三疣梭子蟹的種質鑑定方法

2023-05-17 11:43:46

專利名稱：：三疣梭子蟹的種質鑑定方法
技術領域：
：本發明涉及一種種質鑑定方法，特別是一種三疣梭子蟹的種質鑑定方法。
背景技術：
：三疣梭子蟹CP的'似^rw/a加)，俗稱海蟹或大蟹，屬於甲殼綱，十足目，梭子蟹科。它廣泛分布在中國南北沿海，是中國大型海洋經濟蟹類，是沿海重要的漁業資源。生活在中國近海不同海區的三疣梭子蟹由於生活環境的不盡相同，水文因素的差異以及各海區地理位置的不同造成三疣梭子蟹分屬於各個不同的種群。對產於中國四大海區的大連、東營、連雲港、舟山、湛江五個典型群體進行有效的鑑定或鑑別，對於三疣梭子蟹的增養殖親本選擇和資源保護具有重要的應用價值。目前常用來進行評價生物遺傳多樣性和種質鑑定的分子標記均具有一定程度的缺陷，如RAPD技術(隨機擴增序列多態性DNA，RandomamplifiedpolymorphicDNA)，常因RAPD引物過短10個鹼基、退火溫度過低一般36-37°C，導致擴增產物的一些非特異結果，其可靠程度和真實性是主要的缺陷；而AFLP技術(擴增片段長度多態性，Amplifiedfragmentlengthpolymorphism),又因操作條件複雜如要求酶切、成本相對較高而限制了其廣泛的應用，微衛星技術因分子標記難以篩選，要求技術和設備高尖而限制其廣泛的應用。
發明內容本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種快速、經濟、相對準確和操作簡便的三疣梭子蟹的種質鑑定方法；用於對我國主要海區(大連、東營、連雲港、舟山、湛江五個典型海區)的三疣梭子蟹種質鑑定。本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是一種三疣梭子蟹的種質鑑定方法，其特點是，其步驟如下，(1)取至少30個待測樣品梭子蟹進行7個形態學參數的測定，分別測定其背甲長CL、背甲寬CW、內背甲寬ICW、腹部寬AW、螯肢長節長ML、第5步足趾節寬5PW和螯肢腕骨上外面的棘長OCS這7個參數；然後以背甲長CL參數值作分母、其餘6個參數值作分子，獲得6個比例參數值X1:CW/CL;X2:ICW/CL;X9:AW/CL;X14:亂/CL;X17:5PW/CL;X19:OCS/CL;(2)將X,、X2、X9、X14、Xn和Xw6個比例參數值分別代入下列方程中進行結果判定-YzsH).07010X廣0.52105X2隱1.14342X9+1.30263Xw-0.22921Xn-1.13982X19-2.62019Yd屍1.70164X廣1.49333X2-1.89597X9+0.65353Xw-0.32891Xn-1.31352Xw-3.66955Y,yg4.03275X廣2.37031X2+0.71223X9+0.72934X,4-0.59053Xn+4.01213Xw-5.20638Yd廣0.94429X廠1.55943X2+0.11175X9隱0.74477Xw+1.87868Xn+0.49741X19-2.92971Yzj二隱2.85322Xi+4.81737X2+1.39575X9-1.43024X!4隱0.82160Xn-2.15829Xw-6.13701(3)根據所得Y值的最大值出現頻率最多的群體即為待測樣品梭子蟹所處的來源。以下對發明人所作的研究試驗進行闡述。一、樣本採集。採集的試驗材料均取自天然海區，分別是大連海區(dl)、東營海區(dy)、連雲港海區(lyg)、舟山海區(zs)和湛江海區(zj)這5個海區的雌性三疣梭子蟹，各種群取樣時間、地點和數目見表l，所得到的樣本快速低溫運送到實驗室並在第一時間對其進行實驗數據的測量。表1三疣梭子蟹樣本生物學數據tableseeoriginaldocumentpage5採用遊標卡尺、分規、直尺等測量工具，精確到0.2mm,選取三疣梭子蟹背甲、前額裂片、腹甲、步足和螯肢部位，測量參數為23個可量性狀，共測得3496個形態學數據，測量部位見附圖。測量形態性狀標識如下1.CW(Carapacewidth):背甲寬；2.ICW(Internalcarapacewidth):內背甲寬；3.8CW(Carapacewidthatspine8):第8對棘的背甲寬；4.CL(Carapacelength):背甲長；5.PWC(Posteriorwidthofcarapace):背甲底寬；6.FW(Frontalwidth):前額寬；7.FMSH(Frontalmedianspineheight):前額中間棘的高；8.DFLS(Distancebetweenfrontallateralspines):前額側棘之間的距離；9.DFMS(Distancebetweenfrontalmedianspines):前額中間束束之間的距離；10.SW(Stemumwidth):腹甲寬；11.AW(Abdomenwidth):