培養鏈球菌的發酵工藝以及從中提取cps的純化工藝的製作方法

2023-04-29 07:29:41 1

專利名稱：培養鏈球菌的發酵工藝以及從中提取cps的純化工藝的製作方法
技術領域：
本發明屬於細菌培養領域，尤其涉及培養條件的優化以及提高細菌莢膜多糖產率 的方法。莢膜多糖(cps)是位於細菌表面的參與多種細菌性疾病的重要免疫原。這一特徵 使其成為疫苗設計的重要成分。試驗證明它們可用於刺激免疫反應，尤其是與載體蛋白相 連時(參考文獻1)。一般來說，生產莢膜多糖的方法包括在複合培養基中分批培養(B型鏈球菌，金黃 色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，月市炎鏈球菌(streptococcuspneumoniae)禾口流感 嗜血菌(Haemophilus influenzae))、補料分批培養(流感嗜血菌)或連續培養(B型鏈球 菌和鼠李糖乳桿菌(lactobacillus rhamnosus))(參考文獻2_7)。大多數研究使用分批培 養系統，其中生長速率、營養水平和代謝物濃度在培養期間是變化的。在這種系統中，一種 因素的改變往往會導致與生長相關的其他因素的改變，對產率產生不可預測的影響。連續 培養可以使研究人員在分批培養期間相互獨立地分離和定義參數，如生長速率、營養物和 產物濃度以及細胞密度。在連續培養期間，新鮮培養基以固定的速率添加到培養物內，細胞 和培養基以一定的速率被去除，從而可使培養體積保持恆定。當莢膜多糖的生產被證明依 賴於培養條件時優選用連續培養方法生產(參考文獻8)。對於B型鏈球菌來說(GBS，無乳鏈球菌(S. agalactiae))，據報導細胞生長速率是 調節莢膜多糖產率的主要因素)。另外，研究顯示III型莢膜多糖的產率與生長限制營養 物無關。細胞的質量倍增時間(td)較快(0. 8，1. 4或1. 6h)時的單位產率(高達約90mg/ gCDw)要高於質量倍增時間較短(td = 2. 6或Ilh)時(參考文獻8-10)。但是，連續培養容 易產生菌株穩定性的問題和汙染，並且因為需要連續進料培養基和營養物，也比較昂貴。因 此需要找到能獲得高莢膜多糖產率的連續培養的替代方法，從而可以解決上述連續培養所 遇到的問題。W02007/052168描述了一種克服連續培養的缺點的方法。現在已經開發出了一種 複合分批發酵工藝，該工藝可維持有利於cps生成的營養環境和生長速率。這種工藝結合 了分批培養和連續培養技術的優點，可得到很高的細胞密度，因為指數生長期延長以及在 發酵期間可控制底物進料的條件。然而，複合分配發酵技術需要使用帶有複雜算法的軟體 來控制發酵。另外，生產可支持臨床試驗的材料需要符合《藥品生產和質量管理規範》的高 效而經濟的生產工藝。因此，急需簡化分批發酵工藝以便於用於大規模生產。除了需要簡化發酵方法以外，還需要找到適用於發酵後大規模生產莢膜多糖的簡 化純化方法。WO 2007/052168所描述的方法是基於WO 2006/082527公開的方法，該方法 包括提取、醇沉澱、透析過濾、陽離子去汙劑處理以及再增溶。這種方法的效率很高，一般來說生產出的莢膜多糖製備物純度約為80%。但是，陽離子去汙劑處理的步驟會導致莢膜多 糖沉澱。隨後從上清中分離沉澱物(例如，通過離心)和再增溶的過程是十分費力的，並且 會導致莢膜多糖的丟失，因此會降低產率。陽離子去汙劑處理的效率也取決於莢膜多糖的 初始純度。莢膜多糖的初始純度越低，陽離子去汙劑處理的效率越低，從而進一步降低了產 率。因此，需要有一種簡化的純化方法，複雜的和/或昂貴的純化步驟更少，但是得到的純 度卻更高。另外還需要一種無論多糖的初始純度多少都能獲得較高莢膜多糖產率的純化方 法。公開的實施方式概述發明者通過提供從鏈球菌規模生產莢膜多糖(cps)的方法滿足了簡化發酵工藝 的需求。在某些實施方式中，去除了線性添加碳源期間維持PH平衡的算法，在其他實施方 式中，刪除了培養基中的不必要組分。優選的鏈球菌種是無乳鏈球菌，也被稱作蘭斯菲爾德 B型鏈球菌(Lancefield' s Group BStr印tococcus)或GBS，尤其是菌株090、H36b、CBJlll 或 M781。本發明的一個方面提供了表達CPS的鏈球菌菌株接種物。在一個實施方式中，接 種物的最佳密度(OD)優選0. 6-1. 8，該密度是接種物的指數生長中期。雖然報告的OD值是 在590nm處測得的，但是也可以根據給定試驗的吸光度波長轉化成0D。本發明的另一方面提供了通過發酵培養鏈球菌菌株的方法。在一個實施方式中， 培養期間培養基的PH在6. 0-7. 5之間，優選約7. 3。在另一實施方式中，培養期間培養基的 溫度在34-38°C之間，優選約36°C。本發明的另一方面提供了培養鏈球菌菌株的方法，其中培養包括兩次瞬時添加酵 母提取物，然後線性添加碳源。線性添加的碳源優選葡萄糖。每一次添加都在指定的OD水 平時開始，該時間點是經過選擇的，通過調節細菌的生長速率可以達到較高的cps體積產 量，使微生物適應生成最大血清型特異性的cps。在一個實施方式中，第一次瞬時添加酵母提取物是從2. 8-3. 2的OD水平開始的， 優選約3. 0。在另一實施方式中，第二次瞬時添加酵母提取物是從4. 3-4. 7的OD水平開始 的，優選約4. 5。在另一實施方式中，線性添加碳源是從9. 8-10. 0的OD水平開始的，優選約 10。總之，無需算法的線性添加碳源與以前複雜的補料分批發酵工藝相比是一個進 步，因為後者需要利用算法通過監測培養基的PH來控制培養。本發明的另一方面提供了培養基，其中包括確定成分培養基或複合培養基。用於 培養鏈球菌的確定成分培養基包含磷酸鹽源、礦物質源、碳源、維生素源和胺基酸源。維生 素源由選自如下7種維生素的6種或更少的維生素構成生物素、煙醯胺、泛酸鈣、核黃素、 鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇和葉酸，其中的兩種維生素必須是泛酸鈣和煙醯胺。用於培養鏈球菌的複合培養基包含複合提取物(優選酵母提取物)、磷酸鹽源、碳 源、維生素源以及可選的胺基酸源。維生素源由選自如下5種維生素的4種或更少的維生 素構成生物素、煙醯胺、核黃素、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆醇，其中一種維生素必須是生物素 (即，培養基中包含5種維生素中的4種，第5種不是添加的，而是複合提取物中的天然成 分)。在優選實施方式中，維生素源包含3種或更少、兩種或更少，或者只有生物素。本發明還提供了組合物，其中包括培養基，該培養基是確定成分培養基，由用於培養鏈球菌的磷酸鹽源、礦物質源、碳源、維生素源和胺基酸源組成。再次重申，鏈球菌優選菌 株是無乳鏈球菌，尤其是菌株090、H36b、CBJlll或M781。在一個實施方式中，磷酸鹽源由 K2HP04、KH2PO4、Na2HPO4. H20、NaH2P04. H2O或NaCl組成。在一個實施方式中，優選碳源是葡萄糖。在另一實施方式中，維生素源由選自如下7種維生素的6種或更少的維生素組成 生物素、煙醯胺、泛酸鈣、核黃素、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇和葉酸，其中的兩種維生素必須 是泛酸鈣和煙醯胺。在另一實施方式中，維生素源由選自如下7種維生素的5種或更少的維生素組成 生物素、煙醯胺、泛酸鈣、核黃素、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇和葉酸，其中的兩種維生素必須 是泛酸鈣和煙醯胺。在另一實施方式中，維生素源由選自如下7種維生素的4種或更少的維生素組成 生物素、煙醯胺、泛酸鈣、核黃素、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇和葉酸，其中的兩種維生素必須 是泛酸鈣和煙醯胺。在另一實施方式中，維生素源由選自如下7種維生素的3種或更少的維生素組成 生物素、煙醯胺、泛酸鈣、核黃素、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇和葉酸，其中的兩種維生素必須 是泛酸鈣和煙醯胺。在另一實施方式中，維生素源由泛酸鈣和煙醯胺組成。在另一實施方式中，胺基酸源由選自如下19種胺基酸的19種或更少的胺基酸組 成丙氨酸、精氨酸、穀氨醯胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙 氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、鹽酸半胱氨酸、穀氨酸和酪氨酸， 其中15種必須是精氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、 絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、鹽酸半胱氨酸、穀氨酸和酪氨酸。在另一實施方式中，胺基酸源由選自如下19種胺基酸的18種或更少的胺基酸組 成丙氨酸、精氨酸、穀氨醯胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙 氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、鹽酸半胱氨酸、穀氨酸和酪氨酸， 其中15種必須是精氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、 絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、鹽酸半胱氨酸、穀氨酸和酪氨酸。在另一實施方式中，胺基酸源由選自如下19種胺基酸的17種或更少的胺基酸組 成丙氨酸、精氨酸、穀氨醯胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙 氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、鹽酸半胱氨酸、穀氨酸和酪氨酸， 其中15種必須是精氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、 絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、鹽酸半胱氨酸、穀氨酸和酪氨酸。在另一實施方式中，胺基酸源由選自如下19種胺基酸的16種或更少的胺基酸組 成丙氨酸、精氨酸、穀氨醯胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙 氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、鹽酸半胱氨酸、穀氨酸和酪氨酸， 其中15種必須是精氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、 絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、鹽酸半胱氨酸、穀氨酸和酪氨酸。在另一實施方式中，胺基酸源由精氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨 酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、鹽酸半胱氨酸、穀氨酸和酪氨酸組成。本發明的另一方面提供了組合物，其中包括培養基，該培養基是複合培養基，由用 於培養鏈球菌的複合提取物(優選酵母提取物)、磷酸鹽源、碳源、維生素源以及可選的氨 基酸源。再次重申，鏈球菌優選菌株是無乳鏈球菌，尤其是菌株090、H36b、CBJlll或M781。在一個實施方式中，維生素源由選自如下5種維生素的4種或更少的維生素組成 生物素、煙醯胺、核黃素、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆醇，其中的一種維生素必須是生物素。在另一個實施方式中，維生素源由選自如下5種維生素的3種或更少的維生素組 成生物素、煙醯胺、核黃素、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆醇，其中的一種維生素必須是生物素。在另一個實施方式中，維生素源由選自如下5種維生素的2種或更少的維生素組 成生物素、煙醯胺、核黃素、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆醇，其中的一種維生素必須是生物素。在另一個實施方式中，維生素源是生物素。上述方面和實施方式並不意味著著彼此排除，可以彼此組合或與本說明書公開的 除互相排除之外的其他任何方面或實施方式組合。本發明還提供了純化莢膜多糖的方法，通常是從無乳鏈球菌中純化，該方法包括 使用附著濾器過濾的步驟。附著濾器是能夠結合莢膜多糖內可能存在的汙染物而允許莢膜 多糖通過的濾器，例如蛋白質和/或核酸。本發明的發明者發現附著濾器可用於純化莢膜 多糖，替代WO 2007/052168和WO 2006/082527所描述的陽離子去汙劑處理。使用附著濾 器以後就無需再用陽離子去汙劑，這意味著無需分離這個階段產生的莢膜多糖沉澱，因此 無需從上清中分離沉澱，簡化了方法，防止了分離期間可能發生的莢膜多糖丟失。因而附著 濾器的使用可提供純化方法產率。附著濾器的效率也不依賴於莢膜多糖的初始純度。本領域的技術人員能夠確定適用於本發明的合適附著濾器。一般來說，莢膜多糖 內的主要汙染物是蛋白質，因此附著濾器是蛋白質附著濾器。發明者發現碳濾器尤其合適。 它們通常包含活性炭(例如，以顆粒性碳床或壓縮或排出碳塊的形式)，可用作純化樣品的
濾器O本領域的技術人員能夠確定合適的碳濾器。一般而言，可用於本發明的碳濾器包 含固定在基質上的活性炭。基質可以是可滲透樣品的任何有孔濾器。基質可包含支持材料 和/或結合材料。支持材料可以是合成的聚合物或天然聚合物。合適的合成聚合物包括聚 苯乙烯、聚丙烯醯胺和聚甲基丙烯酸甲酯，天然聚合物包括纖維素、多糖和葡聚糖、瓊脂糖。 一般來說，聚合物支持材料是以纖維網絡的形式提供機械剛性。結合材料可以是樹脂。基 質可以是膜紙的形式。固定在基質上的活性炭一般採用柱體的形式。柱體是一種自含式實 體，其中包含粉末狀活性炭，活性炭被固定在基質上，製成膜紙的形式。膜紙可被捕獲在可 滲透塑料支持物上形成盤。另外，膜紙可以是螺旋狀損傷的。為了增加濾器的表面積，幾個 盤彼此疊加在一起。更具體地說，彼此疊加在一起的盤形成一個中央核心管道，用於從濾器 中收集和去除碳處理的樣品。疊加在一起的盤的形狀可以是透鏡狀。碳濾器內的活性炭可 取自不同的原材料，例如，泥炭、褐煤、木頭或椰殼。本領域熟知的任何工藝，如蒸汽或化學 處理，都可用於製備活性炭。在本發明中，固定在基質上的活性炭可以被放置在罩內形成獨 立的濾器單位。每一個濾器單位都有自己的入口和出口，便於待純化樣品的出入。可用於 本發明的濾器單位的例子是庫諾股份有限公司(莫瑞頓，美國)(Cimo Inc. (Meriden,USA) 或派爾公司(東山，美國)(Pall Corporation (East Hill, USA))的碳柱。
更特別的是，本發明的發明者發現庫諾ζ碳濾器(CUNO zetacarbon filters)適 用於本發明。這些碳濾器包含纖維素基質，活性炭粉末被摻入其中並且和樹脂原位結合。本發明這個方面的方法所用的起始材料可以是下文「起始材料」部分所描述的起 始材料中的一種。另外，方法還可以包含下文「醇沉澱和陽離子交換」、「透析過濾」、「再N乙 醯化」、「進一步透析過濾」、「結合物製備」和/或「其他步驟」部分所描述的一個或多個步驟。 因此，步驟的順序一般如下i) 「醇沉澱和陽離子交換」部分所描述的步驟；ii) 「透析過濾」 部分所描述的步驟；iii)使用上述附著濾器過濾的步驟；iv) 「再N乙醯化」部分所描述的 步驟；以及ν) 「進一步透析過濾」部分所描述的步驟。這個過程之後是「結合物製備」部分 所描述的步驟。最後，這個過程是「其他步驟」部分所描述的步驟。另外，方法還可以包含下文「陽離子去汙劑處理」和「再增溶」部分所描述的一個或 多個步驟，儘管在本發明的方法中使用附著濾器進行過濾時通常不再需要通過陽離子去汙 劑處理來沉澱莢膜多糖以及隨後再增溶多糖，因而常常省卻這些步驟。相應的，本發明特別 優選的純化莢膜多糖，一般是從無乳鏈球菌中，的方法包括使用附著濾器過濾的步驟，其中 方法不包括陽離子去汙劑處理以沉澱莢膜多糖的步驟以及隨後的再增溶莢膜多糖的步驟。本發明還提供了從鏈球菌中純化莢膜多糖(cps)的方法，也是生產規模的。優選 的鏈球菌菌種是無乳鏈球菌，也被稱作蘭斯菲爾德B型鏈球菌(Lancefield' s Group B Streptococcus)或 GBS，尤其是菌株 090、H36b、CBJlll 或 M781。在一個優選實施方式中，生產純化的莢膜多糖的方法包括如下步驟中的一個或多 個(a)提供包含莢膜多糖的粗分離物；(b)去除因粗分離物與醇溶液接觸而形成的醇沉澱 物；(c)過濾去除小分子化合物而保留莢膜多糖；以及(d)利用蛋白質附著濾器去除蛋白質 汙染物，生產出純化的莢膜多糖。在一個優選實施方式中，方法包括上述所有步驟。在一個 更優選的實施方式中，方法省卻了去汙劑沉澱。在某些實施方式中，可以執行一個或多個附加步驟，其中包括(e)再N乙醯化純化 的莢膜多糖，(f)沉澱純化的莢膜多糖；和/或(g)以莢膜多糖為一種組分製備疫苗。在某些實施方式中，醇溶液添加的濃度到足以沉澱核酸汙染物而不沉澱莢膜多糖 的程度。在一個優選實施方式中，醇是酒精，添加的濃度優選在約10%到50%酒精之間，更 優選的濃度是約30%酒精。可選的是，醇溶液可包含陽離子，優選金屬陽離子，更優選的是 二價陽離子，最優選的是鈣。在某些實施方式中，蛋白質附著濾器是活性炭濾器。附圖簡述

圖1顯示的是作為潛在GBS疫苗靶位的莢膜多糖。圖2是連接莢膜多糖(cps)與GBS B型糖類的推薦模式的示意圖。圖3A顯示的是來自於Ia型和Ib型的GBS血清型特異性cps的分子結構。圖3B顯示的是來自於III型和V型的GBS血清型特異性cps的分子結構。圖4顯示的是抗GBS的糖結合疫苗的生產工藝。圖5A-D顯示的是(A)菌株090、(B)H36b菌株、(C)M781菌株和(D) CJBlll菌株的 生長曲線和培養基PH。比生長速率用OD值計算，範圍在0. 1-2. 4之間。圖6顯示的是(A)090菌株的生長曲線，(B)090菌株的cps濃度，以及(C)每克細 胞乾重所產生的CPS產量，其中確定了氫氧化鈉和甲醇中含生物素和四種維生素；水中含生物素和三種維生素，不含核黃素；只含生物素；以及不含維生素條件下的生長速率。圖7顯示的是(A)H36b菌株的生長曲線，(B)H36b菌株的cps濃度，以及(C)每克 細胞乾重所產生的CPS產量，其中確定了氫氧化鈉和甲醇中含生物素和四種維生素；水中 含生物素和三種維生素，不含核黃素；以及只含生物素條件下的生長速率。圖8顯示的是(A)M781菌株的生長曲線，(B)M781菌株的cps濃度，以及(C)每克 細胞乾重所產生的CPS產量，其中確定了氫氧化鈉和甲醇中含生物素和四種維生素；水中 含生物素和三種維生素，不含核黃素；以及只含生物素條件下的生長速率。圖9顯示的是CJBlll菌株的生長曲線，CJBlll菌株的cps濃度，以及每克細胞幹 重所產生的cps產量，其中確定了只含生物素條件下的生長速率。圖10顯示的是(A)090菌株的生長曲線，(B)090菌株的cps濃度，以及(C)每克 細胞乾重所產生的cps產量，其中確定了分批進料技術；在OD水平為3和5時瞬時添加酵 母提取物，然後線性添加葡萄糖；以及在一批培養基中添加上全部酵母提取物，然後線性添 加葡萄糖條件下的生長速率。圖11顯示的是㈧H36b菌株的生長曲線，⑶H36b菌株的cps濃度，以及(C)每 克細胞乾重所產生的cps產量，其中確定了分批進料技術；在OD水平為3和5時瞬時添加 酵母提取物，然後線性添加葡萄糖；以及在一批培養基中添加上全部酵母提取物，然後線性 添加葡萄糖條件下的生長速率。圖12顯示的是(A)M781菌株的生長曲線，(B)M781菌株的cps濃度，以及(C)每 克細胞乾重所產生的cps產量，其中確定了分批進料技術；在OD水平為3和5時瞬時添加 酵母提取物，然後線性添加葡萄糖；以及在一批培養基中添加上全部酵母提取物，然後線性 添加葡萄糖條件下的生長速率。圖13顯示的是CJBlll菌株的生長曲線，CJBlll菌株的cps濃度，以及每克細胞 乾重所產生的cps產量，其中確定了在OD水平為3和5時瞬時添加酵母提取物，然後線性 添加葡萄糖時的生長速率。圖14提供的是DOT試驗的結果，該結果顯示仏)15%、30%和60%的!13613菌株的 生長曲線，(B)H36b菌株的cps濃度，(C)每克細胞乾重所產生的cps產量以及(D)H36b菌 株的平均生產力。圖15提供的是溫度試驗的結果，該結果顯示(A)H36b菌株在34°C、36°C和38°C條 件下的生長曲線，(B)H36b菌株的cps濃度，(C)每克細胞乾重所產生的cps產量以及(D) H36b菌株的平均生產力。圖16提供的是pH試驗的結果，該結果顯示(A) H36b菌株在7.0、73和7. 5條件下 的生長曲線，(B)H36b菌株的cps濃度，(C)每克細胞乾重所產生的cps產量以及(D)H36b 菌株的平均生產力。圖17提供的是壓力試驗的結果，該結果顯示(A)H36b菌株在0. 2和0. 5巴條件下 的生長曲線，(B)H36b菌株的cps濃度，(C)每克細胞乾重所產生的cps產量以及(D)H36b 菌株的平均生產力。圖18顯示的是M781菌株在(A)內含IOOml化學成分確定的培養基(0. Iml w. s.) 的500ml錐形瓶，以及(B) 2L發酵罐中的生長曲線。比生長速率用OD值計算，範圍為 0. 1-0. 7。
