佐劑系統及疫苗的製作方法

2023-04-24 05:57:26

專利名稱：佐劑系統及疫苗的製作方法
佐劑系統及疫苗本申請是申請日為1999年10月8日，申請號為99814341. 3的發明名稱為「佐劑 系統及疫苗」的發明專利申請的分案申請。本發明涉及改進的疫苗、佐劑系統以及製備這樣的疫苗和佐劑系統的方法。具體 地說，本發明的疫苗和佐劑系統包括金屬鹽以及其它免疫刺激劑如單磷醯脂質A或其衍生 物、Quil A或其衍生物、或免疫刺激性寡核苷酸如CpG。在本領域內，眾所周知鋁鹽提供了具有佐劑活性的安全賦形劑。據認為這些佐劑 的作用機制包括形成抗原儲存庫(antigen depot)以致抗原可以在給予後滯留在注射位點 長達3周，以及形成更易被抗原呈遞細胞攝入的抗原/金屬鹽複合物。除鋁外，已經使用其 它金屬鹽來吸附抗原，包括鋅鹽、鈣鹽、鈰鹽、鉻鹽、鐵鹽以及鈹鹽。鋁的氫氧化物和磷酸鹽 是最常用的。包含鋁鹽、抗原以及其它免疫刺激劑的疫苗製劑是本領域內已知的。比起由鋁鹽 和抗原單獨刺激的免疫反應，這樣的製劑引起更強烈的免疫反應。這些疫苗製備物的配製 以前涉及特殊的生產過程，因為據認為要發生最佳的免疫反應，必須使抗原吸附於免疫刺 激劑所吸附的同一鋁鹽顆粒上。這樣，當抗原呈遞細胞攝入抗原時，共吸附的免疫刺激劑直 接對同一抗原呈遞細胞施加其刺激作用。在EP 0 576 478 Bi、EP 0 689 454 Bl 和 EP 0 633 784 Bl 中描述了基於 鋁的疫苗製劑，其中抗原和免疫刺激劑3-脫氧醯化單磷醯脂質A (3-de-0-acylated monophosphoryl lipid A) (3D-MPL)吸附於同一顆粒。在這些情況下，首先使抗原吸附到鋁 鹽上，隨後使免疫刺激劑3D-MPL吸附於同一鋁鹽顆粒。這樣的過程首先涉及在水浴中通過 超聲處理而懸浮3D-MPL，直到顆粒達到80到500nm之間的大小。一般在室溫下，在攪拌的 同時使抗原吸附在鋁鹽上一小時。然後將所述3D-MPL懸浮物加入已吸附的抗原，並將所述 製劑在室溫下溫育1小時，隨後在4°C保存備用。從免疫的觀點上看，所述在先技術的配製方法提供了有效的疫苗，但是，它們也包 含一些商業缺陷。為使得疫苗適於給予人類，所述方法必須保持一致並服從生產質量管理 規範(GMP)控制以及質量控制(QC)。在一些情況下，所述在先技術的方法提供了其中一種 抗原或多種抗原全部吸附到同一金屬鹽顆粒上的疫苗。然後3D-MPL要吸附於同一金屬顆 粒的要求也使得該方法複雜化。在包含多種抗原的聯合疫苗的情況下，可能是特別成問題 的(多種抗原的吸附依賴於每種抗原在特定PH下對特定金屬鹽的親和力)。根據存在何種 抗原，所述在先技術的方法可能在重複生產能力和疫苗QC上存在問題。此外，如果在一種 特定抗原的QC中發生任何事故或可能導致疫苗汙染的事件，這有可能導致所有各個成分 的浪費，而不僅僅是出現問題的特定抗原的浪費。另外，在一些情況下，聯合疫苗可能要求 順序加入抗原，這樣一個過程是極其耗時並且昂貴的。因此，所述在先技術的方法複雜、不 易控制並且昂貴。驚人的是，本發明人已經發現不必將抗原和免疫刺激劑吸附於同一顆粒。與本領 域內已經接受的觀點不同，已經發現當抗原吸附於從免疫刺激劑結合的那些金屬鹽顆粒分 離的特定金屬鹽顆粒上時，可以產生令人滿意的疫苗。
所述改進過程包括吸附免疫刺激劑到金屬鹽顆粒上，接著使抗原吸附於另一金屬 鹽顆粒，隨後混合所述分離的金屬顆粒以形成疫苗。本發明還為佐劑組合物提供了吸附於 金屬鹽顆粒的免疫刺激劑，其特徵在於所述金屬鹽顆粒基本不含其它抗原。此外，本發明還 提供了疫苗，所述疫苗的特徵在於免疫刺激劑吸附於基本不含其它抗原的金屬鹽顆粒，並 且吸附抗原的金屬鹽顆粒基本不含其它免疫刺激劑。因此，本發明提供了包含已經吸附到金屬鹽顆粒上的免疫刺激劑的佐劑製劑，其 特徵在於所述組合物基本不含其它抗原。此外，該佐劑製劑是在本發明的生產疫苗的方法 中要求的中間體。因此，提供了生產疫苗的方法，所述方法包括將本發明的所述佐劑組合物 與抗原混合。所述抗原最好已經預吸附到金屬鹽上。所述金屬鹽可以與吸附所述免疫刺激 劑的金屬鹽相同或相似。本發明還提供了疫苗組合物，所述組合物包含吸附於第一種金屬鹽顆粒的免疫刺 激劑以及吸附於金屬鹽的抗原，其特徵在於所述第一種金屬鹽顆粒和所述第二種金屬鹽顆 粒是不同的。或者，構成本發明的部分的疫苗包括兩組主要的複合物，第一組複合物包括(a) 吸附於金屬鹽顆粒的免疫刺激劑，特徵在於所述金屬鹽顆粒基本不含抗原；而第二組複合 物包括(b)吸附於金屬鹽顆粒的抗原。所述疫苗組合物也可包括兩組主要的複合物，第一 組複合物包括(a)吸附於金屬鹽顆粒的免疫刺激劑，特徵在於所述金屬鹽顆粒基本不含抗 原；第二組複合物包括(b)吸附於金屬鹽顆粒的抗原，特徵在於所述金屬鹽顆粒基本不含 免疫刺激劑。在這兩組主要複合物中存在的金屬鹽可以是相同或不同的。此外，在其中可能存 在多種不同抗原的聯合疫苗的情況下，所述第二組複合物(上面所述)可以包含吸附於不 同金屬顆粒上的多種抗原。關於本發明中基本不含其它抗原的定義，是指能夠吸附於所述金屬鹽顆粒的總物 質中不多於20% (質量)是另一種抗原，優選不多於10% (質量)是另一種抗原，最優選 不多於5% (質量)是另一種抗原。或者，關於本發明中基本不含免疫刺激劑是指能夠吸 附於所述金屬鹽顆粒的總物質中不多於20% (質量)是免疫刺激劑，優選不多於10% (質 量)是免疫刺激劑，最優選不多於5% (質量)是免疫刺激劑。可以使用對於本領域內技術 人員明顯的常規檢驗來確定抗原或免疫刺激劑是否吸附到不同的分離顆粒上，包括但不限 於在電場內通過製劑的自由流動而分離疫苗成為不同組份，或者如特別適用於非顆粒性抗 原的沉降速率分析等技術，隨後分析各組份中的免疫刺激劑或抗原。本發明還提供了試劑盒，所述試劑盒包括一個盛有吸附於金屬鹽的免疫刺激劑的 容器；以及第二個盛有抗原的容器，所述抗原最好吸附於金屬鹽。當需要商業化規模數量的聯合疫苗時，本發明的方法是特別有用的。聯合疫苗是 含有一種以上病原體的一種以上抗原的單劑疫苗。這樣的疫苗可以減少引起對抗多種病原 體和疾病的保護所需的接種數量。例如，如果一種疫苗包含A1(0H)3、3D_MPL以及抗原V、W、X、Y、Z，以前的方法涉及 將所述抗原和3D-MPL配製到Al (OH)3的同一顆粒上。這樣的在先技術方法要求將V、W、X、 Y、Z吸附於Al (OH) 3，隨後將游離的3D-MPL加入到每一種預吸附的抗原複合物。與此不同，在本發明的配製方法中，抗原V、W、X、Y、Z各自在分離的容器中吸附到分離的Al (OH)3顆粒上。3D-MPL也在另一容器吸附到Al(OH)315然後通過將每一獨離容器 的材料簡單混合，組成疫苗。在這種情況下，結合3D-MPL的Al (OH)3顆粒可以與結合抗原 的Al (OH)3顆粒分離。或者，本發明提供了製備包含免疫刺激劑、抗原以及金屬鹽的疫苗的方法，包括1.吸附抗原於第一種金屬顆粒，2.吸附免疫刺激劑於第二種金屬顆粒，然後
