尿多酸肽組合物的製備方法

2023-05-06 04:44:31

專利名稱：尿多酸肽組合物的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種尿多酸肽組合物、尿多酸肽組合物的製備方法以及尿多酸肽組合物在治療及防止癌症復發方面的用途，屬於藥物領域。
惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的常見病，其發病率和死亡率都很高。可以說是目前人類死亡的主要殺手之一，尤其是晚期惡性腫瘤患者一般已失去手術、化療、放療等機會。傳統的四大療法各有利弊，但往往難以從根本上解決問題，因而，治癒或部分治癒惡性腫瘤，減少患者的痛苦，延長生存期，改善生活質量，在臨床上是一個十分棘手的難題，故癌症疾患的攻克和治療是各國醫學界都十分關注的課題。
目前臨床上繼手術、化療、放療、免疫療法後，有人又提出一種誘導惡性腫瘤細胞向正常細胞分化的治療方法，一般稱為細胞分化療法。其主要機理為人惡性腫瘤細胞異常甲基轉移複合酶活性升高，是可能導致腫瘤細胞不斷分裂的重要原因之一，從本質上說，甲基轉移複合酶的異常阻斷了癌細胞的分化，從而使癌細胞不斷地分裂，如能有效地抑制該酶的活性才能誘導腫瘤細胞走向正常分化。
既然異常甲基轉移複合酶是癌症的核心問題，那麼消除這些異常酶之後，癌細胞應該可以象正常細胞那樣被誘導進行分化而變成不再分裂的終末細胞。我們的實驗顯示癌細胞的rRNA甲基轉移酶對類似寡腺嘌呤核苷酸的寡聚核苷酸特別敏感，但是正常酶對這類的抑制劑毫無反應，這是因為正常和異常的甲基轉移複合酶有很顯著的差異，我們可以利用這種差異來尋求有選擇性的抗癌藥物，這種藥物通常被稱為分化誘導劑。寡腺嘌呤核苷酸是一個很理想的分化誘導劑，事實上目前廣泛應用的分化誘導劑如幹擾素，維甲酸，維生素D3，六甲撐二乙醯胺(HMBA)，二甲基亞碸(DMSO)和佛波脂(phorbol ester)大都是通過誘導寡腺嘌呤核苷酸來促成癌細胞的終末分化；由於癌細胞必需具有很多這些分化誘導劑的受體才能達到分化的目的，這類分化誘導劑能夠影響到的癌細胞範圍很小。具有很多受體的幾乎都是一些特例，如毛細胞白血症細胞有很多幹擾素受體，急性早幼粒白血病細胞有很多維甲酸和維生素D3受體，六甲撐二乙醯胺最能產生作用的是紅白血病細胞等等，但是寡腺嘌呤核苷酸本身因為構造特殊不容易被細胞吸收，不能作為藥物。
研究發現尿中含有類似寡腺嘌呤核苷酸功能的化合物，可以將異常的甲基轉移複合酶改變成為正常酶，這種製劑因為沒有受體的限制，所以對多種癌細胞都能夠誘導分化，並促進癌細胞走向正常分化或使癌細胞凋亡，通常認為尿提取物中的有色肽為分化誘導劑(US4470970)。
Liau，M．C．在J．Exptl．Clin．Chemother．59-17，1992中公開了丁酸和苯甲酸可以作為分化幫助劑，單獨或與分化誘導劑共用，用於癌症的治療；US5783605中公開了以合成的N-烷基苯乙醯胺、苯甲酸酯類和吲哚乙酸作為分化幫助劑，用於治療癌症。
US4470970中公開了一種可以從尿中提取、也可以合成的新型抗癌藥物--抗瘤酮A10，其結構為3-苯乙醯氨基-2，6-哌啶雙酮，具有抗多種癌症的作用；通常認為抗瘤酮A10具有抑制人體過多排洩體內抗癌物質--低分子量代謝物的作用；實驗證明抗瘤酮A10注射劑是其開環產物，以苯乙醯穀氨醯胺和苯乙醯異谷醯胺鈉鹽的形式存在，見Hendry L．B．「DrugsExptl Clin．Res，1987，Suppl．171」。
事實上尿和尿的提取物的醫學用途被國內外人們所認識已有幾個世紀了，公元後二世紀希臘人Xenokrates用尿治療癌症(見Turner，F．C．Effects of extracts of human urine on tumorsin mice．U．S．Public Health Service，1855，1939)；Floydc．Tumer在1939年發現從尿中產生的生長抑制物質能防止小鼠腫瘤的形成(Fleming，R．F．，Peczenik．O．Alkalinephosphatase and tumor inhibition．Nature，162，338，1948)；英國和德國對人尿中提取的未知結構物名為H-11的多肽研究(見Fleming，R．，Walters，C．L，Williams，J．L．The effectof adrenal and urinary extracts on malignant tissue．Acta．Un．Inter．can．，7，456，1951．Walters，C．L．A competitive alkaline phosphatase inhibitor from extracts ofnormal male urine．Enzymologia，20，33，1958．Von Klose，G．Chemotherapie in derNachbehandlung von Geschwulstkrankheiten．Schleswig-Holstenisches Artztenblatt，442，1962．)，在早期臨床研究中有16例不宜手術的肺癌患者通過注射該提取物治療，觀察到多數病人症狀緩解、延長生命且無明顯的副作用；1968年Klose和Below闡明在更長期的治療方案中用該提取物治療49例不宜手術的肺癌患者，取得良好效果(見Klose，G．BelowR．verlaufsbeobachtungen bei Kranken mit inoperablen Lungentumoren bei Behandlungmitkombinierter interner Therapie (alkylierend Substanz und korpereigenesPolypeptid)．Krebsarzt，24，1，1969)；Burzynski(Von Burzynski，S．R．，Stolzmann，Z．，Szopa，B．et al．Antineplaston A in cancer therapy(I) physiol．Chem．Phys．，9，485，1977)用人尿提取的抗癌物抗瘤酮A10來醫治晚期癌症病人21個，靜滴給藥有顯著的抗腫瘤作用且無任何毒性，目前正在二期臨床，據美國NCI報告，如按FDA規定的臨床方案，該藥的三期臨床治療non-Hodgkins淋巴瘤患者可能會取得抗腫瘤的預期效果(佐野鎌太郎，消滅癌症，世茂出版社，臺北，臺灣，1997226)，山東醫科大學學報1998，264中公開了抗瘤酮A10的初步抑瘤實驗，當給藥量為1500mg／kg時，對S180的抑制率為28％。
由此可見，尿的提取物是一類很有前途的治療癌症的藥物，但是現有技術只是公開了尿提取物的某一組份或某些組份及其作用，在提取尿液中的有效成分時，通常由於吸附劑的不同、淋洗液及流速不同，得到的產物及收率不同，後處理時採用的工藝和方法不同，也直接影響產品的組成、性質、產率和治療效果，如現有技術中，一般產率較低，而且將提取物濃縮過濾後不再進行處理直接用於藥物製劑，由於尿提取物中可能含有各種病毒，直接應用，對人體存在不可預見的潛在危險；並且現有技術中對於組合物的提取、成分和結構的研究及其在治療癌症方面的作用亦沒有詳細的報導。
本發明的目的在於彌補現有技術的不足，從人尿中提取有效成分，提供一種治療和預防癌症的藥物組合物----尿多酸肽組合物。
本發明的另一個目的是確定尿多酸肽組合物的組成。
本發明的另一個目的是確定尿多酸肽組合物各個主要成分的含量。
本發明的另一個目的是公開一種製備治療和預防癌症的藥物組合物-尿多酸肽組合物及中間體的製備方法。
本發明的再一個目的是公開尿多酸肽組合物在治療和預防癌症復發方面的用途。
為了完成上述任務，本發明採用的技術方案如下1．製備尿多酸肽組合物將新鮮尿酸化，使PH小於等於3，以保證其穩定並易於提取；過濾除去酸化尿中直徑大於20微米的大顆粒；超濾除去酸化尿中分子量較大的有機物質，用乙醇浸泡吸附劑後，用醇和去離子水分別洗滌吸附劑，裝吸附柱，以一定的流速將超濾後的酸化尿加入吸附柱內，用吸附劑吸附濾液中的有效成分；酸化尿中有大量的無機鹽離子和有機物，在進入吸附劑後未被吸附的積存於柱內，用軟水洗滌未被吸附但殘留在吸附劑中的無機物及親水性有機物，純化有效成分；用醇洗脫吸附在矽膠柱上的有效成分；收集有色流出液，濃縮後，用鹼調整PH至中性，控制PH為6．0-8．5，低溫靜置析出濃縮過程中形成的聚合物，經過濾除去結晶及膠體雜質，得到尿多酸肽組合物中間體。
上述中間體經冷凍乾燥，可以得到乾燥的尿多酸肽組合物，該原料藥可以製成口服膠囊，或經過稀釋、除病毒等純化及包裝製成口服液或注射液。
以蒸餾水20L溶解乾燥殘留物，即得尿多酸肽粗品溶液；將粗品在低溫庫中放置；取靜置處理後的粗品上層液，在100000級潔淨室內，用微孔濾紙過濾，收集濾液，即得尿多酸肽溶液；用一萬分子量的超濾膜超濾，以除去熱源，再經PALL公司Ultipor VFTMDV50除病毒過濾器過濾除病毒，細胞內毒素檢測至合格，整個製備工藝見附

圖1。
上述原料尿的酸化可以用鹽酸、硫酸以及適合本發明的其他酸。
原料尿酸化時，控制酸化尿的PH為小於等於3，優選小於等於2，最優選1．0-1．8；酸化尿超濾的壓力為1-5Mpa。
超濾除去酸化尿中分子量大於10000或大於9000的有機物質。
相對於20公斤原料尿，吸附劑的用量為5-20公斤；上述吸附劑可以選用C18柱、XAD-7、XAD-8或XAD-16以及適合本發明的其他吸附劑，優選C18柱和XAD-7，最優選XAD-7；浸泡吸附劑的醇的用量為15-25升，浸泡時間為5-20分鐘；洗滌吸附劑的醇和去離子水的用量為15-25升；酸化尿加入分離柱的流速為0．1-2L／min；洗脫液蒸餾水的用量為5-30L，洗脫速度為0．1-3L／min；洗脫液醇的用量為5-20L，洗脫速度為0．1-3L／min；上述洗脫可以使用乙醇、甲醇、丙醇以及適合本發明的其他醇類，優選甲醇；上述除溶劑可以使用減壓蒸餾、膜技術以及適合本發明的其它方法；減壓蒸餾時，物料的溫度控制在30-80℃；調整PH值時，可以用氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉以及適合本發明的其他鹼，優選氫氧化鈉；濃縮液的PH值調整為6．0-8．5，優選PH7．0-8．0，最優選PH7．2-7．8；用鹼調整PH至中性的過程，可以在流出液濃縮後乾燥之前，也可以在濃縮液乾燥再稀釋後。
上述在低溫庫中放置；取靜置處理後的粗品上層液，在100000級潔淨室內，用微孔濾紙過濾，收集濾液，即得尿多酸肽溶液；用一萬分子量的超濾膜超濾，以除去熱源，再經PALL公司Ultipor VFTMDV50除病毒過濾器過濾除病毒的過程，可以在流出液濃縮後乾燥之前，也可以在濃縮液乾燥再稀釋後進行。上述在低溫庫的溫度控制在0-10℃；放置時間為80-160小時。
上述乾燥可以用冷凍乾燥，也可以用減壓或常壓乾燥，優選冷凍。
整個過程的收率為原料尿的0．2-4．0％。經上述方法製備的尿多酸肽組合物可以直接用於製備各種劑型的藥物。
2．尿多酸肽組合物的分離和鑑定將尿多酸肽幹品稀釋，用高效液相色譜法對採用上述方法製備的尿多酸肽組合物進行分離，並測定其組成，發現從健康人尿中提取的藥物組合物含有四種有機酸，分別是馬尿酸、苯乙醯穀氨醯胺、苯乙酸和吲哚乙酸，以及一系列多相性小分子肽，還含有較多的無機鹽，根據其組成，我們稱之為尿多酸肽組合物。主要包括①按照常規方法檢測本發明方法製備的尿多酸肽組合物的化常數，包括外觀、不溶性微粒含量、PH值、固體總重量、熾灼殘渣、含氮量等；②確認本發明藥物組合物中所含的有機酸；③測定有機酸含量以馬尿酸，苯乙醯穀氨醯胺、苯乙酸、吲哚乙酸的純品為參照標樣，並且對每一種有機酸進行了定量分析，四種有機酸的含量分別為馬尿酸4．17-7．94mg／ml；苯乙醯穀氨醯胺4．87-10．86mg／ml；苯乙酸0．66-4．5mg／ml；吲哚乙酸0．11-0．28mg／ml；尿多酸肽組合物中四種有機酸的總含量為26．34-57．65％；④測定肽含量採用HPLC，Waters公司專一分析柱PICO·TAGTM分別測定藥物組合物的水解總胺基酸與游離胺基酸，從而計算出肽胺基酸的含量(水解總胺基酸總量與游離胺基酸含量之差值)，獲知小分子肽胺基酸的含量約為7．7-10．9mg／m；⑤測定分子量用HPSEC法測定本發明尿多酸肽組合物液的分子量分布，採用美國Sigma公司多肽與小分子蛋白分子量標準品；獲知三個主要峰的分子量分別為7000-9200，4000-5800，1000-2100；尿多酸肽溶液樣品的分子量最大為9200，所含多肽的分子量均小於10000道爾頓，確定其所含多肽的分子量小於1萬；由此可見，該品中肽基本以小分子肽的形式存在。
⑥測定尿多酸肽組合物中肽的成分，經用HPLC排阻層析法，凝膠柱Protein60分離並檢測本發明尿多酸肽組合物的肽成分，得到一系列的肽峰(見附圖28-30)，數量為12-15個。其中有二個十分明顯的主峰，特徵峰之一的保留時間為6．805-7．493，三批相對百分含量分別為15．89％、16．16％、16．27％、．16．56％、17．56，即15．89-17．56；而另一個特徵峰保留時間的均值為7．722-8．824，三批相對百分含量分別為18．68％、19．27％、19．61％、19．19％、19．98％，即18．68-19．19；⑦測定無機元素的含量採用原子吸收分光光度法測定無機元素的含量，獲知尿多酸肽中含有Ca、Mg、Fe、Zn、Mn、Cu、Cr、Co、Na、K等無機離子，總含量為5103-6126μg／ml。
⑧含氮量按中國藥典1995年版附錄Ⅶ D半微量法檢驗，測得含氮量不低於2．0mg／ml。
此外，尿多酸肽組合物中還含有微量的尿紅素和維生素B2。
