用於治療糖尿病併發症的藥用組合物的製作方法

2023-05-13 00:55:31

專利名稱：：用於治療糖尿病併發症的藥用組合物的製作方法
技術領域：
：公開了一種用P-阻滯劑進行給藥來治療糖尿病併發症的方法。糖尿病併發症是由糖尿病引起的，並對它存在很少或不存在治療選擇。本發明描述了(3-阻滯劑在糖尿病併發症治療中的使用。本發明還描述了對作為糖尿病併發症的主要誘發因素之一的醛糖還原酶的抑制作用。還提供了糖尿病傷口癒合的方法。公開了用來治療諸如糖尿病傷口的糖尿病併發症的組合物。本發明包括施用P-阻滯劑外用製劑來改善糖尿病傷口癒合的過程，所述P-阻滯劑基本上不具有抗菌活性。本發明還涉及提高糖尿病個體在傷口上皮化組織(epithelializedtissue)癒合時膠原蛋白的累積速率。
背景技術：
：全球範圍內發生的糖尿病從1985年估計的30,000,000位患者增加到2007年的估計245,000,000位患者，並將在2025年進一步增加至380,000,000(來源國際糖尿病聯盟(InternationalDiabetesFederation))。衝唐尿病和糖尿病併發症的治療費用在2007年達到了232,000,000,000美元並預計到2025年時將超過302，500,000,000美元。慢性糖尿病導致了多種糖尿病併發症，例如糖尿病神經病變、糖尿病腎病、糖尿病心肌病、糖尿病性視網膜病變、糖尿病性白內障、糖尿病性膀胱病、糖尿病性角膜病變、糖尿病皮膚病變、糖尿病樣i血管病變、心肌梗死、黃斑水腫，神經傳導受損和糖尿病傷口。糖尿病併發症的治療依賴於對血糖水平的控制。因此，標準的抗糖尿病藥並不適合作為糖尿病併發症的治療選擇。迫切需要用於糖尿病併發症的新組合物和治療方式。面對糖尿病的主要潛在問題之一即是被減弱的傷口癒合。所有患有糖尿病的人群(2,600,000)中的15%在其有生之年可能患上足部潰瘍。由於這些潰瘍不癒合或癒合極度緩慢，因此這些潰瘍實際上有發展為慢性的趨勢。目前，患有糖尿病足部潰瘍的患者在美國約有750,000人，歐洲約有980,000人，世界上其他地方約有110萬人，總計約280萬人。由於高達25。/。的糖尿病足部潰瘍患者最終需要進行截肢，因此糖尿病足部潰瘍是嚴重的問題。糖尿病傷口癒合的醫療重要性並沒有被過分誇大。進行癒合的能力是人類健康的核心，由於傷口癒合能使患者克服外傷性損傷、外科手術以及由於例如糖尿病的代謝紊亂、微生物因素或其他的物理或化學因素所造成的傷口。傷口無法癒合在糖尿病中是一個嚴重的問題，它使發病率增加(JJ.雷諾茲，英國皮膚病學雜誌，112715-723(1985)(JJ.Reynolds，BritishJDermatol,112715-723(1985));J.A.加洛韋和C.R.舒曼,美國工業醫學期刊，34177-191(1963)(J.A.GallowayandCR.Shuman,AmJMed，34177-191(1963));以及S.H.珀爾和I.O.肯納特，足外科雜誌，27,268-270(1988)(S.H.PearlandI.O.Kanat，JFootSurg,27，268-270(1988)))。傷口癒合中的修復應答由多個細胞成分進行協調，所述多個細胞成分通過多種途徑來共同發揮作用，包括由炎症效應細胞的損害的浸潤。隨後，成纖維細胞組成與炎症效應細胞一起提供抗菌機制並促進壞死組織的除去，同時產生新的結締組織。葡萄糖代謝基礎性紊亂可能擾亂這些複合物和互相作用的保護過程。早期的工作已經指出糖尿病傷口癒合中的細胞功能障礙涉及有缺陷的中性粒細胞功能(J.D.巴格達蒂等人,糖尿病，27,677-681(1978)(J.D.Bagdadeetal.，Diabetes,27，677-681(1978);C.M.諾蘭等人，糖尿病，27，889-894(1978)(CM.Nolanetal.，Diabetes,27，889-894(1978));A.G.莫厄特和J.鮑姆,臨床研究期刊十二月刊，50，2541-2549(1971)(A.G.MowatandJ.Baum，J.ClinInvestDecember,50，2541-2549(1971)))、傷口的炎性細月包的延遲浸潤(D.G.格林哈德等人，美國臨床病理學雜誌，136,1235(1990)(D.G.Greenhalghetal.，AmJPathol，136,1235(1990))和法赫等人,外科學214,175-180(1991)(Faheyetal.，Surg214，175-180(1991)))、膠原蛋白產量的減少(W.H.古德森和T.K.漢特，分析學報，124,401-411(1977)(W.H.GoodsonandT.K.Hunt,JAnal,124,401-411(1977))和W.H.古德森和T.K.漢特，糖尿病四月刊，35，491-495(1986)(W.H.GoodsonandT.K.Hunt,DiabetesApr,35,491-495(1986)))和內源性生長因子(例如鹼性成纖維細胞生長因子，它為肉芽組織的較緩慢的形成和傷口閉合提供基礎)活性的降低。超過100種已知的生理因素造成了患有糖尿病的個體的傷口癒合缺陷(歐亞瑪等人，糖尿病研究與臨床實踐73,227-234(2006)(Oyama，etal.Diabetes:ResearchandClinicalPractice73，227-234(2006));H.布雷姆和M.託米奇-坎尼克，臨床研究期刊，117,1219-1222(2007)(H.BremandM.Tomic-Canic,J.Clin.Invest,117,1219-1222(2007)))。這些因素包括降低或減弱的生長因子產量、血管生成應答、巨噬細胞功能、膠原蛋白的累積、表皮屏障功能、肉芽組織的數量、角質形成細胞和成纖維細胞的遷移和增殖、表皮神經的數量、骨癒合、以及細胞外基質(ECM)組成的積累及其通過金屬蛋白酶(MMPs)進行的重建之間的平衡。傷口癒合作為對損傷的細胞應答而發生，並涉及角質形成細胞、成纖維細胞、內皮細胞、巨噬細胞和血小板的活化。需要由這些細胞類型釋放的許多生長因子和細胞因子相互配合併維持癒合的進行。對患者表皮活檢進行的分子分析已經識別了與延遲的傷口癒合有關的病原體標記物。它們包括c-myc的過度表達和p-連環蛋白的核定位。與表皮生長因子受體(EGFR)降低和異常定位以及糖皮質激素途徑的活化相結合，抑制了角質形成細胞的遷移。在糖尿病足部潰瘍(DFUs)的未癒合邊緣(胼胝)處，角質形成細胞表現出不遷移、過度增殖和不完全分化。成纖維細胞顯示了表型轉化以及降低的遷移和增殖。糖尿病足部潰瘍的病因是複雜的，並且由於各種原因，傷口癒合通常不是非常成功的。糖尿病足部潰瘍的病因與外周血管疾病、自主神經病變和內皮功能障礙有關。非最適於傷口癒合的代謝條件(高血糖、高血脂症、高胰島素血症、促凝血狀態)會愈發延遲該過程，並且也可能存在。傷口癒合是一個複雜的過程，它以三個交迭的階段為特徵炎症、組織形成和組織重建(H.布雷姆和M..託米奇-坎尼克，臨床研究期刊，117,1219-1222(2007))。這一順序過程由真皮和表皮內的細胞的互相作用而引發，伴隨著化學賦形劑從炎症細胞、成纖維細胞和角質形成細胞釋放。在組織形成過程中，局部細胞和遷移細胞合成的生長因子刺激成纖維細胞遷移進入傷口，成纖維細胞在該傷口處進行增殖並構建細胞外基質。已經知道糖尿病與結締組織代謝的各種改變有關，結果糖尿病面臨傷口癒合不良的問題。在大鼠的糖尿病傷口癒合過程中觀察到的普遍特徵是炎症，它是初始癒合階段的緩慢開始，其傾向於使癒合時間延長，降低癒合區域的中性粒細胞的密度，以及導致發生癒合的區域內不能進行巨噬細胞對中性粒細胞的置換。皮膚傷口癒合是複雜且得到良好協調的生物過程，它需要角質形成細胞和成纖維細胞二者及其他細胞類型相互配合的遷移和增殖。表皮創傷產生細胞因子、生長因子、蛋白酶並啟動細胞外基質組成的合成，所有這些可以對上皮再形成所必須的角質形成細胞遷移和增殖的過程進行調節。與糖尿病有關的膠原蛋白的缺失可能是由於新合成的膠原蛋白的合成水平降低和/或其代謝增強所導致的。這些在性質上和在數量上的異常使得在糖尿病病症中觀察到被減弱的傷口癒合。已經報導了糖尿病中細胞損傷的多種機制(酒田等人，動脈粥樣硬化血栓症雜質，3,169-176(2000)(Sakataetal.,J.Atheroscler.Thromb.3,169-176(2000));D.K.