對促腎上腺皮質激素釋放激素刺激的應答而表達增加的基因的製作方法

2023-04-25 14:25:41 4

專利名稱：對促腎上腺皮質激素釋放激素刺激的應答而表達增加的基因的製作方法
技術領域：
本發明一般涉及抑鬱症的治療和診斷。具體地，本發明涉及多肽以及編碼這些多肽的多核苷酸，其中所述多肽表現出在介導促腎上腺皮質激素釋放激素的細胞應答中起主要作用。這些多肽和多核苷酸可用於抑鬱症的診斷、治療和/或預防。
背景技術：
最近的社會經濟學分析發現抑鬱症是無能的首要原因和其他疾病發展的主要的危險因素。此外，在世界範圍規模內，抑鬱症被診斷不足和治療不足。最近的抗抑鬱藥物已經被證明是有效的，但是存在作用起效慢和副作用的問題。在這方面，仍然不清楚它們通過哪種藥理學作用模式發揮它們的臨床效果。基於抑鬱症的皮質類固醇受體假說的假說-驅動的研究已經導致一種新觀念，其聚焦在腦神經肽受體，特別是促腎上腺皮質激素-釋放激素(CRH)受體作為藥物靶標。
促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)是一種41個胺基酸的多肽，在下丘腦-垂體-腎上腺軸的調節中起中心作用，介導對各種應激物的內分泌應答。下丘腦神經元應答壓力而釋放CRH到垂體門脈系統，刺激垂體促腎上腺皮質激素(ACTH)的分泌和生物合成，導致腎上腺糖皮質激素產生增加(1)。一些臨床和臨床前研究針對抑鬱症發展中CRH系統中變化的原因角色(2)。在人中對CRH的最初研究表明在抑鬱症患者中對CRH的ACTH應答被鈍化，反映了連續增加的下丘腦CRH分泌繼發的CRH受體脫敏(3；4)。支持鈍化的ACTH應答作為增加的CRH釋放的結果的證據是發現抑鬱症患者的腦脊液中CRH水平升高。加強抑鬱狀態中CRH分泌過多這一觀念的其他發現為患有抑鬱症的自殺者中CRH分泌性神經元的數目增多和CRH受體的數目減少(5；6)。
關於CRH已經描述了兩種高親和性受體CRH1-R1和CRH-R2，它們兩者都以幾種剪接變體形式存在。這些受體被CRH的活化導致腺苷酸環化酶的Gs-介導的刺激，導致胞內cAMP水平上升。這自身將活化依賴cAMP的蛋白激酶A(KPA)和最終導致cAMP和Ca2+的升高的胞質水平。cAMP和Ca2+的升高的水平導致一些其他的激酶如依賴Ca2+/鈣調蛋白的激酶II(CAMKII)和p42/p44促分裂原活化的激酶(MAPK)的活化。結果，Ca2+/cAMP應答元件結合蛋白(CREB)被磷酸化並且這反過來將調節在啟動子區含有cAMP應答元件(CRE)的基因的轉錄。表明參與CRH信號化(signaling)調節的這些基因的實例包括c-fos、巨噬細胞遷移-抑制因子基因Mif、孤兒核受體Nurr77和Nurr1。
儘管已經在AtT20-細胞——促腎上腺皮質細胞的一種細胞模型中廣泛研究了CRH活化的受體的下遊途徑並且導致參與信號級聯的許多基因的鑑定，但是一個主要領域還未被探索。因此，本發明的目的是研究基因組水平上對CRH刺激的轉錄應答以鑑定與促腎上腺皮質激素釋放激素受體活化的基因網絡有關的其他基因。這樣鑑定的多肽和編碼所述多肽的多核苷酸作為篩選技術的藥物靶標為藥物開發提供了新的機會，或者可用於抑鬱症的診斷、預防和/或治療。
發明概述本發明涉及在基因組水平上與CRH刺激的轉錄應答有關的許多基因的鑑定。尤其涉及編碼調節CRH信號化的蛋白質的許多迄今未知的基因的鑑定，這些基因具有選自SEQ ID No.45、SEQ ID No.47、SEQ IDNo.49和其功能類似物的序列。
另一方面，本發明涉及前述核苷酸序列，包括含有這些序列的載體、含有編碼前述序列之一的載體的宿主細胞以及含有根據本發明的多核苷酸或載體的轉基因非-人動物的重組用途。
本發明的另一個目的是提供許多基因，這些基因迄今還未與CRH信號化相關並因此可用於鑑定調節細胞中CRH信號應答的的化合物的方法中，或者用於診斷方法以鑑定個體中CRH誘導的抑鬱症。在一個實施方案中，鑑定能夠改變細胞中CRH信號應答的化合物的方法包括在所述化合物存在和不存在下將所述細胞與CRH接觸並確定含有一核酸序列的多核苷酸的表達水平，該核酸序列選自SEQ ID No.1、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO 13、SEQ ID No.15、SEQ ID No 17、SEQ ID No 19、SEQID No.21、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQID No.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID No.33、SEQ ID No.35、SEQID No.37、SEQ ID No.39、SEQ ID No.41、SEQ ID No.43、SEQ IDNo.45、SEQ ID No.47或SEQ ID No.49。在該篩選方法中，通常使用結合前述多核苷酸的寡核苷酸探針，優選使用陣列技術方法評估表達水平。因此，在特定實施方案中，本發明提供了鑑定調節細胞中CRH信號應答的化合物的方法，所述方法包括在所述化合物存在和不存在下將所述細胞與CRH接觸；並確定具有核酸序列SEQ ID No.1、SEQID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO 13、SEQ ID No.15、SEQ ID No 17、SEQ ID No 19、SEQID No.21、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQID No.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID No.33、S EQ ID No.35、SEQID No.37、SEQ ID No.39、SEQ ID No.41、SEQ ID No.43、SEQ IDNo.45、SEQ ID No.47和SEQ ID No.49的多核苷酸的表達水平，其中這些序列的表達譜的變化指示能夠改變所述細胞中CRH信號化應答的化合物。
附圖簡述表1調節CRH信號化的蛋白質列表

圖1通過對β-肌動蛋白mRNA水平(視為100％)標準化的定量RT-PCR評估用DMSO、CRH、CRH+R121919或R121919處理的AtT-20細胞中不同時間點的c-fos mRNA水平。
圖2對所有時間點和處理的標準化微陣列數據應用的一致性分析。正方形描繪不同樣品，而圓形描繪基因。正方形之間的距離是對樣品之間相似性的量度。基因與給定樣品的正關聯(即該特定樣品中那個基因的上調)導致該基因和樣品位於穿過矩心(通過十字形描繪)的共有線(common line)上。一致性分析清楚地將時間鑑定為樣品之間的主要辨別者。此外，可以鑑定CRH處理的效果在早期時間點中是最突出的。
圖3描繪CRH處理時有變化的基因的熱圖。通過將每個樣品的強度與相應時間點DMSO樣品的強度相除計算值。用log2換算將這些計算的比值轉化成色道(color ramp)。這樣，表達誘導的不同時間選擇將變得明顯。用CRH處理30分鐘後表現出2倍變化的基因被稱為「早應答者」，「中間應答者」在處理1到2小時後表現出變化，「晚應答者」在2小時或更長時間之後應答。
圖4CRH誘導的基因的概述，通過本文中討論的途徑或功能對這些基因分類。通過將每個樣品的強度與相應時間點DMSO樣品的強度相除計算值。用log2換算將這些計算的比值轉化成色道並在熱圖中描繪。
圖5AtT-20細胞中CRH對Rgs2的誘導。與任何處理前AtT-20細胞中觀察到的水平相比較計算誘導。上面顯示了對Rgs2所得到的陣列數據。下面，顯示了通過定量RT-PCR對用於陣列實驗的相同樣品所測量的Rgs2mRNA水平和對重複實驗所測量的Rgs2mRNA水平。
發明詳述如此處所用的，術語「化合物」或「試劑」指生物或化學化合物如簡單或複雜的有機分子、肽、蛋白質或寡核苷酸。如此處所用的「受試化合物」指用於根據本發明的方法的「化合物」或「試劑」，用以評估所述化合物是否調節CRH信號化活性。
如此處所用的「CRH信號化」指細胞中CRH使促腎上腺皮質激素釋放激素受體活化後所述細胞基因轉錄的變化。其從而誘導CRH特異基因表達譜。可以在蛋白質或基因——RNA水平上評估轉錄水平的變化。
如此處所用的「CRH應答活性」一般指由於細胞暴露於CRH導致可檢測的細胞參數的變化。可檢測的細胞參數包括膜電位的變化、調節所述細胞中CRH信號化的酶的酶活性變化、根據本發明的蛋白質的表達水平的變化或者第二信使如cGMP、cAMP、Ca2+或IP3的量的變化。
術語「類似物」或「功能類似物」指根據本發明的蛋白質的修飾形式，其中已經進行了至少一個胺基酸置換使得所述類似物在體外和/或體內保持和未修飾的蛋白質基本相同的生物學活性。
術語「功能類似物」旨在包括根據本發明的多肽的「片段」、「變體」、「簡併變體」、「類似物」和「同系物」或「化學衍生物」。多肽的有用的化學衍生物是本領域中熟知的並包括，例如具有次級化學部分的多肽內所含的反應性有機位點的共價修飾。熟知的交聯試劑可用於與氨基、羧基或醛殘基反應以導入例如親和標記如生物素、螢光染料，或者將多肽綴合到固相表面(例如，產生親和樹脂)。
多核苷酸或多肽的變體，如該術語在此處所用的，分別是與參比多核苷酸或多肽不同的多核苷酸或多肽。多核苷酸的變體可以是天然發生的變體如天然發生的等位基因變體，或者其可以是不知道是天然發生的變體。(1)在核苷酸序列中與參比多核苷酸不同的多核苷酸。通常差異受到限制從而參比和變體的核苷酸序列總體上非常類似，在許多區域中相同。如下面所指出的，變體的核苷酸序列的改變可以是沉默的。即，它們可能不改變該多核苷酸編碼的胺基酸。當改變局限於這種類型的沉默變化時，變體將編碼具有與參比相同的胺基酸序列的多肽。還如下面所提到的，變體的核苷酸序列的改變可以改變參比多核苷酸所編碼的多肽的胺基酸序列。這種核苷酸改變可導致如上討論的參比序列編碼的多肽中胺基酸置換、加入、缺失、融合和截斷。(2)胺基酸序列與另一參比多肽不同的多肽。一般地，差異受到限制從而參比和變體的多肽序列總體上非常類似並且，在許多區域中相同。變體和參比多肽在胺基酸序列中可以相差一個或多個置換、插入、缺失、融合和截斷，它們可以以任一組合呈現。
如此處所用的術語「互補的」或「互補性」指嘌呤和嘧啶核苷酸通過氫鍵結合形成雙鏈核酸分子的能力。下面的鹼基對通過互補性相關聯鳥嘌呤和胞嘧啶；腺嘌呤和胸腺嘧啶；腺嘌呤和尿嘧啶。如此處所用的「互補的」指前述關係應用於所述分子的全長上，含有兩條單鏈核酸分子的基本所有鹼基對。「部分互補的」指前述關係，其中兩條單鏈核酸分子之一在長度上短於另一條從而兩個分子之一的一部分保持單鏈的。
術語「保守置換」或者「保守胺基酸置換」指基於本領域認識到的某些胺基酸的可置換性，親本蛋白質中一個或多個胺基酸殘基置換而不影響親本分子的生物學活性(見，例如，M.Dayhoff，Atlas ofProtein Sequence and Structure，卷5，增補3，345-352頁，1978)。
「其片段」指序列在此處公開的核酸或蛋白質的片段、片、或亞區域，從而所述片段含有5或更多胺基酸，或者10個或多個核苷酸，在親本蛋白質或核酸分子中這些胺基酸或核苷酸是相鄰的。
如此處所用的「功能片段」指此處公開的蛋白質的分離的亞區域或者片段，或者胺基酸序列，它們例如，含有功能上明顯的區域，如受體的活化位點。功能片段可通過克隆技術產生，或者作為備選剪接機制的天然產物。
術語「同系物」或「同源的」描述不同核酸分子或胺基酸序列之間的關係，其中所述序列或分子通過所述分子或序列內一個或多個區組或區域處的部分同一或類似性相聯繫。「分離的核酸化合物」指任一RNA或DNA序列，其無論如何分析或合成，在位置上與其天然位置不同。
如此處所用的「核酸探針」或「探針」是標記的核酸化合物，其與另一種核酸化合物雜交。「核酸探針」指將與單鏈靶核酸序列雜交的單鏈核酸序列。核酸探針可以是寡核苷酸或核苷酸聚合物。「探針」通常含有可檢測部分，其可以附著到該探針的末端或者可以在該探針的序列內部。
術語「引物」是作為例如核酸分子的酶促或合成的延伸的起始底物的核酸片段。
如此處所用的術語「雜交」指一種過程，其中單鏈核酸分子與互補鏈通過核苷酸鹼基配對接合。
術語「嚴格性」指雜交條件。高嚴格性調節不利於非同源鹼基配對。低嚴格性條件具有相反作用。例如，通過溫度和鹽濃度可以改變嚴格性。「嚴格條件」指在含有50％甲醯胺、5×SSC(750mM NaCl，75mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5×Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖、和20μg/ml變性的、剪切的鮭精DNA的溶液中於42℃下過夜孵育，然後在0.1×SSC中約65℃下洗滌濾器。其他適宜的雜交條件在實施例中描述。
「較低的嚴格條件」包括在含有6×SSPE(20X SSPE＝3MNaCl；0.2M NaH2PO4；0.02M EDTA，pH7.4)、0.5％SDS、30％甲醯胺、100μg/ml鮭魚精子封閉DNA的溶液中37℃整夜孵育，然後用1×S SPE、0.1％SDS在50℃洗滌。此外，為了實現甚至更低的嚴格性，可以在更高鹽濃度(例如，5×SSC)下進行嚴格雜交後的洗滌。注意到通過用於抑制雜交實驗中背景的備選封閉試劑的包括和/或替換可以實現上麵條件的改變。典型的封閉試劑包括Denhardt試劑、BLOTTO、肝素、變性的鮭精DNA、和通過商業途徑可得到的專利製劑。特異封閉試劑的包含由於相容性問題可能需要修改上述雜交條件。
如此處所用的術語「融合蛋白」指為了得到結構域或者接頭(linker)區的組合功能，組合多個蛋白質結構域或者連接體區導致的蛋白質構建體。這可以通過編碼這種結構域的核苷酸序列的分子克隆以產生編碼所希望的融合蛋白的新的多核苷酸序列實現。備選地，通過化學方法連接兩個蛋白質產生融合蛋白。
如此處所用的術語「接頭區」或者「接頭結構域」或者類似的這些描述性術語指用於克隆載體或融合蛋白的構建中的多核苷酸或多肽序列。接頭區的功能可以包括將克隆位點導入核苷酸序列、將柔性組分或空間產生區域導入兩個蛋白質結構域之間，或者產生用於特定分子相互作用的親和標記。接頭區可被導入在多肽或多核苷酸序列構建期間作出的選擇導致的融合蛋白中。
篩選方法本發明涉及用於鑑定調節促腎上腺皮質激素-釋放激素(CRH)誘導的抑鬱症和緊張的化合物的篩選方法。該方法基於作為CRH活化的CRH受體的下遊調節劑的許多基因的鑑定。具體地，本發明提供了鑑定能夠改變細胞中CRH信號化應答的化合物的方法，所述方法包括a)所述化合物存在或不存在時將所述細胞與CRH接觸；b)確定調節所述細胞中促腎上腺皮質激素-釋放激素(CRH)信號化的至少一種蛋白質在轉錄水平上的改變；和c)比較在所述化合物存在和不存在時所述蛋白質的轉錄水平；其中，調節促腎上腺皮質激素-釋放激素(CRH)信號化的蛋白質選自SEQ ID NO.2、SEQ ID 4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48。
為了確定蛋白質水平上轉錄的變化，可以使用本領域中公知的技術確定所述蛋白質的量。例如，使用分離技術如等電聚焦或SDS-PAGE聯合蛋白質染色技術如考馬斯或銀染。備選地，對於是酶的蛋白質，可以按照該酶產生的催化效果，即其底物向反應產物的轉化，測量或分析給定溶液或組織提取物中的量。例如，對於激酶，可以使用含有激酶特異磷酸化位點的底物並通過測量由於放射性磷酸向底物的摻入導致的該底物的磷酸化來評估激酶活性。可以在受試化合物存在或不存在時實施該測定法。對於不是酶的蛋白質，需要其他定量方法。例如，轉運蛋白可通過它們與它們所轉運的分子的結合來測量，激素和毒素可通過它們產生的生物學效應來測定。
為評估基因水平上轉錄的變化，RNA或eDNA可被直接使用或者可以在分析前通過使用PCR或其他擴增技術酶促擴增。優選地，所述分析方法包括使用標記的寡核苷酸探針，該探針靶定基因的適宜區域。
因此，在優選的實施方案中，使用結合編碼胺基酸序列的多核苷酸的探針評估基因轉錄水平，該胺基酸序列選自SEQ ID NO.2、SEQ ID4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48。
在另一實施方案中，可以構建含有編碼調節CRH信號化的蛋白的核苷酸序列或者其片段的寡核苷酸探針陣列以實施基因表達的有效篩選。陣列技術是熟知的並且具有普遍適用性並且可用於處理分子遺傳學中的各種問題，包括基因表達、遺傳連鎖，和遺傳變異性(見例如M.Chee等人，Science，卷274，610-613頁(1996))。從而本發明的一個目的是提供鑑定能夠改變細胞中CRH信號化應答的化合物的方法，所述方法包括在受試化合物存在和不存在時將所述細胞與CRH接觸；和使用結合編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO.2、SEQ ID 4、SEQID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ IDNO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48的多肽組的多核苷酸的寡核苷酸探針陣列確定基因轉錄的水平。
在備選的實施方案中，鑑定能夠改變細胞中CRH信號化應答的化合物的方法包括a)在所述化合物存在和不存在時將所述細胞與CRH接觸；和
b)確定含有核酸序列的多核苷酸的表達水平，該核酸序列選自SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ IDNo.9、S EQ ID NO.11、SEQ ID NO 13、SEQ ID No.15、SEQ ID No 17、SEQ ID No 19、SEQ ID No.21、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQ ID No.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID No.33、SEQ ID No.35、SEQ ID No.37、SEQ ID No.39、SEQ ID No.41、SEQ ID No.43、SEQ ID No.45、SEQ ID No.47或SEQ ID No.49。
為了評估表達水平的改變，RNA或cDNA可被直接使用或者可以在分析前通過使用PCR或其他擴增技術酶促擴增。優選地，所述分析方法包括使用標記的寡核苷酸探針，該探針靶定該多核苷酸的適宜區域。因此，在優選的實施方案中，使用結合含有核酸序列的多核苷酸的探針評估基因轉錄水平，該核酸序列選自SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO 13、SEQ ID No.15、SEQ ID No 17、SEQ ID No 19、SEQID No.21、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQID No.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID No.33、SEQ ID No.35、SEQID No.37、SEQ ID No.39、SEQ ID No.41、SEQ ID No.43、SEQ IDNo.45、SEQ ID No.47和SEQ ID No.49。
在另一實施方案中，可以構建陳列含有編碼調節CRH信號化的蛋白質的核苷酸或者其片段的寡核苷酸探針陣列以有效篩選基因表達。在該實施方案中，本發明提供了鑑定能夠改變細胞中CRH信號化應答的化合物的方法，所述方法包括在所述化合物存在或不存在時將所述細胞與CRH接觸；確定具有核酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID NO.11、SEQID NO 13、SEQ ID No.15、SEQ ID No 17、SEQ ID No 19、SEQ ID No.21、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQ ID No.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID No.33、SEQ ID No.35、SEQ ID No.37、SEQ ID No.39、SEQ ID No.41、SEQ ID No.43、SEQ ID No.45、SEQ ID No.47或SEQ ID No.49的多核苷酸的表達水平。具體地，使用結合具有核酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO 13、SEQID No.15、SEQ ID No 17、SEQ ID No 19、SEQ ID No.21、SEQ IDNo.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQ ID No.29、SEQ IDNO.31、SEQ ID No.33、SEQ ID No.35、SEQ ID No.37、SEQ IDNo.39、SEQ ID No.41、SEQ ID No.43、SEQ ID No.45、SEQ ID No.47和SEQ ID No.49的多核苷酸的寡核苷酸探針陣列。
在另一實施方案中，寡核苷酸探針陣列含有編碼調節CRH信號化的蛋白質的核苷酸序列或者其片段，可以構建該寡核苷酸探針的陣列用於實施基因表達的有效篩選。陣列技術是熟知的並且具有普遍適用性並且可用於處理分子遺傳學中的各種問題，包括基因表達、遺傳連鎖，和遺傳變異性(見例如M.Chee等人，Science，卷274，610-613頁(1996))。
對於基因組DNA不被直接使用的情況，可以分離mRNA，並實施第一條鏈c DNA合成。可以實施DNA合成的第二輪以產生第二條鏈。隨後，通過特異PCR擴增，可以得到分離的cDNA。如果希望，雙鏈cDNA可被克隆到任一適宜的載體，例如，質粒，從而形成cDNA文庫。類似於上面的方法，可以用靶定編碼調節CRH信號化的蛋白質的基因的任一適宜的區域的標記的寡核苷酸探針篩選在噬菌體或質粒穿梭載體中構建的cDNA文庫。見例如，PCR ProtocolsA Guide to Method andApplication，編者M.Innis等人，Academic Press(1990)。
在適宜的載體如質粒或噬菌體中構建cDNA文庫以在原核或真核細胞中增殖的方法是本領域技術人員熟知的。[見例如Maniatis等人，如前]。適宜的克隆載體是熟知的並且可普遍得到。
在另一實施方案中，在mRNA水平確定基因轉錄的變化。可以使用用於多核苷酸定量的本領域中熟知的方法之一在RNA水平測量減少或增加的表達，這些方法為，例如，核酸擴增，例如，通過PCR、RT-PCR；RNA酶保護；Northern印跡和其他雜交方法。可用於確定蛋白質，如來自宿主的樣品中本發明的多肽的水平的測定技術是本領域技術人員熟知的。這些測定方法包括放射免疫測定法、競爭-結合測定法、蛋白質印跡分析和ELISA測定法。可用於確定蛋白質衍生物或者變體的存在的測定技術包括質譜法。
從而，本發明的一個目的是提供鑑定能夠改變細胞中CRH信號化應答的化合物的方法，所述方法包括a)所述化合物存在或不存在時將所述細胞與CRH接觸；
b)確定調節所述細胞中促腎上腺皮質激素-釋放激素(CRH)信號化的至少一種蛋白質的量；和c)比較在所述化合物存在和不存在時所述蛋白質的量；其中，調節促腎上腺皮質激素-釋放激素(CRH)信號化的蛋白質選自SEQ IDNO.2、SEQ ID 4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48。
優選地，測定調節CRG信號化的蛋白質的量的方法是使用結合含有選自SEQ ID NO.2、SEQ ID 4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48的胺基酸序列的多肽的抗體。
從而，在另一實施方案中，本發明提供了與調節CRG信號化的蛋白質具有免疫反應性的單特異抗體，所述蛋白質選自SEQ ID NO.2、SEQ ID 4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48。使用常規方案，通過將本發明多肽或者含有表位的片段、類似物或者表達這些的細胞施用於動物，優選非-人動物，可以得到所產生的針對本發明多肽的抗體。對於單克隆抗體製備，可以使用提供通過連續細胞系培養產生的抗體的任一技術。實例包括雜交瘤技術(Kohler，G.和Milstein，C.，Nature(1975)256495-497)、trioma技術、人B-細胞雜交瘤技術(Kozbor等人，Immunology Today(1983)472)和EBV-雜交瘤技術(Cole等人，MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAP Y，77-96頁，Alan R.Liss，Inc.，1985)。
產生單鏈抗體，如美國專利號4,946,778中所描述的那些單鏈抗體的技術也可適用於產生針對本發明多肽的單鏈抗體。而且，轉基因小鼠，或者其他生物，包括其他哺乳動物，也可以用於表達人源化抗體。
上述抗體可用於分離或鑑定表達該多肽的克隆或者通過親和層析純化這些多肽。
針對本發明多肽的抗體也可用於治療CRH代謝相關的失調如CRH誘導的緊張或抑鬱症。
為了確定調節CRH信號化的蛋白質的量，根據本發明的抗體被用於常規免疫學技術。適宜的免疫學技術是本領域技術人員熟知的並包括例如，ELISA、蛋白質印跡分析、競爭性或三明治免疫測定法等，如所熟知的，它們都依賴於抗原-抗體免疫複合物的形成，其中為了測定法起見，抗體可以被例如，放射、酶或螢光標記物可檢測地標記，或者可固定在不可溶的載體上。
例如，在一種ELISA篩選方法中，抗體被加到固相(例如，微量滴定板的底部)，該固相被偶聯到載體(如BSA)的蛋白質或者其片段包被，然後加入綴合可檢測標記如酶，優選辣根過氧化物酶，或者放射性同位素如125I的抗-免疫球蛋白抗體(例如，當在小鼠中進行免疫時，使用抗-小鼠免疫球蛋白抗體，例如，綿羊-抗-小鼠免疫球蛋白(Ig))。
