一種中國番茄黃曲葉病毒衛星的組成型表達啟動子的製作方法

2023-04-24 01:12:26 1

專利名稱：一種中國番茄黃曲葉病毒衛星的組成型表達啟動子的製作方法
技術領域：
本發明涉及ー種中國番茄黃曲葉病毒衛星的組成型表達啟動子。具體地說，本發明涉及中國番茄黃曲葉病毒beta衛星分子的PClORF缺失啟動子、全長啟動子和串聯啟動子序列的分離。本發明也涉及含有連接異源基因的中國番茄黃曲葉病毒beta衛星的β ClORF缺失啟動子、全長啟動子和串聯啟動子的載體盒的構建。另外，本發明也涉及利用含有中國番茄黃曲葉病毒beta衛星的β ClORF各種 啟動子的表達載體進行瞬間表達和穩定表達的方法。
背景技術：
植物基因工程的目的是將外源基因導入受體植物後使其正確而有效地表達，而啟動子對外源基因的表達水平影響很大，是基因工程表達載體的重要元件。人們可根據需要選擇或人工構建合適的啟動子來研究新基因的功能，闡明生物體的生長發育及其他生命周期的過程與機理，目前已有許多不同來源的啟動子被用於植物品質改良基因工程、抗病育種基因工程以及植物生物反應器等基因工程領域。這些啟動子中一大類是從根瘤農桿菌中分離出來，另一大類為植物本身來源的啟動子。相比上述啟動子控制的目標基因表達量往往較低，或者與受體植物細胞基因組序列具有一定的同源性的劣勢，植物病毒啟動子在植物遺傳轉化中有著不可或缺的優勢。已經鑑定的植物病毒啟動子，主要包括組成型表達啟動子和組織特異性表達啟動子。組成型啟動子能夠驅動外源基因在植物不同組織或器官以及不同的發育階段持續和穩定的表達，不表現時空特異性，也不受外界因素的誘導。其中花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子在雙子葉植物基因表達中被廣泛應用，它具有多種順式作用元件，利用CaMV 35S核心啟動子與CaMV 35S啟動子的5』端不同區段和菸草花葉病毒(TMV)的5』非轉錄區(omega序列)相連，發現該啟動子可驅動報告基因在雙子葉植物菸草和單子葉植物水稻中均高效表達。有研究表明利用CaMV 35S啟動子的串聯重複序列作為啟動子元件能較大幅度地提高啟動子活性，而進ー步的研究表明啟動子元件或片段的重複雖然能夠提高其表達活性，但啟動子的表達模式不會改變。因此，通過對啟動子進行改造有可能提聞啟動子驅動外源基因表達的能力，從而為外源基因聞效表達載體的構建及應用打下良好基礎。雙生病毒是世界範圍內廣泛存在的ー類具有孿生顆粒形態的植物單鏈DNA病毒。beta衛星是與某些單組份雙生病毒相伴隨的ー類分子，該分子大小約1.3 kb,是其輔助病毒基因組的一半左右。beta衛星分子依賴於其輔助病毒進行DNA複製、移動和包裡。其基因組中除了存在一個富含腺嘌呤的區域(A-rich region)和一個衛星保守區(SCR)タト,還存在ー個大小、位置和胺基酸序列上高度保守的β C10RF，現已證實其與致病性緊密相關，它的缺失並不影響beta衛星的複製，並且已有實驗表明beta衛星可以作為病毒誘導的基因沉默載體進行遺傳操作。已鑑定來源於中國番茄黃曲葉病毒YlO分離物相伴隨的beta衛星分子的啟動子為韌皮部特異性表達的啟動子，而本研究中來源於中國番茄黃曲葉病毒Y25分離物相伴隨的beta衛星分子和上述beta衛星分子同源性達78. 7%，屬於同一衛星分子的不同分離物，但是兩者在致病表型上卻有比較大的差異，推測該beta衛星的啟動子在表達類型上也有別於上述beta衛星的啟動子，有可能為植物基因表達提供ー些有價值的表達元件，並為兩類beta衛星分子不同致病性機理的研究打下良好的分子生物學方面的基礎。因此，本發明的開展既可以通過了解決定致病相關蛋白PCl的啟動子的活性，有助於了解雙生病毒致病性和侵染的機理，並且可以為不同目的的植物基因工程提供合適類型的啟動子，為植物基因工程的迅速做出一定貢獻。已知PClORF啟動子是影響病毒衛星載體表達效率的重要因素，而該啟動子的表達類型也決定了其在植物遺傳轉化中的應用價值，本發明分析了中國番茄黃曲葉病毒Υ25分離物相伴隨的beta衛星分子中β ClORF的缺失啟動子、全長啟動子和串聯啟動子的表達活性以及全長啟動子的表達類型。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供ー種中國番茄黃曲葉病毒衛星的組成型表達啟動子。