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圖19顯示的是如下條件下M781點圖形式的生長曲線以及柱圖形式的葡萄糖消耗 量標準批培養基；10倍量的維生素；10倍量的胺基酸和維生素；以及10倍量的維生素、氨 基酸和鈣。圖20顯示的是確定成分培養基中去除丙氨酸、天冬氨酸和脯氨酸對菌株M781的 GBS生長的影響。圖21顯示的是確定成分培養基中去除生物素、鹽酸吡哆醇、核黃素和硫胺素對菌 株M781的GBS生長的影響。圖22顯示的是3株細菌M781、H36b和090在第一輪實驗室規模的預發酵試驗中 的OD59tlnm模式。圖23顯示的是4株細菌M781、H36b、090和CJBlll在使用簡化工藝的第二輪預發
酵試驗中的OD59tlnm模式。第一次簡化是從維生素溶液中去除硫胺素、核黃素、鹽酸吡哆醇和 煙醯胺。第二次簡化是調整發酵期間進料相的參數。圖24顯示的是4株細菌M781、H36b、090和CJBlll在實驗性發酵輪次中的OD59tlnm 模式。圖25顯示的是在25°C下記錄的純化的GBS Ia型多糖的1H NMR光譜。光譜中鑑 定了某些氫鍵。圖26顯示的是在25°C下記錄的純化的GBS Ib型多糖的1H NMR光譜。光譜中鑑 定了某些氫鍵。圖27顯示的是在25°C下記錄的純化的GBS III型多糖的1H NMR光譜。光譜中鑑 定了某些氫鍵。圖28顯示的是在25°C下記錄的純化的GBS V型多糖的1H匪R光譜。光譜中鑑定 了某些氫鍵。圖29顯示的是多糖樣品和0. 5 μ g/ml的唾液酸標準品(灰線)洗脫模式的重疊。圖30顯示的是多糖樣品和添加鼠李糖的多糖樣品(灰線)洗脫模式的重疊。優選實施方式詳述本發明的發明者發現利用補料分批培養任何鏈球菌菌株都可以獲得生產規模的 高cps產率，這種培養方式是首先將細胞接種到有限體積的新鮮培養基內，細胞生長以後 一次性收穫培養物來終止培養，最初添加的營養素在耗竭以後再額外添加營養素。如此高 的產率與利用連續培養所得的產率相當，甚至更高。另外，本文所公開的方法不容易出現連 續培養所產生的穩定性和汙染問題。發明者還開發出了一種優化純化方法，該方法在使過 程簡化和降低生產規模的成本的同時還能夠明顯改善不純度。本說明書提供了培養鏈球菌的工藝，其中鏈球菌以補料分批培養的方式培養。鏈 球菌的某些菌株被認為是cps的「不良生產者」，因為它們在培養時產生的cps水平通常都 很低。這種不良生產者的例子包括GBS菌株DK21和2603。但是，利用本文所公開的方法， 即使這些被認為只能產生低水平cps的菌株也能生產出高水平的cps。因此，本發明提供了 提高鏈球菌菌株的cps產率的工藝，該工藝包括以補料分批培養的方式培養鏈球菌，其中 在分批或連續培養條件下，「不良生產者」菌株只能生產出低於30mg/gmw或低於10mg/gmw 的 cpsO優選的是，本發明提供了一種補料分批培養鏈球菌的方法，其中可以生產出高產
12率的cps。對於不良生產者來說，cps的優選產率為10mg/geDW或更高(優選15、20、25、30 或更高)，對於其他菌株來說，cps的優選產率為30mg/geDW (優選40、50、60、70、80、90、100、 110、120、130、140、150、160、170、180、190、200 或更高)。優選的是，培養基內的 cps 產率 為 10mg/L 或更高(例如，20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、 260、280、300或更高)。更優選的是，培養基內的cps產率為50mg/L或更高(例如，150、 200、250、300、350、400、450、500、550、600、650或更高)。因此，與連續培養相比，本發明可 以是CPS的產率提高到更高的產率/單位體積的水平。在某些情況下，單位體積的產量至 少是連續培養所得到的量的兩倍，更優選的是連續培養所得到的量的2. 5倍或3倍。本發明還提供了通過發酵培養鏈球菌菌株的方法，該方法包括兩次瞬時添加酵母 提取物，然後線性添加碳源，優選不用算法來檢測PH。線性添加的碳源優選葡萄糖。每一次 添加都在指定的OD水平時開始，該時間點是經過選擇的，通過調節細菌的生長速率可以達 到較高的cps體積產量，使微生物適應生成最大血清型特異性的cps。在一個實施方式中，第一次瞬時添加酵母提取物是從2. 8-3. 2的OD水平開始的， 優選約3. 0。在另一實施方式中，第二次瞬時添加酵母提取物是從4. 3-4. 7的OD水平開始 的，優選約4. 5。在另一實施方式中，線性添加碳源是從9. 8-10. 0的OD水平開始的，優選約 10。總之，線性添加碳源與以前複雜的補料分批發酵工藝相比是一個進步，因為後者 需要利用算法通過監測培養基的PH來控制培養。培養以後，細菌需要經過進一步的處理步驟來純化cps並將其連接到載體蛋白 上。因此本發明還包括從細菌純化cps的步驟以及將莢膜多糖連接到載體蛋白上形成蛋白 質-多糖連接物的步驟(參見圖1-2)。純化出的cps還需要進一步處理以製備藥物製備 物。在優選實施方式中，純化是用本文所描述的改良純化方法完成。鏈球菌術語「鏈球菌」是指選自無乳鏈球菌(GBS)、釀膿鏈球菌(S. pyogenes) (GAS)、肺炎 鏈球菌(S. pneumoniae)(肺炎球菌)和變異鏈球菌的細菌。鏈球菌還可以是嗜熱鏈球菌或 乳酸鏈球菌。優選的鏈球菌是GBS，優選的血清型是la、Ib、3、4或5。優選的GBS菌株是 090(Ia)、7357(Ib)、H36b(Ib)、DK21(2)、M781(3)、2603(5)或 CJBlll (5)。參見圖 3A-B。如 果使用的鏈球菌是肺炎鏈球菌，那麼優選的血清型是4、6B、9V、14、18C、19F和23F中的一種 或多種，或者全部。血清型1也是優選的。優選的血清型是1、3、4、5、68、7 、抓、14、18(、19 和23F中的一種或多種，或者全部。另外，使用本發明的方法生產出的培養物可以是勻質的(S卩，由單一物種或鏈球 菌菌株組成)，或者是異質的(即，包含兩種或多種物種或鏈球菌菌株)。優選的培養物是 勻質的。所用的鏈球菌可以是野生型菌株，或者是經過遺傳改造的。例如，經過修飾後產生 非天然莢膜多糖或異源多糖，或者產率提高。生產工藝概述GBS的生產分為四個部分(1)通過發酵生產每一種cps及其原始回收；(2)微孔 過濾滲透物的純化；(3)幹純化的cps的製劑製備；以及(4)糖結合物生物分子的特徵鑑定。
第一步在中試規模的廠房內進行了優化，包括通過發酵生產生物質，生物質的連 續流動離心，細胞團(或細胞膏)的收集，微生物的滅活和cps的釋放，以及最後微孔過濾 細胞膏和收集滲透物。發酵包括(1)接種製備物，(2)發酵，生物質的離心，細胞團的化學 處理以及細胞團的微孔過濾，如圖4所示。本發明提供了以生產規模生產cps的方法，該方法包括提供表達cps的鏈球菌菌 株接種物的方法以及通過發酵培養菌株的方法。培養包括監測培養基的光密度(OD)，這樣 在OD達到指定加料水平時，向培養基中兩次瞬時添加酵母提取物，隨後線性添加碳源，這 樣就無需算法通過監測培養基的PH來控制培養。接種物培養接種物的培養可在經過121°C高壓滅菌的搖瓶內完成。接種物包含複合培養基 (由酵母提取物、Na2HPO4. 2H20、NaH2P04. H2O以及天然pH約為7. 3的一水葡萄糖組成)、維生 素溶液(由硫胺素、核黃素、鹽酸吡哆醇和煙醯胺組成，用NaOH稀釋)和生物素溶液。在優 選實施方式中，省去了維生素溶液，只以生物素溶液作為維生素補充。在一個優選實施方式中，每一個搖瓶接種2. 75 士 0. 25mL工作種子液。培養物在約 35°C振蕩培養，大約200rpm培養約4小時。此後通過測定590nm處的OD來評估生物質的 濃度，進行革蘭氏染色。如果OD59tlnm值在約0.6-1. 8之間，革蘭氏染色顯示只有革蘭氏陽性 球菌，那麼將搖瓶的內容物倒入與發酵罐的孵育管相連的熱滅菌的罐內。在接種物製備期間，優選的條件如下培養基初始PH為7. 3士0. 1，工作種子液的 體積為2. 5-3. Oml/瓶，孵育溫度為35 士 1°C，振蕩速度為200士 lOrpm。在搖瓶培養結束時， 最終OD59tlnm優選在0. 6-1. 8之間，革蘭氏染色優選只有革蘭氏陽性菌。在發酵罐內，培養物 的純度優選不含汙染物。最後，孵育時間優選3-5小時之間。補料分批發酵工藝本發明提供了利用生產規模的補料分批發酵工藝培養鏈球菌的改良方法(參見 圖6-18)。補料分批培養可以是固定體積的，也可以是可變體積的。對於固定體積的補料 分批培養來說，底物進料量有限因此不會稀釋培養物(例如，利用濃縮的液體或氣體，或者 利用透析)。對於可變體積的補料分批培養來說，發酵期間的體積是變化的，因為有底物進 料。對於300L發酵罐的發酵工藝來說，優選條件如下培養溫度設定在36士 1 °C，發酵 罐內的餘壓設定在約0. 2巴，pH設定在7. 3士0. 1，用4M NaOH調節pH，初始攪拌速度設定 在50rpm，初始空氣流設定在20升/分(L/min)，發酵罐內的泡沫水平通過肉眼監測，需要 時用消泡劑PPG2500調節，溶解氧張力(DOT)設定在30%，通過攪拌(50_350rpm之間)、空 氣流(20-100L/min之間)和氧氣流(O-lOOL/min之間)逐級調節。本發明提供了在指定OD水平上向培養基中兩次瞬時添加酵母提取物，隨後線性 添加碳源。在發酵的批期以及接種後2小時採樣，測定0D59(tam。每15分鐘採集一次樣品，直 到OD59tlnm達到3，在這個時間點利用150g/L的酵母提取物溶液開始首次瞬時添加。首次添 加後約45分鐘，再次測定0D59(tam。每15分鐘採集一次樣品，直到OD59tlnm達到5，在這個時間 點利用150g/L的酵母提取物溶液開始第二次瞬時添加。當OD59tlnm達到10-12時開始線性 添加。在線性添加期間，每小時採樣一次測定0D59(tam。線性添加持續約3小時，此時停止參 數的自動控制。攪拌速度調節到IOOrpm，穩定設定在30°C。
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牛長培養基適用於維持鏈球菌生長的任何類型的液體生長培養基都可以使用。優選的培養基 包括複合培養基，如哥倫比亞肉湯(Columbia broth)、LB、託德-哈維特(Todd-Hewitt)、 OC培養基、血肉湯或腦-心浸液；半確定成分培養基如MCDM ；用於鏈球菌的化學成分確定 培養基如M1、MC、FMC(參考文獻11)或C-48(參考文獻12)；以及用於培養真核細胞系的包 含必須營養缺陷組分的組合培養基如RPMI、耗竭培養基(spent medium)、麥克伊氏培養基 (McCoy' s)和伊格爾氏培養基(Eagle' s)。典型的生長培養基包含酵母提取物以及生長 所需的其他因子，其中包括脂質(長鏈脂肪酸如亞油酸或油酸)、類固醇(如膽固醇)、嘌呤 和嘧啶、礦物質、維生素和生長因子、胺基酸(L-和/或D-型)和/或化學元素或無機離子 (如Fe、K、Mg、Mn、Ca、Co、Cu、P和/或Zn)。通過增加培養基的濃度可以達到更高的0D， 獲得更高的cps體積產量。相應的，用於培養鏈球菌的複合培養基優選包含酵母提取物、磷 酸鹽源、碳源、維生素源以及可選的胺基酸源，其中維生素源由生物素以及可選的選自煙醯 胺、核黃素、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆醇中的一種或多種維生素組成。用於培養鏈球菌的化學成分確定的培養基優選包含磷酸鹽源、礦物質源、碳源、維 生素源和胺基酸源，其中維生素源由泛酸鈣、煙醯胺和選自生物素、核黃素、鹽酸硫胺素、鹽 酸吡哆醇和葉酸的一種或多種維生素組成。生長培養基還可以包含一種或多種抗生素和消泡劑。抗生素通常包括卡那黴素、 氨苄青黴素和四環素。抗生素可用於產生選擇壓力以便於篩選出包含抗生素耐藥基因的特 殊細菌和/或篩選出革蘭氏陽性細菌(例如，鏈球菌)。因此，抗生素可用於維持表達理想 CPS的細菌的篩選壓力。例如，抗生素氨曲南可有效抑制革蘭氏陰性細菌，但是對革蘭氏陽 性細菌無效。消泡劑是本領域熟知的，其中包括礦物油、醫用油、聚矽氧烷甘油共聚物、矽酮 化合物和乳化劑、烷氧基化的化合物、礦物油/合成混合物、甘油/酯混合物等。培養物中還可以添加促生長的各種其他因子，如脂質(例如，長鏈脂肪酸如亞油 酸或油酸)、類固醇(如膽固醇)、嘌呤和嘧啶、礦物質、維生素和生長因子、胺基酸(L-和/ 或D-型)和/或化學元素或無機離子(如Fe、K、Mg、Mn、Ca、Co、Cu、P和/或Zn)。如果生長培養基包含動物來源的添加劑如牛血清白蛋白，這些添加劑應當來自於 無傳播性海綿狀腦病的動物，這樣才能避免汙染培養基和最後的cps。碳源所用碳源的類型不是關鍵因素。優選的初級碳源選自如下一組葡萄糖、果糖、蔗 糖、麥芽糊精、澱粉、菊糖、甘油、蔬菜油如豆油、烴類、醇如甲醇和乙醇、有機酸如乙酸。更優 選的碳源選自葡萄糖、甘油、乳糖、果糖、蔗糖和豆油。術語「葡萄糖」包括葡萄糖漿，即，包含 葡萄糖寡聚物的葡萄糖組合物。碳源可以固體或液體的形式添加到培養物中。優選的是， 碳源的添加是可控的，這樣可避免對細胞產生滲透性應激，導致過量進料。一般通過不將發 酵期間所需的全部碳源都加入到初始批培養物中來控制。碳源的添加需要控制的另一個原 因是避免耗竭，導致生長受限和色素產生(參考文獻13)。氮源所有氮源的類型不是關鍵因素。優選的氮源選自尿素氨水、銨鹽(如硫酸銨、磷 酸銨、氯化銨和硝酸銨)、其他硝酸鹽、胺基酸如穀氨酸和賴氨酸、酵母提取物、酵母自溶產 物、酵母胺基酸氮源、蛋白質水解產物(其中包括而不限於腖類、酪蛋白水解產物如胰蛋白腖和酪蛋白胺基酸)、大豆粉、Hy-Soy、胰蛋白酶大豆肉湯、棉籽粉、麥芽提取物、玉米漿和糖 蜜。更優選的氮源選自氨水、硫酸銨、氯化銨和磷酸銨。最優選的氮源是氨水。使用氨水作 為氮源的優點在於添加的氨水還可以作為PH控制劑。如果使用硫酸銨和/或磷酸銨作為氮源，那麼至少可以滿足微生物的一部分硫和 /或磷需求。磷源如上所述，磷可以添加到生長培養基中。磷可以是鹽的形式，尤其是以磷酸鹽(如 上述磷酸銨)或多聚磷酸鹽的形式添加。如果使用多聚磷酸鹽，那麼可以使用磷酸鹽晶體， 如多聚磷酸鈉(參考文獻14)。這種磷酸鹽晶體是可用的，因為它們的溶解特性很高，這樣 就可以製備出濃縮的營養培養基而不會在混合時產生沉澱。其他變量培養物的溫度維持在30-45°C之間(例如，31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44°C)。優選的溫度約為36°C。因此，必須加熱或冷卻含培養物的容器以確保培養 物的溫度保持恆定。溫度可用於控制倍增時間(td)，因此，對於一個給定的培養工藝來說， 不同相的溫度可以是不同的(即，分批相、分批進料相和碳源進料相)。培養物的氧飼可以是受控的。可以空氣、富集氧、純氧或其任意組合的形式供應 氧。監測氧濃度的方法是本領域熟知的。氧可以某種進料速率供應，或者根據培養物溶氧 含量的測定結果，按照維持溶氧含量恆定的要求供氧。攪拌或換氣速率也可以是受控的。這樣可確保營養物和氧被轉移到包含培養物的 生物反應器各處。營養物溶液和細胞個體之間的相對速率應該在0.5m/sec左右(例如， 0. 1、0· 2、0· 3、0· 4、0· 5、0· 6、0· 7、0· 8、0· 9 或 1. Os)。如上所述，可以通過添加酸或鹼來控制培養物的pH。在培養期間當pH下降時優選 加鹼。合適的鹼的例子包括NaOH和ΝΗ40Η。所有這些變量都可以通過計算機、計算機輔助裝置或上述控制算法來控制。這些 變量的改變可用於控制培養物的倍增時間。多糖製備從細菌中製備莢膜多糖的方法是本領域熟知的，例如，參見參考文獻15、16、17 等。對於GBS來說，可以使用下列方法(也可參見參考文獻18)。更具體地說，可以使用本 發明的純化莢膜多糖的方法。如上所述，本發明的這些方法包括如下步驟中的一個或多個。起始材料一般而言，在細菌生長期間有少量莢膜多糖釋放到培養基中，因此起始材料可以 是細菌培養物離心後的上清液。然而更常見的是通過處理有莢膜的細菌本身(或者包含細 菌肽多糖的材料)來製備起始材料，這樣結可以釋放出莢膜多糖。可以通過各種方法使細 菌釋放出cps，其中包括化學的、物理的或酶催化的處理方法。因此，可在初始蛋白質/核酸 沉澱反應前處理多糖的水性製備物。典型的化學處理方法是鹼提取(參考文獻19)(例如，使用氫氧化鈉)，該方法可裂 解莢膜多糖與肽多糖骨架之間的磷酸二酯連接。但是，在通過鹼處理使莢膜多糖去N乙醯 化時，隨後必須進行再N乙醯化。典型的酶催化處理方法包括使用變溶菌素和β -N-乙醯氨基葡萄糖苷酶(參考文
16獻20)。這些物質可作用於細菌的肽多糖，使其釋放出可用於本發明的莢膜多糖，但是也會 導致型特異性的糖類抗原的釋放。另一種酶催化處理方法包括用II型磷酸二酯酶(0DE2) 處理。PED2與氫氧化鈉一樣可裂解磷酸鹽(見上)，釋放出莢膜多糖，但是不會裂解型特異 性的糖類抗原，也不會導致莢膜多糖去N乙醯化，因此簡化了下遊步驟。因此PDE2酶是制 備莢膜多糖的優選選項。可用於本發明的工藝的優選起始材料是去N乙醯化的莢膜多糖，可通過US 6248570所述的鹼提取方法獲得(參考文獻19)。另一種優選的起始材料是PDE2處理鏈球 菌後的產物。可在上述沉澱前將這種材料濃縮(例如，超濾)。起始材料可以經過醇沉澱去除汙染的蛋白質和/或核酸，如下文所述。醇沉澱和陽離子交換培養後獲得的鏈球菌莢膜多糖通常都是不純的，包含細菌核酸和蛋白質汙染物。 這些汙染物可通過用RNA酶、DNA酶和蛋白酶順序過夜處理來去除。但是，一種優選選項不 用酶催化去除汙染物，而是通過醇沉澱方法。如果需要(例如，鹼提取後)，材料在沉澱前通 常需要中和。用於沉澱汙染的核酸和/或蛋白質的醇優選低聚醇，如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙 醇、1-丁醇、2-丁醇、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-2-丙醇、二元醇等。根據經驗就可以選擇 出合適的醇，無需過多試驗，但是醇如乙醇和異丙醇(2-丙醇)是優選的，而不是醇如苯酚。醇優選添加到多糖懸液中，終濃度在10%到50%之間(例如，30%左右)。最有用 的濃度是能夠使汙染物完全沉澱而不會使多糖沉澱的濃度。醇的最佳終濃度要根據提取多 糖的細菌血清型而定，無需過多負擔只需常規試驗就可確定。在乙醇濃度超過50%時可以 觀察到多糖沉澱。添加的醇可以是純的，也可以是用易混合溶劑稀釋的形式(例如，水)。優選的 容積混合物是乙醇水混合物，優選比例在約70 30到約95 5之間(例如，75 25、 80 20,90 10)。糖類還可以用水性金屬陽離子處理。優選單價和二價金屬陽離子，二價陽離子更 優選，如Mg、Mn、Ca等，因為它們能更有效地形成複合物。鈣離子是特別優選的，因此醇混合 物優選包含可溶性的鈣離子。可以鈣鹽的形式添加到糖類/醇混合物中，以固體或水溶液 的形式。優選通過使用氯化鈣來提供鈣離子。鈣離子的優選濃度在10到500mM之間(例如，約0. 1M)。鈣離子的最佳終濃度要 根據獲取多糖的鏈球菌菌株和血清型而定，無需過多負擔只需常規試驗就可確定。汙染的蛋白質和/核酸經過醇沉澱以後溶液中只剩下莢膜多糖。通過任何合適的 方式都可以將沉澱的材料從多糖中分離出來，例如離心。上清液經過微孔過濾，特別是死端 式過濾(垂直過濾)去除可能會在下面的步驟中阻塞濾器的顆粒(例如，直徑超過0. 22ym 的沉澱顆粒)。作為死端式過濾的另一種選項，可以使用正切微孔過濾。例如，使用0.2μπι 纖維素膜進行正切微孔過濾。正切微孔過濾步驟後通常是利用0. 45/0. 2 μ m的濾器進行過 濾ο透析過濾可以使用透析過濾步驟。例如，如果方法中包括上述的醇沉澱和陽離子交換，那麼 這個步驟可在沉澱蛋白質和/或核酸後進行。同樣，如果方法中包括下述的陽離子去汙劑處理的步驟，那麼這個透析過濾步驟可在去汙劑介導的沉澱前進行。在包括利用附著濾器 進行過濾的本發明的方法中，例如，利用蛋白質附著濾器進行過濾，這個透析過濾步驟可在 該過濾之前進行。一般來說，透析過濾步驟在沉澱蛋白質和/或核酸之後以及去汙劑介導 的沉澱或使用附著濾器進行過濾，如蛋白質附著濾器，之前使用。如果使用鹼提取或磷酸二酯酶來釋放莢膜多糖，那麼透析過濾步驟尤其有優勢， 因為型特異性的糖類也可以被水解，形成比完整莢膜多糖小很多的片段。這些小片段可通 過透析過濾步驟去除。正切流過濾是典型方法。因此濾膜應該是能夠允許型-特異性抗原的水解產物通 過而保留莢膜多糖的濾膜。截留值範圍通常為10kDa-30kDa。也可以使用更小的截留值，因 為型特異性抗原的水解片段通常在IKDa左右(5聚、8聚和11聚糖)，但是更高的截留值更 有利於去除汙染物而不會導致莢膜多糖的丟失。一般要進行至少5個循環的正切流透析過濾，例如，6、7、8、9、10、11或更多個循 環。一般來說，要進行兩個循環的正切流透析過濾。在第一和第二個循環之間，第一透析 過濾循環的保留物可用乙酸/乙酸鈉溶液處理。得到的懸液通過過濾去除沉澱物，例如用 0. 45 μ m的濾膜。懸液還可以用或者再用0. 2 μ m的濾膜過濾。透析過濾之後還可以用0. 45/0. 2 μ m的濾膜進一步過濾。陽離子去汙劑處理沉澱可溶性多糖的許多技術都是本領域熟知的。可選的是，可以利用一種或多種 陽離子去汙劑沉澱糖類，儘管優選的純化實施方式不用去汙劑沉澱。用陽離子去汙劑處理 莢膜多糖和型特異性糖類的混合物會導致莢膜多糖優先沉澱，因而可以方便和有效地使型 特異性糖類的汙染達到最小化。可用於本發明工藝的特別優選的去汙劑是四丁銨和十六烷基三甲基銨硝酸鹽 (例如，氫溴酸鹽)。溴化十六烷基三甲銨(CTAB)是特別優選的(參考文獻21)。CTAB也 被稱作十六烷基三甲基銨溴化物、西曲溴銨、溴棕三甲銨和森替麥德(Centimide)。其他去 汙劑包括海美溴銨和十四烷基三甲銨鹽。去汙劑介導的沉澱步驟優選用於莢膜多糖。優選的是，可選的去汙劑沉澱步驟使用與糖類中的唾液酸殘基相互作用，例如，通 過唾液酸的羧基，的去汙劑如CTAB。因此，去汙劑優先沉澱含唾液酸的莢膜多糖，特別是混 合物中較長的糖類，這樣可以是糖類的汙染達到最小化，在較早的處理步驟中具有抗原重 要性的唾液酸可能已被破壞。再增溶當使用可選的去汙劑沉澱步驟時，多糖(通常是和陽離子去汙劑形成複合物的 形式)可以被再增溶，在水性介質或醇性介質中。對於水性再增溶作用來說，沉澱物中的 CM—陽離子通常被金屬陽離子所取代；對於醇性再增溶來說，CM—陽離子通常得以保留。選 擇水性或醇性再增溶取決於獲取多糖的GBS血清型以及該階段依然存在的汙染物。例如， 沉澱團中有時會存在色素，通過醇再增溶作用然後通過碳過濾可將其有效去除。用於再增溶的典型水性介質包含金屬陽離子。優選單價和二價陽離子，但是更優 選的是二價陽離子，如Mn、Ca等。鈣離子是特別有用的，因此再增溶優選使用鈣，通過添加 氯化鈣來提供。鈣濃度優選在10到500mM之間(例如，約0. 1M)。鈣離子的最佳終濃度要
