用於靶向遞送(包括負載物的透皮遞送)的多孔納米顆粒支撐的脂質雙層(原始細胞)及其方法

2023-05-15 15:41:26

用於靶向遞送(包括負載物的透皮遞送)的多孔納米顆粒支撐的脂質雙層(原始細胞)及其方法【專利摘要】本發明涉及特異性靶向肝細胞和其它癌細胞的原始細胞，其包含：1)具有受支撐的脂質雙層的納米多孔二氧化矽核、至少一種促進癌細胞死亡的藥劑(例如傳統小分子、大分子負載物(例如，siRNA或蛋白質毒素，如蓖麻毒素A鏈或白喉毒素A鏈)，和/或在納米多孔二氧化矽核中處理的(優選超螺旋的以更有效地將DNA封裝入原始細胞)的組蛋白封裝的質粒DNA，所述納米多孔二氧化矽核任選地經核定位序列修飾以有助於在癌細胞的細胞核內定位原始細胞和表達以下肽的能力：涉及癌細胞治療(細胞凋亡/細胞死亡)的肽，或作為報告子，一種靶向待治療組織中的癌細胞從而使得原始細胞和靶細胞的結合是特異性的和增強的靶向肽和一種促進原始細胞和包封的負載物(包括DNA)的內體逃逸的融合肽)。本發明的原始細胞可用於治療癌症，尤其包括使用選擇性結合肝細胞組織的新型結合肽(c-MET肽)治療肝細胞(肝)癌，或者用於癌症診斷，包括癌症治療和藥物發現。【專利說明】用於靶向遞送(包括負載物的透皮遞送)的多孔納米顆粒支撐的脂質雙層(原始細胞)及其方法[0001]相關申請和政府支持[0002]本發明要求於2011年10月14日提交的、名為「EngineeringNanoporousParticle-SupportedLipidBilayersforTransdermalCargoDelivery，，的美國臨時申請61/547，402;於2011年12月21日提交的名為「EngineeringNanoporousParticle-SupportedLipidBilayersforTransdermalCargoDelivery，，的美國臨時申請61/578，463的優先權，其全部內容在此引入作為參考。[0003]本申請還要求於2011年12月19日提交的、名為「DeliveryofTherapeuticMacromolecularCargosbyTargetedProtocells，，的美國臨時申請61/577，410的優先權，其全部內容在此引入作為參考。[0004]本發明是由政府支持在美國國立衛生研究院批准號PHS2PN2EY016570B、美國國立癌症研究院批准號1U01CA151792-01、美國空軍科學研究室批准號FA9550-07-1-0054/9550-10-1-0054、美國國家環境衛生科學研究院(NIEHS)的1U19ES019528-01、美國國家科學基金會NSF:EF-0820117和美國國家科學基金會的DGE-0504276下作出的。美國政府對本申請擁有某些權利。發明領域[0005]本發明的實施方案涉及特異性靶向患者體內細胞的原始細胞，尤其包括含有以下的肝細胞和其它癌細胞:1)納米多孔二氧化矽或金屬氧化物核；2)受支撐的脂質雙層；3)至少一種促進癌細胞死亡的藥劑(例如傳統小分子、大分子負載物(siRNA、shRNA、其它微RNA,或蛋白質毒素,如蓖麻毒素A鏈或白喉毒素A鏈)，和/或DNA,包括雙鏈或線性DNA,質粒DNA，其可以是超螺旋和/或經如組蛋白封裝並在納米多孔二氧化矽核中處理的(優選超螺旋的以更有效地將DNA封裝入原始細胞)，所述納米多孔二氧化矽核任選地經核定位序列修飾以有助於在癌細胞的細胞核內定位原始細胞和表達以下肽的能力:涉及癌細胞治療(細胞凋亡/細胞死亡)的肽，或作為報告子，一種靶向待治療組織中的癌細胞從而使得原始細胞和靶細胞的結合更特異性和增強的靶向肽和一種促進原始細胞和包封的負載物(包括DNA)的內體逃逸的融合肽)。本發明的原始細胞可用於治療癌症，尤其包括使用選擇性結合肝細胞組織的新型結合肽治療肝細胞(肝)癌，或者用於癌症診斷，包括癌症治療和藥物發現。[0006]在一些實施方案中，本發明的原始細胞促進多種活性成分的遞送。顯著地，這些原始細胞有效地增強角質層通透性並使包括大分子的活性成分透皮遞送。[0007]在一些實施方案中，本發明提供了穩定的、疏水性的和超疏水性的多孔納米顆粒，其用於在環境如胃中遞送多種活性成分。[0008]在一些其它實施方案中，本發明提供了用於遞送多種活性成分的透皮原始細胞，所述原始細胞包含多個裝載有siRNA的中孔納米顆粒二氧化娃核,其中所述siRNA誘導NiV核殼體蛋白(NiV-N)mRNA的序列特異性降解，和促進胃中多種活性成分遞送的胃上浮(gastrically-buoyant)原始細胞。[0009]發明背景[0010]包封在納米載體內的藥物的靶向遞送可潛在地改善常規「游離」藥物所呈現的多種問題，包括不良的溶解性、有限的穩定性、快速的清除，和尤其地缺乏選擇性，其導致對正常細胞的非特異性毒性並妨礙清除患病細胞所需的劑量爬升。被動靶向方案(其依賴於增強的腫瘤脈管系統通透性和降低的腫瘤淋巴系統的引流效能以在腫瘤位點直接蓄積納米載體(所謂的增強的通透性和滯留，或EPR效應))克服了很多上述問題，但誘導納米載體細胞內攝作用所需的細胞特異性相互作用的缺乏降低了治療效果並可導致藥物排出和誘導多重耐藥性。[0011]納米藥物的一個挑戰是越過細胞膜在高濃度下操縱可有效包封負載物(例如藥物)的納米結構和材料，並在規定時間內在靶點處可控地釋放所述藥物。最近，無機納米顆粒已成為納米藥物中新一代藥物或治療遞送載體。更最近，採用香豆素、偶氮苯、輪烷、聚合物或納米顆粒的門控方法已被開發用於在顆粒內密封負載物並允許根據光學或電化學刺激觸發的釋放。[0012]儘管脂質體由於其低免疫原性和低毒性已被廣泛用於藥物遞送中，它們仍需要在若干方面進行改善。首先，負載物的裝載僅可在製備脂質體的條件下實現。因此，負載物的濃度和種類可能受限制。其次，脂質體的穩定性相對較低。脂質體的脂質雙層經常趨向老化和融合，這改變了脂質體的大小和大小分布。第三，在脂質體破裂時，脂質體中負載物的釋放是瞬時的，從而使得很難控制釋放。[0013]多孔納米顆粒支撐的脂質雙層(原始細胞)(通過脂質體與納米多孔二氧化矽顆粒的融合形成)是一種新型的納米載體，其解決了與癌症治療和診斷靶向遞送相關的多種挑戰。與脂質體類似，原始細胞是生物相容的、生物可降解的和非免疫原性的，但與類似大小的脂質體遞送劑相比，其納米多孔二氧化矽核賦予了極大增加的負載物容量並延長了雙層的穩定性。可進一步調節該核的孔隙率和表面化學以促進多種治療劑如藥物、核酸和蛋白質毒素的包封。可通過該核的孔徑、化學組成和二氧化矽的總壓縮度來控制負載物的釋放率，使得原始細胞可用於需要突然釋放或控制釋放特點的應用中。最後，該原始細胞的受支撐的脂質雙層(SLB)可經不同配體的修飾以促進選擇性遞送並經PEG修飾以延長循環時間。[0014]改善化療劑活性和增強癌症治療的需要一直存在。使用原始細胞與替代方法的結合以靶向、結合、促進癌症的侵襲並使化療劑在接近其活性位點處滯留是癌症療法的重要方面。進行本發明以推進癌症治療領域並且通過增強癌症治療劑的給藥或診斷改善可影響治療結果的藥劑的遞送，促進診斷癌症和監測癌症治療的方法。[0015]還需要透皮遞送載體，其經設計最適地穿透角質層以促進此前受限於通過其它較劣勢途徑給藥的活性成分的遞送。[0016]發明目的[0017]本發明的目的涉及提供對原始細胞技術，對原始細胞本身，對包含此類原始細胞的藥物組合物的改善以及將本發明的原始細胞和藥物組合物用於治療和診斷(包括監測治療)的方法。[0018]本發明實施方案的另外的目的涉及新型MET結合肽，其用於本發明其它實施方案的藥物組合物和方法。[0019]從本說明書呈現的描述的概覽，可容易地悉知本發明的這些和/或其它目的。[0020]發明概述[0021]本發明的實施方案涉及特異性靶向細胞(尤其是肝細胞和其它癌細胞)的原始細胞。[0022]在一些方面，本發明涉及靶向細胞的多孔原始細胞，其包含具有受支撐的脂質雙層的納米多孔二氧化矽或金屬氧化物核和至少一種選自以下的其它組分:[0023]靶向細胞的物種；[0024]促進原始細胞內體逃逸的融合肽；[0025]和包封的DNA，以及包含至少一種選自以下的負載物組分的其它負載物:[0026]雙鏈線性DNA或質粒DNA；[0027]藥物；[0028]顯像劑；[0029]小幹擾RNA、小髮夾RNAJiRNA或其組合；[0030]其中所述負載物組分的一種任選地進一步與核定位序列綴合。[0031]在一些實施方案中，本發明實施方案的原始細胞包含具有受支撐的脂質雙層的納米多孔二氧化矽核、包含任選促進癌細胞死亡的至少一種治療劑的負載物例如傳統小分子、大分子負載物(例如siRNA，如S565、S7824和/或S10234，其中，shRNA或蛋白質毒素，如蓖麻毒素A鏈或白喉毒素A鏈)和/或在納米多孔二氧化矽核中處理的(優選超螺旋的以更有效地將DNA封裝入原始細胞)封裝質粒DNA(在一些實施方案中為組蛋白封裝的)，所述納米多孔二氧化矽核任選地經核定位序列修飾以有助於在癌細胞的細胞核內定位或呈現該質粒和表達涉及癌細胞治療(例如癌細胞的細胞凋亡/細胞死亡)的肽的能力，或作為報告子(綠色螢光蛋白、紅色螢光蛋白，其中，本文另有描述)用於診斷應用。本發明的原始細胞包含祀向治療細胞(組織中待治療的癌細胞)從而使得該原始細胞與祀細胞的結合是特異性的和增強的靶向肽，以及促進原始細胞和包封DNA的內體逃逸的融合肽。本發明的原始細胞可用於治療和診斷，更具體地用於治療癌症和其它疾病，包括病毒感染，尤其包括肝細胞(肝)癌。在本發明的其它方面，原始細胞使用選擇性結合癌組織(包括肝細胞、卵巢和宮頸癌組織，除外其它組織)的新型結合肽(MET結合肽，本文另有描述)用於癌症的治療和/或診斷，包括癌症治療和藥物發現的監測。[0032]在一方面，本發明實施方案的原始細胞包括多孔納米顆粒原始細胞，其常包含具有受支撐的脂質雙層的納米多孔二氧化矽核。在本發明的該方面，該原始細胞包含靶向肽，其常為本文另有描述的MET受體結合肽，常與該原始細胞表面上的融合肽結合。該原始細胞可裝載有多種治療性和/或診斷性負載物，包括例如小分子(治療性和/或診斷性的，尤其包括抗癌和/或抗病毒劑(用於治療HBV和/或HCV))，大分子包括多肽和核酸(包括RNA(shRNA和siRNA)或包含核定位序列的超螺旋和組蛋白封裝的質粒DNA，其可以是治療性的和/或診斷性的(包括報告子分子，如螢光肽，其中包括綠色螢光蛋白/FGP、紅色螢光蛋白/FRP)。[0033]本發明的透皮實施方案包括含有以下多孔納米顆粒的原始細胞:(a)裝載有一種或多種藥學活性劑和(b)被脂質雙層包封並支撐脂質雙層，其中所述脂質雙層包含一種或多種選自以下的角質層通透性促進劑:單飽和ω-9脂肪酸(油酸、反油酸、二十碳烯酸、二十碳三烯酸(meadacid)、芥酸和神經酸,最優選油酸)、醇、二醇(最優選聚乙二醇(PEG))、R8肽和膜軟化劑(edgeactivator)如膽鹽、聚氧乙烯酯和聚氧乙烯醚、單鍊表面活性劑(例如去氧膽酸鈉)，且其中該原始細胞具有的平均直徑為約50nm至約300nm，更優選約55nm至約270nm,更優選約60nm至約240nm、更優選約65nm至約210nm、更優選約65nm至約190nm、更優選約65nm至約160nm、更優選約65nm至約130nm、更優選約65nm至約lOOnm、更優選約65nm至約90nm、更優選約65nm至約80nm、更優選約65nm至約75nm、更優選約65nm至約66、67、68、69、70、71、72、73、74或75nm、最優選約70nm。[0034]因此，在一方面，本發明提供了包含大量多孔納米顆粒的透皮原始細胞，所述多孔納米顆粒:(a)裝載有一種或多種藥學活性劑和(b)被脂質雙層包封並支撐脂質雙層，其中所述脂質雙層包含一種或多種選自以下的角質層通透性促進劑:單飽和ω-9脂肪酸、醇、二醇、溶劑、共溶劑、滲透促進肽和核苷酸以及膜軟化劑(edgeactivator),其中該原始細胞的平均直徑為約50nm至約300nm。該單飽和ω-9脂肪酸可選自油酸、反油酸、二十碳烯酸、二十碳三烯酸、芥酸和神經酸，最優選油酸，和其混合物。該醇可選自甲醇、乙醇、丙醇和丁醇，以及它們的混合物，且該溶劑和共溶劑可選自PEG400和DMS0。該二醇可選自乙二醇和丙二醇，以及它們的混合物。該膜軟化劑可選自膽鹽、聚氧乙烯酯和聚氧乙烯醚、單鍊表面活性劑，以及它們的混合物。在一項優選實施方案中，該膜軟化劑為去氧膽酸鈉。[0035]與口服和胃腸外途徑相比，透皮給藥途徑是一種更優途徑。口服給予的藥物經歷首過代謝並可具有與食物和消化道寬PH範圍的不良相互作用。胃腸外給藥痛苦，產生生物有害性廢物並且不能自行給藥。透皮藥物遞送解決了所有與口服和胃腸外途徑有關的上述問題。此外，透皮遞送系統(TDDS)允許持續數天的可控釋放曲線。然而，與透皮藥物遞送有關的主要挑戰存在於皮膚表皮的最外層-角質層。由於角質層的結構類似於「磚泥結構(brickandmortar)」，其賦予了皮膚屏障功能。「磚」由富含蛋白質、糖蛋白、脂肪酸和膽固醇的扁平的角質細胞組成。包含「泥」的細胞間隙富含由神經醯胺、膽固醇、脂肪酸組成的雙層，並展現類似於丁醇的極性。在過去40年中，已經開發了3代TDDS。第一代系統利用低分子量親脂性化合物的擴散。第二代和第三代系統認識到角質層的通透性是關鍵。這些策略除去/繞過角質層或利用化學促進劑、生化促進劑和電動勢來增加角質層的通透性。在不同的促進策略中，已顯示脂質體可破壞角質層高度有序的結構並隨後增加皮膚的通透性。[0036]在本文的一項實施方案中，描述了納米多孔顆粒支撐的脂質雙層(「原始細胞」)的開發，以用作TDDS。原始細胞通過將脂質體靜電融合至納米多孔二氧化矽顆粒核而形成。它們協同地結合了無機納米顆粒和脂質體的優點，如可調的孔隙率、能夠高容量裝載不同類型負載物的高表面積，和具有可調的流動性的受支撐的脂質雙層(SLB)(其可經多種分子修飾)。這些生物物理學和生物化學性質使得該原始細胞可被修飾用於不同的應用。在我們的前期研究中，使用電感耦合等離子體質譜，我們表明0.1-0.5重量％我們的標準原始細胞製劑(55%D0PE、30%膽固醇、15%PEG-2000)以8.125mg給藥能夠穿過患者衍生的全層腹部皮膚。此外，我們證明0.3-2.4重量％原始細胞能夠穿過角質層已被除去的斷層皮膚。[0037]所述透皮原始細胞的納米多孔二氧化矽顆粒核具有高表面積、易變的孔隙率和易於修飾的表面化學。這些性質使得原始細胞核能夠高容量裝載多種不同類型的負載物。所述原始細胞的受支撐的脂質雙層(SLB)具有固有的低免疫原性。此外，SLB提供可與肽、聚合物和其它分子綴合的液體表面從而促進靶細胞攝取。這些生物物理學和生物化學性質使得原始細胞對特定環境最優化，促進其穿透進入角質層並隨後經透皮途徑遞送不同類型的負載物。治療癌症的方法是本發明透皮原始細胞治療用途的一個實例。還描述了相關的藥物組合物。[0038]在一項實施方案中，本發明提供了原始細胞，其包含可經含胺矽烷如N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基矽烷(AEPTMS)修飾的大量帶負電荷的、納米多孔的、納米顆粒的二氧化矽核，所述二氧化矽核(a)裝載有siRNA或蓖麻毒素A鏈和(b)被脂質雙層包封並支撐脂質雙層，所述脂質雙層包含一種或多種選自以下的脂質:1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)、I,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1，2-二油醯基_sn_甘油_3_[磷-L-絲氨酸](DOPS)、1，2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸化_(1』-rac-甘油)(DOPG)U,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、I,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N_[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油醯基-2-[12-[(7-硝基-2-1，3-苯並噁二唑-4-基)氨基]月桂醯基]-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(18:1-12:ONBDPC)U-棕櫚醯基-2-{12-[(7-硝基-2-1，3-苯並噁二唑_4_基)氨基]月桂醯基}-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(16:0-12:0NBDPC)、膽固醇和其混合物/組合，且其中所述脂質雙層包含陽離子脂質和一種或多種兩性離子磷脂。[0039]在前述章節的實施方案中，所述脂質優選選自1，2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)或1,2-二油醯基-sn-甘油_3_磷酸化-0--rac-甘油)(DOPG)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和其混合物，且所述原始細胞具有至少一個以下特徵:BET表面積大於約600m2/g、孔體積分數為約60%至約70%、由具有平均直徑為約20nm至約30nm的孔組成的多模式孔形態學、通過具有平均直徑為5nm至約15nm的孔互相連接的表面可及的孔。優選地，所述原始細胞每101°納米顆粒二氧化娃核包封約IOnMsiRNA。[0040]在另一項實施方案中，本發明提供了原始細胞，其包含可經含胺矽烷如AEPTMS修飾的大量帶負電荷的、納米多孔的、納米顆粒的二氧化矽核，所述二氧化矽核(a)裝載有一種或多種靶向周期蛋白超家族成員(其選自細胞周期蛋白A2、細胞周期蛋白B1、細胞周期蛋白Dl和細胞周期蛋白E)的siRNA;和(b)被脂質雙層包封並支撐脂質雙層，所述脂質雙層包含一種或多種選自以下的脂質:1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)、I,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)U,2-二油醯基-sn-甘油_3_[磷-L-絲氨酸](DOPS)U,2-二油醯基_3_三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)、1，2-二油醯基-sn-甘油_3_磷酸化-0--rac-甘油)(DOPG)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:lPEG-2000PE)、l，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)U-油醯基~2-[12-[(7~硝基-2-1,3-苯並噁二唑~4~基)氨基]月桂醯基]-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(18:1-12:ONBDPC)U-棕櫚醯基_2_{12-[(7-硝基-2-1，3-苯並噁二唑-4-基)氨基]月桂醯基}-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(16:0-12:ONBDPO、膽固醇和其混合物/組合，且其中(I)所述脂質雙層裝載有SP94和內體裂解肽，和(2)所述原始細胞選擇性的與肝細胞癌細胞結合。[0041]在前述章節的實施方案中，所述脂質雙層優選包含約為55:5:30:10質量比的D0PC/D0PE/膽固醇/PEG-2000。[0042]治療癌症如肝癌的方法是本發明AEPTMS修飾的原始細胞治療用途的一個實例。還描述了相關藥物組合物。[0043]在另一項實施方案中，本發明提供包含大量納米多孔的、納米顆粒二氧化矽核的原始細胞，所述二氧化矽核:(a)裝載有誘導Nipah病毒(Niv)核殼體蛋白(NiV-N)mRNA序列特異性降解的siRNA，和(b)被脂質雙層包封並支撐脂質雙層，所述脂質雙層包含一種或多種選自以下的脂質:1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(D0PC)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)、1，2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-[磷-L-絲氨酸](DOPS)、1，2-二油醯基_3_三甲基銨-丙烷(18:10(^卩)、1，2-二油醯基-811-甘油-3-磷酸化-(1』-以(3-甘油)(D0PG)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1，2-二油醯基-sn-甘油_3_磷酸乙醇胺_N_[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油_3_磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)U-油醯基_2-[12-[(7_硝基-2-1,3-苯並噁二唑~4~基)氨基]月桂醯基]-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(18:1-12:ONBDPC)U-棕櫚醯基_2_{12-[(7-硝基-2-1，3-苯並噁二唑-4-基)氨基]月桂醯基}-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(16:0-12:ONBDPC)、膽固醇和其混合物/組合。[0044]在前述章節的原始細胞的一些實施方案中，所述脂質雙層包含1，2_二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC),1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、聚乙二醇(PEG)、靶向肽、和R8，且所述中孔、納米顆粒二氧化矽核各自平均直徑為約lOOnm，平均表面積大於1，OOOmVg和平均直徑為約20nm至約25nm的表面可及的孔，並且每101°顆粒裝載約IμΜsiRNA或更多。所述靶向肽優選為結合ephrinΒ2(ΕΒ2)的肽，且最優選為TGAILHP(SEQIDNO:18)。[0045]最優選地，所述原始細胞包含約0.01至約0.02重量的TGAILHP、約10重量％的PEG-2000和約0.500重量％的R8。[0046]治療被Nipah病毒(NiV)感染或有NiV感染風險的受試者的方法是本發明包含誘導Nipah病毒(NiV)核殼體蛋白(NiV-N)mRNA序列特異性降解的siRNA的原始細胞治療用途的一個實例。還描述了相關的藥物組合物。[0047]本發明實施方案的其它方面涉及藥物組合物。本發明的藥物組合物包含原始細胞群，其可以是相同或不同的並且與藥學上可接受的載體、添加劑或賦形劑組合配製。所述原始細胞可單獨配製或與另一種生物活性劑(如額外的抗癌劑或抗病毒劑)組合配製，取決於所治療的疾病和給藥途徑(本文另有描述)。這些組合物包含經修飾用於特定目的(例如，治療，包括癌症治療，或診斷，包括癌症治療的監測)的原始細胞。藥物組合物包含有效群體的原始細胞與藥學上可接受的載體、添加劑或賦形劑組合用於特定目的和給藥途徑。[0048]本發明的實施方案還涉及利用本文所述的新型原始細胞的方法。因此，在替代實施方案中，本發明涉及治療疾病和/或病症的方法，其包括向有需要的患者或受試者給予有效量的本文另有描述的藥物組合物。本發明的藥物組合物具體地用於治療多種疾病狀態，尤其包括癌症和繼發於癌症或為癌症起因的疾病狀態或病症(具體地，HBV和/或HCV感染)。[0049]在其它替代方面，本發明涉及診斷癌症的方法，所述方法包括給予包含原始細胞群的藥物組合物，所述原始細胞經修飾以遞送對癌細胞具有選擇性的診斷劑或報告子顯像劑從而確定患者的癌症。在該方法中，本發明的原始細胞可通過包含至少一種與癌細胞結合的靶向肽以適於靶向癌細胞，所述癌細胞表達多肽或更普遍地，表達表面受體或細胞膜組分，其為所述靶向肽的目標，並且通過包含靶向所述癌細胞的原始細胞的報告子組分(包括顯像劑)，可用於通過與具有標準信號的報告子比較信號確認患者或受試者中癌性組織的存在和大小。所述標準信號可例如自健康患者或作出診斷的已知具有疾病的患者的群體獲得。一旦診斷，可實施含有本發明藥物組合物的適當治療或替代治療。[0050]在本發明的其它方面，本發明的組合物可用於監測特定疾病狀態和/或病症的治療過程，包括含有本發明組合物的治療。在本發明的該方面，可向正在進行治療的患者或受試者給予包含特異性結合癌細胞並含有報告子組分的原始細胞群的組合物從而可監測所述疾病狀態治療的進展。[0051]本發明的替代方面涉及五(5)種新型MET結合肽，本文另有描述，其可因在多種癌細胞(包括肝細胞、宮頸和卵巢細胞，在癌性組織為數眾多的其它細胞中)中結合MET蛋白的優勢用作本發明一些實施方案的原始細胞上的靶向肽或用於藥物組合物中。本發明的一項實施方案涉及五(5)種不同的7肽，其顯示作為MET受體(也稱為肝細胞生長因子受體，由c-MET基因表達)的新型結合肽活性。這五(5)種7肽如下:[0052]ASVHFPP(Ala-Ser-Val-His-Phe-Pro-Pro)SEQIDNO:1[0053]TATFffFQ(Thr-Ala-Thr-Phe-Trp-Phe-Gln)SEQIDNO:2[0054]TSPVALL(Thr-Ser-Pro-Val-Ala-Leu-Leu)SEQIDNO:3[0055]IPLKVHP(Ile-Pro-Leu-Lys-Val-His-Pro)SEQIDNO:4[0056]WPRLTNM(Trp-Pro-Arg-Leu-Thr-Asn-Met)SEQIDNO:5[0057]這些肽的每一種可單獨使用或與上述組內的其它MET結合肽或一系列其它靶向肽(例如，如本文所述的SP94肽)(其可協助將本發明實施方案的原始細胞與癌細胞(包括肝細胞癌細胞、卵巢癌細胞、乳腺癌細胞和宮頸癌細胞，在無數癌細胞中)結合)組合使用。這些結合肽還可單獨作為MET結合肽用於藥物組合物以治療癌症和在其它方面抑制肝細胞生長因子結合受體。這些肽可單獨配製或與其它生物活性劑組合配製以提供預期結果。藥物組合物包含與藥學上可接受的載體、添加劑或賦形劑組合的有效量的上文確認的五(5)種MET結合肽中的至少一種，任選與額外的生物活性劑(其可包括抗癌劑、抗病毒劑或其它生物活性劑)組合。[0058]附圖簡述[0059]圖1顯示可改變本發明所用的一項實施方案的納米顆粒(其通過氣溶膠輔助EISA方法製備)以控制顆粒大小和分布。[0060]圖2顯示根據一項實施方案經設計定製用於多種類型負載物的孔徑和框架並且氣溶膠化輔助組分易於滲入。[0061]圖2A顯示圖2的a、b、c和e是被CTAB、B58、P123和PS+B56模板化的。A、B、D和E是被CTAP+NaCl、3%重量P123、3%重量P123+聚(丙二醇丙烯酸酯)、微乳劑和CTAB(NH4)2SO4模板化的。[0062]圖3顯不孔表面化學(即，電荷和疏水性)和孔徑主要由有機矽烷和娃酸的共縮合通過一項實施方案的共自組裝或後自組裝衍生控制。參見Lin等人，Chem.Mater.15，4247-562003；Liu,J.等人，J.Phys.Chem.，104，8328-2339，2000；Fan,H.等人，Nature,405，56-60，2000和Lu,Y.等人，J.Am.Chem.Soc.，122，5258-5261，2000。[0063]圖4描述了使用組蛋白封裝CBl質粒。[0064](A)示意圖描述了用於將CBl質粒(pCBl)超螺旋，使用H1、H2A、H2B、H3和H4封裝超螺旋PCB1，並使用促進通過核孔易位的核定位序列(NLS)修飾所得pCBl-組蛋白複合物的方法。(B)和⑶CBl質粒⑶和組蛋白封裝的pCBl(D)的原子力顯微鏡(AFM)圖像。比例尺=lOOnm。(C)和(E)分別對應於⑶和(D)中紅線的高度剖面圖。[0065]圖5描述了裝載有組蛋白封裝的pCBl的MC40-靶向中孔二氧化矽納米顆粒支撐的脂質雙層(原始細胞)的合成。(A)示意圖描述了用於生成DNA-裝載的、肽靶向的原始細胞的方法。通過簡單地將顆粒浸入PCBl-組蛋白複合物溶液中將組蛋白-封裝的pCBl裝載至形成原始細胞核的中孔二氧化矽顆粒中。然後將PEG化的脂質體與DNA-裝載的核融合以形成受支撐的脂質雙層(SLB)(其進一步經結合HCC的靶向肽(MC40)和促進內化原始細胞內體逃逸的內體裂解肽(H5WYG)修飾)。巰基-胺交聯子(間隔臂=9.5nm)用於將經C-端半胱氨酸殘基修飾的肽綴合至SLB的DOPE部分。(B)可用作原始細胞核的中孔二氧化矽納米顆粒的透射電子顯微鏡圖像。比例尺=200nm。插入圖=掃描電子顯微鏡(SEM)圖像，其證明15_25nm孔是表面可及的。插入圖比例尺=50nm。(C)中孔二氧化娃納米顆粒的大小分布，其由動態光散射(DLS)測定。(D，左軸)中孔二氧化矽納米顆粒的累積孔體積圖，其使用Barrett-Joyner-Halenda(BJH)模型由圖S-4A所示的氮吸附等溫線的吸附支計算得到。Φ，右軸)pCBl-組蛋白複合物的大小分布，其通過DLS測定。[0066]圖6顯示中孔二氧化矽納米顆粒對組蛋白封裝的pCBl具有高容量，且根據一項實施方案，所得的原始細胞僅在模擬內體環境的條件下釋放包封的DNA。(A)可包封在未經修飾的中孔二氧化矽納米顆粒U=-38.5mV)或經APTES(—種含胺矽烷)修飾的中孔二氧化矽納米顆粒(ζ=+11.5mV)內的pCBl或組蛋白封裝的pCBl(「複合物」)的濃度。(B)當IxlO6細胞/mL與1x109MC40-靶向的、pCBl-裝載的原始細胞一起在37°C孵育24小時時，對ZsGreen(—種由pCBl編碼的綠色螢光蛋白)變得陽性的H印3B的百分數。X軸詳細說明了原始細胞核是否經APTES修飾和pCBl是否經組蛋白預封裝。將經DOTAP和DOPE(1:1重量/重量)的混合物封裝的pCBl包括在(A)和(B)中作為對照。(C)和(D)暴露於模擬體液(C)或pH5緩衝液(D)後，組蛋白封裝的pCBl從未經修飾的中孔二氧化矽納米顆粒和相應原始細胞的時間依賴性釋放。原始細胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000組成，且對於(B)，經0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。所有誤差棒表示η=3的95%置信區間(1.96σ)。[0067]圖7提供了描述MC40靶向的原始細胞將組蛋白封裝的pCBl遞送至HCC的方法的不意圖。[I]由於祀向肽向Met(其被多種HCC系過表達)的募集，MC40祀向的原始細胞高親和性地與Hep3B細胞結合。流體DOPCSLB提高肽的活動性，因此使經低MC40密度修飾的原始細胞保持對H印3B的高特異性親和性(見圖8A)。[2]MC40靶向的原始細胞經受體介導胞吞作用被H印3B內化(見圖8B和圖15A)。[3]內體條件使SLB[插入天然材料參考]去穩定並引起H5WYG內體裂解肽質子化，這兩種情況使得組蛋白封裝的pCBl在H印3B細胞質中變得分散(見圖16B)。[4]當pCBl-組蛋白複合物經核定位序列(NLS)修飾時，其在~24小時內在H印3B細胞的細胞核中變得濃縮，這使得分裂和非分裂癌細胞能夠有效轉染(見圖17)。[0068]圖8顯示MC40靶向的原始細胞高親和性地與HCC結合併被Hep3B而不是正常的肝細胞內化。㈧當暴露於H印3B或肝細胞時，MC40靶向的原始細胞的表觀解離常數(Kd)；Kd值與特異性親和性負相關並且從飽和結合曲線(見圖S-11)測定。誤差棒表示η=5的95%置信區間(1.96σ)。⑶和(C)在37°C暴露於1000倍過量MC40靶向原始細胞I小時的H印3B(B)和肝細胞(C)的共聚焦螢光顯微鏡圖像。Met經AlexaFluor?488標記的單克隆抗體(綠色)染色，原始細胞核經AlexaFluor?594(紅色)染色，且細胞核經Hoechst33342(藍色)染色。比例尺=20μm。原始細胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經0.015重量％(A-C)或0.500重量％(A)的MC40靶向肽修飾。[0069]圖9顯示MC40靶向的、pCBl裝載的原始細胞在皮摩爾濃度誘導HCC的細胞凋亡但對正常肝細胞的活力具有最小的影響。在37°CHep3B持續暴露於MC40靶向的、pCBl裝載的原始細胞後，細胞周期蛋白BImRNA和細胞周期蛋白BI蛋白質表達的劑量(A)和時間(B)依賴性降低。將細胞在(A)中暴露於多種pCBl濃度48小時和在(B)中暴露於5pMpCBl多種時間周期。納入肝細胞中細胞周期蛋白BI和H印3B中ZsGreen的表達作為對照。分別採用實時PCR和免疫螢光測定細胞周期蛋白BImRNA和蛋白質濃度。(C)在37°C持續暴露於MC40靶向的、pCBl裝載的原始細胞([pCBl]=5pM)多種時間周期後，停留在G2/M期的Hep3B的百分數。G2/M期的肝細胞和S期的H印3B的百分數納入用於比較。在細胞周期分析前，細胞經Hoechst33342染色。(D)在37°C持續暴露於MC40靶向的、pCBl裝載的原始細胞([PCBl]=5pM)多種時間周期後，凋亡的H印3B的百分數。對凋亡標記物呈陽性的肝細胞的百分數納入作為對照。對AlexaFluor?647標記的膜聯蛋白V呈陽性的細胞被認為處於細胞凋亡的早期，而對膜聯蛋白V和碘化丙啶均呈陽性的細胞被認為處於細胞凋亡的晚期。通過添加單-和雙陽性細胞的數目測定凋亡細胞的總數。在所有實驗中，原始細胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。所有誤差棒表示η=3的95%置信區間(1.96ο)。[0070]圖10顯示MC40靶向的、pCBl裝載的原始細胞較相應的脂質複合物(Iipoplex)2500倍更有效地誘導HCC的選擇性凋亡。(A)DOPC原始細胞、經10重量％PEG-2000(18:1)修飾的DOPC原始細胞、由pCBl以及DOTAP和DOPE(1:1重量/重量)的混合物組成的脂質複合物，和經10重量％PEG-2000修飾的D0TAP/D0PE脂質複合物的ζ電勢值。所有?電勢測量在0.5XPBS(pH7.4)中進行。(B，左軸)在37°C持續暴露於經MC40靶向的原始細胞或脂質複合物遞送的5pMpCBl48小時後，凋亡的!fep3B和肝細胞的百分數。(B，右軸)在37°C在48小時內誘導90%IxlO6H印3B細胞凋亡所需的MC40靶向的、pCBl裝載的原始細胞或脂質複合物的數目。對於(B)，細胞經AlexaFluor''647標記的膜聯蛋白V和碘化丙錠染色；單-和雙-陽性細胞被認為是凋亡的。原始細胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000(當標明時)組成，且經0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。