一種低溫型草菇新菌株的誘變方法和應用的製作方法

2023-04-28 05:00:46

專利名稱：一種低溫型草菇新菌株的誘變方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於食用菌誘變育種技術領域，具體涉及一種低溫型草菇新菌株的一種特 殊誘變方法和應用。
背景技術：
草菇是一種食用菌，營養豐富，味道鮮美，深受廣大消費者喜愛。草菇是典型的熱帶高溫型食用菌，菌絲對低溫的抵抗力差，對環境條件的變化尤 其是溫度的變化很敏感當平均氣溫在27°C以下時，草菇子實體難以形成，極不利於草菇 的生長發育，極大地影響著草菇的產量和品質，有時甚至造成絕產。故在我國長江以北地區 適應期較短，極大地制約了草菇的栽培範圍。同時，草菇存在著冷害，即在4°C的低溫條件下 保存，菌絲會發生自溶而導致菌種死亡和子實體發軟、液化直至腐爛。這給草菇的菌種保存 和產後保鮮帶來了極大的困難。此外，草菇的生物學效率低。因此，培育高產低溫的草菇新 品種就顯得尤為重要。然而，草菇為同宗結合真菌，具有很複雜的生活史，菌絲沒有鎖狀聯 合，雜種選擇缺乏標記，這給草菇的雜交育種帶來極大的困難，長期以來草菇產業的優良菌 株十分貧乏。現有技術關於草菇誘變國內對於草菇的誘變只有採用單一方法的誘變，如紫外誘 變或化學試劑誘變，誘變結果不穩定。

發明內容
本發明的目的是克服現有草菇誘變技術的不足，提供一種新的複合誘變方法，使 草菇基因產生變異，結合合適的o°c低溫篩選，從而獲得穩定遺傳的低溫型草菇新菌株。本發明的目的通過以下技術方案予以實現提供一種低溫型草菇新菌株的誘變方法，包括以下步驟(1)將草菇菌絲塊接種到含有0. 6% (W/V)氯化鋰的固體PDSA平板上；所述草菇菌絲塊優選0. 1 X 0. Icm大小；具體是可將32°C恆溫培養箱培養3d的草 菇表面菌絲刮去，切取中上部0. 1X0. Icm大小的薄菌絲塊接種到含有0.6% (W/V)氯化鋰 的固體PDSA平板。(2)將步驟(1)接有菌絲塊的含氯化鋰的固體PDSA平板置於紫外光線下照射處理 後避光培養；優選將接有菌絲塊的含氯化鋰的固體PDSA平板置於距離15W紫外燈管的30cm處 照射50min，每個水平做三組平行，用錫箔紙包好，避光30°C培養3d。所述紫外燈照射之前 先打開預熱約20min，使光波穩定。(3)將經步驟(2)處理後恢復生長的草菇菌絲體切割成薄塊，轉接到新的PDSA平 板，並置於0°c低溫處理36 48h，28 33°C正常培養進行篩選。優選地，將恢復生長的草菇菌絲體切割成0. 1X0. Icm大小的薄塊。(4)將步驟(3)中存活的草菇菌絲塊繼續切割成薄的小菌塊，轉接至新鮮的PDSA
3平板上，並按步驟(3)中方法篩選。存活的菌絲用相同的方法進行重複篩選，最後能存活的 菌絲即為誘變株；優選重複篩選3 6次。在本發明方法中，所用的培養基為常規的草菇菌絲培養基，配方為PDSA 去皮馬鈴薯 200g，葡萄糖 20g, KH2POJg, MgSO4L 5g，維生素 B15 10mg，瓊 脂20g，水1升。含0.6% (W/V)氯化鋰固體培養基配方為去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g， KH2POJg, MgSO4L 5g，維生素 B15 10mg，氯化鋰 6g，瓊脂 20g，水 1 升。本發明的方法能有效地使草菇菌絲體發生變異，因此也適用於其他食用菌的菌絲 體的誘變，如金針菇、杏鮑菇、平菇等。紫外線是一種非電離輻射，能引起DNA鏈的斷裂、DNA分子內和分子間的交聯、核 酸與蛋白質的交聯，特別是形成嘧啶二聚體，阻礙DNA雙鏈的解鏈、複製和鹼基的正常配 對，從而導致基因突變。由於紫外誘變時存在光復活作用，因此單獨紫外誘變效果不明顯。 氯化鋰是一種鹼金屬滷化物，能導致AT-GC鹼基對的轉換或導致鹼基的缺失，單獨使用時 也沒有明顯的誘變效果。