18根據獲取多糖的鏈球菌血清型而定，無需過多負擔只需常規試驗就可確定。用於再增溶的典型醇性介質是基於乙醇製備的。可以使用沉澱核酸和/或蛋白質 所用的相同的醇，但是沉澱莢膜多糖所需的濃度通常會稍高，例如，優選醇的終濃度在70% 到95%之間(例如，70%、75%、80%、85%、90%或95%左右)。醇的最佳終濃度要根據獲 取多糖的鏈球菌血清型而定。為了達到較高的醇濃度，優選添加含水量低的醇，例如，96% 的乙醇。再增溶作用一般在室溫下進行。優選避免酸性條件，再增溶作用通常發生在PH約 為7左右。再增溶的材料相對於沉澱前的懸液來說是經過高度純化的。一種製備糖類的優選方法包括沉澱多糖，然後利用上述低聚醇增溶沉澱的多糖。 再增溶以後，多糖還需要經過進一步處理以去除汙染物。在即使是微量的汙染物也不可接受的情況下(例如，用於生產人用疫苗)，這一點 是特別重要的。通常包括一個或多個過濾步驟，例如，深度過濾，通過活性炭過濾、尺寸過濾 和/或超濾。一旦通過過濾去除汙染物以後，要將多糖沉澱以進行下一步的處理和/或加 工。通過陽離子交換可以很容易地實現(例如，通過添加鈣鹽或鈉鹽)。利用附著濾器過濾在優選實施方式中，莢膜多糖的純化還包括通過濾器過濾去除蛋白質和/或DNA 汙染物的步驟，例如，蛋白質附著濾器，蛋白質和/或DNA可粘附其上，但是莢膜多糖不會粘 附或只有弱的粘附。這種濾器的優選例子是碳濾器。合適的粘附濾器如上所述。利用附著濾器過濾以後還可利用0. 45/0. 2 μ m濾膜進行過濾。再N乙醯化再N乙醯化的步驟可在，例如，使用附著濾器過濾以後進行，或者再次過濾。如果 GBS莢膜多糖內的唾液酸殘基已經去N乙醯化，例如，在上述鹼處理期間，那麼優選進行再N 乙醯化(re-N-acetylation)。利用試劑如乙酸酐(CH3CO)2O，例如，溶於5%碳酸氫銨中，可 以很容易地完成受控的再N乙醯化[Wessels等，(1989) Infect Immun 57:1089-94]。再次透析過濾可以再進行一次透析過濾步驟，例如，再N乙醯化之後。透析過濾可按照上述「透 析過濾」部分的描述完成。透析過濾之後再用0. 45/0. 2 μ m的濾膜過濾。終產物優選的是，最後將多糖製備成乾粉末的形式，用於連接。結合物製備培養細菌並製備出莢膜多糖以後，糖類可連接到載體蛋白上。一般來說，糖類與載 體的共價連接可增強糖類的免疫原性，因為可將其從T非依賴性抗原轉化成T依賴性抗原， 從而激發免疫記憶。結合物特別適用於兒科疫苗(例如，參考文獻22)，是大家熟知的技術 (例如，參考文獻23-32的綜述)。優選的載體蛋白是細菌毒素或類毒素，如白喉類毒素或破傷風類毒素。白喉毒素 的CRM197變體(參考文獻32-34)是特別優選的載體，如白喉類毒素一樣。其他合適的載 體蛋白包括腦膜炎奈瑟菌外膜蛋白(參考文獻35)、合成肽(參考文獻36，37)、熱休克蛋白(參考文獻38，39)、百日咳蛋白(參考文獻40，41)、細胞因子(參考文獻42)、淋巴因子(參 考文獻42)、激素(參考文獻42)、生長因子(參考文獻42)、包含各種病原體來源抗原的多 個人CD4T細胞表位的人工合成蛋白(參考文獻43)如參考文獻44)、流感嗜血桿菌的 蛋白質D(參考文獻45，46)、肺炎球菌表面蛋白PspA(參考文獻47)、肺炎球菌溶血素(參 考文獻48)、離子攝取蛋白(參考文獻49)、艱難梭菌的毒素A或B (參考文獻50)、GBS蛋白 (見下文)(參考文獻51)等。與載體的連接優選通過-NH2基團，例如，載體蛋白賴氨酸殘 基或精氨酸殘基側鏈內的-NH2基團。如果糖類含有游離醛基，那麼它可以和載體內的氨基 反應通過還原胺化作用形成結合物。這種結合物可通過還原胺化作用製備，參與的基團有 糖類內氧化的半乳糖(它可以形成醛基)和載體或連接子內的氨基。連接還可以通過-SH 基團，例如，半胱氨酸殘基側鏈內的-SH基團。使用多個載體蛋白也是可能的，例如，以便於降低載體抑制的風險。因此，不同的 鏈球菌菌株或血清型可使用不同的載體蛋白，例如，GBS血清型Ia糖類可連接到CRM197上， 而血清型Ib糖類可連接到破傷風類毒素上。一個特定的糖類抗原使用多個載體蛋白也是 可能的，例如，血清型III糖類可分成兩組，其中一些連接到CRM197上，而另一些連接到破 傷風類毒素上。但是，通常優選所有糖類使用相同的載體蛋白。一個載體蛋白可攜帶多個糖類抗原(參考文獻52，53)。例如，一個載體蛋白可連 接上來自於血清型Ia和Ib的糖類。為達到此目的，在連接反應前可將不同的糖類混合在一 起。但是，通常優選每一個血清型用不同的結合物，結合以後再將不同的糖類混合在一起。 不同的結合物可包含相同的載體。包含過量蛋白(例如，1 5)和過量糖類(例如，5 1)之間的糖類蛋白比例 (w/w)的結合物是優選的。1 2到5 1之間的比例是優選的，正如1 1.25到1 2.5 之間的比例一樣。1 1到4 1之間的比例也是優選的。對於較長的糖鏈來說，通常是糖 類過量。總之，本發明提供了結合物，其中結合物包含連接到載體上的鏈球菌，優選無乳鏈 球菌的莢膜多糖基序，其中糖類載體的比例至少為2:1。 組合物可包含少量游離載體。當本發明的組合物中的給定載體蛋白既有游離的形 式也有結合的形式時，未結合形式佔組合物內載體蛋白總量的比例優選不超過5 %，優選重 量百分比低於2%。任何合適的結合反應都可以利用，如果需要時可帶有合適的連接子。在結合前糖類通常被活化或功能化。活化包括，例如，氰化試劑如CDAP(例如， 1-氰-4- 二甲基氨吡啶四氟硼酸鹽)(參考文獻54，55等)。其他合適的技術利用碳二亞 胺、醯胼、活化酯、雙環庚烷、P-硝基苯甲酸、N-羥基琥珀醯亞胺、S-NHS、EDC和TSTU (也可 參見參考文獻29的前言部分)。通過連接基團進行連接可用任何已知的方法完成，例如，參考文獻56和57所描 述的方法。一種類型的連接是通過多糖的還原胺化作用，產生的氨基與脂肪酸連接基團的 一個末端偶聯，然後將蛋白質偶聯到脂肪酸連接基團的另一個末端(參考文獻27，58，59)。 其他連接子包括B-丙醯胺基(參考文獻60)、硝基苯基-乙胺(參考文獻61)、滷代醯滷 (haloacyl halide)(參考文獻62)、糖苷鍵(參考文獻63)、6_氨基己酸(參考文獻64)、 ADH(參考文獻65)、C4到C12基序(參考文獻66)等。除了使用連接子之外，也可以直接連 接。與蛋白直接連接包括多糖氧化然後與蛋白發生還原胺化作用，例如，如參考文獻67和
2068所描述的。優選的方法是，將氨基基團引入到糖類中(例如，用-NH2取代末端=0基團)，然 後用脂肪二酯衍生化(例如，脂肪酸N-羥基琥珀醯亞胺二酯)，再和載體蛋白反應。另一種 優選的反應利用CDAP活化蛋白質D載體。結合以後，可將游離的糖類與結合的糖類分離。有許多合適的方法可用，其中包括 熟睡層析、正切超濾、透析過濾等(也可參見參考文獻69和70等)。當本發明的組合物包含解聚的寡糖時，優選在結合前完成解聚，例如，在糖類活化
、r -在一個優選的結合方法中，糖類是與脂肪酸二醯胼反應。對於血清群A來說，也可 以在這個階段添加碳二亞胺。這個反應過後添加氰基硼氫化鈉。然後製備衍生出的糖類， 例如，通過超濾。隨後衍生出的糖類與載體蛋白混合(例如，與白喉類毒素混合)，添加碳二亞胺。 反應過後回收結合物。其他步驟除了包括上述步驟以外，本發明的方法還可包括其他步驟。例如，本發明的方法可 包括從細菌中製備出莢膜多糖之後，在連接之前，解聚莢膜多糖的步驟。解聚可降低糖類的 長度，對GBS來說可能是不好的。對於鏈球菌來說，尤其是GBS，較長的糖類比較短的糖類更 具有免疫原性(參考文獻71)。結合以後，可以測定未結合載體蛋白的水平。一種測定方法是毛細管電泳(參考 文獻72)(例如，在游離溶液中)或膠束動電色譜(參考文獻73)。結合以後，可以測定未結合糖類的水平。一種測定方法是HPAEC-PAD(參考文獻 69)。結合以後，可以利用從未結合糖類中分離結合糖類的步驟。一種分離方法是利用 選擇性地沉澱一種組分的方法。優選選擇性沉澱結合的糖類，而使未結合糖類留在溶液中， 例如，通過脫氧膽酸鹽處理(參考文獻69)。結合以後，可以進行測定結合物分子大小和摩爾質量的步驟。更具體地說，可以測 定其分布。一種測定方法是分子排阻層析，利用多角光散射光密度測定法和微分折光測定 法(SEC-MALS/RI)檢測(參考文獻74)。結合物組合各個結合物可按上述方法製備，適用於任何肺炎球菌血清群。優選製備適用於血清群1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F中的一個或多個的 結合物。然後混合各種結合物以提供多價混合物。也可能混合選定數目的結合物以提供二價、三價、四價、五價、六價、七價或十一 價混合物(例如，混合 l+3+4+5+6B+7F+9V+14+18C+19F+23F、4+6B+9V+14+18C+19F+23F 或 1+4+6B+9V+14+18C+19F+23F 等)。對於GBS來說，優選製備適用於血清群la、Ib或III中的一個或多個的結合物。可以通過將結合物逐個添加到緩衝液中來混合它們。優選的溶液是磷酸鹽緩衝生 理鹽水(磷酸鈉的終濃度為IOmM)。最終混合物中每種結合物的優選濃度(以糖類計)在 1到20 μ g/ml之間，例如，5到15 μ g/ml之間，如約8 μ g/ml。可選的是，在這個階段可以添加鋁鹽佐劑(例如，Al3+的終濃度在0. 4到0. 5mg/ml之間)。混合以後，混合的結合物可通過過濾除菌。藥物組合物利用本發明的方法製備出的結合物可與藥學上可接受的載體組合。這種載體包括 其自身不會誘導產生對接受組合物的個體有害的抗體的任何載體。合適的載體通常是代謝 緩慢的較大的大分子，如蛋白質、多糖、聚乳酸、聚胺基酸、胺基酸共聚物、蔗糖、海藻糖、乳 糖和脂質凝聚物(如油滴或脂質體)。這種載體是本領域技術人員所熟知的。疫苗還可以 包含稀釋劑，如水、鹽水、甘油等。另外，敷料如增溼劑或乳化劑、PH緩衝物質等也可包含在 內。無熱原的磷酸鹽緩衝的無菌生理鹽水是典型的載體。有關藥學上可接受的賦形劑的完 整討論可參見參考文獻75。組合物可包含抗菌劑，特別是多劑量形式的包裝時。組合物可包含去汙劑，例如，吐溫(Tween (聚山梨酯))，如吐溫80 (TWEEN80 (TM))。 去汙劑的含量一般很低(例如，大於0. 01% )。組合物可包含鈉鹽以賦予張力(例如，氯化鈉)。氯化鈉的濃度一般為10士2mg/ ml ο組合物通常包含緩衝劑。一般是磷酸鹽緩衝劑。組合物可包含糖醇(例如，甘露醇)或二糖(例如，蔗糖或海藻糖)，例如，濃度為 15-30mg/ml左右(例如，25mg/ml)，特別是需要冷凍乾燥時或者包含從冷凍乾燥的材料重 構的材料時。冷凍乾燥前需將組合物的PH調整到6. 1左右以便於冷凍乾燥。結合物可與其他免疫調節劑一起用藥。更具體地說，組合物通常包含疫苗佐劑。本 發明的組合物中所用的佐劑包括而不限於A.含礦物質的組合物組合物中所包含的適合作為本發明的佐劑的礦物質包括礦物質鹽，如鋁鹽和鈣鹽 (或其混合物)。本發明包括礦物質鹽如羥化物(例如，羥基氧化物)、磷酸鹽(例如，羥基 磷酸鹽，正磷酸鹽)、硫酸鹽等(參考文獻，例如，參見參考文獻76的8和9章)，或者不同 礦物質化合物和具有合適形式的化合物(例如，凝膠、結晶的、無定形的等)的混合物，優選 吸附其上。組合物中所含的礦物質也可以是金屬鹽顆粒的形式(參考文獻77)。磷酸鋁是特別優選的，尤其是適用於包含流感嗜血桿菌糖類抗原的組合物，典型 的佐劑是無定形的羥基磷酸鋁，P04/A1摩爾比在0. 84到0. 92之間，含量為0. 6mg Al+Vml0可以用低劑量的磷酸鋁吸附，例如，50_100yg Al3+/結合物/劑量。如果組合物 中包含不止一種結合物，那麼並非所有結合物都需要被吸附。鈣鹽包括磷酸鈣(例如，參考文獻258所描述的「CAP」顆粒)。鋁鹽包括具有合適 形式(例如，凝膠、結晶的、無定形的等)羥化物、磷酸鹽、硫酸鹽等。優選吸附到這些鹽上。 組合物中所含的礦物質也可以是金屬鹽顆粒的形式(參考文獻77)。鋁鹽佐劑在下文有詳 細描述。可以使用被稱作氫氧化鋁和磷酸鋁的佐劑。這些名字是傳統叫法，只是為了方便 使用，是對實際化合物不準確的描述(例如，參見參考文獻76的9章)。本發明可以使用通 常被用作佐劑的任何「氫氧化物」或「磷酸鹽」佐劑。被稱為「氫氧化鋁」的佐劑通常是羥基氧化鋁鹽，一般來說至少有一部分是結晶
22的。羥基氧化鋁可用化學式AlO(OH)表示，通過紅外(IR)光譜檢測可以將其與其他鋁化 合物如氫氧化鋁Al (OH)3區分開來，特別是根據是否存在1070釐米-YcnT1)的吸收帶和 βΟΘΟ-βΙΟΟοπι-1處的強肩峰(參考文獻76的9章)。氫氧化鋁佐劑的結晶度可通過半高處 衍射帶寬度(WHH)反映，低結晶顆粒具有較大的譜線增寬，這是因為結晶的顆粒較小。WHH 增大表面積增大，具有較高WHH值的佐劑具有較強的抗原吸附能力。氫氧化鋁佐劑的常見 形態是纖維狀(例如，投射電鏡照片所見)。氫氧化鋁佐劑的PI —般約為11，即，在生理PH 條件下佐劑自身帶表面正電荷。據報導，PH為7. 4時氫氧化鋁佐劑的吸附能力在1. 8-2. 6mg 蛋白質/mgAl+++之間。被稱為「磷酸鋁」的佐劑一般是羥基磷酸鋁，通常還包含少量硫酸鹽(即，羥基磷 酸硫酸鋁)。通過沉澱可以獲得，沉澱期間的反應條件和濃度會影響鹽中磷酸基取代羥基的 程度。羥基磷酸鹽的Ρ04/ΑΙ摩爾比一般在0.3到1.2之間。根據是否存在羥基可以將羥 基磷酸鹽與純的AlPO4區分開來。例如，3164CHT1處存在IR帶(例如，當加熱到200°C時) 說明存在結構羥基[參考文獻76的9章]。磷酸鋁佐劑的P04/A13+摩爾比一般在0. 3到1. 2之間，優選在0. 8到1. 2之間，更 優選的是0.95+0. 1。磷酸鋁通常是無定形的，特別是羥基磷酸鹽。典型的佐劑是P04/A1摩 爾比在0. 84到0. 92之間的無定形羥基磷酸鋁，含量為0. BmgAl3VmI0磷酸鋁一般呈顆粒 狀(例如，透視電鏡照片可見板塊狀形態)。吸附抗原以後顆粒的直徑一般在0. 5-20μπι之 間(例如，約5-10 μ m)。據報導，pH為7. 4時磷酸鋁佐劑的吸附能力在0. 7-1. 5mg蛋白質 /mgAl+++之間。磷酸鋁的零電荷點(PZC)與磷酸基取代羥基的程度成負相關，通過沉澱來製備鹽 時所用的反應條件和反應物的濃度決定了取代的程度。改變溶液中游離磷酸鹽離子的濃度 (更多磷酸鹽=更酸性的PZC)或通過添加緩衝劑如組氨酸緩衝劑(是PZC變得更鹼性)可 改變PZC。本發明所用的磷酸鋁的PZC —般在4. 0到7. 0之間，更優選的是5. 0到6. 5之 間，如約5. 7。用於製備發明的組合物的鋁鹽懸液可包含緩衝劑(例如，磷酸鹽或組氨酸或氨丁 三醇緩衝劑)，但這不是必須的。懸液優選無菌無熱原。懸液可包含游離水性磷酸鹽離子， 例如，濃度在1. 0到20mM之間，優選5到15mM，更優選的是約10mM。懸液也可包含氯化鈉。本發明可使用氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物，如達隆瑞克斯TM(DAR0NRIX )。在這 個例子中，磷酸鋁的含量高於氫氧化鋁，例如，重量比至少為2 1，如>5 1、>6 1、> 7 1、> 8 1、> 9 1 等。可用於患者的組合物中Al+++濃度優選低於10mg/ml，例如< 5mg/ml、< 4mg/ml、 < 3mg/ml、< 2mg/ml、 and Saponaria officianalis (soaproot)白勺！？！品。gHi^^ 製劑包括純化的製劑如QS21，以及脂質佐劑如ISC0M。QS21的商品名是STIMULON(TM)。利用HPLC和RP-HIPLC已經純化出了皂苷組合物。利用這些技術純化出的特殊組 分經過了鑑定，其中包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH_A、QH-B和QH-C。優選的皂苷是QS21。 參考文獻79描述了 QS21的製備方法。皂苷製劑還可包含固醇，如膽固醇(參考文獻80)。可利用皂苷和膽固醇的組合物製成被稱為免疫刺激複合物(ISCOM)的 獨特顆粒(參考文獻76的23章)。ISCOM通常還包含磷脂，如磷脂醯乙醇胺或 phosphatidyiclioline。任何已知的皂苷都可用於ISC0M。優選的是，ISCOM包含QuilA、 QHA和QHC中的一種或多種。ISCOM在參考文獻80-82中有進一步的描述。可選的是，ISCOM 可不含其他去汙劑(參考文獻83)。有關開發以皂苷為基礎的佐劑的綜述可參見參考文獻84和85。D.病毒體和病毒樣顆粒病毒體和病毒樣顆粒(VLP)也可用作本發明的佐劑。這些結構通常包含來自於病 毒的一種或多種蛋白質，可選的是與磷脂組合或製成製劑。它們通常都是非致病性的非復 制型的，一般不含任何天然病毒基因。病毒蛋白可通過重組製備，或者從完整病毒中分離。 適用於病毒體或VLP的這些病毒蛋白包括來自於流感病毒的蛋白(如HA或NA)、來自於乙 型肝炎病毒的蛋白(如核蛋白或衣殼蛋白)、來自於戊型肝炎病毒、麻疹病毒、辛德畢斯病 毒、輪狀病毒、手足口病病毒、逆轉錄病毒、諾沃克病毒、人乳頭狀瘤病毒、HIV, RNA噬菌體、 Q^-噬菌體(如包膜蛋白)、GA-噬菌體、fr-噬菌體、AP205噬菌體和Ty (如逆轉錄轉座子 Ty蛋白pi)的蛋白。VLP在參考文獻86-91中有進一步的討論。病毒體在參考文獻92中 有進一步的討論。E.細菌或微生物衍生物適用於本發明的佐劑包括細菌或微生物衍生物，如腸道細菌脂多糖(LPS)的非毒 性衍生物、脂質A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP核糖基化毒素及其脫毒衍生物。LPS的非毒性衍生物包括單磷醯脂質A (MPL)和3_0_去醯化MPL (3dMPL)。3dMPL 是帶有4、5或6乙醯化側鏈的3去-0-乙醯化單磷醯脂質A的混合物。優選的「小顆粒」 形式的3去-0-乙醯化單磷醯脂質A在參考文獻93中有描述。這種「小顆粒」的3dMPL要 足夠小以便於能夠用0. 22 μ m的膜過濾除菌(參考文獻93)。其他非毒性LPS衍生物包括 單磷醯脂質A模擬物，如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸鹽衍生物，例如RC-529 (參考文獻94， 95)。脂質A衍生物包括大腸桿菌脂質A的衍生物，如0M-174。0M-174在參考文獻96 和97中有描述。適合作為本發明的佐劑的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(包含一個非甲 基化胞嘧啶以及一個由磷酸鍵連接起來的鳥嘌呤)的核苷酸序列。包含重複或聚(dG)序列的雙鏈RNA和寡核苷酸也顯示具有免疫刺激性。CpG可包含核苷酸修飾/類似物，如磷硫醯修飾，可以是雙鏈的，也可以是單鏈的。 參考文獻98、99和100公開了可能的類似物取代，例如，用2』 -脫氧-7-脫氮鳥苷取代鳥 苷。CpG寡核苷酸的佐劑效應在參考文獻101-106中有進一步的討論。CpG序列可靶向到TLR9，如基序GTCGTT或TTCGTT (參考文獻107)。