中國番爺黃曲葉病毒衛星的組成型表達啟動子所述啟動子DNA序列為中國番爺黃曲葉病毒beta衛星分子的PClORF的缺失啟動子SEQ ID NO: I、全長啟動子SEQ ID NO:2或串聯啟動子SEQ ID NO:3所示DNA序列。DNA構建體包括權利要求I所示的中國番茄黃曲葉病毒beta衛星分子的β ClORF的缺失啟動子SEQ ID NO: I、全長啟動子SEQ ID NO:2或串聯啟動子SEQ ID NO:3，以及與之進行可操作連接的有效基因，其中所述有效基因包括殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因。利用植物細胞表達殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因的方法包括如下步驟(a)以可表達的方式將殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因連接到中國番茄黃曲葉病毒beta衛星分子的PClORF的缺失啟動子SEQ IDNO: I、全長啟動子SEQ ID NO:2或串聯啟動子SEQ ID NO:3所述的啟動子DNA序列下遊以獲得重組DNA片段；(b)將該重組DNA片段插入植物表達載體中；(c)用上述重組表達載體轉化植物細胞；(d)培養該植物細胞表達殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因。利用植物細胞製備蛋白質的方法包括如下步驟(a)以可表達的方式將編碼所需蛋白質的DNA連接到中國番茄黃曲葉病毒beta衛星分子的PClORF的缺失啟動子SEQ ID NO: I、全長啟動子SEQ ID NO:2或串聯啟動子SEQID NO: 3所述的啟動子DNA序列下遊，獲得重組DNA片段；(b)將重組DNA片段插入表達載體中，獲得重組表達載體；(C)重組表達載體經農桿菌或基因槍法轉化植物細胞，培養轉化的植物細胞以表達所需的蛋白質；(d)從培養物中回收所需的蛋白質。表達載體含有中國番茄黃曲葉病毒beta衛星分子的β ClORF的缺失啟動子SEQID NO: I、全長啟動子SEQ ID NO: 2或串聯啟動子SEQ ID NO: 3所述的啟動子DNA序列，其中所述載體是適用於植物細胞的質粒載體、噬菌體或病毒，所述載體能夠插入殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因。本發明與現有技術相比具有的有益效果I)應用本發明中的啟動子，在植物抗病基因工程中可以實現有效的抗病目的。組成型啟動子與組織特異性啟動子相比，它能持續高效地表達目的基因，能有效控制病蟲害在整個植株中蔓延，使植物各類組織細胞都得到保護。組織化學染色法結果表明，本發明中的全長啟動子在轉基因植株根、莖、葉的皮層細胞、葉肉細胞以及維管組織的韌皮部、木質部中都能夠表達(如圖5)。組成型表達的強啟動子，通常會導致外源基因在植株體內的過量表達，從而對植株生長發育產生負面影響。儘管本發明中中國番茄黃曲葉病毒beta衛星分子的串聯啟動子活性明顯強於全長啟動子以及缺失啟動子的活性，但與強組成型表達啟動子CaMV 35S啟動子相比，串聯啟動子的活性僅是它的58. 62%，所以該啟動子驅動的外源 基因的表達量對植株生長發育產生的影響較小。鑑於文獻報導已掲示啟動子的串聯重複不會改變其表達模式，綜合本發明中啟動子的組成型表達和非過量表達外源基因的優點，應用於植物抗病基因工程中能夠達到經濟有效的抗病目的。