3.混合上面步驟1和步驟2的產品。本發明提供了克服在先技術中存在的問題的生產疫苗的方法。各個抗原-金屬鹽 複合物都可以接受GMP控制，並且如果特定抗原-金屬鹽製備物發生任何不湊巧的汙染，那 麼不會危及其它抗原以及免疫刺激性佐劑的完整性。驚人的是，與本領域內已經接受的觀 點不同，通過本發明的方法產生的疫苗與使用在先技術製備的疫苗一樣有效。在本發明的意義內，免疫刺激劑的定義可以描述為具有佐劑活性的天然化 合物或合成化合物，所述佐劑活性來源於所述化合物本身對免疫系統細胞的直接 或間接刺激效應，而不是通過其它非刺激性效應如儲存庫效應(cbpot effect)或靶 向免疫系統。這樣的免疫刺激劑的例子描述於「Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach，，(Powell, M. F.禾口 Newman, M. J.編 輯；1995, Pharmaceutical Biotechnology (Plenum Press, New York and London, ISBN 0-306-44867-X)中由 Powell, M.F.和NeWman，M.編寫的名為「疫苗佐劑與賦形劑綱要」的一章。在本發明範圍內的這些 免疫刺激劑包括得自細菌的化合物，如單磷醯脂質A或其衍生物；得自植物的皂苷類或其 衍生物，例如Quil A ；或免疫刺激性寡核苷酸如CpG、嵌段共聚物、霍亂毒素、免疫刺激性細 胞因子如GM-CSF和IL-Upolyribo A和polyribo U以及胞壁醯三肽(MTP)。單磷醯脂質A是具有佐劑活性的衍生自細菌的化合物，並且是在本發明的應用中 優選的免疫刺激劑。已經改變該毒性化合物以形成毒性更低的衍生物，一種這樣的衍生物 是3-脫氧醯化單磷醯脂質A (稱為3D-MPL或d3-MPL，表示還原性末端葡糖胺的3位是脫氧 醯化)。為製備3D-MPL，見GB 2 220 211 A。在化學上它是具有3、4、5或6個醯化鏈的3-脫 醯化單磷醯脂質A的混合物。在本發明的組合物中最好使用小顆粒MPL。小顆粒MPL具有 這樣的顆粒大小以致其可以通過0.22 μ m濾膜無菌濾過。在國際專利申請第WO 94/21292 號中描述了這樣的製備物。其它改進在公開了包含三醯基和四醯基同族元素的3D-MPL的 穩定製備物的GB 9807933. 8中描述。GB 2 220 211 A提到降低了以前使用的腸桿菌脂多糖(LPS)的內毒性，同時保留 了免疫原性特性。然而GB 2 220 211僅在關於細菌(革蘭氏陰性)系統時引用了這些發 現。在本發明的應用中另一種優選的免疫刺激劑是Quil A及其衍生物。Quil A是一 種從南美洲的樹Quilaja Saponaria Molina分離得到的皂苷製備物，Dalsgaard等在1974 年(「阜苷佐劑，，，Archiv. fur diegesamte Virusforschung,第 44 卷，Springer Verlag, Berlin，第243-254頁)首次描述其具有佐劑活性。已經通過HPLC分離了保留其佐劑 活性並且不具有與Quil A相關的毒性的Quil A的純化片段(EP 0 362278)，例如QS7和 QS21 (也稱為QA7和QA21)。已經描述了特別優選的QS21的特定製劑，這些製劑還包含固 醇(W096/33739)。
CpG是具有已知佐劑特性的免疫刺激性寡肽(W0 96/02555)。在本發明的範圍內 優選的 CpG 序列是(TCC ATG AGC TTC CTG ACGTT，Krieg 1826)、(TCT CCC AGC GTG CGC CAT, Krieg 1758)以及 TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT。本發明涉及所述佐劑的特定配製方法以及特性，並且因此可以與許多種抗原一起 使用。本發明的疫苗可以用於初次劑量和加強劑量(priming and boosting dose)，以及用 於引起針對多種病原體的免疫反應和引起針對由多種病原體介導的感染的保護。同時本發 明提供了引發針對抗原的免疫反應的方法，包括使用包含金屬鹽、免疫刺激劑和抗原的疫 苗，其中所述免疫刺激劑吸附於從吸附所述抗原的那些金屬鹽顆粒分離的金屬鹽顆粒上。 下面列出了 一些病原體和抗原。由A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、丁型肝炎病毒和戊型肝炎病 毒導致的病毒性肝炎是非常普遍的病毒性疾病。尤其是通過B型肝炎病毒和C型肝炎 病毒，還引起了許多例肝癌。因此發展有效的疫苗是非常重要的，儘管有值得注意的 成功，但這仍是一項正在進行的工作。在Lancet，1990年5月12日第1142頁及其下 (Prof A. L. W. F. Eddleston)中可以找到關於現代肝炎疫苗的綜述，包括許多重要的參考 資料。還可參見 「Viral H印atitis and Liver Disease」 (Vyas, B. N.，Dienstag, J. L.， 禾口 Hoofnagle，J. H.,編輯，Grune 禾口 Stratton. Inc. (1984))禾口 「Viral Hepatitis and Liver Disease，，(Proceedings of the 1990International Symposium, F. B. Hollinger, S. M. Lemon 和 H. Margolis 編輯，Williams and Wilkins 出版)。本文使用的表述「B型肝炎抗原」用來指由B型肝炎病毒衍生的可用於在人體內 引起針對所述病毒的免疫的任何抗原性物質。B型肝炎病毒(HBV)感染是一個廣泛的問題，但用於群體免疫(mass immunisation)的疫苗目前是可以得到的，例如通過遺傳工程技術獲得的產品 "Engerix-B" (SmithKline Beecham pic)。製備B型肝炎表面抗原(HBsAg)已經有許多文獻論述。見，例如，Harford等在 Develop. Biol. Standard 54，第 125 頁(1983)、Gregg 等在 Biotechnology, 5，第 479 頁 (1987) ,EP-A-O 226 846, EP-A-O 299 108 以及其中的參考文獻。本文使用的表達方式「B型肝炎表面抗原」或「HBsAg」包括顯示HBV表面抗原 的抗原性的任何HBsAg抗原或其片段。可以知道除HBsAg S抗原的226胺基酸序列(見 Tiollais等，Nature, 317,489 (1985)和其中的參考文獻)外，如果需要，如本文所述的 HBsAg可以包括全部或部分前S序列，如上面的參考資料以及EP-A-O 278 940所述。尤其 是所述HBsAg可以包括包含這樣的胺基酸序列的多肽所述胺基酸序列包含殘基12-52，其 後是殘基133-145，其後是與ad血清型B型肝炎病毒上的可讀框有關的HBsAg的L-蛋白 的殘基175-400 (該多肽稱為L*;見EP 0 414 374)。在本發明範圍內的HBsAg也可以包括 在EP 0 198 474 (Endotronics)中描述的前Sl-前S2-S多肽或其類似物，如在EP O 304 578 (Mc Cormick and Jones)中描述的那些類似物。