CpG序列可特 異性地誘導Thl免疫反應，如CpG-A 0DN,它也可以更特異性地誘導B細胞反應，如CpG-B ODN0參考文獻108-110有關於CpG-A和CpG-BODN的討論。優選的CpG是CpG_A0DN。優選的是構建CpG，這樣5』末端易於被受體識別。可選的是，兩個CpG寡核苷酸序 列以其3』末端相連形成「免疫聚合物」。參見，例如，參考文獻107和111-113。因此，細菌ADP核糖基化毒素及其脫毒衍生物可用作本發明的佐劑。優選的蛋白 來源於大腸桿菌(大腸桿菌不耐熱腸毒素「LT」)、霍亂(「CT」)或百日咳(「PT」)。使用 脫毒的ADP-核糖基化毒素作為黏膜佐劑可參見參考文獻114，作為胃腸外佐劑可參見參考 文獻115。毒素或類毒素優選全毒素的形式，包含A和B亞單位。優選的是，A亞單位包含 脫毒突變；優選的B亞單位是非突變的。優選的佐劑是脫毒的LT變體，如LT-K63、LT-R72 和LT-G192。利用ADP核糖基化毒素及其脫毒衍生物，特別是LT-K63和LT-R72，作為佐劑 可參見參考文獻116-123。胺基酸取代的數字編碼優選根據ADP核糖基化毒素A和B亞單 位的比對而定，如參考文獻124所述，本文已完整納入作為參考。F.人免疫調節劑適於作為本發明的佐劑的人免疫調節劑包括細胞因子，如白細胞介素(例如， 11^-1、11^-2、11^-4、11^-5、11^-6、11^-7、11^-12(參考文獻 125)等)(參考文獻 126)、幹擾素(幹 擾素-Y )、巨噬細胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子。優選的免疫調節劑是IL-12。G.生物粘附劑和黏膜粘附劑生物粘附劑和黏膜粘附劑也可用作本發明的佐劑。合適的生物粘附劑包括酯化的 透明質酸微球(參考文獻127)或黏膜粘附劑如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、 多糖和羧甲基纖維素的交聯衍生物。殼聚糖及其衍生物也可用作本發明的佐劑(參考文獻 128)。H.微粒微粒也可用作本發明的佐劑。優選的是由生物可講解的和非毒性的材料(例如， 聚(α-羥酸)、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚酸酐(polyarthydride)、聚己酸內酯等)形成的 包含聚(丙交酯-共_乙交酯)的微粒(即，直徑為約IOOnm到約150 μ m的顆粒，更優選 的是直徑為約200nm到約33 μ m,最優選的是直徑為約500nm到約10 μ m)，可選的是進行處 理使其具有帶負電荷的表面(例如，用SDS處理)或帶正電荷的表面(例如，用陽離子去汙 劑處理，如CTAB)。I.脂質體(參考文獻76的13和14章)適於作為佐劑的脂質體製劑的例子可見於參考文獻129-131的描述。J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯製劑適用於本發明的佐劑包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯(參考文獻132)。這種製劑 還包括聚氧乙烯山梨坦酯和辛苯昔醇的組合物(參考文獻133)以及聚氧乙烯烷基醚或酯 表面活性劑與至少一種其他非離子表面活性劑如辛苯昔醇的組合物(參考文獻134)。優
25選的聚氧乙烯醚選自如下一組聚氧乙烯-9-十二烷基醚(聚乙二醇單十二醚9)、聚氧乙 烯-9-硬脂醯醚、聚氧乙烯-8-硬脂醯醚、聚氧乙烯-4-十二烷基醚、聚氧乙烯-35-十二烷 基醚和聚氧乙烯-23-十二烷基醚。K.聚膦腈(PCPP)PCPP製劑在參考文獻135和136中有描述。L.胞壁醯肽適合作為本發明的佐劑的胞壁醯肽的例子包括N-乙醯胞壁醯-L-蘇氨醯-D-異 谷醯胺(thr-MDP)、N-乙醯胞壁醯-L-丙氨醯-D-異谷醯胺(nor-MDP)和N-乙醯胞壁 醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯-L-丙氨酸-2-(1』 -2』 - 二棕櫚醯-sn-甘油_3_羥基磷醯氧 基)-乙胺(MTP-PE)。M.咪唑並喹諾酮化合物適合作為本發明佐劑的咪唑並喹諾酮化合物的例子包括IMIQUAMOD(TM)及其類 似物(例如，RESIQUIMOD 3M(TM)，參考文獻137和138有進一步的描述。本發明還包括上述一種或多種佐劑的組合。例如，下列佐劑組合物可用於本發明 (1)皂苷和水包油乳劑(參考文獻139) ； (2)皂苷(例如，QS21) +非毒性LPS衍生物(例 如，3dMPL)(參考文獻140) ； (3)皂苷(例如，QS21)+非毒性LPS衍生物(例如，3dMPL) + 膽固醇；⑷皂苷(例如，QS21)+3dMPL+IL-12(可選的+固醇)(參考文獻141) ； (5) 3dMPL 與，例如，QS21和/或水包油乳劑的組合(參考文獻142) ； (6)SAF，其中包含10%角鯊烷、 0. 4%吐溫SO(TM)、5%普流尼克嵌段聚合物L121和thr_MDP，微流化成亞微米乳劑或振蕩 製成大顆粒乳劑；(7) RIBI (TM)佐劑系統(RAS)，(Ribi免疫化學(Ribi Immunochem))，其中 包含2%角鯊烯，0. 2吐溫SO(TM)和一種或多種選自如下一組的細菌細胞壁成分單磷醯脂 質A (MPL)海藻糖二黴菌酸酯(TDM)和細胞壁骨架(CWS)；優選MPL+CWS (DETOX (TM))；以及 (8) 一種或多種礦物質鹽(如鋁鹽)+LPS的非毒性衍生物(如3dMPL)。參考文獻76的7章描述了可作為免疫刺激劑的其他物質。優選使用氫氧化鋁和/或磷酸鋁佐劑，抗原通常吸附在這些鹽上。磷酸鈣是另一 種優選佐劑。組合物可以是無菌和/或無熱原的。組合物可以是人體等滲的。組合物可盛裝在小瓶中，或者包裝在預裝注射器內。注射器可帶或不帶針頭。注 射器內可盛裝單次劑量的組合物，而小瓶內可盛裝單次劑量的或多次劑量的組合物。可注 射的組合物通常是液體或懸液。另外，也可以是固體形式的(例如，凍幹的)，在注射前用液 體載體製備成溶液或懸液。組合物可以單位劑量或多次劑量的形式包裝。如果是多次劑量的形式，小瓶優選 預裝注射器。根據常規方法就可確定有效的給藥體積，但是人用注射組合物的體積一般為 0. 5ml。如果組合物需要在使用前製備(例如，凍幹形式的組分)，以試劑盒的形式提供， 那麼試劑盒可包含兩個小瓶，或者包含一個預裝注射器和一個小瓶，其中注射器的內容物 用於在注射前溶解小瓶的內容物。可用作疫苗的免疫原性組合物包含免疫有效量的抗原以及所需的任何其他組分。 免疫有效量是指當給予個體該劑量時，無論是作為單次劑量還是作為一系列劑量的一部
26分，都可以起到有效治療或預防的作用。這種劑量因需要治療的個體的健康和物理狀況、年 齡、被治療個體的種群(例如，非人靈長類、靈長類等)、個體免疫系統合成抗體的能力、相 應達到的保護程度、疫苗的劑型、醫生對醫療狀況的評估以及其他因素的不同而不同。據估 計該劑量的範圍應該比較寬，通過常規試驗可以確定，每種鏈球菌結合物的量通常在Iyg 到20 μ g之間(以糖類計)。因此，本發明提供了製備藥物組合物的方法，該方法包括步驟(a)按照上述方法 製備結合物；(b)結合物與一種或多種藥學上可接受的載體混合。本發明還提供了製備藥學產品的方法，該方法包括步驟(a)按照上述方法製備 結合物；(b)結合物與一種或多種藥學上可接受的載體混合；以及(c)將結合物/載體混合 物包裝到容器內，如小瓶或注射器，從而得到藥學產品。插入到注射器內可在工廠或外科完 成。本發明還提供了利用糖類-蛋白質結合物製備藥學組合物的方法，該方法包括結 合物與藥學上可接受的載體混合物的步驟，其中結合物是通過上述處理結合物的方法製備 的。結合方法和混合步驟可由不同的人在不同的地點(例如，在不同的國家)不同的時間 完成。本發明還提供了將糖類-蛋白質結合物包裝成藥學產品的方法，其中結合物是通 過上述處理結合物的方法製備的。結合方法和包裝步驟可由不同的人在不同的地點(例 如，在不同的國家)不同的時間完成。藥物用途本發明還提供了治療患者的方法，該方法包括將組合物給予患者。患者可能是自 身有患病的風險，或者是孕婦(母源免疫)。患者優選人。人可以是任何年齡的，例如，2歲 以內、2-11歲、11-55歲、55歲以上等。本發明還提供了用於治療的組合物。本發明還提供了組合物在製造用於治療疾病 的藥物中的用途。優選的疾病是流感或肺炎。組合物通常直接給予患者。直接給藥可通過胃腸外途徑(例如，經皮注射、皮下注 射、腹膜內注射、靜脈注射、肌肉注射或注射到組織的細胞間隙內)或通過直腸內、口服、陰 道內、眼內、真皮內、鼻內、眼內、耳內、肺內或其他粘附給藥途徑完成。肌肉注射(例如，注 射到大腿或上臂)是優選的。注射可通過針頭(例如，皮下針頭)完成，或者也可以通過無 針注射。肌肉注射劑量一般為0.5ml。本發明可用於激發系統和/或黏膜免疫。劑量療法可以是單次劑量方案或多次劑量方案。多次劑量方案用於初始免疫和/ 或加強免疫。初始劑量方案之後可以用加強劑量方案。通過常規途徑可以確定初次劑量之 間的時間間隔(例如，4-16周之間)和初始免疫與加強免疫之間的時間間隔。細菌感染可影響身體的各個區域，因此組合物可製成各種形式。例如，組合物可制 成可注射形式的溶液或懸液。也可以製備成適於在注射前用液體載體製成溶液或懸液的固 體形式(例如，凍幹組合物)。組合物可製備成用於局部給藥的劑型，例如，軟膏、乳膏或粉 末。組合物也可以製備成用於口服給藥的劑型，如片劑或膠囊，或者糖漿(可選的是添加調 味劑)。組合物可製備成用於肺內給藥的劑型，如吸入劑，使用細粉末或噴霧。組合物可制 備成栓劑或子宮套。
組合物可製備成適於鼻內、耳內或眼內給藥的劑型，如噴霧、滴劑、凝膠或粉末 (參考文獻143和144)。優選可注射的組合物。本發明組合物中的其他抗原性組分本發明的方法還包括鏈球菌結合物與下列一種或多種其他抗原混合的步驟-B型嗜血流感菌的糖類抗原(例如，參考文獻145的14章)。-腦膜炎球菌B血清群的純化蛋白抗原。-腦膜炎球菌B血清群的外膜製備物。-A型肝炎病毒的抗原，如滅活病毒(例如，46，147)。-B型肝炎病毒的抗原，如表面和/或核心抗原(例如，147，148)。-白喉抗原，如白喉類毒素(例如，參考文獻145的13章)。-破傷風抗原，如破傷風類毒素(例如，參考文獻145的27章)。-百日咳博得特菌的抗原，如百日咳博得特菌的百日咳全毒素(PT)和絲狀血凝素 (FHA)，可選的是與百日咳桿菌粘附素和/或凝集原2和3組合(例如，參考文獻149和150 ； 參考文獻145的21章)-脊髓灰質炎抗原(例如，151，152)，如IPV(參考文獻145的24章)。-麻疹、腮腺炎和/或風疹抗原(例如，參考文獻145的19、20和26章)。-流感抗原(例如，參考文獻145的17章)，如血凝素和/或神經醯胺酶表面蛋白。-黏膜炎莫拉菌的抗原(例如，153)。-無乳鏈球菌的蛋白抗原(B型鏈球菌)(例如，154，155)。-釀膿鏈球菌的抗原(A型鏈球菌)(例如，155，156，157)。-金黃色葡萄球菌的抗原(例如，158)。組合物可包含這些抗原中的一種或多種。如果需要時可使毒性蛋白抗原脫毒(例如，通過化學和/或基因方法使百日咳毒 素脫毒(參考文獻150))。如果組合物中包含白喉抗原，那麼優選的是組合物還包含破傷風抗原和百日咳抗 原。同樣，如果組合物中包含破傷風抗原，那麼優選的是組合物還包含白喉抗原和百日咳抗 原。同樣，如果組合物中包含百日咳抗原，那麼優選的是組合物還包含破傷風抗原和白喉抗 原。因此，DTP組合物是優選的。組合物中抗原的濃度一般至少為每種lg/ml。總之，任何給定的抗原的濃度都要足 以激發抗該抗原的免疫反應。除了在本發明的免疫原性組合物中使用蛋白質抗原以外，也可以使用編碼抗原的 核酸(優選DNA，例如，以質粒的形式)。 抗原優選吸附在鋁鹽上。組合物中所包含的優選非鏈球菌抗原是那些能產生抗B型流感嗜血桿菌(Hib)保 護作用的抗原；通常為Hib莢膜多糖抗原。B型流感嗜血桿菌的糖類抗原是大家熟知的。優選的是，Hib糖類共價結合到載體蛋白上以增強其免疫原性，尤其是用於兒童 時。多糖結合物的總體製備方法，特別是Hib莢膜多糖的詳細製備方法已有詳細描述。本發明可以使用任何合適的Hib結合物。合適的載體蛋白在上文已有描述，Rib 糖類的優選載體是CRM 197 (HbOC)、破傷風類毒素(PRP-T)和腦膜炎球菌的外膜複合物(PRP-OMP)。結合物的糖類基序可以是多糖(例如，全長磷酸多核糖基核糖醇(PRP))，但是優 選使多糖水解成寡糖(例如，MW在約1到5kDa之間)。優選的結合物包含通過脂肪酸連接子與CRM197共價連接的Hib寡糖(參考文獻 159，160)。破傷風類毒素也是優選的載體。優選的是，Hib抗原的給藥可以產生濃度超過0. 15 μ g/ml的抗-PRP抗體，更優選 的是 lyg/ml。如果組合物包含Hib糖類抗原，那麼優選的是不包含氫氧化鋁佐劑。如果組合物 包含磷酸鋁佐劑，那麼Hib抗原可吸附在佐劑上(參考文獻161)，也可以是非吸附的(參考 文獻162)。防止吸附可通過在抗原/佐劑混合期間選擇正確的PH、選擇合適的零電荷點和 組合物中各種不同抗原的合適混合順序來達到(參考文獻163)。本發明的組合物可包含不止一種Hib抗原。Hib抗原可以是凍幹的，例如，用於腦 膜炎球菌的重建。因此，Hib抗原可以和腦膜炎結合物分開包裝，或者混合在一起。本發明的組合物中所包含的其他非鏈球菌抗原是那些來源於性傳播疾病(STD) 的抗原。這些抗原可用於預防或治療STD，如衣原體、生殖器皰疹、肝炎(如HCV)、生殖器疣、 淋病、梅毒和/或軟下疳(參考文獻164)。抗原可來源於一種或多種病毒或細菌性STD。可 用於本發明的病毒STD抗原可來源於，例如，HIV、單純皰疹病毒(HSV-1和HSV-2)、人乳頭 瘤病毒(HPV)和/或肝炎病毒(HCV)。可用於本發明的細菌性STD抗原可來源於，例如，淋 球菌、沙眼衣原體、蒼白密螺旋體、杜克雷嗜血桿菌或大腸桿菌。除非另外說明，利用分子生物學、重組DNA和免疫學的常規技術可以實現本 發明，這些技術是本領域的技術人員熟知的。這些技術在文獻中有詳細描述。參見， 例如，((DNA克隆》(DNA Cloning)，I和II卷(D. N Glover編輯，1985)；《寡核苷酸合 成》(Oligonucleotide Synthesis) (MT Gait 編輯，1984)；《核酸雜交》(Nucleic Acid Hybridization) (B. D. Hames 和 ST Higgins 編輯，1984)；《轉錄和翻譯》(Transcription and Translation) (B. D. Hames 和 ST Higgins 編輯，1984)；《動物細胞培養》(Animal Cell Culture) (R. I. Freshney 編輯，1986)；《固定化細胞和酶》(Immobilized Cells and Enzymes) (IRL 出版社，1986) ；B. Perbal，《分子克隆實用指南》(A Practical Guide to Molecular Cloning) (1984)；胃歹[J^t去》(the Methods in Enzymology series) ( ψ 術出版社有限公司(Academic Press, Inc.))，特別是154和155卷；《哺乳動物基因轉移 載體》(GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells) (J. H. Miller 禾口 Μ· P. Calos 編輯， l987，冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory)) ；Mayer 和 Walker 編輯 (1987)，《細胞和分子生物學中的免疫化學方法》(Immunochemical Methods inCell and Molecular Biology)(倫敦學術出版社(Academic Press, London)) ；Scopes, (1987)，《蛋 白質純化原理與實踐》(Protein Purification principles andPractice)，第 2 版(紐 約斯普瑞英格-佛拉格出版社(Springer-Verlag，N. Y.)；《實驗免疫學手冊》(Handbook of Experimental Immunology)第 I-IV 卷(D. Μ. Weir 和 C. C. Blackwell 編輯，1986)；《雷 明頓藥物學》(Remington' s PharmaceuticalSciences)，濱州伊斯頓馬克出版公司(Mack Publishing Company，Easton，Pa.)，第 19 版(1995)；《酶學方法》(Methods In Enzymology) (S. Colowick和N. Kaplan編輯，學術出版有限公司(Academic Press, Inc.)；《實驗免疫學
29手冊》(Handbookof Experimental Immunology)第 I-IV 卷(D. M. Weir 和 C. C. Blackwell 編輯，1986，布萊克韋爾科學出版社(Blackwell Scientific Publications) ；Sambrook等， 《分子克隆實驗室手冊》(Molecular Cloning =A Laboratory Manual)(第2版，1989)；《表 面和膠體化學手冊》(Handbook of Surface and ColloidalChemistry) (Birdi,K. S.編輯， CRC 出版社(CRC Press), 1997)；《分子生物學簡明方法》(Short Protocols in Molecular Biology)，第4版，(Ausubel等編輯，1999，約翰威利父子出版公司(John Wiley & Sons))； 《分子生物學技術實驗室重點課程》(Molecular Biology Techniques =An Intensive Laboratory Course) (Ream 等編輯，1998，學術出版社(Academic Press))；《PCR》(生物 技術系列叢書引言)(PCR{Introduction to Biotechniques Series)，第 2 版，(Newton 和Graham編輯，1997，斯普瑞英格_佛拉格出版社(Springer-Verlag))；以及Peters和 Dalrymple，《區域病毒學》(Fields Virology)(第 2 版)，Fields 等(編輯)，紐約 B. N. Raven 出版社(B. N. Raven Press, New York, NY)。本說明書使用了核苷酸和胺基酸的標準縮寫。本文所引用的所有出版物、專利和專利申請都已完整納入本文作為參考。 實施例為了闡明本文的方法，我們研究了分離自GBS病患者的無乳鏈球菌090、H36b、 M781和CBJ111，這些菌株可產生四種有代表性的血清型(la、lb、III和V)。實施例1-5升和20升發酵A)接種物製備工藝的開發三種GBS血清型菌株的生長試驗在包含IOOOml接種培養物的5000ml無檔板搖瓶 中進行，培養物中包含:8g/L 二水Na2HPO4(默克)、2g/L —水Na2HPO4(默克)、17g/L酵母 自溶提取物(迪菲克實驗室(Difco laboratories) )、lmg/L生物素(默克)和33g/L—水 D-葡萄糖(默克)。所有化合物都溶解到反滲水(ROW)中，通過0.22 μ m孔徑的濾膜(奈 爾基因公司(Nalgene))過濾除菌，然後通過無菌操作添加到5000ml錐形瓶中，燒瓶經過 1220C 30分鐘高壓滅菌處理。對於每一個系列的搖瓶試驗來說，用不同體積的解凍培養物(工作種子菌儲存在 10%的甘油中，-70°c保存)接種培養基(PH= 7. 3)，在35°C的水平搖床櫃(Irmova 4330， 偏心圓1英寸)上以200rpm振蕩培養。在培養的不同時間點測定590nm處的光密度值(novaspecll分光光度計-法瑪西 亞生物技術公司(Pharmacia Biotech)，在光密度值大於或等於0. 5時還要監測pH值(pH 計，麥氏公司(Metrohm))。指數生長期的倍增時間通過生長曲線線性部分的回歸分析確定。 曲線的斜率對應於最大比生長速率ymax，倍增時間(td)用公式td= 1η2/μ計算。B) 5升和20升發酵罐的準備在裝填容器和培養基滅菌前應用標準方法校正發酵裝置(pH電極和ρ02表)。由於GBS是營養缺陷型微生物，因此它不能合成特殊有機化合物，如胺基酸和維 生素，這些化合物是其生長所必須的。因此，已經開發出了一種低成本的不含動物源組分的 複合培養基，如W007/052168所述。用於生產多糖的基礎培養基包含2g/L 二水Na2HPO4 (默克)、16. 7g/L酵母自溶提取物(迪菲克實驗室)、32g/L —水D-葡萄糖(默克)、lmg/L生物素(默克)、0· 5mg/L鹽 酸硫胺素(BDH 實驗室(BDH Laboratories))、0. 5mg/L 核黃素(佛盧卡(Fluka))、0. 5mg/L 煙酸(卡爾埃爾巴(Carlo Erba))、0. 5mg/L鹽酸吡哆醇(西格瑪(Sigma))和防止泡沫形 成的lml/L聚乙烯甘油(BDH實驗室)。由於空培養罐無法滅菌，因此用磷酸鹽、酵母提取物和聚乙烯甘油(7L的發酵罐 加入4. 