從而本發明的一個目的是提供確定或檢測調節樣品中CRH信號化的蛋白質的免疫測定法，該方法包括將樣品與根據本發明的蛋白質接觸並確定在該抗體和所述蛋白質之間是否形成免疫複合體。可以對組織樣品或者體液樣品實施這些方法並且它們通常包括從受試者的身體得到樣品；將所述樣品與根據本發明的可檢測標記的抗體的成像有效量接觸；並檢測標記以鑑定調節樣品中CRH信號化的蛋白質的存在。
使用本發明抗體的測量方法不被具體限制。可以使用任一測量方法，只要相應於抗原的抗體、抗原或者抗原-抗體複合體的量可被化學或物理方法檢測，並且從通過使用含有已知量的抗原的標準溶液製備的標準曲線計算得到。例如，可以適宜地使用濁度測定法、競爭法、免疫測量方法和三明治方法。對於靈敏性和特異性，尤其優選使用下面描述的三明治方法。
在使用標記物質的測量方法中，放射性同位素、酶、螢光物質、發光物質等被用作標記劑。放射性同位素的實例包括125I、131I、3H和12C。酶通常被綴合適宜的底物，該底物又反過來催化可檢測的反應物而使得該酶可被檢測。該底物的實例包括，例如，β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹼性磷酸酶、過氧化物酶和蘋果酸脫氫酶，優選辣根過氧化物酶。發光物質包括，例如，魯米諾、魯米諾衍生物、螢光素、水母發光蛋白和螢光素酶。此外，抗生物素蛋白-生物素系統也可以用於標記抗體和本發明的免疫原。
因此，在另一方面，本發明提供了鑑定能夠改變細胞中CRH信號化應答活性的化合物的方法，該方法包括a)將表達含有選自SEQ ID NO.2、SEQ ID 4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48的胺基酸序列的至少一種蛋白質的細胞與所述受試化合物接觸；和b)比較所述化合物存在和不存在時所述細胞中CRH應答活性。
使用常規電生理學技術並且當它們可以得到時，使用當前正在開發的新的高通量方法測量膜電位的變化。因為膜電位的改變通常是離子通量的結果，作為備選方法，使用離子敏感的螢光染料，包括fluo-3、fluo-4、fluo-5N、fura red、Sodium Green、SBFI和來自包括Molecular Probes的供應商的其他類似探針，可以通過細胞內離子濃度的變化間接測量膜電位的變化。來自包括Molecular Probes的供應商的其他螢光染料如DIBAC4(3)或Di-4-Anepps可以檢測膜電位變化。例如，使用螢光測量和螢光成像技術，包括螢光顯微術，用或不用雷射共聚焦方法組合圖像分析算法，可以實時表徵鈣和鈉離子通量。
在優選的實施方案中，該測定法基於稱作螢光成像板讀出器((FLIPR)，Molecular Devices Corporation)的儀器。在其最通常的配置中，該儀器激發並測量基於螢光素的染料發出的螢光。其使用氬離子雷射在螢光團的488nm處產生高能量激發，用光學系統快速掃描96-/384-孔板的底部並用靈敏的冷CCD相機捕捉發出的螢光。其還包括96-/384-孔移液頭以允許該儀器遞送試劑溶液到96-/384-孔板的孔中。FLIPR測定法被設計用於同時從所有96-/384-孔實時地測量化合物加入之前、之中和之後來自細胞群體的螢光信號。
從而本發明的一個目的是提供用於篩選和鑑定在調節細胞CRH應答中具有功能活性的化合物的FLI PR測定法，所述細胞表達選自SEQ IDNO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32和SEQ IDNO.34的蛋白。
在備選實施方案中，可以使用電生理學方法評估細胞的活性。因此，可以使用全細胞和單通道電生理學鑑定調節細胞中CRH信號化的蛋白質。
從而，本發明的另一個目的是提供鑑定調節細胞中CRH信號化應答活性的化合物的篩選方法，所述方法包括a)將表達選自SEQ ID NO.2、SEQ ID 4、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48的蛋白質的宿主細胞與受試化合物接觸；b)使用電生理技術檢測受試化合物對所述細胞膜電位的影響；和c)比較所述化合物存在和不存在時所述細胞中CRH應答活性。備選地，前述篩選方法中的宿主細胞表達選自SEQ ID NO.26、SEQ IDNO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.34的蛋白質。
在優選的實施方案中，宿主細胞是爪蟾(Xenopus)卵母細胞並且電生理學測量由使用電壓鉗技術在不同的膜電位測量膜電流組成。
調節所述細胞中CRH信號化的酶的酶活性的變化一般可以按照酶產生的催化效果，即其底物向反應產物的轉化來測量或分析。例如，對於激酶，可以使用含有該激酶特異磷酸化位點的底物並通過測量該底物的磷酸化評估該激酶的活性。類似地對於磷酸酶，可以使用磷酸化底物並通過測量該底物的去磷酸化評估磷酸酶活性。
可以在受試化合物存在和不存在時實施這些測定。
從而本發明的一個目的是提供鑑定能夠改變細胞中CRH信號化應答活性的化合物的方法，所述方法包括a)將包括選自SEQ ID NO.10、SEQ ID 12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.18的激酶的混合物與磷酸源和適宜的激酶底物接觸；b)在所述化合物存在或不存在時孵育所述混合物；和檢測與所述受試化合物不存在時所述底物的磷酸化水平相比所述化合物存在時所述底物的磷酸化水平。
在本發明的測定法中，激酶可作為蛋白質提供或者其可以作為編碼所述激酶的mRNA在測定混合物中提供。當該測定法包括無細胞組分時，該激酶以蛋白質提供。當該測定法在細胞環境中實施時，該激酶可以作為蛋白質或者作為編碼所述激酶的mRNA提供，其中，為了該激酶可以在該測定法中被利用，該mRNA被翻譯從而產生激酶蛋白。從此處提供的實施例顯然的是得到該激酶的mRNA並將該mRNA注射到細胞中以產生激酶蛋白是簡單的事情。還可以通過編碼激酶蛋白的質粒的表達提供激酶。可以用標準分子生物學技術構建編碼激酶蛋白的可操作質粒並在細胞中表達質粒(Sambrook，等人，1989，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)。
如此處所討論的，可以在體外(其中測定混合物無細胞或者其中活細胞被包括在測定法中)，或者體內在動物中實施鑑定激酶調節劑的方法。從而，在本發明的一個方面，混合物被包含在真核細胞中並且可以實施本發明的方法，其中測定混合物的一些組分可以通過這些組分向細胞的微注射外源地提供給細胞，一些組分可以是細胞內源的。
如此處所用的術語「細胞內源的」指該組分在受試細胞中天然地產生。
如此處所用的術語「細胞外源的」指該組分在受試細胞中沒有天然地發現，或者在細胞中以低水平發現，和被加到細胞中。
當使用真核細胞實施本發明方法時，一種或多種激酶蛋白、激酶底物和受試化合物可以在真核細胞孵育前注射到真核細胞中。然後如此注射的細胞在促進蛋白質激酶活性的條件下孵育，在孵育期之後，使用此處描述的測定法隨後測量蛋白質激酶活性水平。
用於本發明方法中的真核細胞可以是非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母細胞、非洲爪蟾胚細胞、哺乳動物細胞(如IOTI/2細胞)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)S2細胞、Dictyostefium discoideum細胞和酵母細胞。更優選地，真核細胞是鼠垂體促腎上腺皮質激素細胞-來源的腺瘤細胞系細胞AtT-20之一。
用於本發明方法的磷酸源可以是磷酸的任一普通來源，包括，但不限於，核苷酸三磷酸如，但不限於，ATP或GTP。在優選的實施方案中，磷酸源上結合可檢測的標記，在反應期間該標記隨磷酸基團轉移到激酶底物。這樣，磷酸化激酶底物可以與非-磷酸化激酶底物區分，因為磷酸化底物將含有可檢測的標記而非磷酸化底物將不含有標記。在另一實施方案中，磷酸源上不結合可檢測標記；而是，例如通過抗體識別底物的一種形式而不能識別另一種形式，可以將磷酸化激酶底物與非-磷酸化激酶底物區分。
用於本發明的方法中的可檢測標記可包括任一已知或至今未知的可檢測標記，該標記由於蛋白質激酶活性的結果在磷酸根基團轉移時轉移到激酶底物。可用的標記包括，但不限於，放射性標記，如γ32P、31S和非放射性標記，如生物素等。
在另一實施方案中，本發明提供了鑑定能夠改變細胞內CRH信號化應答活性的化合物的方法，所述方法包括a)將含有選自SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.38的磷酸酶的混合物與適宜的磷酸化底物接觸；b)在所述化合物存在或不存在時孵育所述混合物；和檢測與所述受試化合物不存在時所述底物的磷酸化水平相比，所述化合物存在時所述底物的磷酸化水平。
對於激酶測定法，本發明的測定法中的磷酸酶可以以蛋白質提供或者其可以作為編碼所述磷酸酶的mRNA在測定混合物中提供。通常用可檢測的磷酸殘基標記磷酸化底物。可用的標記物包括，但不限於，放射性標記，如γ32P、31S和非放射性標記，如生物素等。對於用於磷酸酶活性測定法，底物優選由在酪氨酸或絲氨酸殘基被磷酸化，典型地用γ32P標記的肽底物組成。通常，可以以各種方法完成磷酸化。典型地，使用蛋白質酪氨酸激酶。例如，可以使用可溶的EGF-受體激酶聯合、sup、32P標記的ATP磷酸化本發明的肽上的酪氨酸殘基。這種磷酸化反應通常允許在30℃持續約2小時或者在室溫過夜。
然後從磷酸化反應混合物純化磷酸化肽，其在下文中被稱為「磷酸肽」。例如，通過加入三氯乙酸並離心，從而肽保留在上清液中，可以從反應混合物分離肽。一般通過柱層析，例如在C18上進一步純化肽。純化的磷酸化肽可被凍幹並在-20℃保存備用。
孵育後，通過磷酸肽的去磷酸化(即從去磷酸化釋放的游離放射性磷)釋放的放射性分離沒有去磷酸化的磷酸肽(「未-去磷酸化的磷酸肽」)。如此處所用的，術語「放射性磷「包括所有形式，其中放射性磷原子可存在於酪氨酸殘基上並且可通過去磷酸化，例如，作為磷酸基團被除去。通常，通過離心，然後通過加入包括非放射性磷酸和活性炭的物質終止去磷酸化反應實現未-去磷酸化的磷酸肽與磷酸肽的去磷酸化釋放的游離的放射性磷的分離。通過本領域普通技術人員熟知的方法確定上清液的放射性。基於最初通過磷酸肽加入測定混合物的放射性的量和作為去磷酸化釋放的放射性在測定法的末尾檢測的放射性的量，可以計算所分析的樣品的磷酸酶酶促活性。
本發明的一個實施方案是提供鑑定能夠改變細胞中CRH信號化應答活性的化合物的方法，所述方法包括a)將表達包括選自SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQID NO.30、SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.34的至少一種蛋白質的細胞與所述受試化合物接觸；和b)比較所述化合物存在和不存在時所述細胞中第二信使，如cAMP、cGMP、Ca2+或IP3的水平。
使用本領域公知的技術確定含有前述蛋白質之一的全細胞或細胞提取物中第二信使的水平。
鑑定能夠改變細胞中CRH信號化應答活性的化合物的另一方法是基於基因的使用，如報導基因，其可操作地連接基因啟動子或者其調節序列元件，其特徵是所述基因啟動子或者調節序列元件含有轉錄因子結合位點，其中所述轉錄因子能夠調節細胞中CRH信號化。在優選的實施方案中，能夠調節細胞中CRH信號化的轉錄因子選自SEQ IDNO.2、SEQ ID 4、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8。因此，本發明提供了含有如上面定義的基因啟動子區的重組DNA分子。在所述重組DNA分子中，啟動子區可操作地連接編碼可檢測的產物的核酸分子，如報導基因。如此處所用的，術語「可操作地連接」指按適宜的框將基因與啟動子功能性融合以表達處於該啟動子控制下的基因。如此處所用的，術語「報導基因」指一種基因，其編碼的基因產物可以用簡單、便宜的方法鑑定並且該基因可以可操作地連接到啟動子區或者其活性片段。報導基因如，例如，螢火蟲螢光素酶、β-半乳糖苷酶、鹼性磷酸酶、細菌氯黴素乙醯基轉移酶或者綠色螢光蛋白報導基因可用於確定根據本發明的篩選測定法中的轉錄活性(見，例如，Goeddel(編著)，Methods Enzymol.，卷185，San DiegoAcademic Press，Inc.(1990)；還見Sambrook，如前)。在優選的實施方案中，報導基因是螢火蟲螢光素酶基因。本發明還提供了含有如上定義的重組DNA分子的載體，以及用所述載體，或者一般用根據本發明的重組DNA分子穩定轉化的宿主細胞。術語「載體」指用於將DNA轉移到宿主細胞中以通過宿主細胞複製和/或適宜表達外源DNA的任何外源DNA的運載工具。因此，在特定實施方案中，所述載體是表達載體，如pGL31uc、pBLCAT5(LMBP 2451)、pGMCSFlacZ(LMBP 2979)、pEGFP或pSEAPbasic(DMB 3115)，其中LMBP和DMB號指比利時微生物保藏中心(BelgianCo-ordinated Collections of Microorganisms)的這些表達載體的保藏號。
另一方面，本發明提供了鑑定調節CRH信號化活性的化合物的方法，所述方法包括步驟(i)將候選試劑與如上面定義的基因啟動子區接觸；和(ii)確定所述侯選試劑是否調節可檢測產物的表達，該調節指示能夠調節CRH信號化活性的試劑。可檢測的產物指該基因編碼的蛋白或者報導基因的產物如螢光素酶、β-半乳糖苷酶或綠色螢光蛋白。定量可檢測產物的方法是本領域中公知的並且包括如果表達產物是酶則使用比色底物，或者在RIA或ELISA測定法中使用特異抗體或者測量從可操作地連接到啟動子的基因轉錄的mRNA的水平，其中可以使用標準方法直接測量所述mRNA或者間接測量所述mRNA。優選地，基因啟動子包含轉錄因子結合位點，所述轉錄因子選自SEQ Ib No.2、SEQ Ib No.4、SEQ Ib No.6和SEQ Ib No.8。
編碼能夠調節CRH信號化的蛋白質的核酸的鑑定另一方面，本發明涉及分離並純化的核酸分子，它們編碼能夠調節CRH信號化的蛋白質，其中所述核酸分子是RNA、DNA、cDNA或基因組DNA。
具體地，本發明包括分離並純化的核酸分子，它們含有選自下面組的一個成員(a)編碼調節CRH信號化的蛋白質的核酸分子，該蛋白質與含有選自SEQ ID No.46和SEQ ID No.48的胺基酸序列的多肽具有至少70％同一性；(b)與(a)的多核苷酸互補的核酸分子；(c)含有(a)或(b)的多核苷酸的至少15個連續鹼基的核酸分子；(d)在嚴格條件下與(a)或(b)的多核苷酸分子雜交的核酸分子；和(e)編碼調節CRH信號化的蛋白質的核酸分子，該核酸分子含有由於(a)到(d)任一個的多核苷酸的核苷酸序列的遺傳密碼的簡併產生的核苷酸序列。
本領域技術人員將認識到由於遺傳密碼簡併性，核苷酸鹼基對的許多「沉默」置換可被導入由SEQ ID NO45、SEQ ID NO 47或SEQ IDNO49鑑定的序列而不改變所編碼的胺基酸或蛋白質產物的同一性。所有這些置換都旨在位於本發明的範圍內。
另一方面，本發明涉及人嘌呤通透酶多核苷酸。這些多核苷酸包括分離的多核苷酸，其含有編碼多肽的核苷酸序列，該多肽與選自SEQID NO46和S EQ ID NO48的胺基酸序列在該胺基酸序列的全長上具有至少70％同一性，優選至少80％同一性，更優選至少90％同一性，更優選至少95％同一性。這一點上，高度優選具有至少97％同一性的多肽，更高度優選具有至少98-99％同一性的多肽，最高度優選具有至少99％同一性的多肽。這些多核苷酸包括基本上由選自SEQ ID No.45、SEQ ID No.47或SEQ ID No.49的多核苷酸序列組成。
因此，另一方面，本發明提供了分離的多核苷酸，其含有a)編碼與選自SEQ ID NO46和SEQ ID NO48的胺基酸序列具有至少70％同一性，優選至少80％同一性，更優選至少90％同一性，更優選至少95％同一性，甚至更優選至少97-99％同一性的多肽的核苷酸序列；b)與選自SEQ ID No.45、SEQ ID No.47和SEQ ID No.49的多核苷酸在所述多核苷酸的全長上具有至少70％同一性，優選至少80％同一性，更優選至少90％同一性，更優選至少95％同一性，甚至更優選至少97-99％同一性的核苷酸序列；c)與選自SEQ ID No.45、SEQ ID No.47和SEQ ID No.49的多核苷酸在所述多核苷酸的全部編碼區上具有至少70％同一性，優選至少80％同一性，更優選至少90％同一性，更優選至少95％同一性，甚至更優選至少97-99％同一性的核苷酸序列；和d)由選自SEQ ID No.45、SEQ ID No.47和SEQ ID No.49的多核苷酸組成的核苷酸序列。
具體提供了上面概述的多核苷酸用於根據本發明的篩選方法或診斷方法。尤其用於鑑定能夠調節細胞中CRH信號化的化合物或者診斷個體中改變的CRH代謝。
同一性或相似性，如本領域中公知的，是如通過比較序列確定的兩個或多個多肽序列或者兩個或多個多核苷酸序列之間的關係。在本領域中，同一性還指多肽或多核苷酸序列之間的序列相關性程度，可以如通過這些序列串之間的匹配確定。可以容易地計算同一性或相似性(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，編者，OxfordUniversity Press，New York，1988；BiocomputingInformaticsand Genome Projects，Smith，D.W.，編者，Academic Press，NewYork，1993；Computer Analysis of Sequence Data，PartI，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysisin Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，編者，M Stockton Press，New York，1991)。儘管有許多方法可以測量兩種多核苷酸或兩種多肽序列之間的同一性或相似性，但是兩種術語都是技術人員熟知的(Sequence Analysis inMolecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，編者，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H.，和Lipman，D.，(1988)SIAM J.Applied Math.，48，1073)。通常用於確定序列之間的同一性或相似性的方法包括，但不限於Carillo，H.，和Lipman，D.，(1988)SIAM J.Applied Math.，48，1073中公開的那些方法。設計確定同一性的優選方法以給出所試驗的序列之間的最大匹配。確定同一性或相似性的方法在電腦程式中編碼。確定兩個序列之間同一性和相似性的優選的電腦程式方法包括，但不限於GCG程序包(Devereux，J.，等人，(1984)Nucleic Acids Research12(1)，387)、BLASTP、BLASTN、和FASTA(Atschul，S.F.等人，(1990)J.Molec.Biol.215，403)。
可以從所述基因被表達的組織，如但不限於，腦、心臟、腎臟、胰腺、肝臟和皮膚分離編碼能夠調節CRH活性的蛋白質的核酸序列或者其片段。也可以從人和小鼠之外的哺乳動物分離所述序列。其他細胞和細胞系也可以適宜用以分離哺乳動物嘌呤通透酶cDNA。如此處描述的，通過篩選細胞提取物或全細胞測定中CRH活性可以進行適宜的細胞的選擇。在這些測定法的任一種中具有CRH調節活性的細胞可適於分離嘌呤通透酶DNA或mRNA。
本領域中公知的各種方法的任一種可用於編碼根據本發明的蛋白質的DNA的分子克隆。在一種方法中，mRNA被分離，並且實施第一條鏈cDNA合成。可以實施第二輪DNA合成以產生第二條鏈。隨後通過從調節CRH信號化的純化蛋白的胺基酸序列設計簡併寡核苷酸引物對DNA片段進行特異PCR擴增，可以得到分離的cDNA。如果希望，可將雙鏈cDNA克隆到任一適宜的載體，例如，質粒，從而形成cDNA文庫。另一種方法是篩選用靶定SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO 13、SEQ ID No.15、SEQ ID No 17、SEQ ID No 19、SEQ ID No.21、SEQID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQ ID No.29、SEQID NO.31、SEQ ID No.33、SEQ ID No.35、SEQ ID No.37、SEQID No.39、SEQ ID No.41、SEQ ID No.43、SEQ ID No.45、SEQ IDNo.47或SEQ ID No.49的任一適宜區域的標記的寡核苷酸探針在噬菌體或質粒穿梭載體中構建的cDNA文庫。見例如，PCR ProtocolsAGuide to Method and Application，Ed.M.Innis等人，AcademicPress(1990)。
在適宜的載體如質粒或噬菌體中構建cDNA文庫以在原核或真核細胞中增殖的方法是本領域技術人員熟知的。[見例如，Maniatis等人，如前]。適宜的克隆載體是熟知的和普遍可得到的。
對本領域技術人員顯而易見的是其他類型的文庫，以及從其他細胞或細胞類型構建的文庫，可用於分離根據本發明的核酸序列。其他類型的文庫包括，但不限於，從其他細胞、從不同於人和小鼠的其他生物得到的cDNA文庫，和基因組文庫，其包括YAC(酵母人工染色體)和粘粒文庫。可通過本領域中熟知的標準技術實施基因組DNA文庫的構建。在T.Maniatis等人，Molecular CloningA LaboratoryManual，第二版.14章(1989)可發現熟知的基因組DNA文庫構建技術。
技術人員將明白，在許多情況中，分離的cDNA序列將是不完整的，因為編碼多肽的區域在該cDNA的5』末端短。這是逆轉錄酶——具有內在的低「持續合成能力」(酶在聚合反應期間保持附著到模板的能力的一種測量)的一種酶——在第一條鏈cDNA合成期間不能完成mRNA模板的DNA拷貝的結果。
有一些方法可利用並且是本領域中技術人員熟知的，用於得到全長c DNA，或者延伸短cDNA，例如，基於cDNA末端的快速擴增(RACE)的方法(Frohman等人，1988，PNAS USA 85，8998-9002)，或者該技術的最近改良方法，例如MarathonTM技術(Clontech La boratoriesInc.)。
為了通過上面的方法克隆編碼根據本發明的蛋白質的多核苷酸，所述核酸序列編碼的多肽的胺基酸序列可能是必要的。為了實現該目的，可以純化根據本發明的蛋白質並通過自動測序儀測定部分胺基酸序列。不必確定全部胺基酸序列，但是確定該蛋白質的6到8個胺基酸的兩個區域的線性序列以產生用於部分DNA片段的PCR擴增的引物。
一旦已經鑑定了適宜的胺基酸序列，就合成能夠編碼它們的DNA序列。因為遺傳密碼是簡併的，可以使用一個以上的密碼子編碼一個特定胺基酸，因此，該胺基酸序列可被一組相似的DNA寡核苷酸的任一個編碼。該組中只有一個成員與根據本發明的多核苷酸序列相同並且將能夠與編碼所希望的蛋白質的DNA雜交，即使存在具有錯配的DNA寡核苷酸也是如此。通過這些方法分離的DNA可用於從各種細胞型、無脊椎動物和脊椎動物來源篩選DNA文庫，和分離同源基因。
多肽在另一實施方案中，本發明涉及調節CRH信號化的基本純的形式的多肽，其中所述多肽被分離和純化的根據本發明的核酸分子編碼。在優選實施方案中，該多肽具有選自SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48和其功能類似物的胺基酸序列。
根據本發明的蛋白質包括根據本發明的核酸編碼的所有可能的胺基酸變體，包括被所述分子編碼和具有保守胺基酸變化的多肽。
本領域技術人員將認識到通過多種重組DNA技術包括，例如，雜交、聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，或者從頭DNA合成(見，例如，T.Maniatis等人.Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版.14章(1989))，可以得到調節CRH信號化的蛋白質。
調節CRH信號化的純化的生物活性蛋白質可以具有幾種不同的物理形式。根據本發明的多肽可以以全長新生的或者未加工的多肽，或者作為部分加工的多肽或者加工的多肽的組合存在。全長新生多肽可以是被特定蛋白質水解切割事件翻譯後修飾的，該事件導致全長新生多肽的片段的形成。片段，或者片段的物理締合可以具有與根據本發明的蛋白質相關的全部生物學活性；然而，CRH調節活性的程度可以在個體片段之間變化。
在本發明的該方面還優選的是該多肽的結構或功能屬性所表徵的片段。在這一點上本發明的優選實施方案包括含有α-螺旋和α-螺旋形成區、β-摺疊和β-摺疊-形成區、轉角和轉角-形成區、捲曲螺旋和捲曲螺旋-形成區、親水區、疏水區、α兩性區、β兩性區、彈性區、表面-形成區、底物結合區、本發明的多肽的高抗原性指數區的片段，和這些片段的組合。優選的區是介導本發明的多肽的活性的區。在這一點上最高度優選的是具有本發明的應答調節多肽的化學、生物學或其他活性的片段，包括具有類似活性或者提高的活性，或者具有降低的不希望的活性的那些片段。
編碼調節CRH活性的蛋白質的多核苷酸的重組表達在另一實施方案中，根據本發明的多核苷酸可以通過分子克隆到含有適宜的啟動子和其他適宜的轉錄調節元件的表達載體中，並轉移到原核和真核宿主細胞以產生調節CRH信號化的蛋白質，而被重組地表達。這種操作技術在Maniatis，T，等人(如前)中完整描述，並且是本領域中熟知的。