3．尿多酸肽組合物的藥理及毒理用在體和離體試驗方法，對多種瘤株細胞或他們所致的病理模型，進行了多方位的試驗研究，結果如下在體試驗在體試驗表明本發明的藥物組合物溶液劑量在100-1000mg／kg時，對裸鼠或經免疫抑制的昆明種小鼠接種人腫瘤細胞的動物模型的腫瘤有明顯抑制生長作用，抑瘤率均在30％以上，其中對經免疫抑制的昆明種小鼠，腎囊膜下接種的急性早幼粒白血病HL-60細胞有顯著的生長抑制作用，劑量在640mg／kg時，抑制率達64％以上，並且HL-60細胞形態上呈現明顯分化現象，癌組織中出現大量中晚幼粒及成熟細胞。600mg／kg時，對裸鼠肝包膜下接種的高轉移性人肝癌LCI-D20裸鼠模型，有一定的抑制腫瘤生長作用，抑瘤率約43％；並可大大減少移植性肝癌的腹腔轉移，尤以高劑量(1800mg／kg)更為顯著。分子生物學研究表明本發明尿多酸肽組合物溶液(1200-1800mg／kg)對上述LCI-D20肝癌組織中與增殖分化相關的原癌基因c-myc，N-ras，c-jun和c-fos的表達有非常明顯的下調作用(P＜0．01)；並能有效地下調反映腫瘤侵襲和轉移能力的指標MMP9基因的mRNA轉錄(P＜0．05)。腫瘤在生長和轉移過程中有粘附分子表達的改變，整合素β1亞基是一類重要的異型粘附分子，介導異種細胞間的粘附，參與細胞的信息傳導，本發明尿多酸肽組合物溶液(1200-1800mg／kg)可使整合素β1亞基的量下降(P＜0．05)；E-鈣粘素是同型粘附分子，參與同種細胞間的粘附，腫瘤轉移時原灶的E-鈣粘素表達會有明顯減少，而本發明尿多酸肽組合物溶液1800mg／kg治療後，可增加組織中E-鈣粘素含量(P＜0．05)，且上述作用均與5-FU有協同作用。本發明尿多酸肽組合物溶液劑量為100-400mg／kg時，對裸鼠接種人肝癌細胞株(Smmu7721)有一定的抑制作用，抑瘤率為51．8-83．5％。劑量為1000mg／kg時能抑制小鼠(前臂皮下接種HCP肝癌細胞)肝癌實體瘤的生長，抑制率達34％。裸鼠肝包膜接種高轉移性肝癌LCI-D20瘤塊後，早期肝癌組於16天切除肝癌，晚期肝癌組於22天切除肝癌，皮下注射本發明尿多酸肽組合物溶液960mg／kg，早、晚期肝癌切除後肝臟切緣處局部復發腫瘤直徑均非常小於對照組(P＜0．01)，肝內和累及臟器轉移灶數目也明顯減少(P＜0．05)，表明對LCI-D20裸鼠肝癌高轉移模型，早期和晚期肝癌切除術後的轉移和復發有一定的防治作用。
離體試驗本發明尿多酸肽組合物溶液對體外培養的癌細胞有生長抑制、分化誘導作用。其中對人急性早幼粒白血病HL-60細胞作生長曲線和細胞形態學研究，發現有生長抑制作用，藥物作用6天後，呈量效關係，IC50為0．18mg／mL；劑量為1．2mg／mL時作用7天後，NBT細胞還原陽性百分率增多，大於50％的細胞由早幼粒向中晚期幼粒方向分化(而未用藥組分化率＜3％)，即細胞核縮小，偏向一邊，核漿比例減少，出現腎型核，顯示細胞已向晚幼粒成熟方向分化。濃度為5mg／mL以上可抑制MHCC97高轉移人肝癌細胞株的浸潤性；15mg／mL以上能抑制MHCC97對纖維連接蛋白的粘附能力，而該粘附是癌細胞侵襲的始動步驟。濃度為1mg／mL時，能明顯抑制人骨髓血癌細胞(HL-60)的生長，並能抑制該細胞中端粒酶的活性。以上均表明本發明尿多酸肽組合物溶液可能是一種細胞分化劑。對人肝癌細胞Smmu7721有抑制作用，其IC50及95％可信限為0．78mg／mL(0．72-0．83mg／mL)。對人肺癌細胞AGZY-83A的生長有抑制作用，呈量效關係，濃度為2．5mg／mL時抑制率約30％左右。
上述實驗結果與對比文獻提供的數據相比，抗癌活性明顯提高。
具體實驗內容如下①尿多酸肽組合物對人急性早幼粒白血病細胞(HL-60)離體和在體生長抑制以及誘導分化作用以臺盼蘭排染法觀察尿多酸肽組合物注射液對體外培養的HL-60細胞的生長抑制作用，並尋找其誘導細胞分化的濃度，以分化濃度的注射液尿多酸肽組合物注射液作用HL-60細胞7天後，再用Giemsa染色鏡檢。發現，＞50％的HL-60細胞由早幼粒向晚期幼粒方向分化，細胞的NBT還原反應陽性率明顯增多。分化的程度與藥物劑量有一定依賴性。
以腎囊膜下接種法進行體內試驗，將體外培養的HL-60細胞接種於經免疫抑制的昆明種小鼠腎囊膜下，腹腔注射尿多酸肽組合物注射液。試驗結果顯示，尿多酸肽組合物注射液對接種於小鼠腎囊膜下的HL-60細胞有顯著的生長抑制作用，劑量在640mg／kg時，抑制率達64％以上。
②本發明尿多酸肽組合物抗人原發性肝細胞肝癌生長和轉移的作用。
用裸鼠以瘤塊肝包膜下接種的方法，製備高轉移性人肝癌裸鼠模型LCI-D20。接種後10天隨機分為4組，(對照組；尿多酸肽組合物低、中、高劑量組)。第11天腹腔注射給藥，連續給藥20天後處死，剝離腫瘤稱重，計算抑瘤率，並觀察腹腔轉移情況。
應用RT-PCR方法，半定量研究與肝癌相關的癌基因c-myc，N-ras，c-fos和c-jun的基因表達以及與侵襲相關的基質金屬蛋白酶MMP-9的基因表達。應用Western印跡及斑點免疫印跡法，檢測整合素β1和E-鈣粘素的表達。應用免疫組織化學的方法對肝癌組織的增殖性細胞核抗原PCNA Ki67及E-鈣粘素的表達進行半定量觀察。
應用與上述模型同源的MHCC97高轉移肝癌細胞株，觀察本發明尿多酸肽組合物溶液對MHCC97粘附、侵潤和移動的抑制作用。試驗結果表明a．600-1800mg／kg的本發明尿多酸肽組合物溶液，對裸鼠肝包膜下接種的高轉移性人肝癌裸鼠模型LCI-D20，有一定的抑瘤作用，抑瘤率約43％。
b．本發明尿多酸肽組合物高劑量組能抑制肝癌的腹腔轉移，未發現轉移結節，腫瘤呈單個生長。
c．分子生物學研究表明，高劑量本發明尿多酸肽組合物溶液對上述肝癌組織中原癌基因c-myc，N-ras，c-jun和c-fos的表達有明顯的下調作用(P＜0．01)。中劑量(M組)本發明尿多酸肽組合物僅能減少N-ras的表達(P＜0．05)。本發明尿多酸肽組合物能有效地下調MMP9基因的mRNA的轉錄。
d．本發明尿多酸肽組合物溶液使整合素β1亞基下降，且與5-FU有協同作用；使E-鈣粘素表達增加。且兩者均有統計學意義。
e．細胞學實驗結果表明，本發明尿多酸肽組合物在15mg／ml以上的劑量範圍內能抑制MHCC97高轉移細胞株對纖維連接蛋白的粘附能力。在5mg／ml濃度以上可抑制MHCC97細胞株的浸潤能力，但對該細胞的運動無作用。
結論在高轉移性原發性肝癌LCI-D20中，本發明尿多酸肽組合物溶液對實體瘤的生長有明顯抑制作用。在高劑量(1800mg／kg)作用時能減少腹腔內轉移，大多數腫瘤呈單個生長(6／8)。分子生物學研究表明，本發明尿多酸肽組合物處理能下調c-myc、N-ras、c-fos和c-jun基因的表達，能明顯增加粘附分子E-鈣粘素的表達，部分抑制整合素β1亞基的表達。
③尿多酸肽組合物注射液離體試驗對人類血癌細胞的生長和端粒酶活性的抑制離體試驗表明本發明尿多酸肽組合物溶液對人骨髓血癌細胞(HL-60)有抑制作用並呈量效關係；並且對該細胞中端粒酶的活性有抑制作用，效果隨時間的延長而加強。故認為本發明尿多酸肽組合物溶液可能有促進細胞分化的作用。
④尿多酸肽組合物注射液離體和在體對人肝癌Smmu的藥效研究離體試驗證明本發明尿多酸肽組合物溶液對人肝癌細胞Smmu7721有抑制作用，其IC50及95％可信限為0．78mg／ml(0．72-0．83mg／ml)。在體試驗表明，本發明尿多酸肽組合物溶液劑量為100-400mg／kg時，對裸鼠接種人肝癌細胞株的抑瘤率在51．8-83．5％，具有一定的抑制腫瘤生長的作用。
⑤尿多酸肽組合物注射液離體對肺癌細胞，在體對腹水性肝癌、肝癌實體瘤以及肺癌實體瘤的影響為了觀察本發明尿多酸肽組合物溶液的抗腫瘤藥效，進行了如下4項試驗。離體試驗分為7組陰性(模擬處理)對照組；受試藥物5個濃度組；陽性(絲裂黴素)對照組。在體試驗都分為5組陰性對照組；受試藥物低、中、高三個劑量組；陽性對照組。①離體抗腫瘤作用試驗將AGZY-83A細胞在5％CO2培養箱中培養，表明受試藥物對人肺癌細胞的生長有抑制作用，且呈現量效關係。②在體延長腹水型肝癌動物生存期作用的試驗小鼠腹腔內接種HCP肝癌細胞，受試藥物能改善動物生活質量，在一定劑量時能延長動物生存期(延長率24％左右)。③在體對抗動物肝癌實體瘤作用的試驗小鼠前臂皮下接種HCP肝癌細胞，受試藥物能改善動物生活質量，在3種劑量時都能抑制腫瘤生長，抑制率平均可達29％左右，高劑量組可達34．5％(P＜0．05)；而絲裂黴素雖有明顯抑瘤效果(P＜0．01)但使動物生活質量明顯惡化。④在體對抗動物肺癌實體瘤作用的試驗受試藥物能改善動物生活質量，3種劑量都能抑制腫瘤的生長，有量效關係，中高劑量組抑制率平均可達20％左右；而絲裂黴素雖有明顯抑瘤效果(P＜0．01)但使動物生活質量明顯惡化，約1／3動物在試驗終止日期前死亡。
結果證明受試藥物有一定的抗腫瘤效果，且作用性質與絲裂黴素不同，前者改善而後者惡化動物生活質量。
⑥尿多酸肽組合物注射液防治裸鼠肝癌轉移復發的療效觀察採用如下方法證明本發明尿多酸肽組合物溶液對裸鼠早期和晚期肝癌切除術後的轉移復發有防治作用裸鼠肝癌高移模型腫瘤接種後，於轉移發生前後分別進行肝癌切除術，術後皮下注射本發明尿多酸肽組合物溶液(1200mg／kg)。腫瘤接種後35天處死動物，記錄動物體重、切緣復發、肝內轉移和遠處轉移情況。結果證明①晚期肝癌切除後，本發明尿多酸肽組合物溶液組動物體重較高，肝內轉移發生減少，肝溼重降低，切緣局部復發腫瘤也較小，反映遠處轉移的肺轉移灶和轉移累及的臟器數目也減少；②早期肝癌切除後，本發明尿多酸肽組合物溶液組動物肝內轉移灶和轉移累及臟器數目也減少，無肺內轉移發生。
⑦尿多酸肽組合物注射液逆轉腫瘤耐藥性的研究用離體試驗方法，觀察到不同劑量的本發明尿多酸肽組合物溶液能有效地增加VCR對KBV200耐藥性細胞的抑制作用，使KBV200耐用藥細胞對VCR敏感性提高16倍。但本發明尿多酸肽組合物溶液並未引起KBV200耐藥細胞中MDR1基因表達發生明顯變化，也未誘導出MRP和GST-π基因表達。進一步研究表明，本發明尿多酸肽組合物溶液均可使敏感H23和耐藥H1435細胞中MDR1和GST-π基因的表達隨者本發明尿多酸肽組合物溶液劑量增加而減弱或消失，均未誘導出MRP基因表達。提示本發明尿多酸肽組合物溶液對KBV200和H1435耐藥細胞均有不同程度的逆轉腫瘤耐藥的作用，而對KBV200耐藥作用可能涉及P-gp以外逆轉耐藥途徑。
⑧毒理研究急性毒性試驗給小鼠和大鼠靜脈推注或腹腔注射最大容積的本發明尿多酸肽組合物溶液都不能使動物致死，不能測得系列的LD值。根據最大耐受量試驗，認為本發明尿多酸肽組合物溶液對小鼠iv或ip的LD50＞50ml／kg(相當2000mg／kg)。對大鼠iv或ip的LD50＞30ml／kg(相當1200mg／kg)。給小鼠iv濃縮受試物，測得LD50及其95％可信限為3794mg／kg(3165~4547mg／kg)。
長期毒性試驗共用大鼠和狗二種動物進行了實驗，結果表明無論大鼠和狗經過6個月的用藥，給藥組與模擬處理對照組相比較，各項觀察指標皆無有意義的差別。說明本發明尿多酸肽組合物溶液在該種劑量連用6個月的情況下是安全的，無蓄積毒性，未發現任何對機體有害的影響。
一般藥理試驗所進行的實驗表明，本發明尿多酸肽組合物溶液小劑量對貓和大鼠血壓無明顯影響；中、大劑量是貓和大鼠血壓輕度和中等度下降，均為一過性。小、中、大劑量對貓心率無明顯影響；中、大劑量使大鼠心率輕度減慢，但無統計學意義。除大劑量使貓和大鼠7例中各1例出現一過性節律不齊外，其餘無心電和心律改變。小劑量對貓和大鼠呼吸頻度和幅度無明顯影響；中劑量使呼吸頻度和幅度輕度增大。小、中、大劑量對貓和大鼠精神神經系統各有關指標無影響。
特殊毒性試驗用微生物回復突變、微核、精子畸形和致畸4項試驗進行了安全性評價。實驗結果表明本發明尿多酸肽組合物溶液無致突變、致畸和生殖毒性作用。提示本發明尿多酸肽組合物溶液應用在臨床上是安全的。
4．尿多酸肽組合物的藥理分析尿多酸肽組合物治療和預防癌症的主要有效成分包括分化誘導劑，分化幫助劑和抗惡病質劑。
(1)分化誘導劑分化誘導劑是尿多酸肽組合物最重要的有效成分，但含量很少，化學結構也還沒有完全清楚。主要的分化誘導物質是與色素結合的有色肽和一特殊的有機酸。這兩種分化誘導成分和oligoisoadenylate一樣針對異常的癌蛋白質使其消失作用，將導常甲基轉移複合酶改變成為正常酶，結果癌細胞就通過缺甲基核酸的合成進行終末分化而停止分裂或產生凋亡。正常細胞的生長和功能則不受尿分化誘導劑的幹擾，因為正常細胞沒有異常的癌因子，因此這種分化誘導劑是具有很高選擇性的抗癌物質。
從酶的研究角度看，異常的甲基轉移複合酶轉變成正常酶是誘導癌細胞進行終末分化的一個轉折點。分析細胞內AdoMet和AdoHcy的量也證明酶的變化在癌細胞分化中所起的重要作用。癌細胞的AdoMet量遠比正常細胞為高，因為癌細胞的MATLT比正常細胞的MATLKm嵩出許多。癌細胞一旦分化變成終末細胞，AdoMet和AdoHcy的量也減低很多，也可以說明MATLT和SAHHLT失去致癌因素而變成MATLT和SAHHLT，這些結果從另一角度也證明我們的發現是正確的。
(2)分化幫助劑尿多酸肽組合物的主要化學成分之一是分化幫助劑，分化幫助劑是甲基轉移複合酶各成員酶的抑制劑，這些抑制劑的量高到可以明顯地抑制各成員酶時也有很好的分化誘導作用，但是因為病因，即異常的癌蛋白因子沒有除去，分化是可逆性的，要單獨用這類製劑達到抗癌作用不可能，所以我們要強調協助的功能。在劑量不大時，對癌細胞的分裂和分化並沒有產生明顯的作用，這種劑量卻有增強分化誘導劑消除異常癌因子的功能，因此我們把這種化合物命名為分化幫助劑。尿多酸肽組合物中MAT的競爭性抑制劑有苯乙酸、吲哚乙酸和馬尿酸，MT的抑制劑則有尿赤素和維生素B2。MA物抑制劑需要mM的劑量才有明顯的促進作用，MT的抑制劑只需數μM的劑量就有相同的促進作用，所以MT的抑制劑有比較好的分化協助活性。