如本文所述的HBsAg也可以指突變體， 例如在WO 91/14703或歐洲專利申請公開號O 511 855 Al中描述的「逃逸突變體(escape mutant) 」，特別是其中在145位上的胺基酸取代是從甘氨酸到精氨酸的HBsAg。一般HBsAg將是顆粒形式的。所述顆粒可以包括例如單獨的S蛋白或者可以是復 合顆粒，例如0Λ S)，其中L*如上所定義，S表示HBsAg的S蛋白。在酵母中表達時，所述顆粒在形式上是有利的。對A型肝炎具有保護的成份最好是名為「Havrix」 (SmithKlineBeecham Biologicals)的產品，「Havrix」是由HAV HM-175株得到的滅活減毒疫苗[見「Inactivated Candidiate Vaccines for Hepatitis A，，，F. Ε· Andre, A. Hepburn 禾口 Ε· D Hondt (1980), Prog. Med. Virol.第 37 卷,第 72-95 頁以及由 SmithKline Beecham Biologicals 出版的 產品專題文章「Havrix」 (1991)。因此，在本發明的一個優選實施方案中，提供了包含HBsAg以及A型肝炎抗原的 聯合疫苗。另外，本發明提供了生產A型肝炎和B型肝炎聯合疫苗的方法，以及由該方法得 到的產品。其它聯合疫苗可以在市場上獲得，包括由SmithKline BeechamBiologicals製造 的Infanrix 系列(range)。這樣的疫苗基於Diptheria毒素、破傷風毒素和百日咳博德特 氏菌(B. pertussis)抗原的「核心」組合。該疫苗包含一種百日咳成份(滅活的完整百日咳 博德特氏菌細胞，或一般包括兩種抗原PT和FHA、通常69kDa的無細胞百日咳，可選地還有 凝集原2或凝集原3中的一種或兩種)。這樣的疫苗通常稱為DTPw (完整細胞)或DTPa (無 細胞)。在本發明範圍內的特定聯合疫苗包括Diptheria-破傷風-百日咳-B型肝炎(DTP-HB)Diptheria-破傷風-B型肝炎(DT-HB)Hib-B型肝炎DTP-Hib-B型肝炎IPV (滅活脊髓灰質炎疫苗)-DTP-Hib-B型肝炎所述百日咳成份合適地是完整細胞的百日咳疫苗或包含部分或高度純化的抗原 的無細胞百日咳疫苗。上面的組合可選地包括保護對抗A型肝炎的成份。所述A型肝炎 成份最好經過福馬林滅活的HM-175。最好如下純化HM-175:用胰蛋白酶處理培養的 HM-175，通過滲透層析從小蛋白酶消化的蛋白中分離完整的病毒，然後用福馬林滅活。最 好所述B型肝炎聯合疫苗是一種兒科疫苗。本發明的其它聯合疫苗公開於GB 9805105. 5 (SmithKlineBeecham Biologicals s. a.)，這樣的聯合疫苗對用於青少年的疫苗特別有利。優選的組合基於B型肝炎抗原(Hep B)和單純皰疹(HSV)抗原的「核心」組合。在這個「核心」中可以選擇地加入一種或多種得 自下面的抗原埃-巴二氏病毒(EBV)抗原、A型肝炎抗原(Hep Α)、人乳頭瘤病毒(HPV) 抗原。這些聯合疫苗可以另外包含水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、人巨細胞病毒(HCMV)或弓 形蟲抗原。本發明的疫苗製劑最好包含能夠引發對抗人類病原體的免疫反應的抗原或抗原 組合物，所述抗原或抗原組合物來自HIV-I (如tat、nef, gpl20或gpl60)、人類皰疹病毒 (如gD或其衍生物或立即早期蛋白如來自HSVl或HSV2的ICP27)、巨細胞病毒((特別是人 類)(如gB或其衍生物))、輪狀病毒(包括活減毒病毒)、埃-巴二氏病毒(如gp350或其 衍生物)、水痘-帶狀皰疹病毒(如gp I、II和IE63)，或者所述抗原或抗原組合物來自肝炎 病毒如B型肝炎病毒(例如B型肝炎表面抗原或其衍生物)、A型肝炎病毒、C型肝炎病毒 和戊型肝炎病毒，或者所述抗原或抗原組合物來自其它病毒性病原體，如副粘病毒呼吸道合胞病毒(如F蛋白和G蛋白及其衍生物)、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳頭瘤 病毒(例如HPV6、11、16和18)、黃病毒(如黃熱病毒、登革病毒、蜱傳腦炎病毒、日本腦炎病 毒)或流感病毒，或者所述抗原或抗原組合物來自細菌病原體，如奈瑟氏菌屬(Neisseria spp.)，包括淋病奈瑟氏菌(N. gonorrhea)和腦膜炎奈瑟氏菌(N. meningitidis)(例如 莢膜多糖及其偶聯物、運鐵蛋白結合蛋白、乳鐵蛋白結合蛋白、PilC、粘附素)；鏈球菌屬 (Streptococcus spp.)，包括肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)(例如莢膜多糖及其偶聯物、 PsaA, PspA、鏈球菌溶血素、膽鹼結合蛋白)、釀膿鏈球菌(S. pyogenes)(例如M蛋白或 其片段、C5A蛋白酶、脂磷壁質)、無乳鏈球菌(S.agalactiae)、變異鏈球菌(S. mutans)； 嗜血菌屬(Haemophilus spp.)，包括B型流感嗜血菌(H. influenzae)(例如PRP及其 偶聯物)、未定型(non typeable)流感嗜血菌(例如0MP26、高分子量粘附素、P5、P6、 脂蛋白D)、杜氏嗜血菌(H. ducreyi)；莫拉氏菌屬(Moraxella spp.)，包括黏膜炎莫 拉氏菌(M. catarrhal is),也稱為卡他布蘭漢氏菌(Branhame 1 lacatarrhal is)(例如 高分子量粘附素和低分子量粘附素及侵染素)；博德特氏菌屬(Bordetella spp.)， 包括百日咳博德特氏菌(B. pertussis)(例如pertactin、百日咳毒素或其衍生物、絲 狀血凝素、腺苷酸環化酶、菌毛)、副百日咳博德特氏菌(B. parapertussis)和支氣管 炎博德特氏菌(B. bronchiseptica)；分枝桿菌屬(Mycobacterium spp.)，包括結核 分枝桿菌(M. tuberculosis)(例如ESAT6、85A抗原、85-B抗原或85-C抗原)、牛分枝 桿菌(M.bovis)、麻風分枝桿菌(M. 1印rae)、鳥分枝桿菌(M. avium)、副結核分枝桿菌 (M. paratuberculosis)、耳止櫃分枝桿菌(M. smegmatis)；軍團菌屬(Legionella spp.),包 括嗜肺軍團菌(L. pneumophila)；埃希氏菌屬(Escherichia spp.)，包括腸毒性大腸桿菌 (E. coli)(例如定居因子、熱不穩定毒素或其衍生物、熱穩定毒素或其衍生物)、腸出血性大 腸桿菌、腸致病性大腸桿菌(例如志賀樣毒素或其衍生物)；弧菌屬(Vibro spp.)，包括霍 亂弧菌(V. cholera)(例如霍亂毒素或其衍生物)；志賀氏菌屬(Shigella spp.)，包括宋內 氏志賀氏菌(S. sonnei)、痢疾志賀氏菌(S. dysenteriae)、弗氏志賀氏菌(S. flexnerii)； 耶爾森氏菌屬(Yersinia spp.)