維斯'M丄希茲,維生素與激素，60,149-193(2000)(D.K.Ways,M丄Sheetz，Vitam.Horm.60，149-193(2000);真島等人，脂血症新見，4,411-418(2001)(Mashima，etal.,Curr.Opin.Lipidol.4,411-418(2001))),包括加速的糖化作用、提高的蛋白激酶C的活性以及增加的氧化應激，但對於精確的機制並沒有得到完全的理解。崛田小組(N.坂本、J.H.木下、P.F.卡多爾、N.崛田，多元醇通路及其在糖尿病併發症中的作用，艾斯維爾科學出版社B.V.,阿姆斯特丹，1988(N.Sakamoto,J.H.Kinoshita，P.F.Kador,N.Hotta，PolyolPathwayanditsRoleinDiabeticComplications,ElsevierScienceB.V.,Amsterdam,1988))認為多元醇通路的參與是由高濃度葡萄糖誘導的多種器官損傷的機制。所述多元醇通路由兩步組成。第一步是葡萄糖向山梨糖醇的轉化，第二步是山梨糖醇向果糖的轉化。關鍵酶是將葡萄糖轉化為山梨糖醇的醛糖還原酶。在許多組織中發現了這種酶。高血糖增強了這種多元醇通路，結果使山梨糖醇在細胞內累積。山梨糖醇在細胞內的累積引起各種器官損傷。已經認為高滲透壓和高氧化應激是多元醇通路參與細胞損傷的機制。然而，仍然沒有完全理解多元醇通路的精確機制。已經觀察到，高葡萄糖誘導的內皮細胞損壞可以由伴隨有增強的氧化應激的多元醇通路的活化介導。醛糖還原酶抑制劑的使用說明了對多元醇通路的抑制可以防止糖尿病病症下發生的內皮細胞損壞。已知(3-腎上腺素能受體參與了傷口癒合的過程，而且激動劑已經表現出延遲傷口癒合過程。也已經證實了P-腎上腺素能受體的誘導抑制角質形成細胞遷移，這延遲了傷口癒合(陳等人，皮膚病學研究雜誌，119,1261-8(2002)(Chenetal.，J.Invest.Dermatol.119,1261-8(2002)))。還有其他的文獻描述了水溶液形式或滴眼液(opthalmicdrops)形式的P-拮抗劑的外部應用(雷迪等人，英國眼科學雜誌,78,377-380(1994)(Reidyetal.,Br.J.Ophthalmol.78，377-380(1994))。傳田等人，皮膚病學研究雜誌，121,142-148(2003)(Dendaetal.，J.Invest.Dermatol.121，142-148(2003)))。此外，卩-阻滯劑能夠增加梗塞的心臟處的血管生成說明了它們促進了血管生成，這在傷口癒合中可能是有用的(美國生理學雜誌-心臟與循環生理學(AmJPhysiolHeartCircPhysiol.2005))。另夕卜，普萘洛爾(propranolol)通過控制cAMP和cGMP的比例顯示出增強肺膠原蛋白(RC林登斯米特和HP威特斯奇；藥理與實驗治療，232,346-350(1985)(RCLindenschmidtandHPWitschi;PharmacologyandExperimentalTherapeutics,232，346-350(1985)))。然而，對於卩-腎上腺素能受體阻滯劑在糖尿病併發症(例如糖尿病傷口癒合)中的用途未有報導，而且糖尿病傷口癒合涉及的病理與常規或外傷傷口癒合不同。
發明內容本發明提供了通過用(3-腎上腺素能拮抗劑或(3-阻滯劑進行給藥來治療由糖尿病引起的糖尿病併發症的方法和組合物。本發明還提供了用來治療糖尿病患者的慢性糖尿病傷口的方法，該方法包括用治療劑量的試劑向患者進行給藥，例如P-腎上腺素能阻滯劑，它對增強的醛糖還原酶活性進行抑制，提高一氧化氮水平，促進成纖維細胞的遷移，減少肉芽組織的形成並提高血管灌注，因此使向癒合的糖尿病傷口供給的氧氣增加。本發明的一個目的是提供一種治療哺乳動物的糖尿病併發症的方法，該方法包括將在治療上有效量的P-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽給藥於需要這種治療的患者。該在治療上有效量的P-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽在其藥用可接受載體、賦形劑或稀釋劑中被提供。優選地，所述糖尿病併發症選自由糖尿病神經病變、糖尿病腎病、糖尿病心肌病、糖尿病性視網膜病變、糖尿病性白內障、糖尿病性膀胱病、糖尿病性角膜病變、糖尿病皮膚病變、糖尿病^f效血管病變、心肌梗死、黃斑水腫、神經傳導受損和糖尿病傷口所組成的組。(3-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽可以以緩釋形式進行給藥。所述哺乳動物可以為靈長類動物、犬科動物、貓科動物、牛科動物、綿羊、豬科動物、^^駝科動物、山羊、齧齒動物或馬科動物。優選地，所述哺乳動物為人類。可以通過用在治療上有效量的P-腎上腺素能阻滯劑進行給藥來治療糖尿病併發症，所述P-腎上腺素能阻滯劑可以包括但不限於醋丁洛爾(acebutolol)、阿普洛爾(alprenolol)、氨磺洛爾(amosulalol)、阿羅洛爾(arotinolol)、阿替洛爾(atenolol)、苯呋洛爾(befimolol)、倍他洛爾(betaxolol)、貝凡洛爾(bevantolol)、比索洛爾(bisoprolol)、波。引洛爾(bopindolol)、溴節銨(bretylol)、布庫洛爾(bucumolol)、布菲洛爾(bufetolol)、丁呋洛爾(bufUralol)、布尼洛爾(bunitrolol)、布引洛爾(buprandolol)、布拉洛爾(bup薩lol)、丁非洛爾(butofi固)、卡拉洛爾(ca畫lol)、卡替洛爾(carteolol)、卡維地洛(carvedilol)、塞利洛爾(celiprolol)、西他洛爾(cetamolol)、西那洛爾(cinamolol)、氯拉洛爾(cloranolol)、地來洛爾(dilevatol)、恩布洛爾(entbutolol)、依洋洛爾(epanolol)、艾司洛爾(esmolol)、呋洛爾(fUmolol)、茚諾洛爾(indenolol)、替莫洛爾(istalol)、拉貝洛爾(labetalol)、左倍他洛爾(levobetaxolol)、左布諾洛爾(levobunolol)、曱巧l洛爾(mepindolol)、美替》各爾(metipranolol)、美替普萘》各爾(metipropranolol)、美託洛爾(metoprolol)、莫普洛爾(moprolol)、納多洛爾(nadolol)、萘肝洛爾(nadoxolol)、奈比洛爾(nebivolol)、尼普地洛(nipradilol)、美替卜洛爾(optipranolol)、氧烯洛爾(oxprenolol)、噴布洛爾(penbutolol)、培布洛爾(perbutolol)、卩引咪洛爾(pindolol)、普拉洛爾(practolol)、萘心定(pronethalol)、普萘洛爾(propranolol),胡椒喘定(protokylol)、索他洛爾(sotalol)、磺千心定(sulfmalol)、他林地洛(talindol)、特他洛爾(tertatolol)、替索洛爾(tillisolol)、噻嗎洛爾(timolol)、託利洛爾(toliprolol)、抑肽酶(trasylol)、希苯洛爾(xibenolol)及其藥物可接受鹽或溶劑化物。可以按每小時、每日、每周或每月進行給藥。每日給藥可以為每天給藥l-6次。卩-腎上腺素能阻滯劑可以通過經口、靜脈內、腹腔內、眼部、非消化道、外用、皮下、硬膜下、靜脈內、肌肉內、鞘內、腹腔內、腦內、動脈內、病灶10內、局部或肺部途徑進行給藥。當通過經口途徑進行給藥時，P-腎上腺素能阻滯劑的劑量優選為約lmg至1000mg。當通過眼部途徑給藥時，(3-腎上腺素能阻滯劑的劑量優選為約0.001°/。至10.0%。當通過外用途徑進行給藥時，(3-腎上腺素能阻滯劑的劑量優選為約0.001%至50.0%.本發明還提供用於對需要治療的患者的糖尿病傷口癒合進行治療的外用藥用組合物，該組合物包括在治療上有效量的(3-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽，以及藥用可接受外用載體、賦形劑或稀釋劑，其中，所述組合物的形式為乳膏(cream)、軟膏(ointment)、外用藥籤(topicalswab)、乳液(emulsion)、噴霧(spray)或洗劑(lotion)。