D0TAP/D0PE脂質複合物經10重量％的PEG-2000(當標明時)、0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。在所有實驗中,pCBl經NLS修飾。所有誤差棒表示η=3的95%置信區間(1.96σ)。[0071]圖11顯示MC40靶向的原始細胞選擇性地將高濃度的紫杉醇、Bcl-2-特異性siRNA和pCBl遞送至HCC而不影響肝細胞的活力。(A)紫杉醇、使Bcl_2表達沉默的siRNA的濃度，和可包封於IO12原始細胞、脂質體或脂質複合物的CBl質粒的濃度。紅棒表示當紫杉醇和PCBl均裝載於原始細胞內時，紫杉醇和pCBl濃度如何變化。藍棒表示當紫杉醇、siRNA和pCBl均裝載於原始細胞或當siRNA和pCBl裝載於脂質複合物內時，紫杉醇、siRNA和pCBl濃度如何變化。(B)共聚焦螢光顯微鏡圖像顯示在經MC40靶向的原始細胞遞送至Hep3B後，OregonGreen?488標記的紫杉醇(綠色)、AlexaFluor*594標記的siRNA(紅色)和Cy5標記的pDNA(白色)的細胞內分布。細胞在37°C與1000倍過量的MC40靶向的原始細胞一起孵育24小時，然後經Hoechst33342(藍色)固定和染色。比例尺=IOym0(C)在37°C暴露於IOnM紫杉醇和/或5pMpCBl48小時後，停留G2/M期的H印3B、SNU-398和肝細胞的分數。將分數對^/M中對數生長細胞的百分數標準化。⑶在37°C暴露於IOnM紫杉醇、250pMBcl-2-特異性siRNA和/或5pMpCBl48小時後，對AlexaFluor:約1200!112/^。通常，孔徑越大，表面積越小。見圖2A。理論上，如果不除去模板劑或如果孔徑小於0.5nm,表面積可減少至基本為0，因此由於動力學作用在77K通過N2吸附無法測量。然而，在這種情況下，它們可通過CO2或水吸附測量，但可能被視為無孔的。這將適用於如果生物分子直接包封在未使用模板製備的二氧化矽核中的情況，在這種情況中，顆粒(內部負載物)將通過在遞送至細胞後二氧化矽基質的溶解來釋放。[0152]通常，本發明的原始細胞裝載有負載物，容量達超過100重量％:定義為(負載物重量/原始細胞重量)x100。負載物的最適裝載量常為約0.01至30%，但這取決於摻合入原始細胞作為負載物的藥物或藥物組合。這通常以μΜ/101(ι顆粒的表示，其中取值範圍為2000-100μΜ/1010顆粒。本發明優選的原始細胞顯示在pH約5.5時釋放負載物，該pH為內體的pH，但在生理pH7或更高(7.4)時穩定。[0153]用於裝載的內部空間的表面積為孔體積，其最適值範圍為約1.1至0.5立方釐米/克(cc/g)。注意，在本發明一項實施方案的原始細胞中，所述表面積主要為與所述納米顆粒的外部幾何表面積相對的內部表面積。[0154]本發明的一項實施方案的多孔顆粒上支撐的脂質雙層具有較低的融化轉變溫度，即較非多孔載體上支撐的脂質雙層或脂質體中的脂質雙層更具流動性。這在低肽密度實現靶配體的高親和性結合中有時是重要的，因為雙層的流動性允許側向擴散和靶細胞表面受體的肽募集。一項實施方案提供了成簇肽，其促進與互補性靶點結合。[0155]在本發明中，脂質雙層在組成上可有顯著差異。一般而言，任何可用於脂質體的脂質或聚合物也可用於原始細胞。優選脂質本文另有描述。用於本發明原始細胞中的特別優選的脂質雙層包含重量比為5%DOPE,5%PEG、30%膽固醇、60%DOPC或DPPC(以重量計)的脂質混合物(本文另有描述)。[0156]通過ζ電勢測量的中孔二氧化矽NP核的電荷經胺矽烷、2-(氨基乙基)丙基三甲氧基矽烷(AEPTMS)或其它有機矽烷修飾可從-50至+50mV單調地變化。這種電荷修飾依次改變了所述原始細胞的負載物內藥物的裝載。通常，在受支撐的脂質雙層融合後，ζ電勢降低至-1OmV至+5mV,其對於最大化在血液中的循環時間和避免非特異性相互作用是重要的。[0157]取決於表面活性劑模板如何除去，例如在高溫(500°C)焙燒vs在酸性乙醇中萃取，以及取決於摻入二氧化矽框架中的AEPTMS的量，二氧化矽的溶解速率可差異巨大。這依次控制了內部負載物的釋放速率。這種現象的發生是因為與孔的內表面緊密結合的分子緩慢地擴散到顆粒核外，因此，顆粒核的溶解部分地控制釋放速率。[0158]本發明的一項實施方案的原始細胞的其它特徵是它們在pH為7時穩定，即它們不會洩漏負載物，但在pH為5.5(該pH為內體的pH)時，脂質或聚合物包衣會變得不穩定開始釋放負載物。這種PH觸發的釋放對於維持原始細胞的穩定直至其通過胞吞作用被內化至細胞內的點(在此點若干PH觸發的事件引起釋放至內體，並隨後至胞質溶膠)是重要的。原始細胞核顆粒和表面也可經修飾以提供在特定、延長時期內負載物的非特異性釋放，以及可被重新配製以在其它生物物理變化(如局部發炎區域中活性氧簇和其它因子的存在增加)後釋放負載物。定量實驗證據顯示被靶向的原始細胞僅引起弱免疫應答，因為它們不支持更高親和性IgG(—個有利的結果)所需的T細胞幫助。[0159]本發明的原始細胞顯示至少一個或多個特徵(取決於實施方案)使得它們區別於現有技術的原始細胞:[0160]I)與現有技術相反，本發明的實施方案指定平均大小(直徑)小於約20nm的納米顆粒-該大小被工程化以促進通過受體介導的胞吞作用進行的有效細胞攝取並最小化非靶細胞和器官的結合和攝取；[0161]2)本發明的實施方案可指定單分散和/或多分散大小均可控制生物分布；[0162]3)本發明的實施方案涉及誘導受體介導的胞吞作用的靶向納米顆粒；[0163]4)本發明的實施方案通過融合肽或內體裂解肽的包裹誘導負載物分散至細胞質中；[0164]5)本發明的實施方案提供pH觸發負載物釋放的顆粒；[0165]6)本發明的實施方案顯示受控的時間依賴性負載物釋放(通過熱誘導的二氧化娃納米顆粒基質的交聯程度)；[0166]7)本發明的一項實施方案可顯不時間依賴性pH觸發釋放；[0167]8)本發明的一項實施方案可包含並提供複合物多種負載物的細胞遞送；[0168]9)本發明的一項實施方案顯示靶癌細胞的殺死；[0169]10)本發明的一項實施方案顯示靶癌細胞的診斷；[0170]11)本發明的一項實施方案顯示癌細胞的選擇進入；[0171]12)本發明的一項實施方案顯示從脫靶細胞的選擇排除(選擇性)；[0172]13)本發明的一項實施方案顯示受支撐的脂質雙層增強的流動性；[0173]14)本發明的實施方案顯示對靶細胞的亞納摩爾和受控的結合親和性；[0174]15)本發明的一項實施方案顯示與低於現有技術中濃度的靶向配體密度的亞納摩爾結合親和性；[0175]16)本發明的一項實施方案可進一步將現有技術與現有技術中不可得的更精細的細節水平區分。[0176]術語「脂質」用於描述用於在本發明中所使用的納米顆粒的表面上形成脂質雙層的組分。[0177]多種實施方案提供了從支撐一個或多個脂質雙層的納米顆粒構建而來的納米結構。在本發明的實施方案中，所述納米結構優選包括，例如，包含被脂質雙層殼包裹的多孔顆粒核的核-殼結構。所述納米結構，優選上文所述的多孔二氧化矽納米結構，支撐脂質雙層膜結構。[0178]在本發明的實施方案中，所述原始細胞的脂質雙層可提供生物相容性並可經修飾具有靶向物種(包括，例如靶向肽、融合肽、抗體、適體和PEG(聚乙二醇))從而使得例如所述原始細胞更穩定和/或靶向遞送至生物活性細胞，尤其是癌細胞中。當包含於脂質雙層中時，PEG的分子量可變化巨大(儘管PEG範圍為約10至約100單位乙二醇，但可使用約15至約50單位、約15至約20單位、約15至約25單位、約16至約18單位等)且通常通過胺基與磷脂綴合的PEG組分包括約1%至約20%、優選約5%至約15%、約10%重量的包含於脂質雙層中的脂質。[0179]脂質體遞送中使用的眾多脂質可用於在納米顆粒上形成脂質雙層以提供本發明的原始細胞。實際上，任何用於形成脂質體或多聚體(polymersome)的脂質或聚合物可用於脂質雙層中，所述脂質雙層包裹納米顆粒已形成本發明一項實施方案的原始細胞。用於本發明的優選脂質包括，例如1，2_二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(D0PC)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)、1，2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC),1,2-二油醯基-sn-甘油_3_[磷-L-絲氨酸](DOPS),1,2-二油醯基_3_三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸化_(1』-rac-甘油)(DOPG)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:lPEG-2000PE)、l，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)U-油醯基_2-[12-[(7_硝基-2-1,3-苯並噁二唑~4~基)胺基]月桂醯基]-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(18:1-12:ONBDPC)U-棕櫚醯基_2_{12-[(7-硝基-2-1，3-苯並噁二唑-4-基)胺基]月桂醯基}-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(16:0-12:ONBDPO、膽固醇和其混合物/組合。膽固醇，技術上不是脂質，但考慮到膽固醇可以是本發明原始細胞的脂質雙層的重要組分，膽固醇可作為脂質存在用於本發明的一項實施方案的目的。膽固醇經常摻合至原始細胞的脂質雙層中從而增強所述雙層的結構完整性。所有這些脂質均可容易地從AvantiPolarLipids,Inc.(Alabaster,Alabama,USA)購得。DOPE和DPPE特別用通過脂質上的胺基綴合肽、多肽(包括抗體)、RNA和DNA。[0180]在一些實施方案中，所述多孔納米顆粒還可是生物可降解的聚合物納米顆粒，其包括一種或多種選自以下的組合物:脂族聚酯、聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)、聚(己內酯)(PCL)、聚酐、聚原酸酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己內酯)、藻酸鹽和其它多糖、膠原和其化學衍生物、白蛋白(一種親水性蛋白)、玉米蛋白(一種醇溶蛋白，親水性蛋白)和共聚物及它們的混合物[0181]在其它實施方案中，所述多孔納米顆粒各自包含具有基本上無二氧化矽的核表面的核，和與該核表面連接的殼，其中所述核包含選自以下的過渡金屬化合物:氧化物、碳化物、硫化物、氮化物、磷化物、硼化物、滷化物、硒化物、碲化物、氧化鉭、氧化鐵或其組合。[0182]本發明所用的二氧化矽納米顆粒可以是，例如，中孔二氧化矽納米顆粒和核-殼納米顆粒。所述納米顆粒可摻合吸收分子，例如吸收染料。在適當的條件下，所述納米顆粒發射源自化學發光的電磁輻射。可包含其它造影劑以便於MR1、CT、PET和/或超聲成像中的造影。[0183]中孔二氧化矽納米顆粒的大小可以是例如約5nm至約500nm，包括其間的所有整數和範圍。以顆粒的最長軸測量大小。在多項實施方案中，所述顆粒大小為約IOnm至約500nm和約IOnm至約lOOnm。所述中孔二氧化娃納米顆粒具有多孔結構。這些孔的直徑可為約I至約20nm，包括其間的所有整數和範圍。在一項實施方案中，這些孔的直徑為約I至約10nm。在一項實施方案中，約90%的孔的直徑為約I至約20nm。在另一項實施方案中，約95%的孔的直徑為約I至約20nm。[0184]可根據本領域已知的方法合成所述中孔納米顆粒。在一項實施方案中，所述納米顆粒通過溶膠-凝膠方法學合成，其中一種或多種二氧化矽前體和一種或多種與吸附分子綴合(即共價結合)的二氧化矽前體在膠束形式的模板存在下水解。所述模板可使用表面活性劑例如溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)形成。據預期可使用任何可形成膠束的表面活性劑。[0185]核-殼納米顆粒包含核和殼。所述核包含二氧化矽和吸附分子。所述吸附分子經由所述分子與二氧化矽網絡之間的一個或多個共價鍵併入所述二氧化矽網絡中。所述殼包含二氧化矽。[0186]在一項實施方案中，使用已知的溶膠-凝膠化學法，例如通過一種或多種二氧化矽前體的水解獨立地合成所述核。所述二氧化矽前體以二氧化矽前體和與吸附分子綴合(例如，通過共價鍵連接)的二氧化矽前體(本文稱為「綴合的二氧化矽前體」)的混合物存在。水解可在鹼(鹼性)條件下進行以形成二氧化矽核/或二氧化矽殼。例如，水解可通過向包含一種或多種二氧化矽前體和一種或多種綴合的二氧化矽前體的混合物中加入氫氧化銨進行。[0187]二氧化矽前體是在水解條件下可形成二氧化矽的化合物。二氧化矽前體的實例包括但不限於，有機矽烷，例如四乙氧基矽烷(TEOS)、四甲氧基矽烷(TMOS)等。[0188]用於形成所述綴合二氧化矽前體的二氧化矽前體具有能夠與所述一種或多種吸附分子反應形成一個或多個共價鍵的一個或多個官能團。這類二氧化矽前體的實例包括但不限於，異氰酸丙基三乙氧基矽烷(ICPTS)、氨基丙基三甲氧基矽烷(APTS)、巰基丙基三甲氧基矽烷(MPTS)等。[0189]在一項實施方案中，用於形成核的有機矽烷(可綴合的二氧化矽前體)具有通式R4nSiXn，其中X為可水解的基團，如乙氧基、甲氧基、或2-甲氧基-乙氧基；R為具有I至12個碳原子的單價有機基團，其可任選含有，但不限於，功能性有機基團，如巰基、環氧、丙烯醯基、甲基丙烯醯基或氨基；且η為O至4的整數。所述可綴合的二氧化矽前體與吸附分子綴合併隨後與二氧化矽前體(例如TEOS和TM0S)共縮合形成核。用於形成二氧化矽殼的矽烷具有η等於4。也已知功能性單_、雙-和三-烷氧基矽烷用於共反應性官能團或羥基功能性表面(包括玻璃表面)，參見Kirk-Othmer,EncyclopediaofChemicalTechnology,Vol.20,3rdEd.,J.Wiley,N.Y.；還參見E.Pluedemann,SilaneCouplingAgents,PlenumPress,N.Y.1982。有機矽烷可引起凝膠，因此採用醇或其它已知的穩定劑可能是理想的。可在美國專利申請10/306，614和10/536，569中找到使用改良的Stoeber方法合成核-殼納米顆粒的方法，這類方法的公開內容在此引入作為參考。[0190]「含胺矽烷」包括但不限於，經矽原子功能化的伯胺、仲胺或叔胺，且可以是單胺或多胺，如二胺。優選地，所述含胺矽烷為N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基矽烷(AEPTMS)。含胺矽烷的非限制性實施例還包括3-氨基丙基三甲氧基矽烷(APTMS)和3-氨基丙基三乙氧基矽烷(APTS)，以及氨基功能性三烷氧基矽烷。還可使用質子化仲胺、質子化叔烷基胺、質子化脒、質子化胍、質子化吡啶、質子化嘧啶、質子化吡嗪、質子化嘌呤、質子化咪唑、質子化吡咯、季烷基胺或其組合。[0191]在本發明的原始細胞的一些實施方案中，所述脂質雙層由一種或多種選自磷脂醯膽鹼(PC)和膽固醇的脂質組成。[0192]在一些實施方案中，所述脂質雙層由一種或多種選自以下的磷脂醯膽鹼(PC)組成:1，2-二肉豆蘧醯基-Sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DMPC),1,2-二油醯基_3_三甲基銨-丙烷(DOTAP)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)，卵PC，以及包含約50%至約70%、或約51%至約69%、或約52%至約68%、或約53%至約67%、或約54%至約66%、或約55%至約65%、或約56%至約64%、或約57%至約63%、或約58%至約62%、或約59%至約61%、或約60%的一種或多種不飽和磷脂醯膽鹼的脂質混合物，具有碳長度為14並無不飽和鍵的DMPC[14:0]、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)[16:0]、I,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)[18:0]、1，2-二油醯基_sn_甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)[18:1(Λ9-順式)]、POPC[16:0-18:1]、和DOTAP[18:1]。[0193]在其它實施方案中:[0194](a)所述脂質雙層由(I)卵PC和⑵一種或多種選自以下的磷脂醯膽鹼(PC)組成:1，2-二肉豆蘧醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DMPC),1,2-二油醯基_3_三甲基銨-丙烷(DOTAP)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)、包含約50%至約70%、或約51%至約69%、或約52%至約68%、或約53%至約67%、或約54%至約66%、或約55%至約65%、或約56%至約64%、或約57%至約63%、或約58%至約62%、或約59%至約61%、或約60%的一種或多種不飽和磷脂醯膽鹼的脂質混合物，具有碳長度為14並無不飽和鍵的DMPC[14:0]、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)[16:0]、1，2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)[18:0]、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)[18:1(八9-順式)]、卩0卩(:[16:0-18:1]、和DOTAP[18:1];且其中[0195](b)混合物中卵PC的摩爾濃度為約10%至約50%或約11%至約49%，或約12%至約48%，或約13%至約47%，或約14%至約46%，或約15%至約45%，或約16%至約44%，或約17%至約43%，或約18%至約42%，或約19%至約41%，或約20%至約40%，或約21%至約39%，或約22%至約38%，或約23%至約37%，或約24%至約36%，或約25%至約35%，或約26%至約34%，或約27%至約33%，或約28%至約32%，或約29%至約31%，或約30%。[0196]在一些實施方案中，所述脂質雙層由一種或多種選自以下的組合物組成:磷脂、磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯二乙醇胺、磷脂醯肌醇(phosphatidylinosite)、鞘脂和乙氧基化留醇，或它們的混合物。在這類實施方案的示例性實施例中，所述磷脂可以是卵磷脂；所述磷脂醯肌醇可衍生自大豆、油菜、棉籽、卵和其混合物；所述鞘脂可以是神經醯胺、腦苷酯、鞘氨醇和鞘磷脂，和其混合物；所述乙氧基化留醇可以是植物留醇、PEG-(聚乙二醇)-5-大豆留醇和PEG-(聚乙二醇)-5-菜籽留醇。在一些實施方案中，所述植物留醇包含以下組合物的至少兩種的混合物:谷留醇(sistosterol)、菜油留醇和豆甾醇。[0197]在其它示例性實施方案中，所述脂質雙層由選自以下的一種或多種磷脂醯基組成:磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯肌醇、溶血磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯乙醇胺、溶血磷脂醯肌醇和溶血磷脂醯肌醇。[0198]在其它示例性實施方案中，所述脂質雙層由選自單醯基磷酸甘油酯或二醯基磷酸甘油酯的磷脂組成。[0199]在其它示例性實施方案中，所述脂質雙層由選自以下的一種或多種磷酸肌醇(phosphoinositides)組成:磷脂醯肌醇_3_磷酸酯(PI_3_P)、磷脂醯肌醇_4_磷酸酯(P1-4-P)、磷脂醯肌醇-5-磷酸酯(P1-5-P)、磷脂醯肌醇-3，4-二磷酸酯(PI_3，4-P2)、磷脂醯肌醇-3，5-二磷酸酯(P1-3，5-P2)、磷脂醯肌醇-4，5-二磷酸酯(PI_4，5-P2)、磷脂醯肌醇_3，4，5-三磷酸酯(P1-3，4，5-P3)、溶血磷脂醯肌醇-3-磷酸酯(LP1-3-P)、溶血磷脂醯肌醇-4-磷酸酯(LP1-4-P)、溶血磷脂醯肌醇-5-磷酸酯(LP1-5-P)、溶血磷脂醯肌醇_3，4-二磷酸酯(LP1-3，4-P2)、溶血磷脂醯肌醇-3，5-二磷酸酯(LP1-3，5-P2)，溶血磷脂醯肌醇_4，5-二磷酸酯(LP1-4，5-P2)和溶血磷脂醯肌醇_3，4，5-三磷酸酯(LP1-3,4，5-P3)和磷脂醯肌醇(PI)以及溶血磷脂醯肌醇(LPI)。[0200]在其它示例性實施方案中，所述脂質雙層由選自以下的一種或多種磷脂組成:PEG-聚(乙二醇)衍生的二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(PEG-DSPE)、聚(乙二醇)衍生的神經醯胺(PEG-CER)、氫化大豆磷脂醯膽鹼(HSPC)、卵磷脂醯膽鹼(EPC)、磷脂醯乙醇胺(PE)、磷脂醯甘油(PG)、磷脂醯肌醇(PI)、monosialogangolioside、鞘磷脂(spingomyelin)(SPM)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二肉豆蘧醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)和二肉豆蘧醯基磷脂醯甘油(DMPG)。[0201]在本發明的原始細胞的一項示例性實施方案中:[0202](a)所述一種或多種藥學活性劑包括至少一種抗癌劑；[0203](b)在缺乏活性氧簇的條件下，少於約10%至約20%的抗癌劑自所述多孔納米顆粒釋放；和[0204](C)在由於與活性氧簇接觸導致脂質雙層破裂後，所述多孔納米顆粒釋放抗癌劑的量大約等於脂質雙層經5%(重量/體積)TritonX-100溶解釋放的抗癌劑的量的約60%至約80%、或約61%至約79%、或約62%至約78%、或約63%至約77%、或約64%至約77%、或約65%至約76%、或約66%至約75%、或約67%至約74%、或約68%至約73%、或約69%至約72%、或約70%至約71%、或約70%。[0205]本發明的原始細胞的一項示例性實施方案包括大量帶負電荷的、納米多孔的、納米顆粒二氧化矽核，所述二氧化矽核:[0206](a)經選自以下的含胺矽烷修飾:(1)伯胺、仲胺、叔胺，其各自經矽原子功能化；(2)單胺或多胺；(3)N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基矽烷(AEPTMS);(4)3-氨基丙基三甲氧基矽烷(APTMS);(5)3-氨基丙基三乙氧基矽烷(APTS)；(6)氨基功能性三烷氧基矽烷；和(7)質子化仲胺、質子化叔烷基胺、質子化脒、質子化胍、質子化吡啶、質子化嘧啶、質子化吡嗪、質子化嘌呤、質子化咪唑、質子化吡咯、季烷基胺或其組合；[0207](b)裝載有SiRNA或蓖麻毒素A鏈；和[0208](c)被包含選自以下的脂質的脂質雙層包封和支撐包含選自以下的脂質的脂質雙層:[0209]I,2-二油醯基-sn-甘油_3_磷酸膽鹼(DOPC)、I,2_二棕櫚醯基_sn_甘油_3_磷酸膽鹼(DPPC)、1，2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-[磷-L-絲氨酸](DOPS)、1，2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸化_(1』-rac-甘油)(DOPG)、1，2-二油醯基_sn_甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、I,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、I,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油醯基-2-[12-[(7-硝基-2-1，3-苯並噁二唑-4-基)氨基]月桂基]_sn_甘油-3-磷酸膽鹼(18:1-12:ONBDPC)、1-棕櫚醯基-2-{12-[(7-硝基_2_1，3-苯並噁二唑_4_基)氨基]月桂基}-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(16:0-12:ONBDPC)、膽固醇和其混合物/組合，且其中所述脂質雙層包括陽離子質子和一種或多種兩性離子磷脂。[0210]本發明的原始細胞可包括多種藥學活性成分。[0211]術語「報告子」用於描述摻入至本發明實施方案的磷脂雙層或原始細胞的負載物中並提供可被測量信號的成像劑或部分。該部分可提供螢光信號或者可以是允許放射檢測的放射性同位素。用於原始細胞中的示例性螢光標記(優選地經綴合或吸附至脂質雙層或二氧化矽核，儘管這些標記也可被摻入至經原始細胞遞送至細胞的負載物元件如DNA、RNA、多肽和小分子中)，包括Hoechst33342(350/461)、4',6-二脒基_2_苯基吲哚(DAPI,356/451)、AlexaFluorv405羧酸、琥珀醯亞胺酯(401/421)、CellTracker?VioletBMQC(415/516),CellTracker?GreenCMFDA(492/517)、鈣黃綠素(495/515)、膜聯蛋白V的AlexaFluor?488綴合物(495/519)、AlexaFluor*488山羊抗小鼠IgG(H+L)(495/519)、Click-1T?AHAAlexaFluor*488蛋白質合成HCS分析(495/519)、LIVEOEAD?可固定綠色死細胞染色試劑盒(495/519)、SYlOX綠色核酸染色(504/523)、MitoSOX?紅色線粒體超氧化物指示劑(510/580)。AlexaFluor?532羧酸、琥珀醯亞胺酯(532/554)、pHrodo?琥珀醯亞胺酯(558/576)、CellTracker?RedCMTPX(577/602)、TexasRed*1，2-二(十六醯基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(TexasRed?DHPE,583/608),AlexaFluor?647醯肼(649/666)、AlexaFluor*647羧酸、琥珀醯亞胺酯(650/668)、Ulysis?AlexaFluor?647核酸標記試劑盒(650/670)和膜聯蛋白V(650/665)的AlexaFluor?647綴合物。還可摻入增強螢光信號或使螢光衰減變慢的部分(moities)，其包括S1wFadenGold抗衰減試劑(含和不含DAPl)和Image-1T?FX信號增強劑。所有這些均為本領域已知的。其它的報告子包括可被質粒(如組蛋白封裝的超螺旋DNA質粒)表達的多肽報告子並包括多肽報告子如綠色螢光蛋白和紅色螢光蛋白。本發明的報告子主要用於診斷性應用(包括診斷患者中癌症(癌組織)的存在或進展和患者或受試者中治療的進展)中。[0212]術語「組蛋白封裝的超螺旋質粒DNA」用於描述本發明原始細胞(其利用已經「超螺旋化」(即，使用引起質粒在自身上摺疊的過飽和鹽溶液或其它離子溶液在自身上進行摺疊並「超螺旋」以變得更緊湊以有效地封裝至原始細胞中)的優選的質粒DNA)的優選組分。實際上，所述質粒可以是表達任意數目的多肽或編碼RNA(包括小髮夾RNA/shRNA或小幹擾RNA/siRNA)的任何質粒，如本文另有描述。一旦超螺旋化(使用濃縮鹽或其它陰離子溶液)，所述超螺旋質粒RNA然後與組蛋白複合以產生組蛋白封裝的「複合的」超螺旋質粒DNA。[0213]本文「封裝的』DNA指的是裝載至原始細胞中(或吸附至孔中或直接限制於納米二氧化矽核自身內)的DNA。為使DNA空間上最小化，DNA經常被封裝，其可以若干方式實現，從調整周圍介質的電荷到形成DNA和例如脂質、蛋白質或其它納米顆粒(通常，但不排他為陽離子型)的小複合物。封裝DNA通常經由脂質複合物(即將DNA和陽離子型脂質混合物複合)來實現。此外，DNA還被陽離子型蛋白質(包括除組蛋白外的蛋白質)以及金納米顆粒(例如，NanoFlares-工程化DNA和金屬複合物,其中該納米顆粒的核為金)封裝。[0214]任意數目的組蛋白，以及其它將DNA封裝至較小體積的手段如標準陽離子型納米顆粒、脂質或蛋白質，可用於封裝超螺旋質粒DNA「組蛋白封裝的超螺旋質粒DNA」,但在涉及治療人類患者的治療方面，優選使用人類組蛋白。在本發明的一些方面，本領域已知或可根據本發明的教導容易地實施，儘管可使用其它相似比例的其它組蛋白，但人類組蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4以優選比例1:2:2:2:2的組合。DNA也可以是雙鏈線性DNA而不是質粒DNA，其也可以任選地為超螺旋和/或經組蛋白或其它封裝組分封裝的。[0215]可用於本發明該方面的其它組蛋白包括，例如H1F、H1F0、HlFNT,H1F00、HlFXH1H1HIST1H1A、HIST1H1B、HIST1H1C、HIST1H1D、HIST1H1E、HIST1H1T;H2AF、H2AFB1、H2AFB2、H2AFB3、H2AFJ、H2AFV、H2AFX、H2AFY、H2AFY2、H2AFZ、H2A1、HIST1H2AA、HIST1H2AB、HIST1H2AC、HIST1H2AD、HIST1H2AE、HIST1H2AG、HIST1H2A1、HIST1H2AJ,HIST1H2AK、HIST1H2AL、HIST1H2AM、H2A2、HIST2H2AA3、HIST2H2AC、H2BF、H2BFM、HSBFS,HSBFWT、H2B1、HIST1H2BA、HISTIHSBB,HIST1HSBC、HISTIHSBD,HIST1H2BE、HIST1H2BF、HIST1H2BG、HIST1H2BH、HIST1H2B1、HIST1H2BJ,HIST1H2BK、HIST1H2BL、HIST1H2BM、HIST1H2BN、HIST1H2B0、H2B2、HIST2H2BE、H3A1、HIST1H3A、HIST1H3B、HIST1H3C、HIST1H3D、HIST1H3E、HIST1H3F、HIST1H3G、HIST1H3H、HIST1H31、HIST1H3J、H3A2、HIST2H3C、H3A3、HIST3H3、H41、HIST1H4A、HIST1H4B、HIST1H4C、HIST1H4D、HIST1H4E、HIST1H4F、HIST1H4G、HIST1H4H、HIST1H41、HIST1H4J、HIST1H4K、HIST1H4L、H44和HIST4H4。[0216]術語「核定位序列」指的是摻入或者交聯至組蛋白的肽序列，其中所述組蛋白包含組蛋白封裝的超螺旋質粒DNA。在一些實施方案中，本發明的原始細胞可進一步包含經核定位序列(注意組蛋白可與該核定位序列交聯或質粒本身可經修飾以表達核定位序列)修飾(交聯)的質粒(常為組蛋白封裝的超螺旋質粒DNA)，所述核定位序列增強了組蛋白封裝的質粒穿透細胞核並將其內容物放置於那裡(以促進表達和最終細胞死亡)的能力。這些肽序列有助於將組蛋白封裝的質粒DNA和結合的組蛋白搬運至靶細胞的細胞核中，隨後質粒將表達所需的肽和/或核苷酸以遞送治療性和/或診斷性分子(多肽和/或核苷酸)至靶細胞的細胞核中。本領域公知，任意數目的交聯劑可用於將核定位序列共價連接至組蛋白(常位於賴氨酸基團或在懸掛(pendant)暴露於多肽的胺基酸的側鏈中具有親核性或親電性基團的其它基團)，其可用於將組蛋白封裝的質粒引入細胞核中。或者，表達核定位序列的核苷酸序列可定位於靠近表達組蛋白的核苷酸序列的質粒中，從而發生綴合至核定位序列的組蛋白的表達，促進質粒轉移至靶細胞的細胞核中。[0217]蛋白質通過核被膜進入細胞核。核被膜由同心膜、外層膜和內層膜組成。這些是通往細胞核的入口。被膜由孔或大細胞核複合物組成。經NLS翻譯的蛋白質將與輸入蛋白(akakaryopherin)強烈地結合，同時該複合物將移動通過核孔。任意數目的核定位序列可用於將組蛋白封裝的質粒DNA引入至細胞核中。優選的核定位序列包括H2N-GNQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGYGGC-COOHSEQ1.DNO:9、RRMKffKK(SEQIDNO:10)、PKKKRKV(SEQIDNO:11)和KR[PAATKKAGQA]KKKK(SEQIDNO:12)、核質蛋白的NLS、包含兩個鹼性胺基酸簇、被具有約10個胺基酸的間隔區分隔的原型二分裂信號(prototypicalbipartitesignal)。數目眾多的其它核定位序列是本領域公知的。參見,例如LaCasse等人，NuclearlocalizationsignalsoverlapDNA-orRNA-bindingdomainsinnucleicacid-bindingproteins.Nuc1.AcidsRes.,23,1647-16561995)；ffeis,K.1mportinsandexportins:howtogetinandoutofthenucleus[publishederratumappearsinTrendsBiochemSci1998Jul；23(7):235].TIBS,23，185-9(1998)；和MuratCokoI,RajNair&BurkhardRost,「Findingnuclearlocalizationsignals，，，atthewebsiteubic.bioc.Columbia,edu/papers/2000nls/paper.html#tab2。[0218]術語「癌症」用於描述具有失去正常控制的獨特特徵的腫瘤細胞(新生物)的增殖，其導致不受調控的生長、缺少分化、局部組織侵襲和/或轉移。如本文所用，新生物包括但不限於，受試者或宿主組織中細胞形態學不規則以及與相同類型組織的正常增生相比，受試者組織中細胞的病理性增生。此外，新生物包括侵襲性或非侵襲性的良性腫瘤和惡性腫瘤(例如，結腸腫瘤)。惡性新生物與良性新生物區別在於前者顯示較大程度的發育異常，或細胞分化和定向的損失，並且具有侵襲和轉移的性質。在本文中術語癌症還包括耐藥癌症，包括多重耐藥癌症。