2L，30L的發酵罐加入16L)填充發酵罐，在121°C原位滅菌30分鐘。在滅菌期間會 有一些液體蒸發掉。根據經驗判斷培養基的高度可以評估出因蒸發而損失的液體量，在滅 菌前多加一些水(7L的發酵罐多加0. 5L，30L的發酵罐多加1L)。同時用ROW溶解一水D-葡萄糖(550g/L)和維生素(鹽酸硫胺素、煙酸和鹽酸吡 哆醇各0. 5g/L，核黃素0. 05g/L,生物素0. 2g/L)的濃縮液，通過0. 22 μ m孔徑的濾膜(奈 爾基因公司)分別過濾除菌，通過無菌操作加到發酵罐內，形成最終的濃度(對於7L的發 酵罐來說300mL —水D-葡萄糖、25mL生物素、5mL維生素溶液(鹽酸硫胺素、煙酸和鹽酸 吡哆醇)和50mL核黃素；對於30L的發酵罐來說1000mL —水D-葡萄糖、IOOmL生物素、 17mL維生素溶液(鹽酸硫胺素、煙酸和鹽酸吡哆醇)和170mL核黃素)。C) 5L和20L發酵罐的培養GBS表達的cps與其他包膜細菌致病原一樣不是組成型的，而是在體外生長期間 不斷變化的，分離自不同感染位點的原始培養物的表達也是不同的(參考文獻173)。儘管 有這種現象，但是對GBS的這種表面表達的糖類抗原的調節知之甚少。據報導連續培養物 中的細胞生長速率是調節莢膜多糖產生的主要因素，III型莢膜多糖生長速率依賴性的合 成不依賴於生長限速營養物。實際上，當細胞維持的較快的質量倍增時間(1. 4小時-1OT1)) 時比較慢的生長速率(IltT1)時的cps產率更高(參考文獻174)。在開始的時候，所有有關GBS的研究都是通過分批培養使細胞生長，其特徵是生 長速率、營養物濃度和PH都是變化的。分批培養的細胞所經歷的生長參數改變會導致代謝 產生變化，進而影響細胞的組成。連續培養可以使細胞在穩定的底物、產物和生物質濃度的 環境中以及由研究者控制的速率下達到連續指數生長。如果能夠維持生長速率條件就可以 達到穩定狀態。但是，對於工業生產來說應避免連續培養，因為這容易產生穩定性的問題和 汙染，以製造規模來生產也是很昂貴的，因為需要連續進料培養基和營養物。5L和20L規模的培養分別在Biostat CT5-2和C20-3反應器(BB國際生物技術 公司(B. Braun Biotech International))，其總體分別為6. 9L和31L。生物反應器分別裝 配有2個和3個攪拌子，每一個攪拌子有6個葉片。另外，還有測定溶氧濃度(Inpro 6500 系列2氧傳感器；MT公司(Mettler Toledo))、pH(Pa/2模式；MT公司)、溫度(ptlOO電極， MKJ公司(M. K. Juchleim GmbH))、泡沫(L300/Rd. 28模式；BB國際生物技術公司)所用的 可蒸汽滅菌的探針接口。操作由DCU-3數字控制單位和MFCs/win軟體包聯合控制和記錄 (BB國際生物技術公司)。排出生物反應器的廢氣內的二氧化碳和氧濃度由1310發酵罐監 測器(Irmova)和GMUX-8分析儀(BB國際生物技術公司)監測。培養在如下條件下進行36°C 士 1°C，0. 2巴的壓力，培養基中p02 = 30士 10%飽和 度，通過轉速調節，7L發酵罐的轉速在100 士 10 %到700 士 10 % rpm之間，30L發酵罐的轉速 在50士 10%到500士 10% rpm之間，換氣速率為0. 1和1. Ον/ν/m士 10%。培養基的pH維持 在7. 3士0. 2，通過可控的添加4M氫氧化鈉自動調節。各種參數如溫度、ph和攪拌的監測和
31控制由PID控制單位執行。用消泡劑乳劑(BDH實驗室)自動控制泡沫。IOOOmL無菌接種培養基用合適體積的待測菌株工作種子液接種，在35°C下孵育 一個理想的時期，利用旋轉搖床振蕩。當接種物燒瓶內的培養物達到指數生長中期(0D在 0.8到1.2之間)時，利用足量的這種培養物接種新鮮批培養基(4. 7L或17L)，得到的初始 OD 為 0. 032。發酵的批相可持續到培養物OD59tlnm達到2.5 (士0.5)時。當培養物達到或接近這 個OD值時，開始添加第一指數分批進料的酵母提取物培養基(150g/L)，繼續培養45-50分 鍾以維持比生長速率(P)在0. 1381Γ1。在第一部分結束時，OD達到4. 5 士 0.5，此時開始添 加第二指數分批進料的酵母提取物培養基(150g/L)，維持μ等於0. 9241Γ1，繼續培養45-50 分鐘。這些進料相可使細菌的倍增時間從20-25分鐘，通常批相是這種長度，延長到45分 鍾，這樣可以使微生物適應多糖合成的理想條件。最後，為了提高生產力，在第二次添加酵 母提取物結束時，即OD達到10. 0士2，通過ρΗ調節的進料方式添加濃縮的一水D-葡萄糖 (550g/L)，持續3小時，繼續培養，以避免底物完全耗竭，底物完全耗竭的結果是色素產生 和莢膜多糖產量減少。在發酵過程中以一定的時間間隔從培養物液體中取50mL少量樣品，用於分析細 菌的生長、葡萄糖消耗以及多糖產生情況。D) GBS的收穫和滅活當生長速率持續下降時收穫培養物，一般發生在ρΗ控制的葡萄糖相開始後的3小 時。培養物立刻在室溫下離心，7741xg離心45分鐘(AvantiTM離心機J-20XPI，貝克曼庫 爾特(Beckmam coulter)).棄去上清，儲存在_20°C用於葡萄糖分析，測定收穫物的重量。純化GBS多糖首先需要滅活和水解cps。將IM的氫氧化鈉加入到細胞團內，終濃 度為0. 8M。反應混合物在37°C孵育36小時，並且以120rpm的速度振蕩，任何測定血清型 特異性的cps的含量。E)發酵罐清洗收穫培養物以後，需要清洗髮酵罐和輔助裝置。首先在發酵罐內加上ROW，通過人 工添加4M的氫氧化鈉將ρΗ提高到12。通過將水加熱到80°C，維持30分鐘完成清潔，壓力 維持在0.2巴，200rpm攪拌以確保熱量均勻分散。完成清潔後，收穫含氫氧化鈉的水，發酵 罐用ROW清洗直到ρΗ值下降到5-7的範圍內。一般來說，要達到理想的ρΗ需要清洗三次。 清空發酵罐，從各自接口上取下探針和輔助裝置。用於接種的帶隔膜的接插件和用於添加 營養物和校正試劑的帶隔膜的接插件以及用去收穫和儲存樣品的瓶子分別滅菌，在122°C 高壓滅菌30分鐘。發酵罐在填充上ROW，121°C滅菌30分鐘。實施例2-2L發酵菌株和培養基無乳鏈球菌III型菌株M781最初是從患GBS腦膜炎的新生兒體內分離出來的，由 Carol J.Baker提供。菌株M781的細胞用經過調整的化學成分確定培養基培養，這種培養 基最初是為A型鏈球菌開發的(參考文獻174)。用於分批培養試驗的化學成分確定培養基 的成分列在表1中。表1 化學成分確定培養基成分批相 利用標準溶液(pH值=7和4)通過兩點校正方法校正pH探針。將p02和pH探 針安裝到培養罐上。將葡萄糖加入到發酵罐(Applikon 3L)內，122°C高壓滅菌30分鐘。 所有其他化合物分別通過0. 22 μ m孔徑的濾膜過濾除菌，然後通過無菌操作添加到發酵罐 內。為了避免培養基出現沉澱，準備濃縮溶液(20x磷酸鹽、IOOx硫酸鹽、50x鈉鹽、240x含 氮鹼基、9000x維生素、35x胺基酸水溶液和90x胺基酸氫氧化鈉溶液)，以合適的體積按照 如下順序添加到碳源內，得到希望的終濃度磷酸鹽、胺基酸、維生素、硫酸鹽和含氮鹼基。當添加完所有添加物後，校正PO2探針。發酵罐充氮氣過夜後的PO2為0。培養基氧飽和以 後，開始運行條件時電極的斜率校正到100%。B) 2L規模的培養菌株M781表達莢膜多糖的預實驗通過分批培養進行。為了活化細胞，IOOmL化學成分確定培養基(pH值=7. 2，用6M鹽酸調整)通過 0. 22 μ m孔徑的濾膜(奈爾基因公司)過濾除菌，加入到500mL錐形瓶中，接種0. ImL解凍 的M781培養物(工作種子液儲存在10%甘油中，-70°C保存)。這個種子培養物在35°C的 水平搖床(Innova 4330，偏心圓1英寸)上孵育，200rpm振蕩培養9小時。然後將種子培 養物接種到含1.8L基礎培養基的2. 5L加套發酵罐(Applikon)中，初始OD值為0.4。發酵由愛普力肯儀器公司(Applikon Instruments)的數字測量和控制單位(生 物控制器 ADI 1030 (Biol controller ADI 1030)，愛普力肯(Applikon))控制，所有數據 由計算機(BioXpert軟體)採集。溫度由外部恆溫器(海客(Haake))自動控制在36°C。 溶氧由可滅菌的電極(愛普力森(Applisens))測定，通過在150到IOOOrpm之間自動調節 攪拌速度(電動機控制器ADI 1012)以及在0. 1到1. Ον/ν/m之間調節換氣速率(氣流控 制器，愛普力肯)使空氣飽和度維持在30%以上。培養物的pH通過自動滴定2M氫氧化鈉 (泵驅動器，麥弗公司(Masterflex))維持在7. 3)。對於有未知限速因子的補料分批培養來說，培養開始於批生長相(1.2L)，然後是 進料相。為了開發出最佳的補料分批培養策略，利用三種補料分批培養技術來檢測每一種 細胞生長；(I)PH-穩態，(2)DOT-穩態以及(3)指數生長。定期監測cps濃度。 為了利用pH-穩態方法控制底物進料速度，在培養過程中通過用蠕動泵(MCD公司 儀器(Masterflex Concode Drive))添加進料溶液將培養基的pH調整到7. 3。當pH超過 7. 3的設定點時，說明葡萄糖已經被耗竭。這時自動添加營養物將pH再次調整到設定點。對於p02-穩態策略來說，p02高於40%的溶氧設定點時自動添加碳源。對於指數培養技術來說，在指數生長期結束時啟動蠕動泵以使比生長速率維持在 0. 921Γ1 (td = 45分鐘)，這是莢膜多糖生產的最近倍增時間。按照如下公式進料 其中F是進料速率，μ是比生長速率，(VX)tl是開始進料時的生物質，tf是開始進 料時的時間，Sf,const是飼料的底物濃度，Yx7s是葡萄糖的細胞產率係數。C)用於鑑定所需細胞因子的搖瓶試驗微生物所需的生長因子通過從確定成分培養基中去除各個營養物以及通過確定 有此得到的培養基是否支持生長來確定。試驗在500mL無檔板的搖瓶中進行，其中包含 IOOmL化學成分確定的培養基(參見表1)。培養基的pH值用6M鹽酸調整到7. 2，然後通過0. 22 μ m孔徑的濾膜(奈爾基因 公司)過濾除菌。對於每一個系列的搖瓶試驗來說，培養基接種0. ImL解凍的M781培養 物(工作種子液儲存在10%甘油中，-70°C保存)，在35°C的水平搖床(Irmova 4330，偏心 圓1英寸)上孵育，200rpm振蕩培養。18小時後測定590nm處的ODfcovaspecII分光光度 計-法瑪西亞生物技術(PharmaciaBiotech))和pH值(pH計，麥氏公司)。
在缺少胺基酸和維生素的培養基中生長的細菌與在包含所有化合物的培養基中 生長的對照培養物比較。實施例3-分析方法A)生長測定在採集樣品以後通過測定培養物在590nm處的OD值(Novaspec II分光光度計， 法瑪西亞生物技術(Pharmacia bioteck))來檢測生物質含量。稀釋樣品是為了使吸光度 值在0. 10-0. 50的範圍內。化學成分確定培養基內的細胞濃度通過將精確體積的培養物肉湯(30mL)加入到 經過乾燥和稱重的50mL聚乙烯離心管中來測定，以g/L計。細胞用Avanti-TM JA-20 XPl 貝克曼庫爾特冷凍離心機(Avanti-TM JA-20 XPIBeckman Coulter)離心，27，217xg，4°C離 心45分鐘。棄去上清，在85°C烤箱中乾燥細胞團24小時，然後稱重。確立OD59tlnm與gmw/L 生物質(細胞乾重)的關係。1個OD59tlnm等於0. 44gCDff/L生物質。B)革蘭氏染色革蘭氏染色可以分出兩類主要的細胞壁。具有包含少量肽多糖和特徵性的脂多糖 的細胞壁的細菌是革蘭氏陰性的，而具有包含相對較多的肽多糖但是不含脂多糖的細胞壁 的細菌是革蘭氏陽性的。在實驗室規模和中試規模的發酵中使用這種方法可確保種子培養 物和發酵罐培養物是純的。至於染色技術，顯微玻片上的細胞熱固定，用鹼性染料結晶紫染色，該染料可將所 有細菌細胞染成藍色。然後細胞用碘_碘化鉀溶液處理，使碘進入細胞內，與結晶紫染料形 成水溶性的複合物。細胞用乙醇溶劑處理，碘-結晶紫複合物在乙醇溶液中是可溶的。用 溶劑處理以後，只有革蘭氏陽性細胞仍然被染色。染色以後，細胞用復染劑番紅精處理，這樣就可以看到脫色的革蘭氏陰性細胞。復 染的革蘭氏陰性細胞呈紅色，而革蘭氏陽性細胞依然是藍色。將復染劑漂洗去後，玻片稍微 加熱使殘存的水分蒸發掉。然後將玻片放到顯微鏡載物臺上，在油鏡上滴上鏡油。C)葡萄糖含量測定在培養物上清中，利用比色法測定葡萄糖消耗量，測定溶液在340nm處的1釐米 (cm)光程吸光度(NADPH)，並與利用純葡萄糖製作的標準曲線比較。在有己糖激酶和ATP存在的條件下，D-葡萄糖可被磷酸化成D-葡萄糖_6_磷酸， 同時生成ADP D-葡萄糖在己糖激酶和ATP存在時磷酸化形成D-葡萄糖_6_磷酸，同時形成 ADP
D-葡萄糖+ATP己麵》D-葡萄糖-6-磷酸+ADP在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶存在的條件下，D-葡萄糖-6-磷酸可以被NADP氧化，形 成D-葡萄糖酸鹽-6-磷酸和NADPH
D-葡萄糖-6-磷酸+NADP+㈣*1·6—8* P-葡萄糖酸鹽-6-磷酸+NADPH+ H+這個反應中形成的NADPH量可以換算成D-葡萄糖的量。這個試驗中D-葡萄糖的量在1到50 μ g之間。為了產生足夠的吸光度差異，樣品
36溶液稀釋到D-葡萄糖的濃度在0. 08到0. 5g/L之間。上清儲存在_20°C的冰箱中終止酶反應，用ROW系列稀釋。50 μ L稀釋上清與10 μ L 包含己糖激酶(約320U)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(約160U)的溶液在室溫下孵育15分 鍾，其中酶用含NADP、ATP和硫酸鎂的三乙醇胺緩衝液(ρΗ = 7. 6)溶解。按照羅氏的方法將樣品加入到一次性比色杯(1cm光路)中，利用分光光度計在室 溫下測定340nm處的吸光度值。D)測定莢膜多糖的含量N-乙醯-D-神經胺酸(唾液酸)是一種酸性糖，通常作為真核細胞糖類結構的組 分而存在(糖蛋白和糖脂)。對於原核細胞來說，也發現唾液酸是少數幾個屬的致病性細 菌的cps組成成分[10]。事實上，GBS血清型特異性的cps包含如下糖的重複單位N-乙 醯-神經氨酸或唾液酸、葡萄糖、半乳糖和N乙醯葡萄糖胺。由於唾液酸是多糖的組成成分， 因此測定其含量可用於檢測血清型特異性的cps的產量，方法由Svermerholm設計(參考 文獻176)。在測定唾液酸的含量以前，滅活樣品中的cps要先經過部分純化和濃縮。多糖用 氫氧化鈉水解36小時以後，1. 5mL滅活的樣品在15600xg離心25分鐘(離心機5415R-艾 本德股份公司(Eppendorf))以去除細胞。上清液用ROW按1 10稀釋，然後用森曲肯 (centricon)離心式濾器(米力普(Millipore)的Ultracel YM-30再生纖維素)純化和濃 縮。按照下列方法使稀釋的樣品通過各向異性膜超濾可達到需要的濃度。將樣品池插入到過濾瓶內，然後在樣品池內加入1. 5mL水，共添加兩次，在 2519xg、20°C離心20分鐘，清潔森曲肯系統。系統準備好以後加入1. 5mL稀釋的樣品， 2519xg離心30分鐘。離心力可使溶劑和低分子溶質透過膜進入到過濾瓶內。大分子如cps 被保留在樣品池內的膜上。樣品體積縮小後，可提高保留的溶質的濃度。保留物用0.5mL 0. 5m的NaCl洗滌三次以去除雜質，然後在2519xg、20°C離心20分鐘。為了回收，將0. 5mL 0. 5M的NaCl加入到樣品池內。通過將一個瓶子放到樣品池 上，倒置，然後在205xg離心1分鐘使cps轉移到保留物瓶內。回收重複兩次以回收所有的
Cps0為了測定唾液酸的量，使用包含間苯二酚-鹽酸的比色法。定量分析試劑包含 0. 2g間苯二酚(默克)，溶於包含80ml 37% HCl、20mL水和20 μ mo 1 CuS045H20(默克)的 溶液中，以確保酸性水解。試驗過程如下lmL包含5_25 μ g唾液酸的樣品加入到2mL間苯二酚試劑中。加 入試劑後混合溶液，在沸水浴中100°c加熱20分鐘，期間可產生藍-紫色。試管在室溫下冷卻，利用Novaspec 11分光光度計測定554nm處的吸光度值。使 用Icm光路和ImL容量的一次性比色杯。在5_25 μ g範圍內，吸光度值與唾液酸的濃度成 正比。為了補償生物材料中的非特異性顏色，對照樣品不添加間苯二酚。在計算唾液酸 的量之前，待測樣品的吸光度值減去空白樣品的吸光度值。同時進行的是，在相同條件下準備0、5、10、15、20和25yg N-乙醯唾液酸標準溶 液。N-乙醯唾液酸的量通過UV LAMBDA程序利用N-乙醯唾液酸標準溶液得到的公式計算。090、H36b和M781的莢膜多糖包含31% (w/w)的N-乙醯唾液酸。CJBlll的莢膜多糖包含23% (w/w)的N-乙醯唾液酸.因此，cps濃度可用這個校正因子確定。Cps的體 積產率用mg/L表示，cps比產率用mg/L. OD表示。實施例4-簡化的複合培養基和線性添加A)接種物製備工藝的開發在製備GBS血清型特異性cps的發酵工藝中，使用包含500mL培養基的2000mL搖 瓶準備接種培養物。但是，這些搖瓶不適合中試規模和生產規模的製備。因此，用新搖瓶研 究四種GBS菌株(090、H36b、M781和CJB111)的行為以開發出適於中試規模的接種物製備 工藝。然後按照cGMP的要求利用這個工藝製備I期臨床前試驗所用的批次。本實施例的第一個目標是找到這四種GBS菌株在包含IOOOmL培養基的5000mL錐 形瓶中的生長參數，另外還研究指數生長後期所需的最佳培養時間以及發酵罐中合適的PH 值。第二目標是研究用於接種搖瓶的工作種子液的體積，這是為了調整培養時間，使菌株具 有合適的生長速率的同時可以在發酵日之前的晚上(培養時間約8小時)或者在發酵日早 晨較早的時候(培養時間約3小時)開始接種。三種GBS血清型的研究用3mL工作種子液接種IOOml新鮮無菌接種培養基。另夕卜， 每個試驗都進行兩次以確保重現性。但是，由於得到的生長曲線和倍增時間是一樣的，因此 每個試驗只用一個結果。對於090菌株來說，細胞的指數生長期為6. 5小時，倍增時間為30分鐘(μ _ = 1. 411Γ1)。因此，在6. 8的合適ρΗ條件下，6小時就足以達到指數生長中期。由於這個時間無 法在發酵日的前一天晚上接種搖瓶，因此工作種子液的體積減少到0. ImL以延長這個培養 時間。在這些條件下，細菌的指數生長期為8. 5小時，倍增時間為35分鐘(Ufflax= 1. 201Γ1)。 因此，這個菌株的接種培養物準備時間需要8小時。對於H36b菌株來說，只進行一個試驗，工作種子液體積為3mL。細胞立即進入指 數生長期，倍增時間為25分鐘(μ_= 1.651^)，減速期開始於4. 5小時後。因此，為了使 OD處於0. 8-1. 2的範圍，使ρΗ在6. 5左右(7+0. 5)，這個菌株的培養基必須在發酵前4小 時接種。對於Μ781菌株來說，試驗進行兩次，第一次用3mL的工作種子液，第二次用0. ImL 的工作種子液。用3mL的工作種子液培養時間需要3小時。為了使培養時間延長2. 5小時 培養過夜(5倍增時間)，使用0. ImL的工作種子液。我們觀察到時間差只有30分鐘，倍增 時間從31. 4分鐘(Ufflax = 1. 321Γ1)下降到27. 5分子(μ max = 1. 511Γ1)。因此這個菌株用 0. ImL的工作種子液，搖瓶必須在發酵前8小時接種。對於CJBlll菌株來說，只進行一個試驗，工作種子液體積為3mL。細胞立即進入 指數生長期，倍增時間為21分鐘(μ_= 1.9811_1)，減速期開始於4.5小時後。因此，為了 使OD處於0. 8-1. 2的範圍，使ρΗ在6. 5左右(7+/-0. 5)，這個菌株的培養基必須在發酵前 4小時接種。在這個新接種工藝能用於中試規模的發酵前，必須在cGMP條件下研究這四株 GBS,以進一步驗證接種物製備工藝。如《藥品生產和質量管理規範》(GoodManufacturing Practices)(卷4)所述「驗證試驗需按照確定的方法進行。當採用任何新生產工藝或制 備方法時，步驟應該能夠證明其在常規工藝中的適用性。利用特殊材料和設備的確定的工 藝應當顯示能夠始終如一地生產出複合質量要求的產品」。這個新的接種物製備工藝用要每個菌株的最佳工作種子液體積重複驗證。對於090菌株來說，要達到理想的範圍，即OD 為1 士0.2，pH為6. 5士0.2，要用0. ImL的工作種子液和8. 5小時的培養時間。對於H36b菌 株來說，達到指數生長晚期需要3mL的工作種子液和4小時的培養時間。對於M781菌株來 說，要達到0. 8-1. 2的理想OD範圍要用0. mL的工作種子液和7. 50小時的培養時間。對於 CJBlll菌株來說，達到理想OD需要3mL的工作種子液和4小時的培養時間。這個接種物製備工藝可用於中試規模的發酵，要使200L發酵罐的初始OD達到 0. 032需要4個搖瓶，每個搖瓶包含IOOOmL培養基。B)發酵工藝開發i)複合培養基中添加維生素溶液的需求量驗證由於GBS是營養缺陷型微生物，因此它不能合成特殊有機化合物，如胺基酸和維 生素，這些化合物是其生長所必須的。