分化幫助劑雖然名為協助，其實在分化療法中是不可或缺的角色。癌細胞用單一的分化誘導劑時總有一小部分細胸，5-10％左右，不能被誘導分化。很可能是在細胞分裂時期某些細胞特別容易受到分化誘導劑的傷害而停頓下來。分化的程序需要經過兩個分裂周期，如果細胞受到傷害不能完成兩個周期分裂，就不能完成終末分化，因此會有少數沒有分化的細胞。造成細胞的傷害是分化誘導劑引起的，當甲基轉移複合酶分化誘導劑修正去掉癌蛋白質因子，複合酶會分解成單獨成員酶，它們有分解核酸的活性從而造成傷害，經過一段長時間的停頓和修復，癌細胞又恢復原狀。這是臨床應用單個分化誘導劑所面臨的問題，維甲酸對急性早幼粒細胞白血病有良好的療效，但緩解期只能維持數月就又復發，復發是因為有少數的癌細胞沒有完全分化造成的。如果分化是在有分化幫助劑的存在下地行，不管是MAT或MT的抑制劑，則癌細胞的分化可以達到百分之百。分化幫助劑一方面可以促進分化，另一方面又可以防止分化誘導劑引起的細胞傷害使分化順利完成，復發就可以明顯減低；可以減低分化誘導劑的需求量；單用分化幫助劑也有效果，苯乙酸對星形腦瘤的治療已經肯定。腦局部比較特殊，內在的分化誘導成分消失，所以用分化幫助劑療效顯著。
(3)尿多酸肽組合物與天然化學監察尿中的細胞分化誘導劑和分化幫助劑是人體細胞的低分子代謝產物，既然人體內有天然的抗癌物質，為什麼會有癌症發生？我們發現癌症病人絕大多數從尿排洩多於正常人的低分子量代謝物質，持久的過量排洩造成體內缺乏抗癌物質，因而無法抑制細胞的增殖，終於出現床症狀，越嚴重的病人缺失越厲害。這是一種惡性循環，到後來完全失去監控能力，這時癌細胞可以毫不受約束地繁殖下去。異常的甲基轉移複合酶是一個很重要的因素，但是天然化學監控能力的破壞也是一個很重要的因素。所以要有效的克服癌症必須要同時顧及這兩個因素，即要抑制異常的甲基轉移複合酶，也要減低病人過度排洩天然抗癌化學物質，這樣才會收到事半功倍的效果。從尿精製的抗癌製劑--尿多酸肽組合物，能兼顧到這兩個因素，病人過量排洩低分子代謝物慢慢減少，等到病情好轉也就恢復到正常的狀態。
病人之所以排洩過量小分子量代謝物質可能是炎症的結果，有發炎的症狀就有過度排洩的現象。發炎的結果促使巨噬細胞產生惡病質素(cachectin)，惡病質素的生理作用導致病人過度排洩。急性發炎因為很快恢復正常，對癌症的形成沒有很大關係。慢性發炎持久的影響才會促成癌症，愛滋病人及B型肝炎病人到後來往往會發生癌症的原因也與此有關。癌細胞本身也構成慢性炎症的病源，癌細胞越繁殖，發炎的現象越嚴重，過度的排洩也越明顯。有效地控制過度排洩對癌症的治療是一個很重要的課題。細胞毒藥物本身會促進過度排洩，對天然化學監察沒有保護反而有破壞作用，不難想像細胞毒療法的成功需要依賴所有癌細胞消除乾淨，否則病人經長期細胞毒藥物的破壞，沒有自衛能力去抑制殘餘的癌細胞。相反的，從尿精製的抗癌製劑中有些成分可以改善癌症人的過度排洩，病人的天然化學監察能力恢復後，就可依賴本身的自衛能力來消除殘餘的癌細胞，不用清除所有的癌細胞即可痊癒。這種尿抗癌製劑中的苯乙醯穀氨醯胺就有改善癌症病人過度排洩的功能，雖然這個化合物本身對異常甲基轉移複合酶沒有作用，對癌細胞也沒有直接抑制作用，但是由於能夠防止過度排洩抗癌物質，保護天然化學監察能力，對症狀較輕的癌症病人也有醫療效果，同時對動物的癌變有顯著的預防作用。動物細胞的癌變過程在細胞培養中比在動物體內容易進行，因為動物有天然的化學監察能力，要一段很長的促進時期去除這種自衛能力，癌細胞才能繁殖起來。一般來說，像巴豆油這種發炎促進物質可以縮短促進期，苯乙醯穀氨醯胺可以保護化學監察的能力則可預防癌症的發生。
(4)分化療法的其它優點癌基因和抑癌基因大多是細胞分裂的調節基因，一旦癌細胞分化了，癌基因的表達會下降，而抑癌基因的表達會上升，這是分化的結果。但是有些和細胞分裂以及分化沒有直接關係，而和癌細胞惡變有關聯的因素也會隨著癌細胞的分化而消失，例如端粒酶(telomerase)是促成癌細胞持續分裂的因子，在癌細胞分化後自然消失，我們發現癌細胞經過尿多酸肽組合物處理後也會導致telomerase消失。抑制細胞凋亡的熱休克蛋白質或bcl-2也會隨著癌細胞的分化而消失。擴增出來的基因也會因癌細胞分化而消失，包括擴增的myc基因，擴增的多藥耐藥基因。最重要的是癌細胞轉移能力的消失，研究顯示尿多酸肽組合物能有效地抑制肝癌的肝內以及肺轉移。以上實驗充分地說明癌細胞一旦分化成終末細胞就已不再是癌細胞，癌細胞本來具有的種種特性都會隨著細胞的分化而消失，所以已經分化的癌細胞即使沒有凋亡，對病人已不再構成威脅。
(5)細胞的分化與凋亡正常的幹細胞如果缺乏生長素就會凋亡，不過一旦變成終末分化的細胞就不再受缺乏生長素的影響；同樣固醇激素的靶幹細胞如果缺乏固醇激素也會導致細胞的凋亡；癌細胞如果甲基轉移複合酶的成員酶受到幹擾或抑制也會促成細胞的凋亡。這些結果很強地暗示甲基轉移複合酶和細胞的凋亡有直接的關係，如果甲基轉移複合酶能夠維持複合酶的狀態細胞不會凋亡，否則細胞就會凋亡，所以細胞的凋亡和甲基轉移複合酶以及單酶的互變有密切的關係。我們的觀察顯示核小體的rRNA甲基轉移酶的活性和RNA分解酶的活性正好成的比的關係，很有可能甲基轉移酶在複合酶中的主要功能是甲基轉移，一旦分解成單獨酶時就轉變成核酸分解酶，這正好說明為什麼oligoisoadenglate有很強的誘導核酸分解酶的活性，核酸分解酶強烈表現的結果會中止細胞的分裂而導致細胞的凋亡。這種甲基轉移酶與核酸分解酶的互變關係就像微生物DNA甲基轉移酶與DNA核酸分解酶同是一個酶，但有兩種不同的活性一樣。
細胞分化誘導劑抑制異常甲基轉移複合酶的結果，會促成癌細胞的分化，也會促成癌細胞的凋亡，因此有些癌細胞分化之後即自行凋亡。我們的實驗數據也顯示HL-60癌細胞經尿多酸肽組合物處理後，時間一久分化的細胞數會減低，而凋亡的細胞數則在增加。雖然有些癌細胞有分化後即自行凋亡的因果關係，但這種關係並不是必然的，因為控制細胞分化和細胞凋亡的因素畢竟不同。控制癌細胞的分化，異常的甲基轉移複合酶是最重要的因素，只要抑制這種酶，癌細胞一定會分化，可是決定細胞凋亡的因素很多，線粒體膜的變化、自殺基因的表達、蛋白質合成、新蛋白酶的出現、DNA的分解，以及抗凋亡的成分的多寡等等。所以分化和凋亡不是必然的因果關係，有些癌細胞向正常細胞分化後反而更不容易凋亡。
(6)尿多酸肽組合物作為輔助療法分化療法的缺點是不一定能使腫瘤很快地消失。細胞毒化和放療主要在促進癌細胞的凋亡，所以腫瘤的縮小較明顯，可以用來彌補分化療法的不足。而這種療法因為沒有控制異常甲基轉移複合酶而引起的嚴重後果，則可以用尿多酸肽組合物來補救。我們發現由於細胞毒藥物引起的DNA過度甲基化，如果有細胞分化誘導劑時就不會發生，所以尿多酸肽組合物可以防止化療因DNA過度甲基化引起的嚴重後果。不但如此，尿多酸肽組合物甚至可以增進放療和化療的效果，因為癌細胞對這兩種療法的抵抗性往往是因為癌基因或抗凋亡因素的表達過多，而這些因素會因癌細胞的分化而降低，因此分化的結果會增加放療和細胞毒化療的敏感度。實驗已證明本來對放療有抵抗性的癌細胞經分化誘導劑處理後會變成對放療敏感，同樣也可以增加對化療的敏感。尿多酸肽組合物在臨終病人臨床應用的結果也證明可以顯著增加化的療效，並且減輕副作用，提高病人的生活質量。尿多酸肽組合物有明顯抑制癌細胞轉移的作用，本身又沒有毒性，無疑是手術後防止復發的理想藥物。
(7)分化療法的效果分化療法還處在萌芽階段，Burzynski用尿抗癌製劑抗瘤酮A10醫治晚期的癌症病人，有40-60％的病人達到50％以上或全部腫瘤消失，其中三分之一超出五年而無復發，這類藥物最大的優點是沒有副作用。
甲基轉移複合酶是由MAT、MT和SAHH結合組成。有生長素時複合酶的活性提高，核糖體的產生和DNA甲基分布的複製主可以順利進行，細胞乃得以在分裂周期運轉。一旦生長素不復存在，甲基轉移複合酶率先失去活性，而核酸合成酶的活性仍相當穩定，這時細胞會合成缺甲基的核酸，細胞從而由分裂轉入分化，核糖體不再產生，分化基因得以表達，這樣細胞就分化成終末細胞而停止分裂。
癌細胞產生特異的蛋白質因子與MAT和SAHH結合在一起，這種異常的癌因子使複合酶維持在活性很高的穩定狀態，因此癌細胞無法進行終末分化而停留在分裂周期運轉不息，癌細胞需要外來的抑制因素，如尿多酸肽組合物將異常甲基轉移複合酶的癌因子抵消掉，那麼癌細胞就會像正常細胞進行終末分化。
綜上所述，尿多酸肽組合物是由新鮮人尿經科學提煉精製而成的抗癌物質，有效成分包括分化誘導劑、分化幫助劑和抗惡病質劑，分化誘導劑是異常甲基轉移複合酶的特殊對抗劑；分化幫助劑是甲基轉移複合酶各成員酶之抑制劑，有很強的增進分化誘導劑的誘導作用；抗過多排洩劑則能恢復病人的化學監察協能，本發明的尿多酸肽組合物綜合了分化療法的各種藥物，通過其協同作用，大大提高了對癌症的治癒效果。
本發明從人尿中經提取和純化等現代手段，製得含一定比例的肽、胺基酸衍生物、有機酸及無機微量元素的混合物質，系統進行了理化、藥效、藥理、毒理等系統研究，該製劑對腫瘤有分化誘導、分化幫助和抗過多排洩的協同作用，且毒性低，能促進癌細胞走向正常分化或使癌細胞凋亡，作為新型的抗腫瘤藥物，在臨床上可用於多種晚期惡性腫瘤的治療，實驗結果表明該藥物對多種腫瘤有治療效果且無毒性，具有很高選擇性，可為癌症病人帶來福音。
下面結合附圖和實施例詳細描述本發明藥物的製備方法、藥物組合物及藥物組合物的藥理及毒理性附圖簡要說明圖1為尿多酸肽的製備工藝流程2為供試品溶液的色譜3尿多酸肽組合物溶液離體對肺癌細胞影響的測試組、及陰、陽性3個組的肺癌細胞生長曲線圖4為馬尿酸對照樣品的HPLC譜5為苯乙醯穀氨醯胺對照樣品的HPLC譜6為苯乙酸對照樣品的HPLC譜7為吲哚乙酸對照樣品的HPLC譜8為四種有機酸對照樣品的HPLC譜9為尿多酸肽組合物溶液(批號980906)有機酸的HPLC譜10為尿多酸肽組合物溶液(批號980907)有機酸的HPLC譜11為尿多酸肽組合物溶液(批號980908)有機酸的HPLC譜12為尿多酸肽組合物溶液(批號980908)馬尿酸確證的HPLC譜13為尿多酸肽組合物溶液(批號980908)苯乙醯穀氨醯胺確證的HPLC譜14為尿多酸肽組合物溶液(批號980908)苯乙酸確證的HPLC譜15為尿多酸肽組合物溶液(批號980908)吲哚乙酸確證的HPLC譜16為17種胺基酸國家標準品的HPLC譜17為尿多酸肽組合物溶液(批號980906)游離胺基酸的HPLC分析譜18為尿多酸肽組合物溶液(批號980907)游離胺基酸的HPLC分析譜19為尿多酸肽組合物溶液(批號980908)游離胺基酸的HPLC分析譜20為尿多酸肽組合物溶液(批號980906)水解胺基酸的HPLC分析譜21為尿多酸肽組合物溶液(批號980907)水解胺基酸的HPLC分析譜22為尿多酸肽組合物溶液(批號980908)水解胺基酸的HPLC分析譜23為肽標樣分子量測定的HPLC譜24為分子量測定的標準曲線圖25尿多酸肽組合物溶液(批號980906)分子量測定的HPLC譜26尿多酸肽組合物溶液(批號980907)分子量測定的HPLC譜27尿多酸肽組合物溶液(批號980908)分子量測定的HPLC譜28尿多酸肽組合物溶液(980906)肽成分分析HPLC色譜29尿多酸肽組合物溶液(980907)肽成分分析HPLC譜30尿多酸肽組合物溶液(980908)肽成分分析HPLC譜31尿多酸肽組合物溶液對體外培養的HL-60細胞生長抑制作用圖32尿多酸肽組合物溶液(1．2mg／ml)作用6天對HL-60細胞生長抑制作用圖33對照組作用體外培養的HL-60細胞7天後的顯微攝影照片圖34本發明尿多酸肽組合物溶液(1．2mg／ml)作用體外培養的HL-60細胞7天後的顯微攝影照片圖35RA(1μg／ml)作用體外培養的HL-60細胞7天後的顯微攝影照片圖36腹腔注射尿多酸肽組合物溶液對小鼠腎囊膜下生長的HL-60細胞的生長抑制作用圖37尿多酸肽組合物溶液作用於小鼠腎囊膜下生長的HL-60細胞的作用7天後切片，HE染色的顯微攝影照片--對照組圖38尿多酸肽組合物溶液作用於小鼠腎囊膜下生長的HL-60細胞的作用7天後切片，HE染色的顯微攝影照片圖39維甲酸陽性對照組作用於小鼠腎囊膜下生長的HL-60細胞的作用7天後切片，HE染色的顯微攝影照片圖40尿多酸肽組合物溶液對肝癌組織中原癌基因表達的影響圖41尿多酸肽組合物溶液對肝癌組織的MMP-9基因表達的影響圖42尿多酸肽組合物溶液對肝癌組織的整合素β1亞基和E-鈣粘素含量的影響圖43尿多酸肽組合物溶液對MHCC97肝癌細胞株的體外浸潤的抑制圖44尿多酸肽組合物溶液對人原發性肝細胞肝癌裸鼠模型LCI-D20生長的抑制作用AC組(上圖)L組(下圖)圖45尿多酸肽組合物溶液對人原發性肝細胞肝癌裸鼠模型LCI-D20生長的抑制作用BM組(上圖)H組(下圖)圖46尿多酸肽組合物溶液對人肝細胞肝癌LCI-D20基因影響A．RNA的鑑定(甲醛變性凝膠電泳)(上左)B．尿多酸肽組合物對人肝細胞肝癌LCI-D20 MMP-9基因影響(RT-PCR)(上右)C．尿多酸肽組合物對人肝細胞肝癌LCI-D20原癌基因影響(RT-PCR)(下中)圖47免疫組織化學檢測人肝細胞肝癌裸鼠模型LCI-D20中E-鈣粘素的表達A．肝細胞膜E-鈣粘素表達陽性(上)B．正常肝細胞中E-鈣粘素表達強陽性(×100)(+++)(下)圖48免疫組織化學檢測人肝細胞肝癌裸鼠模型LCI-D20中E-鈣粘素表達陽性增多(X100)(++)圖49免疫組織化學檢測人肝細胞肝癌裸鼠模型LCI-D20中Ki67的表達A．尿多酸肽組合物處理組肝癌組織中Ki67的表達(×100)(+)(A)B．尿多酸肽組合物處理組肝癌組織中Ki67的表達(×100)(++)(B)C．尿多酸肽組合物處理組肝癌組織中Ki67的表達(×100)(+++)(C)圖50生長於無尿多酸肽組合物和尿多酸肽組合物在劑量為1和2mg／ml時血癌細胞(HL-60cells)的生長曲線圖51以劑量1或2mg／ml的尿多酸肽組合物溶液測試2，4和6天後與對照組相比，血癌細胞(HL-60cells)的增殖(細胞生存率(％))的測試圖52血癌細胞在對照和兩個尿多酸肽組合物劑量下的相關的端粒酶活性圖53生長於有、無尿多酸肽組合物溶液的血癌細胞(HL-60cells)的相關端粒酶活性。