新生物或瘤變(本發明的靶細胞可自其中衍生得到)的實例包括但不限於，癌(例如，鱗狀細胞癌、腺癌、肝細胞癌和腎細胞癌)，特別是膀胱癌、骨癌、腸癌、乳腺癌、宮頸癌、結腸癌(結腸直腸癌)、食管癌、頭部癌症、腎癌、肝癌(肝細胞癌)、肺癌、鼻咽癌、頸部癌症、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌；白血病，如急性髓細胞性白血病、急性淋巴細胞性白血病、急性早幼粒細胞性白血病(APL)、急性T細胞成淋巴細胞性白血病、成人T細胞白血病、嗜鹼細胞性白血病、嗜酸細胞性白血病、粒細胞性白血病、毛細胞性白血病、白細胞減少性白血病、淋巴性白血病、成淋巴細胞性白血病、淋巴細胞性白血病、巨核細胞性白血病、小原粒型白血病、單核細胞性白血病、中性粒細胞性白血病和幹細胞白血病；良性和惡性淋巴瘤，特別是伯基特淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和B細胞淋巴瘤；良性和惡性黑色素瘤；骨髓增生性疾病；肉瘤,特別是尤因肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、脂肉瘤、肌肉瘤、外周神經上皮樣瘤和滑膜肉瘤；中樞神經系統腫瘤(例如,膠質瘤、星形細胞瘤、少突神經膠質瘤、室管膜瘤、成膠質細胞瘤、成神經細胞瘤、神經節瘤、神經節神經膠質瘤、髓母細胞瘤、松果體細胞腫瘤、腦膜瘤、腦膜肉瘤、神經纖維瘤和神經鞘瘤)；生殖系腫瘤(例如，腸癌、乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌、子宮癌、肺癌(例如，小細胞肺癌、混合型小細胞和非小細胞癌、胸膜間皮瘤，包括轉移性胸膜間皮瘤小細胞肺癌和非小細胞肺癌)、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、星形細胞瘤、食管癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、結腸癌和黑色素瘤)；混合型瘤變，特別是癌肉瘤和霍奇金病；以及混合起源的腫瘤，如Wilm腫瘤和畸胎癌。應當注意其中一些腫瘤包括肝細胞癌和宮頸癌顯示在癌細胞上特異性地展現升高水平的MET受體，並且是本發明實施方案的組合物和療法(其包括與原始細胞複合的MET結合肽)的主要靶點。[0219]術語「同服」和「共同給予」同義地用於描述給予與至少一種其它藥劑(常為至少一種其它抗癌劑(如本文另有描述))組合的至少一種本發明的原始細胞組合物，本文明確的公開了在同一時間或大約在同一時間被視為有效量的量和濃度。儘管優選同時給予共同給予的組合物/藥劑，但可在多個時間給予藥劑從而使得兩種(或兩種以上)組合物/藥劑的有效濃度在患者中同時出現至少一段時間。或者，在本發明的一些方面中，可能可以使共同給予的組合物/藥劑在不同的時間在患者中展現其抑制作用，且最終結果為癌症(尤其包括肝細胞癌或細胞性癌)的抑制和治療以及其它疾病狀態、病症或併發症的減少或抑制。當然，當不只是疾病狀態、感染或其它病症存在時，本發明的化合物可根據需要與其它藥劑組合以治療該其它感染或疾病或病症。[0220]術語「抗癌劑」用於描述可與一種或多種包含本發明的原始細胞的組合物組合配製的化合物，並用於治療任意類型的癌症，其中尤其是肝細胞癌或宮頸癌。可與本發明的化合物一起配製的抗癌化合物包括，例如，可用於本發明的例示性抗癌劑包括依維莫司、曲貝替定、白蛋白結合型紫杉醇(abraxane)、TLK286、AV-299、DN-101、帕唑帕尼、GSK690693、RTA744、ON0910.Na、AZD6244(ARRY-142886)、AMN-107、TK1-258、GSK461364、AZD1152、恩扎妥林(enzastaurin)、凡德他尼(vandetanib)、ARQ-197、MK-0457、MLN8054、PHA-739358、R-763、AT-9263、FLT-3抑制劑、VEGFR抑制劑、EGFRTK抑制劑、極光激酶抑制劑、PIK-1調節劑、Bcl-2抑制劑、HDAC抑制劑、c-MET抑制劑、PARP抑制劑、Cdk抑制劑、EGFRTK抑制劑、IGFR-TK抑制劑、抗HGF抗體、PI3激酶抑制劑、AKT抑制劑、JAK/STAT抑制劑、檢查點-1或2抑制劑、粘著斑激酶抑制劑、Map激酶激酶(mek)抑制劑、VEGFtrap抗體、培美曲塞、厄洛替尼、達沙替尼、尼羅替尼、decatanib、帕尼單抗、氨柔比星、奧戈伏單抗(oregovomab)、Lep-etu、諾拉曲塞、azd2171、batabulin、奧法木單抗、扎木單抗(zanolimumab)、edotecarin、粉防己喊、盧I:匕替康、替米矛[I芬、obIimersen、ticiIimumab、易普利單抗、棉酚、Bio111、131-1-TM-601、ALT-110,BIO140、CC8490、西侖吉肽、吉馬替康、IL13-PE38QQR、INO1001、IPdRlKRX-0402、硫蒽酮、LY317615、neuradiab、vitespan、Rta744,Sdx102、他侖帕奈(talampanel)、阿曲生坦、Xr311、羅米地辛、ADS-100380、舒尼替尼、5-氟尿嘧啶、伏立諾他、依託泊苷、吉西他濱、多柔比星、多柔比星脂質體、5』-脫氧-5-氟尿苷、長春新鹼、替莫唑胺、ZK-304709、seliciclib、ro0325901、AZD-6244、卡培他濱、L-穀氨酸、N-[4-[2-(2-氨基-4，7-二氫-4-氧代-1H-吡咯並[2，3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲醯基]二鈉鹽七水合物、喜樹鹼、PEG-標記的伊立替康、他莫昔芬、枸櫞酸託瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、來曲唑、DES(己烯雌酚)、雌二醇、雌激素、綴合的雌激素、貝伐珠單抗、IMC-1ClUCHIR-258);3_[5_(甲基磺醯基哌啶(piperadine)甲基)_吲哚基-喹諾酮、瓦他拉尼、AG-013736、AVE-0005、[D-Ser(But)6，Azgly10](pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2乙酸鹽[C59H84N18Oi4-(C2H4O2)x,其中x=I至2.4]的乙酸鹽、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、雙羥萘酸曲普瑞林、醋酸甲羥孕酮、己酸羥孕酮、醋酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡魯胺、氟他胺、尼魯米特、醋酸甲地孕酮、CP-724714;ΤΑΚ-165、ΗΚΙ-272、厄洛替尼、拉帕替尼、卡奈替尼、ABX-EGF抗體、愛必妥、ΕΚΒ-569、ΡΚΙ-166、GW-572016、洛那法尼(1nafarnib)、BMS-214662、替吡法尼(tipifarnib);氨磷汀、NVP-LAQ824、辛二醯基苯胺一羥肟酸、丙戊酸、曲古抑菌素A、FK-228、SU11248、索拉菲尼、KRN951、氨魯米特、arnsacrine、阿那格雷、L-門冬醯胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、博來黴素、布舍瑞林、白消安、卡鉬、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱、氯膦酸鹽、環丙孕酮、阿糖胞苷、達卡巴嗪、放線菌素D、柔紅黴素、己烯雌酚、表柔比星、氟達拉濱、氟氫可的松、氟甲睪酮、氟他胺、吉西他濱、格列衛、羥基脲、伊達比星、異環磷醯胺、伊馬替尼、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、雙氯乙基甲胺、美法侖、6-巰基嘌呤、美司鈉、甲氨蝶呤、絲裂黴素、米託坦、米託蒽醌、尼魯米特、奧曲肽、奧沙利鉬、帕米磷酸鹽、噴司他丁、普卡黴素、葉菲爾鈉、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔單抗、鏈佐星、替尼泊苷、睪酮、沙利度胺、硫鳥嘌呤、塞替派、維A酸、長春地辛、13-順式-視黃酸、苯丙氨酸氮芥、尿嘧啶氮芥、雌莫司汀、六甲密胺、氟脲嘧啶脫氧核苷、5-脫氧尿苷、阿糖胞苷、6-硫基嘌呤、脫氧柯福黴素、骨化三醇、戊柔比星、光輝黴素、長春鹼、長春瑞濱、託泊替康、雷佐生、馬立馬司他、C0L-3、新伐司他、BMS-275291、角鯊胺、內皮他丁、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、頂862、血管他丁、vitaxin、屈洛昔芬、idoxyfene、螺內酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥珠單抗、地尼白介素融合毒素、吉非替尼、硼替佐米(bortezimib)、紫杉醇、無氫化蓖麻油的紫杉醇、多西他賽、埃坡黴素B、BMS-247550、BMS-310705、屈洛昔芬、4-羥基他莫昔芬、哌噴昔芬(Pipendoxifene)、ERA-923、阿佐昔芬、氟維司群、阿考比芬(Acolbifene)、拉索昔芬、艾多昔芬、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、託泊替康、PTK787/ZK222584、VX-745、PD184352、雷帕黴素、40-0-(2-羥基乙基)-雷帕黴素、替西羅莫司、AP-23573、RADOOUABT-578、BC-210、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青黴素、ZM336372、L-779,450、PEG-非格司亭、達貝泊汀(darbepoetin)、促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子、唑來磷酸鹽、潑尼松、西妥昔單抗、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、組氨瑞林、PEG化的幹擾素a_2a、幹擾素a_2a、PEG化的幹擾素a-2b，幹擾素a_2b、阿扎胞苷、PEG-L-門冬醯胺酶、來那度胺、吉妥珠單抗、氫化可的松、白介素-11、右丙亞胺、阿侖單抗、全反式維甲酸、酮康唑、白介素_2、甲地孕酮、免疫球蛋白、氮芥、甲潑尼龍、替伊莫單抗(ibritumomabtiuxetan)、雄激素類、地西他濱、六甲密胺、貝沙羅汀、託西莫單抗、三氧化二砷、可的松、editronate、米託坦、環孢菌素、柔紅黴素脂質體、Edwina-門冬醯胺酶、銀89、卡索匹坦(casopitant)、奈妥匹坦(netupitant)、NK-1受體拮抗劑、帕洛諾司瓊、阿瑞匹坦(aprepitant)、苯海拉明、輕嗪、甲氧氯普胺、蘿拉西泮、阿普唑侖、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、甲潑尼龍、丙氯拉嗪、格拉司瓊、昂丹司瓊、多拉司瓊、託烷司瓊、聚乙二醇非格司亭、促紅細胞生成素、阿法依泊汀(epoetinalfa)、阿法達貝泊汀(darbepoetinalfa)和其混合物。[0221]在整個說明書中，術語「抗肝細胞癌劑」用於描述可用於抑制、治療或降低肝細胞癌可能性或該癌症的轉移的抗癌劑。本發明中可使用的抗癌劑包括，例如，多吉美(索拉菲尼)、舒尼替尼、貝伐珠單抗、特羅凱(厄洛替尼)、泰立沙(拉帕替尼)和其混合物。此外，本發明還可使用其它抗癌劑，其中這類藥劑可抑制癌症(尤其是肝細胞癌)的轉移。[0222]術語「抗病毒劑」用於描述生物活性劑/藥物，其抑制病毒(包括突變株如耐藥病毒株)的生長和/或加工(elaboration)。優選的抗病毒劑包括抗HIV劑、抗HBV劑和抗HCV劑。在本發明的一些方面，尤其是治療肝細胞癌是治療目的的方面，考慮到經常發現B肝病毒(HBV)和/或C肝病毒(HCV)是與肝細胞癌相關的主要或次要感染或疾病狀態，抗C肝劑或抗B肝劑的納入可與其它傳統抗癌劑組合以影響治療。本發明可使用的抗HBV劑，作為原始細胞中的負載物組分或作為包括原始細胞群的藥物組合物中的額外的活性劑，包括如下藥劑:賀維力(阿德福韋二匹伏酯)、拉米夫定、恩替卡韋、替比夫定、替諾福韋、恩曲他濱、克來夫定、valtoricitabine、amdoxovir、帕拉德福韋(pradefovir)、racivir、BAM205、硝唑尼特、UT231_B、Bay41_4109、EHT899、日達仙(胸腺肽α-1)和其混合物。用於本發明的典型的抗HCV劑包括如下藥劑:波普瑞韋(boceprevir)、daclatasvir、asunapavir、INX-189、FV-100,NM283、VX-950(替拉瑞韋)、SCH50304、TMC435、VX-500、BX-813、SCH503034、R1626、ITMN-191(R7227)、R7128、PF-868554、TT033、CGH-759、GI5005、MK-7009、SIRNA-034、MK-0608、A-837093、GS9190、GS9256、GS9451、GS5885、GS6620、GS9620、GS9669、ACH-1095、ACH-2928、GSK625433、TG4040(MVA-HCV)、A-831、F351、NS5A、NS4B、ANA598、A-689、GN1-104、IDX102、ADX184、ALS-2200、ALS-2158、BI201335,BI207127、BIT-225、BIT-8020、GL59728、GL60667、PS1-938、PS1-7977、PS1-7851、SCY-635、利巴韋林、PEG化幹擾素、PHX1766,SP-30和其混合物。[0223]術語「抗HIV劑」指的是抑制HIV病毒(I和/或II)或其突變株的生長和/或加工的化合物。用於本發明的可作為負載物包含於本發明原始細胞的例示性抗HIV劑包括，例如，其中包括核苷逆轉錄酶抑制劑(NRTI)、其它非核苷逆轉錄酶抑制劑(即，那些不是本發明代表的逆轉錄酶抑制劑)、蛋白酶抑制劑、融合抑制劑，其例示性化合物可包括，例如3TC(拉米夫定)、AZT(齊多夫定)、(-)-FTC、ddl(地達諾新)、ddC(扎西他濱)、阿巴卡韋(ABC)、替諾福韋(PMPA)、D-D4FC(Reverset)、D4T(司他夫定)、Racivir、L-FddC,L-FD4C、NVP(奈韋拉平)、DLV(地拉韋定)、EFV(依法韋侖)、SQVM(甲磺酸沙奎那韋)、RTV(利託那韋)、IDV(茚地那韋)、SQV(沙奎那韋)、NFV(那非那韋)、APV(安潑那韋)、LPV(洛匹那韋)、其中融合抑制劑如T20、fuseon和其混合物。[0224]術語「靶向活性物種」用於描述與本發明的原始細胞(其與所靶向細胞的表面上的部分結合從而使得該原始細胞可選擇性地與該靶細胞的表面結合併將其內容物放置於細胞中)的表面複合或優選地共價鍵接的化合物或部分。在與靶細胞結合的物種中，用於本發明的靶向活性物種優選為本文另有描述的靶向肽、包含抗體或抗體片段的多肽、適體或碳水化合物。[0225]術語「靶向肽」用於描述一種優選的靶向活性物種，具有特定序列的肽，其與癌細胞中的受體或其它多肽結合併允許本發明的原始細胞靶向表達與該靶向肽結合的肽(為受體或其它功能性多肽)的特定細胞。在本發明中，例示性靶向肽包括，例如，SP94游離肽(H2N-SFSIILTPILPL-C00H，SEQIDNO:6)、經C端半胱氨酸修飾用於與交聯劑綴合的SP94肽(H2N-GLFHAIAHFIHGGWHGLIHGWYGGC-COOH(SEQID.NO:13)或8mer多聚精氨酸(H2N-RRRRRRRR-C00H,SEQIDNO:14))、經修飾的SP94肽(H2N-SFSIILTPILPLEEEGGC-COOH,SEQIDNO:8)或MET結合肽，如本文另有描述。其它靶向肽是本領域已知的。靶向肽可通過使用本文另有描述的交聯劑與脂質雙層複合或優選地共價連接。[0226]術語「MET結合肽」或「MET受體結合肽」用於五(5)中7-mer肽，已顯示其將MET受體結合到癌細胞表面，結合效率增強。根據本發明，鑑定了若干具有可變胺基酸序列的小肽，所述序列以可變水平的特異性和可變能力結合MET受體(a.La.肝細胞生長因子受體，由基因c-MET表達)以活化MET受體信號轉導通路。使用噬菌體展示生物淘選鑑定7-mer肽，所得序列的實例證明與MET受體以及隨後與表達高水平MET受體的細胞如癌細胞(例如肝細胞、卵巢和宮頸)的結合增強，其顯示如下。生物淘選方法中若干種最常觀測到的序列的結合數據也再本發明的實施例部分呈現。具體地，這些肽可用作細胞特異性療法的靶向配體。然而，具有活化受體通路能力的肽本身或與其它治療組合可具有額外的治療值。已發現很多肽不僅結合肝細胞癌(其為最初預期的靶點)還結合多種其它癌，包括卵巢癌和宮頸癌。據信這些肽可廣範圍地應用於靶向或治療多種癌症和其它與MET和相關受體表達有關的生理學問題。[0227]以下五種7-mer肽序列顯示大量與MET受體結合併具體地用作用於本發明原始細胞上的靶向肽。[0228]ASVHFPP(Ala-Ser-Val-His-Phe-Pro-Pro)SEQIDNO:1[0229]TATFffFQ(Thr-Ala-Thr-Phe-Trp-Phe-Gln)SEQIDNO:2[0230]TSPVALL(Thr-Ser-Pro-Val-Ala-Leu-Leu)SEQIDNO:3[0231]IPLKVHP(Ile-Pro-Leu-Lys-Val-His-Pro)SEQIDNO:4[0232]WPRLTNM(Trp-Pro-Arg-Leu-Thr-Asn-Met)SEQIDNO:5[0233]這些肽可各自單獨使用或與上述其它MET肽組合使用或與其它可有助於將本發明的原始細胞與癌細胞(其中，包括肝細胞癌細胞、卵巢癌細胞和宮頸癌細胞)結合的靶向肽組合使用。這些結合肽也可單獨作為MET結合肽用於藥物化合物中以治療癌症和抑制肝細胞生長因子結合。[0234]術語「融合肽」和「內體裂解肽」同義地用於描述任選地並優選地交聯至本發明的原始細胞脂質雙層表面上的肽。融合肽被摻合至原始細胞上以促進或有助於從內體逃逸並促進原始細胞引入至靶細胞中以影響預期結果(如本文另有描述的治療性和/或診斷性結果)。在本領域已知的融合肽中，用於本發明原始細胞中的代表性的和優選的融合肽包括H5WYG肽、H2N-GLFHAIAHFIHGGWHGLIHGWYGGC-COOH(SEQID.NO:13)或8mer聚精氨酸(H2N-RRRRRRRR-C00H,SEQIDNO:14)。[0235]術語「交聯劑」用於描述具有可變長度包含兩個不同官能團的雙功能化合物，其可用於將多種本發明的組分彼此共價連接。本發明的交聯劑可包含兩個親電基團(以與寡核苷酸的肽上的親核基團反應)、一個親電基團和一個親核基團或兩個親核基團。取決於待連接的組分和所需要的相對柔性，所述交聯劑的長度可變。交聯劑可用於將靶向和/或融合肽錨定於磷脂雙層上，用於將核定位序列連接至組蛋白以封裝超螺旋質粒DNA，且在一些情況中，用於交聯原始細胞的脂質雙層中的脂質。存在數量眾多的可用於本發明的交聯劑，很多可購得或在文獻中可得。其中，用於本發明的優選交聯劑包括，例如1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)、4-[N-馬來醯亞胺基甲基]環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯(SMCC)，Ν-[β-馬來醯亞胺基丙酸]醯肼(BMPH),NHS-(PEG)n-馬來醯亞胺、琥珀醯亞胺基-[(N-馬來醯亞胺基丙醯胺基)_二十四乙二醇]酯(SM(PEG)24)和6-[3'-(2-吡啶基二硫代)_丙醯胺基]己酸琥珀醯亞胺酯(LC-SPDP)。[0236]如上文所詳述,本發明的多孔納米顆粒核可包括具有至少一個維度(dimension)的多孔納米顆粒，例如，寬度或直徑為約3000nm或更小、約1000nm或更小、約500nm或更小、約200nm或更小。優選地，所述納米顆粒核為球形，優選直徑為約500nm或更小，更優選為約S-1Onm至約200nm。在實施方案中，所述多孔顆粒核具有多種橫斷層形狀，包括環形、矩形、正方形或其它形狀。在一些實施方案中，所述多孔顆粒核可具有平均孔徑範圍為約2nm至約30nm的核，儘管所述平均孔徑和其它性質(例如，所述多孔顆粒核的孔隙率)不限於本發明教導的多種實施方案。[0237]通常，本發明的原始細胞是生物相容的。藥物和其它負載物組分經常通過吸附和/或所述顆粒核的孔的毛細填充至大約最終原始細胞(含所有組分)的50%重量。在本發明的一些實施方案中，所裝載的負載物可自顆粒核(中孔)的多孔表面釋放，其中釋放特點可由例如孔徑、多孔顆粒核的表面化學、系統的PH值和/或本文概述的多孔顆粒核與周圍脂質雙層間的相互作用決定或調整。[0238]在本發明中，用於製備原始細胞的多孔納米顆粒核可變得親水或進行性地更加疏水，如本文另有描述，且可進一步經處理以提供更加親水的表面。例如，中孔二氧化矽顆粒可進一步經氫氧化銨和過氧化氫處理以提供更高的親水性。在本發明的優選方面中，脂質雙層被融合至多孔顆粒核上以形成原始細胞。本發明的原始細胞可包括多種重量比的多種脂質，優選包含1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)、I,2-二棕櫚醯基-sn_甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)、1，2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-[磷-L-絲氨酸](DOPS),1,2-二油醯基_3_三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸化-(l』-rac-甘油)(DOPG)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油_3_磷酸乙醇胺(DPPE)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油醯基-2-[12-[(7-硝基-2-1，3-苯並噁二唑-4-基)氨基]月桂醯基]_sn_甘油-3-磷酸膽鹼(18:1-12:ONBDPC)、1-棕櫚醯基-2-{12-[(7-硝基-2-1,3-苯並噁二唑_4_基)氨基]月桂醯基}-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(16:0-12:ONBDPC)、膽固醇和其混合物/組合。[0239]用於製備本發明的原始細胞的脂質雙層可例如通過以下方法製備:使用本領域已知或如本文另有描述的標準方案，將水合脂質薄膜通過孔徑為例如約IOOnm的過濾器擠出。然後可將濾過的脂質雙層膜與多孔顆粒核例如通過吸量管混合融合。在一些實施方案中，過量的脂質雙層或脂質雙層薄膜可用於形成原始細胞以改善該原始細胞的膠體穩定性。[0240]在一些診斷性實施方案中，為了診斷性目的，多種染料或螢光(報告子)分子可包含於原始細胞負載物(如由質粒DNA表達的)中或依附於所述多孔顆粒核和/或脂質雙層。例如，所述多孔顆粒核可以是二氧化矽核或脂質雙層，並且可以是經FITC(綠色螢光)共價標記的，而脂質雙層或顆粒核可以是經FITCTexasred(紅色螢光)共價標記的。然後，可通過例如共聚焦螢光觀測所述多孔顆粒核、脂質雙層和所形成的原始細胞以用於診斷性應用中。此外，如本文所討論的，質粒DNA可作為負載物用於本發明的原始細胞中從而該質粒可表達一種或多種可用於診斷性應用中的螢光蛋白如綠色螢光蛋白或紅色螢光蛋白。[0241]在多項實施方案中，原始細胞用於協同系統中，其中所述脂質雙層融合或脂質體融合(即，在多孔顆粒核上)裝載並密封有多種負載物組分和顆粒核的孔，從而形成經裝載的原始細胞用於負載物遞送穿過脂質雙層的細胞膜，或者如果適用，通過多孔納米顆粒的溶出。在一些實施方案中，除融合單個脂質(例如磷脂)雙層外，多個具有相反電荷的雙層可被接連融合至多孔顆粒核上以進一步影響負載物的裝載和/或密封以及最終原始細胞的釋放特徵。[0242]負載物遞送可包括融合和協同裝載機制。例如，負載物可通過多孔顆粒上的脂質體融合協同地裝載、包封或密封。所述負載物可包括，例如，小分子藥物(例如，尤其包括抗癌藥物和/或抗病毒藥物如抗HBV或抗HCV藥物)、肽、蛋白質、抗體、DNA(尤其是質粒DNA，包括優選的組蛋白封裝的超螺旋質粒DNA)、RNA(包括shRNA和siRNA(其也可由作為負載物摻入原始細胞中的質粒DNA表達))、螢光染料(包括螢光染料肽，其可由摻入原始細胞內的質粒DNA表達)。[0243]在本發明的實施方案中，負載物可被裝載至多孔顆粒核的孔(中孔)中以形成經裝載的原始細胞。在多項實施方案中，任何開發用於基於脂質體的藥物遞送的常規技術，例如使用PEG化的靶向遞送，可被轉移並應用於本發明的原始細胞。[0244]如上文所討論的，靜電學和孔徑可在負載物裝載中發揮作用。例如，多孔二氧化娃納米顆粒可搬運負電荷，而孔徑在約2nm至約IOnm或IOnm以上是可調的。負電荷納米顆粒可具有吸附正電荷分子的自然趨勢，而正電荷納米顆粒具有吸附負電荷分子的自然趨勢。在多項實施方案中，其它性質如表面潤溼性(如，疏水性)也可影響具有不同疏水性的負載物的裝載。[0245]在多項實施方案中，負載物裝載可以是通過調整脂質組合物進行的協同的脂質輔助的裝載。例如，如果負載物組分是負電荷分子，則負載物裝載至負電荷二氧化矽可通過脂質輔助的裝載實現。在一些實施方案中，例如，當脂質雙層融合至二氧化矽表面顯示融合和協同裝載機制時，帶負電荷的物種可作為負載物被裝載至負電荷二氧化矽顆粒的孔中。以該方式，帶負電荷的中孔顆粒上的非負電荷(即，正電荷或中性)脂質雙層或脂質體的融合可用於裝載具有負電荷負載物組分的顆粒核。所述負電荷負載物組分可在經裝載的原始細胞(與溶液中帶電荷的負載物組分相比，其具有超過約100倍的濃度)中濃縮。在其它實施方案中，通過改變中孔顆粒和脂質雙層的電荷，正電荷負載物組分可被容易地裝載至原始細胞中。[0246]—旦產生，在給予後，所述經裝載的原始細胞可具有細胞攝取以將負載物遞送至所需位點。例如，可向患者或受試者給予負載物裝載的原始細胞並且包含靶向肽的原始細胞可與靶細胞結合併被靶細胞(例如，受試者或患者中的癌細胞)內化或攝取。由於靶細胞中負載物裝載的原始細胞的內化，然後負載物組分可被遞送至靶細胞中。在一些實施方案中，所述負載物為小分子，其可被直接遞送至靶細胞中用於治療。在其它實施方案中，負電荷DNA或RNA(包括shRNA或siRNA)，尤其包括DNA質粒(其優選配製為組蛋白封裝的超螺旋質粒DNA，優選地經核定位序列修飾)可被靶細胞直接遞送或內化。因此，DNA或RNA可首先被裝載至原始細胞中，然後通過所述經裝載的原始細胞的內化遞送至靶細胞中。[0247]如所討論的，被裝載至原始細胞並被原始細胞遞送至靶細胞中的負載物包括小分子或藥物(尤其是抗癌劑或抗HBV劑和/或抗HCV劑)、生物活性大分子(生物活性多肽，如蓖麻毒素A鏈或白喉毒素A鏈或RNA分子,如shRNA和/或siRNA,如本文另有描述)或組蛋白封裝的超螺旋質粒DNA(其可表達治療性或診斷性肽或治療性RNA分子如shRNA或siRNA，其中所述組蛋白封裝的超螺旋質粒DNA任選地並優選地經核定位序列(其可定位並濃縮所遞送的質粒DNA至靶細胞的細胞核中)修飾)。如此，經裝載原始細胞可將它們的負載物遞送至靶細胞以用於治療或診斷。[0248]在本發明的多項實施方案中，原始細胞和/或經裝載的原始細胞可提供靶向遞送方法學以選擇性地將所述原始細胞或負載物組分遞送至靶細胞(例如，癌細胞)中。例如，脂質雙層的表面可經相應於靶細胞的靶向活性物種修飾。所述靶向活性物種可以是本文另有描述的靶向肽、包含抗體或抗體片段的多肽、適體、碳水化合物或其它與靶細胞結合的部分。在本發明的優選方面中，所述靶向活性物種是本文另有描述的靶向肽。在一些實施方案中，優選的肽靶向物種包括本文另有描述的MET結合肽。[0249]例如，通過在經裝載的原始細胞的表面上提供靶向活性物種(優選靶向肽)，所述原始細胞選擇性地與本發明的祀細胞結合。在一項實施方案中,通過將祀向癌細胞(包括肝癌細胞)的本文另有描述的示例性靶向肽SP94或類似物或MET結合肽綴合至脂質雙層，由於所述示例性SP94或MET結合肽對所述癌(包括肝癌)細胞的特異性祀向，大量的負載物裝載的原始細胞可被該特異性癌細胞識別並內化。在大多數情況中，如果所述原始細胞與所述靶向肽綴合，則所述原始細胞選擇性地與所述癌細胞結合併且不與非癌性細胞發生明顯的結合。[0250]一旦被所述靶細胞結合併攝取，所述經裝載的原始細胞可從多孔顆粒釋放負載物組分並將所釋放的負載物組分轉運至靶細胞中。例如，被多孔顆粒核上的脂質體融合的雙層密封在原始細胞內的負載物組分可從所述脂質雙層的孔中釋放，轉運穿過所述脂質雙層的原始細胞膜並遞送至靶細胞內。在本發明的實施方案中，原始細胞中負載物組分的釋放特點與僅使用本領域已知的脂質體時的釋放特點相比更可控。負載物的釋放可通過例如多孔核和脂質雙層的相互作用和/或其它參數如系統的PH值來測定。例如，負載物的釋放可通過脂質雙層、通過多孔二氧化矽的溶解實現；同時負載物從原始細胞中的釋放可以是PH依賴的。[0251]在一些實施方案中，負載物的pH值常小於7，優選為約4.5至約6.0，但可以是約pH14或小於pH14。較低的pH與高pH相比傾向於更顯著地促進負載物組分的釋放。較低的PH是有利的，因為大多數細胞中的內體隔室處於低pH(約5.5)，但細胞的負載物遞送速率可被負載物的pH影響。取決於負載物和負載物從原始細胞中釋放所處的pH，負載物的釋放可以是相對短的(約數小時至一天)或持續數天至約20-30天或更長。因此，本發明可適應於從原始細胞本身的即釋和/或緩釋應用。[0252]在一些實施方案中，表面活性劑的納入可使得脂質雙層快速的破裂，將負載物組分轉運穿過原始細胞以及靶細胞的脂質雙層。在一些實施方案中，表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉(SDS)的應用/釋放可使所述原始細胞的磷脂雙層破裂，從而促進負載物快速地從原始細胞中釋放至靶細胞中。除表面活性劑外，其它材料也可被納入以使所述雙層快速破裂。一個實例是金或磁性納米顆粒，其可使用光和熱以產生熱量從而使所述雙層破裂。此外，可調節所述雙層以在離散的生物物理現象如在響應活性氧簇產生增加的炎症過程中破裂。在一些實施方案中，所述脂質雙層的破裂可依次誘導負載物組分從原始細胞的顆粒核的孔中即刻釋放和完全釋放。以該方式，與本領域的其它遞送系統相比，原始細胞平臺可提供日益多樣的遞送系統。例如，當與僅使用納米顆粒的遞送系統相比時，本文所公開的原始細胞平臺可提供簡單的系統並可利用脂質體或脂質雙層的低毒性和免疫原性以及其被PEG化或被綴合以延長循環時間和影響靶向作用的能力。在另一實例中，當與僅使用脂質體的遞送系統相比，所述原始細胞平臺可提供更穩定的系統並利用中孔核以控制裝載和/或釋放特點並提供增加的負載物容量。[0253]此外，多孔顆粒核上的脂質雙層和其融合可被微調以控制裝載、釋放和靶向特點並且可包含融合肽和相關的肽以促進原始細胞的遞送，達到更大的治療性和/或診斷性作用。而且，所述原始細胞的脂質雙層可為配體展示和多價靶向提供流體界面，由於流體脂質界面上配體重組的容量，其允許相對低表面配體密度的特異性靶向。此外，本文所公開的原始細胞可容易地進入靶細胞而無多孔顆粒支撐的空脂質體不能被所述細胞內化。[0254]本發明的藥物組合物包含如本文另有描述與藥學上可接受的載體、添加劑或賦形劑組合配製以產生預期結果(例如，治療性結果和/或診斷性分析，包括治療監測)的有效群體的原始細胞。取決於所需要獲得的結果，所述組合物群體內的原始細胞可以是相同的或不同的。本發明的藥物組合物還可包含額外的生物活性劑或藥物，如抗癌劑或抗病毒劑，例如抗HIV劑、抗HBV劑或抗HCV劑。[0255]通常，根據受試者的體格大小和病症，根據標準的藥物規範，確定所述化合物的給予劑量和途徑。所採用的劑量水平可變化巨大，且可由本領域的技術人員容易地確定。通常，採用毫克(mg)至克(g)的量。可通過多種途徑，例如口服、經皮、圍神經或胃腸外(即靜脈)、皮下、腹膜內、鞘內或肌內注射，向受試者給予所述組合物，其中包括口腔、直腸和經皮給予。本發明的方法治療的受試者包括人、伴侶動物、實驗動物等。本發明涵蓋即釋和/或緩/控釋組合物，包括同時包含即釋和緩釋製劑的組合物。當不同群體的原始細胞用於藥物組合物中時或當一種或多種額外的生物活性劑與一種或多種群體的本文另有描述的原始細胞組合使用時，尤其如此。[0256]包含本發明化合物的製劑可以是液體、固體、半固體或凍乾粉末形式，如例如，溶液、混懸液、乳劑、緩釋製劑、片劑、膠囊、散劑、栓劑、乳膏劑、軟膏劑、洗劑、氣霧劑、貼劑等，優選適於容易給予精確計量的單位劑量形式。[0257]本發明的藥物組合物通常包括常規藥物載體或賦形劑且可能額外地包括其它藥用劑、載體、佐劑、添加劑等。優選地，所述組合物為約0.1重量％至約85重量％、約0.5重量％至約75重量％為本發明的一種或多種化合物，其餘基本上由適宜的藥物賦形劑組成。[0258]用於胃腸外給予(例如，靜脈、肌內或鞘內)的可注射組合物通常包含於適宜1.V.溶液如滅菌生理鹽水溶液中的化合物。所述組合物還可作為混懸劑在水性乳劑中配製。[0259]液體組合物可通過將原始細胞群(約0.5重量％至約20重量％或更多)和任選的藥用佐劑溶解或分散於載體例如鹽水、水性葡萄糖、甘油或乙醇中以形成溶液或混懸劑。為用於口服液體製劑，可以溶液、混懸劑、乳劑或糖漿劑製備所述組合物，以液體形式或適於在水或生理鹽水中水合的乾燥形式提供。[0260]為了口服給予，這類賦形劑包括藥用級別的甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、明膠、蔗糖、碳酸鎂等。如果需要，所述組合物也可包含少量的非毒性輔助物質如潤溼劑、乳化劑或緩衝劑。[0261]當所述組合物以固體製劑的形式用於口服給予時，所述製劑可以是片劑、顆粒劑、散劑、膠囊等。在片劑製劑中，所述組合物通常與添加劑例如賦形劑(如糖類或纖維素製劑)、粘合劑如澱粉糊或甲基纖維素、填充劑、崩解劑和其它藥物製劑製備中通常使用的添加劑一起配製。[0262]製備這類劑型的方法是已知的或者對本領域的技術人員而言是顯而易見的；例如，參見Remington’sPharmaceuticalSciences(17thEd.,MackPub.C0.,1985)。所給予的組合物將包含在生物學系統(包括本發明的患者或受試者)中用於治療性用途的藥學上有效量的所選擇的化合物。[0263]治療有需要的患者或受試者的特定疾病狀態或感染(尤其包括癌症和/或HBV、HCV或HIV感染)的方法包括給予有效量的本發明的藥物組合物，所述藥物組合物包含治療性原始細胞和任選至少一種額外的生物活性(例如，抗病毒)劑。[0264]本發明的診斷性方法包括向有需要的患者(懷疑患有癌症的患者)給予有效量的診斷性原始細胞群(例如，包含靶物種，如靶向肽(其與癌細胞和報告子組分選擇性結合，從而若所述癌細胞存在，則標識原始細胞與癌細胞的結合)的原始細胞)，於是使得由所述報告子組分(部分)證明的原始細胞與癌細胞的結合能夠診斷患者中癌症的存在。