因此，在另一方面，本發明提供了在重組宿主中表達調節CRH信號化的蛋白質的表達載體，其中所述載體含有編碼調節CRH信號化的蛋白質的核酸序列和其功能類似物。在本發明的更優選的方面，該表達載體含有編碼調節CRH信號化的蛋白質的核酸分子，其具有選自SEQ ID No.45、SEQ ID No.47或SEQ ID No.49的核苷酸序列和其功能類似物或者含有編碼調節CRH信號化的蛋白質的基因組DNA。
表達載體在此處被定義為適宜的宿主中所克隆基因拷貝的轉錄和它們的mRNA翻譯所需要的DNA序列。這些載體可用於在各種宿主中表達真核基因，該宿主為如細菌(包括大腸桿菌)、藍細菌、植物細胞、昆蟲細胞、兩棲動物細胞、真菌細胞(包括酵母細胞)和動物細胞。
特別設計的載體允許宿主之間的DNA穿梭，如細菌-酵母或細菌-動物細胞或者細菌-真菌細胞或細菌-無脊椎動物細胞。適宜構建的表達載體可含有用於在宿主細胞中自主複製的複製起點、可選擇的標記物、有限數目的有用的限制酶位點、高拷貝數的潛力，和活性啟動子。啟動子被定義為指導RNA聚合酶結合DNA並啟動RNA合成的DNA序列。強啟動子是導致mRNA以高頻率啟動的mRNA。表達載體可包括，但不限於，克隆載體、修飾的克隆載體、特別設計的質粒或病毒。
編碼調節CRH信號化的蛋白質的根據本發明的分離和純化的核酸分子可被克隆到表達載體中以在重組宿主細胞中表達。重組宿主細胞可以是原核或真核的，包括但不限於細菌如大腸桿菌、真菌細胞如酵母、兩棲動物細胞如爪蟾卵母細胞、哺乳動物細胞包括但不限於人、牛、豬、猴和嚙齒類來源的細胞系，和昆蟲細胞包括但不限於果蠅-和蠶-來源的細胞系。適宜的並且可通過商業途徑得到的來自哺乳動物種類的細胞系包括但不限於CV-1(ATCC CCL 70)、COS-1(ATCC CRL1650)、COS-7(ATCC CRL 1651)、CHO-K1(ATCC CCL 61)、3T3(ATCCCCL 92)、NIH/3T3(ATCC CRL 1658)、HeLa(ATCC CCL 2)、C127I(ATCCCRL 1616)、BS-C-1(ATCC CCL 26)、MRC-5(ATCC CCL 171)、L-細胞、成神經細胞瘤、神經膠質細胞和HEK-293(ATCC CRL1573)。
因此，在另一實施方案中，本發明涉及重組宿主細胞，其含有編碼調節CRH信號化的蛋白的重組克隆的核酸分子或其功能類似物。在另一方面，根據本發明的重組宿主細胞含有核酸分子，其或者是基因組DNA或者具有選自(SEQ ID No.45)、(SEQ ID No.47)、(SEQ ID No.49)、和其功能類似物的核苷酸序列。
通過包括但不限於轉化、轉染、原生質體融合、脂轉染、和電穿孔的許多技術之一可以將表達載體導入宿主細胞中。含有表達載體的細胞被克隆增殖和分析以確定它們是否產生介導CRH信號化的蛋白質。表達通透酶的宿主細胞克隆的鑑定可通過幾種方法進行，這些方法包括但不限於與針對根據本發明的多肽的抗體的免疫反應性，和宿主細胞相關的哺乳動物嘌呤通透酶活性的存在。
從而，本發明還涉及在重組細胞中表達調節CRH信號化的蛋白質的方法，該方法包括在允許調節來自如此處概述的表達載體的調節CRH信號化的蛋白質表達的條件下培養根據本發明的宿主細胞。本發明的蛋白質可以通過直接表達合成或者作為融合蛋白合成，該融合蛋白含有作為與另一種蛋白質或肽翻譯融合的目標蛋白，該另一種蛋白質或肽可自身地、通過酶或化學切割除去。因此，在具體實施方案中，本發明提供了根據本發明的蛋白，其中所述多肽是融合蛋白的部分。
在重組系統的某些肽的產生中經常觀察到作為融合蛋白的表達延長了壽命，增加了所希望的肽的產率，或者提供了純化該蛋白質的方便的方法。當在原核宿主中表達哺乳動物蛋白時這尤其相關。公知各種肽酶(例如，腸激酶和凝血酶)，它們在特定位點切割多肽或者，從肽鏈的氨基或羧基末端(例如二氨基肽酶)消化肽。此外，特定化學藥品(例如溴化氰)將在特定位點切割多肽。技術人員將明白如何對胺基酸序列進行必要的修飾(和如果使用重組方法，合成的或半合成的編碼序列)以摻入位點-特異的內部切割位點。見例如，P.Carter，「融合蛋白的位點特異的蛋白酶解」，第13章，Protein PurificationFromMolecular Mechanisms to Large Scale Processes，AmericanChemical Society，Washington，D.C.(1990)。
此外，可以使用例如，已經在其基因組中含有如上面描述的編碼調節CRH信號化的蛋白質的核酸分子，但是由於例如，弱啟動子而不表達該核酸分子或者不以適宜的方式表達該核酸分子的哺乳動物細胞，並向該哺乳動物細胞導入與編碼所述嘌呤通透酶多肽的內源核酸分子緊鄰的調節序列如強啟動子，以便誘導該核酸分子的表達。
同樣，含有編碼處於異源轉錄和/或調節序列或蛋白質控制下的調節CRH信號化的蛋白質的多核苷酸的重組宿主細胞將是本發明的另一實施方案。
在該上下文中，術語「調節序列」指可用於增加嘌呤通透酶多肽的表達的核酸分子，這是由於該核酸分子整合到細胞的基因組中並且與CRH調節蛋白-編碼基因緊鄰。這些調節序列包括啟動子、增強子、失活的沉默子內含子序列、3』UTR和/或5』UTR編碼區、蛋白質和/或RNA穩定元件、編碼調節蛋白的核酸分子，例如，轉錄因子，這些調節序列能夠誘導或引發CRH調節蛋白質-編碼基因的表達，或者公知活化基因表達和/或增加基因產物的量的其他基因表達控制元件。所述調節序列的導入導致多肽的表達的增加和/或誘導，該多肽調節CRH信號化，最後導致細胞中所述多肽的量增加。從而，本發明的目的是提供調節CRH信號化的多肽的從頭和/或增加的表達。
通過磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、陽離子脂質-介導的轉染、電穿孔、轉導、感染或其他方法可以實現構建體向宿主細胞的導入。這些方法在許多標準實驗室手冊，如Davis，Basic Methods InMolecular Biology(1986)中描述。特別考慮調節CRH信號化的多肽可以實際上被缺乏重組載體的宿主細胞表達。
此外，使用體外產生的合成mRNA也可以實施根據本發明的多核苷酸的表達。合成的mRNA或者從能夠調節CRH信號化的細胞分離的mRNA可被有效地在各種無細胞系統中翻譯，這些無細胞系統包括但不限於麥芽提取物和網織紅細胞提取物，以及在基於細胞的系統中有效翻譯，其包括但不限於微注射到蛙卵母細胞，一般優選微注射到蛙卵母細胞。
轉基因非-人動物本發明還涉及產生轉基因非人動物，優選轉基因小鼠的方法，該方法包括將本發明的多核苷酸或載體導入生殖細胞、胚胎細胞、幹細胞或卵或者從它們得到的細胞。非-人動物可以按照此處描述的本發明的篩選方法使用並且可以是非-轉基因健康動物，或者可以有磷酸攝入或再吸收失調，優選由調節CRH信號化的蛋白質中至少一個突變導致的失調。這些轉基因動物很適於，例如，與上述多肽的突變形式有關的藥物的藥理學研究。可以，例如，如A.L.Joyner編者，GeneTargeting，A Practical Approach(1993)，Oxford UniversityPress描述的實施轉基因胚胎的產生和這些胚胎的篩選。使用例如，DNA印跡，用適宜的探針可以分析胚胎的胚胎膜的DNA；見如前。
優選地，本發明的轉基因非-人動物還含有相應哺乳動物CRH調節蛋白-編碼基因的至少一個失活的野生型等位基因；見如前。該實施方案允許例如，研究根據本發明的多肽的各種突變形式的相互作用對CRH代謝中疾病相關的失調的臨床症狀的發作的影響。此前關於轉基因動物討論的所有應用也應用於攜帶兩個、三個或更多轉基因；例如編碼中性內肽酶(NEP)的動物。還希望使調節CRH信號化表達或者處於該轉基因動物的發育和/或生命的一定階段的功能失活。這可以通過使用，例如，組織特異的、發育和/或細胞調節的和/或可誘導的啟動子，該啟動子驅動例如，針對編碼能夠調節CRH信號化的蛋白的RNA轉錄物的反義或核酶的表達，來實現；也見上文。適宜的可誘導的系統為例如四環素-調節的基因表達，如例如，Gossen和Bujard(Proc.Natl.Acad.Sci.89USA(1992)，5547-5551)和Gossen等人(TrendsBiotech.12(1994)，58-62)所描述的。類似地，通過這些調節元件可以控制調節CRH信號化的突變蛋白的表達。
此外，本發明還涉及含有(優選穩定整合到其基因組)根據本發明的核酸或者其部分的轉基因哺乳動物細胞，其中該核酸分子或者其部分的轉錄和/或表達導致調節CRH信號化的蛋白質的合成的減少。
在優選的實施方案中，通過反義、有義、核酶、共抑制和/或顯性突變體效應實現減少。「反義」和「反義核苷酸」指阻斷天然發生的基因產物的表達的DNA或RNA構建體。
根據本發明的多核苷酸的提供打開了產生具有如上述的蛋白質的降低的水平並，從而，具有磷酸代謝缺陷的轉基因非-人動物的可能性。怎樣實現該可能性的技術是本領域中技術人員熟知的。這些技術包括，例如，反義-RNA、核酶或者組合反義和核酶功能的分子和/或提供共抑制效果的分子的表達；也見上文。當使用反義方法減少調節細胞中CRH信號化的蛋白質的量時，編碼反義-RNA的核酸分子對於用於轉化的動物種類優選為同源來源。然而，還可能使用表現出與編碼調節CRH信號化的蛋白質的內源發生的核酸分子具有高度同源性的核酸分子。在這種情況中，同源性優選高於80％，特別優選高於90％，更優選高於95％。轉基因哺乳動物細胞中根據本發明的蛋白質的合成的減少可導致例如腺嘌呤再吸收的改變。在含有這些細胞的轉基因動物中，這可導致各種生理的、發育的和/或形態的改變。
從而，本發明還涉及含有上述轉基因細胞的轉基因非-人動物。這些動物可以表現出，例如，與野生型動物相比CRH代謝的不足，這是由於外來DNA的穩定或瞬時存在導致至少一種下面的特徵(a)編碼能夠調節CRH信號化的內源基因的破壞；(b)針對含有本發明的多核苷酸的轉錄物的至少一種反義RNA和/或核酶的表達；(c)本發明的多核苷酸的有義和/或不翻譯的mRNA的表達；(d)本發明的抗體的表達；(e)本發明的調節序列的功能或非功能拷貝的摻入；或(f)本發明的重組DNA分子或載體的摻入。
使用本發明的多肽、它們的編碼多核苷酸和載體，現在可能研究體內和體外關於調節患者的CRH信號化的蛋白質中特定突變的藥物的效率和受到影響的表型。此外，本發明的多肽的突變形式可用於確定藥物的藥理學圖譜和鑑定和製備其他藥物，這些藥物可有效治療與CRH代謝有關的失調，尤其改善CRH誘導的緊張或抑鬱症。
從而將明白本發明還涉及預防、治療或改善與包括CRH受體相關的失調的CRH代謝失調有關的醫學病症的方法，該方法包括對哺乳動物受試者使用治療有效量的本發明的多肽、編碼能夠調節CRH信號化的蛋白質的多核苷酸或者載體。
診斷試驗本發明還涉及本發明的多核苷酸作為診斷試劑的用途。通過以與功能異常相關的SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.7、SEQ ID No.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO 13、SEQ ID No.15、SEQ ID No 17、SEQ ID No 19、SEQ ID No.21、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQ ID No.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID No.33、SEQ ID No.35、SEQ ID No.37、SEQ ID No.39、SEQ ID No.41、SEQ ID No.43、SEQ ID No.45、SEQ ID No.47或SEQ ID No.49的多核苷酸為特徵的基因的突變形式的檢測將提供一種診斷工具，其可輔助，或者限定疾病或者對疾病的易感性的診斷，該疾病，或者對疾病的易感性來自該基因的表達不足、過表達或者改變的空間或時間上的表達。通過各種技術可以在DNA水平上檢測攜帶該基因突變的個體。
從而將明白本發明提供了診斷與CRH活性失調相關的受試者中的病理狀況或者對病理狀況的易感性的方法，該方法包括(a)確定根據本發明的多核苷酸中突變的存在或不存在；和(b)基於所述突變的存在或不存在檢測病理狀況或者對病理狀況的易感性。
用於診斷的核酸可從受試者的細胞，如從血液、尿、唾液、組織活檢或屍檢材料得到。基因組DNA可直接用於檢測或者在分析前使用PCR或者其他擴增技術酶促擴增。RNA或者cDNA也可以以類似方式使用。通過與正常表型相比擴增產物的大小的改變檢測缺失或插入。將擴增的DNA與哺乳動物嘌呤通透酶核苷酸序列雜交可以鑑定點突變。通過RNA酶消化或者通過熔解溫度的差異可以將完美匹配的序列與錯配的雙鏈體區別。通過改變毛細管電泳柱或者凝膠中的DNA片段的電泳遷移率，使用或不使用變性劑，或者通過直接DNA測序(例如，Myers等人，Science(1985)2301242)也可以檢測DNA序列差異。通過特定限制性內切酶、核酸酶保護測定法，如RNase和S1保護或者化學切割方法也可以揭示特定位置的序列變化(見Cotton等人，ProcNatlAcad Sci USA(1985)854397-4401)。在另一實施方案中，可以構建含有編碼能夠調節CRH活性的蛋白的核酸序列或者其片段的寡核苷酸探針陣列以實施例如基因突變的有效篩選。陣列技術是熟知的並且具有普遍適用性並且可用於處理分子遺傳學中的各種問題包括基因表達、遺傳連鎖，和基因變異性(見例如M.Chee等人，Science，卷274，610-613頁(1996))。
該診斷試驗提供了通過用所描述的方法檢測CRH調節蛋白-編碼基因中的突變，診斷或確定對疾病的易感性的方法。此外，通過包括從來自受試者的樣品確定多肽或者mRNA的異常減少或增加的水平，以及通過從所述樣品確定與正常結構(見上面)相比蛋白質衍生物的存在的方法診斷這些疾病。可以使用用於多核苷酸定量的本領域中熟知的方法的任一種在RNA水平上測量減少或增加的表達，該方法為如，例如，核酸擴增，例如，通過PCR、RT-PCR；RNA酶保護；RNA印跡和其他雜交方法。可用於確定來自宿主的樣品中蛋白質，如本發明的多肽的水平的測定技術是本領域中熟知的。這些測定方法包括放射免疫測定法、競爭-結合測定法、蛋白質印跡分析和ELISA測定法。可用於確定蛋白質衍生物或變體的存在的測定技術包括質譜法。
從而，另一方面，本發明提供了診斷與長期CRH暴露的失調有關的受試者中病理學狀況或者對病理學狀況的易感性的方法，該方法包括(a)確定生物樣品中根據本發明的多肽或者其衍生物的存在或者表達量；和(b)基於該多肽或者其衍生物的存在或者表達量診斷病理學狀況或者對病理學狀況的易感性。
具體地，本發明提供了診斷個體中CRH誘導的基因表達的方法，所選方法包括a)得到所述個體的生物樣品；和b)確定所述生物樣品中調節促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)信號化的至少一種蛋白質的量；其中調節促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)信號化的蛋白選自SEQ ID NO.2、SEQ ID 4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48。在備選實施方案中，診斷CRH誘導的表達譜的方法不限於根據本發明的至少一種蛋白，但是需要同時評估鑑定為與CRH信號化有關的蛋白質組，即具有胺基酸序列SEQ ID NO.2、SEQ ID 4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48的蛋白質的表達水平。
優選地，在蛋白質水平上，優選使用結合該蛋白質的抗體，或者在基因轉錄水平上，優選使用結合編碼選自SEQ ID NO.2、SEQ ID 4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48的胺基酸序列的多核苷酸的探針確定所述蛋白質的量。在與CRH信號化有關的蛋白質組的同時評估中，使用微陣列技術分析基因表達的水平。
備選地，通過評估含有選自SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO 13、SEQ ID No.15、SEQ ID No 17、SEQ ID No 19、SEQ ID No.21、SEQID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQ ID No.29、SEQID NO.31、SEQ ID No.33、SEQ ID No.35、SEQ ID No.37、SEQID No.39、SEQ ID No.41、SEQ ID No.43、SEQ ID No.45、SEQ IDNo.47或SEQ ID No.49的核酸序列的基因的基因轉錄水平確定CRH誘導的基因表達譜。確定基因轉錄水平的方法已經在上文中描述並且包括在優選的實施方案中使用結合、優選選擇性結合選自SEQ IDNo.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO 13、SEQ ID No.15、SEQ ID No 17、SEQID No 19、SEQ ID No.21、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID No.33、SEQ IDNo.35、SEQ ID No.37、SEQ ID No.39、SEQ ID No.41、SEQ IDNo.43、SEQ ID No.45、SEQ ID No.47或SEQ ID No.49的多核苷酸或者其互補序列的探針。在另一實施方案中，可以構建含有根據本發明的核苷酸序列或者其片段的寡核苷酸探針陣列以實施個體樣品中基因轉錄水平的有效篩選。
在另一方面，本發明涉及診斷試劑盒，其含有(a)本發明的多核苷酸，優選SEQ ID No.45、SEQ ID No.47、SEQ ID No.49的核苷酸序列或者其片段；(b)與(a)的核苷酸序列互補的核苷酸序列；(c)本發明的多肽，優選SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.48的多肽或者其片段；或(d)本發明的多肽的抗體，優選SEQ ID NO.46或SEQ ID NO.48的多肽和任選適宜的檢測方法。
將明白在任何這種試劑盒中，(a)、(b)、(c)或(d)可以含有實質性組分。這種試劑盒將用於診斷疾病或對疾病的易感性，尤其CRH代謝相關的失調如CRH誘導的緊張或抑鬱症。
本發明的核苷酸序列對於染色體定位也是有價值的。這些序列特異靶定，並可以與個人染色體上的特定位置雜交。與根據本發明的染色體相關的序列的作圖是將這些序列與基因-相關的疾病相互關聯的重要的第一步。一旦序列被映射到精確的染色體位置，那麼染色體上該序列的物理位置可以與遺傳圖數據相關聯。這些數據在例如，V.McKusick，Mendelian Inheritance in Man(可通過Johns HopkinsUniversity Welch Medical Library在線獲得)中發現。然後通過連鎖分析(物理上相鄰的基因的共遺傳)鑑定已經被映射到相同的染色體區域的基因和疾病之間的關係。本發明的基因映射到人15號染色體。
也可以確定受影響和未受影響的個體之間cDNA或基因組序列中的差異。如果在一些或者所有受影響的個體中但是沒有在任一正常個體中觀察到突變，那麼該突變可能是該疾病的病因。
本發明的核苷酸序列對於組織定位也是有價值的。這些技術允許通過檢測編碼根據本發明的多肽的mRNA來確定這些多肽的表達模式。這些技術包括原位雜交技術和核苷酸擴增技術，例如，PCR。這些技術是本領域中熟知的。來自這些研究的結果指出生物中這些多肽的正常功能。
本發明的多肽或者它們的片段或它們的類似物，或者表達它們的細胞，也可用作免疫原以產生對本發明的多肽免疫特異的抗體。術語「免疫特異的」指抗體具有對本發明的多肽比它們對現有技術中其他相關多肽大得多的親和性。
從而在另一實施方案中，本發明提供了與哺乳動物嘌呤通透酶具有免疫反應性的單特異抗體。在優選的實施方案中，所述抗體與具有選自(SEQ ID NO.46)、(SEQ ID NO.48)的胺基酸序列的多肽和其功能類似物具有免疫反應性或者所述抗體阻斷調節CRH信號化的蛋白質的活性。
針對本發明的多肽的抗體可以通過使用常規方案，將該多肽或者含有表位的片段、類似物或者表達這些的細胞施用於動物，優選非人哺乳動物得到。對於單克隆抗體的製備，可以使用通過連續細胞系培養產生的抗體。實例包括雜交瘤技術(Kohler，G.和Milstein，C.，Nature(1975)256495-497)、trioma技術、人B-細胞雜交瘤技術(Kozbor等人，Immunology Today(1983)472)和EBV-雜交瘤技術(Cole等人，MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY，77-96頁，Alan R.Liss，Inc.，1985)。
產生單鏈抗體，如美國專利號4,946,778中所描述的那些單鏈抗體的技術也可適用於產生針對本發明多肽的單鏈抗體。而且，轉基因小鼠，或者其他生物，包括其他哺乳動物，也可以用於表達人源化抗體。
上述抗體可用於分離或鑑定表達該多肽的克隆或者通過親和層析純化這些多肽。
針對本發明多肽的抗體也可用於治療CRH代謝相關的失調。
另一方面，本發明涉及基因工程化的可溶的融合蛋白，其包括本發明的多肽，或者其片段，和各種亞類(IgG、IgM、IgD、IgE)的免疫球蛋白的重鏈或輕鏈恆定區的各種部分。優選作為免疫球蛋白的是人IgG，特別是IgGI的重鏈的恆定部分，其中在鉸鏈區發生融合。在具體實施方案中，通過切割序列的摻入可以簡單地除去Fc部分，該切割序列可以用例如血液凝固因子Xa切割。此外，本發明涉及通過基因工程製備這些融合蛋白的方法，還涉及它們用於藥物篩選、診斷和治療的用途。本發明的另一方面還涉及編碼這些融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技術的實例可以在國際專利申請號WO 94/29458和WO 94/22914中發現。
治療效用本發明的另一方面涉及免疫/疫苗製劑(組合物)，其當導入哺乳動物宿主時，在該哺乳動物中誘導針對本發明的多肽的免疫應答，其中該組合物含有本發明的多肽或者多核苷酸。疫苗製劑可以還含有適宜的載體。因為多肽可以在胃中分解，所以其優選腸胃外(例如，皮下、肌內、靜脈內，或者皮內注射)施用。適於腸胃外施用的製劑包括水性和非水性無菌注射液，其可以含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑和使得製劑與接受者的血液等滲的溶質；和水性和非水性無菌懸浮液，其可以包括懸浮劑或增稠劑。該製劑可以在單劑量或者多劑量容器，例如，密閉的安瓿和小瓶中提供並且可以保存在冰凍乾燥的條件中，僅需要在使用前加入無菌液體載體。該疫苗製劑還可包括用於增強制劑的免疫原性的佐劑系統，如水包油系統和本領域中公知的其他系統。劑量將依賴於疫苗的特異活性並且可通過常規實驗方法容易地確定。
在再一個方法中，可以使用表達阻斷技術抑制編碼調節CRH信號化的蛋白質的基因的表達。公知的這些技術包括使用反義序列，其或者是內部產生的或者是外部施用的(見，例如，O′Connor，J.Neurochem(1991)56560；寡脫氧核糖核苷酸作為基因表達的反義抑制劑，CRC Press，Boca Raton，FL(1988))。備選地，可以提供與基因形成三螺旋(「三鏈體」)的寡核苷酸(見，例如，Lee等人，Nucleic Acids Res(1979)63073；Cooney等人，Science(1988)241456；Dervan等人，Science(1991)2511360)。這些寡聚體本身可被施用或者可以體內表達相關的寡聚體。合成的反義或三鏈體寡核苷酸可含有修飾的鹼基或者修飾的主鏈。修飾的主鏈的實例包括甲基磷酸酯、硫代磷酸酯和肽核酸主鏈。這些主鏈被摻入反義和三鏈體寡核苷酸中以提供保護防止核酸酶降解並且是本領域中熟知的。用這些和/或其他修飾的主鏈合成的反義和三鏈體分子也形成本發明的部分。
在用於抑制細胞中靶基因表達的另一方法中，具有部分和完全雙鏈特徵的RNA被導入細胞或者胞外環境。抑制是特異的，因為選擇來自靶基因的一部分的核苷酸序列產生抑制性RNA。該RNA可含有聚合的核糖核苷酸的一條或多條鏈；其可以包括對磷酸酯-糖主鏈或者核苷的修飾。通過單條自身-互補RNA鏈或者兩條互補鏈可以形成雙鏈結構。抑制是序列-特異的，因為相應於RNA的雙鏈體區的核苷酸序列被靶定用於基因抑制。優選含有與靶序列的一部分相同的核苷酸序列的RNA。可以在國際專利申請WO 99/32619中發現RNA抑制技術的實例。
此外，調節CRH信號化的蛋白質的表達可以通過使用對編碼所述蛋白質的mRNA序列特異的核酶來防止。核酶是具有催化活性的RNA，其可以是天然的或合成的(見例如Usman，N，等人，Curr.Opin.Struct.Biol(1996)6(4)，527-33)。可以設計合成的核酶以在所選的位置特異切割前述mRNA，從而防止所述mRNA翻譯成功能多肽。可以合成具有天然核糖磷酸酯主鏈和天然鹼基的核酶，如通常在RNA分子中發現的。備選地，可以合成具有非天然主鏈的核酶，例如，2』-0-甲基RNA以提供對核糖核酸酶降解的保護，並且可以含有修飾的鹼基。
對於治療與調節CRH信號化的蛋白質的表達不足有關的異常病症，也可以利用幾種方法。一種方法包括對受試者施用治療有效量的激活本發明的多肽的化合物，例如，如上述的激動劑，與藥學上可接受的載體相組合，從而減輕異常病症。備選地，可以使用基因治療來影響受試者的相關細胞內源產生哺乳動物嘌呤通透酶。例如，可以將本發明的多核苷酸工程化以在複製-缺陷的逆轉錄病毒載體中表達，如上面討論的。然後逆轉錄病毒表達構建體可被分離並導入用含有編碼本發明的多肽的RNA的逆轉錄病毒質粒載體轉導的包裝細胞中，從而該包裝細胞產生含有目標基因的感染性病毒微粒。這些生產者細胞可被施用於受試者以體內工程化細胞並體內表達多肽。對於基因治療的綜述，見Human Molecular Genetics，TStrachan和A P Read，BIOSScientific Publishers Ltd(1996)中第20章基因治療核其他基於分子遺傳學的治療方法(和其中引用的參考文獻)。另一種方法是施用本發明的多肽的治療量與適宜的藥物載體相組合。