腹部寬；12.3PML(3rdperiopodmeruslength):第3步足長節長；13.5PL(5thperiopoddactyllength):第5步足趾節長；14.5PW(5thperiopoddactylwidth):第5步足趾節寬；15.DL(Dactyllength):螯肢指節長；16.PD(Propodusdepth):螯肢掌節厚；17.0PS(Outerpropodussprine):螯肢掌節上外面的棘；18.IPS(Innerpropodussprine):螯肢掌節上裡面的棘；l義ICS(Innercarpussprine):螯肢腕骨上裡面的棘；20,OCS(Outercarpussprine):螯肢腕骨上外面的棘；21.PL(Propoduslength):螯肢掌節長；22.PW(Propoduswidth):螯肢掌節寬；23.ML(Meruslength):螯肢長節長。三、數據處理。為消除蟹體規格大小對參數值的影響，先將每隻蟹的所有參數分別除以背甲長(CL)予以校正，得出22個形態學比例性狀，使用STASTISTICA99，editkm軟體中的判別分析方法對5個三疣梭子蟹群體進行逐步判別分析，建立判別方程。對所有樣本進行逐個判別。判別準確率的計算公式為判別準確率P,(%)=判別正確的數目/實測數目乂100判別準確率P2(%)=判別正確的數目/判別數目乂100綜合判別率/,一其中，Ai為第i個種群判別正確的梭子蟹數目，Bi為第i個種群實際判別的梭子蟹數目，k為種群數。判別方程如下Yz產0.33514Xi+2.27668X2+0.29775X3+0.7074X4......-0.3334X22-4.13686Yd產2.36822X廣2.34319XrH).27807X3-0.53283X4......-0.41483X22-5.04868Y,yg^0.12102X廣0.72597X2+0.3214Xr0.99157X4......+1.71947X22-7.29^9Yd廣1.01375X廣1.96828X2+0.91468X3+1.4451X4……-0.12343X22-4.70165Yzj二2.76002Xi+5.75857X2-1.53328Xr0,73471X4......-0.83617X22-7.%712將23個參數的校正值分別代入上述判別函數中，比較函數值的大小，被判個體值最大的即歸屬於所對應的群體。公式中XiX22分別代表CW/CL、ICW/CL、8CW/CLIPS/CL，各函數的自變量和常數項見表2，應用公式所作的判別分析結果見表3。判別準確率Pi為90%100%，判別準確率P2為87.1%100%，5個地理種群的綜合判別率為94.74%。表25個地理種群三疣梭子蟹形態判別公式各項係數及常數項tableseeoriginaldocumentpage7Xi4ML/CL0.472041.282042.14098-1.03185-2.07459xlsFVV/CL0.11762-1.01562-1.094871.130380.429275PL/CL-0.3237-0.297720.324230.30925-0.11098xl75PW/CL-0.245950.20411-0.659691.70778-0.91718x"3PL/CL0.55847陽0.43娜-0.733260.48437-0.00978OCS/CL-1.08363-0.857224.47227-0.23359-2.21012ICS/CX-0.05961-0.37961-0.346851.00294-0.33903OPS/CL-0,82939-0.946730.49S74-0.263971.0848IPS/CL-0.3334-0.414831.71947-0.12343-0.83617常數-4.13686-5.04868-7.29909-《70165-7.96712表35個地理種群三疣梭子蟹判別分析測試結果種群/群體樣本數目判別準確l率(％)預測分類(個)PiP2zsdllygdyzjzs30卯87.1272010dl2290.91卯.91220000iyg3193.551001029013396.9781.08100320zj3610097.3000036合計15294.743119283737以上所述的建立判別方程所使用的計算應用軟體為STATISTICA99'EDITION。由美國StatSoft,Icn.公司提供，公司地址2300East14thStreet;網址:http:〃statsoft.com。