，包括小腸結膜炎耶爾森氏菌(Y. enterocolitica)(例如 Yop蛋白)、鼠疫耶爾森氏菌(Y.pestis)、假結核耶爾森氏菌(Y. pseudotuberculosis)； 彎曲桿菌屬(Campylobacterspp.)，包括空腸彎曲桿菌(C. jejuni)(例如毒素、粘附素 和侵襲素)和大腸彎曲桿菌(C. coli)；沙門氏菌屬(Salmonella spp.)，包括傷寒沙 門氏菌(S. typhi)、副傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌(S. choleraesuis)、腸炎沙門氏 菌(S. enteritidis)；李斯特氏菌屬(Listeria spp.)，包括單核細胞增生李斯特氏菌 (L. monocytogenes)；螺旋桿菌屬(Helicobacterspp.)，包括幽門螺旋桿菌(H. pylori)(例 如脲酶、過氧化氫酶、空泡毒素(vacuolating toxin))；假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)， 包括銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)；葡萄球菌屬(Staphylococcus spp.)，包括金黃色葡 萄球菌(S. aureus)、表皮葡萄球菌(S. epidermidis)；腸球菌屬(Enterococcus spp.), 包括糞腸球菌(E. faecalis)、屎腸球菌(E. faecium)；梭菌屬(Clostridium spp.),包 括破傷風梭菌(Ctetani)HfiJ如破傷風毒素及其衍生物)、肉毒梭菌(C. botulinum) (例如肉毒桿菌毒素及其衍生物)、艱難梭菌(C. difficile)(例如梭菌毒素A或梭菌 毒素B及它們的衍生物)；芽孢桿菌屬(Bacillus)，包括炭疽芽孢桿菌(B. anthracis) (例如肉毒桿菌毒素及其衍生物)；棒桿菌屬(Corynebacterium spp.)，包括白喉棒桿菌(C. diphtheriae)(例如白喉毒素及其衍生物)；疏螺旋體屬(Borrelia spp.)，包括布氏 疏螺旋體(B. burgdorferi)(例如 OspA、OspC, DbpA、DbpB)、嘎氏疏螺旋體(B. garinii) (例如 OspA、OspC、DbpA、DbpB)、阿氏疏螺旋體(B. afzelii)(例如 OspA、OspC、DbpA、 DbpB)、B. andersonii (例如 OspA、OspC, DbpA, DbpB)、赫氏蜱疏螺旋體(B.hermsii)；埃 裡希氏體屬(Ehriichiaspp.)，包括馬埃裡希氏體(E. equi)和人粒細胞增多埃裡希病的 病原體；立克次氏體屬(Rickettsia spp.)，包括立氏立克次氏體(R. Rickettsii)；衣原 體屬(Chlamydia spp.)，包括沙眼衣原體(C. trachomatis)(例如Μ0ΜΡ、肝素結合蛋白)、 肺炎衣原體(C. pneumoniae)(例如Μ0ΜΡ、肝素結合蛋白)、鸚鵡熱衣原體(C. psittaci)； 鉤端螺旋體屬(L印tospira spp.)，包括問號鉤端螺旋體(L. interrogans)；密螺旋體 屬(Tr印onema spp.)，包括蒼白密螺旋體(T. pallidum)(例如稀有外膜蛋白)、齒垢密 螺旋體(T. denticola)、豬痢疾密螺旋體(T. hyodysenteriae)；或來自寄生蟲，例如瘧原 蟲屬(Plasmodium spp.)，包括惡性瘧原蟲；弓漿蟲屬(Toxoplasma spp·)，包括鼠弓漿 蟲(T. gondii)(例如 SAG2、SAG3、Tg34)；內阿米巴屬(Entamoeba spp.)，包括痢疾內變 形蟲(E. histolytica)；巴貝蟲屬(Babesia spp.)，包括田鼠巴貝蟲(B. microti)；錐蟲 屬(Trypanosomaspp·)，包括克魯茲錐蟲(T. cruzi)；賈第鞭毛蟲屬(Giardia spp.)，包 括吸吮賈第蟲(G. Iamblia) ；Leshmania 物種，包括 L. major ；肺囊蟲屬(Pneumocystis spp.)，包括卡氏肺囊蟲(P.carinii)；毛滴蟲屬(Trichomonas spp.)，包括陰道毛滴蟲 (T. vaginalis) ；Schisostoma物種，包括S. mansoni，或得自酵母，例如念珠菌屬(Candida spp.)，包括白色念珠菌(C. albicans)；隱球酵母屬(Cryptococcus spp.)，包括新型隱球 菌酵母(C. neoformans)。在一個優選的方面，本發明的疫苗製劑包含HIV-I抗原gpl20，特別是當在CHO細 胞中表達時。在另一個優選的實施方案中，本發明的疫苗製劑包含如上面所定義的gD2t。在本發明一個優選的實施方案中，含有要求保護的佐劑的疫苗包括據認為引起生 殖器疣的HPV病毒(HPV 6或HPV 11及其它病毒)以及引起宮頸癌的HPV病毒(HPV 16、 HPV 18及其它病毒)。尤其優選的疫苗形式包含Ll顆粒或病毒殼粒，以及包含由以下選 出的一種或多種抗原的融合蛋白HPV 6和HPV 11蛋白E6、E7、L1和L2。最優選的融合蛋 白形式是GB 95 15478. 7中公開的L2E7以及GB9717953. 5(W099/10375)中公開的蛋白 D(l/3)-E7。本發明的疫苗還包括由導致瘧疾的寄生蟲得到的抗原。例如，優選的來自 Plasmodia falciparum的抗原包括RTS、S和TRAP。RTS是一種雜種蛋白，包含通過乙型肝 炎表面抗原前S2部分的四個胺基酸連接到B型肝炎病毒表面(S)抗原的惡性瘧原蟲環子 孢子蛋白的基本上全部C末端片段。其完整結構公開於要求英國專利申請第9124390. 7號 的優先權的公開號為WO 93/10152的國際專利申請第PCT/EP92/02591號中。當在酵母中表 達時，RTS作為脂蛋白顆粒產生，當其與來自HBV的S抗原共表達時，它產生名為RTS，S的 混合顆粒。公開號為WO 90/01496的國際專利申請第PCT/GB89/00895號中描述了 TRAP抗 原。本發明的優選實施方案是一種瘧疾疫苗，其中所述抗原製備物包含RTS，S和TRAP抗原 的組合。有可能成為多級瘧疾疫苗的成份的候選物的其它瘧原蟲抗原是惡性瘧原蟲MSP1、 AMA1、MSP3、EBA、GLURP, RAPl、RAP2、鉗合蛋白、PfEMPl、Pf332、LSAl、LSA3、STARP, SALSA、 PfEXPl、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfsl6、Pfs48/45、Pfs230 以及它們在瘧原蟲物種中的類似物。所述製劑還可以包含抗腫瘤抗原並可用於治療癌症的免疫療法 (immunotherapeutic treatment cancers)。