另一方面，本發明提供了含有治療有效量的多肽，如本發明多肽的可溶形式，激動劑/拮抗劑肽或者小分子化合物，與藥學上可接受的載體或賦形劑相組合的藥物組合物。這些載體包括，但不限於，鹽水、緩衝鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇和它們的組合。本發明還涉及藥物包裝和試劑盒，它們含有裝有一種或多種本發明的前述組合物的成分的一個或多個容器。本發明的多肽和其他化合物可以單獨使用或者與其他化合物，如治療性化合物聯合使用。
該組合物將被適應於施用途徑，例如，通過全身的或者口服途徑。全身性施用的優選形式包括注射，通常通過靜脈內注射。可以使用其他注射途徑，如皮下、肌內或者腹膜內注射。全身性使用的備選方法包括使用滲透劑如膽汁鹽或者梭鏈孢酸或者其他去汙劑透黏膜和透皮施用。此外，如果本發明的多肽和其他化合物可以製備成腸或者膠囊化製劑，那麼經口施用也是可能的。這些化合物的施用也可以是局部和/或局部化的，為貼劑、藥膏、糊劑、凝膠劑等的形式。
所需要的劑量範圍依賴於本發明的多肽和其他化合物的選擇、施用途徑、製劑的性質、受試者病症的性質，和主治醫生的判斷。然而，適宜的劑量為0.1-100μg/kg受試者。然而，考慮到可利用的化合物的多樣性和各種施用途徑的不同效率，可以預期所需劑量的寬的變化。例如，口服施用預期比通過靜脈內注射施用需要更高的劑量。使用用於優化的標準經驗常規可以判斷這些劑量水平的變化，如本領域中所熟知的。
也可以在受試者內內源地產生用於治療的多肽，這在治療模式中通常被稱為如上述的「基因治療」。從而，例如，來自個體的細胞可被多核苷酸，如DNA或RNA工程化以體外編碼多肽，以及例如，通過使用逆轉錄病毒治療載體。然後將細胞導入受試者中。
通過參考下面的實驗細節可以更好地理解本發明，但是本領域中技術人員將容易明白這些實驗細節僅用於闡明本發明，其在後面的權利要求書中更完全地描述。此外，在該申請書的全文中，應用了各種出版物。這些出版物的公開在此處被併入本申請的參考文獻中以更完整地描述本發明所屬的本領域的狀態。
實驗程序細胞培養和樣品製備-AtT-20細胞購於ATCC並被保持在37℃，5％CO2溼潤空氣，含有10％胎牛血清、5％馬血清和4.5g/L D-葡萄糖的Dulbecco氏改良的Eagle培養基(Invitrogen Life Technologies)中。為了實驗，將細胞接種於25cm2燒瓶中。培養基在48h後被替換並將細胞用新鮮培養基中的0.1％DMSO、DMSO中的1μM CRH(Sigma)、DMSO中的1μM R121919或者DMSO中的1μM CRH+1μM R121919處理0、0.5、1、2、4、8和24小時。通過抽出孵育培養基並加入用於細胞裂解的3ml Trizol(Invitrogen Life Technologies)中止孵育。根據生產商的使用說明書用Trizol提取總RNA。使用Rneasy試劑盒(Qiagen)進一步純化100μg總RNA，用DNAseI處理柱子。
微陣列雜交-如下製備cRNA。使用T7-oligo(dT)24-引物和SuperscriptII RT(Invitrogen Life Technologies)對10μg總RNA在42℃實施逆轉錄1h。用大腸桿菌DNA聚合酶I、DNA連接酶和RNAseH(Invitrogen Life Technologies)在16℃進行2h的第二條鏈cDNA合成。用相-鎖定凝膠(Eppendorf)進行苯酚-氯仿萃取後，使用Bioarray高產率RNA轉錄物標記試劑盒與生物素標記的核糖核苷酸(Enzo Diagnostics)在37℃實施體外轉錄6h。cRNA樣品在QiagenRneasy柱上純化並在95℃片段化35分鐘。cRNA產率為50到100μg。在GeneChips(Affymetrix，Santa Clara，CA)上處理樣品。為了檢查每個樣品的質量，將5μg標記的cRNA在Test2-陣列上運行。實際的實驗在Murine Genome U74Av2陣列上實施，該陣列含有檢查約12,000個全長小鼠基因和來自UniGene database(Build 74)的EST簇的探針組。在持續旋轉下用15μgcRNA於45℃實施雜交16h。將陣列在Affymetrix Fluidics工作檯(Station)中用鏈黴抗生物素蛋白/藻紅蛋白(SAPE)染色，然後用抗-鏈黴抗生物素蛋白的抗體染色並進行第二次SAPE染色。隨後，用HP-雷射掃描器掃描陣列並用Microarray Suite Software(Affymetrix)分析數據。在該階段不進行分級或者標準化。基於所有樣品間當前調用(present calls)百分數(平均值為47.06±2.45％)評估實驗的質量。胞質β-肌動蛋白和GAPDH5』/3』的比分別為1.10±0.08和0.93±0.05。
數據分析和基因選擇使用下面的全局平均算法將每個陣列上的原始強度校準
基本上該校準將一個陣列的平均強度設定為對所有陣列間測量的平均值，彌補了雜交、洗滌和染色中陣列與陣列的差異，最終允許陣列之間合理的比較。校準後，使用加權光譜作圖分析所校準的數據。加權光譜作圖是一種無監督的多變量分析方法，其包括數據的雙中心化與代表兩種最高的主要組分的專門的可視化相組合。儘管雙中心化除去了陣列數據的「大小」成分，但是通過代表各自樣品和基因大小的符號的面積，該信息在可視化中被再次導入。該方法允許減小大的微陣列數據集和提供可視地檢查從而鑑定數據中的基因簇和/或受試者。用OmniViz程序實施了更詳細的分析。除去所有實驗中缺乏的所有記錄並將小於20的所有信號設為20。計算每個時間點上CRH、R121919和CRH+R121919處理的基因表達倍數差異。對於那些計算，DMSO處理的樣品中相應時間點的信號被用於計算比值。
定量RT-PCR-使用實時PCR分析證實微陣列數據。使用隨機六聚物引物和SuperscriptII RT(Invitrogen Life Technologies)對0.5μg總RNA實施第一條鏈cDNA合成。用Taqman PCR試劑盒在ABIPrism 7700循環儀(Applied Biosystems)上實施定量PCR。cDNA的連續稀釋液被用於產生相對β-肌動蛋白、c-fos、Crh-R1、Crh-R2、Rgs2和目的基因(序列見表2)的濃度的對數的循環閾值的標準曲線。從標準曲線計算的線性回歸線容許確定來自不同時間點的RNA樣品的轉錄水平。
結果在表達CRH-R1的鼠AtT-20垂體促腎上腺皮質激素細胞-來源的腺瘤細胞系中研究了對CRH的轉錄應答。儘管通過實時定量RT-PCR(RTq)和蛋白質印跡都可以容易地檢測CRH-R1，但是在AtT-20細胞中不能看出CRH-R2表達。為了鑑定CRH-R1特異應答，細胞被暴露於1μMCRH、1μM CRH與1μM CRH-R1特異拮抗劑R121919和僅暴露於R121919。隨時間跟蹤轉錄應答直到第一次施用後24小時。為了評估處理效能，通過RTq對來自陣列實驗實施之前不同處理和時間點的RNA確定c-fos mRNA水平。與以前的報導一致，暴露於CRH引起c-fos轉錄瞬時猛增，0.5到1h後水平已經下降(見圖1)(8；9)。存在R121919時該應籤幾乎被完全抑制。有趣的是，0.1％DMSO誘導c-fos表達，然而與CRH誘導的表達相比，表達水平低5到10倍。
在含有約12000個小鼠基因和ESTs的微陣列上分析了所有時間點。使用光譜作圖(稱作無監督的方法)對表達譜的總體分析表明時間進度是造成所觀察到的基因表達中大多數變化的原因(圖2)。通過加入新培養基和血清所誘導的這些培養物中細胞周期的同步化可能是該現象的原因，儘管代謝物的積累和不斷進行的細胞培養也是另外的貢獻因素。光譜圖分析還表明CRH處理的樣品與其他樣品的不同之處主要在早期時間點(0.5h到2h)，表達中的總體差異在8h後變得非常小。因為時間的這種明顯影響，所以相對於在DMSO處理的對照樣品中相應時間點觀察的那些表達測量值分析了這些表達測量值。
受調節的基因被定義為在任一時間點表現出轉錄物水平的變化大於2倍的那些基因。使用OmniViz Treescape view，選擇了滿足該標準的111種基因，它們表現出與拮抗劑處理相比，CRH處理後表達的差異。這111種基因中的26種是「早應答者」，它們用CRH處理30分鐘後已經表現出2倍變化。32種基因是「中期應答者」，它們在處理1到2h後應答，53種基因是「晚應答者」，處理後2小時或更長時間後表現應答(見圖3)。這些應答被CRH-R1拮抗劑R121919抑制。在早應答者中是CRH-R1下遊途徑中公知的成員，如轉錄因子Nurr1、Nurr77、Jun-B，它們驗證了該測定。
所鑑定的有趣的新成員包括轉錄因子(例如，毛髮/分叉相關的增強子1(Hey1)、白介素3調節的核因子(NFIL3)、cAMP應答元件調節子(CREM)和前列腺特異的ets轉錄因子(Pse))；受體和通道調節物(例如，Ras-相關的GTP-結合蛋白(GEM)和受體(降鈣素)活性修飾蛋白3(RAMP3))；分泌肽(例如，腎上腺髓質素、降鈣素、縮膽囊素)和與胞內信號化有關的蛋白質(例如，G-蛋白信號化調節物2(Rgs2)、cAMP特異的磷酸二酯酶4B(Pde4b)、肌醇1，4，5-三磷酸受體1(IP3R1)和調節性亞基磷脂醯肌醇3-激酶，p85)。其他有趣的受調節基因包括Period同系物Per1、成纖維細胞生長因子受體2(Fgfr2)、血清/糖皮質激素調節的激酶和血清-可誘導的激酶(圖4)。
有趣的是，根據上面提到的標準鑑定的所有應答者暴露於CRH後都被上調。該誘導是瞬時的並且4到8h後幾乎所有被誘導的基因都回到基線。許多被誘導的轉錄物編碼對CRH-R1信號化產生負反饋的蛋白質(例如，Pde4、Rgs2、CREM，等)，可能是該誘導的瞬時性質的原因。除了該負反饋，其他機理如通過磷酸化和內化而去敏的CRF，可有助於轉錄誘導的瞬時性質。在這方面，有趣的是注意到用CRF刺激可以快速下調大鼠垂體細胞中CRF1mRNA水平。然而，我們沒有檢測到暴露於1μM CRF的垂體來源的AtT-20細胞中CRF1mRNA的變化。用定量實時PCR分析對用於雜交實驗和重複實驗的相同樣品實施微陣列數據證實。通過微陣列鑑定的調節水平和時間歷程相應於圖5中顯示的通過定量PCR觀察的對Rgs2的那些調節水平和時間歷程。對於已經被檢驗的那些基因，在圖4中顯示了與未處理樣品相比的誘導水平。
討論我們已經用CRH-R1特異拮抗劑鑑定了AtT-20細胞中CRH-R1下遊的轉錄途徑。我們的發現與用CRH刺激時一些第二信使如cAMP和Ca2+的活化一致。一些轉錄應答可通過CREB的磷酸化和cAMP應答元件下遊基因的隨後轉錄來解釋。在例如Per1、Nurr1、CREM-ICER、c-Fos的啟動子中已經發現了這些元件。此外，這些基因的誘導的動力學圖譜相應於cAMP形成0.5小時後通過CREB所觀察的最大轉錄率。CREM-ICER的誘導在衰減對cAMP的轉錄應答方面構成負反饋機制。有趣的是所報導的響應垂體腺的中葉急性壓力的CREM-ICER誘導。缺乏CREM-ICER的小鼠表現出β-內啡肽水平的慢性增加，表明CREM-ICER誘導可能參與響應壓力的基因表達的調節(10)。我們的結果表明CREM-ICER直接參與CRH信號化調節並且結果，CREM-ICER的除去可導致對壓力信號的應答改變。CRH信號化的另一種新的假定的負反饋調節物是Rgs2。我們鑑定了人RGS2基因啟動子中的兩個單一的CRE基序，可能解釋用CRH刺激時該基因的早應答行為。支持我們的發現的是一份最近報導，其指出磷酸肌醇信號化和cAMP都可誘導人星形細胞瘤和成神經細胞瘤細胞中Rgs2mRNA的快速和瞬時增加。Rgs2蛋白是Gqα功能的選擇性抑制劑。
最近已經表明Rgs2降低增味劑-引起的cAMP產生，Rgs2不是作用於Gα而是直接抑制III型腺苷酸環化酶的活性。雖然Rgs2最初被鑑定為活化的T淋巴細胞中立即早應答基因，但是在Rgs2缺陷小鼠中的研究表明Rgs2在壓力相關的行為的調節中也起作用，因為這些小鼠表現出增加的焦慮和攻擊行為(11)。而且，cAMP特異磷酸二酯酶4B(Pde4b)的誘導也可根據負反饋分類，直接減弱cAMP信號。CRH刺激時產生的另一種重要的第二信使是Ca2+。已經表明CRH通過電壓控制的Ca2+通道引發穩態去極化刺激的胞外Ca2+進入並通過從肌醇1，4，5-三磷酸(InsP3)敏感Ca2+庫釋放而升高胞內Ca2+濃度(12)。InsP3受體和磷脂醯肌醇3-激酶的p85調節亞單位都被上調，這可能解釋長時間Ca2+信號化的補償機制。而且小G-蛋白kir/Gem的上調針對長時間Ca2+信號化的衰減。最近的研究已經表明Gem通過這些輔助性亞單位調節細胞膜上的Ca2+通道表達。已經表明Gem的上升的水平抑制Ca2+-引發的胞吐，並且已經提出Gem可能具有針對Ca2+負荷的保護作用。Ca2+除了作為第二信使，還表現出在調節基因表達中起關鍵作用。有趣的是鈣調磷酸酶/NFAT和CaM激酶信號化對NFIL3/E4BP4的調節，其可解釋CRH處理時NFIL3mRNA水平的增加。在B淋巴細胞中，白介素2通過Raf-有絲分裂原-活化的蛋白質激酶和磷脂醯肌醇3-激酶途徑誘導NFIL3的表達。在該細胞類型中，NFIL3與依賴Bc1-x1的途徑協同抑制凋亡。我們的數據表明NFIL3在防止AtT-20細胞凋亡中扮演角色。
CRH是最有效的ACTH促分泌素。不幸地是，所用的微陣列不詢問POMC水平。然而，CRH施用後發現一些其他前肽原mRNA被上調，這些前肽原為如縮膽囊素(CCK)和兩個降鈣素肽家族成員腎上腺髓質素(ADM)和降鈣素(CT)。在該方面還有趣的是RAMP3的上調。RAMPs控制降鈣素受體樣受體(CRLR)的轉運和糖基化。對於RAMP3，已經表明其與CRLR一起產生ADM受體。該基因的上調可能在CRH暴露或者其他細胞外(因為還不知RAMP3是否調節其他G-偶聯的受體)刺激後AtT-20細胞對ADM的應答性的調節中起作用。
儘管CCK由AtT-20細胞分泌，但是以前還沒有報導CRH誘導CCK表達(13)。然而，已經深入研究了CCK和CRH之間的相互作用並且在驚恐、抑鬱症、焦慮和胃排空中論證該相互作用(14-19)。大多數這些實驗指出CRH在介導CCK的中心作用中的角色。我們的數據表明CRH還可能作為CCK促分泌素髮揮作用。腎上腺髓質素也可能具有和CCK的非常類似的條件。已經闡明ADM在垂體腺中表達並且影響動物中基礎和CRH-刺激的ACTH釋放，從而表明其在調節下丘腦-垂體-腎上腺軸中的有力角色(20-23)。當前的表達數據表明CRH誘導ADM和CT。此外，最近的發現表明循環的腎上腺髓質素在庫興氏病中增加，並且垂體腺可能代表ADM的產生增加的位置(24)，表明CRH可能誘導ADM。
總之，我們解開了促腎上腺皮質激素-釋放激素受體1活化的基因網絡的一部分並且已經鑑定了該信號級聯的一些新的靶標。我們的發現引起了對進一步實驗的需求，這些實驗用於闡明細胞和完整生物水平上對CRH刺激的這些轉錄應答的功能。
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序列表SEQ ID NO.1atgcagctgagaaaaatgcagaccatcaaaaaggagcccgcacccctagatcctaccagcagctcagacaagatgctgctgctgaactctgccttagctgaggtggccgaggacctagcctcaggtgaagatttgctcctgaacgaagggagcatggggaaaaacaaatcctcggcgtgtcggagaaaacgggaattcattccggacgagaagaaagacgccatgtattgggagaaacggcggaaaaacaacgaagctgccaaaagatctcgggagaagcgccgcctcaatgacctggttttggagaacaagctgattgccctgggagaagaaaatgccactttaaaagctgagctgctctccctgaaattaaagtttggtttaattagctccacggcgtatgcccaagaaatccagaaactcagtaattccacagctgtctactttcaggactaccagacatccaaggctgccgtgagctcttttgtggacgagcatgagcctgcgatggtagccggaagttgcatctcagtcatcaagcactctccccagagctcgctctccgatgtgtcagaggtgtcctcggtggagcacactcaggaaagccccgcacagggaggctgccggagccctgagaacaagttccctgtgatcaagcaggagcccgtggagttggagagctttgccagggaggccagggaggagcggggcacgtattccacctccatctaccagagctacatgggaagctctttctccacttactcccactccccacccctcttgcaggtccatgggtccactagcaactccccaagaacctcagaggccgatgagggtgtagtgggcaagtcttctgatggggaagacgaacaacaggtccctaagggccccatccattctccagtggagctgcaacgggttcacgccacggtggtgaaggttccggaagtgaacccttctgccttaccgcacaagcttcggattaaagccaaggccatgcaggtcaaagtggaggctttggacagcgagtttgaaggcatgcagaaactctcttcacccgccgatgcgatcgccaaaagacattttgacctggagaaacatggaacctcgggtatggcccattcctccctccctcctttctcagtgcaggtgacgaacattcaagattggtccctcaaatcggaacactggcatcacaaagaactgagcagcaaaactcagagtagcttcaaaacaggtgtggtggaagtcaaagacggtggctataaggtttccgaagctgagaatttgtatttgaagcagggaatagcaaacttatctgcagaggtggtctcgctcaagagattcatagccacacaaccgatctcggcttcggactccaggtaaSEQ ID No.2MQLRKMQTIKKEPAPLDPTSSSDKMLLLNSALAEVAEDLASGEDLLLNEGSMGKNKSSACRRKREFIPDEKKDAMYWEKRRKNNEAAKRSREKRRLNDLVLENKLIALGEENATLKAELLSLKLKFGLISSTAYAQEIQKLSNSTAVYFQDYQTSKAAVSSFVDEHEPAMVAGSCISVIKHSPQSSLSDVSEVSSVEHTQESPAQGGCRSPENKFPVIKQEPVELESFAREAREERGTYSTSIYQSYMGSSFSTYSHSPPLLQVHGSTSNSPRTSEADEGVVGKSSDGEDEQQVPKGPIHSPVELQRVHATVVKVPEVNPSALPHKLRIKAKAMQVKVEALDSEFEGMQKLSSPADALAKRHFDLEKHGTSGMAHSSLPPFSVQVTNIQDWSLKSEHWHHKELSSKTQSSFKTGVVEVKDGGYKVSEAENLYLKQGIANLSAEVVSLKRFIATQPISASDSRSEQ ID No.3tgtccgctctgcctcccacacctagcaccccagcccgctgctgccccggtgagaacccccagcttgggccttgtcatggtgccagcaggtggccctgagcttctgacaggggcctgcctatagacctgcaggcctgaggcctcagactcacactcaaggggcaagaggccctggtggcccacctaagagccacctctgtccccagccctgctgccccactgatgtctgactgagacccagcagtgaccctgagctgcctgcccactgcctcctcctggtccctgaggttggctctgccgaggacggacgactcttctgaagcaggcggctaacggaagcagccccaagcctccaccgcagcatgggcagtgccagcccaggcctgagcaacgtgtcccccggttgcctgctactgttcccagatgtggcaccacgaacagggacggagaaggcagcatcaggagcaatgggccctgagaagcaggaatggagtcctagtccacccgccacccctgagcagggcctgtctgctttctacctctcttactttaacatgtatcccgacgatagcagctgggtcgccaaagtccccgaggcccgtgccggggaggaccacccggaggagcccgagcagtgtcccgtcattgacagccaggcctctgggagcacgttggatgagcactcgctagagcaggtgcaatcgatggttgtgggcgaggtcctgaaagatattgagacggcctgcaagcttctgaacatcacagcagaccctggggactggagccctggtaacgtgcagaagtggcttttatggacagaacaccagtaccggctgcctccagcaggcaaggccttccaggagctgggcggtaaggagctgtgcgccatgtccgaggaacagttccgtcagcgtgcacccttgggtggggatgtactgcatgcccacctggacatctggaagtcagcggcctggatgaaggagaggacctcgcctgggacccttcactactgcgcctccaccagcgaggagggctggacggatggtgaggtggactcgtcgtgctccgggcagcccattcacctgtggcagttcctgaaagaactgctgctcaagccccacagctatggccgcttcatccgctggctcaacaaggagaaaggcatcttcaaaattgaggactcagcacaggtggcccgactgtggggtgtgcgcaagaaccggccagccatgaactatgataaactaagccgctccatccgccagtattacaagaagggcatcattcgtaaacccgacatctctcagcgccttgtctaccaatttgtgcatccagtctgagagccacagagaccagaggcctacaacctgccccaggcagccactctctggttggcctggtcctctctgctcactctgaattcaggggctgctggtatcccagaacccaaggtcccagatagacagccactgatctagggatacacatgagctctctgggtcatacacaggccccaggaagatcgagggagctagttcagcacacagggactggaccaagtcagctcaccggacagtgatgtcactggtctctgctcctgccacaatcctgtaccatatctggcatggtgctaagagatgtctgtaccctgcgttgggaagccaggggtgccctggggatggataataaagacgtaagataactgSEQ ID No.4MGSASPGLSNVSPGCLLLFPDVAPRTGTEKAASGAMGPEKQEWSPSPPATPEQGLSAFYLSYFNMYPDDSSWVAKVPEARAGEDHPEEPEQCPVIDSQASGSTLDEHSLEQVQSMWGEVLKDIETACKLLNITADPGDWSPGNVQKWLLWTEHQYRLPPAGKAFQELGGKELCAMSEEQFRQRAPLGGD