圖54尿多酸肽組合物溶液在體對人肝癌Smmu藥效研究的CTX陽性對照組瘤的外觀圖55尿多酸肽組合物溶液在體對人肝癌Smmu藥效研究的生理鹽水陰性對照組瘤的外觀圖56尿多酸肽組合物溶液在體對人肝癌Smmu藥效研究的高劑量組瘤的外觀圖57尿多酸肽組合物溶液在體對人肝癌Smmu藥效研究的中劑量組瘤的外觀圖58尿多酸肽組合物溶液在體對人肝癌Smmu藥效研究的低劑量組瘤的外觀圖59尿多酸肽組合物溶液離體對肺癌細胞影響的測試組、及陰、陽性3個組的肺癌細胞生長曲線實施例一．尿多酸肽的製備將1mol／L鹽酸溶液約450ml加入20kg新鮮尿液中，調節至pH值約為3；過濾後，收集尿液。
用超濾設備超濾在超濾設備中加入去離子水，洗泡超濾膜；將收集尿液倒入加料桶中，開始納濾，控制壓力5Mpa，流速800ml／分鐘，收集分子量低於10000的低分子濾液，棄去高分子量濾液。
將C18矽膠5kg，用乙醇15L浸泡5分鐘，裝入袋中放置於漏鬥狀塑桶內，製成吸附柱，柱截面積0．018m2，用去離子水洗去乙醇，再依次用15升乙醇及25升去離子水洗滌C18矽膠各一次；然後將低分子量濾液以2L／分鐘的流速加入柱中；加完後，先用25L蒸餾水以0．5L／分鐘的流速洗滌C18矽膠柱；再用10L乙醇以3L／分鐘的流速加入C18矽膠柱中，使被吸附的有效成分解吸附，收集有色部分為有效洗脫液；將收集的有效洗脫液加入真空乾燥機，緩慢加熱升溫，控制料液溫度為30℃，直到溶劑基本蒸發掉；冷凍乾燥，得到尿多酸肽組合物幹品。
以蒸餾水20L溶解乾燥殘留物，即得尿多酸肽粗品溶液；用2mol／L氫氧化鈉溶液調節尿多酸肽粗品的pH值到6．0後；將粗品在1℃的低溫庫中放置80小時；取靜置處理後的粗品上層液，在100000級潔淨室內，用微孔濾紙過濾，收集濾液，即得尿多酸肽溶液；用一萬分子量的超濾膜超濾，以除去熱源，再經PALL公司Ultipor VFTMDV50除病毒過濾器過濾除病毒，回收率為投料量的0．18％左右(體積比)，經細胞內毒素檢測合格。
尿多酸肽乾粉可以複合其它添加劑製成口服片劑或膠囊，尿多酸肽溶液可以製成口服液，也可以製成注射液。
實施例二．尿多酸肽的製備將1mol／L鹽酸溶液約500ml加入20kg新鮮尿液中，調節至pH值約為2；過濾後收集尿液。
用超濾設備超濾在超濾設備中加入去離子水，洗泡超濾膜；將收集尿液倒入加料桶中，開啟進料泵，開始納濾，控制壓力為1Mpa，流速900ml／分鐘，收集分子量低於10000的低分子濾液，棄去高分子量濾液。
將XAD-8矽膠10kg，用乙醇25L浸泡20分鐘，裝入袋中放置於塑桶內，製成吸附柱，用去離子水洗去乙醇，再依次用25升乙醇及20升去離子水洗滌XAD-8矽膠各一次；然後將低分子量濾液以1．5L／分鐘的流速加入柱中；加完後，先用20L蒸餾水以3L／分鐘的流速洗滌XAD-8柱；再用15L乙醇以1．0L／分鐘的流速加入XAD-8柱中，使被吸附的有效成分解吸附，收集有色部分為有效洗脫液；將收集的有效洗脫液加入真空乾燥機，緩慢加熱升溫，控制料液溫度為70℃，蒸發掉部分溶劑後；得尿多酸肽粗品溶液；用2mol／L氫氧化鈉溶液調節尿多酸肽粗品的pH值到8．0後；將粗品在10℃的低溫庫中放置160小時；取靜置處理後的粗品上層液，在100000級潔淨室內，用微孔濾紙過濾，收集濾液，即得尿多酸肽溶液；用一萬分子量的超濾膜超濾，以除去熱源，再經PALL公司Ultipor VFTMDV50除病毒過濾器過濾除病毒，再通過真空乾燥，得到尿多酸肽組合物幹品。
回收率為投料量的0．8％左右(體積比)，經細胞內毒素檢測合格。
實施例三．尿多酸肽的製備將1mol／L鹽酸溶液約520ml加入20kg新鮮尿液中，調節至pH值約為1．2；過濾後收集尿液。
用超濾設備超濾在超濾設備中加入去離子水，洗泡超濾膜；將收集尿液倒入加料桶中，開啟進料泵，開始納濾，控制壓力為2Mpa，流速1200ml／分鐘，收集分子量低於10000的低分子濾液，棄去高分子量濾液。
將XAD-7矽膠15kg，用乙醇20L浸泡10分鐘，裝入袋中放置於漏鬥狀塑桶內，製成吸附柱，用去離子水洗去乙醇，再依次用20升乙醇及15升去離子水洗滌XAD-7各一次；然後將低分子量濾液以1．0L／分鐘的流速加入柱中；加完後，先用15L蒸餾水以1．5L／分鐘的流速洗滌XAD-7柱；再用15L乙醇以0．5L／分鐘的流速加入XAD-7柱中，使被吸附的有效成分解吸附，收集有色部分為有效洗脫液；將收集的有效洗脫液加入真空乾燥機，緩慢加熱升溫，控制料液溫度為80℃，直到蒸發掉溶劑；冷凍乾燥，得到尿多酸肽組合物幹品。
以蒸餾水20L溶解乾燥殘留物，即得尿多酸肽粗品溶液；用2mol／L氫氧化鈉溶液調節尿多酸肽粗品的pH值到7．4後；將粗品在5℃的低溫庫中放置120小時；取靜置處理後的粗品上層液，在100000級潔淨室內，用微孔濾紙過濾，收集濾液，即得尿多酸肽溶液；用一萬分子量的超濾膜超濾，以除去熱源，再經PALL公司Ultipor VFTMDV50除病毒過濾器過濾除病毒，回收率為投料量的2．5％左右(體積比)，經細胞內毒素檢測合格。
實施例四．尿多酸肽的製備將1mol／L鹽酸溶液約510ml加入20kg新鮮尿液中，調節至pH值約為1．5；過濾後收集尿液。
用超濾設備超濾在超濾設備中加入去離子水，洗泡超濾膜；將收集尿液倒入加料桶中，開啟進料泵，開始納濾，控制壓力為1．5Mpa，流速1000ml／分鐘，收集分子量低於9000的低分子濾液，棄去高分子量濾液。
將XAD-16 12kg，用甲醇22L浸泡23分鐘，裝入尼龍袋中放置於漏鬥狀塑桶內，製成吸附柱，柱截面積0．022m2，用去離子水洗去甲醇，再依次用17升乙醇及23升去離子水洗滌XAD-16各一次；然後將低分子量濾液以0．5L／分鐘的流速加入柱中；加完後，先用22L蒸餾水以1．2L／分鐘的流速洗滌XAD-16柱；再用20L甲醇以2L／分鐘的流速加入XAD-16柱中，使被吸附的有效成分解吸附，收集有色部分為有效洗脫液；將收集的有效洗脫液加入真空乾燥機，緩慢加熱升溫，控制料液溫度為65℃，直到蒸發掉溶劑；冷凍乾燥，得到尿多酸肽組合物幹品。
以蒸餾水20L溶解乾燥殘留物，即得尿多酸肽粗品溶液；用2mol／L氫氧化鈉溶液調節尿多酸肽粗品的pH值到7．0後；將粗品在5℃的低溫庫中放置110小時；取靜置處理後的粗品上層液，在100000級潔淨室內，用微孔濾紙過濾，收集濾液，即得尿多酸肽溶液；用一萬分子量的超濾膜超濾，以除去熱源，再經PALL公司Ultipor VFTMDV50除病毒過濾器過濾除病毒，回收率為投料量的3．2％左右(體積比)，經細胞內毒素檢測合格後包裝為成品。
實施例五．尿多酸肽的製備將1mol／L鹽酸溶液約490ml加入20kg新鮮尿液中，調節至pH值約為2．5；過濾後收集尿液。
用超濾設備超濾在超濾設備中加入去離子水，洗泡超濾膜；將收集尿液倒入加料桶中，開啟進料泵，開始納濾，控制壓力為2．5Mpa，流速1100ml／分鐘，收集分子量低於9000的低分子濾液，棄去高分子量濾液。
將XAD-16矽膠20kg，用乙醇17L浸泡8分鐘，裝入尼龍袋中放置於漏鬥狀塑桶內，製成吸附柱，柱截面積0．010m2，用去離子水洗去乙醇，再依次用22升乙醇及18升去離子水洗滌XAD-16各一次；然後將低分子量濾液以0．7L／分鐘的流速加入柱中；加完後，先用18L蒸餾水以1．2L／分鐘的流速洗滌XAD16柱；再用8L乙醇以0．8L／分鐘的流速加入XAD-16柱中，使被吸附的有效成分解吸附，收集有色部分為有效洗脫液；將收集的有效洗脫液加入真空乾燥機，緩慢加熱升溫，控制料液溫度為60℃，直到蒸發掉溶劑；冷凍乾燥，得到尿多酸肽組合物幹品。
以蒸餾水20L溶解乾燥殘留物，即得尿多酸肽粗品溶液；用2mol／L氫氧化鈉溶液調節尿多酸肽粗品的pH值到7．0後；將粗品在5℃的低溫庫中放置100小時；取靜置處理後的粗品上層液，在100000級潔淨室內，用微孔濾紙過濾，收集濾液，即得尿多酸肽溶液。
用一萬分子量的超濾膜超濾，以除去熱源，再經PALL公司Ultipor VFTMDV50除病毒過濾器過濾除病毒，回收率為投料量的3．9％左右(體積比)，經細胞內毒素檢測合格後包裝為成品。
實施例六．尿多酸肽組合物的理化常數分別稱取尿多酸肽組合物乾粉約0．4g各四份，加入10ml去離子水，得到尿多酸肽組合物溶液，批號分別為980905、980906、980907、980908、980909每份的固含量見下表；
分別取樣測試如下1．性狀與溶液的顏色本發明尿多酸肽組合物溶液五批供試品(批號980905、980906、980907、980908、980909)外觀均呈淺黃色、棕色至深棕色澄明液體。
2．不溶性微粒檢查按中國藥典1995年版二部附錄IX C檢驗，本品均符合規定。
3．pH值按中國藥典1995年版二部附錄Ⅵ H檢查，本發明尿多酸肽組合物溶液的pH值為
4．熾灼殘渣按中國藥典1995年版二部附錄Ⅷ N檢查，本品的熾灼殘渣為
依結果熾灼殘渣定為不得超過2．0％(w／v)。
5．含氮量按中國藥典1995年版附錄Ⅶ D半微量法檢驗，精密量取本品1ml測定，測定含氮量為
依結果含氮量不得低於2．0mg／ml。
6．元素測定方法原子吸收分光光度法測定結果如下所示(單位μg／ml)
實施例七．尿多酸肽組合物中有機酸結構的確認用HPLC分析確認本發明的藥物組合物中主要含有四種有機酸馬尿酸、苯乙醯穀氨醯胺、苯乙酸和吲哚乙酸，並測定了含量。
供試品尿多酸肽組合物，批號980908(固含量0．0405mg／ml)；參照標樣購於Sigma公司的純品，馬尿酸，苯乙醯穀氨醯胺、苯乙酸、吲哚乙酸；方法HPLC法儀器及色譜條件Waters510高效液相色譜儀，481型檢測器，U6K手動進樣器，島津C-6RA積分儀柱ZORBAX 300SB-C18 4．6×150mm 5μ流動相甲醇∶水(15∶85)0．5％乙酸流速0．6ml／min柱溫35℃檢測波長260nm對照品溶液的配製分別稱取馬尿酸、苯乙酸、苯乙醯穀氨醯胺、吲哚乙酸適量，用0．4M氫氧化鈉溶液溶解並配成以下濃度的對照品溶液馬尿酸6．559mg／ml，苯乙醯穀氨醯胺7．576mg／ml，苯乙酸4．09mg／ml、吲哚乙酸0．214mg／ml。
分別經0．45μm薄膜過濾，取各濾過液1μl(苯乙醯穀氨醯胺取5μl)，記錄相應的色譜圖，特徵峰為馬尿酸Rt=5．9；苯乙醯穀氨醯胺Rt1=6．3，Rt2=7．117；苯乙酸Rt=11．467；吲哚乙酸Rt=13．98，見附圖4-7。
供試品溶液製備取供試品適量，經0．45μm薄膜過濾，以濾過液作為供試品溶液，進樣1μl，記錄相應的色譜圖見圖2。
確證溶液的製備分別取苯乙酸、吲哚乙酸、馬尿酸、苯乙醯穀氨醯胺溶液對照品溶液，與供試品溶液適量混合，經0．45μm薄膜過濾，濾過液作為加入對照品的供試液(確證溶液)。分別進樣2μl，記錄相應的色譜圖，並與樣品有機酸分析圖譜比較。
馬尿酸的確證(見附圖12)通過與馬尿酸譜圖比較，可以看出加入馬尿酸後的供試品色譜圖中，除Rt=6．1的峰面積比未加馬尿酸的樣品譜圖中相應位置(Rt=5．933)的峰面積明顯增大外，其餘各峰峰面積基本一致，從而確證樣品色譜圖中9#峰(Rt=5．933)即為馬尿酸。
苯乙醯穀氨醯胺的確證(見附圖13)通過與苯乙醯穀氨醯胺譜圖比較，可以看出加入苯乙醯穀氨醯胺後的供試品色譜圖中，除Rt=6．398的峰面積比未加苯乙醯穀氨醯胺的樣品譜圖中相應位置(Rt=6．383)的峰面積明顯增大外，其餘各峰峰面積基本一致，從而確證尿多酸肽樣品色譜圖中10#峰(Rt=6．383)即為苯乙醯穀氨醯胺。
苯乙酸的確證(見附圖14)通過與苯乙酸譜圖比較，可以看出加入苯乙酸後的供試品色譜圖中，除Rt=11．833的峰面積比未加苯乙酸的樣品譜圖中相應位置(Rt=11．333)的峰面積明顯增大外，其餘各峰峰面積基本一致，從而確證樣品色譜圖中19#峰(Rt=11．333)即為苯乙酸。
吲哚乙酸的確證(見附圖15)通過與吲哚乙酸譜圖比較，可以看出加入吲哚乙酸後的供試品色譜圖中，除Rt=13．767的峰面積比未加吲哚乙酸的樣品譜圖中相應位置(Rt=13．733)的峰面積明顯增大外，其餘各峰峰面積基本一致，從而確證樣品色譜圖中22#峰(Rt=11．733)即為吲哚乙酸。
實施例八．尿多酸肽組合物中有機酸含量的確定儀器、色譜條件儀器Waters510高效液相色譜儀柱ZORBAX SB-C18 3．0 mm×150mm流動相 甲醇∶水(15∶85)0．5％乙酸流速0．4ml／min
柱溫35℃檢測波長260nm操作A．對照品溶液的配製①馬尿酸取5．7毫克溶於2．5毫升甲醇。
②苯乙醯穀氨醯胺取8．3毫克溶於2．5毫升0．4mol／L氫氧化鈉溶液。
③苯乙酸取43．0毫克溶於2．5毫升甲醇。
④吲哚乙酸取4．7毫克溶於2．5毫升甲醇。
各取200μl，混勻，進樣量為10μl；四種有機酸對照品的HPLC圖譜見圖8B．供試品溶液配製供試品批號980905(固含量0．0372mg／ml)980906、980907、980908、980909(固含量0．0409mg／ml)取原液用超純水稀釋5倍後，0．45μm薄膜過濾，進樣10μl；供試品的HPLC譜圖見圖9-11。通過分析，四種有機酸的含量如下表所示表6．四種有機酸的含量
以上結果得出，四種有機酸的含量分別為馬尿酸4．17-7．94mg／ml；苯乙醯穀氨醯胺4．87-10．86mg／ml；苯乙酸0．66-4．5mg／ml；吲哚乙酸0．11-0．28mg／ml；尿多酸肽組合物中四種有機酸的總含量為26．34-57．65％。
實施例九．尿多酸肽組合物肽胺基酸含量的測定本發明尿多酸肽組合物主成份之一是小分子肽，通過測定游離胺基酸和水解胺基酸量的方法，確定肽胺基酸的量，測試方法和結果如下一、游離胺基酸的測定方法Waters公司PICO．TAGTM胺基酸測定方法。