本發明還提供一種用於對需要治療的患者的糖尿病傷口癒合進行治療的外用藥用組合物，該組合物包括在治療上有效量的P-腎上腺素能阻滯劑艾司洛爾、其前藥或其藥物可接受鹽，以及藥用可接受外用載體、賦形劑或稀釋劑，其中，所述組合物的形式為乳膏、凝膠、外用液(topicalsolution)、皮膚貼(patch)、軟膏、外用藥籤、乳液、噴霧或洗劑。本發明還提供一種治療糖尿病傷口的方法，該方法包括向需要治療的患者用治療量的P-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽進行外部給藥。優選地，所述P-腎上腺素能阻滯劑為艾司洛爾。用來治療糖尿病併發症的艾司洛爾可以參與選自由以下機制所組成的組的機制誘導一氧化氮產生；提高糖尿病傷口處膠原蛋白的水平；通過增強糖尿病傷口處的新生血管來提高血管灌注；通過增強糖尿病傷口的血管灌注來增加氧供給；對糖尿病患者體內提高的醛糖還原酶活性進行抑制；增強在糖尿病傷口中的生長因子，例如神經生長因子、上皮生長因子、血管內皮生長因子、血小板衍生生長因子，以及它們的組合。可以以乳膏、軟膏、外用藥籤、乳液、噴霧或洗劑的形式外部施用P-腎上腺素能阻滯劑。當所述p-腎上腺素能阻滯劑為艾司洛爾時，可以以乳膏、凝膠、外用液、皮膚貼、軟膏、外用藥籤、乳液、噴霧或洗劑的形式外部施用艾司洛爾。所述哺乳動物可以為靈長類動物、犬科動物、貓科動物、牛科動物、綿羊、豬科動物、駱駝科動物、山羊、齧齒動物或馬科動物。優選地，所述哺乳動物為人類。本發明進一步提供治療哺乳動物中的由醛糖還原酶介導的糖尿病併發症的方法，該方法包括向需要治療的患者用在治療上有效量的具有醛^f唐還原酶活性的(3-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽進行給藥。優選地，所迷(3-腎上腺素能阻滯劑為艾司洛爾、噻嗎洛爾或普萘洛爾(propanolol)。在治療上有效量的P-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽可以在其藥用可接受載體、賦形劑或稀釋劑中被提供。優選地，由醛糖還原酶介導的糖尿病併發症選自由糖尿病神經病變、糖尿病腎病、糖尿病心肌病、糖尿病性視網膜病變、糖尿病性白內障、糖尿病性膀胱病、糖尿病性角膜病變、糖尿病皮膚病變、糖尿病微血管病變、心肌梗死、黃斑水腫、神經傳導受損和糖尿病傷口所組成的組。具體實施例方式根據本發明的具體實施方式，使用下列縮寫和定義。應該注意的是，當使用於此時，單數形式"一個(a)"、"與"和"該(the)"包括多個被提及對象，除非上下文已經明確表示是其他意思。因此，例如，對"劑量"的描述包括本領域公知的一種或多種劑量及其等效量。本文所討論的出版物在本申請的申請日之前單獨地提供它們公開的內容。本文中沒有形成這樣的認可本發明無權藉助於在先發明而先於這些出版物。此外，所提供的出版物的日期可能與實際公開日期不同，這需要另外進行確認。本文使用的術語"受治療者(subject)"或"患者"表示包括哺乳動物。所述哺乳動物可以為靈長類動物、犬科動物、貓科動物、牛科動物、綿羊、豬科動物、駱駝科動物、山羊、齧齒動物或馬科動物。優選地，所述哺乳動物為人類。本文使用的術語"療效(efficacy)"表示的特定處理規則的有效性。對治療糖尿病併發症和傷口的療效進行評價的方法是治療和診斷醫療行業中公知的。短語"藥物可接受載體"和"藥物可接受賦形劑"是表示用於形成製劑中僅起到載體作用的部分的任意化合物。所述藥物可接受載體或賦形劑通常是安全無毒的，並且既不是生物劑也不會產生不期望的效果。本發明中使用的藥物可接受載體或賦形劑包括一種或多於一種的這種載體或賦形劑。本文使用的術語"治療"和"處理，，等通常表示獲得期望的藥理學和生理學的效果。更具體地說，本文中描述的試劑用於治療患有糖尿病併發症和/或糖尿病傷口的患者。可以通過醛糖還原酶或其他的作用機制(例如對醛糖還原酶活性增強進行抑制、誘導一氧化氮產生；提高糖尿病傷口處膠原蛋白的水平；通過增強糖尿病傷口處的新生血管來提高血管灌注；通過增強糖尿病傷口的血管灌注來增加氧供給；對糖尿病患者體內提高的醛糖還原酶活性進行抑制；增強在糖尿病傷口中的生長因子，例如神經生長因子、上皮生長因子、血管內皮生長因子、血小板衍生生長因子)來介導糖尿病併發症。本文中使用的術語"處理"，包括了對哺乳動物(特別是人類)的疾病進行的任何處理。"在治療上有效量"表示當用本文公開的劑(agent)、試劑、化合物、組合物或這些物質的組合對哺乳動物進行給藥時，它們的足以有效地對抗糖尿病併發症或糖尿病傷口的量。在美國，至少有17,000,000的人患有糖尿病，並且每年還會診斷出接近1,000,000的新增病例。糖尿病人口中的大部分被診斷有嚴重的糖尿病併發症，包括糖尿病神經病變、糖尿病腎病、糖尿病心"幾病、糖尿病性一見網膜病變、糖尿病性白內障、糖尿病性膀胱病、糖尿病性角膜病變、糖尿病皮膚病變、糖尿病微血管病變、心肌梗死、黃斑水胂、神經傳導受損和糖尿病傷口。目前對患有糖尿病併發症的患者的治療選擇是有限的。因此，對於有效治療糖尿病併發症的迫切需要就成為本發明的主要課題。糖尿病傷口患者通常表現出減少的傷口炎症、傷口感染的復發、減少的皮膚微血管灌注、傷口膠原蛋白沉積不足以及疤痕化膿。血小板衍生生長因子(PDGF)不足與慢性糖尿病潰瘍有關,並引起減弱的癒合(HD畢爾，MT龍雅可，S沃納,皮膚病學研究雜誌109，132(1997)(HDBeer,MTLongaker,SWerner,JInvestDermatol109，132(1997))。使用了瑞格蘭奈RTM(Regranex.RTM)的臨床試驗僅在半數或更少的被評價患者中表現出了促進慢性足部潰瘍癒合的療效(DL斯蒂德，血管外科雜誌，21,71(1995)(DLSteed，JVaseSurg,21,71(1995))。對促使糖尿病傷口癒合減弱的通路進行的調查揭示了一些造成不良癒合應答的因子。大血管和小血管的動脈粥樣硬化阻止氧氣和營養物質向傷口的輸送。神經病變導致了保護性敏感性的損失和局部外傷。最終，有缺陷的免疫防禦抑制了對死細胞的細胞吞噬作用並促進了感染。高血糖本身導致了晚期糖基化終產物(AGE，s)的形成，它將細胞膜與外細胞間質蛋白結合併阻止它們發揮作用。發現在糖尿病傷口處缺乏生長因子(例如血小板衍生生長因子、轉化生長因子卩和血管內皮生長因子)，而在糖尿病傷口液體中的基質金屬蛋白酶和過氧化物的水平上升。長期升高的血糖水平導致了白細胞功能的降低和細胞營養不良，這引起了高的傷口感染率以及糖尿病患者中的相關癒合問題。糖尿病足部潰瘍的發生也是多種其他因素的結果。這些因素包括足部的骨架結構構造的機械變化、外周神經病變和動脈粥樣硬化外周動脈疾病，所有這些在糖尿病人口中具有高發頻率和強度。非酶糖化容易使韌帶變得僵硬。神經病變造成腳和腿中的保護性感覺喪失和肌肉群的協調喪失，這二者增加了行走過程中的機械應力。也已知糖尿病與結締組織代謝中的各種變化有關，其結果是，糖尿病面臨著傷口癒合不良的問題。與糖尿病有關的膠原蛋白的損失可能是由於新合成的膠原蛋白的合成水平降低或代謝增強，或同時由於這二者的原因所導致的。這些在性質上和在數量上的異常使得在糖尿病病症中觀察到減弱的傷口癒合。在上述描述的其他通路中，已經反映出多元醇通路是由高濃度葡萄糖誘導的各種器官損傷(包括糖尿病足部潰瘍)的機制。病原學研究的結果表示高血糖通過山梨糖醇的累積和蛋白質糖化作用而誘導了與糖尿病有關的併發症。多元醇通路包括兩個步驟。第一步是葡萄糖向山梨糖醇的轉化，第二步是山梨糖醇向果糖的轉化。關鍵酶是將葡萄糖轉化為山梨糖醇的醛糖還原酶。在許多組織中發現了這種酶。現存的醛糖還原酶抑制劑包括例如託瑞司他(tolrestat)、唑泊司他(zopolrestat)、非達司他(fidarestat)、和依帕司他(epalrestat)的分子。本發明提供了特定p-腎上腺素能阻滯劑(例如艾司洛爾、普萘洛爾和噻嗎洛爾)的醛糖還原酶抑制活性的第一證據。本發明發現的特定P-腎上腺素能阻滯劑的醛糖還原酶抑制活性使它們被定位成用來治療由醛糖還原酶介導的疾病(例如糖尿病併發症)的藥物。提高的醛糖還原酶活性導致了山梨糖醇累積的加劇，引起了多種糖尿病併發症。本發明提供了對p-腎上腺素能阻滯劑的醛糖還原酶抑制活性的發現，以及它們在治療諸如糖尿病傷口癒合的糖尿病併發症中的應用。山梨糖醇在細胞內的累積？1起各種細胞損傷，這種細胞損傷又引起了皮膚微血管病變。糖尿病可以通過多種機制導致微血管病變。這些機制包括過量的山梨糖醇的形成、增加的糖基化終產物、氧化性損壞和蛋白激酶C過度活動。所有這些過程都在皮膚內發生，並且糖尿病皮膚微血管病變的存在已經得到了完全地證實。這些^f敖血管病變的變化與皮膚血流量的異常有關。