VLHAHLDIWKSAAWMKERTSPGTLHYCASTSEEGWTDGEVDSSCSGQPIHLWQFLKELLLKPHSYGRFIRWLNKEKGIFKIEDSAQVARLWGVRKNRPAMNYDKLSRSIRQYYKKGIIRKPDISQRLVYQFVHPVSEQ ID No.5cgggtcgacccacgcgtccgcccacgcgtccggcggagcttctgggttgcgggccgaaacggcaagcggatggagggcgctcgaacggccaggtgtcgtgattaaattagtcagccctcagagacaggcgtcctacctcctttatccagacctcaaaagccccgttgtgcacccgtggtggcttcttcaccttccctgtttcgtcctccactgtatggcccagacatgagtggtcccctagaaggggccgatgggggaggagaccccaggcccggagaacctttttgtcctggaggagtcccatcccctggggccccgcagcaccggccttgtccaggccccagcctggctgatgacactgatgcaaacagcaatggctcaagtggcaatgagtccaacggacccgagtccaggggcgcatctcagcggagttctcatagttcctcttctggcaatggcaaggactcagctctgctggagaccactgagagcagcaagagtacaaactcacagagcccatccccacccagcagctccattgcctacagcctcctgagtgcgagctcagagcaggacaacccatctaccagtggctgcagcagtgaacagtcagctcgagccaggacccagaaagaactcatgactgcacttcgggagctcaaacttcgactgccaccagagcgtcggggcaagggccgctctgggaccttggccacactgcagtacgctctggcctgtgtcaagcaggttcaggctaaccaggaatattaccagcagtggagtctggaggagggtgagccttgtgccatggacatgtctacttacaccctggaggaattggagcatatcacatccgaatacacacttcgaaaccaggacaccttctctgtggctgtgtccttcctgacaggccggattgtctatatttcggagcaggcaggtgtcctgctgcgttgcaaacgggatgtgtttcggggtgcccgctttcagagctcctggctccccaggatgtgggtgtcttctatggctctactacaccatctcgactgcccacctggggcactggcacctctgcaggttcaggtctcaaggacttcacccaggaaaagtctgtcttctgccgaatcagaggaggtcctgaccgggatccagggcctcggtaccagccattccgcctaaccccatatgtgaccaagattcgggtctcagatggagcccctgcacagccgtgctgcctactcattgccgagcgcatccactctggttatgaagctccccggatccctcctgacaagaggatcttcaccacccgacacacaccaagctgcctcttccaggatgtagatgaaagggctgccccactgctgggttaccttccccaggatctcctgggggctccagtacttctctttctacatcctgaggaccgacccctcatgctggccattcataagaagatactgcagctggcaggccagccctttgaccattcccctattcgcttctgtgctcggaacggggaatatgtcaccatggacaccagctgggccggttttgtgcacccctggagccgcaaggtggctttcgtgttgggtcgccataaagtgcgcacggcacccctgaatgaggacgtcttcactcccccagcccccagcccagctccgtccctggactctgatatccaggagctctcagagcagatccatcgattgctgctgcagcctgtgcacagctccagccccacggggctctgtggagttggccctctgatgtcccctggtcctctacacagccctggctcctccagtgatagcaatgggggggacgctgaggggcctgggcctcctgctccagtgactttccagcagatctgtaaggatgtgcatctggtaaagcaccagggacaacagctcttcattgaatctcgggccaagcccccaccccggccccgcctccttgctacaggtacattcaaagccaaagtccttccctgccagtccccaaaccccgaactggaggtggccccagttcctgaccaagcctcgttagccttggcccctgaggagccagagaggaaagaaacctctggctgttcctaccagcagatcaactgcctggacagcatcctcaggtatttggagagctgcaacattcccagtacaaccaagcgtaaatgtgcctcctcctcctcctacactgcctcttcagcctctgatgatgacaagcagagggcaggtccagttcctgtgggggccaagaaagatccgtcgtcagcaatgctgtctggggagggggcaactcctcggaaggagccagtggtgggaggcaccctgagcccgctcgccctggccaataaggcagagagcgtggtgtccgtcaccagtcagtgtagcttcagctccaccatcgtccatgtgggagacaagaagcccccggagtcggacatcatcatgatggaagacctgcctggcctggcccctggcccagcccccagtccggcccccagccccacagtagcccctgacccaaccccagatgcttatcgcccagtgggtctgaccaaggccgtgctgtccctgcacacacagaaggaagagcaagccttcctcaaccgcttcagagatcttggcaggcttcgtggacttgacacctcttctgtggccccctcagcccctggctgccaccatggccccattccccctggtcgccgacaccactgccgatctaaagcaaagcgttcccgccaccaccaccaccagaccccccggcccgaaactccctgctatgtctcccatccttcacctgtgccctcttctggaccctggccacccccaccagccacgacccccttcccagcaatggtccagccctacccactcccagtattctcccctcgaggaggaccccagccccttccccctgcccctacatctgtgtcccctgctaccttcccttcccccttagtgaccccaatggtggccttggtgctccctaactatctattccctaccccacctagttatccatatggggtgtcccaggcccctgttgaggggccacccacgcctgcttcccactcgccctctccatccctgcccccaccacctctcagccccccccaccgcccagactccccactgttcaactcgagatgcagctccccactccagctcaatctgctgcagcttgaggagtccccccgcacggaggggggcgctgctgcaggaggcccaggaagcagtgctgggcccctgcctcccagtgaggagactgctgagccagaggccagattggtggaggttactgagtcgtccaatcaggatgcactttcaggctccagcgacctgctggagctactgctccaagaagactctcgctcgggcacaggctccgcagcctcaggctcctgggctctggcctgggctctgggtctggttcaggatcccacgaagggggaagcacctcagccagcatcacccgcagcagtcagagcagccatacaagcaagtactttggcagcatcgactcctccgaggctgaagctggggctgctcgggccaggactgagcctggggaccaggtcatcaagtgtgtgctccaggaccccatctggctgctcatggccaatgccgaccagcgtgtcatgatgacataccaggtgccgtccagggatcgcagcctctgtgctgaagcaagaccgggagaggctccgggccatgcagaaacagcagccacggttctcagaggaccagaggcgggaactgggcgctgtgcactcctgggtccggaagggccagctgcctcgggcccttgatgtgatggcgtgtgtggactgtggcagcagcgttcaagatcctggccactctgatcgacccgctcttctcagaactggatggattggggctggagcccatggaagagggtggaggcgagggtggtgggtgtggtgttggcggtggtgggggtgatggtggtgaggaggcccagacccaaattggggctaagggttcaagctctcaggactctgccatggaggaagaagagcaaggcgggggctcatccagcccagctttacctgcagaagaaaacagcaccagctagatccattttggggccgcttacagcagcctaatgagaggcttcctttcgaccatgttggggttcttataactcaagatacagctggaccaaccaataggaaactgccccagcttctcccaacatagggggctggacccccattaccagcccaggcacaggagctgcctctagcttcttagcagagtggaagttctcagccccatttggaggattgtccacgcccgtcccactgaggagacgggcgggccttcggttaaggttgctgacaagctgctgaagtggtctgtccaaatcccagctgagcctgagtcccagtcgcagggttggggctgcacttatttatttgggagagacagctcactctcccacctcaccccaagatgggaggaggggaacctgggatctgtgtaggatccaggtccgtgaacccctagccgctccagggtgggggaggttggtggaccatggagtccctggtgctgcccctcaggtgggacccaggtgttctcagctctaccctctaccaatgacatttgtgtttttgatattgtgcctgttattttttttttaacacaaaatgacaaaatgaaaaaccaaaaaSEQ ID No.6
MSGPLEGADGGGDPRPGEPFCPGGVPSPGAPQHRPCPGPSLADDTDANSNGSSGNESNGPESRGASQRSSHSSSSGNGKDSALLETTESSKSTNSQSPSPPSSSIAYSLLSASSEQDNPSTSGCSSEQSARARTQKELMTALRELKLRLPPERRGKGRSGTLATLQYALACVKQVQANQEYYQQWSLEEGEPCAMDMSTYTLEELEHITSEYTLRNQDTFSVAVSFLTGRIVYISEQAGVLLRCKRDVFRGARFSELLAPQDVGVFYGSTTPSRLPTWGTGTSAGSGLKDFTQEKSVFCRIRGGPDRDPGPRYQPFRLTPYVTKIRVSDGAPAQPCCLLIAERIHSGYEAPRIPPDKRIFTTRHTPSCLFQDVDERAAPLLGYLPQDLLGAPVLLFLHPEDRPLMLAIHKKILQLAGQPFDHSPIRFCARNGEYVTMDTSWAGFVHPWSRKVAFVLGRHKVRTAPLNEDVFTPPAPSPAPSLDSDIQELSEQIHRLLLQPVHSSSPTGLCGVGPLMSPGPLHSPGSSSDSNGGDAEGPGPPAPVTPQQICKDVHLVKHQGQQLFIESRAKPPPRPRLLATGTFKAKVLPCQSPNPELEVAPVPDQASLALAPEEPERKETSGCSYQQINCLDSILRYLESCNIPSTTKRKCASSSSYTASSASDDDKQRAGPVPVGAKKDPSSAMLSGEGATPRKEPVVGGTLSPLALANKAESVVSVTSQCSFSSTIVHVGDKKPPESDIIMMEDLPGLAPGPAPSPAPSPTVAPDPTPDAYRPVGLTKAVLSLHTQKEEQAFLNRFRDLGRLRGLDTSSVAPSAPGCHHGPIPPGRRHHCRSKAKRSRHHHHQTPRPETPCYVSHPSPVPSSGPWPPPPATTPFPAMVQPYPLPVFSPRGGPQPLPPAPTSVSPATFPSPLVTPMVALVLPNYLFPTPPSYPYGVSQAPVEGPPTPASHSPSPSLPPPPLSPPHRPDSPLFNSRCSSPLQLNLLQLEESPRTEGGAAAGGPGSSAGPLPPSEETAEPEARLVEVTESSNQDALSGSSDLLELLLQEDSRSGTGSAASGSLGSGLGSGSGSGSHEGGSTSASITRSSQSSHTSKYFGSIDSSEAEAGAARARTEPGDQVIKCVLQDPIWLLMANADQRVMMTYQVPSRDAASVLKQDRERLRAMQKQQPRFSEDQRRELGAVHSWVRKGQLPRALDVMACVDCGSSVQDPGHSDDPLFSELDGLGLEPMEEGGGEGGGCGVGGGGGDGGEEAQTQIGAKGSSSQDSAMEEEEQGGGSSSPALPAEENSTSSEQ ID No.7gaattcggcacgagcagcgagacgccgcgcacggtgcttccccagtggagccaatcggctaacccgcgctccggcagagtccttggcgctcgcccgccggcgggacagaccacccgcctctggccgctctctggaccctggccgccccgagcgaagactggagcaaaatgatgcttcaacatccaggccaggtctctgcctcagaagtcagtgcgaccgccattgtcccctgcctctcacctcctgggtcactggtatttgaggattttgctaacctgacaccctttgtcaaggaagagctgagattcgccatccagaataaacacctctgccatcggatgtcctctgcgctggagtcagttaccgtcaacaacagacccctggagatgtcagtcaccaagtctgaggcggcccctgaagaagatgagaggaaaaggaggcggcgagaaagaaataaaattgctgctgccaagtgtcgaaacaagaaaaaggagaagacagagtgcctgcagaaagagtcagagaaactggagagtgtgaatgctgagctgaaggcccagattgaggagctgaagaatgagaaacagcatttgatatacatgctcaacctgcaccggcccacctgtatcgtccgggctcagaatggacggacaccggaagacgagaggaacctctttatccaacagataaaagaaggaacattgcagagctaagcagaggtggcacggaggcaattggggagttcttactgaatcctccttttccaccccacaccctgaagccattggaaaactggcttcctgtgcacttctagaatcccagcagccaagagccgttggggcaggagggcctgtggtgacctactgcattgacccactctgcccccgagtgaaccgtggagcaggcaggagcatcctttgtctcaccaattccaggatttaggccttatcatcccggccagtctcagatgacctagctggccccaggctggggtcctatgcaaagcaggatcccactaatgggattcaggcagaagtgtctaccttgataggtggggtgggaccacatcctccactgtggctgacaacgcccttccaagggaatatggaatgagaacattcattattgaggttgtccaatggccagggtatgctttctagaaaaatatgctgttctgtcccagaatgactgtgcatagggtatccgtttcagagcctggtgttgtgctatttagatgtttgtcttgcacaacattggcatgatttttccgggagtttcatcagatctgatttctgagagtctggggatctgccatggtggaaagtgcccctcaaaagcatttgtgtggccacatgaactggctggcaccaggggagtgaaactggctgatgaccagctgagccactttgtgccaacagaggatggacgacacctttccctgtacccactgcagaggaagaaccctgggcacagcagctttgtccttggctacaaactgttacaacgtcacacaatgaaggcacaaagtccaactttcaaagggtgtaggactccatactcagtgacagggcaggaagagccaaagataaccacagccacagcctgtggagaccagggttggaagccaggtgcagggccaggcatctgcattgtgggatgttaatggcacttttgtcttgtagctattttgagatgtggtccagagcatttcagctgggagatctccctctggccaccaggactctggctactgttaaaatcctgatgtttctgtggaatcctcagtgtttaatcccactcaatagtatcattacagttttctgtaagagaaaatattacttatttatcccagtattcctagcctgtcaacataataaatatcggaacaaaacctggtaSEQ ID No.8MMLQHPGQVSASEVSATAIVPCLSPPGSLVFEDFANLTPFVKEELRFAIQNKHLCHRMSSALESVTVNNRPLEMSVTKSEAAPEEDERKRRRRERNKIAAAKCRNKKKEKTECLQKESEKLESVNAELKAQIEELKNEKQHLIYMLNLHRPTCIVRAQNGRTPEDERNLFIQQIKEGTLQSSEQ ID No.9cccagagataagctgacgctgggcaaacccctgggggaaggttgcttcgggcaagtagtcatggctgaagcagtgggaatcgataaagacaaacccaaggaggcggtcaccgtggcagtgaagatgttgaaagatgatgccacagagaaggacctgtctgatctggtatcagagatggagatgatgaagatgattgggaaacataagaacattatcaacctcctgggggcctgcacgcaggatggacctctctacgtcatagttgaatatgcatcgaaaggcaacctccgggaatacctccgagcccggaggccacctggcatggagtactcctatgacattaaccgtgtccccgaggagcagatgaccttcaaggacttggtgtcctgcacctaccagctggctagaggcatggagtacttggcttcccaaaaatgtatccatcgagatttggctgccagaaacgtgttggtaacagaaaacaatgtgatgaagatagcagactttggcctggccagggatatcaacaacatagactactataaaaagaccacaaatgggcgacttccagtcaagtggatggctcctgaagcc
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SEQ ID No.16MGCVQCKDKEAAKLTEERDGSLNQSSGYRYGTDPTPQHYPSFGVTSIPNYNNFHAAGGQGLTVFGGVNSSSHTGTLRTRGGTGVTLFVALYDYEARTEDDLSFHKGEKFQILNSSEGDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQAEEWYFGKLGRKDAERQLLSFGNPRGTFLIRESQTTKGAYSLSIRDWDDMKGDHVKHYKIRKLDNGGYYITTRAQFETLQQLVQHYSEKADGLCFNLTVVSSSCTPQTSGLAKDAWEVARDSLFLEKKLGQGCFAEVWLGTWNGNTKVAIKTLKPGTMSPESFLEEAQIMKKLKHDKLVQLYAVVSEEPIYIVTEYMSKGSLLDFLKDGEGRALKLPNLVDMAAQVAAGMAYIERMNYIHRDLRSANILVGNGLICKIADFGLARLIEDNEYTARQGAKFPIKWTAPEAALYGRFTIKSDVWSFGILLTELVTKGRVPYPGMNNREVLEQVERGYRMPCPQDCPISLHELMIHCWKKDPEERPTFEYLQGFLEDYFTATEPQYQPGENLSEQ ID No.17ggacgtcagactagagagtagggagagagactggtgctcgagggacagggctagcccggacgcgtgtccgcgcctcggaggtggcaagtaggcagtgtcgggtggcgaggcaacgatggagctcctgcggactatcacctaccagccggccgccggcaccaagatgtgcgagcaggctctgggcaaagcttgcggcggggactcaaagaagaagcgaccacagcagccttctgaagatgggcagccccaagcccaggtgaccccggcggccccgcaccaccatcaccaccattcccactcgggacccgagatctcgcggattatagtcgaccccacgacggggaagcgctactgccggggcaaagtgctgggcaagggtggatttgcaaagtgttacgaaatgacagatctgacaaacaacaaagtctacgctgcaaaaattattcctcacagcagagtagctaaacctcatcagagggaaaagatcgacaaagaaatcgagcttcacagactactgcaccataagcatgtcgtgcagttttaccactactttgaagacaaagaaaacatttacattctcttggaatagtgcagtagaaggtccatggctcacatcttgaaagcaagaaaggtgttgacagagccagaagtccgatactacctcaggcagattgtgtcaggactcaagtatcttcacgaacaagaaatcttgcacagggatctcaagctagggaactttattattaatgaagccatggagctgaaggtgggagactttggtttggcagccagactggaaccactggaacacagaaggagaacaatatgtggaaccccaaattatctctcccccgaagtcctcaacaaacaaggacacggctgtgaatcagacatctgggccttaggctgtgtaatgtatacgatgctgctaggaagacctccattcgaaaccacaaatctgaaagaaacgtacaggtgcataagggaagcaaggtataccatgccgtcctcattgctggcccctgctaagcacttgatagctagcatgctgtccaaaaacccagaggaccgccccagtttggatgacatcattcggcatgacttcttcctgcagggtttcactccggacagactctcttccagctgttgccacacagttccagatttccacttgtcaagcccagccaagaatttctttaagaaagccgcagccgctctttttggtggcaagaaggacaaagcaagatataacgacacacacaataaggtgtctaaggaagatgaagacatttacaagcttcggcatgatttgaagaaagtgtcgataacccagcagcctagcaaacacagagcagacgaggagccccagccgcctcccactactgttgccagatctggaacgtccgcagtggaaaacaaacagcagattggggatgcaatccggatgatagtcagggggactctcggcagctgcagcagcagcagcgaatgccttgaagacagcaccatgggaagtgttgcagacacagtggcaagagtccttcgaggatgtctagaaaacatgccggaagctgactgtatccccaaagagcagctgagcacgtcctttcagtgggtcaccaagtgggtcgactactccaacaaatatggctttgggttccagctctcggaccacactgttggcgtccttttcaacaacggggctcacatgagcctccttccggacaaaaagacagttcactattatgcggaacttggccaatgctctgttttcccagcaacagatgcccctgaacaatttattagtcaagtgacggtgctgaaatacttttctcattacatggaggagaacctcatggatggtggtgatctcccgagtgttactgacattcgaagacctcggctctacctcctgcagtggttaaagtctgataaagccttaatgatgctcttcaatgacggcacatttcaggtgaatttctaccacgatcatacaaaaatcatcatctgtaaccagagtgaagaataccttctcacctacatcaatgaggacaggatctctacaactttcagactgacgactctgctgatgtctggctgttcgttagaattgaaaaatcgaatggaatatgccctgaacatgctcttacagagatgtaactgaaaacattattattattattattataattatttcgagcggacctcatgggactcttttccactgtgagatcaacagggaagccagcggaaagatacagagcatgttagagaagtcggacaggtggtggtacgaatacaattcctctgtggcctgctggactgctggaaccagaccagcctaaggtgtagagttgactttggacaatcctgagtgtggagccgagtgcagttttccctgagatacctgtcgtgaaaaggtttatgggacagtttttcagaaagatgcattgactctgaagttctctctgttgagagcgtcttcagttggaagacttggaactgtgaatacacttcctgaaggggagggagaagggaggttgctcccttgctgtttaaaggctacaatcagagcagcttttggctgcttaactgtgaactatggccatacatttttttttttttggttatttttgaatacacttgtggttggaaaagtgcattccttgttaataaactttttatttattacagccccaagagcagtatttattatcaagatgttctctttttttatgttgaccatttcaaactcttggcaataaagagtatgacatagaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaSEQ ID No.18MELLRTITYQPAAGTKMCEQALGKACGGDSKKKRPQQPSEDGQPQAQVTPAAPHHHHHHSHSGPEISRIIVDPTTGKRYCRGKVLGKGGFAKCYEMTDLTNNKVYAAKIIPHSRVAKPHQREKIDKEIELHRLLHHKHVVQFYHYFEDKENIYILLEYCSRRSMAHILKARKVLTEPEVRYYLRQIVSGLKYLHEQEILHRDLKLGNFIINEAMELKVGDFGLAARLEPLEHRRRTICGTPNYLSPEVLNKQGHGCESDIWALGCVMYTMLLGRPPFETTNLKETYRCIREARYTMPSSLLAPAKHLIASMLSKNPEDRPSLDDIIRHDFFLQGFTPDRLSSSCCHTVPDFHLSSPAKNFFKKAAAALFGGKKDKARYNDTHNKVSKEDEDIYKLRHDLKKVSITQQPSKHRADEEPQPPPTTVARSGTSAVENKQQIGDAIRMIVRGTLGSCSSSSECLEDSTMGSVADTVARVLRGCLENMPEADCIPKEQLSTSFQWVTKWVDYSNKYGFGYQLSDHTVGVLFNNGAHMSLLPDKKTVHYYAELGQCSVFPATDAPEQFISQVTVLKYFSHYMEENLMDGGDLPSVTDIRRPRLYLLQWLKSDKALMMLFNDGTFQVNFYHDHTKIIICNQSEEYLLTYINEDRISTTFRLTTLLMSGCSLELKNRMEYALNMLLQRCN