[0265]本發明替代性的診斷性方法可用於監測患者中癌症或其它疾病狀態的治療，所述方法包括在治療前向患者或受試者給予有效群體的診斷性原始細胞(例如，包含祀物種，如靶向肽(其與癌細胞和報告子組分選擇性結合，從而若所述癌細胞存在，則標識原始細胞與癌細胞的結合)的原始細胞)，測定所述患者中診斷性原始細胞與祀細胞的結合水平，並且在治療過程中和/或治療後，測定所述患者中診斷性原始細胞與靶細胞的結合水平，於是治療開始前和治療過程中和/或治療後患者中結合的差異將證明患者中治療的有效性，包括患者是否完成治療或疾病狀態是否被抑制或消除(包括癌症的緩解)。[0266]以下非限制性實施例是本發明和其有利特性的解釋，並不以任何方式限制本發明公開的內容或權利要求。在實施例以及本申請的任意處，除非另外指出，所有份數和百分數均以重量計。[0267]實施例1[0268]配體靶向原始細胞[0269]如以下實施例所提供的，經由脂質體與納米多孔二氧化矽顆粒融合形成的多孔納米顆粒支撐的脂質雙層(原始細胞)是一種新型的納米載體，其解決了與癌症治療和診斷的靶向遞送相關的多種挑戰。與脂質體相似，原始細胞是生物相容的、生物可降解的和非免疫原性的，但與類似大小的脂質體遞送劑相比，其納米多孔二氧化矽核賦予了極大增加的負載物容量和延長的雙層穩定性。而且，可調節該核的孔隙率和表面化學以促進多種治療劑如藥物、核酸和蛋白質毒素的包封。可通過孔徑和二氧化矽的總體壓縮程度來控制負載物的釋放速率，使得原始細胞用於需要爆發性釋放或控釋特點的應用中。最終，該原始細胞的受支撐的脂質雙層(SLB)可經配體修飾以促進選擇性遞送和經PEG修飾以延長循環時間。在實施例中，【發明者】報告了使用肽靶向的原始細胞實現編碼小髮夾RNA(shRNA)的質粒的高度特異性遞送，其通過沉默細胞周期蛋白BI誘導轉染細胞的生長停滯和細胞凋亡。如以下實施例部分所述，【發明者】已通過使用雙重表面活性劑方法製備了具有足夠大孔的合成的二氧化矽納米顆粒以適應組蛋白封裝的質粒。當用於與膨脹劑(1，3，5-三甲基苯)合用時，非離子型表面活性劑(Pluronic?F-127)用作大孔模板，而碳氟化合物表面活性劑(FC-4)促進二氧化矽核的生長。所得的顆粒直徑範圍為IOOnm至300nm並包含具有20nm孔和17.3nm孔入口的有序網絡。超螺旋質粒DNA經組蛋白封裝，並且所得複合物(直徑約15nm)在裝載至二氧化矽核之前經核定位序列(NLS)修飾。在37°C暴露於模擬體液後，月旨質體與納米多孔核的融合促進了包封DNA的長期滯留(>1個月)。使用噬菌體展示，【發明者】鑑別出對肝細胞生長因子受體(c-Met)(已知其被多種類型的肝細胞癌(HCC)過表達)具有納摩爾親和性的靶向肽。裝載有DNA-組蛋白-NLS並經"240份副本(每一靶向肽和融合肽促進原始細胞和包封DNA的內體逃逸)修飾的原始細胞能夠轉染分裂和未分裂的HCC。此外，靶原始細胞有效地誘導HCC的GJM停滯和細胞凋亡(LC，，=25nM)而不影響非癌性細胞(包括肝細胞、內皮細胞和免疫細胞(PBMC、B細胞和T細胞))的活力。[0270]方法[0271]如前所述1,2(也參見Ashley等人,NatureMaterials,2011,May；10(5):389-97)使用在油包水乳劑液滴1內的氣溶膠輔助的蒸發誘導自組裝(EISA)或溶劑萃取驅動的自組裝從一種或多種水溶性二氧化矽前體和一種或多種兩親性表面活性劑製備形成原始細胞的核的納米多孔二氧化矽顆粒。溶劑蒸發或萃取濃縮了一種或多種表面活性劑中的氣溶膠或乳劑液滴，其指導周期的有序結構(在其周圍二氧化矽組裝並濃縮)的形成。通過熱煅燒除去表面活性劑，得到具有界限清楚、均勻的孔徑和拓撲學的多孔納米顆粒。經由氣溶膠輔助的EISA形成的顆粒(「單式」顆粒)具有平均直徑為大約120nm(在基於尺寸排阻的分離後)，Brunauer-Emmer-Teller(BET)表面積超過1200m2/g,孔體積分數為約50%,且單式孔直徑為2.5nm。在乳劑液滴內形成的顆粒(『多形』顆粒)具有平均直徑為~150nm(在基於尺寸排阻的分離後)，BET表面積>600m2/g，孔體積分數為~65%，且多模式孔形態學由被6-12nm孔互連的大的(20_30nm)、表面可及的孔組成。(分別)與氣溶膠或乳劑加工有關的液-汽或液-液界面張力強制形成具有最小表面糙度的球形。此外，氮吸附等溫線的分析證明兩種類型的顆粒均具有完全可及的三維孔網。[0272]所述納米多孔二氧化矽核的高孔體積、表面積和可及性賦予了高負載物容量並使得能夠快速裝載多種類型的治療性和診斷性藥劑。單式納米多孔核對低分子量的化療劑具有聞容量，而多形核具有包封siRNA、蛋白質毒素和其它聞分子量負載物(例如，質粒DNA)所需的大的、表面可及的孔。通過二氧化矽核的濃縮程度可精確地控制負載物的釋放速率。將各種量的AEPTMS、含胺矽烷摻入至用於形成納米多孔二氧化矽核的溶膠中降低了可達到的濃縮水平並促進了所述核在中性pH、高離子強度(即，細胞溶質)條件下更加快速的溶解。不含AEPTMS的顆粒在模擬體液中歷時2周時間溶解，而含30mol%AEPTMS的顆粒在24小時內溶解。因此，原始細胞可適應於需要連續或爆發性釋放特點的應用。[0273]將AEPTMS摻入至用於形成納米多孔二氧化矽顆粒的前體溶膠中促進了在細胞溶質條件下的顆粒溶解並促進包封負載物與經簡單擴散達到的釋放速度相比更加快速的釋放。然而，經AEPTMS修飾的顆粒還降低了對弱鹼性化療藥物(例如，多柔比星)的容量。因此，為了最大化容量和細胞內釋放，我們描述了ζ電勢、負載物(例如，藥物(多柔比星/DOX)/化療)容量、二氧化矽溶解速率和負載物釋放速率作為AEPTMS濃度的函數。如之前所證明的，未經修飾的單式顆粒(ζ=-104.5±5.6)對負載物具有高容量(在DOX的情況中，每IOltl顆粒~1.8mM)但在24小時(即，HCC的典型的倍增時間)內僅釋放其20%的包封負載物(藥物)。相反的，經30重量％AEPTMS修飾的單式顆粒(ζ=88.9±5.5)在6小時內釋放其所有的包封負載物(藥物)，但具有降低的藥物(DOX)容量(每IOltl顆粒~0.15mM)。含15重量％AEPTMS的多形顆粒(ζ=-21.3±5.I)保留了其對藥物(DOX)的高容量(每IOltl顆粒~1.1mM)並且當暴露於模擬體液時在24小時內釋放其幾乎所有的包封負載物(藥物)；因此這些顆粒被選用於涉及負載物遞送的所有實驗。應當著重注意，儘管單式二氧化矽顆粒的ζ電勢作為AEPTMS濃度的函數增加，但經AEPTMS修飾的顆粒的孔體積分數(對於含30重量％AEPTMS的顆粒，~45%)與未經修飾的顆粒(~50%)基本上沒有差異。因此，我們將經AEPTMS修飾的單式顆粒的負載物容量降低歸因於靜電排斥而不是孔體積降低。多形顆粒被納入作為對照以證明孔徑對負載物容量和負載物釋放動力學的影響。[0274]通用試劑[0275]無水乙醇、鹽酸(37%)、原矽酸四乙酯(TE0S，98%)、3_氨基丙基三乙氧基矽烷(APTES，^98%)、3-[2-(2_氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基矽烷(AEPTMS,工業級)、2_氰基乙基三乙氧基矽烷(CETES，≥97.0%)、溴化十六烷基三甲基銨(CTAB,≥99%)、Brif-56、十二烷基硫酸鈉(sds,^98.5%),Triton?x-1oo、十六烷(≥99%)、鹽酸多柔比星(≥98%)、5_氟尿嘧啶(≥99%)、順式二胺二氯鉬(II)(順鉬，>99.9%)、從白喉桿菌獲得的白喉毒素、從多孔木黴獲得的環孢菌素A(CsA,>95%),N-乙醯基-L-半胱氨酸(NAC，≥99%)、人表皮生長因子、L-α-磷脂醯乙醇胺、胸苷(≥99%)、次黃嘌呤(≥99%)、牛纖連蛋白、牛膠原I型、明膠、大豆胰蛋白酶抑制劑(≥98%)、2_巰基乙醇(≥99.0%)、DL-二硫蘇糖醇(≥99.5%)、二甲亞碸(≥99.9%)、ρΗ5檸檬酸緩衝液、乙二胺四乙酸(EDTA，99.995%)、4_(2_羥乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸(HEPES,^99.5%)、磷酸氫二胺(^99.99%)和Sepharose?CL-4B購自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。ABIL*EM90(鯨蠟基PEG/PPG-10/1二甲矽油)購自EvonikIndustries(Essen,Germany)。超純、EM級甲醒(16%，無甲醇)購自Polysciences,Inc.(Warrington,PA)。He"rnanexII購自(Milllheim,Germany)。[0276]脂質[0277]I,2-二油醯基-sn-甘油_3_磷酸膽鹼(DOPC)、I,2_二棕櫚醯基_sn_甘油_3_磷酸膽鹼(DPPC),1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC),1,2-二油醯基_3_三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)、1，2-二油醯基-sn-甘油_3_磷酸化-0--rac-甘油)(DOPG)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油_3_磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)U-油醯基_2-[12-[(7_硝基-2-1,3-苯並噁唑_4_基)氨基]月桂醯基]-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(18:1-12:0NBDPC)、1-棕櫚醯基-2-{12-[(7-硝基-2-1，3-苯並噁唑-4-基)氨基]月桂醯基}-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(16:0-12:ONBDPC)和膽固醇購自AvantiPolarLipids、Inc.(Alabaster,AL)。[0278]細胞系和生長基質[0279]人H印3B(HB-8064)、人肝細胞(CRL-11233)、人外周血單核(CRL-9855)、人臍靜脈內皮細胞(CRL-2873)、T淋巴細胞(CRL-8293)、B淋巴細胞(CCL-156)、Eagle最低必需培養基(EMEM)、Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)、Iscove改良的Dulbecco培養基(IMDM),RPMI1640培養基、胎牛血清(FBS)、和IX胰蛋白酶-EDTA溶液(含0.53mMEDTA的0.25%胰蛋白酶)購自美國典型培養物中心(ATCC;Manassas,Virginia)。BEGMBullet試劑盒購自LonzaGroupLimited(Clonetics;WalkersviIIe,MD)。無酌.紅的DMEM購自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。[0280]螢光染料和顯微鏡試劑[0281]Hoechst33342(350/461)、4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAP1、356/451)、AlexaFluor?405羧酸、琥珀醯亞胺酯(401/421)、CellTracker?VioletBMQC(415/516)、CellTracker?GreenCMFDA(492/517)、鈣黃綠素(495/515)、膜聯蛋白V的AlexaFluor?488綴合物(495/519)、AlexaFluor?488山羊抗小鼠IgG(H+L)(495/519)、Click-1T*AHAAlexaFluor?488蛋白質合成HCSA分析(495/519)、LIVE43EAD?可固定綠色死細胞染色試劑盒(495/519)、SYTOX?綠色核酸染色(504/523)、MitoSOX?紅色線粒體超氧化物指示劑(510/580)、AlexaFIUOT?532羧酸、琥珀醯亞胺酯(532/554)、碘化丙啶(535/617)、pHrodo?琥珀醯亞胺酯(558/576)、CellTracker?RedCMTPX(577/602)、TexasRed?1，2_二(十六醯基)_sn_甘油_3_磷酸乙醇胺(TexasRed?DHPE,583/608)、AlexaFluor647醯肼(649/666)、AlexaFluor?647羧酸、琥珀醯亞胺酯(650/668)、Ulysis?AlexaFluor?647核酸標記試劑盒(650/670)和膜聯蛋白V的AlexaFluor?647綴合物(650/665)、ShwFadeglGold抗衰減試劑(含和不含DAPI)和Image-1T?FX信號增強劑、IXDulbecco磷酸鹽緩衝鹽水(D-PBS)、牛血清白蛋白第五組分溶液(BSA，7.5%)和轉鐵蛋白購自InvitrogenLifeSciences(Carlsbad,CA)。紅色突光蛋白(RFP,557/585)、CaspGLOff?螢光素活性半胱天冬酶-3染色試劑盒(485/535)和CaspGLOW?紅色活性半胱天冬酶-8染色試劑盒(540/570)購自BioVision,Inc.(MountainView,CA)。水溶性CdSe/ZnS量子點、CZWD640(640/660)購自NN-Labs(Fayetteville,AR)。[0282]交聯劑[0283]1-乙基_3_[3_二甲基氨基丙基]碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)、4_[N_馬來酸亞胺基甲基]環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯(SMCC)、Ν-[β-馬來醯亞胺基丙酸]醯肼(BMPH)、琥珀醯亞胺基-[(N-馬來醯亞胺基丙醯胺基)_二十四乙二醇]酯(SM(PEG)24)、6-[3'-(2-批啶基二硫代)_丙醯胺基]己酸琥珀醯亞胺酯(LC-STOP)和巰基添加試劑盒(SulfhydrylAdditionKit)購自PierceProteinResearchProducts(ThermoFisherScientificLSR；Rockford,IL)。[0284]其它二氧化矽納米顆粒[0285]亞5nm娃納米顆粒購自MeloriumTechnologies,Inc.(Rochester,NY)。10_20nm氧化娃納米顆粒購自SkySpringNanomaterials,Inc.(Houston,TX)。30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、lOOnm、150nm、200nm和10μm二氧化娃顆粒購自DiscoveryScientific,Inc.(Vancouver,BritishColumbia)。[0286]合成的siRNA和肽[0287]沉默子選擇siRNA(對於EGFR、VEGFR-2和PDGFR-a，siRNAID分別為s565、s7824和sl0234)購自Ambion,Inc.(Austin,TX)。具有5』氨基改良劑C12的雙鏈DNA寡核苷酸(5，-AAACATGTGGATTACCCATGTC-3』)購自IntegratedDNATechnologies(IDT;Coralville，IA)。「游離的」SP94肽(H2N-SISIILTPILPL-C00H,SEQIDN0:6)、經C端半胱氨酸改良用於綴合的SP94肽(H2N-SiSlII/IPILP1.GGC-C00H,SEQIDNO:7)和用於圖2d募集實驗的SP94肽(H2N-SFSI1LTP1LPLEEEGGC-C00H,SEQIDNO:8)由NewEnglandPeptide(Gardner,MA)合成。H5WYG肽(H2N-GLFHAIAHFIHGGWHGLIHGWYGggc-cooh)和核定位序列(H2N-NQSSNFC；PMK(；(；NF(；(；RSS(；PVCMC)中，且在二氧化矽顆粒濃縮(在水相中)後，所得膠束模製6-12nm孔。此外，兩種表面活性劑(CTAB和AbilEM90)在水油界面的吸附協同地降低了界面張力，導致模製大的、表面可及孔的20-30nm微乳劑液滴的自發形成。[0295]二氧化矽納米顆粒的特徵描述[0296]使用ZetasizerNano(Malvern!Worcestershire,UnitedKingdom)進行納米多孔二氧化矽顆粒的動態光散射。通過將48μL二氧化矽顆粒(25mg/mL)稀釋於2.4ml的IXD-PBS中製備樣品。將溶液轉移至ImL聚苯乙烯試管(Sarstedt；Niimbrecht,Germany)用於分析。使用ASAP2020表面積和孔隙率分析儀(MicromeriticsInstrumentCorporation；Norcross,GA)進行氮吸附。使用ZetasizerNano(Malvern!Worcestershire,UnitedKingdom)測量ζ電勢。在一項典型的實驗中，將二氧化矽顆粒、脂質體或原始細胞以1:50稀釋於模擬體液(ρΗ7.4)或檸檬酸緩衝液(ρΗ5.0)(兩種緩衝液均經調節以包含150mMNaCl)中，並轉移至Iml摺疊毛細孔(foldedcapillarycell)(Malvern；Worcestershire,UnitedKingdom)用於分析。見DLS和氮吸附數據的附圖1和二氧化娃納米顆粒、脂質體和原始細胞的ζ電勢值的附圖12。[0297]原始細胞的合成、裝載和表面功能化[0298]脂質體與納米多孔二氧化矽顆粒的融合[0299]Liu等人25_27描述了用於合成原始細胞的操作並將簡單地提及。脂質訂購自AvantiPolarLipids,將其預溶解於氯仿中並在_20°C保存。在氮氣流下乾燥2.5mg脂質並放置於真空烘箱(Model1450M,VffRInternational,WestChester,PA)中過夜以除去殘餘溶劑，然後立即進行原始細胞合成。濃度為2.5mg/mL的脂質在0.5XD-PBS中再水合併使用Min1-Extruderset(AvantiPolarLipids,Inc.；Alabaster,AL)將脂質通過IOOnm過濾器至少10次。將DPPC和DSPC溶解於預熱至其各自轉變溫度(41°C和55°C)的0.5XD-PBS中，並在擠出過程中維持在60°C。所得脂質(直徑~120nm)在4°C保存不超過一周。在室溫將納米多孔二氧化矽核溶解於0.5XD-PBS(25mg/mL)中並暴露於過量的脂質體(1:2-1:4體積比的脂質:二氧化矽)中30-90分鐘。在4°C將原始細胞在過量脂質存在下保存達3個月。為除去過量的脂質，將原始細胞在10，OOOrpm離心5分鐘，洗滌兩次並在0.5XD-PBS中再懸浮。[0300]受支撐的脂質雙層組合物的優化[0301]優化SLB組合物以最小化非特異性結合和毒性以控制細胞；使用的多種脂質的結構參見附圖4。用於所有表面結合、內化和遞送實驗的原始細胞具有由DOPC(或DPPC)和5重量％DOPE(或DPPE)、30重量％膽固醇、和5重量％18:1(或16:0)PEG-2000PE組成的SLB。如果有必要，可將螢光脂質(18:1-12:0NBD-PC、16:0-12:0NBD-PC、或TexasRed*DHPE)以1-5重量％摻入至SLB中。在再水合和擠出前將脂質一起凍幹；例如合併和乾燥75μL的DOPC(25mg/mL)、5μL的DOPE(25mg/mL)、10μL的膽固醇(75mg/mL)、5μL的18:1PEG-2000PE(25mg/mL)和5μL的18:1-12:ONBD-PC(5mg/mL)以形成由DOPC和5重量％DOPE、30重量％膽固醇、5重量％PEG-2000和I重量％NBD-PC組成的脂質體。[0302]經多種類型的靶向配體修飾的受支撐的脂質雙層[0303]通過將多種密度的多種類型的靶向配體與SLB綴合以優化原始細胞對HCC的特異性親和性。經由異雙功能交聯劑NHS-(PEG)n-馬來醯亞胺(其對巰基和胺部分具有反應性並具有PEG間隔臂，其長度可改變以優化特異性親和性)，將SP94和H5WYG肽(與C端半胱氨酸殘基合成)與PE的頭基中存在的伯胺綴合。在大多數研究中使用SM(PEG)24(間隔臂=9.52nm)。使用巰基添加試劑盒(根據製造商說明書)將轉鐵蛋白、抗EGFR和CHALV-1中存在的胺部分轉化成游離的巰基。使用SM(PEG)2Jf功能化的轉鐵蛋白和抗體與SLB中的PE綴合。通過反應立體化學和孵育時間控制配體密度。例如在室溫使用10倍摩爾過量的SP94孵育原始細胞2小時以得到0.015重量％的肽密度(~6肽/原始細胞)，而在4°C使用5000倍摩爾過量的SP94過夜孵育原始細胞以得到5.00重量％的肽密度(~2048肽/原始細胞)通過Tricine-SDS-PAGE(SP94和H5WYG肽)或Laemml1-SDS-PAGE(轉鐵蛋白、抗EGFR和CHALV-1)28測定平均配體密度。簡而言之，在使用LC-SH)P(間隔臂=1.57nm)，一種與伯胺和巰基反應並經可經由還原消除的異雙功能交聯劑條件下，使用多種配體密度修飾原始細胞。將原始細胞暴露於IOmM二硫蘇糖醇(DTT)30分鐘並在10，OOOrpm離心5分鐘；所得含有游離配體的上清液的濃度經由SDS-PAGE通過使用ImageJImage處理和分析軟體(NationalInstitutesofHealth；Bethesda,MD)比較各樣品的條帶強度來測定。20%明膠(含6%雙丙烯醯胺和6M尿素)用於分析SP94和H5WYG肽的密度。10%明膠用於分析抗體(抗EGFR和CHALV-1)的密度，而15%明膠用於分析轉鐵蛋白的密度。[0304]螢光標記的納米多孔核的製備[0305]通過向900μL含20%APTES的0.5ΧD-PBS中添加100μL顆粒(25mg/mL)螢光標記納米多孔核；在室溫在APTES中過夜孵育顆粒並離心(10，OOOrpm,5分鐘)以除去未反應的APTES，並再懸浮於ImL0.5XD-PBS中。添加胺反應性螢光團(fIuorophore)(例如AlexaFluor*647甲酸琥珀醯亞胺酯；lmg/mL於DMSO中)(每mL顆粒5μL染料)，並將所述顆粒在室溫保持2小時，然後離心除去未反應的染料。在4°C將螢光標記的顆粒保存於0.5XD-PBS中。[0306]使用化療藥物裝載單式核和脂質體[0307]在脂質體融合前，在室溫將經修飾含有15重量％AEPTMS(25mg/mL)的單式納米多孔核浸泡於多柔比星(5mM)或多柔比星、順鉬和5-氟尿嘧啶(每種藥物各5mM)的混合物中I小時。經顆粒在10，OOOrpm離心5分鐘除去過量藥物。使用在先描述的磷酸銨梯度法29，使用DOX裝載120nm脂質體。簡而言之，脂質薄膜經300mM(NH4)2HPO4再水合，並且所述脂質體溶液通過IOOnm膜擠出至少10次。脂質體經等張性緩衝溶液(140mMNaCl,IOmMHEPES、pH7.4)經由滲析(Float-A-LyzerG2滲析單兀、3.5_5kDaMWCO；SpectrumLaboratories,Inc.；RanchoDominguez,CA)平衡，並在4°C經鹽酸多柔比星(1:3藥物:月旨質摩爾比)過夜孵育。如在先所述3°，31使用5-FU或順鉬裝載脂質體。[0308]使用多組分混合物、siRNA和白喉毒素A鏈裝載多式核[0309]將經修飾含有20重量％AEPTMS(25mg/mL)的多式納米多孔核浸泡於鈣黃綠素(5mM)、AlexaFluor;647標記的dsDNA寡核苷酸(100μΜ)、RFP(100μΜ)和CdSe/ZnS量子點(10μΜ)的溶液中4小時；各負載物的濃度可改變以得到高光譜成像最適的螢光強度。通過將各為Img的鈣黃綠素和NLS溶解於850μLIXD-PBS中使用NLS修飾鈣黃綠素(使用C端半胱氨酸殘基合成)；添加100μLEDC(10mg/mL於去離子水中)和50μLBMPH(10mg/mL於DMSO中),並在室溫孵育該混合物2小時。經滲析(Slide-A-Lyzermini滲析單元，2kDaMWCO；ThermoFisherScientificLSR；Rockford,IL)除去過量的鈣黃綠素。使用Ulysis?AlexaFluor?647核酸標記試劑盒(根據製造商說明書)標記dsDNA寡核苷酸並通過混合50μLdsDNA(2mM於去離子水中)和50μLNLS(ImM於DMSO中)以及10μLSMCC(10mg/mL於DMSO中)經NLS修飾；在室溫孵育該混合物2小時,並經滲析(Slide-A-Lyzermini滲析單兀，7kDaMWCO；ThermoFisherScientificLSR；Rockford,IL)除去過量的NLS。對於附圖13-16中所述的遞送實驗，在4°C將經20重量％AEPTMS(25mg/mL)修飾的多式納米多孔核浸泡於SiRNA(IOOyM)或白喉毒素A鏈(100μM)2小時。經10，OOOrpm離心5分鐘除去未包封的負載物，並立即將脂質體與負載物裝載的核融合。[0310]使用組蛋白封裝CBl質粒。[0311]圖4描述了用於使CBl質粒(pCBl)超螺旋的方法。示意圖描述了使用高飽和鹽溶液使CBl質粒(pCBl)(下文和附圖12中所示的CBl質粒載體)超螺旋，使用組蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4封裝超螺旋的pCBl，並使用通過與組蛋白綴合促進易位通過核孔的核定位序列(NLS)修飾所得的pCBl-組蛋白複合物的方法。圖4(B)和⑶顯示CBl質粒(B)和組蛋白封裝的PCBl(D)的原子力顯微鏡(AFM)圖像。比例尺=lOOnm。(C)和(E)分別對應於(B)和(D)中紅線的高度剖面圖。[0312]裝載有組蛋白封裝的pCBl的MC40靶向中孔二氧化矽納米顆粒支撐的脂質雙層(原始細胞)的合成。[0313]如圖5所述，5㈧提供了描述用於產生DNA裝載的、肽靶向的原始細胞的方法。根據該方法，通過簡單地將顆粒浸入PCBl-組蛋白複合物溶液中將組蛋白-封裝的pCBl裝載至形成原始細胞核的中孔二氧化矽顆粒中。然後將PEG化的脂質體與DNA-裝載的核融合以形成受支撐的脂質雙層(SLB)(其進一步經結合HCC的靶向肽(MC40)和促進內化原始細胞內體逃逸的內體裂解肽(H5WYG)修飾)。巰基-胺交聯子(間隔臂=9.5nm)用於將經C-端半胱氨酸殘基修飾的肽綴合至SLB的DOPE部分。圖5(B)顯示可用作原始細胞核的中孔二氧化矽納米顆粒的透射電子顯微鏡圖像。比例尺=200nm。插入圖=掃描電子顯微鏡(SEM)圖像,其證明15-25nm孔是表面可及的。插入圖比例尺=50nm。5(C)顯示中孔二氧化矽納米顆粒的大小分布，其由動態光散射(DLS)測定。(5D，左軸)中孔二氧化矽納米顆粒的累積孔體積圖，其使用Barrett-Joyner-Halenda(BJH)模型由圖S-4A所示的氮吸附等溫線的吸附支計算得到。(5D，右軸)pCBl-組蛋白複合物的大小分布，其通過DLS測定。[0314]中孔二氧化矽納米顆粒對組蛋白封裝的pCBl具有高容量，且所得的原始細胞僅在模擬內體環境的條件下釋放包封的DNA。[0315]如圖6(A)所述，可包封在未經修飾的中孔二氧化矽納米顆粒(ζ=-38.5mV)或經APTES(—種含胺矽烷)修飾的中孔二氧化矽納米顆粒(ζ=+11.5mV)內的pCBl或組蛋白封裝的pCBl(「複合物」)的濃度。06(B)顯示當IxlO6細胞/mL與1x109MC40-靶向的、pCBl-裝載的原始細胞一起在37°C孵育24小時時，對ZsGreen(—種由pCBl編碼的綠色螢光蛋白)變得陽性的Hep3B的百分數。X軸指明了原始細胞核是否經AEPTMS修飾和pCBl是否經組蛋白預封裝。在(A)和⑶中納入經DOTAP和DOPE(1:1重量/重量)的混合物封裝的PCBl作為對照。圖6(C)和⑶顯示暴露於模擬體液(C)或pH5緩衝液⑶後，組蛋白封裝的PCBl從未經修飾的中孔二氧化矽納米顆粒和相應原始細胞的時間依賴性釋放。原始細胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000組成，且對於(B)，經0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。所有誤差棒表示η=3的95%置信區間(1.96ο)。[0316]MC40靶向的原始細胞遞送組蛋白封裝pCBl至HCC的方法[0317]如附圖7中所示的示意圖所述，[I]由於靶向肽向Met(其被多種HCC系過表達)的募集，MC40靶向的原始細胞高親和性地與Hep3B細胞結合。流體DOPCSLB提高肽的活動性，因此使經低MC40密度修飾的原始細胞保持對Hep3B的高特異性親和性(見圖8A)。[2]MC40靶向的原始細胞經受體介導胞吞作用被H印3B內化(見圖8B和圖15A)。[3]內體條件使SLB[插入天然材料參考]去穩定並引起H5WYG內體裂解肽質子化，這兩種情況使得組蛋白封裝的PCBl在H印3B細胞質中變得分散(見圖15B)。[4]當pCBl-組蛋白複合物經核定位序列(NLS)修飾時，其在~24小時內在Hep3B細胞的細胞核中變得濃縮(見圖16C)，這使得分裂和非分裂癌細胞能夠有效轉染(見圖17)。[0318]MC40靶向的原始細胞高親和性地與HCC結合併被H印3B而不是正常的肝細胞內化。[0319]圖8(A)顯示當暴露於Hep3B或肝細胞時，MC40靶向的原始細胞的表觀解離常數(Kd);Kd值與特異性親和性負相關並且從飽和結合曲線(見圖S-11)測定。誤差棒表示η=5的95%置信區間(1.96ο)。圖8(B)和(C)顯示在37°C暴露於1000倍過量MC40靶向原始細胞I小時的H印3B(B)和肝細胞(C)的共聚焦螢光顯微鏡圖像。Met經AlexaFluor*488標記的單克隆抗體(綠色)染色,原始細胞核經AlexaFluor?594(紅色)染色,且細胞核經Hoechst33342(藍色)染色。比例尺=20μπι。原始細胞SLB由DOPC和5重量％D0PE、30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經0.015重量％(A-C)或0.500重量％(A)的MC40靶向肽修飾。[0320]MC40靶向的、pCBl裝載的原始細胞在皮摩爾濃度誘導HCC的細胞凋亡但對正常肝細胞的活力具有最小的影響。[0321]圖9(A)和(B)顯示在37°CHep3B持續暴露於MC40靶向的、pCBl裝載的原始細胞後，細胞周期蛋白BImRNA和細胞周期蛋白BI蛋白質表達的劑量(A)和時間(B)依賴性降低。將細胞在(A)中暴露於多種pCBl濃度48小時和在(B)中暴露於5pMpCBl多種時間周期。納入肝細胞中細胞周期蛋白BI和H印3B中ZsGreen的表達作為對照。分別採用實時PCR和免疫螢光測定細胞周期蛋白BImRNA和蛋白質濃度。圖9(C)顯示在37°C持續暴露於MC40靶向的、pCBl裝載的原始細胞([pCBl]=5pM)多種時間周期後，停留在G2/M期的Hep3B的百分數。G2/M期的肝細胞和S期的H印3B的百分數納入用於比較。在細胞周期分析前，細胞經Hoechst33342染色。圖9(D)顯示在37°C持續暴露於MC40靶向的、pCBl裝載的原始細胞([PCBl]=5pM)多種時間周期後，凋亡的H印3B的百分數。對凋亡標記物呈陽性的肝細胞的百分數納入作為對照。對AlexaFluor?647標記的膜聯蛋白V呈陽性的細胞被認為處於細胞凋亡的早期，而對膜聯蛋白V和碘化丙啶均呈陽性的細胞被認為處於細胞凋亡的晚期。通過添加單-和雙陽性細胞的數目測定凋亡細胞的總數。在所有實驗中，原始細胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。所有誤差棒表示η=3的95%置信區間(1.96σ)。[0322]MC40靶向的、pCBl裝載的原始細胞較相應的脂質複合物(lipoplex)2500倍更有效地誘導HCC的選擇性凋亡。[0323]圖10⑷顯示DOPC原始細胞、經10重量％PEG-2000(18:1)修飾的DOPC原始細胞、由PCBl以及DOTAP和D0PE(1:1重量/重量)的混合物組成的脂質複合物，和經10重量％PEG-2000修飾的D0TAP/D0PE脂質複合物的ζ電勢。所有ζ電勢測量在0.5ΧPBS(ρΗ7.4)中進行。圖10(Β，左軸)顯示在37°C持續暴露於經MC40靶向的原始細胞或脂質複合物遞送的5pMpCBl48小時後，凋亡的!fep3B和肝細胞的百分數。圖10(B，右軸)顯示在37°C在48小時內誘導90%lxl06Hep3B細胞凋亡所需的MC40靶向的、pCBI裝載的原始細胞或脂質複合物的數目。對於(B)，細胞經AlexaFluor*647標記的膜聯蛋白V和碘化丙錠染色；單-和雙-陽性細胞被認為是凋亡的。原始細胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000(當標明時)組成，且經0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。D0TAP/D0PE脂質複合物經10重量％的PEG-2000(當標明時)、0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。在所有實驗中，pCBl經NLS修飾。所有誤差棒表示η=3的95%置信區間(1.96σ)。[0324]MC40靶向的原始細胞選擇性地將高濃度的紫杉醇、Bcl-2-特異性siRNA和pCBl遞送至HCC而不影響肝細胞的活力。[0325]圖11㈧顯示使Bcl-2表達沉默的紫杉醇、siRNA的濃度，和可包封於IO12原始細胞、脂質體或脂質複合物的CBl質粒的濃度。圖1lA中的紅棒表示當紫杉醇和pCBl均裝載於原始細胞內時，紫杉醇和PCBl濃度如何變化。藍棒表示當紫杉醇、siRNA和pCBl均裝載於原始細胞或當siRNA和pCBl裝載於脂質複合物內時，紫杉醇、siRNA和pCBl濃度如何變化。圖1l(B)提供了共聚焦螢光顯微鏡圖像顯示在經MC40靶向的原始細胞遞送至H印3B後，OregonGreer^488標記的紫杉醇(綠色)、AlexaFluor?594標記的siRNA(紅色)和Cy5標記的pDNA(白色)的細胞內分布。細胞在37°C與1000倍過量的MC40靶向的原始細胞一起孵育24小時，然後經Hoechst33342(藍色)固定和染色。比例尺=10μπι。圖11(C)顯示了在37°C暴露於IOnM紫杉醇和/或5pMpCB148小時後，停留G2/M期的H印3B、SNU-398和肝細胞的分數。將分數對匕/M中對數生長細胞的百分數標準化。圖1l(D)顯示了在37°C暴露於IOnM紫杉醇、250pMBcl-2-特異性siRNA和/或5pMpCBl48小時後，對AlexaFluor?647標記的膜聯蛋白和碘化丙錠(PI)變得陽性的H印3B、SNU_398和肝細胞的百分數。在(C)和(D)中，『pCBl，指的是使用DOTAP和D0PE(1:1重量/重量)的化合物封裝並非特異性地遞送至細胞的pCBl。