2)應用本發明中的組成型表達啟動子，可以高效表達外源基因，増加外源蛋白的產量。組成型表達的啟動子在植物的所有組織中以及生長發育的所有階段都能啟動基因表達，不表現時空特異性；RNA和蛋白質表達量也是相對恆定的。如果要生產某種目的蛋白，應用組成型表達的啟動子其蛋白表達量明顯高於組織特異性啟動子。3)應用本發明中的啟動子，可以有效進行植物轉基因工程。植物基因工程中使用的植物來源的啟動子由於與受體植物基因組具有一定的同源性，往往會在寄主植物體內引起基因沉默現象而造成外源基因失活。這種現象在多基因轉化時更為普遍。而本發明中的啟動子，由幹與植物基因組序列沒有同源性，所以能夠避免基因沉默現象的發生。此外，大量研究表明，侵染雙子葉植物的病毒來源的啟動子可有效地應用於單子葉植物的遺傳轉化。本發明中的啟動子來源於侵染雙子葉植物的病毒衛星分子，開發該啟動子應用於多種作物(包括禾穀類)的基因轉化，應用前景將會十分廣闊。


圖I是中國番茄黃曲葉病毒beta衛星分子的PClORF啟動子的結構圖。以β ClORF的翻譯起始位點(ATG)為+1位；其中SCR代表衛星保守區，A-rich代表富含腺嘌呤的區域；圖2是啟動子表達載體構建圖。克隆後的啟動子片段分別經限制性內切酶HindIII/BamH I雙酶切後插入表達載體pINT121同酶切位點，構建成啟動子表達載體；圖3是對照表達載體構建圖。表達載體PINT121經限制性內切酶BamHI/EcoR I雙酶切後產生的⑶S-NOS片段與BamH I/EcoR I雙酶切後的pBINPLUS載體片段連接，構建成表達載體pBINGUS，其中pINT121用於陽性對照，pBINGUS用於陰性對照；圖4是各啟動子的瞬時表達⑶S活性分析。A，各啟動子的多次重複⑶S活性；B，各啟動子的相對平均GUS活性。A，B中pBINGUS為陰性對照，pINT121為陽性對照，η代表每個啟動子的獨立實驗重複次數。通過統計軟體SAS 8. O中的多重比較方法ANOVA中的LSD檢驗對實驗數據進行差異顯著性分析(p〈0. 05or P<0. 01)，誤差線代表標準差；圖5是全長啟動子982 (a-g)及陽性對照pINT121 (h)的轉基因染色圖片。(a)根部橫切面；(b)莖橫切面；(c和e)根部；(d)葉橫切面；(f)葉片背面；(g)整株植物小苗；(h)陽性對照植物小苗。c,皮質；x,木質部；pm,柵欄組織；sm,海綿組織；vb,維管束；svb,次級維管束。
具體實施例方式中國番爺黃曲葉病韋衛星的組成型表達啟動子DNA序列為中國番爺黃曲葉病韋beta衛星分子的PClORF的缺失啟動子SEQ ID NO: I、全長啟動子SEQ IDNO: 2或串聯啟動子SEQ ID NO:3所示DNA序列。DNA構建體包括權利要求I所示的中國番茄黃曲葉病毒beta衛星分子的β ClORF的缺失啟動子SEQ ID NO: I、全長啟動子SEQ ID NO:2或串聯啟動子SEQ ID NO:3，以及與之進行可操作連接的有效基因，其中所述有效基因包括殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真 菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因。利用植物細胞表達殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因的方法包括如下步驟(a)以可表達的方式將殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因連接到中國番茄黃曲葉病毒beta衛星分子的PClORF的缺失啟動子SEQ IDNO: I、全長啟動子SEQ ID NO: 2或串聯啟動子SEQ ID NO: 3所述的啟動子DNA序列下遊以獲得重組DNA片段；(b)將該重組DNA片段插入植物表達載體中；(c)用上述重組表達載體轉化植物細胞；(d)培養該植物細胞表達殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因。