SEQ ID No.19aacttagctggactgcagccttctccgctggaactcgccaagccagctgatttccccatccaaagccatgaagagcggcgtatgtctgtgcgtggtgatggcagtcctagctgctggcgccctggcgcagccggtagtccctgcagaagctacggaccccgtggagcagcgggcgcaagaggcgccccgaaggcagctgcgggctgtgctccggacggacggcgagccccgagcgcgcctgggcgcactgctagcgcgatacatccagcaggtccgcaaagctccttctggccgcatgtccgttcttaagaacctgcagagcctggaccccagccatagaataagtgaccgggactacatgggctggatggattttggccggcgcagtgccgaggactacgaatacccatcgtagtgggccagcgtcttggccctgcttggaggaggtggaatgaggaaacaaccacacatacgacccctcgcctctaatgtctgacgttttgagtatctatttattaagtccccaatgtgaaatctgtccagagtgtgcaatgcagccacatctcagcctagctgtgtggtcggaaggcagtgtttccttcagtgactcccagacctaatgttgctatgctattaaagagatttccttctgccccccSEQ ID No.20MKSGVCLCWMAVLAAGALAQPVVPAEATDPVEQRAQEAPRRQLRAVLRTDGEPRARLGALLARYIQQVRKAPSGRMSVLKNLQSLDPSHRISDRDYMGWMDFGRRSAEDYEYPSSEQ ID No.21cttggtgacactagacagagcaactccagcgttaccgctcccgctcctggtttctcggcttctcatcgcagtcaatcttggactttggggttttgctactgtcagaaggacttctttctgcttcaagtgcttgacaacgcacccctttatcagggtatcagagcatcgccacagaatgaagctggtttccatcaccctgatgttattgggttcactcgctttcctaggcgcggacactgcagggccagatactccttcgcagttccgaaagaagtggaataagtgggcgctaagtcgtgggaagagggaactacaagcatccagcagctaccctacgggactcgctgatgagacgacagttcctacccagactcttgatccattcctggaacgagcagaacacaactggccccctacaagccagcaatcagagcgaagcccacattcgtgtcaaacgctaccgccagagcatgaaccagggttcccgcagcaatggatgccgcttcgggacctgcacatttcagaaattggcccaccagatctaccagctaacagacaaagacaaggacggcatggctcccagaaacaagatcagccctcaaggctatggccgccggcgccggcgttccctgctggaggtcctccggtcccggactgtggagtcctcccaggagcagacacacacagccccaggcccctgggcgcacatctccagactctttaggatataggtgcgggtgacagcattgaacagtcgggcgagtatcccgttggcgcctgcggaatcagagaacttcgcaccggggcggactgagacaatcctgcagagatctgcctggctgcccctaggggaggcagaggaacccaagaccaagccaggctcatgccagaaaccgagacttacaggctgatactctccgggcaggggtctgagccactgccttgcccgctcataaactggtttctcacggggcataagcctcattactacttgaactttccaaaacctagcgaggaacgtgcaatgcttgttgtccagccaaaggtaactatagtatttaagtttgttgctgtcaaggtttttttttttgtaacttcaaatatatagagatatttttgtacgttatatattgtattaagggcattttaaagtgattatattgtcaccttcccctattttaagacgtgaatgtctcagcaaggtgtaaggttgtttggttccgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtaaggtggagagcgcctgattatcgcctgtggatgaagaaaaaacattgtgtttcctataatctatttacataaaatatgtgatctgggaaaaagcaaaccaataaactgtctcaatgctgSEQ ID No.22MKLVSITLMLLGSLAFLGADTAGPDTPSQFRKKWNKWALSRGKRELQASSSYPTGLADETTVPTQTLDPFLDEQNTTGPLQASNQSEAHIRVKRYRQSMNQGSRSNGCRFGTCTFQKLAHQIYQLTDKDKDGMAPRNKISPQGYGRRRRRSLLEVLRSRTVESSQEQTHTAPGPWAHISRLFRISEQ ID No.23tcgagcggccgcccgggcaggtccaggatcaagagtcaccgcttcgcaagcactgcctggctccatcaggatccccgcaggctcagctccaaggcaccgctcaccaggaaggcatcatgggcttcctgaagttctcccctttcctggttgtcagcatcttgctcctgtaccaggcatgcagcctccaggcagtgcctttgaggtcaatcttggaaagcagcccaggcatggccactctcagtgaagaagaagttcgcctgctggctgcactggtgcaggactatatgcagatgaaagccagggagctggagcaggaggaagagcaggaggctgagggctctagcttggacagccccagatctaagcggtgtgggaatctgagtacctgcatgctgggcacgtacacacaagacctcaacaagtttcacaccttcccccaaacttcaattggggttgaagcacctggcaagaaaagggatgtggccaaggacttggagacaaaccaccaatcccattttggcaactaagctccttctctcctttctagtttccttcttgctttcttcctataacttgatgcatgtagttcctctctggttgctctccaggctattactggttgctttcctgaggcaaagaatggtatctgaaatccccagtgggtgaggagaaagtcccacaggctaaaagagaatcacccaggaagatggcagagagcaagggcacactcaggaagatggcagagagcaagggcagtcatctggcttcctagtagagcttctagtcttgcttctggaagtgttggttgtttgggaaataaaactattttttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaSEQ ID No.24MGFLKFSPFLVVSILLLYQACSLQAVPLRSILESSPGMATLSEEEVRLLAALVQDYMQMKARELEQEEEQEAEGSSLDSPRSKRCGNLSTCMLGTYTQDLNKFHTFPQTSIGVEAPGKKRDVAKDLETNHQSHFGN
SEQ ID No.25aaaggcagcctgataaagctccttgtgacaggctgtcttgccagtctcccagtatgctcctcttgctctgaagtgctccaggattgaaaccacagcttcccaaattagcctgggaagagtgtgcggacccagcagccttttaacccgcgtcagtgcctttgctatgttcaagactgctgttttggatggtgaatgctagctagcactccatcgagacatgacagcaaaaaattctccaaaagaatttactgcttcggaatctgaggtttgcataaagactttcaaggagcagatgcgcttggaacttgagcttccaaagctaccaggaaacagacctacatctcccaaaatttctccacgcagttcaccaaggaattcaccatgctttttcagaaagttgctggtgaataaaagcatccgacagcggcgtcgcttcacggtggctcatacatgctttgatgtggaaaatggcccttctccaggtcggagcccactggaccctcaagccggctcttcgtcgggactggtacttcatgccgcctttcctgggcacagccagcgcagggagtcgttcctctacgatcttgacagcgactatgacttgtcaccaaaagcgatgtccaggaactcatcacttcccagtgagcaacacggcgatgacctgattgtcactccttttgcccaggttcttgccagcttgcgaagtgtaagaaacaacttcaccctgctgacgaaccttcatggagcgccgaacaagaggtcaccagcggctagtcaggctccagtctccagagtcagcctgcaagaggaatcatatcagaaactagcaatggagacgctggaggaactagactggtgcctagaccagctagagaccatccagacctaccgctctgtcagcgagatggcttcaaacaagttcaaaaggatgctgaaccgggagctgacacacctctcagagatgagcagatcagggaaccaggtgtctgagtacatttcaaacacgttcttagacaagcagaacgatgtggaaatcccatctcccacgcagaaggacagggagaagaagaagaagcagcagctcatgacccagataagtggagtgaagaaactgatgcacagctcaagcctgaacaacacaagcatctcacgcttcgggatcaacacggaaaatgaggatcatctagccaaggagctggaagacctgaacaaatggggccttaacatcttcaatgtggctgggtactcacataatcggccccttacgtgcatcatgtatgcaatattccaggaaagagaccttctgaagacgtttaaaatctcatctgacacctttgtaacctacatgatgactttagaagaccattaccattctgatgtggcatatcacaacagcctgcatgctgctgacgtggcccagtcaactcacgttctcctttctacgccggcactggatgctgtcttcacagacctggaaatcctggctgccatttttgcagctgccatccatgatgtcgatcatcctggagtctccaatcagtttctcatcaatacaaattctgaacttgctttgatgtataatgatgaatctgttctggaaaaccatcaccttgctgtgggattcaaattgctacaagaggaacactgcgacatctttcagaatcttaccaagaagcaacgccagacactcaggaaaatggtgattgacatggtgttggcaactgatatgtccaaacacatgagcctcctggcagaccttaaaacaatggtagaaaccaagaaggtgacaagctccggtgttctcctcctggacaactatactgaccggatacaggttcttcgcaacatggtacactgtgcagacctgagcaaccccaccaagtccttggaattgtatcggcaatggaccgatcgtatcatggaggagtttttccagcagggagacaaagaacgggagaggggaatggagattagcccaatgtgtgataagcacacagcttctgtggaaaaatcccaaggttggtttcattgactacattgtccatccactgtgggagacctgggcagacctggttcaaccggatgctcaagatattctggatacactagaagataacaggaactggtaccagagtatgataccccagagcccttccccgccactggatgagaggagcagggactgccaaggcctgatggagaagtttcagtttgaactgacccttgaggaagaggattctgagggaccggaaaaggagggagaaggccacagctatttcagcagcacaaagacgctttgtgtgattgatccagagaacagggattctctggaagagactgacatagacattgcaacagaagacaagtctccgatcgacacataatctctctccctctgtgtggagatgaacattccacccttgactgagcatgcccgctgagtggtagggtcacctaccatggccaaggcctgcacaggacaaaggccacctggcctttccagttacttgagtttggagccagaatgccaggccgtgaagcaaatagcagttccatgctgtcttgccttgcctgcaagcttggcggagacccgcagctgtatgtggtagtagaggccagttcccatcaaagctaaaatggcttgaaaacagaggacacaaagctgagagattgctctgcactaggtgttgggaagctgtcctgacagatgactgaactcactaacaacttcatctataaatctcaccacccaacccattgtctgccaacctgtgtgcctttttttgtaaaatgttttcgcgtctttgaaatgcctgttgaatatctagagtttagtaccaacttctacaaacttttttgagtctttcttgaaaaacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaSEQ ID No.26MTAKNSPKEFTASESEVCIKTFKEQMRLELELPKLPGNRPTSPKISPRSSPRNSPCFFRKLLVNKSIRQRRRFTVAHTCFDVENGPSPGRSPLDPQAGSSSGLVLHAAFPGHSQRRESFLYDLDSDYDLSPKAMSRNSSLPSEQHGDDLIVTPFAQVLASLRSVRNNFTLLTNLHGAPNKRSPAASQAPVSRVSLQEESYQKLAMETLEELDWCLDQLETIQTYRSVSEMASNKFKRMLNRELTHLSEMSRSGNQVSEYISNTFLDKQNDVEIPSPTQKDREKKKKQQLMTQISGVKKLMHSSSLNNTSISRFGINTENEDHLAKELEDLNKWGLNIFNVAGYSHNRPLTCIMYAIFQERDLLKTFKISSDTFVTYMMTLEDHYHSDVAYHNSLHAADVAQSTHVLLSTPALDAVFTDLEILAAIFAAAIHDVDHPGVSNQFLINTNSELALMYNDESVLENHHLAVGFKLLQEEHCDIFQNLTKKQRQTLRKMVIDMVLATDMSKHMSLLADLKTMVETKKVTSSGVLLLDNYTDRIQVLRNMVHCADLSNPTKSLELYRQWTDRIMEEFFQQGDKERERGMEISPMCDKHTASVEKSQVGFIDYIVHPLWETWADLVQPDAQDILDTLEDNRNWYQSMIPQSPSPPLDERSRDCQGLMEKFQFELTLEEEDSEGPEKEGEGHSYFSSTKTLCVIDPENRDSLEETDIDIATEDKSPIDTSEQ ID No.27ggccgcgcgggagtctgagaatgcaaagtgccatgttcctggctgtccagcacgactgcgtacccatggacaagagtgcaggcaacggccccaaggtcgaggagaagcgggagaaaatgaagcggacactcttaaaccattggaagacccgtttgagctacttcttgcagaattcctctgctcctgggaagcccaaaactggcaagaaaagcaaacagcaaacttttatcaagccttctcctgaggaagcgcacgtctgggcagaagcatttgatgaactgctggccagtaaatatgggctggctgcattcagggcgtttttaaagtccgagttctgtgaagaaaacattgaattctggttggcttgtgaagacttcaaaaaaaccaaatcaccccaaaaactgtcctcaaaagcaaggaaaatctataccgacttcatagagaaggaagctcccaaagagataaacatagacttccaaacgaaatctctgattgcccaaaatatccaagaggctacaagtggctgcttcaccacagctcagaagagggtgtacagtttgatggagaacaattcttatcctcggttcttggagtccgaattctaccaggacttatgtaaaaagccacagatcaccacggagccccatgctacatgagaccaggagtccccccacacacaaaggacattccattctgtctcccaagagcaaaggctgtgacctgccagaaaaaaaaaaaaaactgaccttgaattcagcctgagtgttaggaaaacatcgctcagaactattgattcaatg
ttgggtagtgaatcaggaagtcagcaacctaggagaggctctgtgtgagaacggcttccctcactgtgtgaagaacagagggagggaacaggcctctgaatgtgttcttcctccttgtcgggaaagcagagtttgagatgaaagatccgatgcaatgttgttggagcatttaaaatcaagaggtctgggattatgtggccttagctagttggctgtacaccttccctaaactagtccatgttacacatagtggtgttagttctagttttaatattttagtactaagtaacattacaatgtttactgtgtgcaagggtgttgacgttcttaggactacagatcattagtactagtgtgtcacgtatcactgaaactgagaagtatgtttgagttgttaaatggtgtgtgtgatggaccgaatgctgtgccgtgctgtagaaSEQ ID No.28MQSAMFLAVQHDCVPMDKSAGNGPKVEEKREKMKRTLLNHWKTRLSYFLQNSSAPGKPKTGKKSKQQTFIKPSPEEAHVWAEAFDELLASKYGLAAFRAFLKSEFCEENIEFWLACEDFKKTKSPQKLSSKARKIYTDFIEKEAPKEINIDFQTKSLIAQNIQEATSGCFTTAQKRVYSLMENNSYPRFLESEFYQDLCKKPQITTEPHATSEQ ID No.29aaaaagtatatgaggacaaatgtaaggcaaatgaccatggaaacagttgaatcacagcaggatcgaagtgtaacacgttctgtggcagagcatagctctgctcatatgcagactggtcaaatttctgttcctactctagctcaggtagcaacaattgcagagacagatgattctgcagactcagaagtaattgattcgcataaacgtagagaaattctttcacgaagaccctcatatagaaaaatactgaatgaactttcctctgatgtgcctggtattcccaagattgaagaagaaaaatcagaggaagaagggacaccacctaacattgctaccatggcagtaccaactagcatatatcagactagcacggggcaatacaatgaggagactgaccttgccccaagtcacatggctgctgccacaggtgacatgccaacttaccagatccgagctcctactactgctttgccacaaggtgtggtgatggctgcctcaccaggaagcctgcacagtccccagcaactagcagaagaagcaactcgcaagcgggagctgaggctgatgaaaaacagggaagctgcccgggagtgtcgcaggaagaagaaagaatatgtcaaatgtcttgaaaatcgtgtggctgtgcttgaaaatcaaaacaagaccctcattgaggaactcaaggccctcaaagacctttattgccataaagcagagtaactgtgtttgatttggaccttgttgactgtgaactctaatcggggcaggcgatgcagcatcctcataatggccatgtggacttgtagatgggtctcttaacccttgcttaagaatacagtctgctgtagagtgtgaattgggaatactgttccatgggttggaatgcagctcccctcacattaccaagcttgctctattgccaatagcatgcaacatatgttttgtttgcccttctgcttctacttttttcagggaagctgctaaagaatgtcgacgtcgaaagaaagagtatgtgaagtgtcttgagagtcgagtcgcagtgctggaagttcagaacaagaagcttatagaggagcttgaaactttgaaagacatttgctctcccaaaacagattagtagaaatatttaactatgaactgattacagcatgtacagttgcttttgaatgcaatacaaatatatagccggcaagaattatggctttttcctttgtatcattcatctaactttctaaaactaacattcctaagatgctttgttgtatttaatttgctcttacctctaaggtcaattttttagaagagacaaactcaaaaaatgtatgtaacaaattcttaaaatgaagtatttgtaagacttgttccagtcaacatatttacagttcccagtctctctgtcatgaatagtgtcctatgcaataaaaattttgcaggttttaagaatcattttaggaaagggtgaatcaaaggcagtgcatctctccagtagtaagataaaatcaacccatagagatacctcaggaaagaatgaaaggaagtgtatcctgatgacatgacgtgagaatagcctacaaatgaatttatgcatttatagatttttataatcgtcactttgtaaagaaagtattgtattgctgtccttgggtgccacagttgaagacagttttaaatagaaccatgttggttgctctttgtactatttggtatttatttaagtatctgagcatttactacagcttcctactatgtatgtagtatgtgaatttctacaaaagtttgtgctctttgctgttatttaatgaaagagacaacatattttcattatctggaatgagttccacaagtatgaatttattgctacactggatcagcagccttgcaaatactgggccatttcattagaggacaacagcagggctctaggagcagagttcagtgtggagcacttgcctggcatgctacatgttcagttgaaagggaagacctcaagctctgcaaatggaatggggtccaggggaagaggttagaggttagcctttgtgctgtactaggcttcttgctgatcgtctggagagtttctgctgatgaccctccattgtgaattcttgcaacctcaggaatgttaacgtttaaaaaacttcccaagatgtcatttttgattttacaacttggatcaattttgttttgctctttggaatatagctgtgaacatttgtcacgtaggtttaggctggccttaaactcacagttctcttgcctcagccttctgagtgcttggattacggatgtgggccagaatatccagtttgatcaagtattcttttataaaatattactttctttttSEQ ID No.30MTMETVESQQDRSVTRSVAEHSSAHMQTGQISVPTLAQVATIAETDDSADSEVIDSHKRREILSRRPSYRKILNELSSDVPGIPKIEEEKSEEEGTPPNIATMAVPTSIYQTSTGQYNEETDLAPSHMAAATGDMPTYQIRAPTTALPQGVVMAASPGSLHSPQQLAEEATRKRELRLMKNREAARECRRKKKEYVKCLENRVAVLENQNKTLIEELKALKDLYCHKAESEQ ID No.31gctgaagcgtttcctcaagcctgccggggtgggaggagaggaggaggtggtggtggtggaggaggtggaggcagagggtggagagagagaaagcgcacgccgagaggaggtgtgggtgttccgctcccatcctaacggaacgagctccctcttcgcggacatgggattgcccagcggctgctaacccctctcctggtcctgatcccccaaaccggcgtggctccccggtcaccaaggagctgattacaagggaccaggatttgcatccttggctgggcgtccattggctacagagtgcctgacctgggtcaggctttccaacacggacatgtctgacaaaatgtcgagtttcctacatattggagacatttgttctctgtatgcggagggatctacgaatggatttatcagcaccttaggcttggttgatgaccgttgtgttgtacagccagaagccggggaccttaacaatccacccaagaaattcagagactgcctctttaagctatgtcctatgaatcgatactccgcacagaaacagttctggaaagctgctaagcccggggccaacagcactacagatgcagtgctgctcaacaaattgcatcatgctgcagacttggaaaagaagcagaatgagacagaaaacaggaaattgttggggaccgtcatccaatatggcaacgtgatccagctcctgcatttgaaaagcaataaatacctgactgtgaataagaggctcccagccttgctagagaagaatgccatgagggtgacgttggacgaggctggaaatgaagggtcctggttttacattcaaccattttacaagcttcgctccatcggagacagtgtggtcataggcgacaaggtagttttgaatcctgtcaatgctggcc