在所有實驗中，原始細胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。脂質體由DSPC和5重量％DMPE、30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000(16:0)組成，且經0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。脂質複合物由DOTAP:DOPE(1:1重量/重量)混合物組成，且經10重量％PEG-2000,0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。所有誤差棒表示η=3的95%置信區間(1.96σ)。[0326]CBl質粒的載體地圖[0327]如圖12所示，CBl質粒(pCBl)由RNA1-ReadypSIREN-RetroQ-ZsGreen載體(ClontechLaboratories,Inc.；MountainView,CA)和pNEB193載體(NewEnglandBioLabs,Inc.；Ipswich,MA)構建。pCBl編碼細胞周期蛋白BI特異性小髮夾RNA(shRNA)[Yuan等人,Oncogene(2006)25,1753-1762]和Zoanthussp.綠色突光蛋白(ZsGreen)。組成型shRNA表達由RNApolII1-依賴的人U6啟動子(Pu6)驅動，而組成型ZsGreen表達由巨細胞病毒(Pcmvie)的立即早期啟動子驅動。ori和AmpK元件使得E.coli中的質粒能夠傳播。編碼細胞周期蛋白BI特異性的shRNA的有義和反義鏈的DNA序列被下劃線標出並且側面有用於將dsDNA寡核苷酸引入pSIREN載體的限制性酶切位點(紅色為BamHI，藍色為EcoRI)。[0328]組蛋白封裝pCBl的特徵描述[0329]圖13(A)顯示了暴露於升高濃度的組蛋白011、！^、！128、！13和!14的摩爾比為1:2:2:2:2)的pCBl的電泳遷移率變動分析。給出泳道3_6的pCBl:組蛋白的摩爾比。泳道I包含DNA梯帶，而泳道2包含未添加組蛋白的pCBl。圖13(B)顯示了組蛋白封裝的pCBl(l:50pCBl:組蛋白摩爾比)的TEM圖像。比例尺=50nm。[0330]未裝載和pCBl裝載的中孔二氧化矽納米顆粒的氮吸附分析。[0331]圖14(A)裝載組蛋白封裝的pCBl前後中孔二氧化矽納米顆粒的氮吸附等溫線。圖14⑶顯示了裝載組蛋白封裝的pCBl前後中孔二氧化矽納米顆粒的Brunauer-Emmett-Teller(BET)表面積。誤差棒表不η=3的95%置信區間(1.96σ)。[0332]DOPC原始細胞的中子小角散射(SANS)。[0333]圖15顯示了DOPC原始細胞的SANS數據。數據擬合通過使用具有等厚共形殼的多分散多孔二氧化矽球體模型獲得，並且顯示所述二氧化矽顆粒表面跨越多個孔開口的36-Α雙層的存在。雙層厚度為0、20和60A的模擬SANS數據被納入用於比較。測量的雙層厚度36人與其它在平面支撐的脂質雙層上進行的中子研究(33-38Α)[參見Ferrari,M.Cancernanotechnology:Opportunitiesandchallenges.NatureReviewsCancer5，161-171(2005)]一致，且在這些對比條件下，主要表示從所述脂質雙層的富氫烴核的散射。實驗數據也表明存在299.2A孔，其通過將0.0315A4(即，實驗數據中峰的q值，其由孔散射引起)除以2測得。使用100%D2OPBS緩衝液中的5%(體積/體積)原始細胞懸浮液在LQDbeamlineatLANSCE(LosAlamosNationalLaboratories)上獲得SANS數據。使用NCNRSANS數據分析包(NIST)擬合數據。[0334]原始細胞保護包封的DNA免遭核酸酶降解。[0335]圖16顯示DNA酶I處理的pCBl(泳道3)、組蛋白封裝的pCBl(泳道5),DOTAP和DOPE的1:1(重量/重量)混合物封裝的pCBl(泳道7)、裝載於具有陽離子核的原始細胞中的PCBl(泳道9)和裝載於具有陰離子核的原始細胞中的組蛋白封裝的pCBl(泳道11)的瓊脂糖凝膠電泳的結果。裸PCBl(泳道2)、從組蛋白釋放的pCBl(泳道4)、從D0TAP/D0PE脂質複合物釋放的PCBl(泳道6)、從具有陽離子核的原始細胞釋放的pCBl(泳道8)和從具有陰離子核的原始細胞釋放的組蛋白封裝的PCBl(泳道10)被納入用於比較。泳道I包含DNA梯帶。樣品與DNA酶I(每50ngDNAI單位)在室溫一起孵育30分鐘，並使用I%SDS刺激PCBl釋放。[0336]圖17顯示中孔二氧化矽納米顆粒(「未經修飾的核」)、在室溫浸泡於20%(體積/體積)APTES中12小時的中孔二氧化矽納米顆粒(「APTES修飾的核」)、CBl質粒(、081」)、組蛋白封裝的？081(「pCBl-組蛋白複合物U^DOTAP和DOPE的1:1(重量/重量)混合物封裝的pCBl(「D0TAP/D0PE脂質複合物」)的ZetaU)電勢值。(電勢測量在0.5XPBS(pH7.4)中進行。誤差棒表示η=3的95%置信區間(1.96σ)。[0337]用於測定圖6和S-16(A)-⑶中對ZsGreen表達呈陽性的細胞的百分數的代表性前向散射-側向散射(FSC-SSC)圖和FL-1直方圖。[0338]圖18顯示門控㈧或非門控(C)排出細胞殘骸的ZsGreen陰性細胞的FSC-SSC圖(Α和C)和相應的FL-1直方圖(分別為B和D)。FL-1通道的平均螢光強度(MFI)值在(B)和⑶中給出。(E)-(H)門控(E)或非門控(G)排出細胞殘骸的ZsGreen陽性細胞的FSC-SSC圖(Ε和G)和相應的FL-1直方圖(分別為F和H)。(F)和(H)上的門對應於具有MFI(282的細胞的百分數，即100ΧZsGreen陰性細胞的MFI(見D圖)。[0339]MC40靶向肽的鑑別[0340]圖19提供了描述用於從Ph.D.?-7卩遼菌體展不文庫(NewEnglandBioLabs,Inc.；Ipswich,MA)選擇MC40祀向肽的方法的示意圖。lxlOnpfu/mL的肽在室溫與IOOnM融合至人IgGFe域的重組人Met(rhMet)—起孵育I小時。蛋白質A或蛋白質G包被的磁性顆粒用於親和捕捉Met-噬菌體複合物並隨後用TBS(含有150mMNaCl的50mMTris-HCl，pH7.4)洗滌10次以除去未結合的噬菌體。結合的噬菌體克隆經低pH緩衝液(含lmg/mLBSA的0.2M甘氨酸，pH2.2)洗脫，並且洗脫液經宿主細菌(E.coliER2738)感染而擴增。根據示意圖，使用逐漸苛刻的條件=Met濃度從IOOnM降至50nM再降至ΙΟηΜ，孵育時間從I小時減少至30分鐘再減少至15分鐘，且添加至洗滌緩衝液的吐溫-20JAO0Z0(體積/體積)增加至0.1%再增加至0.5%，進行5輪親和性選擇。通過蛋白質A塗布的磁性顆粒和蛋白質G塗布的磁性顆粒間的交替多輪選擇避免對蛋白質A和蛋白質G的肽特異性。[0341]在5輪選擇後，從50株單獨的克隆重新獲得DNA並使用與Ph.D.?-7試劑盒一起提供的_96gIII引物測序。對MET受體具有最大結合活性的序列如下所示:[0342]ASVHFPP(Ala-Ser-Val-His-Phe-Pro-Pro)SEQIDNO:1[0343]TATFffFQ(Thr-Ala-Thr-Phe-Trp-Phe-Gln)SEQIDNO:2[0344]TSPVALL(Thr-Ser-Pro-Val-Ala-Leu-Leu)SEQIDNO:3[0345]IPLKVHP(Ile-Pro-Leu-Lys-Val-His-Pro)SEQIDNO:4[0346]WPRLTNM(Trp-Pro-Arg-Leu-Thr-Asn-Met)SEQIDNO:5[0347]MC40靶向肽的特徵描述[0348]圖20(A)顯示第5輪選擇後的肽序列比對；優勢序列ASVHFPP與此前鑑定的Met特異性12體YLFSVHWPPLKASEQIDNO:15的粗體部分相似。將顯示靶不相關的HAIYPRH肽(~10%)(SEQIDNO:16)的噬菌體克隆從序列比對中略去。圖20(B)和(C)顯示親和選擇的噬菌體克隆與rhMet結合的程度經酶聯免疫吸附分析(ELISA)測定。⑶中所述的ELISA示意圖描述於材料與方法部分。ELISA結果如(C)所示。圖20(D)顯示除去未與Met結合的肽後的序列比對。從該比對測定圖20中所述的共有序列。圖20(E)和(F)顯示暴露於(I)抗Met和不相關噬菌體克隆(TPDWLFP,SEQIDNO:17)的AlexaFluor?488標記的單克隆抗體和抗M13噬菌體的AlexaFluor?546標記的單克隆抗體(藍點)或(2)抗Met和MC40克隆的AlexaFluor?488標記的單克隆抗體和抗M13噬菌體的AlexaFhkH."546標記的單克隆抗體(橙點)的Ifep3B(E)和肝細胞(F)的流式細胞儀散點圖。未處理細胞(紅點)用於設置FL-1(AlexaFluor?488螢光)和FL-2(AlexaFluor?546螢光)通道的電壓參數。[0349]暴露於H印3B的MC40靶向的原始細胞的樣品結合曲線。[0350]為測定圖8A中的解離常數，lxl06Hep3B或肝細胞經細胞松馳素D預處理以抑制胞吞併在37°C與多種濃度的AlexaFklOl:647標記的、MC40靶向的原始細胞一起孵育I小時。流式細胞儀用於測定所得細胞群的平均螢光強度，其對原始細胞濃度作圖以獲得總結合曲線。在飽和濃度的未標記的肝細胞生長因子的存在下，通過將細胞與AlexaHuor?647標記的、MC40靶向的原始細胞一起孵育來測定非特異性結合。通過從總結合曲線減去非特異性結合曲線獲得特異性結合曲線；從特異性結合曲線計算Kd值。在圖21所述的實驗中，原始細胞SLB由DOPC和5重量％D0PE、30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經0.015重量％(~6肽/顆粒)的MC40靶向肽修飾；相應的Kd值為1050±142pM。所有誤差棒表示η=5的95%置信區間(1.96σ)。[0351]MC40靶向的原始細胞經受體介導的胞吞作用內化，並且在不存在H5WYG肽的情況下定向至溶酶體。[0352]圖22⑷顯示在37°C在I小時內被Hep3B或肝細胞各自內化的MC40靶向原始細胞的平均數。IxlO6細胞在不存在(-)或存在(+)飽和濃度(100yg/mL)的人肝細胞生長因子(HGF)的情況下與多種濃度的原始細胞一起孵育，而流式細胞儀用於測定與各細胞有關的顆粒的平均數，如Ashley等人，NatureMaterials,2011,May；10(5):389-97所述。原始細胞經NBD和pHrodo?標記以從那些內化至酸性細胞內隔室的顆粒區別表面結合顆粒(分別地)。誤差棒表示η=3的95%置信區間(1.96ο)。(B)原始細胞和(l)Rab5、(2)Rab7、(3)溶酶體相關的膜蛋白I(LAMP-1)、或(4)Rablla之間的皮爾森相關係數(r值)。Hep3B細胞在37°C與1000倍過量的AlexaFluor?594標記的原始細胞一起孵育I小時，然後固定，透化，並與AlexaFluor"488標記的抗Rab5、Rab7、LAMP-1或Rablla抗體一起孵育。SlideBook軟體用於測定r值，其以η=3x50細胞的平均值土標準差表示。微分幹涉對比(DIC)圖像用於定義H印3Β的邊界從而當計算r值時可忽視細胞邊界外的像素。原始細胞SLB由DOPC和5重量％DOPE、30重量％膽固醇、以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。[0353]當經NLS修飾並經MC40靶向的原始細胞遞送時，組蛋白封裝的pCBl在HCC細胞核中以時間依賴性的方式濃縮。[0354]圖23(A)_(C)描述了在37°C暴露於1000倍過量的MC40靶向的、pCBl裝載的原始細胞15分鐘(A)、12小時⑶、或24小時(C)的!fep3B細胞的共聚焦螢光顯微鏡圖像。對於(B)，在~2小時後，原始細胞的內體逃逸和pCBl的胞質分散是明顯的；然而直至12-16小時，ZsGreen表達仍然不可檢測。在24小時，Cy5標記的pCBl仍然分布於整個細胞；然而在(C)中胞質染色不可見，因為Cy5通道的增益被減小以避免位於細胞核內的像素飽和。二氧化矽核經AlexaFluor?594(紅色)標記，pCBl經Cy5(白色)標記，且細胞核經Hoechst33342(藍色)復染。比例尺=20μm。圖23(D)顯示對於Cy5標記的pCBl和Hoechst33342標記的H印3B細胞核，皮爾森相關係數(r值)對時間的作圖。SlideBook軟體用於測定r值，其以η=3x50細胞的平均值土標準差表示。微分幹涉對比(DIC)圖像用於定義H印3Β的邊界從而當計算r值時可忽視細胞邊界外的像素。原始細胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇、以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。[0355]當經NLS修飾並經MC40靶向的原始細胞遞送時，組蛋白封裝的pCBl選擇性地轉染分裂和非分裂的HCC細胞，接近100%有效性。[0356]圖24⑷、(C)和(E)顯示了在37°C暴露於1000倍過量的MC40靶向的、pCBl裝載的原始細胞24小時的H印3B細胞的共聚焦螢光顯微鏡圖像。在(A)中Hep3B細胞正在分裂而在(C)和(E)中~95%匯合；在所有圖像中，pCBl經組蛋白預封裝，且在(E)中該pCBl-組蛋白複合物進一步經NLS修飾。二氧化娃核經AlexaFluor"594(紅色)標記,pCBl經Cy5(白色)標記，且細胞核經Hoechst33342(藍色)復染。比例尺=20μπι。圖24(B)、(D)和(F)顯示在37°C持續暴露於1x109MC40革巴向的、pCBl裝載的原始細胞(「PC」)24小時後，ZsGreen表達呈陽性的lxl06!fep3B和肝細胞的百分數。在(B)中細胞正在分裂而在(D)和(F)中~95%匯合；x軸表示無論CBl質粒(「pCBl」)和pCBl-組蛋白複合物(「複合物」)是否經NLS修飾，。單獨pCBl，以及經DOTAP和DOPE1:1(重量/重量)混合物封裝的PCBl用作對照。細胞被暴露於20mg/mL的麥胚凝集素(WGA)以阻斷NLS修飾的pCBl通過核孔複合物易位。誤差棒表示η=3的95%置信區間(1.96(0。圖24(G)-⑴分別為圖(A)、(C)和(E)中所採用細胞的細胞周期直方圖。給出了各直方圖GcZG1期細胞的百分數。在所有實驗中，原始細胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇，以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。[0357]圖25顯示了在37°C暴露於MC40靶向的、pCBl裝載的原始細胞I小時或72小時的H印3B細胞(A)和肝細胞(B)的共聚焦螢光顯微鏡圖像；在所有實驗中PCBl濃度維持在5pMo(B)中的箭頭指示有絲分裂細胞。細胞周期蛋白BI經AlexaFluor*594標記的單克隆抗體(紅色)標記，而細胞核經Hoechst33342(藍色)染色。原始細胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇、以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。所有比例尺=20μm。[0358]圖26顯示了在37°C暴露於MC40靶向的、pCBl裝載的原始細胞I小時或72小時的H印3B細胞(A)和肝細胞(B)的共聚焦螢光顯微鏡圖像；在所有實驗中PCBl濃度維持在5pM。細胞分別經AlexaFluorκ647標記的膜聯蛋白V(白色)和碘化丙錠(紅色)染色以分析早期和晚期凋亡，而且細胞核經Hoechst33342(藍色)復染。原始細胞SLB由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇、以及10重量％PEG-2000(18:1)組成，且經0.015重量％MC40和0.500重量％H5WYG修飾。所有比例尺=20μm。[0359]含有兩性離子脂質組成的SLB的原始細胞誘導非特異性細胞毒性。[0360]如附圖27所述，在37°C持續暴露於IxIO9APTES修飾的中孔二氧化矽納米顆粒、含APTES修飾核的DOPC原始細胞、裝載有編碼亂序shRNA序列的質粒(「亂序pCBl」)的DOPC原始細胞或裝載有亂序pCBl的D0TAP/D0PE(1:1重量/重量)脂質複合物48小時後，lxl06Hep3B變得細胞凋亡的百分數。使用正-和負-電荷聚苯乙烯納米顆粒(分別為「胺-PS」和「羧基-PS」)作為陽性對照，而使用暴露於IOmM抗氧化劑N-乙醯半胱氨酸(NAC)或Ipmol游離pCBl的!fep3B作為陰性對照。所有誤差棒表示η=3的95%置信區間(1.96σ)。[0361]本文所公開的所有參考文獻在其相關處引入作為參考[0362]實施例1的參考文獻[0363]ICarroll,N.J.,Pylypenko,S.,Atanassov,P.B.&Petsev,D.N.MicroparticleswithBimodalNanoporosityDerivedbyMicroemulsionTemplating.Langmuir,do1:10.1021/la900988j(2009).[0364]2Lu,Y.F.etal.Aerosol-assistedself-assemblyofmesostructuredsphericalnanoparticles.Nature398,223-226(1999).[0365]3Iler,R.K.TheChemistryofSilica:Solubility,Polymerization,ColloidandSurfaceProperties,andBiochemistry.(JohnWileyandSons,1979).[0366]4DoshijD.A.etal.NeutronReflectivityStudyofLipidMembranesAssembledonOrderedNanocompositeandNanoporousSilicaThinFilms.Langmuir21，2865-2870，do1:10.1021/la0471240(2005).[0367]5Bernhard，M.1.etal.GuineaPigLine10HepatocarcinomaModel:CharacterizationofMonoclonalAntibodyandinVivoEffectofUnconjugatedAnti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mer-boundadriamycindoesnotinducemultidrugresistanceinahumanovariancarcinomacellline.JournalofControlledRelease59,133-148(1999).[0397]實施例2[0398]伊馬替尼的透皮遞送[0399]表皮是皮膚的最上層，且可進一步分為4層。表皮的最外層是角質層，大約10-20pm厚；其是與透皮遞送有關的主要挑戰。表皮的另外3層可共同地被分類為有活力的表皮；該有活力的表皮為50-100pm厚。有活力的表皮包含免疫細胞(郎格爾漢細胞)、上皮角質細胞、感覺神經(麥格爾氏細胞)，以及毛細血管床、微靜脈和小動脈的網絡。真皮為l_2mm厚，並由蜂窩組織組成，所述蜂窩組織包含其它類型的免疫細胞(肥大細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、漿細胞)、成纖維細胞和多種纖維(神經纖維、膠原、彈性纖維)。此外，Ia解釋了負載物遞送穿過角質層可採取的4種主要方法。(a)細胞間途徑，(b)濾泡途徑，(c)跨細胞途徑，和(d)角質層的除去。應當重點指出從角質層至真皮存在逐漸提高的水合梯度。該梯度可提供多種分子擴散進入有活力的表皮和真皮的驅動力。[0400]角質層具有「磚和泥」結構。「磚」為被角蛋白、糖類和脂質填充的死亡的上皮角質細胞。「泥」代表細胞間隙並由神經醯胺、脂肪酸和膽固醇組成。該脂質組合物賦予與丁醇相似的極性。由於該極性和總體的「磚和泥」結構，在無促進措施的情況下，大多數分子不能通過角質層。[0401]因此，簡而言之，皮膚由主要的3層，表皮、真皮和皮下組織組成。最外層(角質層)是皮膚中起屏障作用的主要組分。其由填充有結晶化角蛋白、透明角質和多種脂質(其突出至細胞間隙中)的死亡的上皮角質細胞組成。其還由多種賦予與丁醇類似的極性的不同脂質(即神經醯胺、脂肪酸、膽固醇)組成。這種獨特極性的結果是，氫鍵存在於角質層的細胞間隙中，這增加了通過透皮途徑遞送分子和藥物的第二級阻力。目前，有3代透皮遞送技術。第一代遞送系統利用具有低分子量的親脂性化合物的被動擴散。第二代和第三代遞送系統意識到角質層的通透性是關鍵。第二代和第三代的促進策略是除去角質層或利用化學促進劑、生化促進劑和電動勢來增加角質層的通透性。所有促進策略所面對的問題是尋找充分的角質層通透性和避免模仿更深組織之間的平衡。[0402]透皮途徑給予相比於靜脈和口服給予提供了若干益處。這些益處包括更少的毒性、更好的耐受性和更好地遞送負載物如化學療法、酪氨酸激酶抑制劑和其它對癌症患者的療法。外皮循環為藥物吸收提供了高面積並繞過首過代謝和不良的(藥物-食物，藥物-pH)相互作用。[0403]伊馬替尼是最常被開具的市購可得的酪氨酸及酶抑制劑。伊馬替尼是具有相對低分子量(493Da)和LogP為1.2的弱鹼。[0404]我們表明通過降低pH可容易地升高伊馬替尼的溶解度。然而降低pH增加化合物的離子化，而離子化狀態的分子不能容易地穿過皮膚的脂質雙層。為促進固有溶解度(未離子化物種的溶解度)，我們評估了若干溶劑和共溶劑系統(圖1X2)。發現所有製劑相比於對照(7jC，PH7)可增加藥物溶解度，10%乙醇和DMSO製劑中溶解度最高。[0405]我們的初步研究調查了通過透皮途徑遞送的伊馬替尼的潛力。目前已進行了許多關鍵的初步實驗。首先，我們測定了作為溶劑PH的函數的伊馬替尼的溶解度(圖1X2)。藥物必須在溶液中以穿透皮膚。然而，離子化物種不能容易地透過角質層(6)。儘管伊馬替尼的溶解度隨PH降低而增加，但該溶解度是由於該藥物化學結構上弱鹼性官能團的離子化。[0406]其次，我們篩選了多種共溶劑/溶劑系統以增加伊馬替尼和達沙替尼的固有溶解度(未離子化物種的溶解度)。圖2X2呈現了伊馬替尼的數據。向製劑中添加這類共溶劑廣泛地用於增加溶解較差的藥物的溶解度(7-9)。在我們此前的工作中，評估了作為溶解度促進劑的乙醇、PEG400和DMS0。已知這些共溶劑可促進多種藥物的固有溶解度。與對照(水，PH7)相比，所有共溶劑製劑和DMSO增加伊馬替尼的溶解度。與其它製劑相比，含10%乙醇的製劑展現出最高的溶解度。還發現伊馬替尼在DMSO中高度可溶。[0407]最後，評估了這些共溶劑製劑中多種的體外透皮滲透性質。注意，還已知這些共溶劑在一些製劑中起滲透促進劑的作用(10-11)。對於這一系列實驗，將從腹壁成形術獲得的人皮膚包埋在改良的Franz擴散細胞上並使用高效液相色譜測定作為時間的函數的藥物滲透。[0408]該Franz擴散細胞是透皮藥物遞送領域的基本工具。將患者衍生的皮膚放置於電池帽和溶液室之間。將電池帽暴露於環境以允許角質層也暴露於環境。溶液室填充有等張擴散緩衝液。此外，溶液室具有允許除去擴散緩衝液而不打亂設置的注射口。最終，溶液室被允許溫度控制的水套包裹。Franz擴散細胞允許使用生理學條件進行透皮遞送的體外研究。注意任何溶質通過患者衍生的皮膚穿透進入擴散緩衝液等同於該溶質到達體內系統的系統循環。原始細胞將裝載甲磺酸伊馬替尼，並且通過高效液相色譜(HPLC)實現擴散緩衝液中溶質內容物的特徵描述。使用酶促組織消化和電感耦合等離子體質譜(ICP質譜)測定皮膚不同層中二氧化矽內容物的測定。可將SLB和納米多孔顆粒核螢光標記以允許進行共聚焦顯微術。此外，在用原始細胞處理和孵育後可將皮膚樣品切片從而使用TEM將它們成像。[0409]由圖3X2可見，使用水(pH7)作為溶劑系統無伊馬替尼滲透通過皮膚。在所評估的其它共溶劑系統下，藥物能夠有限地滲透通過皮膚。DMSO展現最高的伊馬替尼滲透性。從這些數據，計算通量(通過皮膚的滲透率)且圖4X2中顯示了這些數據。與對照相比，所有製劑的通量均增加，DMSO製劑展現最高的伊馬替尼通量(0.225μg/cm2hr)。[0410]因此，透皮原始細胞可由多孔納米顆粒組成，所述多孔納米顆粒(a)裝載有一種或多種藥學活性劑如伊馬替尼和(b)被脂質雙層包封並支撐脂質雙層，所述脂質雙層包含一種或多種角質層滲透促進劑，例如單飽和ω-9脂肪酸(油酸、反油酸、二十烯酸、二十碳三烯酸(Meadacid)、芥酸和神經酸，優選油酸)、醇、二醇(最優選聚乙二醇(PEG))、R8肽和膜軟化劑如膽鹽、聚氧乙烯酯和聚氧乙烯醚、單鍊表面活性劑(例如，去氧膽酸鈉)。原始細胞可具有平均為約50nm至約300nm,優選約65nm至約75nm的直徑。[0411]實施例2的參考文獻[0412]1."FASS.se."Mobil,fass.se.Web.26Jan.2010.[0413]2.Benson,Η.2005.TransdemalDrugDelivery:PenetrationEnhancementTechniques.CurrentDrugDelivery.2:23-33.[0414]3.KearjC.，Yang,J.，Godwin,D.，andFelton,L.2008.1nvestigationintotheMechanismbyWhichCyclodextrinsInfluenceTransdermalDrugDelivery.DrugdevelopmentandIndustrialPharmacy.34:692-697.[0415]4.BanyjB.W.2001.NovelmechanismsanddevicestoenablesuccessfUltransdennaldrug[0416]delivery.EuropeanJournalofPharmaceuticalSciences.14101-114[0417]5.MaghrabyjG.，Barry,W.，andWilliams,A.2008.Liposomesandskin:Fromdrugdeliveryto[0418]modelmembranes.EuropeanJournalofPharmaceuticalScience.34203-222.[0419]6.Singh,B.，Singh,J.andSingh,B.N.2005.Effectsofionizationandpenetrationenhancersonthetransdermaldeliveryof5-fluorouraciIthroughexcisedhumanstratumcorneum.1nternationalJournalofPharmaceutics.298:98-107.[0420]7.DouroumisjD.,andFahrjA.2007.Stablecarbamazepinecolloidalsystemsusingthecosolventtechnique.EuropeanJournalofPharmaceuticalScience.30:367-374.[0421]8.Ni，N.，Sanghvi,T.，andYalkowskyjS.2002.Solubilizationandprefomulationofcarbendazim.1nternationalJournalofPharmaceutics.24499-104.[0422]9.RubinojT.J.andYalkowskyjH.S.1987.CosolvencyandCosolventPolarity.Pharmaceutical[0423]Research.4220-230.[0424]10."PharmacologyofDMS0."DimethylSulfoxide(DMSO)-Dr.StanleyJacob.Web.30Mar.[0425]2010.[0426]11.NotmanjR.，Otter,K.W.，NorojG.M.，BrielsjJ.W.，andAnwar,J.2007.ThePermeability[0427]EnhancingMechanismofDSMOinCeramideBilayersSimulatedbyMolecularDynamics.[0428]BiophysicalJournal.93:2056-2068.[0429]實施例3[0430]siRNA裝載的、SP94靶向的原始細胞誘導的細胞凋亡[0431]結果[0432]siRNA裝載的原始細胞的特徵描述。二氧化娃納米顆粒如Carroll等人35所述製備，並具有>600m2/g的BET表面積、~65%的孔體積分數和由通過6-12nm孔互連的大的(20-30nm)、表面可及的孔組成的多式孔形態學(見圖2BX3-CX3)。如方法部分所述在裝載siRNA(或蓖麻毒素A鏈)前按大小分離二氧化矽納米顆粒(見圖2AX3)。圖3AX3顯示使用一系列策略構建的原始細胞或脂質複合物的siRNA裝載容量。由兩性離子磷脂、DOPC組成的脂質複合物每101°顆粒包封~IOnMSiRNA0由陽離子脂質、DOTAP組成的脂質複合物的構建，使得siRNA負載物增加5倍，推測由於負電荷核苷酸和正電荷脂質組分之間的吸引性靜電相互作用。包含負電荷二氧化矽核和兩性離子脂質雙層的原始細胞具有大約與陽離子脂質複合物相同的容量。經含胺矽烷AEPTMS修飾的二氧化矽核，使ζ電勢從_32mV增加至+12mV並得到每101°顆粒~IμM的siRNA容量。使用DOTAP脂質體協同地將siRNA裝載至負電荷核中使得原始細胞具有類似的容量，比基於顆粒的治療應用中常用地兩性離子脂質體的容量高大於100倍。圖3BX3和3CX3中顯示了在分散於替代生物學流體中的DOPC和DOTAP脂質體以及含經AEPTMS修飾的核的DOPC原始細胞的穩定性。在中性和溫和的酸性PH條件下DOPC脂質複合物快速釋放它們包封的siRNA，使得在4_12小時內完全失去核苷酸內容物。儘管在中性PH條件下DOTAP脂質複合物比DOPC脂質複合物更穩定，但在72小時周期內丟失它們siRNA內容物的大約50%。與上述兩種脂質複合物顯著相反，當暴露於模擬體液72小時時，含經AEPTMS修飾的核的DOPC原始細胞保留了它們包封的RNA的95%。在溫和的酸性條件(其反映了內體/溶酶體通路的條件)下，siRNA裝載的、AEPTMS修飾的核和受支撐的脂質雙層的PE和PC頭基之間降低的經典和偶極相互作用引起膜去穩定並將該核暴露於酸性介質。在膜去穩定後，負載物擴散和核溶解的合併速率導致該釋放特點，見圖3CX3。因此，關於siRNA裝載容量、顆粒穩定性和釋放特徵，與相應的脂質複合物相比，原始細胞表現出極大的改善。[0433]siRNA裝載的原始細胞介導的細胞毒性:我們最近證明了與靶向肽(SP94)(其結合肝細胞癌(HCC)但不控制肝細胞)綴合的原始細胞遞送多種化療劑和選擇性誘導表達相關表面標記物的腫瘤細胞的細胞凋亡。此處我們顯著地展開描述裝載有大分子負載物(包括siRNA和蛋白質毒素)的靶向原始細胞。我們製備了由AEPTMS修飾的二氧化矽核和D0PC/D0PE/膽固醇/PEG-2000(55:5:30:10質量比)支撐的脂質雙層組成、與SP94綴合以選擇性結合HCC並與內體裂解肽綴合以促進內體/溶酶體釋放的原始細胞。原始細胞裝載有靶向細胞周期蛋白超家族成員(包括細胞周期蛋白A2、細胞周期蛋白B1、細胞周期蛋白Dl和細胞周期蛋白E、密切牽涉於整個細胞周期和活力的蛋白質)的siRNA的等摩爾混合物。[0434]圖4X3顯示通過使用AEPTMS修飾的核構建的、siRNA-裝載的、SP94靶向的DOPC原始細胞，HCC細胞系H印B中基因沉默的濃度和時間依賴性。A圖證明了在48小時內，原始細胞的濃度增加，以及從而siRNA濃度的增加誘導各靶基因中蛋白質水平的劑量依賴性降低。對於細胞周期蛋白A2、細胞周期蛋白B1、細胞周期蛋白D1、和細胞周期蛋白E，抑制蛋白質表達90%的siRNA的濃度(IC9tl)分別為125pM、92pM、149pM和370pM。B組顯示在添加125pM裝載於靶原始細胞的siRNA後，蛋白質水平如何降低。截至72小時，各靶蛋白水平受抑制超過90%，抑制程度(細胞周期蛋白E略低於其它周期蛋白)反映了IC9tl值的區另ij。圖4CX3顯示使用多種類型的SP94靶向的顆粒可實現基因沉默的選擇性。在與H印3B孵育48小時後，裝載有125pMsiRNA的DOPC原始細胞幾乎誘導細胞周期蛋白A2蛋白質的完全抑制，但對未轉化的肝細胞無影響。相反，裝載有125pMsiRNA的DOPC脂質複合物對各細胞系中的細胞周期蛋白蛋白質水平幾乎無影響。裝載有125pMsiRNA的SP94靶向的DOPC脂質複合物誘導Hep3B中細胞周期蛋白A2~60%抑制，但也降低肝細胞中細胞周期蛋白A2水平，該作用可能由它們的正電荷(ζ=+22mV)引起。抑制細胞周期蛋白A2表達90%所需的SP94靶向的DOPC原始細胞、DOPC脂質複合物和DOTAP脂質複合物的數目顯示於C圖的右軸上。需要的DOPC原始細胞比類似的DOPC脂質複合物少IO4倍而需要的DOPC原始細胞比DOTAP脂質複合物少300倍。因此，關於活性和特異性，靶向原始細胞相比於基於脂質的納米顆粒提供顯著的優勢。[0435]圖5X3顯示了解釋原始細胞分布的時間依賴性和暴露於siRNA裝載的、SP94靶向的原始細胞的細胞中細胞周期蛋白A2、B1、Dl和E的表達的共聚焦螢光顯微鏡圖像。如A圖中所證明的，向Hep3B添加原始細胞I小時後，各蛋白質的表達仍處於對照水平，且二氧化娃核存在於點狀模式(punctuatepattern),表面內體定位。截至48小時,二氧化娃核均勻地遍布於H印3B細胞的細胞質中，且各靶向蛋白質的表達被抑制至本底水平。作為對比，未轉化肝細胞的相同處理既未導致原始細胞的細胞蓄積也未抑制蛋白質表達(見B圖)。[0436]圖6X3證明了siRNA裝載的、SP94靶向的DOPC原始細胞選擇性誘導HCC細胞毒性的能力。原始細胞裝載有125pM的siRNA混合物並添加至!fep3B或對照肝細胞中。通過膜聯蛋白V結合增加鑑定處於細胞凋亡早期的細胞，而處於細胞凋亡晚期的細胞膜聯蛋白V和碘化丙啶染色均為陽性。在添加原始細胞後早在12小時就觀測到凋亡H印3B數目選擇性增加(A圖)，並且截至72小時超過90%細胞的兩種細胞凋亡標記物均呈陽性。相反，在未轉化肝細胞中未觀測到細胞毒性，通過圖6B和6C顯示的代表性顯微鏡圖像確認該觀測。B圖證明在48小時內整個種群的Hep3B對表面結合的膜聯蛋白V和細胞核結合的碘化丙啶呈陽性，而C圖顯示對照肝細胞凋亡的兩種標記物仍為陰性。