例如，發現所述佐劑製劑對腫瘤排斥抗原 (tumor rejection antigen)有作用，如前列腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌、胰腺癌、腎癌或黑素 瘤癌(melanoma cancer)的腫瘤排斥抗原。典型抗原包括MAGE 1和MAGE 3或其它用於治 療黑素瘤的MAGE抗原、PRAM/E、BAGE或GAGE (Robbins和 Kawakami，1996，Current Opiniohs in Immunology 8,第628-636頁；Van den Eynde^, International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997 年提交)；Correale 等(1997)，Journal of the National Cancer Institute 89，第293頁。事實上這些抗原在廣泛的腫瘤類型中表達，例如黑素 瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌。其它適於與本發明的佐劑使用的腫瘤特異性抗原包括但不限制 於前列腺特異性抗原(PSA)或Her-2/neu、KSA(GA733)、MUC-I和癌胚抗原(CEA)。已經提 出其它抗原作為泛癌治療抗原(pan-cancer therapeutic antigen)，其中包括酪氨酸酶和 Survivin。因此，在本發明的一方面，提供了包含依照本發明的一種佐劑組合物以及一種腫 瘤排斥抗原的疫苗。預計本發明的組合物將用於配製包含來自疏螺旋體物種的抗原的疫苗。例如，抗 原可以包括核酸、病原體衍生的抗原或抗原製備物、重組產生的蛋白或多肽以及嵌合融合 蛋白。尤其是所述抗原是OspA。所述OspA可以是藉助於宿主細胞(大腸桿菌)的脂質化 形式的完整成熟蛋白，名為(Lip0-OspA)，或者是非脂質化的衍生物。這樣的非脂質化衍生 物包括具有流感病毒非結構蛋白(NSl)的頭81個N末端胺基酸以及完整OspA蛋白的非脂 質化NSl-OspA融合蛋白，而另一種非脂質化衍生物MDP-OspA是帶有3個額外N末端氨基 酸的非脂質化形式OspA。本發明的疫苗可以用於預防或治療變態反應。這樣的疫苗將包含變態反應原特異 性抗原(例如Der pi以及花粉相關抗原)和變態反應原非特異性抗原(例如stanworth 十肽)。在每一疫苗劑量中抗原量是根據在典型受接種者體內引起免疫保護性反應並 且沒有顯著副作用的量而選擇。這樣的量將根據所使用的是哪一種特定免疫原以及其如 何呈遞而有所不同。一般來說，預期每劑量將包含1-1000 μ g抗原，優選1-500 μ g，優選 1-100 μ g，最優選1到50 μ g。對於特定疫苗的最佳量可以根據涉及觀察受實驗者體內合適 的免疫反應的標準研究而確定。在初次接種(initial vaccination)後，受實驗者可以以 足夠間隔接受一次或幾次加強免疫(boosterimmimisation)。為給予人類，一般免疫刺激劑 含量為每劑量1 μ g-1000 μ g，優選每劑量10 μ g_500 μ g，更優選每劑量20 μ g_200 μ g，更 優選每劑量20-100 μ g，最優選每劑量10-50 μ g。本發明還提供了本發明的佐劑和疫苗在藥中的應用，具體地說是治療患有病原性 感染或癌症或變態反應或對上述狀況易感的哺乳動物。還提供了本發明的佐劑及疫苗在生 產病毒感染、細菌感染、寄生蟲感染、變態反應或癌症的免疫預防藥物和免疫治療藥物中的 應用。本發明的製劑可以用於預防目的以及治療目的。疫苗製備物在，，Vaccine Design-the subunit and adjuvantapproach"Powell, Μ. F.禾口 Newman,Μ· J.編輯；1995, PharmaceuticalBiotechnology (Plenum Press, New York and London, ISBN0-306-44867-X)中一般性描述。
本發明由下面的實施例舉例說明但不限於下面的實施例。實施例1，材料與方法血清學使用HBs (Hep 286)作為包被抗原，通過ELISA進行抗HBs抗體的定量。每孔加入 50 μ 1抗原和抗體溶液。抗原在PBS中稀釋到1 μ g/ml的最終濃度，並於4°C下吸附到96孔 微量滴定板(Maxisorblmmuno-plate，Nunc. Denmark)的孔過夜。然後將所述板在37°C下用 含牛血清白蛋白和0. TWEEN 20的PBS (飽和緩衝液；100 μ 1/孔)溫育1小時。在 HBs包被的板中加入用飽和緩衝液成倍稀釋的血清(從100倍稀釋度開始)，並在37°C下 溫育1小時30分鐘。所述板用PBS0. 1% TffEEN 20洗四次，每孔加入在飽和緩衝液中稀釋 為1/1000的生物素偶聯抗小鼠IgGl、IgG2a、IgG2b或Ig(Amersham，UK)，並在37°C下溫育 1小時30分鐘。在衝洗步驟後，加入在飽和緩衝液中稀釋為1/5000的鏈黴抗生物素-生物 素醯化過氧化物酶複合物(Amersham，UK)，並繼續在37°C下溫育30分鐘。如上洗板，並在 鄰苯二胺(Sigma)O. 04% H2O2 0. 03% 的 0. 1% TffEEN 20，0. 05M 檸檬酸鹽緩衝液 pH 4. 5 中 溫育20分鐘。用2N H2SO4終止反應並在490/630nm讀數。採用SoftmaxPro (使用四參數 方程)根據對照計算ELISA滴度並表示為EU/ml。T細胞擴增第二次免疫後兩周，處死小鼠，無菌操作取出脾置於池中。在含有2mM L-穀氨醯 胺，抗生素，5xl(T5 M 2-巰基乙醇以及同系正常小鼠血清的RPMI 1640培養基(GIBCO) 中製備細胞懸浮液。脾細胞在含有不同濃度(10-0. 03 μ g/ml)HBs抗原的圓底96孔板的 200 μ 1中培養到2χ106細胞/ml的最終濃度。每個測試進行四個平行實驗。在5% 0)2下37°0 培養 96 小時後，用 3H-胸苷(Amersham, UK,5Ci/mmol)以 0. 5 μ Ci/孔脈衝輸送(pulse) 18 小時，然後用細胞收集器收集在Unifilter板(Packard)上。在閃爍計數器(Topcount， Packard)中測量結合的放射性。結果以cpm表示(四個復孔的平均cpm)或表示為刺激數 (stimulation indice)(帶有抗原的細胞培養物的平均cpm/沒有抗原的細胞培養物的平 均 cpm)ο細胞因子產生第二次免疫後兩周，處死小鼠，無菌操作取出脾置於池中(每組3池)。在含有2mM L-穀氨醯胺，抗生素，5x10_5M 2-巰基乙醇以及5%胎牛血清的RPMI 1640培養基(GIBCO) 中製備細胞懸浮液。脾細胞在含有不同濃度(10-0. 1 μ g/ml) HBs抗原的平底24孔板的Iml 中培養到5x IO6細胞/ml的最終濃度。96小時後收集上清液並凍存，直到通過ELISA測 試IFN γ和IL-5的存在。IFN Y 的產生使用Genzyme的試劑，通過ELISA進行IFN γ的定量。每孔加入50 μ 1樣品和 抗體溶液。