通常採用兩種方法的結合，即先進行紫外誘變後獲得的誘變菌株 再使用LiCl進行誘變或先使用LiCl誘變獲得誘變菌株後在進行紫外誘變，然而採用這種 方式的組合誘變非但沒有使草菇突變株的耐寒性增強，有時還使已經獲得的突變株耐低溫 能力喪失。本發明經過創造性的實驗總結得到新的適宜的誘變方案，產生了以下有益效果本發明方法採用紫外、LiCl以及其他誘變劑的單項誘變以及常規組合兩種不同的 誘變實驗，未能獲得預期的耐寒草菇新菌株。經過長期大量的實驗研究和總結分析，本發明 提出本發明技術方案並成功地獲得優良的耐低溫新菌株，按本發明方法將出發菌株直接接 種在含有0. 6% LiCl培養基上，同時採用紫外照射50min，再經過3 6次反覆的0°C低溫 處理，獲得能穩定遺傳的耐低溫草菇突變株。本發明填補食用菌有效誘變育種的空白，為食 用菌的有效誘變育種提供科學理論依據。


圖1是V138草菇菌絲經過紫外和氯化鋰複合誘變後，經0°C低溫處理48h後在 32°C溫度下生長的結果；圖2本發明誘變株R6能在18°C溫度下生長(圖左，圖中為培養3d的菌落)，而對 照株V138在這個溫度下不能生長(圖右)圖3誘變得到的新菌株子實體4誘變菌株R6出菇實驗5對照菌株V138在16°C低溫測試6誘變菌株R6子實體在16 °C低溫測試7是草菇菌絲經過紫外和氯化鋰複合誘變後，經0°C低溫處理36h後在溫 度下生長的結果；圖8誘變株R5能在18°C溫度下生長(圖左，圖中為培養3d的菌落)，而對照株 V138在這個溫度下不能生長(圖右)圖9誘變得到的新菌株R5子實體圖
圖10誘變株R5出菇實驗11對照菌株V138在16°C低溫測試12誘變菌株R5子實體的在16°C低溫測試13是採用AFLP技術對誘變得到的新菌株R5和R6與對照V138在DNA水平的
差異鑑定結果
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發明。下述實施例中所使用的實驗 方法如無特殊說明，均為本技術領域現有常規方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明， 均為可從商業途徑得到的試劑和材料。V138為廣州市主栽品種，由廣州市白雲區農業科學 實驗中心提供，相關信息可見食用菌雜誌插頁介紹。實施例1(1)按照常規方法將V138菌種接種於PDSA平板上，在32°C恆溫培養箱培養3d，刮 去平板上的草菇表面菌絲，切取中上部0. 1X0. Icm大小的薄菌絲塊接種到含有0.6% (W/ V)氯化鋰的固體PDSA平板上；所述含0.6% (W/V)氯化鋰固體培養基配方為去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g， KH2P043g, MgSO4L 5g，維生素 B15 10mg，氯化鋰 6g，瓊脂 20g，水 1 升。(2)先打開紫外燈預熱約20min，使光波穩定。將接有菌絲塊的含氯化鋰的固體 PDSA平板置於距離15W紫外燈管的30cm處照射50min，每個水平做三組平行，用錫箔紙包 好，避光30°C培養3d。(3)將經步驟⑵處理後恢復生長的草菇菌絲體切割成0. 1X0. Icm大小的薄塊， 轉接到新的PDSA平板，並置於0°C低溫處理4 後正常培養進行篩選；本實施例草菇置於 0°C低溫處理4 後在32°C溫度下生長的結果見附圖1 ；如附圖1所示，本發明方法同時使用紫外線和LiCl對草菇V138進行複合誘變，經 過o°c低溫反覆處理與篩選，沒有突變的或負突變的菌絲不能存活，從而篩選出遺傳穩定的 耐低溫的草菇誘變株。附圖1顯示，菌絲體發生變異後能在0°c低溫處理4 後存活(圖中 箭頭所指)，而沒有變異的菌絲經O °C低溫處理後死亡。所述PDSA組成為去皮馬鈴薯200g,葡萄糖20g, KH2POJg, MgSO4L 5g，維生素 B15 10mg，瓊脂20g，水1升。附圖2所示的本發明誘變株R6(左)在18°C培養3d後能長出菌絲，而對照株V138 在這個溫度下不能生長(圖右)，說明誘變株可在比對照低的溫度下生長，對照菌株只能在 25°C以上的溫度生長。