因為皮膚起到體溫調節的作用，所以在正常皮膚內存在大量的毛細血管富餘(capillaryredundancy)。在糖尿病患者中，毛細血管的損失與灌注儲量的減少有關。相關的微血管灌注不能滿足皮膚代謝的要求可能導致患有糖尿病例如糖尿病傷口的患者的各種皮膚損害。神經病變是另一種常見的糖尿病併發症，它由多元醇通路的活化導致。糖尿病足部潰瘍患者在足底、足內側和足外側表面幾乎都患有臨床意義上的外周神經病變。因而發生的神經損壞顯示了外周神經病變，這易使患者患上糖尿病潰瘍。糖尿病神經病變的病理學涉及氧化應激、晚期糖基化終產物、多元醇通路流量以及蛋白激酶C活化，這些都促進糖尿病傷口中所見的微血管病變和神經功能障礙。已經提出將滲透壓和氧化應激的增加作為多元醇通路參與細胞和組織損傷的其他機制。因此，醛糖還原酶抑制劑改善皮膚灌注，誘導神經再生並降低氧化應激，從而促進糖尿病傷口癒合。設計本發明的方法和組合物，其基於在控制條件下對來自患者的樣本中的一氧化氮(NO)的合成進行測量，來檢測、治療和監控具有不良傷口癒合能力的糖尿病患者。本發明發現糖尿病患者表現了NO合成能力的連續譜，並且在譜的較低端的糖尿病患者具有被減弱的傷口癒合功能。對於NO在傷口發炎、組織修復和微血管穩態(microvascularhomeostasis)中的作用的近期研究表明，NO是傷口癒合的主要調節因子(D布魯赫-吉哈爾茲，T魯茨卡，V科爾布-巴霍芬，皮膚病學研究雜誌，110，1(1998)(DBruch隱Gerharz，TRuzicka，VKolb畫Bachofen.JInvestDermatol.110，1(1998));MR謝弗等人，外科學，121,513(1997)(MRSchafferetal.，Surgery121，513(1997)))。已經在所有的糖尿病中觀察到了內皮細胞產生的NO的全身性不足(A維弗斯等人，糖尿病，47，457(1998);(AVevesetal.,Diabetes,47,457(1998));M胡斯卡等人，血栓形成研究，86(2),173(1997)(MHuszkaetal.,ThrombosisRes,86(2),173(1997));SB威廉斯，JA庫斯科，MA羅迪，MT漢斯頓，MA克裡格，美國心臟學會雜誌，27(3),567(1996)(SBWilliams,JACusco，MARoddy,MTHohnston,MACreager,J.Am.Col.Cardiol.，27(3)，567(1996))),這反映了在慢性的、難愈性的下肢潰瘍(LEU)的發病機制中NO發揮了基礎作用。因此，需要將糖尿病病人的傷口癒合能力與NO的產量聯繫起來。這種聯繫使得可能開發出基於糖尿病病人的NO產量來預測他們的傷口癒合能力的方法，並可能提供一種有用的臨床指標，該臨床指標可以起到選擇適當療法的基礎的作用。NO是小的疏水性氣態自由基，它是用於自主功能(例如血管舒張、神經傳遞和腸蠕動)的重要的生理介體。NO通過活化其輩巴分子鳥普酸環化酶而揭:供細胞信號傳導，所述鳥苷酸環化酶提高了環磷酸鳥苷(cGMP)的細胞內濃度(JS貝克曼，一氧化氮，J.蘭卡斯特，初級版(學術出版社，紐約)第一章(JSBeckman，inNitricOxide,J.Lancaster,Jr"Ed.(AcademicPress,N.Y.),chap.1)。細胞信號傳導的進行不需要通道或細胞膜受體的介導，依賴於細胞環境中的NO濃度。NO在生物組織中的半衰期約5秒。它由一氧化氮合酶(NOS)的三種亞型產生，所述一氧化氮合酶將L-精氨酸和分子氧代謝產生瓜氨酸和NO。這三種亞型中的兩種為結構酶系統(cNOS)，^皮描述在神經元細胞(nNOS)和內皮細胞(eNOS)中(D布魯赫-吉哈爾茲，T魯茨卡，V科爾布-巴霍芬，皮膚病學研究雜誌，110,1(1998)(DBruch-Gerharz，TRuzicka，VKolb-Bachofen.JInvestDermatol.110,1(1998))。由於這些亞型，細胞內的釣通過4丐調蛋白對酶進行活化。4丐依賴性cNOS系統產生低(皮摩爾)濃度的NO。第三種系統為可誘導亞型(iNOS)，它是不依賴於鈣的。iNOS的表達是通過組織特異性的刺激(例如炎性細胞因子或細菌脂多糖(LPS))而被誘導。所述可誘導的亞型以比cNOS高得多(納摩爾(nanomolar))的濃度釋放NO，並具有有力的細胞毒作用。cNOS酶參與調解並保持皮膚穩態(S蒙卡達，A希格斯，新英格蘭醫學雜誌，329,2002(1993)(SMoncada,AHiggs,NEngJMed329,2002(1993))。類皮膚中，角質形成細胞、成纖維細胞和內皮細胞具有cNOS和iNOS這兩種亞型。傷口巨噬細胞和角質形成細胞具有iNOS亞型。在傷口癒合研究中顯示，當受到損傷並且產生巨噬細胞成為主要的細胞來源之後，發生NO合成以延長期間(10-14天)(MR謝弗，U唐翠，RA範韋瑟普，A巴布爾，外科研究雜誌，71，25(1997)(MRSchaffer,UTantry，RAvanWesep，ABarbul,JSurgRes,71,25(1997)))。作為組織修復的介體，NO被證實為促進血管生成(A帕帕沛丘珀魯斯，G加西亞-卡登那，JAA馬德瑞，WC西薩，臨床研究雜誌，100(12),3131(1997)(APapapetropoulos,GGarcia-Cardena，JAAMadri，WCSissa.JClinInvest,100(12)，3131(1997)))和細胞遷移(志津子等人，美國生理學雜誌，279:C794(1996)(Noirietal.,Am.J.Physiol.279:C794(1996)))，增加傷口膠原蛋白沉積和膠原蛋白交聯(MR謝弗，U唐翠，SS格羅斯，HL瓦瑟堡，A巴布爾，外科研究雜誌，63,237(1996)(MRSchaffer，UTantry,SSGross,HLWasserburg,ABarbul.JSurgRes,63,237(1996)))，調節微血管穩態(血管舒張)(D布魯赫-吉哈爾茲，T魯茨卡，V科爾布-巴霍芬，皮膚病學研究雜誌，110，1(1998)(DBruch-Gerharz,TRuzicka，VKolb-Bachofen.JInvestDermatol.110，1(1998))，抑制血小板聚集(JS貝克曼，一氧化氮，J.蘭卡斯特，初級版(學術出版社，紐約)第一章(JSBeckman，inNitricOxide,J.Lancaster,Jr.,Ed.(AcademicPress,N.Y.),chap.1)，抑制內皮-白細胞粘附的形成(AM勒夫爾，DJ勒夫爾，心血管研究，32,743(1996)(AMLefer，DJLefer,CardiovascularRes.32，743(1996))),調節內皮的增殖和細胞凋亡(YH沈，XL王，DE威爾卡克，生化學會通訊，433(1-2)，125(1998)(YHShen，XLWang,DEWilcken，FEBSLett,433(l畫2)，125(1998))),提高隨意皮瓣(randomcutaneousflaps)的活力(SC厄姆等人，整形外科，101785(1998)(SCUmetal.,PlastReconstrSurg.101785(1998));GF皮爾斯等人,美國科學院院刊，86,2229(1989)(GFPierceetal"ProcNatlAcadSciUSA.86，2229(1989)))，以及增強細胞免疫調控和細菌細胞毒性(JS貝克曼，一氧化氮，J.蘭卡斯特，初級版(學術出版社，紐約)第一章(JSBeckman，inNitricOxide,J.Lancaster,Jr.,Ed.(AcademicPress,N.Y.),chap.1)。糖尿病中，正常的傷口修復可能受到嚴重威脅。通常來說，在傷口癒合過程中，NO提供增強的組織氧的可利用度、修復機制的炎性介導和傷口基質的發展和重建。NO的主要代謝途徑是變成硝酸鹽和亞硝酸鹽，它們是組織、血漿和尿液中的穩定的代謝物(S蒙卡達,A希格斯，新英格蘭醫學雜誌，329,2002(1993)(SMoncada，AHiggs,NEngJMed329,2002(1993))。人類中的示蹤研究已經證實了體內硝酸鹽/亞硝酸鹽的總量的50%產生自NO合成的底物L精氨酸(PM羅德斯，AM利昂，PL弗朗西斯，AD史特瑟斯，S蒙卡達，生物藥學生理研究通訊，209,590(1995)(PMRhodes,AMLeone，PLFrancis,ADStruthers,SMoncada，BiomedBiophysRes.Commun.209,590(1995));L卡斯蒂略等人，美國學院院刊,90，193(1993)(LCastilloetal.