4°C下用50 μ 1在碳酸鹽緩衝液pH 9. 5中稀釋為1. 5 μ g/ml的倉鼠抗小鼠IFN Y包被96孔微量滴定板(Maxisorblmmuno-plate，Nunc，Denmark)過夜。然後將所述板在 37°C下用100μ 1含牛血清白蛋白和0. 1% TffEEN 20的PBS (飽和緩衝液)溫育1小時。 在抗IFN γ包被的板中，加入得自體外刺激的上清液在飽和緩衝液中的兩倍稀釋液(開 始於1/2)，並在37°C下溫育1小時30分鐘。所述板用PBS 0. 1% TWEEN(洗滌緩衝液)洗 四次，每個孔中加入在飽和緩衝液中稀釋到最終濃度0. 5μ g/ml的生物素偶聯山羊抗小鼠IFN γ，並在37°C下溫育1小時。在洗滌步驟後，加入在飽和緩衝液中稀釋為1/10000的 AMDEX偶聯物(Amersham)，在37°C下溫育30分鐘。如上洗板，並用50 μ ITMB(Biorad)溫 育10分鐘。用0. 4Ν H2SO4終止反應並在450/630nm讀數。使用標準曲線(小鼠IFN γ標 準)通過S0ftmaXPr0(四參數方程)計算濃度並表示為pg/ml。IL-5 的產生使用Pharmingen的試劑，通過ELISA進行IL-5的定量。每孔加入50 μ 1樣品和抗 體溶液。4°C下用50μ1在碳酸鹽緩衝液ρΗ 9. 5中稀釋為1 μ g/ml的大鼠抗小鼠IL-5包 被96孔微量滴定板(Maxisorblmmuno-plate，Nunc，Denmark)過夜。然後將所述板在37°C 下用100μ 1含牛血清白蛋白和0. 1% TWEEN 20的PBS (飽和緩衝液)溫育1小時。在 抗IFN γ包被的板中，加入得自體外刺激的上清液在飽和緩衝液中的兩倍稀釋液(開始於 1/2)，並在37°C下溫育1小時30分鐘。所述板用PBS TffEEN 0. 1% (洗滌緩衝液)洗四次， 每個孔中加入在飽和緩衝液中稀釋到最終濃度1 μ g/ml的生物素偶聯大鼠抗小鼠IL-5，並 在37°C下溫育1小時。在洗滌步驟後，加入在飽和緩衝液中稀釋為1/10000的AMDEX偶聯 物(Amersham)，在37°C下溫育30分鐘。如上洗板，並用50 μ ITMB(Biorad)溫育15分鐘。 用0. 4Ν H2SO4終止反應並在450/630nm讀數。使用標準曲線(重組小鼠IL-5標準)通過 SoftmaxPro (四參數方程)計算濃度並表示為pg/ml。實施例2，小鼠中的免疫原性研究為測試MPL在不含抗原的固體顆粒載體上的作用原理(concept)，使用HABMPL疫 苗的不同配製順序在Balb/C小鼠中進行免疫原性研究表1，疫苗組方 配製方法描述組1，在先技術的配製方法。抗原首先吸附於金屬鹽上，隨後加入游離3D-MPL，導 致3D-MPL吸附於抗原所吸附的同一金屬鹽顆粒。組2和組3，本發明的配製方法。3D-MPL吸附於一種金屬鹽顆粒上，抗原吸附於分 離的金屬鹽顆粒，隨後將預吸附的複合物混合。免疫計劃用基於HAB的製劑(1/10人類劑量，即HAV 72ELU，HBs 2 μ g, MPL 5 μ g)以4周 間隔皮下免疫各組二次，每組10隻小鼠。在第二次免疫後14天，用HBs和HAV體外再刺激 脾細胞後，分析淋巴組織增生反應以及細胞因子產生(IL5/IFN y)0在第35天從眶後竇 (retroorbital sinus)取血，通過ELISA監測對HBs和HAV的抗體反應以及同種型分布型 誘導(isotypic profile induced)(僅 HBs)。結果通過ELISA測定體液反應(Ig和同種型)，使用HBs作為包被抗原測量針對HBV的 體液反應，使用Behring試劑盒測量針對HAV的體液反應。僅分析第二次免疫後14天的 取血。


圖1顯示了在個體血清上測量的抗HBs Ig抗體反應並表示為GMT。圖2顯示了由對匯集的血清分析計算出的同種型重新分布(IgGl、IgG2a和 IgG2b)。在組1和新型製劑(組2和組3)之間沒有觀察到在抗體滴度上的差異。此外，新 型製劑(組2和組3)刺激的IgGl和IgG2a/b同種型比例與由在先技術的製劑(組1)刺 激的IgGl和IgG2a/b同種型比例相似。細胞介導的免疫反應在第二次免疫後14天，在用HBs或HA抗原體外再刺激脾細胞後，測定細胞介導的 免疫反應(淋巴組織增生和IFN Y/IL-5產生)。對於每組小鼠，處死5隻動物並收集脾以 用於體外測試。圖3顯示了在用HBs再刺激的脾細胞中監測到的淋巴組織增生。圖4顯示了在用HBs再刺激的脾細胞中監測到的細胞因子產生。在各製劑之間未能觀察到淋巴組織增生反應的差異。此外，在所有組中觀察到強烈的IFN-Y (+/-1000pg/ml)反應，在各組間未觀察到 IL-5產生的差異(低於60pg/ml)。結論在各HABMPL配製順序之間未觀察到對HBsAg的體液免疫反應及細胞介導的免疫
反應的顯著差異。實施例3，豚鼠的HSV接種前面的實施例證實了新型製劑及方法關於肝炎抗原的功效。本實施例研究經典方 法與本發明的方法相比，用明礬和3D-MPL配製的單純皰疹病毒gD疫苗的免疫原性及保護 功效。用HSV豚鼠陰道內保護模型比較這兩種疫苗。 實驗方法在第0天和第28天兩次免疫各組，每組12隻雌性Hartley豚鼠。在第57天，陰 道內用105pfu HSV2MS株(100 μ 1)攻擊動物。攻擊之後，從第4天到第12天每日監測動 物初次疾病(primary disease)的臨床徵兆。第二次免疫後，在第14天和第28天從眶後 竇取血，並通過ELISA監測抗gD抗體反應(IgG)。配製方法依照WO 92/16231中描述的技術產生來自HSV2的gD2t。3D-MPL購自Ribi ImmunoChem Inc. ,Montana, USA0 々1(0!1)3購自 Superfos。在第一次注射前 15 天製備製劑。 所有溫育在室溫及攪拌的條件下完成。
組4基於Al (OH) 3的製劑(250 μ 1/劑量)經典途徑在加入MPL(12. 5yg)之前，使 gD2t(5yg)吸附於 125yg Al (OH)3 上 15 分鐘。 三十分鐘後，用10倍濃縮的PBS PH 7.4溶液緩衝所述製劑。15分鐘後，加入500 μ g/ml苯 氧基乙醇作為防腐劑。H2CHAl (OH) 3+Ag_15 分鐘-MPL-30 分鐘-10xPBSpH7. 4-15 分鐘-2 苯氧基組5基於Al (OH)3的製劑(250 μ 1/劑量)新途徑使gD2t (5 μ g)吸附100 μ g Al (OH) 315分鐘，並作為濃縮的單批(monobulk)貯存 起來。在另一方面，將MPL(12.5yg)吸附到25 μ gAl (OH)3上30分鐘，並作為另一濃縮單 批貯存起來。為進行最後的配製，將吸附的gD2t稀釋於H2O以及10倍濃縮的PBS pH 7.4。 十五分鐘後，在加入苯氧基乙醇作為防腐劑前，加入吸附的MPL。Al (OH) 3+AgAl (OH) 3+MPLH2O+IOxPBS pH 7. 4+ 加入 gD2t_15 分鐘-加入 MPL-15 分鐘-2 苯氧基樣品定量使用gD 43B318作為包被抗原，通過ELISA進行抗gD抗體的定量。每孔加入50 μ 1 抗原和抗體溶液。抗原在PBS中稀釋到1 μ g/ml的最終濃度，並於4°C下吸附到96孔微量 滴定板(Maxisorblmmuno-plate，Nunc. Denmark)的孔過夜。然後將所述板在37°C下用含