利用植物細胞製備蛋白質的方法包括如下步驟(a)以可表達的方式將編碼所需蛋白質的DNA連接到中國番茄黃曲葉病毒beta衛星分子的PClORF的缺失啟動子SEQ ID NO: I、全長啟動子SEQ ID NO:2或串聯啟動子SEQID NO: 3所述的啟動子DNA序列下遊，獲得重組DNA片段；(b)將重組DNA片段插入表達載體中，獲得重組表達載體；(c)重組表達載體經農桿菌或基因槍法轉化植物細胞，培養轉化的植物細胞以表達所需的蛋白質；(d)從培養物中回收所需的蛋白質。表達載體含有中國番茄黃曲葉病毒beta衛星分子的β ClORF的缺失啟動子SEQID NO: I、全長啟動子SEQ ID NO: 2或串聯啟動子SEQ ID NO: 3所述的啟動子DNA序列，其中所述載體是適用於植物細胞的質粒載體、噬菌體或病毒，所述載體能夠插入殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因。本發明提出的對轉化菸草植株的基因表達產物進行檢測，以評價啟動子的表達強度，並且分析啟動子在植物體內表達的組織化學定位，使用了許多對本領域技術人員來說非常熟知的技術，其中包括用於GUS酶活性分析的螢光分光光度法，用於組織化學分析的半薄切片法等技木。本發明描述了能組成型表達的病毒衛星啟動子，它是與中國番茄黃曲葉病毒Y25分離物相伴隨的beta衛星分子(GenBank登錄號AJ421619. 2)的PClORF啟動子。本發明中以感染有中國番茄黃曲葉病毒Y25分離物的番茄植物總DNA為模板，克隆並鑑定了中國番茄黃曲葉病毒相伴隨的beta衛星分子的PClORF缺失啟動子、全長啟動子以及串聯啟動子，序列表顯示了各啟動子的序列。中 國番茄黃曲葉病毒相伴隨的beta衛星的i3C10RF全長啟動子的全部天然序列有982個鹼基對(啟動子的序列為SEQ ID NO: 2)，根據beta衛星分子基因組的結構特徵，對全長啟動子進行缺失。缺失啟動子982 Λ 776的特徵是缺失全長啟動子中-207至-982的片段(啟動子的序列為SEQ ID NO: I)，串聯啟動子982 X 2的特徵是全長啟動子串聯重複片段(啟動子的序列為SEQ ID NO:3)，在啟動子的活性分析中發現，這兩個突變啟動子仍保留了啟動子活性(圖4)。本發明描述了植物細胞中基因產物表達的方法。將已克隆的啟動子與葡萄糖醛酸酶基因(GUS)融合構建植物表達載體，通過農桿菌浸潤法使GUS基因在菸草植物細胞中進行瞬間表達；將構建後的植物表達載體通過葉盤法轉入菸草細胞中，使GUS基因在菸草細胞中進行穩定表達。本發明還描述了植物細胞中GUS活性的鑑定和檢測方法。在植物細胞的瞬間表達體系中，通過螢光光度分析來檢測其表達活性。本發明中將全長啟動子的表達載體982通過葉盤法轉入菸草植株中，GUS組織化學染色後通過藍色位點的表達部位進ー步鑑定其上遊啟動子的表達類型。結果表明，PClORF全長啟動子982能夠驅動⑶S基因在轉基因植株根、莖、葉等器官中組成型表達。本發明中的中國番茄黃曲葉病毒beta衛星的β ClORF全長啟動子可組成型表達所需要的任何異源基因。異源基因的例子包括殺蟲毒素基因，除草劑抗性基因，抗真菌基因，抗細菌基因或抗病毒基因。本發明中將含有中國番茄黃曲葉病毒beta衛星的i3C10RF啟動子和異源基因的構建體插入到ー種載體中，用該載體轉化植物細胞，優選的載體對於植物而言可以是ー種農桿菌Ti質粒衍生物，該質粒衍生物通過農桿菌介導的雙元載體技術導入植物細胞，這種技術是本領域內所熟知的。將已轉化植物細胞培養於ー種合適培養基中，並再生出植株。本發明包括來自於中國番茄黃曲葉病毒beta衛星的β ClORF缺失啟動子、全長啟動子和串聯啟動子DNA序列以及含有以上序列的DNA構建體。