試劑及儀器十七種胺基酸對照品；異硫氰酸苯酯(PICO)衍生劑；三乙胺；醋酸鈉；乙腈。
高壓泵、梯度控制儀、紫外檢測器、積分儀、柱恆溫器、PICO．TAGTM工作站及胺基酸分析專用柱。
色譜條件1．流動相A液三水醋酸鈉19．0g溶解於1000mL超純水中，加三乙胺0．5mL，用冰醋酸調pH6．4，過濾。取濾液940mL加乙腈60mL；B液60％乙腈溶液；2．檢測波長254nm；3．柱溫38℃；4．洗脫梯度
5．樣品稀釋液取磷酸氫二鈉710mg加超純水1000mL溶解，用10％磷酸∶乙腈液(95∶5)調pH7．4備用。
測定方法將供試品溶液和5μL對照品溶液分別置於樣品小管中，並裝入反應瓶，於PICO．TAG工作站上真空乾燥30分鐘後，每管加10μL再乾燥液(乙醇∶水∶三乙胺=2∶2∶1)，真空乾燥30分鐘，每管加20μL衍生劑(異硫氰酸苯酯∶乙醇∶三乙胺∶水=1∶7∶1∶1)，室溫放置20分鐘後，真空乾燥。每管加200μL樣品稀釋液，進樣測定。
計算按外標法以國家胺基酸標準品為標準進行計算；得到游離胺基酸的含量為
水解胺基酸的測定方法方法Waters公司PICO．TAGTM胺基酸測定方法。
試劑及儀器十七種胺基酸對照品；異硫氰酸苯酯(PICO)衍生劑；三乙胺；醋酸鈉；乙腈。
兩臺高壓泵、梯度控制儀、紫外檢測器、積分儀、柱恆溫器、PICO．TAGTM工作站及胺基酸分析專用柱。
色譜條件1．流動相A液三水醋酸鈉19．0g溶解於1000mL超純水中，加三乙胺0．5mL，用冰醋酸調pH6．4，過濾。取濾液940mL加乙腈60mL；B液60％乙腈溶液；2．檢測波長254nm；3．柱溫38℃；4．洗脫梯度
5．樣品稀釋液取磷酸氫二鈉710mg加超純水1000mL溶解，用10％磷酸∶乙腈液(95∶5)調pH7．4備用。
測定方法將供試品溶液和5μL對照品溶液分別置於樣品小管中，並裝入反應瓶，於PICO．TAG工作站上真空乾燥30分鐘後，在反應瓶底加入含1％苯酚的6mol／L鹽酸200μl後，用氮氣置換空氣，操作重複三次。將反映瓶裝入恆溫加熱器(105℃水解2小時)。每管加10μL再乾燥液(乙醇∶水∶三乙胺=2∶2∶1)，真空乾燥30分鐘，每管加20μL衍生劑(異硫氰酸苯酯∶乙醇∶三乙胺∶水=1∶7∶1∶1)，室溫放置20分鐘後，真空乾燥。每管加200μL樣品稀釋液，進樣測定。
計算按外標法以國家胺基酸標準品為標準進行計算；得到水解胺基酸的含量為
肽胺基酸含量∶肽胺基酸=水解總胺基酸-游離胺基酸結果(1)胺基酸國家標準品(中國藥品生物製品檢定所分發)的HPLC色譜圖(見附圖16)。
(2)尿多酸肽組合物溶液的游離胺基酸的HPLC色譜圖及各峰對應的游離胺基酸見附圖17-19。
(3)尿多酸肽組合物溶液的水解總胺基酸的HPLC色譜圖及各峰對應的游離胺基酸見附圖20-22)由圖16-22可見，三批尿多酸肽組合物溶液的游離胺基酸及水解胺基酸測定中，各胺基酸的保留時間與對照品(十七種胺基酸國家標準品)的保留時間基本一致。
例如十七種胺基酸國家標準品中，穀氨酸(Glu)的保留時間Rt=1．867，尿多酸肽組合物溶液(批號980906)中游離胺基酸的保留時間Rt=1．800，水解後穀氨酸的保留時間Rt=1．817；對照品中丙氨酸的保留時間Rt=6．483，尿多酸肽組合物溶液(批號980906)中游離丙基酸的保留時間Rt=6．508，水解後丙氨酸的保留時間Rt=6．308；對照品中酪氨酸的保留時間Rt=8．383，尿多酸肽組合物溶液(批號980906)中游離酪基酸的保留時間Rt=6．508，水解後酪氨酸的保留時間Rt=8．342；可見各胺基酸的保留時間與對照品中各峰的保留時間基本一致，略有漂移。
(4)尿多酸肽組合物溶液中胺基酸含量的實驗結果如下
HPLC，PICO·TAGTM專一性系統檢測本品游離胺基酸含量為0．8-1．3mg／ml，水解總胺基酸含量為8．5-11．4mg／ml，通過計算得出肽胺基酸量為7．7-10．9mg／ml，肽胺基酸佔水解總胺基酸量為90．6-95．6％，總肽含量約為20．7-26．7％，因而該肽的成份應為本發明尿多酸肽組合物溶液的主成份之一。
實施例十．尿多酸肽組合物肽分子量的測定本發明尿多酸肽組合物中肽的分子量，目前尚未見報導，現用HPSEC法測定本發明尿多酸肽組合物溶液的分子量。
1．供試品尿多酸肽組合物溶液由本公司生產提供，批號980905、980906、980907、980908、980907。
2．肽標樣由中國藥品生物製品檢定所提供多肽與小分子蛋白分子量標準品。
3．實驗材料與方法儀器組成Waters510泵、481型檢測器、U6K進樣器、積分儀或工作站、pH計。
色譜條件流動相0．05％TFA10％乙腈的水溶液流速1．0ml／min柱TSK GEL G2000SW×L7．8mm×300mm 5μ。
柱溫室溫檢測波長214nm分子量標準曲線製作稱取核糖核酸酶A(M．W13700)2mg，胰島素(M．W．5808)2mg，Somatostain(M．W．1521)2mg、6肽(M．W．564)2mg，分別溶於1ml流動相中，再各取等量混合，經0．45μm薄膜過濾後，進樣1μl，記錄相應的保留時間，重複進樣5次，其保留時間相對標準偏差不得大於2．0％。以保留時間為橫坐標，分子量對數為縱坐標進行線性回歸，相關係數不得小於0．99。通過回歸方程計算出對應於分子量1．0萬的保留時間。
供試品測定取供試品適量，0．45μm薄膜過濾，進樣1μl，記錄相應的譜圖，按面積歸一化方法計算。
4．實驗結果肽標樣分子量測定的HPLC譜圖見附圖23。
①肽標樣分子量測定結果如下表所示
②回歸方程及標準曲線以前三點進行線性回歸(舍6肽一點)，得回歸方程，標準曲線見圖24Y=6．685-0．39X，r=0．9991(線性範圍Rt6．5748-90064)③根據回歸方程計算，對應分子量1萬的保留時間為Rt=6．88④尿多酸肽組合物溶液樣品的分子量測定譜圖見附圖25-27，譜圖中，前三個峰的保留時間均在標準曲線的線性範圍內，根據回歸方程計算，這三個峰(1#、2#、3#)對應的分子量如下表
三個各峰對應的分子量分別為7000--9200，4000-5800，1000-2100。
⑤尿多酸肽組合物溶液樣品的分子量最大為9200，所含多肽的分子量均小於10000道爾頓，由此可見，該品中肽基本以小分子肽的形式存在。
實施例十一．尿多酸肽組合物的肽成份分析尿多酸肽組合物的主成份，除游離胺基酸及四種有機酸外，尚有一定比例的小分子肽，經用HPLC排阻層析法分離該品的肽成分，獲得分子量一萬以下多相性小分子肽組分。
1．供試品本公司生產提供，批號980906、980907、980908。
2．HPLC排阻層析法試劑磷酸鹽緩衝液(0．02mol／L)稱取磷酸二氫鉀2．72g，溶於500ml超純水中，用0．1mol／L NaOH調pH至7．4，用超純水稀釋至1000ml。
儀器及系統Waters HPLC510型泵、481型檢測器、740型數據處理器柱Protein-Pak．TM60 7．8mm×300mm；流速1．0ml／min；流動相磷酸鹽緩衝液(0．02mol／L)；柱溫37℃；檢測波長280nm。
取待測供試品5μl，進樣，記錄分析結果，計算出肽的相對百分含量。
3．結果經用HPLC排阻層析法，凝膠柱Protein60分離並檢測本發明尿多酸肽組合物的肽成分，得到一系列的肽峰(見附圖28-30)，數量為12-15個。其中有二個十分明顯的主峰，特徵峰之一的保留時間為6．805-7．493，三批相對百分含量分別為15．89％、16．16％、16．27％、．16．56％、17．56，即15．89-17．56；而另一個特徵峰保留時間的均值為7．722-8．824，三批相對百分含量分別為18．68％、19．27％、19．61％、19．19％、19．98％，即18．68-19．19。
其結果如下
實施例十二．尿多酸肽組合物溶液對HL-60細胞離體和在體實驗中的生長抑制作用以及誘導分化作用。
1．受試藥物尿多酸肽組合物溶液由本公司生產提供，批號970813，玻璃瓶膠塞鋁蓋無菌封裝，每瓶100ml，固形物含量200mg／ml2．動物小鼠為昆明種封閉群，體重18-22g，皆為雌性，由中科院上海實驗動物中心提供。合格證號中科動管會005。各組動物數為8隻，健康，預飼養7日。
3．飼養管理條件群養，每籠5隻，室內溫度、溼度、光照和通風自然，必要時開通風扇。自由攝食充足供水。實驗前觀察1周並記錄相應情況。
4．腫瘤細胞株人急性早幼粒白血病細胞(HL-60)由中科院上海藥物所腫瘤藥理組傳代培養。
5．試劑維甲酸(RA)上海瑞金醫院提供，批號961109。
環磷醯胺上海第十二製藥廠生產，批號960706。
凝血酶、纖維蛋白原、RPMI-1640、NBT、PMA，均購自Sigma公司。
6．尿多酸肽組合物溶液離體對HL-60細胞生長抑制作用6．1試驗方法及步驟臺盼蘭排染法用於觀察對細胞的生長抑制情況，試驗設空白對照，製劑對照，用藥組和陽性對照組。
取對數生長的細胞，計數，用RPMI-1640培液配製細胞懸液，細胞數為2．0×105／ml，細胞液加入96孔板，置於37℃、CO2培養箱，藥物作用6天，加臺盼蘭計數活細胞數，計算藥物對腫瘤細胞生長的抑制率。
以抑制率作為評價標準，計算方法如下抑制率=(對照組活細胞數-用藥組活細胞數)／對照組活細胞數×100％6．2試驗結果首先觀察尿多酸肽組合物溶液作用6天時，對HL-60細胞的抑制作用(即量效關係試驗)，試驗共三批，結果合列於表7。其中一批結果作成附圖31。可知本發明尿多酸肽組合物溶液對體外培養的HL-60細胞有直接生長抑制作用。藥物作用細胞6天後，其IC50為0．18mg／ml。
表7不同濃度尿多酸肽組合物溶液對HL-60細胞生長的抑制作用
#μg／ml，*P＜0．01又以1．2mg／ml的尿多酸肽組合物溶液，進行了處理不同天數對HL-60細胞生長曲線抑制作用的動態觀察，每日計數細胞數，結果見表8及附圖32。可知對照組細胞呈線性生長，用藥組細胞生長受抑制，至接種後的第6天，用藥組細胞與接種時細胞數仍相近。
表8尿多酸肽組合物作用細胞不同天對HL-60細胞生長的抑制情況
6．3試驗結論體外實驗結果表明本發明尿多酸肽組合物溶液對HL-60細胞有明顯抑制的作用，且有量效關係。藥物作用6天，當濃度大於2mg／ml時，細胞全部死亡，其對HL-60細胞的IC50為0．18mg／ml，而且能使HL-60細胞生長曲線明顯受到抑制(曲線變平)。
7．本發明尿多酸肽組合物溶液溶液對HL-60細胞誘導分化作用7．1試驗方法及步驟7．1．1NBT還原反應藥物作用細胞7天，取細胞懸液，以1000rpm的速度離心分離，收集細胞棄上清液，以PBS洗1次，加入含有TPA的NBT工作液，37℃保溫45分鐘，離心1000rpm收集細胞，鏡檢，顯微鏡下觀察200個細胞，胞漿中有藍紫色者為NBT還原陽性細胞，算出NBT反應陽性細胞百分數。
7．1．2形態學變化的觀察藥物作用細胞7天，取細胞懸液，離心1000rpm收集細胞棄上清液，細胞塗於載玻片上，晾乾，用甲醇固定3分鐘，緩衝液衝洗晾乾，Giemsa染色，在顯微鏡下觀察細胞形態。計數200個細胞，算出成熟細胞百分數。
7．2試驗結果NBT還原反應和細胞形態學的觀察結果綜合列於表9。可知①藥物作用HL-60細胞7天，細胞NBT還原反應陽性百分率增高，有大於50％的細胞向中、晚幼粒方向分化，與對照組相比差異在統計學上有非常顯著意義(P＜0．01)。未用藥組的分化率小於3％。②用藥組分化成熟細胞百分率也明顯高於對照組(P＜0．01)。③RA組的相應數值也都明顯高於對照組(P＜0．01)，說明本試驗方法有效可靠。
顯微鏡下細胞形態觀察結果列於附圖33-35。
表9尿多酸肽組合物體外作用HL-60細胞7天後的誘導分化作用
7．3試驗結論體外試驗表明本發明尿多酸肽組合物溶液在1．2mg／ml時對HL-60細胞有生長抑制作用，在此藥物濃度作用下，HL-60細胞培養7天後NBT還原反應陽性細胞增多，有50％以上的細胞形態發生改變，細胞核縮小，偏向一邊，核漿比例減少，出現腎型核。顯示細胞由早幼粒向晚幼粒成熟方向分化。
8．尿多酸肽組合物溶液在體試驗對人急性早幼粒白血病細胞(HL-60)生長抑制及誘導分化作用8．1試驗方法及步驟8．1．1試驗方法體內試驗選用小鼠腎囊下接種法。
8．1．2試驗步驟纖維蛋白凝塊的製備取對數生長期的HL-60細胞，1000×g／min離心5min，濃縮體積到1ml，其中含細胞4×107個。先後加人纖維蛋白和凝血酶工作液使之形成細胞凝塊，在培液中將它切成等體積小塊用於移植。
接種選用25-28g的昆明小鼠，接種前一天腹腔注射環磷醯胺(150mg／kg)以抑制其機體免疫反應。移植時將凝塊插入到小鼠腎囊膜下。
8．1．3分組及劑量設置給藥前動物隨機分組，每組動物數為8隻。本發明尿多酸肽組合物溶液溶液設320，640，1280mg／kg三個劑量組，不同劑量組用生理鹽水稀釋成所需濃度，陽性對照組用維甲酸(RA)，RA為目前臨床上應用的腫瘤誘導分化劑。對照組用生理鹽水。
8．1．4給藥方法均為腹腔注射給藥。本發明尿多酸肽組合物溶液溶液於接種後次日給藥，連續7天。空白對照給生理鹽水。
8．1．5療效評價第8天處死動物，在解剖鏡下以接目測微尺測量腫瘤長短徑。
腫瘤體積=長徑×短徑×短徑／2。
抑瘤率=(對照組瘤體積-用藥組瘤體積)／對照組瘤體積×100％。
8．1．6形態觀察將荷瘤鼠腎在10％甲醛中固定，用石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察形態變化。
8．2試驗結果數據的統計處理用t-檢驗和Logit法計算ED50，均以「藥理學計算與統計程序」軟體進行處理。
各組試驗結果列於表10(包括重複試驗在內共三批)和附圖36。可見隨本發明尿多酸肽組合物溶液溶液劑量的增加其抑瘤率也因之上升。對第一批結果，Logit法計算本發明尿多酸肽組合物溶液溶液對小鼠荷瘤的ED50為87mg／kg。二、三批結果數值高一些。t-檢驗表明各用藥劑量組的抑瘤率與對照組相比均有顯著差異。藥物在中劑量和高劑量時的抑瘤率與陽性對照組RA抑瘤率相似，給藥後小鼠體重毛色均無明顯不良變化。