牛血清白蛋白和0. 1% TffEEN 20的PBS(飽和緩衝液)溫育1小時。在gD包被的板中 加入血清在飽和緩衝液中的兩倍稀釋液，並在37°C下溫育1小時30分鐘。所述板用PBS 0.1% TffEEN 20洗四次，每孔加入在飽和緩衝液中稀釋為1/10000的生物素偶聯抗豚鼠 IgG(Amersham,UK)，並在37°C下溫育1小時30分鐘。在衝洗步驟後，加入在飽和緩衝液中 稀釋為1/1000的鏈黴抗生物素-生物素醯化過氧化物酶複合物(AmershamjK)，並繼續在 37°C下溫育30分鐘。如上洗板，並在鄰苯二胺(Sigma)O. 04% H2O2 0. 03%的0. 1% TffEEN 200. 05M檸檬酸鹽緩衝液pH 4. 5中溫育20分鐘。用2N H2SO4終止反應，並在490/630nm讀 數。由參考通過SoflmaxPro (使用四參數方程)計算ELISA滴度並表示為EU/ml。統計分析使用UNISTAT對血清學數據進行統計分析適用於單因素方差分析的方法可以簡要描述如下1)對數據進行對數轉化。2)對每個群體(組)進行Kolmogorov Smirnov檢驗以檢驗其正態性 (normality)。3)進行Hartley和Cochran檢驗以檢驗不同群體(組)間方差齊性。4)選定數據的方差分析第二次免疫後14天或第二次免疫後28天的數據。結果血清學圖5，顯示了在第二次免疫後對各個血清測量的抗gD IgG抗體反應。在第二次免疫後14天(17090-18508EU/ml GMT)或第二次免疫後28天 (10227-11965EU/ml GMT)，在兩組製劑間沒有觀察到抗體滴度的顯著差異。由數據的對數 轉化後的兩個時間點，分別對兩種疫苗製劑引起的抗gD IgG滴度進行單向因素方差分析。在兩種製劑間沒有檢測到統計學上的顯著差異(對於第二次免疫後14天和第二次免疫後 28天的數據，ρ值分別等於0. 7397和0. 5078)。防護疾病在攻擊後4到12天，通過比較在已接種和未處理的動物中的幾個參數，評估對初 次疾病的防護 有和沒有病變(陰道或外部)動物的百分率。 如下計算每組的初次感染指數(PI)Σ (計數最大值X以％表示的發生率)。 表達為中值的病變計數總數(第4天到第12天)以及具有病變的動物數目(N)。 在第4天和第12天之間，對每組計算的平均累積數計算。表2病變參數的總結
16 *注射後第4天到第12天病變計數的總數(未考慮沒有病變的動物)。病變計數 無病變(0)，陰道病變(0. 5或1)，外部皮膚水泡(2、4、8或16)。
圖6顯示了 HSV攻擊後的累積損傷(lesion)計數曲線。高百分率的免疫後動物沒有出現任何病變(66%到83%)或陰道病變。與此相比， 89%的對照組動物顯示有外部病變。在免疫的動物觀察到初次感染指數的強烈降低(97%到99% )。這伴隨著與未處 理組相比(中值=28)，記錄到接種組的病變程度非常輕(中值=0. 5或1)。如累積計數曲線顯示，兩個組(4和5)都獲得非常好並且相當水平的對初次疾病 的防護。結論比較了用於疫苗HSV疫苗製劑的舊方法和新方法。在IgG滴度或在對初次疾病的 防護上，在兩種方法之間沒有觀察到統計學上的顯著差異。實施例4，小鼠的HPV接種就人乳頭瘤病毒E7抗原和3D-MPL引起抗原特異性體液反應的能力，比較了它 們的不同配製順序(基於Al (OH)3或AlPO4)。對於在同一載體上混合吸附3D-MPL和蛋白 D1/3-E7的製劑(途徑1)以及其中3D-MPL單獨吸附於不含抗原的載體的製劑(途徑2)， 獲得了相當的Ig滴度。依照WO 99/10375的程序製備蛋白D 1/3 E7。所述抗原和MPL制 劑是基於Al (OH) 3的和基於AlPO4的。抗原和3D-MPL順序吸附到同一鋁鹽顆粒上(途徑1)，或在混合前分別吸附(途徑 2)。使用下面製劑免疫各組，每組10隻小鼠(描述於材料與方法)Mτ ε(HO) IV 咭糊勒 Za ε/Τ Q^ojj S ng(Τ 揚票)ε(HO) IV 糊勒 IdW k 丄3 ε/Τ a^ojj S ng(C Sfi) IdW 明'OdIV 士糊勒導卷'ε(Η0) IV 士糊勒 ε/Τ Q^ojd S η S'OdIVzac/τ Q^OJJ S ng(T Sfi)'OdIV 糊勒 IdW k 丄3 ε/Τ a^ojj S ng(c )IdW rn ￡(HO) IV ^min^ ^Odivi^^za ε/τ sng箱ε (ho)τν-za ε/ia^ojjIdWZz (ho) IV -za ε/ia^ojj(idw/'odiv) ε (ho)τν-za ε/ia^ojj'odiv-za ε/ia^ojjidw/'odiv-za ε/τ q^ojj(idw/' (ho) iv) /'odiv-za ε/ia^o^dV0^a ε/ia^o^dOOσιO 1~I-I-H -I-HCM -I-HCO -I-H
通過肌肉內途徑以21天間隔兩次免疫小鼠。在第35天(第二次免疫後14天) 收集血清並分析E7特異性抗體的存在(見材料與方法)。在第一次注射前5天製備製劑。 所有溫育在室溫攪拌的條件下完成。I.基於Al的製劑(50 μ 1/劑量)經典途徑(途徑1)在加入MPL (5 μ g)之前，使 PDl/3E7(5y g)吸附 50 μ g Al(OH)3 或 A1P0430 分鐘。 三十分鐘後，用10倍濃縮的P04，NaCl PH 6. 8溶液緩衝所述製劑。15分鐘後，加入50 μ g/ ml硫柳汞作為防腐劑。H20+Al+Ag-30 分鐘-MPL-30 分鐘 _10xPNpH6. 8-15 分鐘-ThioII.基於Al的製劑(50 μ 1/劑量)新途徑(途徑2)使PDl/3E7(5y g)吸附10 μ g Al (OH) 3或A1P0430分鐘，並作為濃縮的單批貯存起 來。在另一方面，使MPL (5 μ g)吸附20 μ g Al (OH)3或々斤0430分鐘，並作為另一濃縮單批 貯存起來。為進行最後的配製，在加入吸附的MPL和剩餘Al (20 μ g)之前，將吸附的抗原稀 釋於H2O和10倍濃縮的P04，NaCl pH 6. 8的溶液中。十三(thirteen)分鐘後，加入50yg/ ml硫柳汞作為防腐劑。Al+AgAl+MPLH2O+IOxPN pH6. 8+ 加入 PD1/3E7+ 加入 MPL+A1-30 分鐘-Thio血清學使用E7 (Bollen)作為包被抗原，通過ELISA進行抗E7抗體的定量。每孔加入 50 μ 1抗原和抗體溶液。抗原在碳酸鹽緩衝液ρΗ9. 5中稀釋到3 μ g/ml的最終濃度，並於 4°C下吸附到96孔微量滴定板(Maxisorb Immuno-plate, Nunc. Denmark)的孔過夜。然後將 所述板在37°C下用含牛血清白蛋白和0. 1% TffEEN 20的PBS(飽和緩衝液)溫育1小 時。在E7包被的板中加入血清在飽和緩衝液中的兩倍稀釋液(開始於1/100稀釋液)，並 在37°C下溫育1小時30分鐘。所述板用PBS 0. 