，ProcNatlAcadSciUSA90，193(1993)))。雖然硝酸鹽和亞硝酸鹽不是具有生物活性的NO的度量，但是從經歷適當的禁食期後並可選地進行飲食控制之後(低硝酸鹽/低精氨酸)的受治療者所獲得的血漿和尿液樣品允許使用硝酸鹽和亞硝酸鹽作為NO活性指數(C貝利斯，P瓦倫斯,腎與高血壓當前觀點,7，59(1998)(CBaylis,PVallance,CurrOpinNephrolHypertens7,59(1998))。本發提供了確定糖尿病受治療者是否為傷口癒合糖尿病病人或難愈性傷口糖尿病病人的方法。"傷口癒合糖尿病病人，，指的是糖尿病受治療者的傷口癒合能力大約與非糖尿病受治療者相同。"難愈性傷口糖尿病病人"指的是糖尿病受治療者的傷口癒合能力比非糖尿病受治療者低，並因此處於下肢潰瘍(LEU)的風險中。例如，在一個臨床研究中，認為非傷口癒合糖尿病病人是那些具有一次或多次糖尿病足部潰瘍病史的患者，在Regranex.RTM治療20周後仍未完全癒合。患有糖尿病病症的人或動物是血漿葡萄糖濃度的調節有缺陷的人或動物，這通常是胰島素產生不足或抗胰島素生理效果的結果。例如，該受治療者可以為由內科醫生診斷為患有I型或II型糖尿病的人類患者。根據本發明的受治療者可以為任意的患有糖尿病病症(例如糖尿病)的人或動物。所述動物可以為哺乳動物。所述哺乳動物可以為靈長類動物、犬科動物、貓科動物、牛科動物、綿羊、豬科動物、駱駝科動物、山羊、齧齒動物或馬科動物。優選地，所述受治療者為人。給藥方法
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：本發明的一個方面是(3-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽在治療包括由任意形式的糖尿病引起的糖尿病併發症的病症中的應用。P-腎上腺素能阻滯劑可以包括但不限於醋丁洛爾、阿普洛爾、氨磺洛爾、阿羅洛爾、阿替洛爾、苯呋洛爾、倍他洛爾、貝凡洛爾、比索洛爾、波吲洛爾、溴苄銨、布庫洛爾、布菲洛爾、丁呋洛爾、布尼洛爾、布引洛爾、布拉洛爾、丁非洛爾、卡拉洛爾、卡替洛爾、卡維地洛、塞利洛爾、西他洛爾、西那洛爾、氯拉洛爾、癸醯(decanoyl)、十二醯(dodecanoyl)、地來洛爾、恩布洛爾、依泮洛爾、艾司洛爾、呋洛爾、茚諾洛爾、替莫洛爾、拉貝洛爾、左倍他洛爾、左布諾洛爾、曱吲洛爾、美替洛爾、美替普萘洛爾、美託洛爾、莫普洛爾、十四醯(myristoyl)、納多洛爾、萘肟洛爾、奈比洛爾、尼普地洛、辛醯(octanoyl)、美替卜洛爾、氧烯洛爾、十六醯(palmitoyl)(美國專利No.4897417)、噴布洛爾、培布洛爾、。引哚洛爾、普拉洛爾、萘心定、普萘洛爾、胡椒喘定、索他洛爾、康力龍(stanozolol)、磺千心定、他林地洛、特他洛爾、替索洛爾、噻嗎洛爾、託利洛爾、抑肽酶、希苯洛爾、腎上腺素能阻斷劑、它們的前藥或它們的藥用可接受鹽。它們的前藥包括能夠在體內代謝中釋放P-腎上腺素能阻滯劑的所有(3-腎上腺素能阻滯劑衍生物。例如，能夠在代謝中釋放艾司洛爾的所有艾司洛爾衍生物都是潛在的艾司洛爾前藥。已經發現艾司洛爾通過各種機制治療例如糖尿病傷口的糖尿病併發症，所述機制包括但不限於誘導一氧化氮產生；提高糖尿病傷口處膠原蛋白的水平；通過增強糖尿病傷口處的新生血管來提高血管灌注；通過增強糖尿病傷口的血管灌注來增加氧供給；對糖尿病患者體內提高的醛糖還原酶活性進行抑制；增強在糖尿病傷口中的生長因子，例如神經生長因子、上皮生長因子、血管內皮生長因子、血小板衍生生長因子、或他們的組合。本發明的P-腎上腺素能阻滯劑可以具有介導醛糖還原酶活性。所述具有介導醛糖還原酶活性的p-腎上腺素能阻滯劑包括但不限於艾司洛爾、噻嗎洛爾或普萘洛爾。具有介導醛糖還原酶活性的p-腎上腺素能阻滯劑在對糖尿病併發症的治療中特別有用。例如，艾司洛爾是優選的用於糖尿病傷口癒合治療的|3-腎上腺素能阻滯劑。然而，所有的P-腎上腺素能阻滯劑在任意預想的糖尿病併發症的治療中都可以是有用的。用於傷口癒合的P-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其鹽優選在生理可接受載體內向受治療者進行外部給藥。然而，對於除了糖尿病傷口以外的糖尿病併發症的治療，(3-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽可以以多種方式進行給藥，給藥方式包括但不限於經口給藥、經眼部給藥、非消化道給藥(包括外用、皮下(s.c.)、硬膜下、靜脈注射(i.v.)、肌肉注射(i.m.)、鞘內、腹腔注射(i.p.)、腦內、動脈內或病灶內給藥途徑)、局部(例如外科施用或外科栓劑(surgicalsuppositoiy))和肺部(例如，噴霧劑、吸入劑或粉末)，將在下文中進一步描述。含有具有P-腎上腺素能受體拮抗劑的化合物的藥用組合物的正確劑量將根據藥物製劑、施用模式以及特定位點、寄主以及所治療的糖尿病併發症而不同。包括年齡、體重、性別、飲食、給藥時間、排洩率、寄主病症、聯合用藥、反應敏感度和疾病的嚴重程度的其它因素是治療的專業人員或本領域技術人員可以很容易地考慮到的。可以在最大耐受劑量的範圍內持續地或周期性地進行給藥。例如，根據需要，可以每小時進行給藥、每兩小時給藥一次、每三小時給藥一次、每六小時給藥一次、每12小時給藥一次、每日進行給藥、每周進行給藥、每兩周進行給藥、每三周進行給藥或每月進行給藥。給藥的外用途徑是治療諸如難癒合糖尿病傷口的糖尿病併發症的優選途徑。適於外部給藥的組合物可以包括乳膏、洗劑、肥皂、香波(shampoo)、氣霧劑、香月旨(balm)、凝月交、血清、摩絲(mousse)、皮膚貼、泵式噴霧劑(pumpspray)、走珠(roll-on)、外用液、棒、溼巾(towelette)、護足產品、軟膏、溼紙巾(wipe)、乳液、潤膚劑、外用藥籤和它們的任意組合。因此，本發明提供了用於外部給藥的藥用組合物，用於治療糖尿病傷口癒合，該組合物包括P-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽，以及藥用可接受外用載體、賦形劑或稀釋劑。所述外用組合物的形式優選為乳膏、軟膏、外用藥籤、乳液、噴霧或洗劑。該組合物可以以緩釋的形式被提供。已經發現艾司洛爾在糖尿病傷口癒合的治療中是有用的。因此，本發明提供了用於外部給藥的藥用組合物，用於治療糖尿病傷口癒合，該組合物包括艾司洛爾、其前藥或其藥物可接受鹽，以及藥用可接受外用載體、賦形劑或稀釋劑。包括艾司洛爾的外用組合物的形式優選為凝膠、皮膚貼、外用液、乳膏、軟膏、外用藥籤、乳液、噴霧或洗劑。該組合物可以以緩釋的形式被提供。根據攝入方式，可以以各種方式配製P-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽。用於外部給藥的製劑中的治療活性成分的濃度可以在約0.001%至50.0%的濃度範圍內變化。優選地，用於外部給藥的製劑中的治療活性成分的濃度可以在約0.01°/。至40.0%的濃度範圍內變化。更優選地，用於外部給藥的製劑中的治療活性成分的濃度可以在約0.001%至20.0%的濃度範圍內變化。有文獻記載了現存的用來治療高眼壓(IOP)的滴眼液(滴劑)和眼用凝膠形式的P-阻滯劑的外用製劑。用於治療心臟病的P-阻滯劑的經皮貼劑(國際專利公布No.WO/2000/035439/美國專利No.5362757)也已經被製造出來了。然而，並沒有文獻記載外部施用於皮膚或真皮的(3-腎上腺素能阻滯劑的製劑。本發明提供了作為外部施用的P-腎上腺素能阻滯劑(例如艾司洛爾)的製劑。在例如糖尿病傷口的糖尿病併發症的治療中，含有鹽酸艾司洛爾作為活性成分的組合物可以以外用製品的方式方便地向需要治療的受治療者進行給藥，所述外用製品具有約0.001%至50.0%的鹽酸艾司洛爾濃度。優選地，所述|3-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽被配製為用於在合適的惰性載體內進行外部給藥。例如，所述卩-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽在載體溶液中的濃度通常為約0.1%至約50.0%。通過給藥途徑來確定給藥劑量。用於經口給藥的製劑中的治療活性成分的濃度可以在約1mg到1000mg的濃度範圍內變化。