表10不同劑量本發明尿多酸肽組合物對小鼠腎囊下HL-60細胞生長抑制作用
*P＜0．05．**P＜0．01
各組腎囊膜下生長的HL-60細胞的形態學顯微照片見附圖37-39。
8．3試驗結論通過體內試驗表明，本發明尿多酸肽組合物溶液對HL-60細胞生長有明顯的抑制作用，劑量在640mg／kg時抑瘤率達到66％左右，三次重複試驗結果表明，加大用藥劑量後其抑瘤率依然維持在此水平，顯示了分化誘導劑的非殺傷性特點。
目前體內的分化誘導試驗模型不多，我們採用國際上比較成熟的方法即Fimgert的腎囊膜下接種分析法，將體外培養的人體腫瘤細胞接種於經免疫抑制的昆明小鼠腎囊膜下，用藥後經固定、切片、HE染色，鏡檢觀察細胞形態。結果發現，本發明尿多酸肽組合物溶液在640-1280mg／ml時HL-60細胞形態上呈現明顯的分化現象，瘤組織中出現大量中晚幼粒及成熟細胞，其分化程度在1280ml／kg時更為明顯。
實施例十三尿多酸肽組合物溶液抗人原發性肝細胞肝癌生長和轉移的作用1．受試藥物注射用尿多酸肽組合物由本公司生產提供。合衛藥批(95)003號，批號980701，固含量200mg／ml，每瓶100ml。
2．受試動物裸小鼠品系SPF級，BALB／C裸小鼠。由中國科學院上海藥物研究所實驗動物部(上海市實驗動物管理委員會認可並頒發和合格證的單位)提供。合格證號滬動合證字122號。體重18-22克，每組動物數為8隻。
3．細胞株LCI-D20人原發性肝癌的高轉移模型，由上海醫科大學肝癌研究所建立。該肝癌在肝包膜下原位接種後可快速生長並有腹腔內和肺轉移，轉移率可達100％。
人肝癌細胞系MHCC97由上海醫科大學肝癌研究所建立。該細胞與LCI-D20人原發性肝癌的高轉移模型同源，具有高轉移特性。
4．在體注射用尿多酸肽組合物對人原發性肝細胞肝癌生長和轉移的抑制作用4．1實驗方法4．1．1LCI-D20人原發性肝癌高轉移裸鼠模型的製備將LCI-D20人原發性肝癌高轉移瘤塊在無菌條件下切割成1mm3大小備用。裸鼠預飼養7天後施行手術。裸鼠麻醉後常規消毒，打開腹腔，將瘤塊行包膜下套管接種，關腹並將動物放回飼養，觀察。術後無感染，傷口癒合良好。術後繼續餵養10天，第11天開始給藥，連續20天。
4．1．2實驗分組給和給藥方案對照組生理鹽水低劑量組(L)注射用尿多酸肽組合物600mg／kg。
中劑量組(M)注射用尿多酸肽組合物1200mg／kg。
高劑量組(H)注射用尿多酸肽組合物1800mg／kg。
由於LCI-D20人原發性肝癌高轉移裸鼠對細胞分化劑視黃酸(RA)並不敏感，無肯定的療效，故本實驗未設陽性對照組。
4．1．3實驗方法和觀察指標藥物均為腹腔注射。模型鼠在術後繼續餵養10天，第11天開始給藥，連續20天。第21天處動物，剖腹觀察腫瘤生長和腹腔轉移的情況。
腫瘤稱重並用下列公式計算抑瘤率腫瘤抑制率(％)=(1-T／C)×100式中T為給藥組平均瘤重；C為對照組平均瘤重。
肝癌轉移觀察指標肉眼觀察腹腔腫瘤的播散結節，多髮結節和廣泛轉移的狀況。
4．2實驗結果
4．2．1注射用尿多酸肽組合物對人移植性高轉移肝癌LCI-D20生長的抑制作用結果見表11。可知注射用尿多酸肽組合物3劑量對瘤的生長均有抑制作用。
表11注射用尿多酸肽組合物對人移植性高轉移肝癌LCI-D20生長的抑制作用
*P＜0．05，**P＜0．01，按Student t-test統計處理4．2．2注射用尿多酸肽組合物對人移植性高轉移肝癌LCI-D20腹腔轉移的影響結果見表12。表明注射用尿多酸肽組合物治療可大大減少移植性肝癌的腹腔轉移。治療各組均未發現廣泛轉移其中尤以H組的療效顯著。
表12注射用尿多酸肽組合物對人移植性高轉移肝癌LCI-D20腹腔轉移的影響
5．注射用尿多酸肽組合物對肝癌組織中原癌基因表達的影響5．1實驗材料和方法5．1．1實驗材料肝癌組織取自對照組和注射用尿多酸肽組合物處理各組。組織置於-80℃保存備用。TRIzol購自GIBOCO公司。AMV逆轉錄酶，Taq DNA聚合酶，Rnasin，dNTP，Oligo(dT)15購自PROMAGA公司。PCR引物由上海賽百盛公司代理在加拿大合成。引物序列如下
5．1．2 RNA提取本實驗採用TRIzol一步法。50mg肝癌勻漿後加入1ml TRIzol液，震蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。加入0．2ml氯仿，顛倒混勻，冰上放置5分鐘，12000rpm，4℃離心15分鐘。取約0．6ml上層液體，加入0．5ml異丙醇，室溫放置30分鐘，12000rpm，4℃離心10分鐘。棄去上清，用預冷的75％乙醇洗兩次。棄乙醇後置室溫20分鐘以揮發至幹。每管的純化的DNA用50μl DEPC處理的水溶解，保存在-70℃。
5．1．3逆轉錄反應(Reverse Transcription，RT)10μl RNA樣品在70℃變性10分鐘，分別加入5X逆轉錄緩衝液10μl，2．5mM dNTPs，12μl；AMV逆轉錄酶20U，RNasin50U，Oligo(dT)15200ng；用DEPC水補足體積至50μl。42℃溫育1小時，95℃變性10分鐘。
5．1．4多聚酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)分別取逆轉錄反應物(cDNA)用於PCR反應。其體系為逆轉錄反應物，5μl；10xPCR緩衝液，5μl；上，下遊引物各20pmol；Taq DNA聚合酶，5U；2．5mM dNTPs，2μl；15mM MgCl25μl，最後用水補足體積至50μl。反應條件為95℃，1分鐘；60℃，1分鐘；72℃，1．5分鐘。共35個循環；然後72℃下延伸10分鐘。PCR產物經2％瓊脂糖(含0．5μg／ml的溴化乙啶)電泳，電泳圖譜由VDS凝膠圖象分析系統掃描分析得測定條帶的積分光密度(IntegratedOptical Density，IOD)。
5．1．5計算和統計本實驗以β-actin作為內參照標準。
基因相對表達值=IOD測定條帶／IODβ-actinStudent t- test為統計方法。
5．2試驗結果5．2．1注射用尿多酸肽組合物對移植性高轉移肝癌LCI-D20組織中原癌基因表達的影響結果見表13和圖40。研究表明，高劑量注射用尿多酸肽組合物(H組和H+CT組)對上述肝癌組織中原癌基因c-myc，N-ras，c-jun和c-fos的表達有明顯的下調作用。中劑量(M組)注射用尿多酸肽組合物僅能減少N-ras的表達，而低劑量注射用尿多酸肽組合物(L組)對上述基因的mRNA的表達無作用。表13注射用尿多酸肽組合物對人移植性高轉移肝癌LCI-D20組織中原癌基因表達的下調作用
本表數據為基因相對表達值，*P＜0．05，**P＜0．01，與對照組相比6．注射用尿多酸肽組合物對肝癌組織中基質金屬蛋白酶9(Matrix Metalproteinase-9，MMP-9)基因表達的調節6．1材料和方法RT-PCR的方法同B-1-1 。
MMP-9的上遊引物5′-TGGCCGGCCACTGTGCGCCCCTCCGAG-3′。下遊引物5′-CACTAGGTTCACCTTCGTTCCGGGTACT-3′。擴增片段長度為633bp。PCR反應條件94℃，1min；55℃，1min；72℃，1min；共40個循環，72℃延伸5min。
6．2結果結果見表14的MMP-9項和圖41。MMP-9是近年來發現的，與腫瘤細胞水解細胞外基質(Extracellular Matrix，ECM)的能力相關，是反映腫瘤侵襲和轉移能力的客觀指標之一。注射用尿多酸肽組合物能有效地下調該基因的mRNA的轉錄。研究表明，本研究所採用的劑量範圍內，呈一定的劑量效應。且與5-FU(5-氟尿嘧啶上海旭東海普藥業有限公司，滬衛藥準字(1995)第013013號，批號980704，製劑0．5g／10ml)有協同效果。
表14注射用尿多酸肽組合物對MMP-9基因轉錄的抑制作用；注射用尿多酸肽組合物治療對肝癌組織的整合素β1亞基和E-鈣粘素含量的作用
與C組相比，*P＜0．05；**P＜0．01．數據以積分光密度Mass／g組織表示。
7．注射用尿多酸肽組合物對整合素β1亞基和E-鈣粘素表達的影響7．1材料和方法材料肝癌組織的收集同上。抗整合素β1亞基單克隆抗體(Anti-human Integrin β1mAb)由上海醫科大學基礎醫學院生物化學教研組查錫良教授饋贈。抗E-鈣粘素抗體(Anti-human E-Cadherin mAb)，購自Santa-Crus公司。HRP-羊抗鼠IgG，華美公司。其他試劑均為分析純。
Western印跡法樣品稱重後加入裂解液RIPA1ml，冰浴放置10分鐘。然後4℃下500rpm離心15分鐘，取上清液。將處理的樣品液上樣後作SDS聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳結束後將凝膠置於半乾式電轉移儀中，從凝膠上直接將蛋白質轉移至PVDF膜上，然後以含3％BSA的封閉液中封膜二小時後加入第一抗體，4℃過夜，第二天按常規洗滌後加入HRP標記的二抗，溫育二小時後，用DAB顯色。將顯色後的PVDF膜晾乾。在VDS圖像分析系統下掃描半定量，得條帶的IOD值。凝膠則作考馬斯亮藍染色以了解電轉移的情況。
斑點免疫印跡(Dot Immunoblotting)先將PVDF膜放在甲醇中浸透(約3分鐘)，以去離子水漂3次後，用0．02M PBS洗膜兩次，然後將膜置於電雜交儀內，但形成負壓後，每孔加樣品原液10μl．(標本處理同Western印跡法)。標本均作雙份點樣，點樣後將膜以含3％BSA的封閉液中封膜二小時後加入第一抗體，4℃過夜，第二天按常規洗滌後加入HRP標記的二抗，溫育二小時後，用DAB顯色。將顯色後的PVDF膜晾乾。在VDS圖像分析系統下掃描半定量，得斑點的Mass值。
結果表示以IOD或Mass／g肝癌組織表示。
7．2結果腫瘤在生長和轉移過程中，往往有粘附分子表達的改變。整合素β1亞基(Integrinβ1 subunit)是一類重要的異型粘附分子，介導異種細胞間的粘附，參與細胞的信息傳導。而E-鈣粘素(E-Cadherin)也是一類重要的同型粘附分子，參與同種細胞間的粘附；腫瘤轉移時原位灶的E-鈣粘素表達會有明顯的減少。結果顯示與對照組(C組)相比，注射用尿多酸肽組合物治療後，M組，H組，H+CT組的整合素β1亞基量的下降有統計學意義。而H組和H+CT組的E-鈣粘素的含量的上升有顯著意義。見表14的相關項和圖42。
8．應用免疫組織化學檢測注射用尿多酸肽組合物治療對肝癌組織的E-鈣粘素和增殖性細胞核抗原Ki67的影響8．1．材料和方法材料抗人增殖性細胞核抗原Ki67抗體購自華美公司。其餘試劑同上述部分。
方法1)新鮮肝癌標本用甲基纖維素(OCT)包埋後，在恆冷切片機上製備8μ冰凍切片，然後用丙酮在室溫下固定10分鐘，備用。
2)切片用正常羊血清封閉半小時後洗去。分別加上E-鈣粘素或Ki67工作液(1∶50)，置於4℃過夜。
3)用PBS液洗去一抗，共三次，用濾紙吸去組織周圍的緩衝液(以下同)，再加入生物素化二抗(抗羊或抗鼠IgG)，在室溫下溫育一小時。再用PBS洗去二抗後加上三抗(A+B混合物)，室溫下溫育一小時，然後用PBS洗去。
4)DAB溶液(0．5mg／ml)加3％ H2O25-10μl混勻後滴在切片上染色。溼片在顯微鏡下看到出現棕黃色顆粒，然後洗去DAB液。切片在以蘇木精復染，脫水封片鏡檢。
5)判斷標準E-鈣粘素棕黃色顆粒定位於胞漿和／胞膜的癌細胞為陽性細胞。陽性細胞佔腫瘤細胞總數的百分比≤5％為+；≤20％為++；＞20％為+++。
Ki67棕黃色顆粒定位於胞核的癌細胞為陽性細胞。陽性細胞佔腫瘤細胞總數的百分比≤5％為+；≤20％為++；＞20％為+++。
8．2結果8．2．1注射用尿多酸肽組合物對LCI-D20肝癌組織中E-鈣粘素表達的免疫組織化學檢測結果見表15，顯示，注射用尿多酸肽組合物可增加組織中E-鈣粘素的表達。與對照組相比，治療各組的陽性率增加。其中以M組增加最為顯著。
表15免疫組織化學法對肝癌組織中E-鈣粘素、Ki67檢測的半定量結果
8．2．2注射用尿多酸肽組合物對LCI-D20肝癌組織中Ki67表達的免疫組織化學檢測結果顯示見表15右側，各種劑量的注射用尿多酸肽組合物處理對LCI-D20肝癌組織中Ki67表達無明顯的影響。
9．注射用尿多酸肽組合物對高轉移人肝癌細胞株MHCC97粘附、浸潤和移動性能的影響9．1注射用尿多酸肽組合物對高轉移人肝癌細胞株MHCC97粘附性能的影響9．1．1材料和方法1)纖維連接蛋白包被板的製備將1mg／ml纖維連接蛋白(Fibronectin，Sigma公司)用0．01mol／L PBS稀釋至10ng／ml。用無血清的DMEM培養液洗後用無血清的DMEM培養液調配至5×103細胞／50μl。以每孔100μl包被96孔酶標板，37℃，2小時溫育後4℃過夜。次日以PBS洗板，再用0．1％BSA(Sigma公司)封閉，37℃，2小時。用PBS洗後待用。
2)細胞製備用0．25％胰酶；0．02％EDTA消化細胞，並用無血清的DMEM培養液洗後用無血清的DMEM培養液調配至5×103細胞50μl。
3)粘附實驗在纖維連接蛋白包被板上加入已處理的人肝癌細胞MHCC97，5×103細胞／孔。對照孔加入50μl PBS；實驗孔加入注射用尿多酸肽組合物至設定的濃度。每孔總體積為100μl。37℃，5％CO2孵育4小時，輕柔洗去未粘附的細胞。每孔用100μl 10％中性福馬林固定30分鐘，5％結晶紫染色10分鐘。SLT210酶標儀測定光密度，波長為595nm。
4)分組對照組50μl DMEM(含5×103細胞)+50μl PBS