[0437]毒素裝載的原始細胞的特徵描述。由於大的(20_30nm)、表面可及核的存在，多式二氧化娃納米顆粒可容易地裝載有各種蛋白質毒素，包括白喉毒素、霍亂毒素和蓖麻毒素。此外，經低密度(0.015重量％或~6肽/原始細胞)SP94修飾的DOPC原始細胞所展現的高度差別特異性使得選擇性遞送尤其是細胞毒性劑至癌細胞成為可能。蓖麻毒素發現於蓖麻油植物(Ricinuscommunis)的種子中，並由包含被二硫鍵結合在一起的A和B亞單元的異二聚體組成。B亞單元經由受體介導的胞吞作用介導毒素進入細胞，而A亞單元通過裂解28SrRNA中的特異性糖苷鍵抑制蛋白質合成。38催化活性的蓖麻毒素A鏈(RTA)已被用作腫瘤特異性免疫毒素的亞單元以抑制多種模型系統中癌細胞的生長。39』40[0438]圖7X3顯示了裝載有RTA的DOPC原始細胞和脂質細胞的容量和釋放特徵。如A圖所證明，12小時。原始細胞合併的容量、穩定性和靶向和內化效率導致對H印3B格外低得IC9tl值，且實際上對正常肝細胞無副作用。[0452]含有150nm核的原始細胞每顆粒(每L)包封~6xl07siRNA分子或IxlO7蓖麻毒素A鏈(RTA)分子並在暴露於模擬體液72小時後保留幾乎其負載物的100%。作為對t匕，脂質和聚合物納米顆粒具有低10-1000倍的大分子負載物容量，並且在中性pH實質上更不穩定。51』52此外，相比於中孔二氧化矽顆粒，原始細胞具有更高的核酸負載物容量。SIMP,由Tanaka等人研發的用於遞送siRNA裝載的納米脂質體至卵巢癌,包封大約與原始細胞相同量的RNA(每顆粒2pgvs.每顆粒1.3pg)，儘管他們的平均直徑大10倍(1.6μπιvs.150nm)53。[0453]聚乙烯亞胺包被的中孔二氧化矽納米顆粒，由Xia等人研發，每10μg顆粒複合~IμgSiRNAdO重量％)33;作為對比，10μg原始細胞可裝載有~6.5μgSiRNA(65重量％)。容量和穩定性的增強使得siRNA裝載的原始細胞沉默靶基因和在比文獻中報導的值低10-10，OOO倍的濃度誘導HCC細胞凋亡成為可能。51』52』54_58siRNA裝載的、SP94靶向的原始細胞在siRNA濃度範圍為90pM至370pM(IC9(l)時沉默90%的細胞周期蛋白A2、B1、Dl和E的表達，並且在siRNA濃度為125pM殺死>90%的HCC(LC9tl)。作為對比，靶向脂質體具有IC9tl和LC9tl值為5-500nM，取決於顆粒的類型和實驗進行的條件。54_56』58_6°siRNA裝載的、SP94靶向的原始細胞的療效也超過了聚合物包裹的中孔納米顆粒的療效。若干組已使用包封於聚陽離子聚合物內的中孔二氧化矽納米顆粒以複合siRNA;該顆粒在納米顆粒:siRNA(重量/重量)比為10-20時導致報告子和內源性基因表達30-60%敲低。33』61由於我們將siRNA裝載在經AEPTMS修飾的二氧化矽納米顆粒的納米孔內，原始細胞的容量顯著的較高，導致在原始細胞:細胞比例為~8時，完全沉默稀薄啊周期蛋白A2、B1、D1和E的表達。結論，我們的發現表明原始細胞可用作多種大分子包括核酸和毒素的通用的靶向納米載體。納米多孔核也可裝載有其它不同的負載物類型，包括治療診斷學和個體化用藥的新興領域所需的成像和診斷劑。[0454]材料和方法[0455]材料。抗細胞周期蛋白A2抗體(小鼠mAb)、細胞周期蛋白BI(小鼠mAb)、細胞周其月蛋白Dl(小鼠mAb)、和細胞周期蛋白E(小鼠mAb)購自Abeam,Inc.(Cambridge,MA)。沉默子選擇siRNA(siRNAIDs對於細胞周期蛋白A2、B1、Dl和E的siRNAID分別為s2513、s2515,s229和s2526)由LifeTechnologiesCorporation(Carlsbad,CA)購自AppliedBiosystems?。人H印3B(HB-8064)、人肝細胞(CRL-11233)、Eagle最低基礎培養基(EMEM)、Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)、胎牛血清(FBS)和IX胰蛋白酶-EDTA溶液(含0.53mMEDTA的0.25%胰蛋白酶)購自美國典型培養物中心(ATCC；Manassas,Virginia)。1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(D0PE)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1，2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷(DOTAP)和膽固醇購自AvantiPolarLipids,Inc.(Alabaster,AL)。CaspGLOW?螢光素活性半胱天冬酶-9染色試劑盒(485/535)和CaspGLOff?紅色活性半胱天冬酶-3染色試劑盒(540/570)購自BioVision,Inc.(MountainView,CA)。[0456]ΛHfIivEM90(鯨蠟基PEG/PPG-10/1二甲矽油)購自EvonikIndustries(Essen,Germany)。[0457]Hoechst33342(350/461)、AlexaFluor"488抗體標記試劑盒(495/519)、膜聯蛋白V的AlexaFluor?488綴合物(495/519)、Ciick-?Τ*AHAAlexaFluor?488蛋白質合成HCS分析(495/519)、碘化丙啶(535/617)、AlexaFluor?647甲酸琥珀醯亞胺酯(650/668)、SlQwFa4e?>Gold抗褪色劑、Image-1l"FX信號增強劑、IXDulbecco磷酸鹽緩衝鹽水(D-PBS)和牛白蛋白成分V溶液(BSA，7.5%)購自InvitrogenLifeSciences(Carlsbad,CA)。BEGMBullet試劑盒購自LonzaGroupLimited(Clonetics；Walkersville,MD)。AlHlCOlI^Ultra-4離心過濾器裝置(IOkDaMffCO)購自Millipore(Billerica，MA)。所有妝由NewEnglandPeptide(Gardner,MA)合成。玻拍酉先亞胺基-[(N-馬來醯亞胺基丙醯胺基)-二十四乙二醇]酯(SM(PEG)24)購自PierceProteinResearchProducts(ThermoFisherScientificLSR；Rockford,IL)。超純、EM級甲醒(16%,無甲醇)購自Polysciences,Inc.(Warrington,PA)。無水乙醇、鹽酸(37%)、原娃酸四乙酯(TE0S，98%)、3-[2-(2_氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基矽烷(AEPTMS，工業級)、溴化十六烷基三甲基銨(CTAB，>99%)、十二烷基硫酸鈉(SDS，≥98.5%),Triton*X-1OO,十六烷(≥99%)、叔丁醇(≥99.5%)、2_巰基乙醇(≥99.0%)、DL-二硫蘇糖醇(≥99.5%)、二甲亞碸(≥99.9%)、pH5檸檬酸緩衝液、乙二胺四乙酸(EDTA,99.995%)、人表皮生長因子、L-α-磷脂醯乙醇胺、牛纖連蛋白、牛膠原I型、大豆胰蛋白酶抑制劑(≥98%)、無酚紅DMEM、從蓖麻獲得的去糖基化A鏈和Sephadex?G-200購自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。[0458]細胞培養條件。！fep3B和肝細胞獲自ATCC，並根據製造商說明書生長。簡而言之，Hep3B維持於含有10%FBS的EMEM中。肝細胞生長於塗布有BSA、纖連蛋白和牛膠原I型的燒瓶中；所使用的培養基為含有5ng/mL表皮生長因子、70ng/mL磷脂醯乙醇胺和10%FBS的BEGM(慶大黴素、兩性黴素和腎上腺素被從BEGMBullet試劑盒中棄除)。在37°C將細胞維持於潮溼氣氛(補充有5%CO2的空氣)中並用0.05%胰蛋白酶在亞培養比1:3下傳代。[0459]多式二氧化矽納米顆粒的合成。Cairoll等人35描述了用於合成具有多式孔隙率的納米多孔二氧化矽顆粒的乳液處理技術。簡而言之，將1.82gCTAB(可溶於水相中)加入至20g去離子水中，在40°C攪拌直至溶解，並允許冷卻至25°C。將0.57g1.0NHCl、5.2gTEOS和0.22gNaCl加入至CTAB溶液，並攪拌所得溶膠I小時。製備由含3重量％ABIL?EM90(可溶於油相的非離子型乳化劑)的十六烷組成的油相。前體溶膠與油相(1:3體積比的溶膠:油)在1000mL圓底燒瓶中混合，劇烈攪拌2分鐘以促進油包水乳劑的形成，轉移至旋轉蒸發儀(R-205；BuchiLaboratoryEquipment!Switzerland)並放置於80°C水浴中持續30分鐘。然後在120mbar減壓下煮沸混合物(35rpm，持續3小時)以除去溶劑。然後在3000rpm離心(ModelCentraMP4R；InternationalEquipmentCompany；Chattanooga,TN)顆粒20分鐘，並傾出上清液。最後，在500°C將顆粒煅燒5小時以除去表面活性劑和過量的有機物質。[0460]為使得未修飾顆粒更加親水，它們在80°C經(i)4%(體積/體積)氫氧化銨和4%(體積/體積)過氧化氫和(ii)0.4MHCl和4%(體積/體積)過氧化氫處理15分鐘。然後顆粒經水洗滌數次並再懸浮於0.5XD-PBS中，終濃度為25mg/mL。通過向ImL含20%APTES的無水乙醇中添加25mg煅燒過的顆粒(25mg/mL)，納米多孔核經含胺矽烷AEPTMS修飾；在室溫在AEPTMS中過夜孵育所述顆粒，離心(5，OOOrpm,I分鐘)以除去未反應的AEPTMS，並再懸浮於ImL0.5XD-PBS中。通過向ImL顆粒中添加5μL胺反應性突光團(fIuorophore)(AlexaFluor*647甲酸琥珀醯亞胺酯；lmg/mL於DMSO中)(每mL顆粒IμL染料)，螢光標記AEPTMS修飾的顆粒；將所述顆粒在室溫保持2小時，然後離心除去未反應的染料。將螢光標記顆粒保存於4°C0.5XD-PBS中。在負載物裝載和脂質體融合前，經由尺寸排阻色譜或差速離心除去直徑大於~200nm的顆粒。[0461]二氧化娃納米顆粒的特徵描述。使用ZetasizerNano(Malvern；Worcestershire,UnitedKingdom)進行納米多孔二氧化娃顆粒以及負載物裝載的原始細胞和脂質體的動態光散射。通過將48μL二氧化矽顆粒(25mg/mL)稀釋於2.4ml0.5XD-PBS中製備樣品。將溶液轉移至ImL聚苯乙烯試管(Sarstedt；Niimbrecht,Germany)用於分析。使用ASAP2020表面積和孔隙率分析儀(MicromeriticsInstrumentCorporation；Norcross,GA)進行氮吸附。使用ZetasizerNano(Malvern!Worcestershire,UnitedKingdom)測量ζ電勢。將二氧化矽顆粒以1:50稀釋於0.5ΧD-PBS中並轉移至Iml摺疊式毛細管樣品池(foldedcapillarycells)(Malvern!Worcestershire,UnitedKingdom)用於分析。[0462]脂質體與納米多孔二氧化矽顆粒的融合。此前已描述過用於合成原始細胞的操作％36』62』63_enref_33並將僅作簡要提及。脂質訂購自AvantiPolarLipids，將其預溶解於氯仿中並在_20°C保存。在氮氣流下乾燥2.5mg脂質並放置於真空烘箱(Model1450M,VffRInternational,WestChester,PA)中過夜以除去殘餘溶劑,然後立即進行原始細胞合成。濃度為2.5mg/mL的脂質在0.5XD-PBS中再水合併使用Min1-Extruderset(AvantiPolarLipids,Inc.;Alabaster,AL)將脂質通過IOOnm過濾器至少10次。所得脂質(直徑~120nm)在4°C保存不超過一周。在室溫,納米多孔二氧化娃核(25mg/mL)經2_4倍體積過量的脂質體孵育30-90分鐘。在4°C將原始細胞在過量脂質存在下保存達I個月。為除去過量的脂質，將原始細胞在5，OOOrpm離心I分鐘，洗滌兩次並在0.5XD-PBS中再懸浮。[0463]在再水合和擠出前將脂質一起凍幹；例如合併和乾燥75μL的D0PC(25mg/mL)、5μL的DOPE(25mg/mL)UOμL的膽固醇(75mg/mL)、10μL的18:1PEG-2000PE(25mg/mL)以形成由DOPC和5重量％DOPE,30重量％膽固醇和10重量％PEG-2000NBD-PC組成的脂質體。[0464]質量比為55:5:30:10的DOPC:D0PE:膽固醇:18:1PEG-2000PE用於合成『D0PC原始細胞』，而質量比為55:5:30:10^DOTAP:DOPE:膽固醇:18:1PEG-2000PE用於合成iDOTAP原始細胞』。[0465]肽與受支撐的脂質雙層的綴合。使用異雙功能交聯劑SM(PEG)24(其對巰基和胺部分具有反應性並具有9.52nmPEG間隔臂)，將SP94和H5WYG肽(與C端半胱氨酸殘基合成)與PE的頭基中存在的伯胺綴合。首先，原始細胞在室溫經10倍摩爾過量的SM(PEG)24孵育2小時並離心(I分鐘，5，OOOrpm)以除去未反應的交聯劑。然後活化的原始細胞在室溫經5倍摩爾過量的SP94孵育原始細胞2小時以得到0.015重量％的肽密度(~6肽/原始細胞)，而在室溫經500倍摩爾過量的H5WYG孵育4小時以得到0.500重量％的肽密度(~240肽/原始細胞)。[0466]洗滌原始細胞以除去游離態，並使用Tricine-SDS-PAGE測定平均肽密度，如前所述。34[0467]siRNA和蓖麻毒素A鏈裝載的原始細胞的合成。將未修飾的或經AEPTMS修飾的核(25mg/mL)在4°C浸泡於siRNA(250μM，於IXD-PBS中)或去糖基化蓖麻毒素A鏈(100μΜ，於IXD-PBS中)2小時。經5，OOOrpm離心I分鐘除去未包封的負載物，並立即將DOPC脂質體與上文所述的負載物裝載的核融合。經由我們此前描述的協同機理使用siRNA裝載未修飾的核。36簡而言之，向75μL二氧化矽納米顆粒(25mg/mL)中添加25μLsiRNA(ImM)。輕輕地渦旋該溶液，並在4°C將其與200μLDOTAP脂質體孵育。經離心除去過量的脂質和未包封的siRNA後立即使用。[0468]siRNA裝載的脂質複合物的合成。為製備siRNA裝載的DOPC脂質複合物，首先將DOPC、DOPE、cholesterol、和18:1PEG-2000PE以55:5:30:10質量比混合，在氮氣流下乾燥，並放置於真空烘箱中過夜以除去殘餘的氯仿。然後將脂質膜溶解於叔丁醇中，並與siRNA溶液以1:1混合(稀釋於含0.85%(重量/體積)NaCl和0.25M蔗糖的IOmMTris-HCl(ρΗ7.4)中)使得最終DOPC:siRNA比為10:1(重量/重量)。渦旋該混合物，在丙酮和乾冰浴中快速冷凍，並凍幹。在使用前，脂質複合物製劑經等張蔗糖溶液(含0.85%(重量/體積)NaCl和0.25M蔗糖的IOmMTris-HCl(pH7.4))水合至最終siRNA濃度為100μg/mL;經離心驅動的過濾(IOkDaMWCO)除去未包封的siRNA。[0469]如Wu等人64所述，我們在較小的改良下製備siRNA裝載的DOTAP脂質複合物。我們使用18:1PEG-2000PE代替PEG化的神經醯胺並使用D0TAP:D0PE:膽固醇:PEG_2000PE比為55:5:30:10。此外，我們將凍幹的脂質複合物溶解於含0.85%(重量/體積)NaCl和0.25M蔗糖的IOmMTris-HCl(pH7.4)中以使得最終siRNA濃度為100μg/mL，並使用離心過濾裝置(IOkDaMWC0)除去未包封的siRNA。將脂質複合物溶解於0.5XD-PBS中以用於ζ電勢分析。[0470]為使用SP94和H5WYG修飾DOPC和DOTAP，首先將它們與10倍摩爾過量的SM(PEG)24在室溫孵育2小時；在經離心驅動的過濾(IOkDaMWCO)除去未反應的交聯劑後，將它們與5倍摩爾過量的SP94和1000倍摩爾過量的H5WYG在室溫孵育2小時。使用離心過濾裝置(IOkDaMWCO)除去游離態。[0471]RTA裝載的脂質體的合成。為製備RTA裝載的DOPC脂質體，在氮氣流下乾燥2.5mg脂質(55:5:30:10質量比的D0PC:D0PE:膽固醇:18:1PEG-2000PE)並將其放置於真空烘箱(Model1450M,VffRInternational,WestChester,PA)中過夜以除去殘餘溶劑。將脂質在濃度為2.5mg/mL於0.5XD-PBS中再水合，簡單超聲，並與等體積的RTA(100μM，於0.5ΧD-PBS中)混合。渦旋該混合物，在丙酮和乾冰浴中快速冷凍，並凍幹。在使用前，所述脂質體製劑經上文所述的等張蔗糖溶液再水合，劇烈渦旋，並允許其在室溫靜置2-4小時。然後使用Min1-Extruderset(AvantiPolarLipids,Inc.；Alabaster,AL)將脂質體通過IOOnm過濾器至少10次，並通過Sephadex"；G-200柱以除去未包封的RTA。RTA裝載的脂質體經上文所述的SP94和H5WYG修飾。[0472]負載物容量和釋放速率的測定。通過將IxIOici顆粒在I重量％SDS(溶解於D-PBS)中孵育24小時並離心所述溶液以除去原始細胞核和其它碎片測定原始細胞、脂質複合物和脂質體的siRNA和蓖麻毒素A鏈(RTA)容量。通過與標準曲線比較260nm處的吸光度測定上清液中siRNA的濃度。經由SDS-PAGE使用ImageJImageProcessingandAnalysissoftware(NationalInstitutesofHealth；Bethesda,MD)通過與標準曲線比較條帶強度測定上清液中RTA的濃度。[0473]通過在37°C將IxIOiq顆粒懸浮於ImL模擬體液(含150mM和10%血清的EMEM，PH7.4)或檸檬酸緩衝液(pH5.0)中持續多個時期測定siRNA和RTA在中性和酸性pH條件下的釋放速率。經離心(對於原始細胞，5，OOOxg，5分鐘；對於脂質體，15，OOOxg，30分鐘；MicrofUge*16Centrifuge;Beckman_Coulter；Brea,CA)將顆粒製成丸狀。使用UV可見光譜法和SDS-PAGE測定上清液中siRNA和RTA濃度。將釋放的負載物的濃度轉化成最初包封於101°顆粒內的負載物濃度的百分數。[0474]細胞周期蛋白A2、B1、D1和E蛋白質表達的定量。為測定沉默90%細胞周期蛋白A2、細胞周期蛋白B1、細胞周期蛋白Dl或細胞周期蛋白E表所需的siRNA的濃度(IC9(I，見圖4AX3)，將lxl06!fep3B細胞在37°C暴露於多種濃度的裝載於SP94靶向的DOPC原始細胞中的siRNA，持續48小時。將細胞離心(lOOOrpm，I分鐘)以除去過量的顆粒，用3.7%甲醛固定(室溫，15分鐘)，並用0.2%TritonX-100透化(室溫，15分鐘)；然後將細胞暴露於抗細胞周期蛋白A2、抗細胞周期蛋白B1、抗細胞周期蛋白Dl或抗細胞周期蛋白E的1:500稀釋液，使用AlexaFluor*488抗體標記試劑盒在37°C標記I小時。洗滌細胞3次並再懸浮於D-PBS中以用於流式細胞術分析(FACSCalibur)。GraphPadPrism(GraphPadSoftware,Inc.；LaJolla,CA)用於從log(siRNA濃度)對平均螢光強度的作圖計算IC9tl值；初始蛋白質濃度具有暴露於siRNA裝載的原始細胞5分鐘的抗體標記的細胞的平均螢光強度。[0475]為測定細胞周期蛋白A2、細胞周期蛋白B1、細胞周期蛋白Dl和細胞周期蛋白E表達的時間依賴性降低(見圖4BX3)，將siRNA裝載的、SP94靶向的DOPC原始細胞與lxl06Hep3B細胞混合從而使得最終siRNA濃度為125pM;在37°C孵育細胞和原始細胞，持續不同的時期，並經上文所述的免疫螢光測定所得的蛋白質水平。[0476]為收集圖4CX3(左軸)所述的數據，向lxl06!fep3B或肝細胞中添加充足體積的siRNA裝載的SP94靶向的DOPC原始細胞、DOPC脂質複合物或DOTAP脂質複合物使得最終siRNA濃度為125pM。在37°C孵育樣品48小時，並如上所述定量細胞周期蛋白A2表達的降低。為測定圖4CX3(右軸)中所繪製的值，將lxl06Hep3B細胞在37°C暴露於多種濃度(顆粒/mL)的siRNA裝載的SP94靶向的DOPC原始細胞、DOPC脂質複合物或DOTAP脂質複合物48小時；使用免疫螢光法定量細胞周期蛋白A2表達，且從顆粒濃度對細胞周期蛋白A2濃度的作圖計算使細胞周期蛋白A2表達降低90%所需的顆粒數。[0477]將圖5X3中所述的細胞在37°C暴露於10倍過量含AlexaFluor?647標記的核的siRNA裝載的、SP94靶向的DOPC原始細胞I小時或48小時。細胞經D-PBS洗滌3次，根據製造商說明書經Hoechst33342標記,經3.7%甲醒(室溫，15分鐘)固定，經0.2%Tritonx-1oo透化(室溫，5分鐘)，並經Image-1T?FX信號增強劑阻斷(室溫，30分鐘)。[0478]然後將細胞在4°C暴露於AlexaFluor*488標記的抗細胞周期蛋白A2、B1、D1或E的抗體(以1:500稀釋於I%BSA中)過夜，在D-PBS中洗滌3次，並用SlmvFad》Gold封閉。[0479]siRNA裝載的、SP94靶向的原始細胞誘導的細胞凋亡的定量。通過將IxlO6細胞在37°C與125pM的siRNA孵育不同時期，測定暴露於siRNA裝載的、SP94靶向的原始細胞的H印3B和肝細胞(見圖6AX3)的時間依賴性活力。細胞經離心(lOOOrpm，I分鐘)以除去過量的原始細胞並經AlexaFluor488?標記的膜聯蛋白V和碘化丙啶染色。經流式細胞術(FACSCalibur)測定活力的(雙陰性)和非活力的(單或雙陽性)細胞的數目。[0480]將圖6BX3和6CX3所示的細胞在37°C暴露於10倍過量的siRNA裝載的、SP94靶向的含AlexaFluor?647標記的核的原始細胞I小時或48小時。然後細胞經D-PBS洗滌3次,根據製造商說明書經Hoechst33342、AlexaFluor?488標記的膜聯蛋白V和碘化丙啶染色，固定(室溫，3.7%甲醛，10分鐘)，並用SlowFaiieGold封閉。[0481]初生蛋白質合成的定量。通過將lxl06!fep3B細胞在37°C與多種濃度的原始細胞包封的RTA孵育48小時測定RTA裝載的、SP94靶向的DOPC原始細胞的IC9tl值(見圖8AX3)。使用CHck-1T?AHAAlexaFluor?488蛋白質合成HCS分析(根據製造商說明書)檢測初生蛋白質合成的降低，並經流式細胞術(FACSCalibur)定量。將各樣品的平均螢光強度對log(毒素濃度)作圖，並使用GraphPadPrism測定IC9tl值。[0482]通過將RTA裝載的、SP94靶向的原始細胞([RTA]=25pM)在37°C與lxl06!fep3B細胞孵育不同的時期測量初生蛋白質合成中的時間依賴性下降(見圖8BX3);如上所述分析初生蛋白質合成。[0483]為收集圖8CX3(左軸)所示的數據，向lxl06!fep3B或肝細胞中添加充足體積的RTA裝載的SP94靶向的DOPC原始細胞或脂質體使得最終RTA濃度為25pM。在37°C孵育樣品48小時，並如上所述定量初生蛋白合成的降低。為測定圖SC(右軸)中所繪製的值，將lxl06Hep3B細胞在37°C暴露於多種濃度(顆粒/mL)的RTA裝載的、SP94靶向的DOPC原始細胞或脂質體48小時；使用CliditsAHAAlexaFkor?488蛋白質合成HCS分析定量蛋白質生物合成，且從顆粒濃度對初生蛋白濃度的作圖計算使初生蛋白表達降低90%所需的顆粒數。[0484]將圖9X3中所示的細胞在37°C暴露於10倍過量含AlexaFluor?647標記的核的RTA裝載的、SP94靶向的DOPC原始細胞I小時或48小時。使用C]ick-1T;AHAAlexaFluor?488蛋白質合成HCS分析(根據製造商說明書)標記新合成的蛋白質。然後根據製造商說明書使用Hoechst33342將細胞染色，用3.7%甲醛固定(室溫，10分鐘)，並使用SiowFadegyGoId封閉。[0485]RTA裝載的、SP94靶向的原始細胞誘導的細胞凋亡的定量。通過將lxl06!fep3B和肝細胞在37°C暴露於RTA裝載的、SP94靶向的DOPC原始細胞([RTA]=25pM)不同時期測定半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-3的時間依賴性活化(見圖10AX3)。使用CaspGLOW?螢光素活性半胱天冬酶-9和CaspGLOW?紅色活性半胱天冬酶_3染色試劑盒定量半胱天冬酶活化程度；流式細胞術(FACSCalibur)用於測定表達高於本底水平(活力Hep3B細胞)100倍的綠色螢光(FLl)和/或紅色螢光(FL2)的細胞數。凋亡細胞被定義為對半胱天冬酶-9和/或半胱天冬酶-3呈陽性的那些細胞。[0486]將途10BX3和10CX3所示的細胞在37°C暴露於10倍過量的RTA裝載的、SP94靶向的含AlexaFluor?647標記的核的原始細胞48小時。使用CaspGLOW?螢光素活性半胱天冬酶-9和CaspGLOW?紅色活性半胱天冬酶_3染色試劑盒(分別)標記活性半胱天冬酶_9和活性半胱天冬酶-3。然後細胞在D-PBS中洗滌3次，並根據製造商說明書使用Hoechst33342染色，固定(3.7%甲醛，室溫，10分鐘)，並使用ShwFade&Gold封閉。[0487]流式細胞術儀器和設置。對於圖4AX3-4CX3、6DX3、8AX3-8CX3和10AX3，細胞樣品經配備有BDCellQuest?軟體5.2.1版的FACSCalibur流式細胞儀(BectonDickinson；FranklinLakes,NJ)分析。使用線性模式的fsc通道和對數模式的所有其它通道獲得樣品。基於前向光散射觸發事件，並將門放置於除外細胞碎片的前向散射和側向散射圖上。使用488nm雷射源激發AlexaFluor?488和螢光素，並在FLl通道(530/30過濾器/帶通)中收集發射強度。使用488nm雷射源激發碘化丙啶和硫代羅丹明(CaspGLOW?紅色活性半胱天冬酶-3染色試劑盒)，並在FL2通道(585/42)中採集發射強度。使用FlowJo軟體6.4版(TreeStar,Inc.；Ashland,OR)測定平均突光強度。使用SigmaPlotlLO版(SystatSoftware,Inc.；SanJose,CA)生成所有作圖。[0488]共聚焦螢光顯微鏡儀器和設置。使用ZeissLSM510META(CarlZeissMicroimaging,Inc.；Thornwood,NY)以LSM510軟體的通道模式操作獲得三色和四色圖像；在所有成像中使用63X、1.4-NA油浸物鏡。[0489]典型的雷射功率設置如下:對於405nm二極體雷射，30%傳輸；對於488nm氬雷射,5%傳輸(60%輸出)；對於543nm氦氖雷射，100%傳輸,和對於633nm氦氖雷射85%傳輸。對於各通道可調整增益和偏移量以避免飽和，且通常分別維持在500-700和-0.1。使用0.7-0.9μm光學薄片獲得具有1024x1024解析度的8位Z堆棧(8-bitz-stacks)。LSM510軟體用於疊加各通道和用於形成Z堆棧圖像的摺疊投影(collapsedprojections)。所有螢光圖像均為摺疊投影。[0490]對所有顯微鏡實驗，細胞在培養瓶中生長至70-80%匯集，收穫(0.05%胰蛋白酶，10分鐘)，在4000rpm離心2分鐘，並再懸浮於完全生長培養基中。將IxlO4-1xlO6細胞/mL在37°C接種於塗布有0.01%聚-L-賴氨酸(150_300kDa)的無菌蓋玻片(25_mm，N0.1.5)上並允許其附著4-24小時，然後暴露於原始細胞。使用Cytopro?離心機,7620型(ffescor,Inc.；Logan,UT)將48小時樣品紡(spun)回至載玻片上。[0491]實施例3的參考文獻[0492]1.PeerDjKarpJMjHongS，FarokhzadOCjMargalitRjLangerR.Nanocarriersasanemergingplatformforcancertherapy.NatNan0.2007；2(12):751-760.[0493]2.PetrosRA，DeSimoneJM.Strategiesinthedesignofnanoparticlesfortherapeuticapplications.NatRevDrugDiscov.2010；9(8):615-627.[0494]3.WangM，ThanouM.Targetingnanoparticlestocancer.PharmacologicalResearch.2010；62(2):90-99.[0495]4.MeisterG，TuschlT.Mechanismsofgenesilencingbydouble-strandedRNA.Nature.2004；431(7006):343-349.[0496]5.RanaTM.1lluminatingthesilence:understandingthestructureandfunctionofsmallRNAs.NatRevMolCellBiol.2007；8(I):23-36.[0497]6.DavidsonBLjMcCrayPB.CurrentprospectsforRNAinterference-basedtherapies.NatRevGenet.2011；12(5):329-340.[0498]7.LaresMR,RossiJJjOuelletDLRNAiandsmallinterferingRNAsinhumandiseasetherapeuticapplications.TrendsinBiotechnology.2010；28(11):570-579.[0499]8.BumcrotDjManoharanMjKotelianskyV，SahDWY.RNAitherapeutics:apotentialnewclassofpharmaceuticaldrugs.NatChemBiol.2006；2(12):711-719.[0500]9.AagaardL，RossiJJ.RNAitherapeutics:Principles，prospectsandchallenges.AdvancedDrugDeliveryReviews.2007；59(2-3):75-86.[0501]10.0zpolatB，SoodAKjLopez-Bere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於肽，含有5重量％DOPE的DOPC和PEG綴合)與IOOnm中孔二氧化矽納米顆粒的融合形成MSN-SLB。由於其高表面積(>1000m2/g)和大的(20-25nm)、表面可及的孔，該中孔二氧化矽核可迅速地裝載高濃度(每101°顆粒~IμM)的siRNA，該siRNA誘導NiV核殼體蛋白(NiV-N)mRNA的序列特異性降解。脂質體與siRNA裝載的核的融合形成受支撐的脂質雙層(SLB)，其促進長期(>3個月)負載物駐留並提供配體展示的流動性界面。MSN-SLB雙層經靶向肽(誘導巨胞飲的肽(R8))的多個副本和PEG修飾以使得細胞溶質遞送siRNA至模型宿主細胞成為可能。[0561]使用噬菌體展示，我們已鑑別結合印hrinB2(EB2)的肽，一種EphB2、EphB3和EphB4酪氨酸激酶的跨膜錨定配體，其由人內皮細胞和神經元表達，並作為NiV經巨胞飲進入的主要受體；在5輪針對經轉染以表達人EB2的CH0-K1細胞的親和性選擇和針對親代CH0-K1和經轉染以表達人印hrinBI的CH0-K1細胞的反選擇後，TGAILHP(SEQIDNO:18)為優勢序列。使用流式細胞儀，我們發現TGAILHP-靶向的MSN-SLB在高(1.5重量％或~500肽/顆粒)和低(0.015重量％或~5肽/顆粒)肽價對EB2陽性細胞(HEK293)均具有納摩爾親和性。[0562]重要地，經0.015重量％的TGAILHP(SEQIDNO:18)和10重量％的PEG-2000修飾的MSN-SLB，其促進膠體穩定性並減少非特異性相互作用，對HEK293細胞比對EB2陰性細胞(親代CH0-K1)具有高IO3倍的親和性。使用共聚焦螢光顯微鏡，我們測得經0.015重量％的TGAILHP(SEQIDNO:18)和0.500重量％的R8修飾的MSN-SLB被HEK293迅速地(tl/2=5分鐘)內化，而且經多種巨胞飲抑制劑預處理細胞使攝取降低了60-80%。巨胞飲體的酸化作用(I)使SLB不穩定，其觸發包封的siRNA的釋放並且(2)使R8肽質子化，其通過質子-海綿機理破壞巨胞飲體的膜，這兩種情況均使得siRNA的細胞溶質分布成為可能。[0563]選擇性結合和內化，隨後的巨胞飲體逃逸使得TGAILHP靶向的、siRNA-裝載的MSN-SLB在siRNA濃度為~5pM時沉默HEK293中90%的NiV-NmRNA成為可能，而不影響親代CHO-Kl細胞中NiV-N水平。然而，siRNA介導的RNAi是暫時的，並且在治療後5天，NiV-NmRNA水平開始升高。因此，我們設計了編碼對NiV-N特異性的小髮夾RNA(shRNA)的質粒，用組蛋白封裝該質粒，並用核定位序列修飾所得的18nm複合物，然後將其裝載於二氧化矽核內。對於組蛋白封裝質粒(4.5kbp)，MSN-SLB具有較相應的從50:50摩爾比的DOTAP和DOPE形成的脂質複合物高100倍的容量。而且，經0.015重量％的TGAILHP(SEQIDNO:18)和0.500重量％的R8修飾的質粒裝載的MSN-SLB以顆粒:細胞比為~1:20(~1750質粒/細胞cell)沉默HEK293中90%的NiV-NmRNA,並誘導長期RNAi；NiV-NmRNA的濃度仍保持在其初始值的〈10%，持續4周。由於其巨大的負載物容量，以及其穩定性和特異性，MSN-SLB作為能夠預防病毒複製和傳播的治療劑的遞送載體顯示了希望。[0564]實施例5[0565]透皮原始細胞[0566]進行了兩項實驗以測試原始細胞是否能被工程化以促進SC滲透增強和透皮遞送。在第一項實驗中，目的是測定原始細胞的標準製劑是否可能通過被動擴散穿過角質層或通過繞過皮膚而穿過皮膚。為實現該目的，使用了垂直Franz擴散裝置、從腹壁成形術獲得的全層皮膚和電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)。