因此，已經開發出了一種低成本的不含動物源組分的 複合培養基，如W007/052168所述。這個複合培養基可通過加熱滅菌，其中添加生物素和維 生素溶液，維生素包括硫胺素、核黃素、煙酸和鹽酸吡哆醇，溶於0. IM氫氧化鈉和甲醇中， 濃度為0. 5g/L。用於培養GBS的酵母提取物包含這些維生素，但是其比例因酵母自溶產物的生產 工藝和加工過程不同而不同(表2)(參考文獻177)。 為了得到低成本的簡單生產工藝，需要評價添加到複合培養基中的生物素和四種 維生素溶液的作用，其對無乳鏈球菌三種特殊菌株的生長和cps生產的效應。在開發出適用於中試規模的cps工藝的發酵工藝之前，用實驗室規模的發酵罐監 測三種GBS血清型的生長情況，使用的參數是上述實施例中所開發出來的。在這些條件下，加入葡萄糖3小時後最終OD是不同的，090菌株的OD為14，而H36b 的OD為28. 5，這些菌株的cps濃度在300-550mg/L之間。基於安全性的原因要避免使用甲醇，同時維生素在氫氧化鈉中會丟失其特性，因 此選擇硫胺素、鹽酸吡哆醇和煙酸的ROW溶液。同時，對工藝進行第二項改動。由於維生素 是不耐熱的化合物，酵母提取物培養基要用0. 22 μ m孔徑的濾膜過濾除菌，而不是高壓滅 菌，通過無菌操作添加磷酸鹽培養基，而不是在121°C高壓滅菌30分鐘。考慮到上述改動，每一個菌株都要進行新的發酵試驗。雖然三個菌株的生長情況等於(H36b)或好於(090和M781)上述實施例建立的工藝，但是培養物依然有色素產生。事 實上，在Fraile等人的文章中，整合到細胞壁上的橙黃色色素的產生是人溶血性GBS的特 殊特性，可作為用培養基鑑定GBS臨床樣品的基礎(參考文獻178)。為了去除這種化學汙 染(顏色)，純化工藝需要一個額外步驟，該步驟使用Z-碳表面。對於發酵結束時的cps產量來說，經過改動的工藝可以使090和M781菌株的cps 濃度升高約100mg/L，M781菌株的cps濃度升高約300mg/L。另外，每克細胞乾重的cps百 分含量也更高。對於這三株無乳鏈球菌來說，添加核黃素不是必須的，因為酵母提取物中的 維生素濃度足以滿足這些菌株的營養需求。為了減少培養基中添加的維生素溶液量，進行只使用生物素的試驗。雖然H36b和 M781的cps濃度輕微下降，但是cps產量依然比上述實施例建立的工藝有提高。對於無乳 鏈球菌的生長和cps生產來說，複合培養基中添加維生素不是必須的，因為除了生物素以 外，酵母提取物中的維生素足以滿足這三種特殊GBS菌株的營養需求。另外，根據純化的數據，缺乏維生素的條件下產生的cps的結構與上述實施例建 立的工藝所得到的結構是一樣的，乙醯化程度低，產物的純度可以接受。我們還監測了去除生物素後090菌株的生長情況。在這個試驗中，OD值從18降 低到14，cps濃度降低超過100mg/L。酵母提取物中的生物素濃度不足以滿足這個GBS菌 株的生長要求。事實上，從酵母提取物的組成來看，生物素存在的量(0. 25mg/100g)比其他 維生素低。總之，去除硫胺素、核黃素、煙酸和鹽酸吡哆醇對GBS的生長和cps產生的影響很 小。因此，從發酵工藝中去除四種維生素，這樣複合培養基中只添加生物素。對於CJBlll 來說，最終條件也只使用生物素。ii)驗證用於生產GBS血清型特異性莢膜多糖的複合補料分批工藝的必要性據報導，細胞生長速率是調節cps產生的主要因素，III型cps生長速率依賴性的 產生不依賴於生長限速化合物(參考文獻173)。如W02007/052168所述，現在已經開發出 了一種複合補料分批發酵工藝，該工藝可維持有利於cps生成的營養環境和生長速率。這 種複合補料分批工藝結合了指數技術降低細菌倍增時間和PH穩態技術在最後3小時使用 葡萄糖以提高cps生產力。這個工藝結合了分批培養和連續培養技術的優點。事實上，補 料分批發酵可得到很高的細胞密度，因為指數生長期延長以及在發酵期間可控制底物進料 的條件。然而，複合補料分批技術需要使用帶有複雜算法的軟體來控制發酵，使用這個軟體 必須要驗證算法是否複合GMP標準。因此，要簡化發酵工藝以避免使用算法。按照上述實施例建立的工藝，使用相同的OD值開始每一次進料，瞬時添加。另外， 每一批添加150g/L酵母提取物和500g/L葡萄糖，佔初始批體積的10%。兩次瞬時添加分 別在OD為3和4. 5時，佔總需求體積的1/5和4/5。當OD達到10時，開始線性添加濃縮葡 萄糖以取代PH穩態期。添加速率需要經過計算以使葡萄糖添加的量與3小時複合補料分 批工藝中的相同。利用新工藝進行每一個菌株的發酵，監測細胞密度和cps產量。對於090菌株來 說，簡化工藝的結果與複合補料分批工藝的結果相同。對於090和H36b菌株來說，生長速 率比複合補料分批工藝快，發酵結束時的OD從24增加到32.每克細胞乾重的cps濃度和 cps量分別提高約300mg/L和5mg。ps/g。DW。對於M781菌株來說，生長速率和cps產量相同。
40因此，可以通過線性添加葡萄糖而不監測PH來簡化發酵工藝。對於CJBlll來說，只進行最 後的簡化線性添加而不監測PH的過程來驗證該方法的效率。這個使用兩次瞬時添加酵母提取物和線性添加葡萄糖的工藝是優選的中試規模 的發酵方法。這個新工藝無需算法或在培養物中添加維生素溶液。由酵母提取物、磷酸鹽、 葡萄糖和生物素組成的複合培養基是一種低成本的高效工藝，可得到具有重現性的生長行 為和cps產生。C)預驗證發酵工藝我們驗證和優化了以前開發出的用於生產GBS cps的發酵工藝。我們監測了 H36 菌株的生長和cps產生，其中每一個參數都經過了改動，並且與對照培養物比較。報告了 DOT研究、溫度和pH。培養溫度為36°C，pH為7. 3，整個過程中培養基內的溶氧維持在30%。添加葡萄 糖3小時後，最終OD為25. 3，平均生產率為1. 84g/L. h。每克細胞乾重的cps濃度和cps 量分別為 540mg/L 和 59mg。ps/gCDW。I)溶氧水平的影響無乳鏈球菌是一種兼性厭氧微生物，在有氧的條件下可通過有氧呼吸合成ATP; 但是它也能轉化成厭氧生長。首選，培養基內的溶氧維持在15%。在發酵結束時可以觀察到平均生產率從 1.84g/L.h下降到1. 14g/L.，但是590nm處的OD依然能達到23. 2。cps濃度降低，約為 406mg/L,每克細胞乾重的 cps 較少(39. 8mgcps/gCDff)。溶氧維持在60%進行相同的發酵試驗。在這種情況下，平均生產率為1. 16g/L.h， 最終OD為20. 5。特異生產率降低到433mg/L，每克細胞乾重內的cps量減少到49mg。ps/gmw。根據這些結果，中試規模的生產選擇30%的溶氧，攪拌速率為50_350rpm，空氣流 速為20-100L/min。由於氧比空氣貴，因此只在發酵過程的最後數小時使用，從而使生產工 藝成本維持在低水平。ii)溫度的影響我們還監測了改變溫度時的生長情況和cps產生情況，改變溫度是指比標準溫度 36°C升高或降低2°C。溫度降低到34°C，倍增時間將下降，平均生產率從1. 84g/L. h下降到1. 04g/L. h。 但是，cps濃度將下降到60% (312mg/L)，在此溫度下損失約20mg。ps/gCDW。當溫度調整到38°C時，平均生長率從1. 84g/L. h下降到1. 45g/L. h。另外，在發酵 結束時cps濃度和每克細胞乾重的cps量都明顯降低(分別為(267mg/L和32. lmg。ps/gCDW)。由於改變發酵工藝的溫度將影響GBS的倍增時間，並且會明顯降低血清型特異性 cps的產量，因此36°C被確定為GBS生長和cps產生的最佳溫度。iii)pH值的研究另外我們還通過試驗來優化pH值，pH值從最初的7. 3調整到7. 0和7. 5。當pH 維持在7. 0時，最終OD從23. 5增加到28. 8，平均生產率為1. 52g/L. h。但是cps濃度從 540mg/L 減少到 412mg/L。在pH7. 5的條件下進行了相同的發酵過程。從OD來看生長行為相同，但是平均生 產率為1. 08g/L. h，cps體積生產率明顯下降，從540mg/L降低到323mg/L。因此在發酵期間，將PH維持在7. 3對細胞密度和cps產生來說是最佳的。iii)壓力值的研究通過試驗比較兩種壓力0. 2巴和0. 5巴下的發酵過程來優化壓力。當壓力維持在 0. 5時，最終OD為23. 5，平均生產率是1. 5g/L. h。但是，cps濃度從540mg/L降低到272mg/ L0經過試驗檢測了溶氧、溫度、pH和壓力的效應以後，我們發現以前建立的條件是獲 得高細胞密度和血清型特異性CPS的優化條件。實施例4-開發化學成分確定培養基由於上述實施例所用的複合培養基所包含的有機材料的組成並不完全清除(例 如，酵母提取物)，因此發酵工藝的表現是有差異的。一種降低變異性但是能夠保持生產率 的方法是用化學成分確定培養基替代複合培養基，化學成分確定培養基主要由無機化合物 組成。這種替換使發酵工藝可控，並且能簡化多糖的純化。以前的研究(參考文獻179)證明無乳鏈球菌可在化學成分確定培養基中生長，這 種培養基可獲得與複合培養基一樣的生長速率和生長量。本研究的目的在於首先研究代表 血清型III的無乳鏈球菌M781菌株的生長特性及其所需的生長因子。為了提高生物質和 cps的產量，我們開發了一種簡單的補料分批工藝。A)利用化學成分確定培養基進行GBS生長研究為了開發補料分批工藝，一般來說必須首先分析微生物以確定最佳的無生命條 件、不同的生長期、消耗的和產生的組分、生物質和產物形成之間的關係、生長限速底物以 及比生長速率和限速底物濃度之間的關係。但是，有關GBS的行為信息已經從用於開發復 合培養基的研究中獲知。在上述實施例中用複合培養基培養GBS所用的最佳pH和溫度條 件應用到上面表1所述的化學成分確定培養基上。i)錐形瓶的GBS生長試驗M781菌株生長預實驗用500mL錐形瓶通過分批培養進行。細胞在指數生長期培養 8小時，倍增時間為45分鐘(μ ^x = O-Qlh-1) ο第一個生長期過後，比生長速率開始下降， 細胞進入2小時的減速期。最終光密度在1. 5左右，當光密度達到0. 7左右時指數生長期結束。ii) 2L發酵罐的GBS生長試驗第二步，用2L發酵罐監測GBS生長情況。在這些條件下，培養基的pH通過自動添 加2M的氫氧化鈉維持在7. 3。為了活化細胞，使用上述搖瓶內的培養物。當接種物搖瓶達到指數生長後期時 (OD590nm)，這種培養物的體積用於接種1. 8L新鮮培養基，得到的初始OD為0. 4。細胞立刻進 入指數生長期，持續3小時，倍增時間為42分鐘(μ _= LOOtT1)。2小時的減速期之後是 靜止期，這時的OD為2. 56。搖瓶和發酵罐的倍增時間相同。雖然最終的OD有稍許提高，但 是生物質產量(0.05g/L.h)依然很低。和發酵罐中所見到的一樣，pH維持在7. 3。另外，可 以看到葡萄糖不是GBS的限速物質，因為當細胞開始進入減速期時可用的葡萄糖為5. 7g/ L0B)限速化合物的鑑定根據幾乎完全已知的酵母提取物培養基的組分，比較複合培養基工藝所用的營養
42源的濃度和批確定培養基的組分以確定GBS達到最終約15的OD所需的不同化合物之間的 合適比例，同時鑑定生長限速化合物。使用複合培養基的工藝批培養基中包含17g/L酵母 提取物，在進料期間再添加19g/L，因此共有36g/L供無乳鏈球菌使用。比較36g/L酵母提取物的組分和成分確定培養基的初始濃度，比較內容包括礦物 質、葡萄糖、維生素和胺基酸含量(參見表3)。對於礦物質源來說，現有的成分確定培養基 中的所有化合物都足以滿足GBS生長需求，但是鉀比複合培養基高6. 5倍。對於維生素和氨 基酸源來說，使用成分確定培養基的工藝所用的所有濃度都低於使用複合培養基的工藝。 酵母提取物中的維生素或胺基酸濃度的比例與成分確定培養基內的批濃度相似，但是與分 子的特性不同。然而，酵母提取物的精確組分還未完全清楚。比較所用的數值也是平均值， 每種組分的比例因酵母提取物的生產工藝和加工過程不同而有明顯區別。表3 複合培養基和CDM工藝組分比較 實施例5-化學成分確定培養基擴展用於發酵補料分批發酵通常以批模式開始，生物質達到一定濃度或者底物消耗一定程度後 向發酵罐內添加限速底物溶液。因此，營養培養基必須是簡單組合物。本研究的目的在於 開發出一種能夠鑑定限速化合物但是不影響生長速率的批培養基。A)開發用於補料分批工藝的批培養基為了開發出成分確定的補料分批培養基，需要逐個添加限速化合物，評價其對生 長的影響。首先將表2的每一種維生素的濃度都提高到10倍。結果發現維生素對GBS的 生長是至關重要的。細胞立刻進入指數生長期，持續4小時，倍增時間從42分鐘(μ_ = LOOtT1)下降到33分鐘(μ_= 1.261^)。3小時以後，細胞進入減速期，持續2小時後進 入靜止期，這時已培養5小時。最終的OD為3. 70，比以前的試驗高出50%。在批培養基中 加入維生素後，可以觀察到正效應，但是他們不是唯一的限速化合物。指數生長期在3小時 後結束，但是在細胞進入減速期時依然還有6. 3g/L的葡萄糖可用。添加IOX維生素和IOX胺基酸進行相同的試驗。對於添加IOX維生素的發酵來說， 最終OD更高(OD59tlnm = 4. 5)。細胞的指數生長期持續4小時。葡萄糖不是限速化合物，因為 細胞進入減速期時依然還有4g/L葡萄糖。向初始培養基中添加IOX的鉀進行相同的試驗。在這種情況下，倍增時間延長(td =49分鐘)，細胞進入靜止期時的最終OD降低(OD59tlnm = 2. 9)。初始鉀濃度增加10倍對 生長有副作用。因此，鉀需要通過進料來添加，或者以較小的批量添加以避免添加的鉀使鉀 的濃度達到抑制水平。
按照本試驗，批培養基中礦物質的含量與初始的化學成分確定培養基相同，但是 維生素和胺基酸的濃度都增加10倍。磷酸鹽和碳源添加到進料培養基中，但是要確定每一 種組分的濃度，必須和使用複合培養基的工藝進行新的比較。由於批培養基中存在33g/L 的葡萄糖，因此在線性添加期間在加入55g/L葡萄糖。從而使葡萄糖和IOX的鉀的比例相 同，進料培養基組成如下275g/L葡萄糖、10. 08g/L K2HPO4和14. 8g/L KH2PO40 500mL這種 溶液添加到1.2L批培養基內。B)開發補料分批工藝補料分批發酵的策略是以GBS消耗底物相同的速率添加限速底物。營養物的進料速率可通過決定微生物的生長速率和產物形成所需的碳循環的效 率以及使副產物最小化來影響補料分批發酵。C)B型鏈球菌所需的生長因子無論是自養菌還是異養菌都需要少量的某些必須有機化合物來維持生長，微生物 無法從現有的營養素中合成這些化合物。生長因子是細胞所需要的少量化合物，因為它們要在生物合成中完成特殊任務。 對生長因子的需求是因為細胞內有被阻斷的代謝通路或者缺少代謝通路。一般分為三類 (1)核酸合成所需的嘌呤和嘧啶；(2)蛋白質合成所需的胺基酸；以及(3)作為某些酶的輔 酶和功能基團的維生素。本研究的目的在於鑑定無乳鏈球菌M781菌株所需的生長因子，從而可以通過減 少化合物的數目來簡化培養基以及確保低成本的生產工藝。D)無乳鏈球菌M781菌株所需的胺基酸通過從培養基中逐個去除胺基酸我們發現L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-穀氨醯胺和 L-脯氨酸是可有可無的(參見圖20和表4)。這些胺基酸通常可使濁度值比對照培養物升 高80%以上，但是如果缺少其他任何胺基酸，培養基中的細菌將無法生長。
表4 從CDM刪除單個胺基酸對GBS M781菌株生長的影響+ 在缺失該胺基酸時，M781菌株的生長水平只有對照的40%或更低-生長水平至少是對照的40%。當培養基中存在15種胺基酸時可以得到滿意的生長水平。利用2L規模的發酵來 比較只有必需胺基酸時M781的生長情況。其生長水平與存在19種胺基酸時的水平相似。 在兩種情況下，沒有觀察到遲滯期，但是從化學成分確定培養基中去除4種胺基酸後倍增 時間從 62 分鐘(μ max = 0. & 2Κ1)降低到 78 分鐘(μ max = 0. 5331^)。刪除這四種胺基酸對M781菌株的OD和cps產生的影響將在最終的工藝中確定。E)無乳鏈球菌M781菌株所需的維生素通過從培養基中逐個去除維生素我們發現泛酸鈣和煙醯胺是可有可無的(參見 圖21和表5)。在刪除生物素、葉酸、鹽酸吡哆醇、核黃素和硫胺素的試驗中，濁度值大於 65%。當只添加泛酸鹽和煙醯胺時，得到了與對照相同的最終0D。
46 表5 從化學成分確定培養基中刪除單個維生素對B型鏈球菌M781菌株生長的影 響+ 在缺失該胺基酸時，M781菌株的生長水平只有對照的40%或更低-生長水平至少是對照的40%。利用只含泛酸鈣和煙醯胺的原始培養基進行分批發酵。培養8小時以後，OD達到 0.2。因此，只用這兩種維生素的培養不是最佳的。利用500mL錐形瓶進行一個新試驗，逐 個向已經添加泛酸鈣和煙醯胺的培養基中添加經過第一搖瓶試驗證明是生長所不需要的 維生素。在這個試驗中，與只用泛酸鈣和煙醯胺的試驗所觀察到的結果一樣，培養18小時 後每個搖瓶內的濁度值都與對照培養物相同。在發酵罐中進行的其他試驗能夠鑑定出無乳鏈球菌M781菌株生長所必需的維生
ο實施例6-中試生產本實施例的目的在於驗證上述實施例的參數是否能夠用於以生產規模來製備無 乳鏈球菌的血清型特異性莢膜多糖。接種物的培養i)培養基用溫度滅菌(高壓滅菌程序n° 1分鐘(min.)/最大(maX.)，40min.，121°C，表6)， 的4個5L搖瓶培養接種物，每個搖瓶內包含IL複合培養基(17g/L酵母提取物Difco，8g/ L Na2HPO4. 2H20, 2g/L NaH2PO4. H2O和33g/L—水葡萄糖，0. 2 μ m奈爾基因公司一次性過濾系 統過濾除菌，用3M NaOH將給pH調整到7.3士0. 1)，在接種前添加IOmL維生素溶液(硫胺 素、核黃素、鹽酸吡哆醇和煙醯胺，每種0.05g/L，用0. IM NaOH稀釋，0.2μπι過濾除菌)和 5mL生物素(生物素0. 2g/L，0. 2 μ m過濾除菌)。 ii)搖瓶接種和培養條件每個搖瓶接種2. 75士0. 25mL從_70°C冰箱解凍的工作種子液。培養基在35士 1°C 的孵箱(IN-L0641)中培養，200士 IOrpm振蕩，培養4小時。然後通過測定590nm處的OD值 和革蘭氏染色來評價生物質的濃度。如果OD59tlnm值達到1. 2-0. 6，並且革蘭氏染色的結果得 到確認(只有革蘭氏陽性球菌)，那麼將4個搖瓶的內容物倒入5L熱滅菌(高壓滅菌程序 n° lmin. /max.)的瓶內，這個瓶與 300L BB生物技術(B. Braun Biotech)/開麥普(Chemap) 發酵罐(ID VS-L0530)的孵育管相連。iii)接種物製備的關鍵變量接種物製備的關鍵變量描述於表7和表8中。 iv)設備的滅菌和清洗使用完以後，搖瓶和5L瓶要經過熱滅菌(高壓滅菌程序n° 8，髒循環，參見表6 的說明)和清洗。B)300L發酵罐培養i)培養基和設備的準備300L空發酵罐的機械管道和空氣過濾器要經過滅菌(程序SEAL2和EXFC2)。然
48後檢查探針並校正。用PH為7和10的兩種緩衝液校正pH探針。氧探針的校正是將探針 放入通氮氣的水中設定為0%點，放入空氣中設定為100%點。其校正在發酵罐內進行。在300L發酵罐內配製基礎培養基(120L，2g/L Na2HPO4. 2H20,120L加ImL消泡劑 "PPG 2500」)並滅菌(程序FVES 2)。滅菌期間檢查氧探針的0%值，如果需要重新初始化。 在滅菌的冷卻相之後，溫度降到36°C，加入17L150g/L的酵母提取物、9L 550g/L的一水葡 萄糖、2L維生素溶液(硫胺素、核黃素、鹽酸吡哆醇和煙醯胺，每種0.05g/L，用0. IM NaOH 稀釋)完成基礎培養基的配製，添加的溶液都用0.2μπι過濾滅菌。培養基氧化後校正氧探 針的100%值。加入4L接種物後，發酵的起始體積為150L，酵母提取物的終濃度為17g/L， 葡萄糖的終濃度為33g/L。這些添加都是通過可滅菌管道進行的，管道帶有蠕動泵，最大速 度(400rpm)相當於550mL/min的流速。ii)發酵過程和過程質量控制接種前加入生物素溶液(1L 0.2g/L的生物素，0.2μπι過濾除菌)。然後用包含4 個搖瓶的接種物的5L瓶接種300L發酵罐。然後檢查下列參數值，如果需要進行調整，在發酵過程中自動控制這些參數-培養溫度控制在36士 1 °C，-發酵罐內的餘壓設定在0.2巴，-pH設定在7. 3士0. 1，用4M NaOH調節。不用酸溶液校正pH，因為發酵時pH值會 自然下降，-初始攪拌速度設定在50rpm，初始氣流設定在20L/min，-發酵罐內泡沫水平通過肉眼觀察，如果需要用消泡劑PPG2500調整，-溶氧張力(DOT)設定在30%，通過如下方式逐級調節·攪拌(攪拌速度在50到350rpm之間)·氣流(數值範圍在20到lOOL/min)之間·氧流(數值範圍在0到lOOL/min)之間在發酵的批期採樣，接種2小時後採樣測定OD59tlnmt5然後每15分鐘採集一次樣品， 直到OD59tlnm達到3。達到該目標OD後，開始用3. 6L酵母提取物溶液(150g/L)添加第一指 數分批進料，群體倍增時間維持在300分鐘。第一次添加後約45分鐘，測定0D59(tam。然後每15分鐘採集一次樣品，直到OD59tlnm 達到5。達到該目標OD後，開始用酵母提取物溶液(150g/L)添加第二指數分批進料，群體 倍增時間維持在50分鐘。在這個第二指數分批進料結束時，開始pH穩態分批進料。當pH值超過7. 18時添 加一水葡萄糖溶液(550g/L)。在進料期間每小時採集一次樣品測定0D59(tam。發酵在最後一次進料後約3小時結束。然後停止參數的自動控制。攪拌速度設定 在lOOrpm，溫度設定在30°C。iii)發酵過程的關鍵變量發酵過程的關鍵變量描述於表9和表10中。 iv)設備的清潔、滅菌和清洗生物質從300L發酵罐內取出後，將200L ROW加入到發酵罐內開始清潔。然後向 發酵罐內添加3M NaOH直到pH達到11.溫度控制在80°C，保持30分鐘。冷卻到室溫後將 發酵罐內的溶液倒入位置較低的廢液槽內。然後加入200L ROff開始滅菌，按照標準操作規程(SOP)激活程序(FVES2)。滅菌 的冷卻相結束後從發酵罐上取下PH和氧探針，分別儲放在3M KCl溶液和ROW中。最後用200L IM NaOH清洗髮酵罐，IOOrpm攪拌至少30分鐘。洗滌後將這200L NaOH清空到killer tank內，再通過噴霧囊向發酵罐內加100L NaOH，這樣可以清洗罐的上 面部分。這100L用多葉迴轉泵再循環至少30分鐘。經過這個清洗步驟以後，發酵罐用ROW 清洗直到PH降低到5-7之間。C)生物質離心i)設備準備將一個含生理鹽水(約100L，9g/L NaCl，0. 2 μ m過濾除菌)的罐連接到轉移管上， 該轉移管將300L發酵罐與Alfa-Laval離心機(ID CT-L0526)連接起來。在離心過程中用 這個水洗滌生物質團。然後熱滅菌轉移管，像生物質分離器和收集罐一樣。設備的準備在 發酵結束前完成以便於發酵一結束就儘快開始離心。ii)連續流動離心過程連續流動離心過程由如下循環組成