下面對該軟體應用步驟進行舉例說明1、首先將測定的數據輸入MS-Excd中，建立5個種的xls文件；2、然後將這22個性狀除以CL，建立5個種除以CL的xls文件；3、將步驟2的xls文件數據輸入(拷貝)到STATISTICA99'EDITION軟體中，建立5個種除以CL的STA文件；4、對步驟3的STA文件數據進行標準化，以較正數據，建立標準STA文件，其具體實現過程是打開步驟3中建立的STA文件，點STATISTICA軟體中的工具欄中的"Analysis"，彈出小對話框，選擇"DataManagement/MFM"，出現一個界面，點擊"DataManagement/MFM"，出現一個新的界面，點擊"Standardizedvariables"則完成數據的標準化，結果則建立一個"standard.STA"文件；5、打開步驟4建立的"standard.STA"文件，運行STSTISTICA軟體中的工具欄中"分析"工具欄，彈出一個對話框，點擊"DiscriminatntAnalysis"判別分析工具欄，然後點擊"SwitchTo"進行判別分析，出現另一對話框，點擊對話框中的"Variables",選定組變量"1POPU"和自變量(2-22個)後，點擊"OK"，彈出新的對話框，選"Method:"中的"Backwardstepwise","Displayofresults"的"Ateachstep"則為逐步判別分析，再點"OK"，則出現一個結果對話框，點擊該結果對話框的"Classificationfunctions"則出現判別方程中的各變量對應的係數，點擊結果對話框的"Classificationmatrix"則出現判別的結果，即判別的正確率數據；6、依次運行上述結果對話框中的"Next"按鈕，則出現一組變量對應的係數和判別正確率結果，這樣經過16步後，測量的22個變量中，僅有Xj、X2、X9、X14、Xn和X^這6個變量作為判別的依據，且判別的正確率仍較高，顯示為有效。繼續往下判別則結果不理想，因此，將這6個變量作為最終的結果。四、逐步判別分析結果的得出。為更細緻的判別哪幾個比例性狀在三疣梭子蟹判別分析上貢獻的大小，以上對實驗數據進行逐步判別分析，最終的判別結果是在進行完16步逐步判別分析之後得出的，檢驗出CW/CL、ICW/CL、AW/CL、ML/CL、5PW/CL和OCS/CL這6個比例形狀對判別分析的貢獻較大。對這6個比例形狀建立了5個地理種群的判別方程，公式中Xi、X2、X9、X14、X17、X19分別代表CW/CL、ICW/CL、AW/CL、ML/CL、5PW/CL和OCS/CL各函數的自變量和常數。判別方程如下Yz^0.07010X廣0.52105X2-U4342X9+1.30263X!4-0.22921Xn-U3982X19-2.62019Yd屍1.70164X廣1.49333X2-1.89597X9+0.65353X!4-0.32891Xn-1.31352X!9-3.66955Y^4.03275X廣2.37031X2+0.71223X9+0.72934Xi4國0.59053Xi7+4.01213Xw-5,20638Yd廣0.94429X廣l.55943X2+0.11175X9-0.74477X14+1.87868X17+0.49741X19-2.92971Yz廣-2.85322X!+4.81737X2+1.39575X9-1.43024X!4-0.82160Xn誦2.15829X,9隱6.13701由這六個比例性狀對三疣梭子蟹進行判別，對測量數據按上述公式進行預測分類，結果見表4，判別準確率Pi為63.64%94.44%，P2為67.74%96.97%，綜合判別率為82.24%。因此，上述判別方程是可靠的,可以作為判別這5個典型三疣梭子蟹群體的參考依據。表45個地理種群三疣梭子蟹逐步判別分析測試結果tableseeoriginaldocumentpage10圖l一圖7為三疣梭子蟹形態學測量位點圖。具體實施例方式以下參照附圖，進一步描述本發明的具體技術方案，以便於本領域的技術人員進一步地理解本發明，而不構成對其權利的限制。實施例l。參照圖l-7。一種三疣梭子蟹的種質鑑定方法，其步驟如下，(1)取至少30個待測樣品梭子蟹進行7個形態學參數的測定，分別測定其背甲長CL、背甲寬CW、內背甲寬ICW、腹部寬AW、螯肢長節長ML、第5步足趾節寬5PW和螯肢腕骨上外面的棘長OCS這7個參數；然後以背甲長CL參數值作分母、其餘6個參數值作分子，獲得6個比例參數值XCW/CL;X2:ICW/CL;X9:AW/CL;X14:ML/CL;X17:5PW/CL;X19:OCS/CL;(2)將XpX2、X9、X14、Xn和X^6個比例參數值分別代入下列方程中進行結果判定Yzs-0.07010X廣0.52105X2-1.14342X9+1.30263XM陽0.22921Xn-l.13982X19-2.62019Ydrl.70164X廣1.49333X2-1.89597X9+0.65353Xw-0.32891Xn隱1.31352Xi9-3扁55Y)yg:1.03275Xr2.37031X2+0.71223X9+0.72934X4-0.59053Xn+4.01213X!9陽5.20638Yd廣0.94429X廣1.55943X2+0.11175Xr0.74477Xi4+1.87868Xn+0.49741X19-2.92971Yz廣-2.85322X!