附圖3為誘變得到的新菌株R6子實體形態圖。附圖4為本發明誘變得到的新菌株R6的區試結果圖。經過連續3次區試實驗結 果表明該菌株出菇早、出菇整齊、產量高。生產周期比對照短2 3天。附圖5所示是對照菌株V138在16°C低溫下保藏48h的結果。附圖5顯示對照 V138的子實體在16°C低溫下保藏4 後細胞破裂、流出黑水已失去商品價值。附圖6是誘變菌株R6子實體在16°C低溫下保藏48h的結果。附圖6顯示誘變菌 株R6的子實體在16°C低溫下保藏4 後細胞保持完整沒有破裂，外觀正常，具有商品價值，
5充分說明了本發明方法能有效地對草菇菌絲進行誘變，獲得預期的耐低溫草菇優良菌株。R6新菌株形態特徵及生長特性如下形態特徵菌絲體乳白色，子實體淺灰色，蛋形期子實體高28. 0 37. 7mm、寬 20. 7 26. 0mm、菌蓋直徑15. 52mm、菌膜厚度3. 56mm、菌柄長15. 52mm。生長特性菌絲在30°C溫度下的生長速度為PDSA平板上1. 93cm/d、棉子殼培養 基上1.51cm/d，子實體發育溫度27°C，原基形成(出菇)時間平均7. 7d，生產周期10d，生 物轉化率高35 40%。實施例2(1)按照常規方法將V138菌種接種於PDSA平板上，在32°C恆溫培養箱培養3d，刮 去平板上的草菇表面菌絲，切取中上部0. 1X0. Icm大小的薄菌絲塊接種到含有0.6% (W/ V)氯化鋰的固體PDSA平板上；所述含0.6% (W/V)氯化鋰固體培養基配方為去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g， KH2P043g, MgSO4L 5g，維生素 B15 10mg，氯化鋰 6g，瓊脂 20g，水 1 升。(2)先打開紫外燈預熱約20min，使光波穩定。將接有菌絲塊的含氯化鋰的固體 PDSA平板置於距離15W紫外燈管的30cm處照射50min，每個水平做三組平行，用錫箔紙包 好，避光培養3d。(3)將經步驟⑵處理後恢復生長的草菇菌絲體切割成0. 1X0. Icm大小的薄塊， 轉接到新的PDSA平板，並置於0°C低溫處理3 後正常培養進行篩選；本實施例草菇置於 0°C低溫處理3 後在溫度下生長的結果見附圖7 ；如附圖7所示，本發明方法同時使用紫外線和LiCl對草菇V138進行複合誘變，經 過o°c低溫反覆處理與篩選，沒有突變的或負突變的菌絲不能存活，從而篩選出遺傳穩定的 耐低溫的草菇誘變株R5。附圖7顯示，R5菌絲體發生變異後能在0°C低溫處理3 後存活 (圖中箭頭所指)，而沒有變異的菌絲經0°C低溫處理後死亡。所述PDSA組成為去皮馬鈴薯200g,葡萄糖20g, KH2POJg, MgSO4L 5g，維生素 B15 10mg，瓊脂20g，水1升。附圖8所示的本發明誘變株R5(左)在18°C培養3d後能長出菌絲，而對照株V138 在這個溫度下不能生長(圖右)，說明誘變株可在比對照低的溫度下生長，對照菌株只能在 25°C以上的溫度生長。附圖9為誘變得到的新菌株R5的子實體形態圖。附圖10為本發明誘變得到的新 菌株R5的規模化區試實驗，圖示蛋形期。經過連續3次區試實驗結果表明該菌株出菇早、 叢生、產量高。生產周期比對照短2 3天。附圖11所示是對照菌株V138在16°C低溫下保藏48h的結果。附圖11顯示對照 V138的子實體在16°C低溫下保藏4 後細胞破裂、流出黑水已失去商品價值。附圖12是誘變得到的新菌株子實體的在16°C低溫下保藏48h的結果。附圖12 顯示誘變得到的新菌株的子實體在16°C低溫下保藏4 後細胞保持完整沒有破裂，外觀正 常，具有商品價值，充分說明了本發明方法能有效地對草菇菌絲進行誘變，獲得預期的耐低 溫草菇優良菌株。新菌株R5的形態特徵及生長特性如下形態特徵菌絲體乳白色，子實體灰色，蛋形期子實體高沈.0 42. 3mm、寬 20. 3 30. 0mm、菌蓋直徑17. 67mm、菌膜厚度3. 67mm、菌柄長16. 56mm。