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atgtatcagagagccgcgtctgctcacgcaggacactttgagagaacattgatgcagtctgttcggaggaaaaatgaaacaccagaaaacgtttttgtttaaacttatcaagtcagcaaccaacaacccaccaacagaaaaaaaaaaaaaaSEQ ID No.34MSAEGYQYRALYDYKKEREEDIDLHLGDILTVNKGSLVALGFSDGQEARPEDIGWLNGYNETTGERGDFPGTYVEYIGRKRISPPTPKPRPPRPLPVAPGSSKTEADTEQQALPLPDLAEQFAPPDVAPPLLIKLLEAIEKKGLECSTLYRTQSSSNPAELRQLLDCDAASVDLEMIDVHVLADAFKRYLADLPNPVIPVAVYNEMMSLAQELQSPEDCIQLLKKLIRLPNIPHQCWLTLQYLLKHFFKLSQASSKNLLNARVLSEIFSPVLFRFPAASSDNTEHLIKAIEILISTEWNERQPAPALPPKPPKPTTVANNSMNNNMSLQDAEWYWGDISREEVNEKLRDTADGTFLVRDASKMHGDYTLTPRKGGNNKLIKIFHRDGKYGFSDPLTFNSVVELINHYRNESLAQYNPKLDVKLLYPVSKYQQDQVVKEDNIEAVGKKLHEYNTQFQEKSREYDRLYEEYTRTSQEIQMKRTAIEAFNETIKIFEEQCQTQERYSKEYIEKFKREGNEKEIQRIMHNHDKLKSRISEIIDSRRRLEEDLKKQAAEYREIDKRMNSIKPDLIQLRKTRDQYLMWLTQKGVRQKKLNEWLGNENTEDQYSLVEDDEDLPHHDEKTWNVGSSNRNKAENLLRGKRDGTFLVRESSKQGCYACSVVVDGEVKHCVINKTATGYGFAEPYNLYSSLKELVLHYQHTSLVQHNDSLNVTLAYPVYAQQRRSEQ ID No.35ggaaggatgaggcgcccgcggcggcccgggggctccgggggctccgggggctccgggggcctccggctgctggtctgcctgctgttgctgagcggccgccccgggggctgcagcgccatcagtgcccacggctgtctgtttgaccgcagactttgttcgcatctggaagtctgtattcaggatggcttgtttggacagtgccaggcaggagtggggcaggcacggcccctcttacaagtcacttccccagttctccagcgcctacaaggtgtgctccggcaactcatgtcccaaggcttgtcctggcatgatgaccttacccagcatgtgatctcccaggagatggaacgcatccccaggcttcgccccccagagccccatccaagggacaggtctggtttggtgcccaggaaaccaggccctgcaggggaattgctaactcagggcaatcctactggctcctctcctgctgcccagggctttccaaggcctgcagggggacggagctggggcggctccccactgtcctctctgcaggctgagttgttaccccctctcttggagcatctgctaatgcccccacagcctccacaccctgctctgacctatgaacctgcactgctacagccttacctcttccaccagtttggctcccgagatggctcccggggctcagagagctcctctggggtagttggtgttggtcacctgtccaaggctgaaggtcctgcactcttcagcagaagtgcctccaaggccattttggggactcactctggacactcttttggggaccttacaggtccctcacctgctcaacttttccaagattcagggctgctctacatggcccaagagttgccagtgcctggcagagcccgggcaccaaggttgccagagaatgggggcaacagggcagaggactcttcagagggccatgaggaggaagtactagggggtcgtggggagaagtcccctccccaagcagcacaaccagaattgagtctgcagagattgactgctgtactggcaggctatggagtagagctgcgtcagttgaccccggagcagttttctaccctcttgaccctgatgcagttgctgcccaagggcacaggaagaaatcttgaaggggctgtaaatgttggaggagccgatgtcaagaaaacaatacaacagatgcagagaggagacccagcagaagctctgccccccacaccctcgcttcctgggtacctcactgccagccctgcctccagcgaagttcagcaggtgctgagccctggtttccctgaacctccccacacacccagccctctgggctcctcctcagtccttctggagaagaaaagtcccttgggccagagccagcccacagtggtgggacggccatcagctcgaccatcggccgaggagtatggctatatcgtcactgaccagaaacccctgagcctggtggctggagtgaggctgctggagattctggctgagcacgtgcatatgtcctccggtagctttatcaacatcagtgtggtgggaccagctgtcaccttccgaatccggcacaatgagcagaacctgtctttggcagatgtgacccagcaagctgggctggtgaagtctgaactggaagcgcagacagggctccagattttgcagacaggggtgggacagagggaggaagcagctgaagtccttccccgacaagcccatggcatatctcccatgcgctcagtgctgcttactctagtggccctggcaggcgttcgctgggctgctagtggctttggcagtggccttgtgtatgcgccatcattcgagacagcgggataaggagcgcctggcagcgctggggccggagggggcccatggtgacactacttttgagtaccaggacctgtgtcgccagcacatggccacaaagtccctgtttaaccgggcggagggtcagccagagccttctagggtgagcagtgtgtcctcccagttcagcgacgcggcccaggccagccccagttcccacagcagctctccatcttggtgcgaggagcccgcccaggccaacatggacatctccacaggacacatgattctggcatacatggaggatcaccttcggaaccgggaccggttggccaaggagtggcaggctctgtgcgcctaccaagcagagccaaacacctgtgccgccgcacaggatgagagcaacatcaagaagaaccgccatcctgacttcctaccctatgaccatgcccgaatcaagctgaaagtggagagcagcccttctcggagtgattacatcaacgccagccccatcatcgagcatgaccctcggatgccggcctacatagccacacagggaccactgtcccacaccatcgcggacttctggcagatggtgtgggagagtggctgcactgtcatcgttatgctgaccccgttggtggaggacggtgtcaaacagtgtgaccgctactggccggatgaaggatcttccctctaccacgtctatgaggtgaacctggtgtcggagcacatctggtgcgaggacttcctggtgcggagcttctaccttaagaacctgcagacccaggagacgcgcacgctcactcagttccacttcctcagctggccggcagagggcactccggcctccacccggccgctgctggacttccgcaggaaagtgaacaagtgctacagaggccgctcctgccccatcatagtgcactgcagtgacggtgcagggaggacaggcacctacatccttattgacatggtcctgaatcgcatggccaaaggagtgaaggagattgatattgctgccaccctggagcatgtccgtgaccagcggcctggacttgtccgttctaaggaccagtttgagtttgcgctgacagccgtggcagaggaggtgaatgctatcctcaaggccctgccccagtgagcccccctgggcgcctcagtgggcatcctggcctcggctccttctgcctgtgtgagcatctgtgcacccactcttcagcccctacccatctgccaccttggtctgacttggccatgggagcctttcccaacccagtgtggaagggagtcgggagggaaggaaggggtaggctcgccctgctttatccatgctagaaccatggtatcccatgggaagcagacagcaggcaaggagaggcgtggacaccggccacaggtgtgcccgagccccatcctacctgagtctctgtctccctctctggatatgtgcgtccccactcccaccagcctaccacctatagacaaagcagaacgaggaaaccccagctcccccaaccctgctaccactggcctgccaccttgaccctgctcaaccttctccctctagcacaagggaacatttctagaaaagtaaaatctacttttgtatcagtgtgaataaagttagtgtgttgtctgtgcSEQ ID No.36
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tgggaaaataagggggagaacgaatggctccatgaccactgcatgcaggtcggggatgcctatctgatcgtctactctatcacagaccgtgcaagcttcgagaaggcatctgagctgaggattcagctccgcagggcccggcagacagaagacattcctataattttggttggcaacaaaagcgacttagtgcggtgtcgagaagtgtctgtgtcagaagggagagcttgtgctgtggtgttcgactgcaaattcatcgagacctctgcggctgtgcagcacaacgtgaaggaactgtttgagggcattgagcgacaggtgcgcctgccgagggacagcaaggagaagaatgagaggaggctggcctaccagaagaggcgggagagcattcccaggaaagccaggcgcttctggggcaaaattgtggccaaaaacaacaagaacatggcttcaagctccaagtcaaaatcctgccatgacctgtctgtgctctaggcacccagtgtcacccagatgtcccttggtggacatcgttgaaggctattgggaccagtgatctatattagattggatacataagcattgttagacgcaacttcccctatggcagatggaaaccaacaggttagccttgtgggcaaccaagtgcacgggcaatgaatgagctctgtcaagagtcagtatttattcataggaaaagcttgagctgctacgtggatgtctcagactcatttaagacacgcttcgggttcacatgagtttctctctcctttggacagcagaatatttttttcctcagtgttgttccatgtgatttcgaggtccttgggtcatatagaaatgtagggaaatggcggtagtttattggaaggagaagggctcactgcatacttatatccctgaaacgacatctttagagctggcctcatcacagttgtgactatttctgctccagtgaagagaattgttagatttgctggaaactgaggcttactaacagtttttgtttaaagaccacagagattgtagacttaggagctatatggtactacttataggttcaaaaaattgtttacttatgtgtcgtagaagtgtttattttgaggaaactatttttttttttgccaaattctacttagtcaaatcatcttctatgtcttgctgttttttaaatcattaagctatcataaaatattttttaaaaaaatctcaactatattgataacctgcagtgcaaaattttaaatatagtcctgtttttcccccaaaacataaacatgccccatcctttgggttgcttctgtatgccacagctgaattatatttattattttgcaataaccattttatatttgataaagatatttatgagcatatttcttactgagaaaatgtctgttttattacctttttatatttttcaaagtattcaagtttttacctattgtcttataataaataaataaaatctttgaaaaggSEQ ID No.40MTLNNVTMRQGTVGMQPQQRWSMPADARHLMVQKDPHPCNLRNRHSTAPEEHCRRTWSSDSTDSVISSESGNTYYRVVLIGEQGVGKSTLANIFAGVHDSMDSDCEVLGEDTYERTLVVDGESATIILLDMWENKGENEWLHDHCMQVGDAYLIVYSITDRASFEKASELRIQLRRARQTEDIPIILVGNKSDLVRCREVSVSEGRACAVVFDCKFIETSAAVQHNVKELFEGIERQVRLPRDSKEKNERRLAYQKRRESIPRKARRFWGKIVAKNNKNMASSSKSKSCHDLSVLSEQ ID No.41tatcccgctgttgctgcaagccggctgcatcttagttggccatgaagaccccagcacagcggctgcaccttcttccactgttgttgctgctttgtggtgagtgtgcccaggtatgcggctgcaacgagacagggatgctggagaggctgcctcgctgtgggaaagccttcgctgacatgatgcagaaggtggctgtctggaagtggtgcaacctgtcggagttcatcgtgtattatgaaagcttcactaactgcaccgagatggagaccaacatcatgggctgctactggcccaacccgctggcccagagcttcatcactggaatccacaggcagttcttttccaactgcacggtggacaggacccactgggaagaccccccggatgaagtactcatcccactgatcgcggttcctgtcgtgctgactgtggctatggctggcctggtggtgtggcgcagcaagcacactgatcggctgctgtgaggatctgctggatggagggccatgcctggcaggctgggagaatgttgctcagagctctgagagctggcagactcggcttctgtctggtttgctttggccacaccctacctggccatgccaaagtcctcccgaccaggctggtgtggcccttgctgtctagcctgccgcctgctggggttcagattgtccatactttgctctttcttgggctagtggaagaaagtgacaaatcccaagtttgtggaccaggcatggaaatcaactgttgctgagccccgctccccaggctcggttccctagtttctagccgtttcttggcagagtcttgctcagcctgaaccccgccccaggtcctgacccatttctagtcctgaccctgacccctgctacacttggccagagagggcaggcaaggtcatctggaagatgtggacgcccccccgcctctattcaagagactgagcacatcatttatcagacatgaaggatagcctggggtcattaggagccacgtgtgacctactgacccacctgcctgtcctctctgtgatctgtcacgattctgtgtccagtgtgggctggagctgtggcttgtttagcccttcaaagacacctaccctgcaggtagagcgtgaacctccttcttgaggggtattcctgggagtggggcgcactgagtgtgctcaagggttctgtctgctgatgtcagttctttttgattaaagtgtctccttacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaSEQ ID No.42MKTPAQRLHILPLLLLLCGECAQVCGCNETGMLERLPRCGKAFADMMQKVAVWKWCNLSEFIVYYESFTNCTEMETNIMGCYWPNPLAQSFITGIHRQFFSNCTVDRTHWEDPPDEVLIPLIAVPVVLTVAMAGLVVWRSKHTDRLLSEQ ID No.43atgctcaacaaagccaagaattcaaagagtgcccagggtctggctggtcttcgaaaccttgggaacacgtgcttcatgaactcaattcttcagtgcctgagcaacacccgagagctgagagattactgcctccagaggctgtacatgcgggacctcggccacaccagcagcgctcacacggccctcatggaagagtttgcaaaactaatccagaccatatggacgtcgtcccccaatgatgtggtgagcccatctgagttcaagacccagatccagagatatgcgccacgcttcatgggctataatcagcaggatgctcaggaattccttcgtttccttctggatggtctccacaatgaggtgaaccgggtggcagcaaggcctaaggccagccctgagacccttgatcatctccctgatgaagaaaaggggcgacagatgtggaggaagtatctggaaagggaagacagtcggattggggatctcttcgttgggcagctgaagagctccctcacatgcaccgattgtggctactgctctacagtcttcgatcccttctgggatctctcgttgcccatcgcaaagagaggttaccctgaggtgacgttaatggattgtatgaggctcttcaccaaagaggacatattggatggtgatgagaagccaacttgctgccgctgccgagccagaaaacgatgcataaaaaagttctctgtccagaggttcccaaagatcttggtgctccacctgaagcgattctcagaatccaggatacgaaccagcaagctcacaacatttgtgaatttcccactaagagacctggacttgagagaatttgcttcagaaaacaccaaccatgctgtttacaacctgtatgctgtgtccaatcactccggaaccacc