用於眼部給藥的製劑中的治療活性成分的濃度可以在約0.001%到10.0%的濃度範圍內變化。對於非腸道給藥，本發明的P-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽可以以可注射劑量的在具有藥用可接受載體的生理可接受稀釋劑中的物質的溶液或懸浮液的形式進行給藥，所述具有藥用可接受載體的生理可接受稀釋劑可以為無菌液，例如添加有或未添加有表面活性劑的水和油。其它可接受稀釋劑包括動物油、才直物油或合成油，例如，花生油、大豆油和礦物油。通常來說，二醇類(例如丙二醇或聚乙二醇(PEG))是優選的液體載體，特別是對於可注射溶液而言。本發明的(3-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽可以以儲庫型注射(depotinjection)或植入製品的方式進行給藥，它們可以以允許活性成分控制或緩釋的方式被配製根據本發明的一個方面，P-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽可以被單獨給藥，或者與其他以上討論的試劑的組合給藥以治療和/或改善由任意形式糖尿病引起的諸如糖尿病併發症的病症。這些試劑也可以用於製備對患者進行治療所用的藥劑中。用於治療與糖尿病有關的病症的治療劑給藥可以在給藥p-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽之前、同時或之後進行。對受治療者用P-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽進行的給藥可以在任意其他的糖尿病治療形式之前、同時或之後進行。基於傷口的嚴重程度和熟練的醫療服務提供者公知的其他因素，可以根據需要以每小時、每日、每周或每月向受治療者進行p-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽的給藥。優選地，以每周進行p-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽的給藥，給藥一周或更多周。治療的優選規則是連續地或間歇地外部施用優選的製劑，這根據每個患者的情況和糖尿病傷口的位置和嚴重程度而不同。含有(3-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽的藥用組合物還可以包括藥用可接受的無毒的載體或稀釋劑，它們是通常用來配製對動物或人類進行給藥的藥用組合物的賦形劑。製劑也可以包括傳統的添加劑、例如助溶劑、等滲劑(isotonicagents)、懸浮劑、乳化劑、穩定劑和防腐劑。所述組合物可以被配製為緩釋。本發明的所述P-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽可以以緩釋形式進行給藥，例如，儲庫型注射、植入製品、或滲透泵，它們可以以允許活性成分緩釋的方式來配製。緩釋製劑的植入劑是本領域公知的。植入劑被配製為微球體、片等，具有可生物降解的或不可生物降解的聚合物。例如，乳酸和/或乙醇酸的聚合物形成易蝕的聚合物，寄主對該易蝕的聚合物具有良好耐受性的。本發明還提供治療由醛糖還原酶介導的糖尿病併發症的方法，該方法包括將在治療上有效量的具有趁糖還原酶活性的P-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽進行給藥。優選地，所述(3-腎上腺素能阻滯劑為艾司洛爾、噻嗎洛爾或普萘洛爾。所述由醛糖還原酶介導的糖尿病併發症可以包括但不限於糖尿病神經病變、糖尿病腎病、糖尿病心肌病、糖尿病性視網膜病變、糖尿病性白內障、糖尿病性膀胱病、糖尿病性角膜病變、糖尿病皮膚病變、糖尿病微血管病變、心力幾梗死、黃斑水腫、神經傳導受損和糖尿病傷口。實施例實施例1醛糖還原酶(AR)抑制作用研究為了研究酶抑制作用，使用甘油酪作為底物，通過分光光度分析法，用提純的人類重組醛糖還原酶(在大腸桿菌(￡.co//)中表達)來測試(3-腎上腺素能拮抗劑的醛糖還原酶(AR)抑制活性(分子視界,2004,10，148-154(Mol.Vis.2004,10,148-154))。材料DL-甘油醛、葡萄糖、硫酸鋰、2-巰基乙醇、NADPH(還原型輔酶11)、二甲基亞碸，TC-199培養基(M-3769)、山梨糖醇、山梨糖醇脫氫酶、NAD(煙醯胺腺噤呤二核苷酸)和穀胱甘肽還原酶購自西格瑪化學公司(聖路易斯，密蘇裡)(SigmaChemicalCompany(St.Louis,MO))。用於實驗的包括噻嗎洛爾、艾司洛爾、索他洛爾、奈比洛爾、卡維地洛、美託洛爾和拉貝洛爾的卩-腎上腺素能拮抗劑是作為純活性藥用成分(APIs)從當地供應商獲得的。用於實驗的P-拮抗劑的鹽為馬來酸噻嗎洛爾、鹽酸索他洛爾、鹽酸拉貝洛爾、酒石酸美託洛爾、鹽酸奈比洛爾、鹽酸艾司洛爾和鹽酸普萘洛爾。大鼠晶狀體醛糖還原酶從大鼠晶狀體製備粗醛糖還原酶(AR)。將獲得自國家實驗動物中心(全國營養學會，海德^i巴，印度)的9周大的WNIN雄性大鼠的眼球取出。動物護理和方案符合動物倫理委員會(InstitutionalAnimalEthicsCommittee)並受到其認可。用後路手術將晶狀體切開並且在10體積的lOmM的磷酸鉀緩衝液(pH6.2)中均質。將勻漿在4。C以15,000xg離心分離30分鐘，並將得到的上清液用作AR來源。重組人類醛糖還原酶的提純從細菌培養物中提純重組人類醛糖還原酶。提取來自表達培養物(expressioncultures)的酶，並基本按照在先描述(生物化學雜誌1992;267:24833-40(JBiolChem1992;267:24833-40))進行純化，不同的是，使用親和色譜代替藍膠(AffiGelBlue)(伯樂(Bio-Rad))作為最後的提純步驟。醛糖還原酶(AR)分析根據由海曼(Hayman)和木下(Kinoshita)(生物化學雜誌，1965;240:877-82(JBiolChem1965;240:877-82))所描述的方法來分析AR活性。1ml的分析混合物包含50的磷酸鉀緩衝液(pH6.2)、0.4mM的硫酸鋰、5拜的2-巰基乙醇、10岸的DL-甘油醛、0.1(iM的NADPH和酶製品(大鼠晶狀體或重組酶)。使用合適的空白組進行校正。將分析混合物在37。C恆溫培育並通過在37。C加入NADPH來啟動。在卡瑞生物100(CaryBio100)分光光度計中檢測到由於NADPH氧化而發生的在340nm處吸光度的改變。抑制作用的研究為了研究抑制作用，在水中製備P-腎上腺素能拮抗劑、噻嗎洛爾、艾司洛爾、索他洛爾、奈比洛爾、卡維地洛、美託洛爾和拉貝洛爾的濃縮原料。將作為測試化合物的不同濃度的(3-腎上腺素能拮抗劑加入分析混合物中，並在進行如以上所述地由NADPH引發的反應之前進行5-10分鐘的恆溫培育。將不存在抑制劑時AR活性考慮為100%,從而計算具有測試化合物的抑制的百分數。然後評價產生50%抑制(IC5Q)的各個測試樣品的濃度。表l:P-腎上腺素能拮抗劑的醛糖還原酶抑制劑IC50值(pM)tableseeoriginaldocumentpage24實施例2血紅細胞內山梨糖醇的估算測試表現出有效的醛糖還原酶抑制作用的化合物(艾司洛爾、噢嗎洛爾、普萘洛爾)的抑制山梨糖醇在血紅細胞(RBC)內形成的潛力。將細胞在體外用30mM的葡萄糖進行恆溫培育。通過由馬龍等人，糖尿病，1980;29:861-864(Malone,etal.Diabetes;1980;29:861-864)所報導的方法估算山梨糖醇。表2:RBC內的山梨糖醇濃度tableseeoriginaldocumentpage25實施例3動物實驗糖尿病傷口癒合將韋斯大鼠(Wistarrat)裝在具有能任意採食食物(哈蘭德特克蘭德輻照齧齒動物伺料)和無菌水的標準消毒的齧齒動物籠裡。將大鼠關在靜止於微隔離器中的哈蘭特克片粒化的紙(HarlanTek-chippelletedpaper)上，微隔離器被保持在72。F，溼度60%和12小時的光周期下。將動物買來後裝在該設備中飼養IO天以適應環境。通過連續五天腹腔注射50mg/kg體重的鏈脲佐菌素在大鼠內誘導糖尿病。用扭曲的刮痕器在動物背部皮膚上製造深0.57-0.62mm的2mm的切口，從而在大鼠身上造成傷口。在使用刮痕器前，剪去該部分的毛髮並用標準魯戈氏》典液進行清潔。化合物給藥和傷口處理鹽酸艾司洛爾(10%)每天給藥三次，或在標準治療對照中直接將試劑塗抹在傷口上。所使用的陽性對照為可商購得到的血小板衍生生長因子。