進和/或體重增加亢進效果的治療劑或預防劑的篩選 方法，該方法包含以下步驟使試驗物質與哺乳類細胞接觸的步驟；以及檢測細胞中的含有SEQIDNO.10-12、 18-20、 44-46、 74- 82、 104 - 106或116-124中任一個所示鹼基序列的基因表達量的減少；或 者該細胞內含有的或分泌到細胞外的含有SEQIDNO.3、 6、 9、 l3 - l5、 39-41、 65 - 73、 101 - 103或者107 - 115中任一個所示胺基酸序列的多肽量的減少的步驟。
31. 具有攝食亢進和/或體重增加亢進效果的治療劑或預防劑的篩選 方法，該方法包含以下步驟將試驗物質施與哺乳動物的步驟；以及檢測該試驗動物的生物體試樣中的含有SEQ ID NO.10- 12、 18-20、 44-46、 74 - 82、 104 - 106或116 - 124中任一個所示石鹹基序列的 基因的表達抑制；或者檢測含有SEQIDN0.3、 6、 9、 13-15、 39-41、 65 - 73、 101 - 103或者107-115中任一個所示胺基酸序列的多肽的生 成抑制的步驟。
32. 具有攝食亢進和/或體重增加亢進效果的治療劑或預防劑的篩選 方法，該方法包含以下步驟將試驗物質施與權利要求19-22所述的 非人動物的步驟；以及檢測非人動物攝食亢進或體重增加亢進的步驟。
33. 具有攝食亢進和/或體重增加亢進效果的治療劑或預防劑，該藥 物由權利要求30 - 32中任一項所述的方法得到。
全文摘要
本發明涉及攝食調節和/或體重調節相關因子的新獲得方法，以及由該方法得到基因，該基因所編碼的多肽，或者將由該基因所編碼的多肽的信息得到的新型多肽作為與攝食障礙和/或體重調節相關的疾病的治療、控制、診斷方法。本發明還涉及提供將抑制該基因或多肽的作用的物質作為攝食調節和/或體重調節相關疾病的治療、預防、診斷的方法。本發明通過使用具有PPARγ激動劑活性的噻唑烷二酮類，可以得到攝食抑制和/或體重減少相關基因或多肽。由該方法得到的NESFATIN等可用作與攝食障礙和/或體重調節相關的疾病的治療、控制、診斷方法。
文檔編號A61K45/00GK101300346SQ20068002262
公開日2008年11月5日 申請日期2006年6月23日 優先權日2005年6月24日
發明者山本真則, 森昌朋, 江口廣志, 清水弘行 申請人:帝人製藥株式會社;國立大學法人群馬大學