1 % TffEEN 20洗3次，在每孔中加入在飽和 緩衝液中稀釋為1/5000的生物素偶聯抗小鼠(IgGl、IgG2a或IgG2b或)IgGtot (Amersham， UK)，並在37°C下溫育1小時30分鐘。在衝洗步驟後，加入在飽和緩衝液中稀釋為1/5000的 鏈黴抗生物素_生物素醯化過氧化物酶複合物(AmershanuUK)，並繼續在37°C下溫育30分 鍾。如上洗板，並用TMB (四甲基聯苯胺)溫育10分鐘。用4N H2SO4終止反應，並在450nm 讀數。通過SoftmaxPro (使用四參數方程)計算中點稀釋度。結果通過ELISA對匯集的血清測量的抗E7Ig滴度以EU/ml表示，如下所示 當比較基於Al (OH)3的製劑或基於AlPO4的製劑時，獲得相當的滴度。與Al製劑獲 得的滴度5，000EU/ml相比，當把MPL加入Al (OH) 3或AlPO4製劑時，滴度達到高於10，000EU/ ml。使用兩種配製順序獲得相當的滴度。關於抗原和MPL誘導抗原特異性抗體產生的能力，比較了配製的各種順序(基於
20Al (OH) 3 或 AlPO4) 所有包含MPL的製劑都誘導比明礬製劑更高水平的E7特異性Ig。使用MPL和 PD1/3-E7混合吸附於同一載體上的製劑(途徑1)和其中MPL單獨吸附於不含抗原的載體 上的製劑(途徑2)，獲得了相當的Ig滴度。
圖1顯示了對各個血清測量的抗HBs Ig抗體反應並表示為GMT。
圖2顯示了由對匯集血清的分析計算出的同種型重新分布(IgGl、IgG2a和IgG2b)。
圖3顯示了在用HBs再刺激脾細胞後監測到的淋巴組織增生。
圖4顯示了在用HBs再刺激脾細胞後監測到的細胞因子產量。
圖5顯示了抗HSV gD滴度(見實施例3)。
圖6顯示了平均累積HSV損傷計數(見實施例3)。
權利要求
包含吸附於金屬鹽顆粒上的免疫刺激劑的佐劑組合物，其特徵在於所述金屬鹽顆粒基本不含其它抗原。
2.權利要求1要求保護的佐劑組合物，其中所述金屬鹽顆粒是鋁鹽、鋅鹽、鈣鹽、鈰鹽、 鉻鹽、鐵鹽或鈹鹽。
3.權利要求1或2要求保護的佐劑組合物，其中所述金屬鹽是磷酸鹽或氫氧化物。
4.權利要求1到3中任一項要求保護的佐劑組合物，其中所述金屬鹽是氫氧化鋁或磷酸鋁。
5.權利要求1到4中任一項要求保護的佐劑組合物，其中所述免疫刺激劑是單磷醯脂 質A。
6.權利要求5要求保護的佐劑組合物，其中所述單磷醯脂質A衍生物是3-脫氧醯化單 磷醯脂質A。
7.權利要求1到4中任一項要求保護的佐劑組合物，其中所述免疫刺激劑是QS21。
8.權利要求1到4中任一項要求保護的佐劑組合物，其中所述免疫刺激劑是包含寡核 苷酸的CpG。
9.生產疫苗組合物的方法，該方法包括將權利要求1描述的佐劑組合物與抗原混合。
10.權利要求9要求保護的生產疫苗組合物的方法，其特徵在於所述抗原吸附於金屬 鹽顆粒上。
11.權利要求9或10中任一項要求保護的方法，其中所述抗原選自衍生自人免疫缺 損病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、1型單純皰疹病毒、2型單純皰疹病毒、人巨細胞病毒、登革病 毒、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎或戊型肝炎、呼吸道合胞病毒、人乳頭瘤病毒、流感病毒、 Hib、腦膜炎病毒、沙門氏菌屬、奈瑟氏菌屬、疏螺旋體屬、衣原體屬、博德特氏菌屬、瘧原蟲 屬或弓形蟲屬的抗原、Ig E肽、Der pi、花粉相關抗原；或腫瘤相關抗原(TMA)、MAGE、BAGE、 GAGE、MUC-I、Her-2neu、LnRH (GnRH)、CEA、PSA、KSA 或 PRAME。
12.包含兩組主要複合物的疫苗組合物，第一組複合物包含(a)吸附於一種金屬鹽顆 粒上的免疫刺激劑，其特徵在於所述金屬鹽顆粒基本不含抗原；第二組複合物包含(b)吸 附於一種金屬鹽顆粒上的抗原。
13.包含兩組主要複合物的疫苗組合物，第一組複合物包含(a)吸附於一種金屬鹽顆 粒上的免疫刺激劑，其特徵在於所述金屬鹽顆粒基本不含抗原；第二組複合物包含(b)吸 附於一種金屬鹽顆粒上的抗原，特徵在於所述金屬鹽顆粒基本不含單磷醯脂質A或其衍生 物。
14.權利要求12或13要求保護的疫苗組合物，其中在所述第一組複合物和所述第二組 複合物中存在的金屬鹽是相同的。
15.權利要求12到14中任一項要求保護的疫苗組合物，其中所述第二組複合物包含多 種亞複合物，每種亞複合物包含吸附於金屬顆粒上的不同抗原。
16.權利要求12到15中任一項要求保護的疫苗組合物，其中所述金屬鹽是鋁鹽、鋅鹽、 鈣鹽、鈰鹽、鉻鹽、鐵鹽或鈹鹽。
17.權利要求16要求保護的疫苗組合物，其中所述金屬鹽是磷酸鹽或氫氧化物。
18.權利要求17要求保護的疫苗組合物，其中所述金屬鹽是氫氧化鋁或磷酸鋁。
19.權利要求12到18中任一項要求保護的疫苗組合物，其中所述免疫刺激劑是3-脫氧醯化單磷醯脂質A。
20.權利要求12到18中任一項要求保護的疫苗組合物，其中所述免疫刺激劑是QS21。
21.權利要求12到18中任一項要求保護的疫苗組合物，其中所述免疫刺激劑是CpG。
22.權利要求12到21中任一項要求保護的疫苗組合物，其中所述抗原選自人免疫 缺損病毒、水痘_帶狀皰疹病毒、I型單純皰疹病毒、2型單純皰疹病毒、人巨細胞病毒、登 革病毒、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎或戊型肝炎、呼吸道合胞病毒、人乳頭瘤病毒、流感 病毒、Hib、腦膜炎病毒、沙門氏菌屬、奈瑟氏菌屬、疏螺旋體屬、衣原體屬、博德特氏菌屬、瘧 原蟲屬或弓形蟲屬、stanworth十肽、Derpl、花粉相關抗原；或癌症相關抗原、MAGE、BAGE, GAGE、MUC-U Her-2neu, LnRH(GnRH)、CEA, PSA、酪氨酸酶、Survivin、KSA、或 PRAME。
23.權利要求22要求保護的疫苗組合物，其中所述抗原是A型肝炎抗原和B型肝炎抗 原的組合。
24.權利要求22要求保護的疫苗組合物，其中所述瘧原蟲抗原是選自以下的一種或多 種抗原RTS、S和TRAP。
25.權利要求22要求保護的疫苗組合物，應用於藥物(medicine)。
26.權利要求22要求保護的疫苗組合物的用途，用於生產病毒感染、細菌感染、寄生蟲 感染、變態反應或癌症的免疫治療性藥物。
27.治療患有病原體感染或癌症或變態反應或對這類疾病易感的哺乳動物的方法，包 括給予安全有效量的依照權利要求22的疫苗組合物。
28.包括兩個容器的試劑盒，其中一個容器盛有吸附到金屬鹽上的單磷醯脂質A或其 衍生物；第二個容器盛有吸附到金屬鹽上的抗原。
全文摘要
佐劑系統及疫苗。本發明提供疫苗以及包含免疫刺激劑和金屬鹽的佐劑製劑。所述免疫刺激劑吸附於金屬鹽顆粒上，得到的顆粒基本不含抗原。
文檔編號A61P37/04GK101926993SQ20091017316
公開日2010年12月29日 申請日期1999年10月8日 優先權日1998年10月16日
發明者N·加康 申請人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司