持續治療直至被治療的鼠的傷口完全癒合。將傷口用標準生理鹽水進行漂洗，收集衝洗傷口的液體並在2500rpm下，在高倍顯微鏡下觀察任意異常細胞的存在。此外，將沉澱物物質在1nil的RPMI450中稀釋，使用血細胞計數器來確定巨噬細胞的數量。動物實驗結果粗略地，可以從圖l看出，用賦形劑處理的大鼠中的初始傷口的大部分在產生傷口後(27天)仍然有痂，而在被治療的動物的皮膚上的傷口已經完全癒合(參見圖1B)。從組織學水平來看，可以看出被治療的大鼠的皮膚比用賦形劑處理的大鼠有密得多的過渡性基質(provisionalmatrix)。在被治療的皮膚內有更多的紡錘體細胞。圖1C和ID所示的組織用蘇木精和伊紅(eosin)，X330進行染色。用鹽酸艾司洛爾處理後的傷口組織形態示於圖2。所示的傷口底部顯示出由膠原蛋白薄層覆蓋的脂肪組織。在用賦形劑處理的傷口中沒有發現肉芽組織或上皮細胞。另一方面，在用鹽酸艾司洛爾治療的傷口內發現了肉芽組織厚層和上脂肪組織通過中性粒細胞和微血管的浸潤。首個十四天後，每隔7天殺死個體大鼠來得到逐步的組織學報導。收集傷口樣品，進行組織病理診斷評估角質形成細胞和傷口癒合。關於傷口閉合，將動物保持不受損傷。如圖3所示，在用鏈脲佐菌素(STZ)誘導糖尿病並用賦形劑或鹽酸艾司洛爾進行外部治療8周後製備並檢驗組織切片。用賦形劑處理的糖尿病皮膚的特徵包括較薄的表皮、真皮基質的組織瓦解和間質細胞緻密變化(見圖3A和3C)。被治療的皮膚(非糖尿病和糖尿病)的特徵顯示出增厚的表皮和直接位於表皮之下的大量的紡錘體形間質細胞(參見圖3B和3D)。在產生傷口後的第3天、第7天、第12天和第19天測量多個傷口癒合參數。這些參數在以下單獨的表中列出。每隔一天測量傷口大小和大鼠的體重。特別地，每隔一天用微遊標卡尺測量傷口的長度和寬度，並記錄傷口邊緣處的抗張強度。由同一調查者在第3、12、19天時利用電子數字式遊標卡尺(B&D，普馬勒斯，新澤西(B&D,Pomanus,NJ))測量傷口直徑。在即將進行測量前通過調零將卡尺進行校準。傷口直徑的減小記錄於表l中。表l:傷口直徑的減小第3天對照(MM)1.27+/-0.12陽性對照1.16+/-0.12艾司5各爾1.28+/-0.12第12天3.78+/-0.241.35+/-0.191.37+/-0.17第19天7.89+/-0,311.47+/-0.340.79+/-0.28°/。減少536%998%用張力口徑測量器(i哈佛儀器，昆西，麻薩諸塞州(Harvardapparatus,Quincy,MA))測量傷口的收縮，結果示於表2。表2:傷口直徑收縮程度(°/。)第3天對照(畫)12.46+/-5.8陽性^t照11.98+/-6.2艾司洛爾12.17+/-5.8第12天26.78+/-11.437.71+/-12.441.86+/-13.2第19天58.76+/-9.986.14+/-10.298.64+/-9.6用於評價的部分用艾本德(Eppendorf)IO號手術刀進行切割，並將組織保存在10%的磷酸鹽緩衝的福馬林溶液中。將組織從福馬林溶液中取出並在100%的乙醇中浸沒6小時。再次將該組織取出並保存於10%的鮑音液(Bouinssolution)中以待評價。傷口的活才企參數列於表3。表3:糖尿病大鼠中傷口活檢評價第3天第7天第12天對照1.2+/-0.42.3+/-0.32.9+/-0.3陽性對照1.3+/-0.21.5+/-0.41.4+/-0.4艾司洛爾1.3+/-0.31.3+/-0.21.4+/-0.3第19天4.5+/-0.41.5+/-0.51.5+/-0.3總計10.9+/-1.35.9+/-1.45.5+/-1.1基於在高倍顯微鏡觀察的傷口上發現的新的上皮細胞來測量上皮化。通過標準數字式遊標卡尺(B&D,Pomanus,NJ)測量疤痕形成得分。結果示於表4。表4:傷口完全閉合所花費的時間、上皮化和疤痕形成的期間對照陽性對照艾司洛爾傷口閉合(天)未閉合24.7+/-3.419.6+/畫2.2上皮化時間(天)15.7+/-1.811.8+/-2.19.8+/-0.8疤痕形成(得分)4.9+/-0.52.1+/-0.51.3+/-0.4使用微量吸管(Eppendorf)測量來自傷口的滲出物的量。結果示於表5.表5:滲出物pl第3天第7天第12天第19天對照1.1+/-0.31.8+/-0.42.1+/-0.82.6+/-0.7陽性對照1.2+/-0.32.3+/-0.33.2+/-0.34.8+/畫0.2艾司洛爾1.2+/-0.22,7+/-0.53.5+/-0.64.9+/-0.2總計7.6+/-1.911.5+/-0.9712.3+/-1.1通過觀察折射率來測量傷口的透明度。結果示於表6。表6:膜透明度第3天對照1.8+/-0.2陽性對照1.7+/-0.3艾司洛爾1.7+/-0.3第7天2.7+/-0.43.1+/-0.32.3+/-0.4第12天3.7+/畫0.33.8+/-0.42.6+/-0.6第19天3.8+/-0.64.1+/-0.53.3+/-0.4總計11.0+/-1.212.3+/-0.99.9+/-1.1傷口粘附性示於表7。牢(Velcro)指數計測量。表7:傷口粘附力第3天對照2.7+/-0.3陽性對照2.6+/-0.4艾司洛爾2.6+/-0.4粘附性是將傷口兩端附著在一起的強度，通過維可第7天2.3+/-0.53.2+/-0.43.3+/-0.3第12天2.8+/-0.93.7+/-0.63.9+/-0.5第19天3.1+/-0.84.3+/-0.64.7+/誦0.5總計10.9+/-1.413.8+/-1.114.5+/-0.9通過使用微量吸管根據從傷口獲得的液體體積測量積液，示於表8t表8:積液對照陽性對照艾司洛爾第3天2.3+/-0.32.4+/-0.32.3+/-0.4第7天2.8+/-0.42.8+/-0.32.7+/-0.5第12天3.5+/-0.43.1+/-0.42.6+/-0.7第19天3.8+/畫0.52.7+/-0.62.5+/-0.5總計12.4+/-0.911.0+/-0.810.1+/畫1.2用Velcro指數計測量傷口消失的容易性並示於表9。表9:傷口消失的容易性第3天第7天第12天第19天總計對照2.7+/-0.22.9+/-0.13.1+/-0.53.6+/-0.512.3+/-0.5陽性對照2.6+/-0.42.8+/-0.32.8+/-0.42.5+/-0.310.7+〉-1.1艾司洛爾2.6+/-0.22.8+/-0.32.7+/-0.52.5+/-0.410.6+/-1.4傷口彈性通過同一動物的正常皮膚與傷口區域的皮膚相比觀察到的平和度而測得，並示於表IO。表10:彈性第3天對照2.1+/-0.5陽性對照2.2+/-0.6艾司洛爾2.3+/-0.2第7天2.7+/畫0.42.4+/-0.72.4+/-0.5第12天2.3+/-0.83.7+/-1.13.5+/國0.6第19天1.9+/-0.94.0+/畫0.73.9+/-0.8總計7.0+/-0.912.3+/畫3.212.1+/-2.9實施例4一氧化氮的測量將新鮮組織(約0.2g)加入到1ml的冷的均質緩衝液(20mmol/1的羥乙基哌。秦乙磺酸-KOH(HEPES-KOH),pH7.9;25%的甘油；420mmol/1的NaCI;1.5mmol/1的MgCl2;0.2mmol/1的EDTA;0.5mmol/1的二硫蘇糖醇；0.2mmol/1的苯曱基磺醯氟)。將緩衝的組織以最大速度均質5秒鐘並在水水中冷卻30秒。將該過程重複五次以確保組織完全破壞。這些進行渦旋攪拌並在水上培養30分鐘。均勻混合物在4°C以12,000xg離心5分鐘，並將上清液轉移到冰上的新試管中用於NO測量。亞硝酸鹽/硝酸鹽的測量使用迅速應答化學螢光分析器來測量總的氣相NO(硝酸鹽/亞硝酸鹽)。NO氣體與臭氧反應，產生光形式的能量，該光與NO的存在量成比例。使用光度計測量光的發生以確定NO濃度。將樣品管牢固地連接到零點氣體過濾器(ZeroGasFilter)(西弗斯儀器(SieversInstruments))上，並將室內空氣通過該裝置5分鐘。使用4次重複才交正(分別為空白、1、10、50、100和200mmol/l;<1nmol/1的下限用於本儀器)對分析器應答的線性進行插值。向用氦氣洗吹的含有0.8%的氯化釩的鹽酸的容器中注入該樣品(10ml),以將氣態NO從溶解的NO和亞硝酸鹽中釋放出來。然後將樣品在反應器中暴露於臭氧下以形成活化的二氧化氮(N02)，它可以使用紅敏光電倍增管進行檢測，並使用積分描筆式記錄器(integratingpenrecorder)記錄輸出結果。