以100L/h的流速離心生物質7分鐘，手動調節。生物質通過轉移管從發酵罐轉移 到分離器中，發酵罐內的壓力加到0.6巴。以100L/h的流速用生理鹽水洗滌3分鐘，手動調節，排出細胞團。這個循環可重複進行直到生物質處理完畢。不收集上清，而是將其排到廢物槽內。 在處理期間細胞團收到罐(VS-L0536)內，然後通過矽酮連接管轉移到100L—次性無菌袋 內進行化學處理，餘壓升高到0. 3巴。iii)離心的關鍵變量發酵過程的關鍵變量描述在表11中。 監測的變量包括排出次數和收集的生物質的重量。iv)設備的滅菌和清洗細胞團離心並轉移到一次性袋內後，加熱滅菌和清洗轉移管、分離器和生物質的 收集罐。轉移管和分離器用100L NaOH在發酵罐內室溫下清洗，然後通過轉移管以100L/h 的流速轉移到分離器內。然後用20L IM NaOH循環30分鐘清洗收集罐，用噴霧囊清洗以便 於清洗罐的上部。經過這個清洗步驟以後，再用ROW清洗罐，直到pH下降到5到7之間。D)細胞團的化學處理i)細胞團的滅活化學處理細胞團是為了滅活細菌並使其釋放cps。處理包括向細胞團內加入4M NaOH溶液(通過蠕動泵的管)，達到0. 8M NaOH的理論濃度。添加的4M NaOH的重量等於 生物質的重量除以4，因為IL等於1kg。這個步驟在帶有整合攪拌系統的100L—次性袋內 完成，在LS系統(Levtech Sartorius System) (ID AG-10645，恆溫平衡攪拌器)中處理。 調節溫度使細胞團的溫度維持在37°C，然後以ISOrpm攪拌一定的時間。12h足以滅活微生 物。36h是使細菌莢膜釋放cps的合適時間。在其他試驗中，我們發現Ih足以滅活微生物， 而24h是使細菌莢膜釋放cps的合適時間。相應的，36h或24h是這個步驟的合適時間。ii)滅活的關鍵變量發酵過程的關鍵變量描述在表12中。
51 iii)中和與沉澱使用帶蠕動泵的矽酮管加入IM TRIS緩衝液，使終濃度達到0. IM0添加的TRIS的 重量為滅活的生物質的重量除以9。這個添加的重要性在於避免中和期間細胞團的pH發生 變化。因此用一次性袋內的PH探針控制pH。加入6MHC1使最終pH達到7. 5-8. 5。加入2M CaCl2和96%乙醇溶液以沉澱細胞團內的蛋白質和核酸。CaCl2的終濃度 為0. 05M,乙醇為30%。添加的2M CaCl2的重量等於中和的生物質的重量除以19，96%乙 醇的重量等於中和的含CaCl2的生物質的重量除以3. 1。E)經過處理的細胞團的微孔過濾和透析用CaCl2和30%乙醇化學處理的生物質經過微孔過濾回收釋放到上清中的多糖並 去除細胞殘留物以及蛋白質和核酸沉澱物。i)設備準備微孔過濾和透析採用SSII+底座(Sartorius Sartocon II plus holder)，其帶有 一次性容器和4個0. 22 μ m Hydrosart盒，每個0. 6m2，總表面積為2. 4m2。系統用90Nm的 轉矩扳手緊固。盒用20L IM NaOH處理，通過0. 2 μ m過濾除菌，使用多葉迴轉泵保證和調節系統 內的壓力。然後在如下條件下再循環滲餘物和滲透物-入口壓力2·O士0. 2 巴-滲透物閥關閉5分鐘然後打開用蒸餾水清洗系統直到pH達到5-7，然後用20L生理鹽水(0. 9g/L NaCl，使用 0. 2 μ m過濾滅菌)洗滌，在如下條件下使pH達到5-7 -入口壓力Pin= 2. 0 士 0. 2 巴-滲透物壓力=Pperm= 0巴(打開閥門)-滲餘物閥門關閉。微孔過濾前用透析緩衝液(34.77g/L NaCl,4. 49g/L TRIS，10. 93g/L CaCl2,pH用 6HC1調整到7. 8士0. 1，最終體積的WFI qsp 74. 4，96%乙醇直到最終體積，0. 2 μ m過濾除 菌)使盒條件化。ii)微孔過濾和透析包含處理的生物質的一次性袋的出口連接到微孔過濾容器的入口上。容器的滲餘 物出口連接到包含處理的生物質的一次性袋上使處理的生物質再循環。滲透物出口連接到 200L 一次性無菌袋上以收集滲透物。開始時滲透物閥門是關閉的，使細胞團在微孔過濾系統內循環。然後打開這個閥 門，控制多葉迴轉泵的速度以達到如下條件-入口壓力Pin= 2. 0 士 0. 2 巴-滲透物壓力=Pperm= 0. 6 士 0. 1 巴
生物質濃縮10倍，滲餘物用3倍體積的緩衝液透析。為了準確確定微孔過濾 系統內的循環，滲餘物的重量必須高於10kg。這樣滲餘物濃縮直到生物質的重量達到 10士0.5kg。然後以連續步驟透析。所用的緩衝液的重量用CaCl2-乙醇混合物的重量除以 理論濃縮因子10然後乘以透析理想循環數來計算。iii)滲透物過濾除菌在收集到200L —次性袋內以前，滲透物用微孔過濾系統出口處的 2000cm2Sartobran P 0. 22 μ m濾器過濾除菌。最終產物儲存在室溫下，然後放行到純化部 門。iv)微孔過濾和透析的關鍵變量微孔過濾和透析的關鍵變量描述在表13中。 監測的變量包括滲透物流速和多糖的量。ν)設備清洗微孔過濾以後將入口連接到包含100L生理鹽水的罐上以洗滌一次性盒和容器。 然後用20L IM NaOH清潔系統，滲透物和滲餘物連接到入口上，再循環30分鐘，維持下列條 件入口壓力Pin = 2. 0士0. 2 巴滲透物閥門關閉5分鐘然後大開。然後清空系統和管道，用蒸餾水洗滌直到滲透物和滲餘物的pH值達到5-7。未達 到這個目標PH，拆解系統。微孔過濾和透析期間滲透物除菌所用的Sartobran P濾器的完整性檢測在將這批 產物放行到純化部門前進行。F)發酵模式描述我們分析了 3種GBS菌株M781(血清型III)、H36b(血清型Ib)和090 (血清型 Ia)相應的中試規模的發酵試驗的發酵模式並與30L發酵罐(BBBB公司(B. Braun Biotech Biostat))的實驗室規模的發酵進行了比較，後者使用的是H36b菌株，工藝二者相同。三種中試規模發酵的OD59tlnm模式非常相似，與對照發酵也類似(參見圖22)。微生 物生長的一般模式可用如下方式描述批相持續約2. 5小時，此時的OD59tlnm等於3。酵母提 取物溶液的第一指數分批進料(Fl，150g/L)持續約45分鐘，此時的OD59tlnm等於5。酵母提 取物溶液的第二指數分批進料(F2，150g/L)持續約45分鐘，此時的OD59tlnm約等於10。一水 葡萄糖的第三PH穩態分批進料(F3，550g/L)持續約3小時。G)生長速率和群體倍增時間評價
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在3個輪次的預實驗以及對照發酵過程中評價生長速率(μ)和群體倍增時間 (td)。數值顯示在圖22以及表14中。 預實驗輪次的第一指數分批進料過程中的群體倍增時間在43到77分鐘的範圍 內，這個結果至少和參照發酵一樣好。但是，理想的群體倍增時間為30分鐘。預實驗輪次 的第二指數分批進料過程中的群體倍增時間在41到64分鐘的範圍內，這個結果與參照發 酵幾乎一樣(55分鐘)，非常接近理論群體倍增時間(50分鐘)。H)莢膜多糖產量評價在發酵結束時利用比色法測定cps的濃度，該方法的根據是測定cps內唾液酸化 合物的濃度。根據這個結果，通過cps濃度乘以發酵罐內的最終體積(參照發酵20L，中試 規模的發酵215L)來計算培養期間產生的cps量。如下文「發酵相關分析方法」中所述，還 要計算出體積生產率和比生產率。數值報告在表15中。 I)初始工藝的簡化用兩種方式簡化發酵工藝以避免規模放大後可能出現的變化以及降低發酵罐汙 染的風險。第一種方式是從接種培養基和發酵罐的培養基中去除包含硫胺素、核黃素鹽酸吡 哆醇和煙醯胺(每種0. 05g/L,用0. IM NaOH稀釋，0. 2 μ m過濾除菌)的維生素溶液。確實， 實驗室規模的發酵結果顯示添加這些維生素並不是GBS生長所必須的，對cps產生的影響 可忽略不計。第二種方式是調整發酵過程中進料相的參數。兩個酵母提取物指數進料相可用兩 次瞬時添加替代，葡萄糖的PH穩態進料相可用線性添加替代。第一次瞬時添加(Fl)包括 當OD59tlnm達到2. 5-3的範圍時用蠕動泵以550mL. mirf1的速度添加3. 6L 150g/L的酵母提 取物。第二次瞬時添加(F2)包括當OD59tlnm達到4. 5-5的範圍時用蠕動泵以550mL. mirf1的速度添加13. 4L 150g/L的酵母提取物。第三次線性添加(F3)包括當OD59tlnm達到10-12的 範圍時用蠕動泵以95mL. miiT1的速度添加17L葡萄糖溶液。J)發酵模式描述以及和以前輪次的比較我們分析了這個輪次預實驗的發酵模式並與第一系列的試驗進行了比較，以確保 簡化的工藝對中試規模的發酵沒有任何影響。3次中試規模的發酵試驗的OD59tlnm模式非常相似，與第一輪次的預實驗所觀察到 的一般模式也很相似(參見圖23)。二者之間的相似性說明了工藝的修改對微生物的生長 沒有影響，如實驗室規模的發酵所證明的。K)生長速率、群體倍增時間和莢膜多糖產量的評價這個系列的生長速率和群體倍增時間(表16)與第一輪次的預實驗非常相似，沒
有觀察到明顯的區別。 這些預實驗的最終cps濃度與上一輪次的預實驗相同。這說明實驗室規模或中試 規模發酵工藝的修改沒有產生明顯差異(表17)。 L)工藝的關鍵步驟和工藝驗證所需的採樣計劃的確定在這兩個系列的中試規模發酵過程中，已經用其接受標準和相關採樣計劃確定 了關鍵工藝步驟的重要過程質量控制。第一過程質量控制是接種前搖瓶的OD59tlnm,優選 0. 6-1. 8之間以避免在發酵罐內開始培養時出現可能的遲滯期，如實驗室規模的發酵所見 的那樣。下面的過程質量控制與培養物的純度相關搖瓶培養基做革蘭氏染色並將瓶子和 發酵罐內的培養基加到培養板上培養以確保環境中無汙染物。另外在培養結束時再進行革 蘭氏染色並將發酵罐內的培養基鋪到培養板上以證明發酵過程中無汙染。細胞團滅活36 小時後用0. SMNaOH溶解細胞團並鋪到培養板上培養以證明細胞團已被滅活。表18中所描 述的其他過程質量控制用於計算cps的純化產率。我們設計出了一套參數變異模式(Po2，氣流，O2流，攪拌，pH，溫度)，這是發酵工藝重現性的好指標。L)通用發酵模式的描述以及與上述輪次的比較這個輪次試驗的OD59tlnm模式非常相似，與本實施例中較早輪次的試驗所觀察的一 般模式也很相似(參見圖24)。這個系列的生長速率和群體倍增時間(表18)與預實驗輪次的結果是一致的。更 具體地說，三個輪次試驗進料相的生長速率在以前報導的最大和最小生長速率數值之間。 但是，M781培養過程中F3相的生長速率以及090培養高喲吃中F2相的生長速率與以前報 道的最小值稍低(分別為0. 15 < 0. 18和0. 62 < 0. 65)，但是OD59tlnm的最終值都在較早輪 次的試驗所觀察到的OD59tlnm的極值之間(第一輪次的預實驗中090和H36b菌株的數值分 別為14和25. 1)。 通過比較三株細菌的結果發現，試驗輪次中cps的最終濃度和量比預實驗輪次的 結果稍高(參見表19)。H36b菌株的數值在其他菌株以前獲得的數值之間(0.351^，位於 0. 26和0. 42之間，二者分別是090第一預實驗輪次的結果和M781第二預實驗輪次的結 果)。M781和090菌株的數值與預期的稍高。因此，這些菌株的cps/生物質比例超過10%， 這意味著對純化有利。 關鍵過程質量控制的分析第一個過程質量控制是接種前搖瓶的OD59tlnm,範圍在菌株090的0. 80和M781的 1. 50之間。在發酵罐內開始培養時沒有觀察到遲滯期。搖瓶培養物的純度分析通過革蘭氏 染色確定，結果顯示只有革蘭氏陽性球菌，儲液瓶和發酵罐的培養基在培養結束時也只有 革蘭氏陽性球菌。在滅活36小時後用0. SMNaOH稀釋滅活的細胞團，鋪到培養板上培養。在4個輪次的試驗過程中參數的變異模式(Po2，氣流，O2流，攪拌，pH，溫度)與預 實驗輪次所報導的一般模式相似。
表20 中試規模發酵輪次的結果(多糖純化) * μ g/mg 乾重表21 中試規模發酵輪次的結果(活化/結合) (1) Ja 和 Ib 1. 0-3. 5 ；III 0. 5-2. 5 ；V 0. 5-3. 0*通過NMR廣呢糖廣如等量的發酵體積表22 =IOOOL放大規模後的預測產量(根據中試工藝預測)
57 發酵相關的分析方法生物質測定。在發酵過程中，通過在590nm波長處測定培養物的光密度值來監測 生物質的含量。樣品必須經過稀釋以使吸光度的讀數值落在0.300-0. 600的範圍內。收穫 物的溼重在16000xg離心25分鐘後測定。莢膜多糖含量測定。GBS的血清型特異性莢膜多糖是由下列糖的重複單位組成的 NANA =N乙醯神經氨酸或唾液酸；GLUC 葡萄糖；GAL 半乳糖和NAGA =N乙醯葡萄糖胺。唾液 酸含量用 Svennerholm 建立的化學方法測定(Svennerholm L.，(1957) Biochem. Biophys. ACTA 24:604-611)。不同的血清型重複單位的組成是不同的，因此每一種血清型所用的校 正因子也是不同的。 樣品製備。·離心 10 0D. mL 的量(16000xg, 5min, 4°C )[標準化]·用ImL PBS洗滌細胞團，然後離心(16000xg，5min，4°C )[洗滌]·向細胞團內加入 500mcL Na0H(2N，65°C，lh)[水解]· 1 小時後用 5OOmcL HCl (2N，4°C )中和[中和]·通過離心去除細胞碎片(l6000xg，3Omin, 4°C )[純化]·上清液過濾除菌(0. 22微米)[除菌]
58
· IOOmL 用 9OOml 水稀釋[稀釋]標準曲線製備。菌株C0H1_13(非包膜的)的培養物以樣品相同的方式製備。稀 釋步驟的特徵是加入已知量的唾液酸儲存夜以達到如下終濃度1、5、10、15、20和30mg/mL。 (IOOmL 上清液 +χ mL 唾液酸 SS+900-χ mL H2O)。化學反應。試劑的起始材料為A =間苯二酚(2%, H2O) ；B = CuSO4. 5Η20(0· 1Μ， H2O)。新鮮試劑按如下方法混合:10mLA+0. 25mL B+H20(Vfin = 20mL) - > +HCl (37% ) (Vfin =IOOmL)。試劑混合後可在4°C保持穩定達1周。ImL稀釋的樣品加Iml試劑，90°C孵育 40分鐘，然後測定564nm處的吸光度值。定量。利用標準曲線確定樣品中的NANA量。·使用血清型的校正因子[特異性CP含量(mg/LOD)]·乘以培養物的OD [體積CP含量(mcg/mL或mg/L)]·乘以收穫物的體積[產生的總CP (mg)]實施例6-純化本實施例顯示的是典型純化方法，該方法與以前分離和純化GBS la、lb、III和V 型多糖的方法相比可以得到更高水平的純度。例如如下處理步驟從細菌中提取和純化天然GBS V型多糖細菌發酵GBS V型菌株(例如，CJB11)用複合培養基培養。任何培養方法都可以 使用，但是本文所描述的發酵培養方法是優選的。發酵生物質的滅活和多糖提取(鹼處理)如果需要，生物質應加熱使之到室溫。 氫氧化鈉(4M)加到回收的生物質內，終濃度為0.8M，混合均勻。然後懸液在37°C孵育36 小時並伴隨混合。生物質的中和通過鹼處理提取以後，加入IM TRIS鹼(121. 14g/mol)，終濃度為 50mM(52. 6mL/L鹼混合物)，懸液混合均勻。混合物的pH用HCl (6M)調整到7. 8 (1 1稀 釋的濃鹽酸)。 醇沉澱加入2M CaCl2,終濃度為0. IM (52. 6mL/L中和混合物)，懸液混合均勻。加 入乙醇(96% (ν/ν))，終濃度為30% (ν/ν)乙醇(428mL/L)，懸液混合均勻。正切微孔過濾醇沉澱的上清通過正切微孔過濾回收，使用0.2μπι纖維 素膜(SSH 0. Im2 (Sartorius Sartocon Hydrosart 0.1m2))，透析緩衝液包含 NaCl (0. 5M)+CaCl2 (0. IM)+乙醇30% (ν/ν)，緩衝到ρΗ7· 8。微孔過濾使用透析體積。滲透 物用0. 45/0. 2 μ m濾膜過濾除菌(Sartorius Sartobran濾膜)。注作為替代方法，滲餘 物可通過離心澄清(保留上清液)並儲存在2-8°C。正切透析過濾30kDa 為了去除儲存期間形成的顆粒物質，材料用0. 45/0. 2 μ m 濾膜(Sartobran 濾膜)過濾。材料在 30kDa 纖維素膜(SSH 0. Im(SartoriusSartocon Hydrosart 0. Im))上透析過濾，透析液為25倍體積的TRIS 50mM+NaCl 0. 5M,緩衝到 PH 8. 8，然後更換10被體積的透析液Na2CO2 0. 3M+NaC10. 3M，緩衝到pH 8.8。壓力設定 Δ P [Pin-Pout] 1. O (例如，Pin = 2 巴，Pout = 1 巴)。滲餘物 用0. 45/0. 2 μ m濾膜(Sartorius Sartobran濾膜)過濾除菌。然後材料儲存在2_8°C備用 (最多儲存15天)。深度過濾CUNOBioCap 2000 1300cm2膠囊(或CUNO Z-Carbon R52SP濾膜，用於