+4.81737X2+1.39575X9-1.43024Xw-0.82160Xn隱2.15829Xw-6.13701(3)根據所得Y值的最大值出現頻率最多的群體即為待測樣品梭子蟹所處的來源。實施例2。參照圖l-7。一種三疣梭子蟹的種質鑑定方法，其步驟如下，1.採集來的野生雌性三疣梭子蟹樣本應在冷藏條件下測定，且樣本數至少要30個以獲得準確的結果。2.數據測定分別測定背甲長CL、背甲寬CW、內背甲寬ICW、腹部寬AW、螯肢長節長ML、第5步足趾節寬5PW和螯肢腕骨上外面的棘長OCS這7個性狀，以上6個性作分別比上背甲長CL，獲得6個比例性狀。各性狀的測定部位見圖1。3.結果的給出將測定的6個比例性狀帶入下列5個方程中，公式中XpX2、X9、X14、X17、X,9分別代表CW/CL、ICW/CL、AW/CL、ML/CL、5PW/CL和OCS/CL各函數的自變量和常數。判別方程如下Yz^0.07010X)陽0.52105X2-U4342X9+1.30263Xi4-0.22921Xn-U3982X19-2.62019YdH.70164X廣1.49333X2-1.89597X9+0.65353Xw-0.32891Xn-1.31352Xw-3.66955Y!y^l.03275X廣2.37031X2+0.71223X9+0.72934X!4-0.5卯53Xn+4.01213X!9-5.20638Yd廣0.94429X廣1.55943X2+0.11175X9-0.74477XM+1.87868Xn+0.49741X19-2.92971Yzj:-2.85322X!+4.81737X2+1.39575X9-1.43024XM-0.82160Xn-2.15829Xi9-6.13701每一個樣本的6個比例性狀帶入上述5個方程後得出Yzs、YdI、Ylyg、Ydy、Yzj這5個數據，其中值最大的即判別為該樣本為相應的群體。如這個數值中Y^最大，則該樣本來自連雲港群體，其餘如L最大則代表樣本為舟山群體，Ydl代表大連群體，Ydy代表東營群體，Yzj代表湛江群體。對30個樣本判定到不同群體中，統計其概率或頻率，出現頻率最高的那個群體即代表樣本的來源。如測定了30個樣本，26個L最大，而另4個中2個Ydy最大，另兩個L最大，毫無疑問可以判別該批三疣梭子蟹樣本為來自大連群體。權利要求1、一種三疣梭子蟹的種質鑑定方法，其特徵在於，其步驟如下，(1)取至少30個待測樣品梭子蟹進行7個形態學參數的測定，分別測定其背甲長CL、背甲寬CW、內背甲寬ICW、腹部寬AW、螯肢長節長ML、第5步足趾節寬5PW和螯肢腕骨上外面的棘長OCS這7個參數；然後以背甲長CL參數值作分母、其餘6個參數值作分子，獲得6個比例參數值X1CW/CL；X2ICW/CL；X9AW/CL；X14ML/CL；X175PW/CL；X19OCS/CL；(2)將X1、X2、X9、X14、X17和X196個比例參數值分別代入下列方程中進行結果判定Yzs＝0.07010X1-0.52105X2-1.14342X9+1.30263X14-0.22921X17-1.13982X19-2.62019Ydl＝1.70164X1-1.49333X2-1.89597X9+0.65353X14-0.32891X17-1.31352X19-3.66955Ylyg＝1.03275X1-2.37031X2+0.71223X9+0.72934X14-0.59053X17+4.01213X19-5.20638Ydy＝0.94429X1-1.55943X2+0.11175X9-0.74477X14+1.87868X17+0.49741X19-2.92971Yzj＝-2.85322X1+4.81737X2+1.39575X9-1.43024X14-0.82160X17-2.15829X19-6.13701(3)根據所得Y值的最大值出現頻率最多的群體即為待測樣品梭子蟹所處的來源。全文摘要本發明是一種三疣梭子蟹的種質鑑定方法，其特徵在於，其步驟如下，取至少30個待測樣品梭子蟹進行7個形態學參數的測定，分別測定其背甲長CL、背甲寬CW、內背甲寬ICW、腹部寬AW、螯肢長節長ML、第5步足趾節寬5PW和螯肢腕骨上外面的棘長OCS這7個參數；然後以背甲長CL參數值作分母、其餘6個參數值作分子，獲得X1、X2、X9、X14、X17、X196個比例參數值並將這6個比例參數值分別代入判別方程中進行結果判定，根據所得Y值的最大值出現頻率最多的群體即為待測樣品梭子蟹所處的來源。本發明方法可以快速、經濟、相對準確和操作簡便地鑑定三疣梭子蟹的種質。文檔編號A61B19/00GK101301225SQ20081012311公開日2008年11月12日申請日期2008年6月5日優先權日2008年6月5日發明者李曉英,董志國,閻斌倫,煥高申請人:淮海工學院