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生長特性菌絲在30°C溫度下的生長速度為PDSA平板上1. 84cm/d、棉子殼培養 基上1.49cm/d，子實體發育溫度27°C，原基形成(出菇)時間平均7. 7d，生產周期10d，生 物轉化率高35 40%。附圖13是採用AFLP技術對誘變得到的新菌株與對照V138在DNA水平的差異鑑定 結果。附圖13顯示了誘變得到的新菌株R5(泳道幻和R6(泳道幻與對照菌株V138(泳 道1)有一條明顯的條帶差異，說明使用本發明方法獲得的兩株新菌株在DNA水平上發生了 有效的突變，為新菌株。圖中M為DNA MarkerIII(大小從上而下分別為4500bp、3000bp、 2000bp、1200bp、600bp、500bp、200bp)。同時，實驗證明，兩個新菌株均是耐低溫的，說明本 發明方法在草菇的誘變效果上是穩定的。
權利要求
1.一種低溫型草菇新菌株的誘變方法，其特徵在於包括以下步驟(1)將草菇菌絲塊接種到含有0.6% (W/V)氯化鋰的固體PDSA平板上；所述含0. 6% (W/V)氯化鋰固體培養基配方為去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，KH2P043g, MgSO4L 5g，維生 素B15 10mg，氯化鋰6g，瓊脂20g，水1升；(2)將步驟(1)接有菌絲塊的含氯化鋰的固體PDSA平板置於紫外光線下照射處理後避 光培養；(3)將經步驟( 處理後恢復生長的草菇菌絲體切割成薄塊，轉接到新的PDSA平板， 置於0°C低溫處理後正常培養進行篩選；所述PDSA平板組成為去皮馬鈴薯200g，葡萄糖 20g，KH2P043g，MgSO4L 5g，維生素 B15 IOmg,瓊脂 20g,水 1 升；(4)將步驟(3)中存活的草菇菌絲塊繼續切割成薄的小菌塊，轉接至新鮮的PDSA平板 上，並按步驟(3)中方法重複篩選，存活的菌絲即為誘變株。
2.根據權利要求1所述低溫型草菇新菌株的誘變方法，其特徵在於步驟(1)所述草菇 菌絲塊為0. 1X0. Icm大小。
3.根據權利要求1或2所述低溫型草菇新菌株的誘變方法，其特徵在於步驟(1)所述 草菇菌絲為在32°C恆溫培養箱培養3d。
4.根據權利要求1所述低溫型草菇新菌株的誘變方法，其特徵在於步驟(2)所述紫外 光線採用15W紫外燈管，所述紫外燈管距離草菇菌絲塊30cm，照射時間為50min。
5.根據權利要求1所述低溫型草菇新菌株的誘變方法，其特徵在於步驟C3)或步驟 (4)所述草菇菌絲體薄塊大小為0. 1X0. Icm0
6.根據權利要求1所述低溫型草菇新菌株的誘變方法，其特徵在於步驟C3)所述0°C 低溫處理時間為36 48h。
7.根據權利要求1所述低溫型草菇新菌株的誘變方法，其特徵在於步驟(3)所述正常 培養溫度為^ 33°C。
8.根據權利要求1所述低溫型草菇新菌株的誘變方法，其特徵在於步驟(4)所述重複 篩選次數為3 6次。
9.權利要求1 8任一項所述低溫型草菇新菌株的誘變方法的應用，其特徵在於應用 於金針菇、杏鮑菇或平菇的誘變育種方面。
全文摘要
本發明提供了一種低溫型草菇新菌株的誘變方法和應用。本發明將草菇菌絲接種在含有氯化鋰的固體培養基上，並複合照射紫外線，經0℃低溫反覆處理篩選，獲得誘變株，進行出菇實驗，得到低溫草菇菌株。本發明方法能有效地誘變草菇菌絲，獲得低溫的草菇新菌株。本發明為草菇的遺傳育種開闢了一條成功的新的育種途徑-氯化鋰紫外線同時複合誘變，同時也為其他食用菌的誘變提供技術借鑑。
文檔編號A01G1/04GK102119629SQ201010523428
公開日2011年7月13日 申請日期2010年10月26日 優先權日2010年10月26日
發明者曾志忠, 林俊芳, 遊麗容, 郭麗瓊 申請人:華南農業大學