對於各個衝羊品，將曲線下的面積轉化為NO濃度。表ll:NO增加第3天第7天第12天第19天總計%增加對照12561243174517816025陽性對照1179231724311927785430%艾司洛爾1219265732312115922253%實施例5膠原蛋白的測量與其他蛋白質相同地，19種已知膠原蛋白的合成發生在細胞內。膠原蛋白分子的特徵在於Gly-X-Y的重複序列，其中X通常為脯氨酸而Y通常為羥脯氨酸。羥脯氨酸是膠原蛋白降解的最終產物。由於此原因，組織羥脯氨酸水平是組織膠原蛋白產量的間接而客觀的變量。在許多試驗研究中，羥脯氨酸被用於評價組織膠原蛋白產量。通過使用高效液相色譜法(HPLC)從大鼠組織中分離並定量羥脯氨酸水平來測量組織中的膠原蛋白水平。使用反向諾瓦帕克(Nova-Pak)C18柱和溶劑體系(140mM的乙酸鈉、0.05°/。的三乙胺(TEA)、6%的乙腈)使羥脯氨酸完全分離。標準回收範圍為89-103%,批內差異為<8%。此外，利用卩H]羥脯氨酸的測量來檢測用卩H]脯氨酸標記並在10mM未被標記的脯氨酸存在下進行"追蹤，，的大鼠體內的膠原蛋白轉換的變化。表12:膠原蛋白產量tableseeoriginaldocumentpage31雖然參考以下實施例對本發明進行了詳細描述，應該理解的是，在不背離本發明的主旨的前提下可以對本發明做出各種修改，並且這種修改將是本領域技術人員易於知道的。權利要求1.一種治療哺乳動物中的糖尿病併發症的方法，該方法包括將在治療上有效量的β-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽給藥於需要所述治療的患者。2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述在治療上有效量的p-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽在其藥用可接受的載體、賦形劑或稀釋劑中被提供。3.根據權利要求1所述的方法，其中所述糖尿病併發症選自由糖尿病神經病變、糖尿病腎病、糖尿病心肌病、糖尿病性^L網膜病變、糖尿病性白內障、糖尿病性膀胱病、糖尿病性角膜病變、糖尿病皮膚病變、糖尿病微血管病變、心肌梗死、黃斑水肺、神經傳導受損和糖尿病傷口所組成的組。4.根據權利要求1所述的方法，其中，所述P-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽以緩釋形式進行給藥。5.根據權利要求1所述的方法，其中，所述哺乳動物為靈長類動物、犬科動物、貓科動物、牛科動物、綿羊、豬科動物、-膝駝科動物、山羊、齧齒動物或馬一牛動物。6.根據權利要求5所述的方法，其中，所述靈長類動物為人類。7.根據權利要求1所述的方法，其中，通過用在治療上有效量的(3-腎上腺素能阻滯劑進行給藥來治療糖尿病併發症，其中所述P-腎上腺素能阻滯劑選自由醋丁洛爾、阿普洛爾、氨》黃洛爾、阿羅洛爾、阿替洛爾、苯呋洛爾、倍他洛爾、貝凡洛爾、比索洛爾、波吲洛爾、溴節銨、布庫洛爾、布菲洛爾、丁呋洛爾、布尼洛爾、布引洛爾(buprandolol)、布拉洛爾、丁非洛爾、卡拉洛爾、卡替洛爾、卡維地洛、塞利洛爾、西他洛爾、西那洛爾、氯拉洛爾、地來洛爾、恩布洛爾(entbutolol)、依泮洛爾、艾司洛爾、呋洛爾(fUmolol)、茚諾洛爾、替莫洛爾(istalol)、拉貝洛爾、左倍他洛爾、左布諾洛爾、曱吲洛爾、美替洛爾、美替普萘洛爾(metipropranolol)、美託洛爾、莫普洛爾、納多洛爾、萘肟洛爾、奈比洛爾、尼普地洛、美替卜洛爾(optipranolol)、氧烯洛爾、噴布洛爾、培布洛爾、吲哚洛爾、普拉洛爾、萘心定、普萘洛爾、胡椒喘定、索他洛爾、磺苄心定、他林地洛(talindol)、特他洛爾、替索洛爾、^塞嗎洛爾、託利洛爾、抑肽酶、希苯洛爾及其藥物可接受鹽或溶劑化物組成的組。8.根據權利要求1所述的方法，其中，按每小時、每日l到6次、每周或每月進行給藥。9.根據權利要求1所述的方法，其中，所述p-腎上腺素能阻滯劑通過經口、靜脈內、腹腔內、眼部、非消化道、外用、皮下、硬膜下、靜脈內、肌肉內、鞘內、腹腔內、腦內、動^l永內、病灶內、局部或肺部途徑進4亍給藥。10.根據權利要求1所述的方法，其中，所述p-腎上腺素能阻滯劑通過經口途徑以約1mg至1000mg的劑量向哺乳動物給藥。11.根據權利要求2所述的方法，其中，所述p-腎上腺素能阻滯劑通過眼部途徑以約0.001%至10.0%的濃度向哺乳動物給藥。12.根據權利要求2所述的方法，其中，所述(3-腎上腺素能阻滯劑通過外用途徑以約0.001%至50.0%的濃度向哺乳動物給藥。13.—種外用藥用組合物，其用於對需要治療的患者的糖尿病傷口癒合進行治療，該組合物包括在治療上有效量的P-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽，以及藥用可接受外用載體、賦形劑或稀釋劑，其中，所述組合物的形式為乳膏、軟膏、外用藥籤、乳液、噴霧或洗劑。14.一種外用藥用組合物，其用於對需要治療的患者的糖尿病傷口癒合進行治療，該組合物包括在治療上有效量的(3-腎上腺素能阻滯劑艾司洛爾、其前藥或其藥物可接受鹽，以及藥用可接受外用載體、賦形劑或稀釋劑，其中，所述組合物的形式為乳膏、凝膠、外用液、皮膚貼、軟膏、外用藥籤、乳液、噴霧或洗劑。15.根據權利要求14所述的方法，其中，所述用來治療諸如糖尿病傷口的糖尿病併發症的艾司洛爾參與選自由以下機制所組成的組中的機制誘導一氧化氮產生；提高糖尿病傷口處膠原蛋白的水平；通過增強糖尿病傷口處的新生血管來提高血管灌注；通過增強糖尿病傷口的血管灌注來增加氧供給；對糖尿病患者體內提高的醛糖還原酶活性進行抑制；增強在糖尿病傷口中的生長因子，諸如神經生長因子、上皮生長因子、血管內皮生長因子、血小板衍生生長因子，以及它們的組合。16.根據權利要求13所述的方法，其中，以乳膏、軟膏、外用藥籤、乳液、噴霧或洗劑的形式外部施用所述p-腎上腺素能阻滯劑。17.根據權利要求14所述的方法，以乳膏、凝膠、外用液、皮膚貼、軟膏、外用藥籤、乳液、噴霧或洗劑的形式外部施用所述艾司洛爾。18.根據權利要求13所述的方法，其中，所述哺乳動物為靈長類動物、犬科動物、貓科動物、牛科動物、綿羊、豬科動物、駱駝科動物、山羊、齧齒動物或馬一牛動物。19.根據權利要求18所述的方法，其中，所述靈長類動物為人類。20.—種治療哺乳動物中的由醛糖還原酶介導的糖尿病併發症的方法，該方法包括將在治療上有效量的具有醛糖還原酶活性的P-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽給藥於需要治療的患者。21.根據權利要求20所述的方法，其中，所述P-腎上腺素能阻滯劑為艾司洛爾、p塞嗎洛爾或普萘洛爾。22.根據權利要求20所述的方法，其中，所述在治療上有效量的P-腎上腺素能阻滯劑、其前藥或其藥物可接受鹽在其藥用可接受載體、賦形劑或稀釋劑中被提供。23.根據權利要求20所述的方法，其中，所述由趁糖還原酶介導的糖尿病併發症選自由糖尿病神經病變、糖尿病腎病、糖尿病心肌病、糖尿病性視網膜病變、糖尿病性白內障、糖尿病性膀胱病、糖尿病性角膜病變、糖尿病皮膚病變、糖尿病微血管病變、心肌梗死、黃斑水腫、神經傳導受損和糖尿病傷口所組成的組。24.根據權利要求20所述的方法，其中，所述P-腎上腺素能阻滯劑通過經口、靜脈內、腹腔內、眼部的、非消化道、外用、皮下、硬膜下、靜脈內、肌肉內、鞘內、腹腔內、腦內、動脈內、病灶內、局部或肺部途徑進行給藥。全文摘要公開了一種用β-阻滯劑進行給藥來治療糖尿病併發症的方法。糖尿病併發症是由糖尿病引起的，並對它存在很少或不存在治療選擇。本發明描述了β-阻滯劑在糖尿病併發症治療中的使用。本發明還描述了對作為糖尿病併發症的主要誘發因素之一的醛糖還原酶的抑制作用。還提供了糖尿病傷口癒合的方法。公開了用來治療諸如糖尿病傷口的糖尿病併發症的組合物。本發明包括施用β-阻滯劑外用製劑來改善糖尿病傷口癒合的過程，所述β-阻滯劑基本上不具有抗菌活性。本發明還涉及提高糖尿病個體在傷口上皮化組織癒合時膠原蛋白的累積速率。文檔編號A61K31/00GK101616662SQ200880003337公開日2009年12月30日申請日期2008年1月24日優先權日2007年1月29日發明者蘇普裡特·K.·德什潘德,蘇迪爾·A.·庫卡爾尼,雷納·R.·格拉普迪申請人:V生命科學技術有限公司