59較小規模的製備)上的深度過濾用於去除殘留的蛋白質汙染。所用的膠囊或濾膜數量根據 下列比例確定0. 5cm7mg殘留蛋白質。使用CUNO膠囊的例子利用蠕動泵洗滌膠囊，洗滌液為超過9. OL的Na2CO3 300mM+NaCl 0. 3M,緩衝到pH 8. 8，流速為350士50mL/min。如果材料的體積少於1. 6L,要 用Na2CO3 0. 3M+NaCl 0. 3M，緩衝到pH 8. 8，稀釋到正確體積。材料過濾後用2. 5L Na2CO3 0. 3M+NaCl 0.3M，緩衝到pH 8. 8，洗滌濾膜。從不同膠囊獲得的材料混合起來。收集的材料 用一個新膠囊過濾(用以前數量的1/5)，然後用2. 5L Na2CO3 0. 3M+NaCl 0. 3M，緩衝到pH 8. 8，洗滌。材料用0. 45/0. 2 μ m濾膜(Sartorius Sartobran濾膜)過濾除菌。材料儲存 在2-8°C備用(最多儲存15天)。多糖的再N乙醯化材料用緩衝到pH 8. 8的Na2CO3 (0. 3M) +NaCl (0. 3M)稀釋到2mg 多糖/mL(根據間苯二酚唾液酸試驗估計)。按如下比例製備乙酸酐儲存液8. 3mL乙酸酐 +8. 3mL 96%乙醇+983. 4mL水。將新配製的乙酸酐儲存液加到多糖溶液中，以> 22 1乙 酸酐多糖重複單位的比例稀釋到2mg/mL。材料在室溫下混合孵育2小時。2小時的孵育 結束時測定PH，驗證是否在約8. 8。通過正切透析過濾30kDa純化再N乙醯化的多糖為了去除儲存過程中形成的顆 粒，材料用0.45/0. 2 μ m濾膜(Sartobran濾膜)過濾。注通過離心澄清也是可以接受的。 材料在30kDa纖維素膜(SH 0. Im2 (Sartocon HydrosartO. Im2))上透析過濾，透析液為13 倍體積的IOmM乙酸鈉溶液，設定壓力APtPin-P0uJ 1· 0(例 如 Pin = 2 巴，P。ut = 1 巴)。材料用 0. 45/0. 2 μ m 濾膜(Sartorius Sartobran 濾膜)過濾 除菌。材料儲存在2-8°C備用(最多儲存15天)。回收多糖加入2M的CaCl2,終濃度為0. IM(52. 6mL/L中和混合物)，懸液混合均 勻。添加乙醇(96% (ν/ν))到終濃度80% (ν/ν)(比例為4L/L溶液)，懸液混合均勻。沉 澱用新配製的96%乙醇(每個約50mL)洗滌。3000xg離心10分鐘收集沉澱，真空乾燥成 粉末。分析方法溼-化學分析通過唾液酸溼-化學分析確定糖含量(Svermerholm，L。Biochem. Biophys. Acta 1957，24，604)。用鹽酸水解樣品，水解條件為80°C 90分鐘，然後用NaOH中 和，注射到DIONEX(TM)系統中。數據用CHR0MELE0N(TM)軟體處理。用七分鐘線性梯度的 90 10 到 60 40 0. lMNa0H，0. IM 乙酸鈉0. IM NaOH, 0. 5M NaNO3 洗脫糖，使用的是帶 PAl 網罩的 CarboPac PAl 柱，流速為 1. OmL/min。通過注射未水解的用水溶解成1. 0mg/ml的多糖樣品來測定游離唾液酸。在這 種方式中，從結合的唾液酸中分離出遊離唾液酸是有可能的。圖29顯示的是多糖樣品和 0.5yg/ml標準品(灰線)的重疊。再生步驟出現的峰值是未水解的多糖。游離唾液酸是 一個重要參數，因為它與免疫反應相關。利用MicroBCA(TM)商品化試劑盒(Pierce)測定殘留蛋白質含量。按照Sheldon， Ε. L.等，Biochem. Biophys. Res. Comm. 1989，156 (1) 474 發表的方法測定殘留核酸含量。利用HPAEC-PAD分析方法通過測定鼠李糖殘基的含量來確定殘留的B型多糖的含 量。鼠李糖是B型糖類中的特異性糖，上述類型多糖中未發現有鼠李糖存在，可用於確定莢 膜多糖純化後汙染的糖類殘留物的濃度。分析的樣品是純化的GBS III型多糖，如圖30所示。樣品未出現鼠李糖峰，說明不存在其他糖類汙染。向樣品中加入鼠李糖標準品後可得到 灰色色譜圖。樣品和標準品用2N TFA水解，在100°C水解3. 0小時，然後SpeedVac內蒸發， 用450 μ 1水重建。鼠李糖標準曲線的範圍為1. 0-10.0 μ g/mL·色譜條件如下=CarboPac PAl柱，帶PAl網罩，流速為l.Oml/min，NaOH 12mM 15分鐘，然後用NaOH 500mM再生5分 鍾，隨後用NaOH 12mM再平衡25分鐘。色譜分析各種類型多糖的大約分子量通過HPLC測定，使用SUPER0SE(TM)6HR 10/30色譜柱(GE健康護理公司(GE Healthcare))，PPS平衡，右旋糖酐校正。NMR分析將粉末溶解到ImL氧化氘(D20，Aldrich)中形成均勻濃度來紙杯純化 的多糖樣品。分裝(750μ 的樣品轉移到5-mm NMR管(Wilmad)中。在25°C的條件下，用 Bruker 600MHz光譜儀記錄1H NMR試驗，使用5_mm寬帶探針(Bruker)。利用XWINNMR軟體 包(Bruker)採集和處理數據。利用進行32次掃描的標準單-脈衝試驗採集1_D質子NMR 光譜。傳感器設定在HDO頻率(4. 79ppm)。利用總的再循環時間獲取定量物質的IH NMR光 譜以確保完全回收每一個信號(5x縱向弛豫時間Tl)。記錄2-D同-和異-相關NMR光譜分配給1_D質子NMR模式(參見，圖25_28)。 通過與已發表的數據進行比較來確認峰值分配(Michon，F. ； Chal if our, R. ； Fe ldman, R.； ffessels, Μ. ；Kasper, D. L. ；Gamian, Α. ；Pozsgay, V. ；Jennings, HJ. Infect Immun 1991 ； 59 ； 1690以及相關文章)。結果和討論這個過程提供了一種從鏈球菌純化各種類型多糖的簡單、快速而有效的新方法。 其優點在於該方法不使用DNA酶、RNA酶和蛋白酶處理。產品回收率高，而所有主要汙染物 (蛋白質、賀歲和B型多糖)可降低到以下。這個新純化方法可用於製造來源於這 些莢膜多糖的臨床和商業材料。產物的純度已經過確認，如表24所示。 表24-GBS Ia、Ib、III和V型多糖產物純度總結Γ唾液酸溼-化學分析；2MicroBCA 蛋白質商用試劑盒分析；3核酸試驗；4B型多糖試驗)根據分子排阻層析的結果估計，上述類型多糖的平均分子量為1a、Ib型約為 200kDa, III和V型約為IOOkDa0 GBS la、lb、III和V型多糖的結構一致性通過IHNMR光 譜測定法確定圖25-28)。實施例7-純化本實施例顯示的是可以提供比以前純化莢膜多糖的方法更高水平純度的其他典 型純化方法。GBS la、lb、III和V型多糖的分離和純化
利用如下處理步驟從細菌中提取和純化天然GBS V型多糖細菌發酵GBS V型菌株(例如，CJB11)用複合培養基培養。任何培養方法都可以 使用，但是本文所描述的發酵培養方法是優選的。發酵生物質的滅活和多糖提取(鹼處理)如果需要，生物質應加熱使之到室溫。 氫氧化鈉(4M)加到回收的生物質內，終濃度為0.8M，混合均勻。然後懸液在37°C孵育36 小時並伴隨混合。生物質的中和通過鹼處理提取以後，加入IM TRIS鹼(121. 14g/mol)，終濃度為 50mM(52. 6mL/L鹼混合物)，懸液混合均勻。混合物的pH用HCl (6M)調整到7. 8 (1 1稀 釋的濃鹽酸)。醇沉澱加入2M CaCl2,終濃度為0. IM (52. 6mL/L中和混合物)，懸液混合均勻。加 入乙醇(96% (ν/ν))，終濃度為30% (ν/ν)乙醇(428mL/L)，懸液混合均勻。正切微孔過濾醇沉澱的上清通過正切微孔過濾回收，使用0.2μπι纖維 素膜(SSH 0. Im2 (Sartorius Sartocon Hydrosart 0.1m2))，透析緩衝液包含 NaCl (0. 5M)+CaCl2 (0. IM)+乙醇30% (ν/ν)，緩衝到ρΗ7· 8。微孔過濾使用透析體積。滲透 物用0. 45/0. 2 μ m濾膜過濾除菌(Sartorius Sartobran濾膜)。注作為替代方法，滲餘 物可通過離心澄清(保留上清液)並儲存在2-8°C。正切透析過濾30kDa 為了去除儲存期間形成的顆粒物質，材料用0. 45/0. 2 μ m濾 膜(Sartobran濾膜)過濾。材料通過第一透析過濾步驟過濾，使用30kDa纖維素膜(SSH 0. 6m2 (Sartorius Sartocon Hydrosart 0. 6m2))，透析液為 20 倍體積的 TRIS 5OmM，NaCl 0. 5M，緩衝到pH 8. 8，然後更換10被體積的IOmM磷酸鈉，緩衝到pH 7. 2。壓力設定=Pin = 3巴，Pout = 1巴。第一透析過濾步驟的滲餘物稀釋到10kg，然後用pH4. O的乙酸/乙酸鈉 溶液(2L)處理。處理後得到的懸液用GFPIus 0. 45 μ m膠囊(Sartoris)過濾以去除沉澱， 然後再次用0. 2μπι濾膜(Sartobran Sartorius)過濾。pH維持在4. 4 士 0. 1。過濾的產物 再次用ρΗ8· 8的Na2CO3 0. 3Μ，NaCl 0. 3Μ透析過濾。使用0. 45/0. 2濾膜過濾後，材料儲存 在2-8°C備用(最多儲存15天)。用CUNO膠囊粘附過濾利用CUNO Z-碳R53SLP8藥桶進行過濾。使用蠕動泵將 藥桶裝配在專用容器內，然後用超過20L的WFI洗滌，流速為580士40mL/min。然後用超過 20. OL的pH8. 8的Na2CO3 0. 3M，NaCl 0. 3M以相同的流速洗滌。如果材料的體積少於20L， 那麼要用PH 8. 8的Na2CO3 0. 3M,NaCl 0.3M稀釋到理想體積。然後過濾材料並收集到無菌 袋內。容器內加入20LpH8. 8的Na2CO3 0. 3M,NaCl 0. 3M，過濾後收集6L過濾的產物。材料 用0. 45/0. 2 μ m濾膜過濾。材料儲存在2-8°C備用(最多儲存15天)。多糖的再N乙醯化Z-碳過濾的材料用乙酸酐/乙醇溶液處理使其再N乙醯化。 處理IL多糖溶液所需的反應混合物按如下比例製備4. 15mL乙酸酐+4. 15mL 96%乙醇。 反應溶液在室溫下攪拌孵育2小時。2小時結束時檢測pH，確定其在7左右。通過正切透析過濾30kDa純化再N乙醯化的多糖材料在30kDa纖維素膜(0. Im2, SH(Sartocon Hydrosart))上透析過濾，透析液為13倍體積的pH7. 2的IOmM磷酸鉀，設定 壓力 APEPin-P0uJ 1· 0(例如 Pin = 2 巴，Pout = 1 巴)。材 料用0. 45/0. 2 μ m濾膜過濾。材料儲存在_20°C備用。參考文獻
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權利要求
一種為了以生產規模製備莢膜多糖(cps)的培養鏈球菌的方法，其中所述方法包括(a)提供表達cps的鏈球菌菌株的接種物，以及(b)通過發酵培養菌株，其中所述的培養包括向培養基中線性添加碳源，不需要用算法通過監測培養基的pH來控制培養。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，該方法還包括步驟(c)回收莢膜多糖。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述鏈球菌菌株還包括無乳鏈球菌。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述無乳鏈球菌菌株是090、H36b、CBJlll 或 M781。
5.如權利要求1到4中任一項所述的方法，其特徵在於，所述接種物的光密度(OD)在 約0. 6到約1. 8之間。
6.如權利要求1到5中任一項所述的方法，其特徵在於，所述培養基的pH在約6.0到 約7. 5之間。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述pH約等於7.3。
8.如權利要求1到7中任一項所述的方法，其特徵在於，所述培養基的溫度在約34到 約38°C之間。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述溫度為約36°C。
10.如權利要求1到9中任一項所述的方法，其特徵在於，所述碳源還包括葡萄糖。
11.如權利要求1到10中任一項所述的方法，其特徵在於，所述培養還包括監測培養基 的0D，這樣當OD達到指定水平時開始所述的線性添加碳源。
12.如權利要求11所述的方法，其特徵在於，所述指定水平選擇為可達到更高的cps體 積產量。
13.如權利要求11或12所述的方法，其特徵在於，所述指定水平在約9.8到約10. 2之間。
14.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述指定水平約為10。
15.如權利要求11到14中任一項所述的方法，其特徵在於，所述培養還包括監測培養 基的0D，這樣在OD達到第一和第二瞬時添加水平時，在所述的線性添加碳源前兩次瞬時添 加酵母提取物。
16.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述第一和第二瞬時添加水平選擇為可 達到更高的cps體積產量。
17.如權利要求16所述的方法，其特徵在於，所述第一瞬時添加水平在約2.8到約3. 2 之間。
18.如權利要求17所述的方法，其特徵在於，所述第一瞬時添加水平約為3.0。
19.如權利要求16到18中任一項所述的方法，其特徵在於，所述第二瞬時添加水平在 約4. 3到約4. 7之間。
20.如權利要求19所述的方法，其特徵在於，所述第二瞬時添加水平約為4.5。
21.如權利要求1到20中任一項所述的方法，其特徵在於，所述培養基是用於培養鏈球 菌的確定成分培養基，包含磷酸鹽源、礦物質源、碳源、維生素源和胺基酸源，其中所述維生 素源由選自如下7種維生素的6種或更少的維生素組成生物素、煙醯胺、泛酸鈣、核黃素、 鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇和葉酸，其中的兩種維生素必須是泛酸鈣和煙醯胺。
22.如權利要求1到20中任一項所述的方法，其特徵在於，所述培養基是用於培養鏈球菌的複合培養基，包含酵母提取物、磷酸鹽源、碳源、維生素源以及可選的胺基酸源，其中所 述維生素源由選自如下5種維生素的4種或更少的維生素組成生物素、煙醯胺、核黃素、鹽 酸硫胺素和鹽酸吡哆醇，其中一種維生素必須是生物素。
23.一種用於培養鏈球菌的培養基，該培養基包含鏈球菌菌株、磷酸鹽源、碳源、維生素 源和胺基酸源，其中所述維生素源由選自如下7種維生素的6種或更少的維生素組成生物 素、煙醯胺、泛酸鈣、核黃素、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇和葉酸，其中的兩種維生素必須是泛 酸鈣和煙醯胺。
24.如權利要求23所述的培養基，其特徵在於，所述鏈球菌是無乳鏈球菌。
25.如權利要求23或24所述的培養基，其特徵在於，所述磷酸鹽源由K2HP04、KH2PO4, Na2HPO4. H2O, NaH2PO4. H2O 或 NaCl 組成。
26.如權利要求23-25中任一項所述的培養基，其特徵在於，所述碳源是葡萄糖。
27.如權利要求23-26中任一項所述的培養基，其特徵在於，所述維生素源由選自如下 7種維生素的6種或更少的維生素組成生物素、煙醯胺、泛酸鈣、核黃素、鹽酸硫胺素、鹽酸 吡哆醇和葉酸，其中的兩種維生素必須是泛酸鈣和煙醯胺。
28.如權利要求23-26中任一項所述的培養基，其特徵在於，所述維生素源由選自如下 7種維生素的5種或更少的維生素組成生物素、煙醯胺、泛酸鈣、核黃素、鹽酸硫胺素、鹽酸 吡哆醇和葉酸，其中的兩種維生素必須是泛酸鈣和煙醯胺。
29.如權利要求23-26中任一項所述的培養基，其特徵在於，所述維生素源由選自如下 7種維生素的4種或更少的維生素組成生物素、煙醯胺、泛酸鈣、核黃素、鹽酸硫胺素、鹽酸 吡哆醇和葉酸，其中的兩種維生素必須是泛酸鈣和煙醯胺。
30.如權利要求23-26中任一項所述的培養基，其特徵在於，所述維生素源由選自如下 7種維生素的3種或更少的維生素組成生物素、煙醯胺、泛酸鈣、核黃素、鹽酸硫胺素、鹽酸 吡哆醇和葉酸，其中的兩種維生素必須是泛酸鈣和煙醯胺。
31.如權利要求23-26中任一項所述的培養基，其特徵在於，所述維生素源由泛酸鈣和 煙醯胺組成。
32.如權利要求23-31中任一項所述的培養基，其特徵在於，所述胺基酸源由選自如下 19種胺基酸的19種或更少的胺基酸組成丙氨酸、精氨酸、穀氨醯胺、甘氨酸、組氨酸、異 亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、天 冬氨酸、鹽酸半胱氨酸、穀氨酸和酪氨酸，其中15種必須是精氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨 酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、鹽酸半胱氨酸、 穀氨酸和酪氨酸。
33.如權利要求23-31中任一項所述的培養基，其特徵在於，所述胺基酸源由選自如下 19種胺基酸的18種或更少的胺基酸組成丙氨酸、精氨酸、穀氨醯胺、甘氨酸、組氨酸、異 亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、天 冬氨酸、鹽酸半胱氨酸、穀氨酸和酪氨酸，其中15種必須是精氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨 酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、鹽酸半胱氨酸、 穀氨酸和酪氨酸。
34.如權利要求23-31中任一項所述的培養基，其特徵在於，所述胺基酸源由選自如下 19種胺基酸的17種或更少的胺基酸組成丙氨酸、精氨酸、穀氨醯胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、天 冬氨酸、鹽酸半胱氨酸、穀氨酸和酪氨酸，其中15種必須是精氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨 酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、鹽酸半胱氨酸、 穀氨酸和酪氨酸。
35.如權利要求23-31中任一項所述的培養基，其特徵在於，所述胺基酸源由選自如下 19種胺基酸的16種或更少的胺基酸組成丙氨酸、精氨酸、穀氨醯胺、甘氨酸、組氨酸、異 亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、天 冬氨酸、鹽酸半胱氨酸、穀氨酸和酪氨酸，其中15種必須是精氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨 酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、鹽酸半胱氨酸、 穀氨酸和酪氨酸。
36.如權利要求23-31中任一項所述的培養基，其特徵在於，所述胺基酸源由精氨酸、 甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、 纈氨酸、鹽酸半胱氨酸、穀氨酸和酪氨酸組成。
37.一種用於培養鏈球菌的培養基，該培養基包含鏈球菌菌株、酵母提取物、磷酸鹽源、 碳源、維生素源和胺基酸源，其中所述維生素源由選自如下5種維生素的4種或更少的維生 素組成生物素、煙醯胺、核黃素、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆醇葉酸，其中的一種維生素必須是 生物素。
38.如權利要求37所述的培養基，其特徵在於，所述鏈球菌是無乳鏈球菌。
39.如權利要求37或38所述的培養基，其特徵在於，所述維生素源由選自如下5種維 生素的4種或更少的維生素組成生物素、煙醯胺、核黃素、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆醇葉酸， 其中的一種維生素必須是生物素。
40.如權利要求37或38所述的培養基，其特徵在於，所述維生素源由選自如下5種維 生素的3種或更少的維生素組成生物素、煙醯胺、核黃素、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆醇葉酸， 其中的一種維生素必須是生物素。
41.如權利要求37或38所述的培養基，其特徵在於，所述維生素源由選自如下5種維 生素的2種或更少的維生素組成生物素、煙醯胺、核黃素、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆醇葉酸， 其中的一種維生素必須是生物素。
42.如權利要求37或38所述的培養基，其特徵在於，所述維生素源由生物素組成。
43.一種從無乳鏈球菌中純化莢膜多糖的方法，該方法包括使用附著濾器過濾的步驟。
44.如權利要求43所述的方法，其特徵在於，所述方法不包括陽離子去汙劑處理以沉 澱莢膜多糖的步驟以及隨後的再增溶莢膜多糖的步驟。
45.如權利要求43或44所述的方法，其特徵在於，所述附著濾器是蛋白質附著濾器。
46.如權利要求43-45中任一項所述的方法，其特徵在於，所述附著濾器是碳濾器。
47.如權利要求43-46中任一項所述的方法，其特徵在於，所述使用附著濾器過濾的步 驟通過如下步驟進行(i)醇沉澱汙染的蛋白質和/或核酸；以及(ii)透析過濾。
48.如權利要求43-47中任一項所述的方法，其特徵在於，所述使用附著濾器過濾的步 驟通過如下步驟進行(iv)再N乙醯化； (ν)透析過濾。
49.一種製備純化的莢膜多糖的方法，該方法包括(a)提供包含莢膜多糖的粗分離物；(b)去除因粗分離物與醇溶液接觸而形成的醇沉澱物；(c)過濾去除小分子化合物而保留莢膜多糖；以及(d)利用蛋白質附著濾器去除蛋白質汙染物，生產出純化的莢膜多糖。
50.如權利要求49所述的方法，其特徵在於，該方法還包括步驟(e)再N乙醯化純化的 莢膜多糖。
51.如權利要求50所述的方法，其特徵在於，該方法還包括步驟(f)沉澱純化的莢膜多糖。
52.如權利要求51所述的方法，其特徵在於，該方法還包括步驟(g)以莢膜多糖為一種 組分製備疫苗。
53.如權利要求49-52中任一項所述的方法，其中步驟(b)包括添加醇溶液至足以沉澱 核酸汙染物但是不沉澱莢膜多糖的濃度。
54.如權利要求53所述的方法，其特徵在於，所述醇溶液包括乙醇。
55.如權利要求53或54所述的方法，其特徵在於，所述醇溶液還包括CaCl2。
56.如權利要求54或55所述的方法，其特徵在於，所述醇溶液添加至濃度為約10%到 約50%乙醇。
57.如權利要求56所述的方法，其特徵在於，所述醇溶液添加至濃度為約30%乙醇。
58.如權利要求49-57中任一項所述的方法，其特徵在於，所述蛋白質附著濾器是活性 碳濾器。
全文摘要
本發明屬於細菌培養領域，更具體地說，本發明涉及優化培養條件以提高鏈球菌菌株補料分批培養的細菌莢膜多糖產率以及適於以生產規模從鏈球菌菌株純化莢膜多糖的新純化方法，該方法比以前生產規模的製備所得到的純度水平更高。
文檔編號C12N1/20GK101932698SQ200880126144
公開日2010年12月29日 申請日期2008年12月19日 優先權日2007年12月20日
發明者C·M·司卡拉, F·伯爾蒂, F·諾萊利, G·巴卓奇, P·科斯坦蒂諾, R·奧利弗瑞, S·富塔納 申請人:諾華有限公司