以下部分描述了全部的實驗方法，但簡而言之，使用膠帶剝離方法(tapestrippingmethod)從半數樣品除去SC,而其餘樣品保持完整。使用平均直徑為90nm和孔徑直徑為2.5nm的二氧化矽顆粒，和平均直徑為120nm的脂質體以及由55重量％D0PC、30重量％膽固醇和15重量％D0PE-PEG-2000配製成的雙層組合物製備原始細胞。[0567]表1顯示了所有脂質的名稱、簡寫和相關的物理性質。通過填充容器，將皮膚樣品置於其上和將供體帽夾下，修飾的Franz擴散細胞用於擴散實驗。各組對照(SC完整，SC去除)經0.5XPBS處理，而其餘樣品經8.125mg的原始細胞處理24小時。然後收集供體帽、皮膚樣品和容器流體中的其餘樣品。由於高成本/樣品，僅使用ICP-MS分析了容器流體。圖3aX5顯示了根據ICP-MS報告，每組(η=3)容器流體中SiO2的總量，證明原始細胞能夠穿透SC並擴散穿過皮膚。與具有完整SC的皮膚樣品相比，接近4Χ原始細胞的量能夠擴散穿過SC去除的皮膚樣品，然而，由於各組內的高度誤差，這些值統計學上不顯著，因此這些數據僅確認了所提議工作的可行性。[0568]下一項實驗有兩個目的，首先，由於ICP-MS的高成本/樣品，為了開發定量透皮通量的成本有效方法；其次，為了測定原始細胞的SLB組合物和製劑對透皮動力學的影響。由於螢光光譜法具有高敏感性、方便使用螢光計和核可被容易地螢光標記，因此選擇螢光光譜法用於定量通量，圖3bX5為解釋如何使用1°-含胺有機矽烷、3-氨基丙基三乙氧基矽烷(APTES)，隨後與胺反應性螢光團一起孵育通過核的功能化螢光標記原始細胞的核。在所有可見波長下，皮膚本身是高度自發螢光的，但紅外波長展示了螢光光譜法和共聚焦雷射掃描顯微鏡(CLSM)所證明的最少量的自發螢光。因此，選擇AlexaFlour633(激發:632，發射:647)用於該實驗，並將用於所有後續實驗中。取決於皮膚自發螢光的程度，對於容器緩衝液中633標記的核，螢光計的敏感性範圍為~195ng/ml-500ng/ml。在該實驗中，使用以下物質構建含有螢光標記的核的原始細胞:三種鹼性SLB組合物和總共六種製劑，所述製劑基於脂質轉變溫度的差異、飽和度和不飽和度，以及頭基:1.)70重量％D0PC/30重量％膽固醇,2.)55重量％D0PC/30重量％膽固醇/15重量％D0PE-PEG-2000，3.)70重量％DSPC/30重量％膽固醇，4.)55重量％DSPC/30重量％膽固醇/15重量％DSPE-PEG-2000，5.)45重量％D0PC/30重量％膽固醇/25重量％DOPE，和6.)30重量％D0PC/30重量％膽固醇/25重量％DOPE/15重量％DOPE。所有樣品SC保持完整，並且對照經0.5XPBS處理，同時各樣品經8mg原始細胞處理24小時。圖3cX5總結了結果並解釋SLB組合物和製劑極大地影響了原始細胞的透皮動力學。這與文獻一致，該文獻表明具有較低轉變溫度的脂質較深的擴散進入全層皮膚，而具有較高轉變溫度的脂質仍局限於角質層。初步數據共同地證明所提議工作的可行性及其成功的高可能性。此外，已開發了成本有效的螢光分析法方案定量原始細胞的透皮動力學。[0569]方法[0570]原始細胞合成和特徵描述:使用不同的揮發誘導自組裝(EISA)方法在膠體溶液或經霧化合成納米多孔顆粒核。EISA使用兩親性表面活性劑和嵌段共聚物作為與可溶性溶膠-凝膠前體(即酸或鹼、H2O或EtOH和一些有機矽烷)結合的結構導向劑以通過簡單溶劑蒸發促進具有高度有序/均勻孔徑的球形納米尺寸的二氧化矽(SiO2)顆粒的自組裝。56』57—旦完成顆粒合成，則使用溶劑萃取或500°C煅燒除去該結構導向劑。可通過定製濃度和通過選擇結構導向劑控制顆粒大小(30-1000nm)、孔隙率、孔徑(2.5_20nm)、溶解動力學和表面化學。此外，使用上文所述的操作可進行合成後功能化(圖3bX5)。通過擠出法形成SLB，在該方法中水性脂質溶液多次通過具有均勻孔的多孔聚碳酸酯膜以生成單分散脂質體溶液。購買的脂質為保存於氯仿中的25mg/ml儲備液，所以在擠出前必須將其萃取和乾燥。以不同比例配置，將脂質分配於單閃爍瓶中，從而使得最終質量為2.5mg。脂質組合物和製劑的選擇允許對SLB物理和化學性質的精確控制水平，一個額外水平的控制來自後續SLB。一旦與該核融合後，則進行修飾(表1)。在真空下除去氯仿，並脂質經0.5XPBS再水合至終濃度為2.5mg/ml，並擠出，或即刻保存於-20°C〈6個月。【權利要求】1.靶向細胞的多孔原始細胞，其包含:具有受支撐的脂質雙層的納米多孔二氧化矽或金屬氧化物核和至少一種選自以下的其它組分:靶向細胞的物種；促進原始細胞內體逃逸的融合肽；和包封的DNA，以及包含至少一種選自以下的負載物組分的其它負載物:雙鏈線性DNA；質粒DNA；藥物；顯像劑；小幹擾RNA、小髮夾RNAJiRNA或它們的混合物；其中任選地所述負載物組分的一種進一步與核定位序列綴合。2.權利要求1的原始細胞，其中所述二氧化矽核為球狀且直徑範圍為約IOnm至約250nmo3.權利要求2的原始細胞，其中所述二氧化矽核的平均直徑為約150nm。4.權利要求2或3的原始細胞，其中所述二氧化矽核的粒徑分布為單分散或多分散的。5.權利要求2或3的原始細胞，其中所述二氧化矽核為單分散的。6.權利要求2或3的原始細胞，其中所述二氧化矽核為多分散的。7.權利要求1-6任一項的原始細胞，其中所述脂質雙層由選自以下的脂質組成:1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)、1，2-二棕櫚醯基-sn_甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)、1，2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1，2-二油醯基-sn_甘油-3-[磷-L-絲氨酸](DOPS)、1，2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸化_(1』-rac-甘油)(DOPG)、1，2-二油醯基_sn_甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、I,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、I,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油醯基-2-[12-[(7-硝基-2-1，3-苯並噁二唑-4-基)氨基]月桂醯基]_sn_甘油-3-磷酸膽M(18:1-12:ONBDPC)U-棕櫚醯基_2_{12-[(7-硝基-2-1,3-苯並噁二唑_4_基)氨基]月桂醯基}-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(16:0-12:ONBDPC)、膽固醇和它們的混合物。8.權利要求1-7任一項的原始細胞，其中所述脂質雙層包括DOPC和DOPE的組合。9.權利要求1-7任一項的原始細胞，其中所述脂質雙層包括D0TAP、D0PG、D0PC或它們的混合物。10.權利要求1-7任一項的原始細胞，其中所述脂質雙層包括DOPG和D0PC。11.權利要求8-10任一項的原始細胞，其中所述脂質雙層還包括膽固醇。12.權利要求1-7任一項的原始細胞，其中所述脂質雙層包括DOPC與約5重量％DOPE、約30重量％膽固醇和約10重量％PEG-2000PE(18:1)的組合。13.權利要求1-7任一項的原始細胞，其中脂質雙層包括約5重量％DOPE、約5重量％PEG、約30重量％膽固醇、約60重量％DOPC和/或DPPC。14.權利要求13的原始細胞，其中所述PEG與所述DOPE綴合。15.權利要求1-14任一項的原始細胞，其中所述靶向物種為靶向肽。16.權利要求15的原始細胞，其中所述靶向肽為SP94肽。17.權利要求16的原始細胞，其中所述靶向肽為SEQIDNO:6、SEQIDNO:7或SEQIDN0:8。18.權利要求15的原始細胞，其中所述靶向肽為SEQIDNO:KSEQIDN0:2、SEQ1.D.NO:3、SEQ1.D.N0.4或SEQIDNO:5的MET結合肽。19.權利要求1-18任一項的原始細胞，其中所述促融合蛋白為H5WYG肽(SEQIDNO:13)或八體聚精氨酸(SEQIDNO:14)。20.權利要求19的原始細胞，其中所述融合肽為SEQIDNO:13。21.權利要求1-20的原始細胞，其包含質粒DNA，其中所述質粒DNA任選經修飾以表達核定位序列。22.權利要求21的原始細胞，其中所述質粒DNA為超螺旋的或封裝的質粒DNA。23.權利要求22的原始細胞，其中所述DNA為超螺旋的且封裝的質粒DNA。24.權利要求20-23任一項的原始細胞，其中所述質粒DNA任選經修飾以表達核定位序列。25.權利要求21-24任一項的原始細胞，其中所述DNA為組蛋白封裝的超螺旋質粒DNA,其包括人組蛋白的混合物。26.權利要求25的原始細胞，其中所述組蛋白的混合物由H1、H2A、H2B、H3和H4組成。27.權利要求25的原始細胞，其中所述組蛋白混合物為重量比為1:2:2:2:2的H1、H2A、H2B、H3和H4。28.權利要求1-27任一項的原始細胞，其中所述質粒DNA能夠表達多肽毒素、小髮夾RNA(shRNA)或小幹擾RNA(siRNA)。29.權利要求28的原始細胞，其中所述多肽毒素選自蓖麻毒素A鏈或白喉毒素A鏈。30.權利要求1或28的原始細胞，其中所述shRNA或所述siRNA誘導細胞凋亡。31.權利要求1-30任一項的原始細胞，其中所述質粒DNA能夠表達報告蛋白。32.權利要求31的原始細胞，其中所述報告蛋白為綠色螢光蛋白或紅色螢光蛋白。33.權利要求1-32任一項的原始細胞，其中所述核定位序列為SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11或SEQIDNO:12的肽。34.權利要求1-33任一項的原始細胞，其中所述核定位序列為SEQIDNO:9的肽。35.權利要求1-34任一項的原始細胞，其還包含抗癌劑作為藥物。36.權利要求35的原始細胞，其中所述抗癌劑為依維莫司、曲貝替定、白蛋白結合型紫杉醇、TLK286、AV-299、DN-10U帕唑帕尼、GSK690693、RTA744、ON0910.Na、AZD6244(ARRY-142886),AMN-107、TK1-258、GSK461364、AZD1152、恩扎妥林)、凡德他尼、ARQ-197、MK-0457、MLN8054、PHA-739358、R-763、AT-9263、FLT-3抑制劑、VEGFR抑制劑、EGFRTK抑制劑、極光激酶抑制劑、PIK-1調節劑、Bcl-2抑制劑、HDAC抑制劑、c-MET抑制劑、PARP抑制劑、Cdk抑制劑、EGFRTK抑制劑、IGFR-TK抑制劑、抗HGF抗體、PI3激酶抑制劑、AKT抑制劑、JAK/STAT抑制劑、檢查點-1或2抑制劑、粘著斑激酶抑制劑、Map激酶激酶(mek)抑制劑、VEGFtrap抗體、培美曲塞、厄洛替尼、達沙替尼、尼羅替尼、decatanib、帕尼單抗、氨柔比星、奧戈伏單抗、Lep-etu、諾拉曲塞、azd2171、batabulin、奧法木單抗、扎木單抗、edotecarin、粉防己鹼、盧比替康、替米利芬、oblimersen、ticiIimumab、易普利單抗、棉酹、Bio111、131-1-TM-601、ALT-110,ΒΙΟ140、CC8490、西侖吉肽、吉馬替康、IL13-PE38QQR、INO1001、IPdRiKRX-0402、硫蒽酮、LY317615、neuradiab、vitespan、Rta744、Sdx102、他侖帕奈、阿曲生坦、Xr311、羅米地辛、ADS-100380、舒尼替尼、5-氟尿嘧啶、伏立諾他、依託泊苷、吉西他濱、多柔比星、5』-脫氧-5-氟尿苷、長春新鹼、替莫唑胺、ZK-304709、seliciclib;PD0325901、AZD-6244、卡培他濱、L-穀氨酸、N-[4-[2_(2-氨基-4，7-二氫-4-氧代-1H-吡咯並[2，3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲醯基]二鈉鹽七水合物、喜樹鹼、PEG-標記的伊立替康、他莫昔芬、枸櫞酸託瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、來曲唑、DES(己烯雌酚)、雌二醇、雌激素、綴合的雌激素、貝伐珠單抗、IMC-1C11、CHIR-258);3_[5_(甲基磺醯基哌啶甲基)-吲哚基-喹諾酮、瓦他拉尼、AG-013736、AVE-0005、[D-Ser(But)6,Azgly10](pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2乙酸鹽[C59H84N18Oi4-(C2H4O2)x，其中X=I至2.4]的乙酸鹽、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、雙羥萘酸曲普瑞林、醋酸甲羥孕酮、己酸羥孕酮、醋酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡魯胺、氟他胺、尼魯米特、醋酸甲地孕酮、CP-724714;TAK-165、HK1-272、厄洛替尼、拉帕替尼、卡奈替尼、ABX-EGF抗體、愛必妥、EKB-569、PK1-166、GW-572016、洛那法尼(1nafarnib)、BMS-214662、替吡法尼(tipifarnib);氨磷汀、NVP-LAQ824、辛二醯基苯胺一羥肟酸、丙戊酸、曲古抑菌素A、FK-228、SU11248、索拉菲尼、KRN951、氨魯米特、arnsacrine、阿那格雷、L-門冬醯胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、博來黴素、布舍瑞林、白消安、卡鉬、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱、氯膦酸鹽、環丙孕酮、阿糖胞苷、達卡巴嗪、放線菌素D、柔紅黴素、己烯雌酚、表柔比星、氟達拉濱、氟氫可的松、氟甲睪酮、氟他胺、吉西他濱、格列衛、羥基脲、伊達比星、異環磷醯胺、伊馬替尼、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、雙氯乙基甲胺、美法侖、6-巰基嘌呤、美司鈉、甲氨蝶呤、絲裂黴素、米託坦、米託蒽醌、尼魯米特、奧曲肽、奧沙利鉬、帕米磷酸鹽、噴司他丁、普卡黴素、葉菲爾鈉、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔單抗、鏈佐星、替尼泊苷、睪酮、沙利度胺、硫鳥嘌呤、塞替派、維A酸、長春地辛、13-順式-視黃酸、苯丙氨酸氮芥、尿嘧啶氮芥、雌莫司汀、六甲密胺、氟脲嘧啶脫氧核苷、5-脫氧尿苷、阿糖胞苷、6-硫基嘌呤、脫氧柯福黴素、骨化三醇、戊柔比星、光輝黴素、長春鹼、長春瑞濱、託泊替康、雷佐生、馬立馬司他、C0L-3、新伐司他、BMS-275291、角鯊胺、內皮他丁、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、IM862、血管他丁、vitaxin、屈洛昔芬、idoxyfene、螺內酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥珠單抗、地尼白介素融合毒素、吉非替尼、硼替佐米、紫杉醇、無氫化蓖麻油的紫杉醇、多西他賽、埃坡黴素B、BMS-247550、BMS-310705、屈洛昔芬、4-羥基他莫昔芬、哌噴昔芬、ERA-923、阿佐昔芬、氟維司群、阿考比芬、拉索昔芬、艾多昔芬、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、託泊替康、PTK787/ZK222584、VX-745、PD184352、雷帕黴素、40-0-(2-羥基乙基)_雷帕黴素、替西羅莫司、AP-23573、RADOOUABT-578、BC-210、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青黴素、ZM336372、L-779,450、PEG-非格司亭、達貝泊汀、促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子、唑來磷酸鹽、潑尼松、西妥昔單抗、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、組氨瑞林、PEG化的幹擾素a_2a、幹擾素a_2a、PEG化的幹擾素a_2b、幹擾素a-2b、阿扎胞苷、PEG-L-門冬醯胺酶、來那度胺、吉妥珠單抗、氫化可的松、白介素-11、右丙亞胺、阿侖單抗、全反式維甲酸、酮康唑、白介素_2、甲地孕酮、免疫球蛋白、氮芥、甲潑尼龍、替伊莫單抗、雄激素類、地西他濱、六甲密胺、貝沙羅汀、託西莫單抗、三氧化二砷、可的松、editronate、米託坦、環孢菌素、柔紅黴素脂質體、Edwina-門冬醯胺酶、鍶89、卡索匹坦、奈妥匹坦、NK-1受體拮抗劑、帕洛諾司瓊、阿瑞匹坦、苯海拉明、羥嗪、甲氧氯普胺、蘿拉西泮、阿普唑侖、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、甲潑尼龍、丙氯拉嗪、格拉司瓊、昂丹司瓊、多拉司瓊、託烷司瓊、聚乙二醇非格司亭、促紅細胞生成素、阿法依泊汀、阿法達貝泊汀或它們的混合物。37.權利要求1-36任一項的原始細胞，其中所述藥物包括抗病毒劑。38.權利要求37的原始細胞，其中所述抗病毒劑為抗HIV劑、抗HBV劑或抗HCV劑。39.原始細胞，其包括具有受支撐的脂質雙層的納米多孔二氧化矽核和SEQIDNO:KSEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQID.NO:4或SEQIDNO:5的MET結合肽。40.權利要求31的原始細胞，其中所述MET結合肽為SEQIDNO:1的肽。41.權利要求39或40的原始細胞，其中所述MET結合肽與所述脂質雙層綴合。42.權利要求39-41任一項的原始細胞，其中所述原始細胞還包括至少一種選自以下的組分:促進原始細胞內體逃逸的融合肽和包封的DNA;質粒DNA;雙鏈線性DNA、藥物；顯像劑、小幹擾RNA、小髮夾RNA和微RNA，其中所述質粒DNA、所述藥物、所述顯像劑和/或所述RNA進一步與核定位序列綴合。43.權利要求42的原始細胞，其中所述藥物包括至少一種抗癌劑。44.權利要求43的原始細胞，其中所述抗癌劑選自:依維莫司、曲貝替定、白蛋白結合型紫杉醇、TLK286、AV-299、DN-10U帕唑帕尼、GSK690693、RTA744、ON0910.Na、AZD6244(ARRY-142886)、AMN-107、TK1-258、GSK461364、AZD1152、恩扎妥林、凡德他尼、ARQ-197、MK-0457、MLN8054、PHA-739358、R-763、AT-9263、FLT-3抑制劑、VEGFR抑制劑、EGFRTK抑制劑、極光激酶抑制劑、PIK-1調節劑、Bcl-2抑制劑、HDAC抑制劑、c-MET抑制劑、PARP抑制劑、Cdk抑制劑、EGFRTK抑制劑、IGFR-TK抑制劑、抗HGF抗體、PI3激酶抑制劑、AKT抑制劑、JAK/STAT抑制劑、檢查點-1或2抑制劑、粘著斑激酶抑制劑、Map激酶激酶(mek)抑制劑、VEGFtrap抗體、培美曲塞、厄洛替尼、達沙替尼、尼羅替尼、decatanib、帕尼單抗、氨柔比星、奧戈伏單抗、Lep-etu、諾拉曲塞、azd2171、batabulin、奧法木單抗、扎木單抗、edotecarin、粉防己鹼、盧比替康、替米利芬、oblimersen、ticiIimumab、易普利單抗、棉酹、Bio111、131-1-TM-601、ALT-110,BIO140、CC8490、西侖吉肽、吉馬替康、IL13-PE38QQR、INO1001、IPdRlKRX-0402、硫蒽酮、LY317615、neuradiab、vitespan、Rta744、Sdx102、他侖帕奈、阿曲生坦、Xr311、羅米地辛、ADS-100380、舒尼替尼、5-氟尿嘧啶、伏立諾他、依託泊苷、吉西他濱、多柔比星、5』-脫氧-5-氟尿苷、長春新鹼、替莫唑胺、ZK-304709、seliciclib;PD0325901、AZD-6244,卡培他濱、L-穀氨酸、N-[4-[2_(2-氨基-4，7-二氫-4-氧代-1H-吡咯並[2，3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲醯基]二鈉鹽七水合物、喜樹鹼、PEG-標記的伊立替康、他莫昔芬、枸櫞酸託瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、來曲唑、DES(己烯雌酚)、雌二醇、雌激素、綴合的雌激素、貝伐珠單抗、IMC-1ClUCHIR-258);3_[5_(甲基磺醯基哌啶甲基)-吲哚基-喹諾酮、瓦他拉尼、AG-013736、AVE-0005、[D-Ser(But)6,Azgly10](pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2乙酸鹽[C59H84N18Oi4-(C2H4O2)x，其中X=I至2.4]的乙酸鹽、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、雙羥萘酸曲普瑞林、醋酸甲羥孕酮、己酸羥孕酮、醋酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡魯胺、氟他胺、尼魯米特、醋酸甲地孕酮、CP-724714;TAK-165、HK1-272、厄洛替尼、拉帕替尼、卡奈替尼、ABX-EGF抗體、愛必妥、EKB-569、PK1-166、GW-572016、洛那法尼、BMS-214662、替吡法尼；氨磷汀、NVP-LAQ824、辛二醯基苯胺一羥肟酸、丙戊酸、曲古抑菌素A、FK-228、SU11248、索拉菲尼、KRN951、氨魯米特、arnsacrine、阿那格雷、L-門冬醯胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、博來黴素、布舍瑞林、白消安、卡鉬、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱、氯膦酸鹽、環丙孕酮、阿糖胞苷、達卡巴嗪、放線菌素D、柔紅黴素、己烯雌酚、表柔比星、氟達拉濱、氟氫可的松、氟甲睪酮、氟他胺、吉西他濱、格列衛、羥基脲、伊達比星、異環磷醯胺、伊馬替尼、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、雙氯乙基甲胺、美法侖、6-巰基嘌呤、美司鈉、甲氨蝶呤、絲裂黴素、米託坦、米託蒽醌、尼魯米特、奧曲肽、奧沙利鉬、帕米磷酸鹽、噴司他丁、普卡黴素、葉菲爾鈉、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔單抗、鏈佐星、替尼泊苷、睪酮、沙利度胺、硫鳥嘌呤、塞替派、維A酸、長春地辛、13-順式-視黃酸、苯丙氨酸氮芥、尿嘧啶氮芥、雌莫司汀、六甲密胺、氟脲嘧啶脫氧核苷、5-脫氧尿苷、阿糖胞苷、6-硫基嘌呤、脫氧柯福黴素、骨化三醇、戊柔比星、光輝黴素、長春鹼、長春瑞濱、託泊替康、雷佐生、馬立馬司他、C0L-3、新伐司他、BMS-275291、角鯊胺、內皮他丁、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、頂862、血管他丁、vitaxin、屈洛昔芬、idoxyfene、螺內酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥珠單抗、地尼白介素融合毒素、吉非替尼、硼替佐米、紫杉醇、無氫化蓖麻油的紫杉醇、多西他賽、埃坡黴素B、BMS-247550、BMS-310705、屈洛昔芬、4-羥基他莫昔芬、哌噴昔芬、ERA-923、阿佐昔芬、氟維司群、阿考比芬、拉索昔芬、艾多昔芬、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、託泊替康、PTK787/ZK222584、VX-745、H)184352、雷帕黴素、40-0-(2-羥基乙基)-雷帕黴素、替西羅莫司、AP-23573、RAD001、ABT-578、BC-210、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青黴素、ZM336372、L-779,450、PEG-非格司亭、達貝泊汀、促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子、唑來磷酸鹽、潑尼松、西妥昔單抗、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、組氨瑞林、PEG化的幹擾素a-2a、幹擾素a-2a、PEG化的幹擾素a_2b、幹擾素a_2b、阿扎胞苷、PEG-L-門冬醯胺酶、來那度胺、吉妥珠單抗、氫化可的松、白介素-11、右丙亞胺、阿侖單抗、全反式維甲酸、酮康唑、白介素_2、甲地孕酮、免疫球蛋白、氮芥、甲潑尼龍、替伊莫單抗、雄激素類、地西他濱、六甲密胺、貝沙羅汀、託西莫單抗、三氧化二砷、可的松、editronate、米託坦、環孢菌素、柔紅黴素脂質體、Edwina-門冬醯胺酶、鍶89、卡索匹坦、奈妥匹坦、NK-1受體拮抗劑、帕洛諾司瓊、阿瑞匹坦、苯海拉明、羥嗪、甲氧氯普胺、蘿拉西泮、阿普唑侖、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、甲潑尼龍、丙氯拉嗪、格拉司瓊、昂丹司瓊、多拉司瓊、託烷司瓊、聚乙二醇非格司亭、促紅細胞生成素、阿法依泊汀、阿法達貝泊汀或它們的混合物。45.權利要求39-45任一項的原始細胞，其中所述藥物包括至少一種抗病毒劑。46.權利要求45的原始細胞，其中所述抗病毒劑為抗HIV劑、抗HBV劑、抗HCV劑或它們的混合物。47.權利要求39-46任一項的原始細胞，其中所述DNA能夠表達至少一種報告分子。48.權利要求39-47的原始細胞包含質粒DNA，其中所述質粒DNA任選經修飾以表達核定位序列。49.權利要求48的原始細胞，其中所述DNA為超螺旋的或封裝的質粒DNA。50.權利要求49的原始細胞，其中所述DNA為超螺旋的且封裝的質粒DNA。51.權利要求48-51任一項的原始細胞，其中所述質粒DNA任選經修飾以表達核定位序列。52.權利要求47-51任一項的原始細胞，其中所述DNA為組蛋白封裝的超螺旋質粒DNA,其包括人組蛋白的混合物。53.權利要求52的原始細胞，其中所述組蛋白的混合物由H1、H2A、H2B、H3和H4組成。54.權利要求53的原始細胞，其中所述組蛋白混合物為重量比為1:2:2:2:2的H1、H2A、H2B、H3和H4。55.權利要求48-54任一項的原始細胞，其中所述質粒DNA能夠表達多肽毒素、小髮夾RNA(shRNA)或小幹擾RNA(siRNA)。56.權利要求55的原始細胞，其中所述多肽毒素選自蓖麻毒素A鏈或白喉毒素A鏈。57.權利要求55的原始細胞，其中所述shRNA或所述siRNA誘導細胞凋亡。58.權利要求48-57任一項的原始細胞，其中所述質粒DNA能夠表達報告蛋白。59.權利要求58的原始細胞，其中所述報告蛋白為綠色螢光蛋白或紅色螢光蛋白。60.權利要求39-59任一項的原始細胞，其中所述核定位序列為SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11或SEQIDNO:12的肽。61.權利要求60的原始細胞，其中所述核定位序列為SEQIDNO:9的肽。62.藥物組合物，其包含有效引起治療作用的量的原始細胞群體和藥學上可接受的載體/添加劑或賦形劑。63.權利要求62的組合物，其還包含不被處理為原始細胞內的負載物的藥物。64.權利要求63的組合物，其中所述抗藥物為抗癌劑或抗病毒劑。65.權利要求64的組合物，其中所述抗病毒劑為抗HIV劑、抗HBV劑、抗HCV劑或它們的混合物。66.權利要求62-65任一項的組合物為胃腸外劑型。67.權利要求66的組合物，其中所述劑型為皮內劑型、肌肉內劑型、骨內劑型、腹膜內劑型、靜脈內劑型、皮下劑型或鞘內劑型。68.權利要求62-65任一項的組合物為局部或透皮劑型。69.SEQIDNO:1、SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQID.N0:4或SEQIDNO:5的MET結合肽。70.權利要求69的MET結合肽為SEQIDNO:1。71.藥物組合物，其包含權利要求69或70的MET結合肽。72.藥物組合物，其包含原始細胞群體，所述原始細胞群體包含靶向肽從而所述原始細胞與抗癌劑和抗HBV劑和抗HCV劑或它們的混合物的組合選擇性地結合肝細胞癌細胞。73.權利要求72的組合物，其中所述靶向肽選自SP94肽、MET結合肽或它們的混合物。74.權利要求72的組合物，其中所述抗癌劑為多吉美(索拉菲尼)、舒尼替尼、貝伐珠單抗、特羅凱(厄洛替尼)、泰克泊(拉帕替尼)或它們的混合物。75.權利要求72至74任一項的組合物，其中所述抗HBV劑為賀維力(阿德福韋二匹伏酯)、拉米夫定、恩替卡韋、替比夫定、替諾福韋、恩曲他濱、克來夫定、valtoricitabine、amdoxovir、帕拉德福韋、racivir、BAM205、硝唑尼特、UT231_B、Bay41-4109、EHT899、日達仙(胸腺肽α-l)或它們的混合物。76.權利要求72至75任一項的組合物，其中所述抗HCV劑為波普瑞韋、daclatasvir、asunapavir、INX-189、FV-100,NM283、VX-950(替拉瑞韋)、SCH50304、TMC435、VX-500、BX-813、SCH503034、R1626、ITMN-191(R7227)、R7128、PF-868554、TT033、CGH-759、GI5005、MK-7009、SIRNA-034、MK-0608、A-837093、GS9190、GS9256、GS9451、GS5885、GS6620、GS9620、GS9669、ACH-1095、ACH-2928、GSK625433、TG4040(MVA-HCV)、A-831、F351、NS5A、NS4B、ANA598、A-689、GN1-104、IDX102、ADX184、ALS-2200、ALS-2158、BI201335,BI207127、BIT-225、BIT-8020、GL59728、GL60667、PS1-938、PS1-7977、PS1-7851、SCY-635、利巴韋林、PEG化幹擾素、PHX1766,SP-30或它們的混合物。77.治療癌症的方法，其包括向有需要的患者給予有效量的包含權利要求1-61任一項的原始細胞群體的組合物，所述原始細胞適應於遞送抗癌劑至所述患者的癌細胞。78.治療肝細胞癌的方法，其包括向所述患者給予有效量的權利要求72-76任一項的組合物。79.治療癌症的方法，其包括向有需要的患者給予有效量的權利要求1-61任一項的原始細胞群體，其中所述DNA質粒為超螺旋的並且適應於表達抗癌多肽和/或RNA，任選與有效量的被配製作為所述原始細胞內的負載物的其它抗癌劑組合。80.權利要求79的方法，其中所述抗癌多肽選自蓖麻毒素A鏈或白喉毒素A鏈。81.權利要求79或80的方法，其中所述RNA為誘導細胞凋亡的shRNA或siRNA。82.權利要求79-81任一項的方法，其中所述siRNA選自s565、s7824或sl0234。83.權利要求81的方法，其中所述shRNA為誘導細胞死亡的細胞周期蛋白BI特異性ShRNA084.