注射用尿多酸肽組合物實驗組10mg／ml組50μl DMEM(含5×103細胞)+25μl注射用尿多酸肽組合物+25μl PBS15mg／ml組50μl DMEM(含5×103細胞)+37．5μl注射用尿多酸肽組合物+12．5μl PBS20mg／ml組50μl DMEM(含5×103細胞)+50μl注射用尿多酸肽組合物9．1．2結果結果列於表16。本實驗共進行6次，其結果相同，趨勢一致。除10mg／ml注射用尿多酸肽組合物與對照相比無顯著差異外，15mg／ml和20mg／ml注射用尿多酸肽組合物對MHCC97高轉移細胞株對纖維連接蛋白的粘附抑制作用與對照相比有顯著性差異(P＜0．05)。
表16注射用尿多酸肽組合物對高轉移人肝癌細胞株MHCC97粘附性能的影響
p＜0．0001，注射用尿多酸肽組合物整體與對照組相比方差分析(F檢驗)的結果9．2注射用尿多酸肽組合物對高轉移人肝癌細胞株MHCC97浸潤性能的影響、注射用尿多酸肽組合物離體對MHCC97人高轉移肝癌細胞株蛋白酶的抑制作用9．2．1材料和方法用0．05mol／L TBS液(Tris-HCl，pH7．6；0．17mol／L NaCl，0．02mol／L CaCl2)配製2％瓊脂糖，高壓消毒，冷卻至37℃時與預熱的Ⅰ型膠原(Collagen Type I Solution，3mg／ml，日本和光純藥工業株式會社)按1∶1混合後，加入到24孔培養板，每孔800μl，4℃凝結過夜。次日用打孔機打孔，然後將處理好的MHCC97細胞分別加入不同的孔中，每孔20μl(含1×104細胞)。每組3孔。小心加入無血清的DMEM培液。37℃，24小時孵育。小心取出凝膠片，用生理鹽水充分洗滌後，浸於0．1％考馬斯亮藍R250溶液(以45％甲醇-10％冰醋酸配製)中，室溫下染色30分鐘，移至45％甲醇-10％冰醋酸溶液中脫色，拍照。
細胞製備同前。注射用尿多酸肽組合物濃度設置為1．25mg／ml，2．5mg／ml和5．0mg／ml。
9．2．2結果結果見表14及附圖43。對照組中，由於MHCC97細胞有分泌膠原酶和明膠酶的能力，對細胞外基質，如膠原蛋白有強的降解的能力。故本實驗中，細胞外的膠原蛋白大部分被降解，所以考馬斯亮藍R250不染色或較少染色。與對照組相比，1．25mg／ml的注射用尿多酸肽組合物處理並不表現對膠原酶的抑制；而2．5mg／ml的注射用尿多酸肽組合物呈現對膠原酶的抑制；5．0mg／ml以上的注射用尿多酸肽組合物表現出最大的抑制作用。說明注射用尿多酸肽組合物能抑制MHCC97細胞的浸潤性。
9．3注射用尿多酸肽組合物對高轉移人肝癌細胞株MHCC97移動性能的影響9．3．1材料和方法用0．01mol／L PBS液配製0．7％瓊脂糖，高壓消毒，稍冷卻加到24孔培養板，每孔2000μl，4℃凝結過夜。次日用打孔機打孔，然後將處理好的MHCC97細胞分別加入不同的孔中，每孔20μl(含5000個細胞)。每組3孔。小心加入含10％人AB型血清的DMEM培液1．5ml。24小時後吸去培液。分別再加含0．625mg／ml，1．25mg／ml，2．5mg／ml，5mg／ml和10mg／ml注射用尿多酸肽組合物的DMEM培液(含10％人AB型血清)。每孔加1．5ml，每組3孔。每二天換液一次，共培養5天，每24小時觀測細胞的移動距離。
9．3．2結果除10mg／ml注射用尿多酸肽組合物的細胞趨變性壞死，未見明顯的細胞向外移動外，其餘各組與對照組相比無明顯差異；細胞均有向外移動，且移動距離的差異無統計學意義。實施例十四．注射用尿多酸肽藥物組合物離體試驗對人類血癌細胞的生長和端粒酶活性的抑制人的骨髓血癌細胞(HL-60cells)株從長庚大學醫學院臨床醫學研究所獲得。細胞株保持在懸浮於RPMI-1640的培養基中(GIBCO，長島，紐約)，包含10％的牛胎血清(HyClone，Ligan，UT)在5％二氧化碳和95％空氣溫度、37℃的培養箱中。
注射用尿多酸肽藥物組合物(亦稱分化誘導劑)是從新鮮人尿中純化出來的，能引導異常甲基複合酶轉變成正常甲基複合酶。注射用尿多酸肽藥物組合物為本公司樣品。
血癌細胞的生長曲線在有、無注射用尿多酸肽藥物組合物的存在下在實驗時構造出來。總細胞數是以血細胞計數器計算。細胞生存力決定於染色細胞用0．25％胎盼蘭染色計數，不被染色的細胞的部份當做殘存的部份。細胞形態用顯微鏡觀察。分化情況的評定是經過觀察生長能力的消失而沒有失去細胞的生存力和細胞形態的改變。
細胞提取製造CHAPS細胞分解緩衝液的原料溶液[10mM Tris-鹽酸(pH 7．5)，1mM氯化鎂，1mM EGT，0．5％CHAPS，10％甘油(v／v)]貯藏於4℃溫度中。使用前加入phenylmethanesulphonyl floride(PMSF)和巰基乙醇，使最後濃度分別為0．1和5mM。細胞的提取是將細胞懸浮於CHAPS緩衝液中，細胞數為2×103cells／ml，置於冰中培養30分鐘，然後以14，000g在4℃離心30分鐘，上清液移入試管用作端粒酶活性測試。蛋白質濃度用Commassie蛋白質測試劑測定(Pierce)。
端粒酶的測試端粒酶活性的定量是用PCR方法將端粒單位擴增複製(TRAP)(Kim et al．1994)。TS引物(5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′)和CX引物(5′-[CCCTAA]3 CCCTAA-3′)是用長庚儀器中心的DNA合成儀器(Model 380B，Applied Biosystems)合成。TS引物的5′-終端用T4多核苷酸激酶以[γ-32P]ATP標誌。TRAP的定量，首先讓端粒酶來延伸TS引物，與0．1μgTS引物，500nCi放射性元素標誌的2．5mM dNTPs，20mM Tris-鹽酸(pH8．2)，1．5mM氯化鎂，63mM氯化鉀，0．005％ Tween-20，1mM EGTA，0．1mg／ml BSA，以及2單位的Tag DNA合成酶。在反應液裡也加入0．5μg的RNase A。端粒酶延伸反應後，加入0．1μg的CX引物來進行PCR擴增，總共30周期在94℃30秒，55℃30秒，然後72℃1．5分鐘。PCR產物用膠電泳用54mM硼酸，1．2mM EDTA分離，DNA帶型用自體放射照片和SyBr染色顯示出來。染色照片在254nm紫外光照射下拍照。至於端粒酶活性的定量，TRAP產物的自體放射照片用ImageQuaNTm(Molecular Dynamics)作電腦密度掃描。每一處理過的樣本除去緩衝液底值後與沒有處理的樣本比較相對密度。
試驗結果1．注射用尿多酸肽藥物組合物誘導分化後對血癌細胞繁殖的抑制圖50．表示血癌細胞成長於無注射用尿多酸肽藥物組合物和用兩種注射用尿多酸肽藥物組合物劑量使用6天的血癌細胞的生長曲線。在劑量2mg／ml時，細胞對注射用尿多酸肽藥物組合物顯示有毒性的反應，因為有生存力的細胞迅速地降低到1×104cell／culture的水平下。到第4天和第6天細胞數更降低到少於開始細胞數的一個對數的水平(圖51)。在1mg／ml時到第4天和第5天，與對照組相比顯示細胞大約減少90％。
2．注射用尿多酸肽藥物組合物分化誘導後血癌細胞端粒酶的活性狀態過去曾顯示細胞抽取物可能因含有某些未知的因素而能減少TRAP的定量值(Bnoccoli etal．1995)。為了正確的定量我們用不同的細胞液濃度(0．01到3μg)以獲得酶活性的直線幅度。圖52顯示血癌細胞在對照和兩個注射用尿多酸肽藥物組合物劑量存在下的相關的端粒酶活性。用1mg／ml濃度的注射用尿多酸肽藥物組合物時，很清楚的可以看到端粒酶的密度減少，PCR產物的複雜性與密度隨培養時間遞減(圖52C、D、E)。當血癌細胞用2mg／ml的注射用尿多酸肽藥物組合物培養時，生存了2天和4天的血癌細胞的端粒酶活性兩者都減到幾乎不能察覺的程度(圖532F、G)。當我們對血癌細胞在沒有注射用尿多酸肽藥物組合物存在的同樣的溶液中生存了2天，4天和6天的細胞進行測試發現與在第4天和第6天收成的血癌細胞的端粒酶活性類似(沒有提示資料)。這與血癌細胞在2天收成如圖52第二行(B)所示的沒有什麼基本的不同。PCR產品的自體放射照片在生長於無注射用尿多酸肽藥物組合物(第2天，B行)或注射用尿多酸肽藥物組合物濃度在1mg／ml時(第2天，C行；第4天，D行；第6天，E行)的血癌細胞(HL-60cells)體外抽取物。同時以注射用尿多酸肽藥物組合物濃度在2mg／ml時進行相似的測試(第2天，F行；第4天，G行)。A行，陽性對照(結果取自無細胞抽取物的端粒酶測試)。血癌細胞(HL-60cells)在第4天和第6天收成的端粒酶活性顯示與第2天B行(沒有顯示)的照片外形基本上完全相同。
上述用自體放射照片定量PCR產物的結果如用密度器定量時可以更清楚表示端粒酶活性的消失，在1mg／ml的注射用尿多酸肽藥物組合物，端粒酶的活性隨培養時間遞減(圖53上半部)。另一方面，在第2天和第4天收成的細胞的端粒酶的活性顯示有劇烈減低到不能察覺的程度(圖53下半部)。結果列於圖中的曲線表示相關密度的百分率(％)。設每第2，4或6天的無受試物的對照的密度為100％。密度的值數是從圖3試驗的自體放射照片以密度器測讀軟片而轉換獲得。每一受試例子的活性是以受試例子的端粒酶活性除無受試對照×100％。
討論一個連續重複5』TTAGGG3』順序是發生在真核染色體兩端的端粒(Harley，1991；Blackburn，1992；de Lange，1994；Morin，1995；Kiplin，1995；Rhyu，1995)。端粒假定的功能包括下列幾項(i)保護染色體末端以防止外切核酸酶和連接酶的作用；(ii)防止DNA損害調查點的活性；(iii)補償DNA在每一次複製時末端的損失(Hartey 1992；Blackburn，1992；de Lange，1994；Kipling，1995)。端粒的六核苷酸是由核糖核酸核蛋白這種端粒酶促成的(Blackburn，1992)。有不少文獻報告端粒酶的作用涉及細胞的老化和癌細胞的永恆分裂活性(Rhyu，1995)。人類細胞端粒酶的活性在胎兒和成人的睪丸和卵巢的卵泡可以測出(Kim et al．1994)。但是端粒酶的活性在大部分的人體細胞組織測不出來(Counter et al．1995；Kim et al．1994)。相對的端粒酶的活性在大部分的腫瘤和永恆的培養細胞裡是能被察覺的(Kim et al．1995；Taharaet al，1995；Chadeneau et al．1995；Hiyama et al．1995)。
本研究裡，我們證明了注射用尿多酸肽藥物組合物是一種有效的分化誘導製劑，它可以抑制血癌細胞中端粒酶的活性。將這些細胞暴露於注射用尿多酸肽藥物組合物時產生抑制作用(圖50)。基於DNA分析血球記數流量的試驗，這些被分化的細胞顯示停留在細胞周期的G1階段(資料沒有顯示)。同時也顯示使用1或2mg／ml注射用尿多酸肽藥物組合物時端粒酶活性的抑制與時間的長久有密切的關係，端粒酶活性的抑制很可能是因為分化的誘導而不是單純的抗生長的效果。
因為人類端粒酶活性與癌的特殊關聯，這個酶成為很好的醫療靶。對癌細胞裡的端粒酶的特殊抑制或向下調節就可能限制這些細胞分裂次數，終於達到抑制腫瘤的生長。到目前為止關於體內端粒酶活性的調節知道的不多。端粒酶活性的減低細胞變成靜止狀態曾有過此類的報導(Holt et al．1996)。除此之外，對於幾種癌細胞株以細胞分化誘導向下調節端粒酶的活性最近有一些報導。這些結果可從細胞從早幼粒白血病細胞(Shanna et al．1995；Albanell et al．1996)，紅白血病(Sharma et al．1995)，骨髓細胞的血癌細胞(Zhang et al．1996)，胚胎癌(Albanellet al．，1996；Kurk et al．1996)，神經膠質瘤和黑瘤(Cheng et al．1997)等的細胞取得。然而兩種小鼠細胞株和兩種人的腫瘤，神經膠質瘤和黑瘤用分化誘導的方法並沒有失去端粒酶活性(Cheng et al．1997)。這可能與所用以研究的癌細胞的種類不同有關。
端粒酶活性在Xenopus模型(Mantell和Greider，1994)的細胞周期抽取物的S和M階段顯示很活躍，這提示端粒酶活性並不是被染色體的DNA複製所調節。因此，一次細胞周期的停止也許不能足夠抑制端粒酶的活性。另一方面，不是所有分裂的細胞需要端粒酶的活性。這種可能可以部份的解釋為什麼有一些分化的細胞保留繁殖的能力，而且是在沒有端粒酶活性下進行分裂；同時為什麼如上面所述在各種體外惡性腫瘤分化誘導結果對端粒酶活性有不同的抑制。前者顯明的例子有分化的纖維細胞、淋巴細胞、良性的腫瘤和某種血癌如ALL和CML(Morin，1995；Kim et al．1994；Tahara et al．1995)。
總而言之，我們研究的結果發現注射用尿多酸肽藥物組合物對血癌細胞經過細胞分化的誘導有抗腫瘤的療效，附隨的有抑制端粒酶活性的效果。端粒酶活性的抑制與劑量和時間有非常密切的關係。我們初步研究的結果顯示兩種人的黑瘤細胞株以0．5-4mg／ml的注射用尿多酸肽藥物組合物劑量處理7天結果並沒有抑制端粒酶的活性。從造血原始幹細胞獲得的癌細胞對分化誘導有反應而向下調節他們的端粒酶活性是很可能的，而從再回復突變得來的實體腫瘤細胞可能對端粒酶活性的分化調節沒有反應。不同種類的癌細胞的端粒酶活性對分化抑制的敏感性不同，有些癌細胞可能對「分化療法」有反應而其他的癌細胞就沒有反應。然而有一點應當記住，即使對注射用尿多酸肽藥物組合物治療沒有反應的腫瘤細胞，若與其它療法如放射療法合用時，與單獨接受放射療法相比較，發現更容易把癌細胞殺死，因此在使用注射用尿多酸肽藥物組合物以前，應當取樣少量癌組織鑑定其是否含有端粒酶，以確定其是否適用注射用尿多酸肽藥物組合物治療。
試驗結論通過離體試驗證明注射用尿多酸肽藥物組合物能抑制人骨髓血癌細胞(HL-60)的生長；並能抑制該細胞中端粒酶的活性，提示注射用尿多酸肽藥物組合物可能是一種細胞分化劑。