同時，本發明還包括是中國番茄黃曲葉病毒beta衛星的β ClORF啟動子的「功能等同物」的DNA序列，以及含有有效連接到異源基因上的這樣的DNA序列的構建體。本發明還包括使用如本文所述的PClORF啟動子的「功能等同物」賦予處於它們控制下的任何基因的組成型表達。本發明中使用的術語「啟動子活性」是指當以該基因的可表達方式將有效基因連接到啟動子的下遊，並導入到宿主(植物細胞)中，該宿主顯示具有在宿主內或宿主外生產該有效基因產物的功能。通常是將容易定性、定量檢測的蛋白質編碼基因(報告基因)連接至啟動子的下遊，然後將構建後的基因導入宿主內，檢測表達蛋白情況，以此來確定是否存在特定啟動子的活性以及其效カ如何。「缺失啟動子」是指任何有缺失而仍具有啟動子活性的中國番茄黃曲葉病毒beta衛星的PClORF啟動子。「串聯啟動子」是指兩個全長啟動子串聯並具有啟動子活性的中國番茄黃曲葉病毒beta衛星的PClORF啟動子。「功能等同物」是指在嚴格雜交條件下與ー個DNA序列互補的任何DNA序列，該序列與該參照物雜交並且有類似於中國番茄黃曲葉病毒beta衛星的β ClORF啟動子的活性。採用下面的非限制性實施例對本發明作進ー步描述。實施例I中國番茄黃曲葉病毒beta衛星的β ClORF啟動子片段的克隆以及序列測定
基本上按照Sambrook 等所述方法(Molecular Cloning: A LaboratoryManual,しold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory, NY,1989)實施分子技術。以感染中國番茄黃曲葉病毒的番茄植株為材料，用CTAB法提取植物總 DNA[Stewart et al.，BioTechniques, 1993，14:748-749]。預擴增的各啟動子片段見圖I。以植物總DNA為模板，通過特異性引物擴增中國番茄黃曲葉病毒beta衛星的β C10RF 的各啟動子片段。引物 Fl (5』AAGCTTACACCTCTATTAGCCATAATAATC 3』，相應於 SEQID NO: I 中的 1-24 位，引入了 Hind III 位點)和 RL (5，GGATCCGTTTTATGCTGTGGATTATAC3』，相應於SEQ ID NO: I中的206-186位，引入了 BamH I位點)擴增缺失啟動子(SEQ IDNO: I) ο 引物 FL (5，AAGCTTATACGTATGCATACGTATTC 3』，相應於 SEQ ID N0:2 中的 1-20位，引入了 Hind III 位點)和 RL (5，GGATCCGTTTTATGCTGTGGATTATAC 3』，相應於 SEQ IDN0:2中的962-982位，引入了 BamH I位點)擴增全長啟動子(SEQID N0:2)。引物F2(5，GGATCCATACGTATGCATACGTATTC 3』，相應於 SEQID NO: 3 中的 983-1008 位，引入了 BamHI 位點)和 RL (5，GGATCCGTTTTATGCTGTGGATTATAC 3』，相應於 SEQ ID NO:3 中的 1950-1970位，引入了 BamH I位點)擴增串聯啟動子(SEQ ID NO:3)中的後半部分序列。擴增後的PCR 產物經 Hind III/BamH I (對於 SEQ ID NO: I 和 SEQ ID N0:2)或 BamH I (對於 SEQIDNO: 3)直接酶切後經QIAGEN凝膠純化試劑盒回收目的片段，用Sanger雙脫氧鏈終止法測序驗證後用於載體構建。實施例2啟動子表達載體及⑶S融合表達載體的構建用限制性酶Hind III/BamH I酶切消化雙元表達載體pINT121 (該載體的構建見Liu等發表的論文，即Planta，2003，216:824-833)。