權利要求79-84任一項的方法，其中所述抗癌劑選自:依維莫司、曲貝替定、白蛋白結合型紫杉醇、TLK286、AV-299、DN-101、帕唑帕尼、GSK690693、RTA744、ON0910.Na、AZD6244(ARRY-142886)、AMN-107、TK1-258,GSK461364、AZD1152、恩扎妥林、凡德他尼、ARQ-197、MK-0457、MLN8054、PHA-739358、R-763、AT-9263、FLT-3抑制劑、VEGFR抑制劑、EGFRTK抑制劑、極光激酶抑制劑、PIK-1調節劑、Bcl-2抑制劑、HDAC抑制劑、c-MET抑制劑、PARP抑制劑、Cdk抑制劑、EGFRTK抑制劑、IGFR-TK抑制劑、抗HGF抗體、PI3激酶抑制劑、AKT抑制劑、JAK/STAT抑制劑、檢查點-1或2抑制劑、粘著斑激酶抑制劑、Map激酶激酶(mek)抑制劑、VEGFtrap抗體、培美曲塞、厄洛替尼、達沙替尼、尼羅替尼、decatanib、帕尼單抗、氨柔比星、奧戈伏單抗、Lep-etu、諾拉曲塞、azd2171、batabulin、奧法木單抗、扎木單抗、edotecarin、粉防己鹼、盧比替康、替米利芬、oblimersen、ticilimumab、易普利單抗、棉酚、Bio111、131-1-TM-601、ALT-110,BIO140、CC8490、西侖吉肽、吉馬替康、IL13-PE38QQR、INO1001、IPdRlKRX-0402、硫蒽酮、LY317615、neuradiab、vitespan、Rta744、Sdx102、他侖帕奈、阿曲生坦、Xr311、羅米地辛、ADS-100380、舒尼替尼、5-氟尿嘧啶、伏立諾他、依託泊苷、吉西他濱、多柔比星、多柔比星脂質體、5』-脫氧-5-氟尿苷、長春新鹼、替莫唑胺、ZK-304709、seliciclib、PD0325901、AZD-6244、卡培他濱、L-穀氨酸、^[4-[2-(2-氨基-4，7-二氫-4-氧代-1!1-吡咯並[2，3_d]嘧啶_5_基)乙基]苯甲醯基]二鈉鹽七水合物、喜樹鹼、PEG-標記的伊立替康、他莫昔芬、枸櫞酸託瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、來曲唑、DES(己烯雌酚)、雌二醇、雌激素、綴合的雌激素、貝伐珠單抗、IMC-1ClUCHIR-258);3_[5_(甲基磺醯基哌啶甲基)_吲哚基-喹諾酮、瓦他拉尼、AG-013736、AVE-0005、[D-Ser(But)6，Azgly10](pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2乙酸鹽[C59H84N18Oi4-(C2H4O2)x,其中x=I至2.4]的乙酸鹽、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、雙羥萘酸曲普瑞林、醋酸甲羥孕酮、己酸羥孕酮、醋酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡魯胺、氟他胺、尼魯米特、醋酸甲地孕酮、CP-724714;TAK-165、HK1-272、厄洛替尼、拉帕替尼、卡奈替尼、ABX-EGF抗體、愛必妥、EKB-569、PK1-166、GW-572016、洛那法尼、BMS-214662、替吡法尼；氨磷汀、NVP-LAQ824、辛二醯基苯胺一羥肟酸、丙戊酸、曲古抑菌素A、FK-228、SU11248、索拉菲尼、KRN951、氨魯米特、arnsacrine、阿那格雷、L-門冬醯胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、博來黴素、布舍瑞林、白消安、卡鉬、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱、氯膦酸鹽、環丙孕酮、阿糖胞苷、達卡巴嗪、放線菌素D、柔紅黴素、己烯雌酚、表柔比星、氟達拉濱、氟氫可的松、氟甲睪酮、氟他胺、吉西他濱、格列衛、羥基脲、伊達比星、異環磷醯胺、伊馬替尼、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、雙氯乙基甲胺、美法侖、6-巰基嘌呤、美司鈉、甲氨蝶呤、絲裂黴素、米託坦、米託蒽醌、尼魯米特、奧曲肽、奧沙利鉬、帕米磷酸鹽、噴司他丁、普卡黴素、葉菲爾鈉、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔單抗、鏈佐星、替尼泊苷、睪酮、沙利度胺、硫鳥嘌呤、塞替派、維A酸、長春地辛、13-順式-視黃酸、苯丙氨酸氮芥、尿嘧啶氮芥、雌莫司汀、六甲密胺、氟脲嘧唳脫氧核苷、5-脫氧尿苷、阿糖胞苷、6-硫基嘌呤、脫氧柯福黴素、骨化三醇、戊柔比星、光輝黴素、長春鹼、長春瑞濱、託泊替康、雷佐生、馬立馬司他、C0L-3、新伐司他、BMS-275291、角鯊胺、內皮他丁、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、IM862、血管他丁、vitaxin、屈洛昔芬、idoxyfene、螺內酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥珠單抗、地尼白介素融合毒素、吉非替尼、硼替佐米、紫杉醇、無氫化蓖麻油的紫杉醇、多西他賽、埃坡黴素B、BMS-247550、BMS-310705、屈洛昔芬、4-羥基他莫昔芬、哌噴昔芬、ERA-923、阿佐昔芬、氟維司群、阿考比芬、拉索昔芬、艾多昔芬、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、託泊替康、PTK787/ZK222584、VX-745、PD184352、雷帕黴素、40_0_(2-羥基乙基)-雷帕黴素、替西羅莫司、AP-23573、RAD001、ABT-578、BC-210、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青黴素、ZM336372、L-779,450、PEG-非格司亭、達貝泊汀、促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子、唑來磷酸鹽、潑尼松、西妥昔單抗、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、組氨瑞林、PEG化的幹擾素a-2a、幹擾素a-2a、PEG化的幹擾素a-2b、幹擾素a-2b、阿扎胞苷、PEG-L-門冬醯胺酶、來那度胺、吉妥珠單抗、氫化可的松、白介素-11、右丙亞胺、阿侖單抗、全反式維甲酸、酮康唑、白介素_2、甲地孕酮、免疫球蛋白、氮芥、甲潑尼龍、替伊莫單抗、雄激素類、地西他濱、六甲密胺、貝沙羅汀、託西莫單抗、三氧化二砷、可的松、editronate、米託坦、環孢菌素、柔紅黴素脂質體、Edwina-門冬醯胺酶、鍶89、卡索匹坦、奈妥匹坦、NK-1受體拮抗劑、帕洛諾司瓊、阿瑞匹坦、苯海拉明、羥嗪、甲氧氯普胺、蘿拉西泮、阿普唑侖、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、甲潑尼龍、丙氯拉嗪、格拉司瓊、昂丹司瓊、多拉司瓊、託烷司瓊、聚乙二醇非格司亭、促紅細胞生成素、阿法依泊汀、阿法達貝泊汀和它們的混合物。85.權利要求74-84任一項的方法,其中所述原始細胞或所述原始細胞外的組合物還包含抗病毒劑。86.權利要求85的方法，其中所述抗病毒劑為抗HBV劑或抗HCV劑。87.治療患者癌症的方法，其包括向有需要的患者給予有效量的權利要求62-76任一項的組合物。88.權利要求87任一項的方法,其中所述癌症為鱗狀細胞癌、腺癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱癌、骨癌、腸癌、乳腺癌、宮頸癌、結腸癌(結腸直腸癌)、食管癌、頭部癌症、腎癌、肝癌(肝細胞癌)、肺癌、鼻咽癌、頸部癌症、卵巢癌、睪丸癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌；白血病、伯基特淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、惡性黑色素瘤；骨髓增生性疾病；尤因肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、脂肉瘤、肌肉瘤、外周神經上皮樣瘤、滑膜肉瘤；膠質瘤、星形細胞瘤、少突神經膠質瘤、室管膜瘤、成膠質細胞瘤、成神經細胞瘤、神經節瘤、神經節神經膠質瘤、髓母細胞瘤、松果體細胞腫瘤、腦膜瘤、腦膜肉瘤、神經纖維瘤和神經鞘瘤、腸癌、乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌、子宮癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、混合型小細胞和非小細胞癌、胸膜間皮瘤、胸膜間皮瘤、睪丸癌、甲狀腺癌和星形細胞瘤。89.在有癌症風險的患者中診斷癌症的方法，所述方法包括向所述患者給予包含權利要求1-61任一項的原始細胞群體的藥物組合物,所述原始細胞包含適應於選擇性結合癌細胞並遞送所述原始細胞至所述細胞的靶向肽，其中所述原始細胞包含適應於表達報告分子並任選地包含其它報告分子的質粒DNA，如果存在癌細胞，所述原始細胞與癌細胞在所述患者中結合後釋放所述報告分子至所述癌細胞，並且所述報告分子將誘出可與標準相比的信號以測定所述患者是否患有癌症，和如果患有癌症，所述癌症的程度和/或癌性腫瘤的大小。90.在患者中監測癌症治療的方法，所述方法包括向所述患者給予權利要求1-61任一項的原始細胞群體，所述原始細胞包含適應於選擇性結合癌細胞並遞送所述原始細胞至所述細胞的靶向肽，其中所述原始細胞包含適應於表達報告分子並任選地包含其它報告分子的質粒DNA，所述原始細胞與癌細胞在所述患者中結合後將釋放所述報告分子至所述癌細胞中，並且所述報告分子將在治療開始時和治療過程中的不同間隔誘出可與標準相比的信號以測定所述患者是否對治療應答，並且如果應答，測定對治療的應答程度。91.透皮原始細胞，其包含以下大量多孔納米顆粒，所述多孔納米顆粒:(a)裝載有一種或多種藥學活性劑和(b)被脂質雙層包封並支撐脂質雙層，其中所述脂質雙層包含一種或多種選自以下的角質層通透性促進劑:單飽和ω-9脂肪酸、醇、二醇、溶劑、共溶劑、R8肽和膜軟化劑，其中所述原始細胞的平均直徑為約50nm至約300nm。92.權利要求91的透皮原始細胞，其中所述單飽和ω-9脂肪酸選自油酸、反油酸、二十碳烯酸、二十碳三烯酸、芥酸和神經酸，最優選油酸，和它們的混合物。93.權利要求91的透皮原始細胞，其中所述醇選自甲醇、乙醇、丙醇和丁醇，以及它們的混合物，且所述溶劑和共溶劑選自PEG400和DMSO。94.權利要求91的透皮原始細胞，其中所述二醇選自乙二醇和聚乙二醇和其混合物。95.權利要求91的透皮原始細胞，其中所述膜軟化劑可選自膽鹽、聚氧乙烯酯和聚氧乙烯醚、單鍊表面活性劑，以及它們的混合物。96.權利要求91的透皮原始細胞，其中所述膜軟化劑為去氧膽酸鈉。97.權利要求92的透皮原始細胞，其中所述原始細胞的平均直徑為約50nm至約300nmo98.權利要求91的透皮原始細胞，其中所述原始細胞的平均直徑為約55nm至約270nmo99.權利要求92的透皮原始細胞，其中所述原始細胞的平均直徑為約60nm至約240nmo100.權利要求91的透皮原始細胞，其中所述原始細胞的平均直徑為約65nm至約210nmo101.權利要求91的透皮原始細胞，其中所述原始細胞的平均直徑為約65nm至約.190nmo102.權利要求92的透皮原始細胞，其中所述原始細胞的平均直徑為約65nm至約.160nmo103.權利要求91的透皮原始細胞，其中所述原始細胞的平均直徑為約65nm至約.130nmo104.權利要求91的透皮原始細胞，其中所述原始細胞的平均直徑為約65nm至約IOOnm0105.權利要求91的透皮原始細胞，其中所述原始細胞的平均直徑為約65mn至約.90nmo106.權利要求91的透皮原始細胞，其中所述原始細胞的平均直徑更優選地為約65nm至約80nm。107.權利要求91的透皮原始細胞，其中所述原始細胞的平均直徑為約65nm至約.75nm。108.權利要求91的透皮原始細胞，其中所述原始細胞的平均直徑為約65nm至約66、.67、68、69、70、71、72、73、74或75nm。109.權利要求91的透皮原始細胞，其中所述原始細胞的平均直徑為約70nm。110.權利要求91-109的透皮原始細胞，其中(a)所述納米顆粒由一種或多種選自以下的組分組成:二氧化矽、可生物降解的聚合物、溶膠、金屬和金屬氧化物；和(b)所述原始細胞包含至少一種抗癌劑。111.權利要求91-109的透皮原始細胞，其中(a)所述納米顆粒由一種或多種選自以下的組分組成:二氧化矽、可生物降解的聚合物、溶膠、金屬和金屬氧化物；和(b)所述原始細胞包含至少一種選自以下的抗癌劑:依維莫司、曲貝替定、白蛋白結合型紫杉醇、TLK.286、AV-299、DN-101、帕唑帕尼、GSK690693、RTA744、ON0910.Na、AZD6244(ARRY-142886)、AMN-107、TK1-258、GSK461364、AZD1152、恩扎妥林、凡德他尼、ARQ-197、MK_0457、MLN8054、PHA-739358、R-763、AT-9263,FLT-3抑制劑、VEGFR抑制劑、EGFRTK抑制劑、極光激酶抑制劑、PIK-1調節劑、Bcl-2抑制劑、HDAC抑制劑、c-MET抑制劑、PARP抑制劑、Cdk抑制劑、EGFRTK抑制劑、IGFR-TK抑制劑、抗HGF抗體、PI3激酶抑制劑、AKT抑制劑、JAK/STAT抑制劑、檢查點-1或2抑制劑、粘著斑激酶抑制劑、Map激酶激酶(mek)抑制劑、VEGFtrap抗體、培美曲塞、厄洛替尼、達沙替尼、尼羅替尼、decatanib、帕尼單抗、氨柔比星、奧戈伏單抗、Lep-etu、諾拉曲塞、azd2171、batabulin、奧法木單抗、扎木單抗、edotecarin、粉防己鹼、盧比替康、替米利芬、oblimersen、ticilimumab、易普利單抗、棉酹、Bio111、131-1-TM-601、ALT-110.B10140、CC8490、西侖吉肽、吉馬替康、IL13-PE38QQR、INO1001、IPdI^KRX-0402、硫蒽酮、LY317615、neuradiab、vitespan、Rta744、Sdx102、他侖帕奈、阿曲生坦、Xr311、羅米地辛、ADS-100380、舒尼替尼、5-氟尿嘧啶、伏立諾他、依託泊苷、吉西他濱、多柔比星、多柔比星脂質體、5』-脫氧-5-氟尿苷、長春新鹼、替莫唑胺、ZK-304709、seliciclib,PD0325901、AZD-6244、卡培他濱、L-穀氨酸、N-[4-[2-(2-氨基-4，7-二氫-4-氧代-1H-吡咯並[2，3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲醯基]二鈉鹽七水合物、喜樹鹼、PEG-標記的伊立替康、他莫昔芬、枸櫞酸託瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、來曲唑、DES(己烯雌酚)、雌二醇、雌激素、綴合的雌激素、貝伐珠單抗、IMC-1ClUCHIR-258);3_[5_(甲基磺醯基哌啶甲基)-吲哚基-喹諾酮、瓦他拉尼、AG-013736、AVE-0005、[D-Ser(But)6,Azgly10](pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2乙酸鹽[C59H84N18Oi4-(C2H4O2)X，其中X=I至2.4]的乙酸鹽、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、雙羥萘酸曲普瑞林、醋酸甲羥孕酮、己酸羥孕酮、醋酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡魯胺、氟他胺、尼魯米特、醋酸甲地孕酮、CP-724714;TAK-165、HK1-272、厄洛替尼、拉帕替尼、卡奈替尼、ABX-EGF抗體、愛必妥、EKB-569、PK1-166、GW-572016、洛那法尼、BMS-214662、替吡法尼；氨磷汀、NVP-LAQ824、辛二醯基苯胺一羥肟酸、丙戊酸、曲古抑菌素A、FK-228、SU11248、索拉菲尼、KRN951、氨魯米特、arnsacrine、阿那格雷、L-門冬醯胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、博來黴素、布舍瑞林、白消安、卡鉬、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱、氯膦酸鹽、環丙孕酮、阿糖胞苷、達卡巴嗪、放線菌素D、柔紅黴素、己烯雌酚、表柔比星、氟達拉濱、氟氫可的松、氟甲睪酮、氟他胺、吉西他濱、格列衛、羥基脲、伊達比星、異環磷醯胺、伊馬替尼、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、雙氯乙基甲胺、美法侖、6-巰基嘌呤、美司鈉、甲氨蝶呤、絲裂黴素、米託坦、米託蒽醌、尼魯米特、奧曲肽、奧沙利鉬、帕米磷酸鹽、噴司他丁、普卡黴素、葉菲爾鈉、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔單抗、鏈佐星、替尼泊苷、睪酮、沙利度胺、硫鳥嘌呤、塞替派、維A酸、長春地辛、13-順式-視黃酸、苯丙氨酸氮芥、尿嘧啶氮芥、雌莫司汀、六甲密胺、氟脲嘧啶脫氧核苷、5-脫氧尿苷、阿糖胞苷、6-硫基嘌呤、脫氧柯福黴素、骨化三醇、戊柔比星、光輝黴素、長春鹼、長春瑞濱、託泊替康、雷佐生、馬立馬司他、C0L-3、新伐司他、BMS-275291、角鯊胺、內皮他丁、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、頂862、血管他丁、vitaxin、屈洛昔芬、idoxyfene、螺內酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥珠單抗、地尼白介素融合毒素、吉非替尼、硼替佐米、紫杉醇、無氫化蓖麻油的紫杉醇、多西他賽、埃坡黴素B、BMS-247550、BMS-310705、屈洛昔芬、4-羥基他莫昔芬、哌噴昔芬、ERA-923、阿佐昔芬、氟維司群、阿考比芬、拉索昔芬、艾多昔芬、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、託泊替康、PTK787/ZK222584、VX-745、PD184352、雷帕黴素、40-0-(2-羥基乙基)-雷帕黴素、替西羅莫司、AP-23573、RADOOUABT-578、BC-210、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青黴素、ZM336372、L-779,450、PEG-非格司亭、達貝泊汀、促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子、唑來磷酸鹽、潑尼松、西妥昔單抗、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、組氨瑞林、PEG化的幹擾素a_2a、幹擾素a_2a、PEG化的幹擾素a-2b、幹擾素a-2b、阿扎胞苷、PEG-L-門冬醯胺酶、來那度胺、吉妥珠單抗、氫化可的松、白介素-11、右丙亞胺、阿侖單抗、全反式維甲酸、酮康唑、白介素_2、甲地孕酮、免疫球蛋白、氮芥、甲潑尼龍、替伊莫單抗、雄激素類、地西他濱、六甲密胺、貝沙羅汀、託西莫單抗、三氧化二砷、可的松、editronate、米託坦、環孢菌素、柔紅黴素脂質體、Edwina-門冬醯胺酶、鍶89、卡索匹坦、奈妥匹坦、NK-1受體拮抗劑、帕洛諾司瓊、阿瑞匹坦、苯海拉明、羥嗪、甲氧氯普胺、蘿拉西泮、阿普唑侖、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、甲潑尼龍、丙氯拉嗪、格拉司瓊、昂丹司瓊、多拉司瓊、託烷司瓊、聚乙二醇非格司亭、促紅細胞生成素、阿法依泊汀、阿法達貝泊汀和其混合物。112.透皮原始細胞，其包含大量多孔納米顆粒，所述多孔納米顆粒為:(a)裝載有藥學有效量的伊馬替尼的多孔納米顆粒和(b)被脂質雙層包封並支撐脂質雙層的多孔納米顆粒，其中所述脂質雙層包含一種或多種選自以下的角質層通透性促進劑=PEG400、DMSO和乙醇，以及它們的混合物，且其中所述原始細胞的平均直徑為約65nm至約66、67、68、69、.70、71、72、73、74或75nm。113.權利要求112的透皮原始細胞，其中所述原始細胞的伊馬替尼的平均通量為約。0.20至約0.30μg/cm2hr。114.權利要求113的原始細胞，其中所述脂質雙層由選自以下的脂質組成:1，2_二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)、。1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1，2-二油醯基_sn_甘油_3_[磷-L-絲氨酸](DOPS)、1，2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸化_(1』-rac-甘油)(DOPG)U,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、。1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、I,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油醯基-2-[12-[(7-硝基-2-1，3-苯並噁二唑-4-基)氨基]月桂醯基]-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(18:1-12:ONBDPC)U-棕櫚醯基-2-{12-[(7-硝基-2-1，3-苯並噁二唑_4_基)氨基]月桂醯基}-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(16:0-12:ONBDPC)、膽固醇和其混合物。115.治療患有癌症的受試者的方法,所述方法包括向所述受試者透皮給予藥學有效量的權利要求110-114的原始細胞。116.治療患有一種或多種選自慢性髓細胞性白血病、胃腸道間質瘤和急性淋巴細胞性白血病嗜酸粒細胞增多症(HES)的疾病的方法，所述方法包括向所述受試者透皮給予藥學有效量的權利要求112-114的原始細胞。117.治療患有癌症的受試者的方法，所述方法包括向所述受試者透皮給予藥學有效量的權利要求111的原始細胞。118.透皮藥物組合物，其包含藥學有效量的權利要求91-109、112、113和114的原始細胞，和任選地藥學上可接受的賦形劑。119.透皮藥物組合物，其包含藥學有效量的權利要求110的原始細胞，和任選地藥學上可接受的賦形劑。120.透皮藥物組合物，其包含藥學有效量的權利要求111的原始細胞，和任選地藥學上可接受的賦形劑。121.原始細胞，其包含大量經含胺的矽烷(AEPTMS)修飾的帶負電荷的、納米多孔、納米顆粒的二氧化矽核，並且所述二氧化矽核(a)裝載有siRNA或蓖麻毒素A鏈和(b)被脂質雙層包封並支撐脂質雙層，所述脂質雙層包含一種或多種選自以下的脂質:。1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)、1，2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-[磷-L-絲氨酸](DOPS)、1，2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸化_(1』-rac-甘油)(DOPG)、1，2-二油醯基_sn_甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、I,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、I,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油醯基-2-[12-[(7-硝基-2-1，3-苯並噁二唑-4-基)氨基]月桂醯基]_sn_甘油-3-磷酸膽鹼(18:1-12:0NBDPC)、1-棕櫚醯基-2-{12-[(7-硝基-2-1,3-苯並噁二唑_4_基)氨基]月桂醯基}-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(16:0-12:0NBDPC)、膽固醇和其混合物/組合，其中所述脂質雙層包含陽離子脂質和一種或多種兩性離子磷脂。122.權利要求121的原始細胞，其中所述脂質選自1，2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)、1，2-二油醯基-sn-甘油_3_磷酸化-0--rac-甘油)(DOPG)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和其混合物。123.權利要求122的原始細胞，其中所述原始細胞具有至少一個以下特徵:BET表面積大於約600m2/g、孔體積分數為約60%至約70%、由具有平均直徑為約20nm至約30nm的孔組成的多模式孔形態學、通過具有平均直徑為5nm至約15nm的孔互相連接的表面可及的孔。124.權利要求121或122的原始細胞，其中所述原始細胞每101°納米顆粒二氧化矽核包封約IOnMsiRNA。125.原始細胞，其包含大量經含胺矽烷(AEPTMS)修飾的帶負電荷的、納米多孔、納米顆粒的二氧化矽核，並且所述二氧化矽核(a)裝載有一種或多種靶向周期蛋白超家族成員的siRNA，所述周期蛋白超家族成員選自細胞周期蛋白A2、細胞周期蛋白B1、細胞周期蛋白Dl和細胞周期蛋白E;且(b)其被由選自以下的脂質組成的脂質雙層包封並支撐由選自以下的脂質組成的脂質雙層:1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)、1，2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-[磷-L-絲氨酸](DOPS)、1，2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸化_(1』-rac-甘油)(DOPG)、1，2-二油醯基_sn_甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、I,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、I,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油醯基-2-[12-[(7-硝基-2-1，3-苯並噁二唑-4-基)氨基]月桂醯基]_sn_甘油-3-磷酸膽M(18:1-12:ONBDPC)U-棕櫚醯基_2_{12-[(7-硝基-2-1,3-苯並噁二唑_4_基)氨基]月桂醯基}-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(16:0-12:0NBDPC)、膽固醇和其混合物/組合。且其中(I)所述脂質雙層裝載有SP94和內體裂解肽，和(2)所述原始細胞選擇性地與肝細胞癌細胞結合。126.權利要求123的原始細胞，其中所述脂質雙層包含大約55:5:30:10質量比的D0PC/D0PE/膽固醇/PEG-2000。127.治療患有癌症的受試者的方法，其包括向所述受試者給予藥學有效量的權利要求121-126的原始細胞。128.權利要求127的方法，其中所述受試者患有肝癌，並被給予藥學有效量的權利要求123-125的原始細胞。129.藥物組合物，其包含藥學有效量的權利要求121-126的原始細胞，和任選地藥學上可接受的賦形劑。130.原始細胞，其包含大量納米多孔的、納米顆粒二氧化矽核，所述二氧化矽核:(a)裝載有誘導Niv核殼體蛋白(NiV-N)mRNA序列特異性降解的siRNA，和(b)包封於脂質雙層並支撐脂質雙層，所述脂質雙層包含一種或多種選自以下的脂質:1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)、1，2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1，2-二油醯基-sn-甘油_3_[磷-L-絲氨酸](DOPS),1,2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP),1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸化-(I，-rac-甘油)(DOPG)U,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)U,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N_[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油醯基-2-[12-[(7-硝基-2-1，3-苯並噁二唑-4-基)氨基]月桂醯基]-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(18:1-12:ONBDPC)U-棕櫚醯基-2-{12-[(7-硝基-2-1，3-苯並噁二唑_4_基)氨基]月桂醯基}-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(16:0-12:ONBDPC)、膽固醇和其混合物/組合。131.權利要求130的原始細胞，其中所述脂質雙層包含1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、聚乙二醇(PEG)、靶向肽、和R8，且所述中孔、納米顆粒二氧化矽核(I)各自平均直徑為約lOOnm，平均表面積大於.1，OOOmVg和平均直徑為約20nm至約25nm的表面可及的孔，並且(2)每101°顆粒裝載約IyMsiRNA或更多。132.權利要求131的原始細胞，其中所述靶向肽為與ephrinB2(EB2)結合的肽。133.權利要求132的原始細胞，其中所述靶向肽為TGAILHP(SEQIDNO:18)。134.權利要求133的原始細胞，其中所述原始細胞包含約0.01至約0.02重量的TGAILHP(SEQIDNO:18)、約10重量％的PEG-2000和約0.500重量％的R8。135.治療已經被Nipah病毒(NiV)感染或具有被Nipah病毒(NiV)感染風險的受試者的方法，所述方法包括向所述受試者給予藥學有效量的權利要求130-134的原始細胞。136.藥物組合物，其包含藥學有效量的權利要求130-134的原始細胞，和任選地藥學上可接受的賦形劑。137.原始細胞，其包含大量帶負電荷的、納米多孔、納米顆粒二氧化矽核，所述二氧化矽核:(a)經選自以下的含胺矽烷修飾:(1)伯胺、仲胺、叔胺，其各自經矽原子功能化；(2)單胺或多胺；(3)N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基矽烷(AEPTMS);(4)3-氨基丙基三甲氧基矽烷(APTMS);(5)3-氨基丙基三乙氧基矽烷(APTS)；(6)氨基功能性三烷氧基矽烷；和(7)質子化仲胺、質子化叔烷基胺、質子化脒、質子化胍、質子化吡啶、質子化嘧啶、質子化吡嗪、質子化嘌呤、質子化咪唑、質子化吡咯、季烷基胺或其組合；(b)裝載有siRNA或蓖麻毒素A鏈；和(c)被包含選自以下的脂質的脂質雙層包封並支撐包含選自以下的脂質的脂質雙層:.1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(D0PC)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)、1，2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-[磷-L-絲氨酸](DOPS)、1，2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸化_(1』-rac-甘油)(DOPG)、1，2-二油醯基_sn_甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、I,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、I,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油醯基-2-[12-[(7-硝基-2-1，3-苯並噁二唑-4-基)氨基]月桂基]_sn_甘油-3-磷酸膽鹼(18:1-12:ONBDPC)、1-棕櫚醯基-2-(12-[(7-硝基-2-1,3-苯並噁二唑_4_基)氨基]月桂基}-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(16:0-12:0NBDPC)、膽固醇和其混合物/組合，且其中所述脂質雙層包括陽離子質子和一種或多種兩性離子磷脂。138.權利要求137的原始細胞，其中所述脂質選自1，2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷(18:1DOTAP)、2_二油醯基-sn-甘油-3-磷酸化_(1』-rac-甘油)(DOPG)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和其混合物。139.權利要求138的原始細胞，其中所述原始細胞具有至少一個以下特徵:BET表面積大於約600m2/g、孔體積分數為約60%至約70%、由具有平均直徑為約20nm至約30nm的孔組成的多模式孔形態學、通過具有平均直徑為5nm至約15nm的孔互相連接的表面可及的孔。140.權利要求138或139的原始細胞，其中所述原始細胞每101°納米顆粒二氧化矽核包封約IOnMsiRNA。141.原始細胞，其包含大量帶負電荷的、納米多孔、納米顆粒二氧化矽核，所述二氧化矽核:(a)經選自以下的含胺矽烷修飾:(I)伯胺、仲胺、叔胺，其各自經矽原子功能化；(2)單胺或多胺；(3)N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基矽烷(AEPTMS);(4)3-氨基丙基三甲氧基矽烷(APTMS);(5)3-氨基丙基三乙氧基矽烷(APTS)；(6)氨基功能性三烷氧基矽烷；和(7)質子化仲胺、質子化叔烷基胺、質子化脒、質子化胍、質子化吡啶、質子化嘧啶、質子化吡嗪、質子化嘌呤、質子化咪唑、質子化吡咯、季烷基胺或其組合；(b)裝載有一種或多種靶向周期蛋白超家族成員的siRNA，所述周期蛋白超家族成員選自細胞周期蛋白A2、細胞周期蛋白B1、細胞周期蛋白Dl和細胞周期蛋白E;且(c)其被由選自以下的脂質組成的脂質雙層包封並支撐由選自以下的脂質組成的脂質雙層:1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)、1，2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-[磷-L-絲氨酸](DOPS)、1，2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷(18:1D0TAP)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸化-(I』-rac-甘油)(DOPG)、I，2-二油醯基_sn_甘油_3_磷酸乙醇胺(DOPE)、I,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、I,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](18:1PEG-2000PE)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](16:0PEG-2000PE)、1-油醯基-2-[12-[(7-硝基-2-1，3-苯並噁二唑-4-基)氨基]月桂醯基]_sn_甘油-3-磷酸膽M(18:1-12:ONBDPC)U-棕櫚醯基_2_{12-[(7-硝基-2-1,3-苯並噁二唑_4_基)氨基]月桂醯基}-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(16:0-12:0NBDPC)、膽固醇和其混合物/組合。且其中(I)所述脂質雙層裝載有SP94和內體裂解肽；和(2)所述原始細胞選擇性地與肝細胞癌細胞結合。142.權利要求141的原始細胞，其中所述脂質雙層包含大約55:5:30:10質量比的D0PC/D0PE/膽固醇/PEG-2000。143.治療患有癌症的受試者的方法，其包括向所述受試者給予藥學有效量的權利要求137-142的原始細胞。144.權利要求143的方法，其中所述受試者患有肝癌，並被給予藥學有效量的權利要求141或142的原始細胞。145.藥物組合物，其包含藥學有效量的權利要求137-142的原始細胞，和任選地藥學上可接受的賦形劑。【文檔編號】A61K31/7088GK104023711SQ201280061866【公開日】2014年9月3日申請日期:2012年10月12日優先權日:2011年10月14日【發明者】C.E.阿什莉,C.J.布林克爾,E.C.卡恩斯,M.H.菲克拉扎德,L.A.費爾頓,O.內格裡特,D.P.帕迪利亞,B.S.威爾金森,D.C.威爾金森,C.L.威爾曼申請人:Stc.Unm公司,桑迪亞公司