atgggaggccactatacagcctactgccgaagtccggttacaggcgaatggcacactttcaatgattccagtgtcacacccatgtcctccagccaagtgcgcaccagcgacgcctatttgctcttctatgaactggccagtccaccctcccgtatgtagcattgaggagctgcggcccttccctcttccctgtggtggccccacgtcctaagSEQ ID No.44MLNKAKNSKSAQGLAGLRNLGNTCFMNSILQCLSNTRELRDYCLQRLYMRDLGHTSSAHTALMEEFAKLIQTIWTSSPNDWSPSEFKTQIQRYAPRFMGYNQQDAQEFLRFLLDGLHNEVNRVAARPKASPETLDHLPDEEKGRQMWRKYLEREDSRIGDLFVGQLKSSLTCTDCGYCSTVFDPFWDLSLPIAKRGYPEVTLMDCMRLFTKEDILDGDEKPTCCRCRARKRCIKKFSVQRFPKILVLHLKRFSESRIRTSKLTTFVNFPLRDLDLREFASENTNHAVYNLYAVSNHSGTTMGGHYTAYCRSPVTGEWHTFNDSSVTPMSSSQVRTSDAYLLFYELASPPSRMSEQ ID No.45gcggagcgtgagctgtgcgagcgagcgagcgcgagcatagcctgcgagcgagcagagagaaagagcgagggcaagagagcggcgaggcgcctgcgcgatgctcgggcccctaagcccgcggcgctgagccagccgggacggacatgcgcgggagggcgccgcggggtcccgctcccttgggggaatgaaagctactggttgacttaaaaacacctgggctttacaaatttgaaggcatcccagagtggggcacaatgtcaacagcaggagttgctgctcaggatattcgagtcccattaaaaactggatttctccataatggtcaggccttggggaatatgaagtcctgctggggcagtcacagtgagtttgaaaataactttttaaatattgatccaataaccatggcctacaatctgaactcccctgctcaggagcacctaacaactgttggatgtgctgctcggtctgctccagggagcggccacttctttgcagagtgtggtccatctccaaggtcaagcttgccccctcttgttatctcaccaagtgaaagctcgggacagcgtgaagaggatcaagttatgtgtggttttaagaaactctcagtgaatggggtctgcacttccacacctccacttacacccattaaaagctgcccttcccctttcccctgtgcggctctgtgtgatcggggttctcggccgctcccgccactgcccatctctgaagacctatgtgtggatgaggccgacagtgaggtagagcttctaaccaccagctcagacacagacttgcttttagaagactctgcgccttcagatttcaaatacgatgctcctggcaggcgcagcttccgtgggtgcggccagatcaactatgcatattttgacagcccaactgtttctgtggcagatcttagctgtgcatctgaccagaacagagttgttccagacccaaaccctcccccacctcaaagccatcgcagattaaggaggtctcactcaggaccagctgggtcatttaacaagccagccattcggatatctagctgcacacacagagcttctcctagctctgatgaagacaagcctgaggtccctcccagggttcctatacctcctaggccagcaaagccagactatagacggtggtcagcagaagtgacctccaacacctacagtgatgaagataggcctcccaaagtccccccgagagaacctttgtctcggagtaactcccgtaccccaagtcctaaaagccttccgtcttacctcaatggggtcatgcccccaacacagagcttcgctcctgaccccaagtatgtcagcagcaaagccctgcagagacagagcagcgaaggatctgccaacaaggttccttgcatcctgcccattattgaaaatgggaagaaggttagctcaacgcattattacttactacctgagaggccaccgtacctggacaaatatgaaaagtattttaaggaagcagaagaaacaaacccaagcacccaaattcagccattacctgctgcctgtggtatggcctctgccacagaaaagctggcctccagaatgaaaatagatatgggtagccacgggaagcgcaaacacttatcctacgtggtttctccataaatatgggggtcatgattcaacagaagttacatgggatgaatggctcccagttttccagtttgaggttcgtagaacaatgtcaagtggcaaaatgaagttggtggactccgccttaatgagaaaggcttagagcagttatgaggtgctgttatgctgggagtccctgatctatcagcataggagaaaaaagtatgatttaaagatgtgctagggggagggaaaaatgggcaacttttacatttgactacattatatacctatgtataaaagtgcggtgtaaccatagaccatagctgcaggataaccaattagtcactcttagagtaatctgtattcagaacaattcaaacaagctggaggaacagctcctgatagtgtgagaattgagcaaatgggagaaagcaatattgttagatcagattataaatttgttaagtttaaagattcctggcatacaggcctgctctataaatttgttttccccttccctgccagcagtcttctccatacacgacagggcgtgttctccaccaggcctgtaacatcttgttgagatcatttctatggcccaatacttgtcgctctggggttttgtcttgttgaggagaggacagcagtttctggaccatgttatcacctgtgtgtgtctcatatcttggaaattgacagatttggtgaataacttttccatactattcctgcttttcccatccactgaaacagcctgttgtagcaagaggctttcaagagtgcagtggagttgcgctggccatcagtgtttggggtctgagtttgatagactagtgcagcgatcagccatatgattgagagctactttggggatatatggtacgttgtttttgttttttagacttaataaaggacaacacgagctggtcttgtgttgctggttcctattcagtatttcctggggattgtttgctttttaagtgaaacacttctgaccaatagcacagaacgtcttaatgccagaggtcacttcagcatcttcctgctttgaaaactcacgctggctgcttcactgccctgagattcagtgagacacgcagtttgtgttcagtttttacatcctctgattgtttatcttgtgcagataaacacaaagagaaggtgcttgctagcagggacactgctgccatgtcccaacaagctgttcagtttaaactgctgaatgacattatttgagctatttaaagcttactttagtatgaactaaatgaaggttaaaacatgctttagaaaaatgcactgatctccgcactgtgtgtacagtattggacaaaggatttattcattttgttgcattattttgaatattgtcttttcattttaataaagttatattacttatttatgaaaaaaaaaaaaaaaaaSEQ ID No.46MSTAGVAAQDIRVPLKTGFLHNGQALGNMKSCWGSHSEFENNFLNIDPITMAYNLNSPAQEHLTTVGCAARSAPGSGHFFAECGPSPRSSLPPLVISPSESSGQREEDQVMCGFKKLSVNGVCTSTPPLTPIKSCPSPFPCAALCDRGSRPLPPLPISEDLCVDEADSEVELLTTSSDTDLLLEDSAPSDFKYDAPGRRSFRGCGQINYAYFDSPTVSVADLSCASDQNRVVPDPNPPPPQSHRRLRRSHSGPAGSFNKPAIRISSCTHRASPSSDEDKPEVPPRVPIPPRPAKPDYRRWSAEVTSNTYSDEDRPPKVPPREPLSRSNSRTPSPKSLPSYLNGVMPPTQSFAPDPKYVSSKALQRQSSEGSANKVPCILPIIENGKKVSSTHYYLLPERPPYLDKYEKYFKEAEETNPSTQIQPLPAACGMASATEKLASRMKIDMGSHGKRKHLSYVVSP
SEQ ID No.47atggctgaacaacttcttcctcaggctttgtatttgagcaatatgcggaaagctgtgaagatacgagagagaaccccagaagacattttcaaacctaccaatgggatcatctatcactttaaaaccatgcaccgatacacgctggagatgttcagaacatgccagttttgcccacagttccgagagatcatccacaaagcacttattgacagaagtgtccaggcttccctggaaagccagaagaagctcaactggtgtcgtgaagtcaggaagctcgtggctctgaaaaccaatggtgatggaaactgcctcatgcatgcagcttgtcagtacatgtggggtgttcaggatactgacctggtcctgaggaaggccctctgcagcacccttaaggagacagacactcggaactttaaattccgctggcagctggaatctctgaaatctcaggaatttgtggaaacaggactttgctacgacactcggaactggaatgacgaatgggacaacttggtcaaaatggcatcagcagacacacctgcagcccgaagtggacttcagtacaattccctggaagaaatccacatatttgtcctcagcaacatcctcagaagacccatcattgtcatttcagacaaaatgctaagaagtttggaatctggttccaattttgctcctttgaaagtgggtgggatttatctgcctcttcactggcctgcccaggagtgttacagatatcccatcgtcctaggctatgacagccagcactttgtacccctggtgaccctgaaggacagtggacctgaacttcgcgctgttccacttgttaacagagaccggggtaggtttgaagacttaaaagttcacttcttgacagatcctgagaatgagatgaaggaaaagcttctaaaggagtacttgatagtgatggagatccctgtgcaaggctgggaccacggcacgactcacctgatcaacgctgcaaaattggatgaagctaacttacccaaagaaataaatttggtagacgattactttgagcttgttcagcacgaatacaagaaatggcaggagaacagcgatcaggccaggagagcggcacatgcgcagaaccccttggagccttccacaccccagctatcactcatggatataaaatgtgagacacccaactgtcctttcttcatgtccgtgaacactcagcctttatgccacgaatgctcagagaggcgccaaaagaatcagagcaagctcccaaagctgaactcgaagctaggccctgaaggactcccaggcgtgggacttggctcctcaaactggagccccgaggaaaccgctggaggacctcattcagccccacccacagcacccagcctttttctcttcagtgagaccactgcaatgaagtgcaggagtcctgggtgcccttttactttgaatgtgcagcataatggattctgtgagcgttgccacgcccggcagattaatgccagccacaccgcagaccctggaaagtgccaagcctgccttcaggatgtcactcggacctttaatggcatctgcagtacctgtttcaaaaggactacagcagagcccagctccagcctcacttccagtatccctgcctcctgtcaccaacgctccaagtctgacccctcacaactcatccaaagtctcactccacactcttgccaccggactggaaatgtctctccttctggctgcctctcccaggctgcacggactccaggagacagagcagggacaagcaagtgcaggaaagctggctgcatgtattttgggactccagaaaacaagggcttttgcactctatgtttcatcgaatacagagaaaataagcagtctgttactgcctctgcgaaagctggttccccggcccccaggttccagaacaatgtcccgtgcctgggcagggagtgcggcacactcggaagcaccatgtttgaagggtactgtcagaagtgtttcatcgaagctcagaaccagagattccatgaagcaagaagaacggaagaacagctgagatcaagccagcatagagacatgcctcgaactacacaggtagcctcaaggctgaaatgtgcccgggcctcctgcaagaacattctggcctgtcgcagtgaggaactctgtatggagtgccagcacctaagccaacgagtaggttctgtggcccaccggggtgagcccacgcctgaagagccccctaaacagcgctgccgggcccctgcttgtgatcactttggcaatgccaagtgtaatggttactgcaatgagtgctaccagttcaagcagatgtatggctaaSEQ ID No.48MAEQLLPQALYLSNMRKAVKIRERTPEDIFKPTNGIIYHFKTMHRYTLEMFRTCQFCPQFREIIHKALIDRSVQASLESQKKLNWCREVRKLVALKTNGDGNCLMHAACQYMWGVQDTDLVLRKALCSTLKETDTRNFKFRWQLESLKSQEFVETGLCYDTRNWNDEWDNLVKMASADTPAARSGLQYNSLEEIHIFVLSNILRRPIIVISDKMLRSLESGSNFAPLKVGGIYLPLHWPAQECYRYPIVLGYDSQHFVPLVTLKDSGPELRAVPLVNRDRGRFEDLKVHFLTDPENEMKEKLLKEYLIVMEIPVQGWDHGTTHLINAAKLDEANLPKEINLVDDYFELVQHEYKKWQENSDQARRAAHAQNPLEPSTPQLSLMDIKCETPNCPFFMSVNTQPLCHECSERRQKNQSKLPKLNSKLGPEGLPGVGLGSSNWSPEETAGGPHSAPPTAPSLFLFSETTAMKCRSPGCPFTLNVQHNGFCERCHARQINASHTADPGKCQACLQDVTRTFNGICSTCFKRTTAEPSSSLTSSIPASCHQRSKSDPSQLIQSLTPHSCHRTGNVSPSGCLSQAARTPGDRAGTSKCRKAGCMYFGTPENKGFCTLCFIEYRENKQSVTASAKAGSPAPRFQNNVPCLGRECGTLGSTMFEGYCQKCFIEAQNQRFHEARRTEEQLRSSQHRDMPRTTQVASRLKCARASCKNILACRSEELCMECQHLSQRVGSVAHRGEPTPEEPPKQRCRAPACDHFGNAKCNGYCNECYQFKQMYGSEQ ID No.49ttttttttcatacttgataaaattttatttaaaaaaaaagagaataataatttatacccttgacaaaataaaagatcttataatataaatgtttcttagaaaatatatgaaaagataatattacaaatattaataaatcaatattcacatgacagcaaaagtggcaatgattctacaagaaggtgaggaggaagatgctttccggtccgcagcaatgtctctggagaggcctcctgtcccttctttctccttcaatgaggtgtgctcctattttaagaaaacctgatacaagcagatctaatcagtttaggaagctggtatttatttgcaccgcaaaataatttttttacaaaaaaaattctatcaaggatcctttaaatatcaagtttcccaatgcacttagaatacagttaaccaaatttacaagtcttcgacttctctctggtgtagctctaccgcanggcgtgaggtattgctgaagtgagtgcgtgcgtccgtg
權利要求
1.編碼一種蛋白質的分離的多核苷酸，該蛋白質調節促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)信號化，所述蛋白質具有選自SEQNO.46和SEQ ID NO.48的胺基酸序列。
2.根據權利要求1的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸是mRNA、DNA或cDNA。
3.編碼一種蛋白質的分離的多核苷酸，該蛋白質調節促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)信號化，所述多核苷酸含有選自SEQ ID No.45、SEQ ID No.47和SEQ ID No.49的核酸序列。
4.編碼一種蛋白質的分離的多核苷酸，該蛋白質調節促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)信號化，所述多核苷酸由選自SEQ ID No.45、SEQ ID No.47和SEQ ID No.49的核酸序列組成。
5.編碼一種蛋白質的分離的多核苷酸，該蛋白質調節促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)信號化，所述蛋白質包含選自SEQ IDNO.46和SEQ ID NO.48的胺基酸序列。
6.含有根據權利要求1到4任一項的分離的多核苷酸的載體。
7.根據權利要求6的載體，其中多核苷酸可操作地連接到表達控制序列。
8.能夠表達調節促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)信號化的蛋白質的宿主細胞，所述蛋白質具有選自SEQ ID NO.46和SEQ IDNO.48的胺基酸序列。
9.用含有調節序列的載體轉染的根據權利要求8的宿主細胞。
10.用根據權利要求6或7的載體轉染的根據權利要求8的宿主細胞。
11.鑑定能夠改變細胞中CRH信號化應答的化合物的方法，所述方法包括a)所述化合物存在和不存在時將所述細胞與CRH接觸；b)確定調節所述細胞中促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)信號化的至少一種蛋白質的量；和c)比較在所述化合物存在和不存在時所述蛋白質的量；其中，調節促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)信號化的蛋白質選自SEQID NO.2、SEQ ID 4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48。
12.根據權利要求11的方法，其中細胞是真核細胞，如鼠垂體促腎上腺皮質激素細胞來源的腺瘤細胞系AtT-20。
13.根據權利要求11或12的方法，其中使用抗體確定調節CRH信號化的蛋白質的量，該抗體結合含有選自SEQ ID NO.2、SEQ ID4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48的胺基酸序列的多肽。
14.根據權利要求11或12的方法，其中通過評估一種基因的基因轉錄水平確定調節CRH信號化的蛋白質的量，該基因編碼選自SEQID NO.2、SEQ ID 4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48的胺基酸序列。
15.根據權利要求14的方法，其中使用探針評估基因轉錄的水平，該探針結合編碼選自SEQ ID NO.2、SEQ ID 4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48的胺基酸序列的多核苷酸。
16.根據權利要求14或15的方法，其中使用微陣列技術分析基因表達的水平。
17.根據權利要求16的方法，其中使用寡核苷酸探針的陣列評估基因表達水平，所述探針結合編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO.2、SEQ ID 4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48的多肽組的多核苷酸。
18.鑑定能夠改變細胞中CRH信號化應答的化合物的方法，所述方法包括a)在受試化合物存在和不存在時接觸所述細胞；和b)確定編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO.2、SEQ ID 4、SEQID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ IDNO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48的多肽的基因的表達水平。
19.根據權利要求18的方法，其中使用寡核苷酸探針的陣列確定基因的表達水平，所述探針結合具有核酸序列SEQ ID No.1、SEQID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO 13、SEQ ID No.15、SEQ ID No 17、SEQ ID No 19、SEQID No.21、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQID No.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID No.33、SEQ ID No.35、SEQID No.37、SEQ ID No.39、SEQ ID No.41、SEQ ID No.43、SEQID No.45、SEQ ID No.47和SEQ ID No.49的多核苷酸。
20.鑑定能夠改變細胞中CRH信號化應答活性的化合物的方法，所述方法包括a)將表達含有選自SEQ ID NO.2、SEQ ID 4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48的胺基酸序列的至少一種蛋白質的細胞與所述受試化合物接觸；和b)比較所述化合物存在和不存在時所述細胞的CRH應答活性。
21.根據權利要求20的方法，其中細胞表達具有胺基酸序列SEQ ID NO.2、SEQ ID 4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48的蛋白質組。
22.根據權利要求21的方法，其中CRH應答活性被評估為基因水平上轉錄的變化。
23.根據權利要求21或22的方法，其中使用微陣列技術評估CRH應答活性。
24.根據權利要求20到23任一項的方法，其中細胞是能夠表達具有選自SEQ ID NO.2、SEQ ID 4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48的胺基酸序列的至少一種蛋白質的宿主細胞。
25.根據權利要求24的方法，其中宿主細胞被含有調節序列的至少一種載體轉染。
26.根據權利要求24的方法，其中宿主細胞被含有編碼選自SEQ ID NO.2、SEQ ID 4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48的胺基酸序列的多核苷酸序列的至少一種載體轉染。
27.診斷個體中CRH誘導的抑鬱症的方法，所述方法包括a)得到所述個體的生物樣品；和b)確定所述生物樣品中調節促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)信號化的至少一種蛋白質的量；其中調節促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)信號化的蛋白質選自SEQ ID NO.2、SEQ ID 4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48。
28.根據權利要求27的方法，其中生物樣品是體液或組織樣品。
29.根據權利要求27或28的方法，其中使用抗體確定調節CRH信號化的蛋白質的量，該抗體結合含有選自SEQ ID NO.2、SEQ ID4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48的胺基酸序列的多肽。
30.根據權利要求27或28的方法，其中通過評估一種基因的基因轉錄水平來確定調節CRH信號化的蛋白質的量，該基因編碼選自SEQ ID NO.2、SEQ ID 4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48的胺基酸序列。
31.根據權利要求3O的方法，其中使用探針評估基因轉錄的水平，該探針結合編碼選自SEQ ID NO.2、SEQ ID 4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48的胺基酸序列的多核苷酸。
32.根據權利要求30或31的方法，其中使用微陣列技術分析基因轉錄的水平。
33.根據權利要求32的方法，其中使用寡核苷酸探針的陣列分析基因轉錄水平，所述探針結合編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO.2、SEQ ID 4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.48的多肽組的多核苷酸。
34.根據權利要求32的方法，其中使用寡核苷酸探針的陣列分析基因轉錄的水平，這些探針結合具有核酸序列SEQ ID No.1、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO 13、SEQ ID No.15、SEQ ID No 17、SEQ ID No 19、SEQID No.21、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQID No.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID No.33、SEQ ID No.35、SEQID No.37、SEQ ID No.39、SEQ ID No.41、SEQ ID No.43、SEQID No.45、SEQ ID No.47和SEQ ID No.49的多核苷酸。
全文摘要
本發明一般涉及抑鬱症的治療和診斷。具體地，本發明涉及多肽以及編碼這些多肽的多核苷酸，其中所述多肽表現出在介導促腎上腺皮質激素釋放激素的細胞應答中起主要作用。這些多肽和多核苷酸可用於抑鬱症的診斷、治療和/或預防。
文檔編號C07K14/435GK1708511SQ200380102546
公開日2005年12月14日 申請日期2003年10月23日 優先權日2002年10月31日
發明者P·J·彼得斯, H·W·H·格爾曼, S·M·A·斯瓦格馬克斯, F·L·P·費倫斯 申請人:詹森藥業有限公司