將酶切後的缺失啟動子、全長啟動子片段插入對應的同酶切位點，構建為啟動子表達載體(圖2):缺失啟動子為ρβα-982Λ776，全長啟動子為pPCl-982。將BamH I酶切SEQ ID NO: 3部分序列插入相應酶切消化過的P β Cト982，即為串聯啟動子P β Cト982X2。用BamH I和EcoR I雙酶切表達載體ρΙΝΤ121，切割下的⑶S-N0S片段插入到表達載體pBINPLUS (該載體的構建見van Engelen等發表的論文，即TransgenicResearch, 1995，4:288-290)的 BamH I/EcoR I 位點中，構建後的載體為 pBINGUS (圖 3)，該載體作為陰性對照，載體PINT121作為陽性對照。實施例3農桿菌轉化將各啟動子構建物通過電擊法導入農桿菌宿主細胞參照文獻[Mattanovichetal. , Nucleic Acids Research, 1989，17:6747],具體方法如下:28°C, 200rpm條件下培養根癌土壤桿菌16h左右，用I. 5mL離心管取I. 5mL菌液，8000rpm離心30s後去殘液，將沉澱用ImL ddH20充分懸浮，再8000rpm離心30s，重複以上步驟3次。去掉殘液後將沉澱用200 μ LddH20懸浮，即為電擊用農桿菌感受態。取200ng重組質粒至200 μ L感受態，輕打混勻，然後轉移至電擊杯中，置冰上。裝好電擊裝置，電壓為2500V，按住電擊按鈕，直到啪的一聲即電擊完畢。室溫靜止2min後加入800 μ LYEP培養基(10g/L酵母膏，10g/L蛋白腖，5g/L氯化鈉)，28°C靜置lh，然後28°C 200rpm振蕩培養2h。取200 μ L菌液，分別塗布於含有卡那黴素(50 μ g/mL)和利福平(50 μ g/mL)抗生素的固體YEP培養基平板。28°C培養2天後，用特異性引物對其進行PCR鑑定，篩選陽性克隆。實施例4啟動子的瞬間表達I)農桿菌的培養及誘導參照文獻[Kapila et al. , PlantScience, 1997，122:101-108]將含有各啟動子表達載體的農桿菌菌液接種於含相應抗生素的液體YEP培養基中，培養至對數生長期，離心收集菌體，重懸於MMA溶液(IOmmol/L2-(N-嗎啉)-こ基磺酸(MES，pH 5. 6)、100 μ mol/Lこ醯丁香酮、10mmol/L氯化鎂)，並調整菌液濃度使其0D_=1. 5，室溫靜置放置3h。 2)瞬間表達參照文獻[劉兆明等，生物工程學報，2002，18卷4期411-414; Yanget al. , The Plant Journal, 2000，22:543-551]對植株葉片採取農桿菌浸潤法。具體方法選取6-7周齡本氏煙植株中部未完全展開的葉片,取一支ImL的一次性注射器,摘掉針頭，用針管靠壓カ將500 μ L重懸菌液完全注入每片葉片的脈間細胞中。將農桿菌浸潤和農桿菌注射後的植株於25°C恆溫室中培養，光照周期為16/8h。60-72h後取樣進行⑶S螢光活性分析。實施例5⑶S檢測螢光光度測定法參照文獻[Jefferson et al. , The EMBOJournal, 1987，6:3901-3907]將採樣後的植株葉片經液氮研磨，加入3倍體積的⑶S提取液(50mmol/L 憐酸緩衝液 pH 7. 0,10mmol/I,こニ胺四こ酸ニ鈉，0. l%(w/v)TritonX-100,
0.l%(w/v)十二烷基肌氨酸鈉，10mmol/L β -巰基こ醇)，離心後取上清10 μ L與4-MUG(4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸)反應，螢光光度儀測定GUS活性。如圖4，A為各個啟動子構建物多次重複後(重複次數不小於6)測得的GUS活性，B為各啟動子構建物的平均表達活性。實驗數據通過SAS8. O軟體的多次重複比較ANOVA的LSD方法進行分析，以陽性對照ΡΙΝΤ121的35S啟動子活性為參照，結果表明缺失啟動子982 Δ 776的活性是35S啟動子活性的18. 76%，全長啟動子982的活性是35S啟動子活性的44. 01%,串聯啟動子982X2的活性是35S啟動子活性的58. 62%。而且缺失啟動子982 Λ 776，全長啟動子982及串聯啟動子982 X 2與陽性對照PINT121的啟動子活性之間均存在極顯著性差異(Ρ〈0. OI)，具體數據見表I。表I
權利要求
1.ー種中國番茄黃曲葉病毒衛星的組成型表達啟動子，其特徵在於所述啟動子DNA序列為中國番茄黃曲葉病毒beta衛星分子的PCI ORF的缺失啟動子SEQ ID NO: I、全長啟動子SEQ ID NO: 2或串聯啟動子SEQ ID NO: 3所示DNA序列。
2.—種DNA構建體，其特徵在於包括權利要求I所示的中國番茄黃曲葉病毒beta衛星分子的PCI ORF的缺失啟動子SEQ ID NO: I、全長啟動子SEQ ID NO: 2或串聯啟動子SEQ ID NO: 3，以及與之進行可操作連接的有效基因，其中所述有效基因包括殺蟲劑基因、除
3.ー種利用植物細胞表達殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因的方法，其特徵在於包括如下步驟 (a)以可表達的方式將殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因連接到中國番茄黃曲葉病毒beta衛星分子的PCI ORF的缺失啟動子SEQ ID NO:I、全長啟動子SEQ ID NO: 2或串聯啟動子SEQ ID NO: 3所述的啟動子DNA序列下遊以獲 得重組DNA片段； (b)將該重組DNA片段插入植物表達載體中； (c)用上述重組表達載體轉化植物細胞； (d)培養該植物細胞表達殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因。
4.ー種利用植物細胞製備蛋白質的方法，其特徵在於包括如下步驟 (a)以可表達的方式將編碼所需蛋白質的DNA連接到中國番茄黃曲葉病毒beta衛星分子的PCI ORF的缺失啟動子SEQ ID NO: I、全長啟動子SEQ ID NO: 2或串聯啟動子SEQID NO: 3所述的啟動子DNA序列下遊，獲得重組DNA片段； (b)將重組DNA片段插入表達載體中，獲得重組表達載體； (C)重組表達載體經農桿菌或基因槍法轉化植物細胞，培養轉化的植物細胞以表達所需的蛋白質； (d)從培養物中回收所需的蛋白質。
5.—種表達載體,其特徵在於含有中國番爺黃曲葉病毒beta衛星分子的PCI ORF的缺失啟動子SEQ ID NO: I、全長啟動子SEQ ID NO: 2或串聯啟動子SEQ ID NO: 3所述的啟動子DNA序列，其中所述載體是適用於植物細胞的質粒載體、噬菌體或病毒，所述載體能夠插入殺蟲劑基因、除草劑抗性基因、抗真菌基因、抗細菌基因或抗病毒基因。
全文摘要
本發明公開了一種中國番茄黃曲葉病毒衛星的組成型表達啟動子。該啟動子來自於中國番茄黃曲葉病毒相伴隨的beta衛星分子。分離的啟動子是該beta衛星分子的βC1ORF的部分缺失啟動子、全長啟動子及串聯啟動子序列。實驗表明來自於中國番茄黃曲葉病毒beta衛星分子的βC1ORF的啟動子為組成型表達的啟動子。本發明涉及了中國番茄黃曲葉病毒beta衛星分子的βC1ORF的缺失啟動子、全長啟動子和串聯啟動子序列以及含有該βC1ORF缺失啟動子、全長啟動子和串聯啟動子序列的表達盒。本發明中的啟動子可應用於植物抗病毒基因工程及植物轉基因工程。
文檔編號C12N15/82GK102732521SQ20121019784
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月13日 優先權日2012年6月13日
發明者吳建祥, 周雪平, 張潔, 錢亞娟 申請人:浙江大學