實施例十五．注射用尿多酸肽藥物組合物離體和在體對人肝癌Smmu的藥效研究受試藥物注射用尿多酸肽藥物組合物由本公司生產提供。批號970810。玻璃瓶膠塞鋁蓋無菌封裝，每瓶100ml。固形物含量200mg／ml。外觀呈深棕色澄明液。無沉澱和絮狀物現象，流動性良好，振蕩不起泡沫。避光室溫保存。試驗前直接或以無牛血清的DMEM適當稀釋備用。
動物裸鼠雌雄各半，體重18-20g，中國藥品生物製品檢定所動物繁育場提供。健康，預飼養7日。
飼養管理條件按SPF動物要求管理飼養。群養，每籠5隻，室內溫度、溼度、光照和通風控制合乎標準。自由攝食充足供水。實驗前觀察1周並記錄相應情況。
腫瘤細胞株人肝癌Smmu7721細胞，由中國藥品生物製品檢定所生化藥物與基因工程藥物室傳代培養。
試劑和器材試劑培養基DMEM(Sigma)液加入10％小牛血清，青、鏈黴素各100單位／ml，pH調至7．2-7．4。
MTT Sigma產，以DMEM液配製成0．4mg／ml的溶液。
二甲基亞碸北京化工廠，分析純。
環磷醯胺(CTX)200mg／支，上海華聯製藥有限公司。
儀器培養箱二氧化碳培養箱(Forma Scientific333型)酶標儀ETERTECH∑960型檢測項目、方法及試驗結果1．離體抗腫瘤試驗1．1試驗方法及步驟MTT法測定供試品對癌細胞的抑制作用。取對數生長期的癌細胞，用Versens消化液將細胞消化，懸浮於培養基中，將細胞濃度調至1．0×105個／ml，鋪96孔細胞培養板，100μl／孔，加供試品100μl／孔，每濃度4孔，設空白對照及正常細胞對照孔，培養板置37℃5％二氧化碳培養箱中，培養72小時，棄去上清液，加入MTT液100μl／孔，置37℃5％二氧化碳培養箱中4小時，棄去上清液，加入二甲基亞碸100μl／孔，置振蕩器上振蕩，至顆粒溶解為止，用酶標儀測定OD值，波長550nm，回歸計算IC50，即50％細胞存活濃度。OD值為4孔平均值。
1．2試驗結果試驗結果見表17。對照組OD值為1．131，細胞存活率定為100％。
細胞存活率=注射用尿多酸肽藥物組合物各劑量組的OD均值／對照組OD均值×100％可見隨著注射用尿多酸肽藥物組合物濃度增加OD及細胞存活率明顯減小，有密切的劑量依賴關係。
由表1數據求出注射用尿多酸肽藥物組合物的IC50等於0．78±0．41(x±s-)表17不同濃度注射用尿多酸肽藥物組合物離體對人肝癌Smmu7721細胞的作用
1．3結論注射用尿多酸肽藥物組合物對體外人肝癌細胞的半數抑制濃度IC50在0．72-0．83mg／ml的範圍內。
2．在體抗腫瘤試驗2．1試驗方法及步驟分組共5個組；注射用尿多酸肽藥物組合物3個劑量組；陽性對照為CTX；陰性對照為生理鹽水。
接種肝癌細胞懸浮液1-2×107個／鼠，背部皮下接種。接種一周後選擇接種上腫瘤的裸鼠(肉眼可見小米粒大小)，隨機均為分組，每組4-6隻。
給藥劑量供試品以生理鹽水稀釋成200、100、50mg／ml，腹腔注射0．2ml／只／次，即400、200、100mg／kg體重，每天1次，連續10天。
給藥途徑按《新藥(西藥)臨床前研究指導原則彙編》臨床用藥靜脈給藥者可用腹腔注射代替，故本實驗採用腹腔注射。
2．2試驗結果表18各組各批次裸鼠體內抗腫瘤試驗結果
*P＜0．05，**P＜0．01連續給藥10天，停藥24小時後處死動物，解剖剝離瘤塊，稱瘤重，計算抑瘤率及與空白對照作t-測驗，P＜0．05時表示差異有顯著性意義。4次試驗結果見表18。
計算公式抑瘤％=100×(C-T)／C式中T為給藥組平均瘤重，C為對照組平均瘤重。
5個組的瘤的外觀大小見附圖54-58。
2．3結論注射用尿多酸肽藥物組合物劑量為100-400mg／kg裸鼠體重時，對裸鼠接種人肝癌細胞株的抑瘤率在51．8-83．5％，具有一定的抑制腫瘤生長的作用。實施例十二注射用尿多酸肽藥物組合物離體對肺癌細胞，在體對腹水性肝癌、肝癌實體瘤以及肺癌實體瘤的影響受試藥物注射用尿多酸肽藥物組合物本公司生產提供。共3個批號960601，960606，960608。玻璃瓶膠塞鋁蓋無菌封裝，每瓶100mL。固形物含量40mg／mL。外觀呈深棕色澄明液。無沉澱和絮狀物現象，流動性良好，振蕩不起泡沫。避光室溫保存。
試驗前直接或以生理鹽水適當稀釋應用。
動物小鼠為昆明種封閉群，體重18-22g，皆為雌性，由中國醫科大學實驗動物部(遼寧省實驗動物管理委員會認可並頒發合格證書單位，瀋陽110001)提供，合格證號遼實動字第521號。健康，預飼養7日。
C57／BL純系黑鼠體重18-21g，皆為雌性，由中國醫科大學實驗動物部提供，合格證號遼實動字第532號。健康，預飼養7日。
飼養管理條件群養，每籠5隻，室內溫度、溼度、光照和通風自然，冬季有暖氣，必要時開通風扇。飼料為瀋陽市實驗動物飼料廠提供的實驗動物鼠全價顆粒飼料，標準代號DB21-741-93，自由攝食充足供水。實驗前觀察1周並記錄相應情況。
4．腫瘤細胞株(1)人肺癌細胞株AGZY-83A，引自鞍山市腫瘤研究所。用於離體試驗。
(2)肝癌細胞株HCP，中科院上海藥物研究所藥理研究室提供。液氮保存。用於小鼠腹水瘤及實體瘤模型。
(3)鼠肺癌細胞株Lewis肺癌，中科院上海醫藥工業研究院藥物所提供。用C57／BL鼠進行實體瘤造型。
試劑和器材RPMI培養粉 美國JR Scientific Inc生產。
小牛血清天津系列化製品所生產。
絲裂黴素日本Kyowa Hakko Kogyo有限公司生產，批號098AFC。
24孔培養板美國Corning(New York)產品。
檢測項目、方法及試驗結果1．離體抗腫瘤作用1．1試驗方法(1)試驗分組、濃度及給藥方案設計分為以下7組陰性(模擬處理)對照組加RPMI／1640培養液；低濃度組加受試藥物(0．157mg／mL)；中濃度組加受試藥物(0．313mg／mL)；高濃度組加受試藥物(0．625mg／mL)；超高濃度組(2組)加受試藥物(1．25或2．5mg／mL)；陽性對照組加絲裂黴素(0．01mg／mL)。
每組設3個重複孔。
(2)方法及步驟先將AGZY-83A細胞復甦培養，待細胞生長旺盛時，將細胞製成為1×104個／mL的濃度，向24孔板內每孔加1mL，再按上述分組加入等容相應藥液，置37℃5％CO2培養箱內，每隔24小時用0．4％臺盼蘭染色計數死、活細胞數，連續計測7天。
(3)計算公式細胞生長抑制率(％)=(1-各組活細胞數／陰性對照組活細胞數)×1001．2試驗結果試驗結果列於表19，可知受試藥物在一定濃度時對癌細胞有一定的抑制作用，且有量-效關係。但濃度較高濃度組再大時(1．25或2．5mg／mL)抑制作用並不再增加，因而測不到具體的IC50值。
表19各組對人肺癌細胞的抑制率(％，第7天3個孔均值)
陽性對照組 絲裂黴素陰性對照、高濃度及陽性對照組的生長曲線如圖3所示。
1．3試驗結論由以上結果可知離體試驗中受試藥物對人肺癌細胞的生長有抑制作用，且呈現量-效關係。但作用強度和性質與絲裂黴素不同，後者使細胞迅速死亡，不再生長。這說明受試藥物不是典型的細胞毒劑。
2．在體延長腹水型肝癌動物生存期作用的試驗2．1試驗方法(1)腫瘤造型將液氮保存的肝癌細胞復甦後，接種於小鼠腹腔內使形成腹水。抽出腹水收取癌細胞，用生理鹽水稀釋使癌細胞密度為2×106個／mL。取75隻小鼠，每隻小鼠腹腔接種0．2mL(4×105個癌細胞)，隨機分組，24小時後開始試驗。
(2)試驗分組、劑量及給藥方案設計分為以下5組(每組15隻小鼠)。受試藥物高劑量為1250mg／kg，相當人臨床用量(167mg／kg)的7．5倍。絲裂黴素劑量為1mg／kg，亦相當人臨床用量的8倍左右。
陰性(模擬處理)對照組iv生理鹽水；低劑量組iv受試藥物(6．25mg／20g)；中劑量組iv受試藥物(12．5mg／20g)；高劑量組iv受試藥物(25．0mg／20g)；陽性對照組iv絲裂黴素(0．02mg／20g)。
藥物以生理鹽水稀釋(高劑量組不稀釋)，每隻小鼠經尾靜脈iv鹽水或藥液0．5mL／20g，每天一次，連續14天。
(3)方法及步驟各組連續給藥14天後停止iv，但繼續飼養觀察動物一般狀況，記錄各組各動物的死亡時間及死時體重。
(4)計算公式生命延長率(％)=100×(T-C)／CT……各組的半均生存天數C……陰性對照組的平均生存天數2．2結果如上試驗先後共進行了兩批，結果合併列於表20。除表內數據外還重點觀察了動物的一般狀態(食慾、精神狀態、活動、皮毛)。絲裂黴素組動物，皆有食慾不佳、精神不振、萎蘼、活動少、皮毛無光和瘦小；而受試物組與陰性對照組則無此情況。
表20各組動物死時體重、生存天數及生命延長率的均值
結果表明受試藥物較之絲裂黴素能改善動物生活質量，動物體重不減少；在一定劑量時能延長動物生存期，有量效關係，雖然未達＞30％的療效標準，但延長率可達24％左右。
3．在體對抗動物肝癌實體瘤作用的試驗31試驗方法(1)腫瘤造型將液氮凍存的HCP肝癌細胞株復甦後，接種於小鼠前臂皮下，形成腫瘤後，取出腫瘤，製備癌細胞懸液。取50隻小鼠，每隻小鼠按3×105個癌細胞接種於小鼠前臂皮下。隨機分為5組，每組10隻。稱體重，24小時後開始試驗。
(2)試驗分組、劑量及給藥方案設計分為以下5組(每組10隻小鼠)陰性(模擬處理)對照組iv生理鹽水；低劑量組iv受試藥物(5．0mg／20g)；中劑量組iv受試藥物(10．0mg／20g)；高劑量組iv受試藥物(20．0mg／20g)；陽性對照組iv絲裂黴素(0．03mg／20g)。
藥物以生理鹽水稀釋(高劑量組不稀釋)，每隻小鼠經尾靜脈iv鹽水或藥液0．5mL／20g，每天一次，連續14天。
(3)方法及步驟各組連續給藥14天後，用乙醚處死小鼠，稱體重，剝離出腫瘤並稱瘤重。肉眼觀察後取主要臟器與瘤一併放入中性福馬林中固定。
(4)計算公式腫瘤抑制率(％)=(1-T／C)100T……各組的平均瘤重C……陰性對照組的平均瘤重3．2結果如上試驗先後共進行了三批，結果合併列於表20。除表內數據外還重點觀察了動物的一般狀態(食慾、精神狀態、活動、皮毛)。絲裂黴素組動物，皆有食慾不佳、精神不振、萎蘼、活動少、皮毛無光和瘦小；而受試物組與陰性對照組則無此情況，且受試物組動物狀態還好於陰性對照組。試驗過程中各組動物均有死亡。
表21各組動物存活數、瘤重及抑制率的均值(x±s)
** P＜0．01，*P＜0．05結果表明受試藥物在3種劑量時都能抑制腫瘤的生長，有量效關係，抑制率平均可達29％左右，高劑量組可達34．5％，與陰性對照相比差異在統計學上有尚顯著的意義(P＜0．05)。受試藥物能改善動物生活質量，而絲裂黴素雖有明顯抑瘤效果但使動物生活質量明顯惡化。
4．在體對抗動物肺癌實體瘤作用的試驗41試驗方法(1)腫瘤造型將兩隻已皮下荷Lewis肺癌株的C57黑鼠處死，75％乙醇消毒皮膚，切皮取出瘤塊，剪碎研磨後，過200目網、離心，用生理鹽水調細胞濃度為1×106個／mL，共28mL。取70隻C57／BL純系黑鼠，每隻皮下注射0．25mL。按體重組間一致原則分為5組，每組10隻。24小時後開始試驗。
(2)試驗分組、劑量及給藥方案設計分為以下5組(每組10隻小鼠)陰性(模擬處理)對照組ip生理鹽水；低劑量組ip受試藥物(5．0mg／20g)；中劑量組ip受試藥物(10．0mg／20g)；高劑量組ip受試藥物(20．0mg／20g)；陽性對照組ip絲裂黴素(0．025mg／20g)。
藥物以生理鹽水稀釋，每隻小鼠ip鹽水或藥液0．5mL／20g，每天一次，連續10天。
(3)方法及步驟各組連續給藥10天後，頸椎脫臼處死小鼠，稱體重，剝離出腫瘤並稱瘤重。肉眼觀察後取主要臟器與瘤一併放入中性福馬林中固定。
(4)計算公式腫瘤抑制率(％)=(1-T／C)×100T……各組的平均瘤重C……陰性對照組的平均瘤重4．2結果如上試驗先後共進行了三批，結果合併列於表22。除表內數據外還重點觀察了動物的一般狀態(食慾、精神狀態、活動、皮毛)。絲裂黴素組動物，皆有食慾不佳、精神不振、萎蘼、活動少、皮毛無光澤和瘦小；而受試物組與陰性對照組則無此情況，動物進食飲水和活動狀態良好，皮毛順滑有光澤。試驗過程中各組動物均有死亡。
表22各組動物存活數、瘤重及抑制率的均值(x±s)
**P＜0．01結果表明受試藥物在3種劑量時都能抑制腫瘤的生長，有量效關係，中高劑量組抑制率平均可達20％左右。受試藥物能改善動物生活質量，而絲裂黴素雖有明顯抑瘤效果(P＜0．01)但使動物生活質量明顯惡化，約1／3動物在試驗終止日期前死亡。
試驗總結4項試驗的結果證明了注射用尿多酸肽藥物組合物有一定程度的抗腫瘤藥效。①離體抗腫瘤作用試驗表明受試藥物對人肺癌細胞的生長有抑制作用，且呈現量效關係。②在體延長腹水型肝癌動物生存期作用的試驗受試藥物能改善動物生活質量，在一定劑量時能延長動物生存期(延長率24％左右)。③在體對抗動物肝癌實體瘤作用的試驗受試藥物能改善動物生活質量，在3種劑量時都能抑制腫瘤生長，抑制率平均可達29％左右，高劑量組可達34．5％(P＜0．05)；而絲裂黴素雖有明顯抑瘤效果(P＜0．01)但使動物生活質量明顯惡化。④在體對抗動物肺癌實體瘤作用的試驗受試藥物能改善動物生活質量，3種劑量都能抑制腫瘤的生長，有量效關係，中高劑量組抑制率平均可達20％左右；而絲裂黴素雖有明顯抑瘤效果(P＜0．01)但使動物生活質量明顯惡化，約1／3動物在試驗終止日期前死亡。故認為受試藥物有一定的抗腫瘤效果，且作用性質與絲裂黴素不同，前者改善而後者惡化動物生活質量。
實施例十六．尿多酸肽藥物組合物防治裸鼠肝癌轉移復發的療效觀察肝癌的轉移復發是目前影響肝癌療效的主要因素之一。即使是小肝癌早期根治性切除後，五年復發率也高達43．5％[1]。本實驗在裸鼠肝癌轉移發生前後行肝癌切除術，術後採用尿多酸肽藥物組合物皮下注射，觀察在體試驗其是否有防治裸鼠肝癌轉移復發的療效。
受試藥物尿多酸肽藥物組合物由本公司生產提供，批號970508。玻璃瓶膠塞鋁蓋無菌封裝，每瓶100ml。固形物含量40mg／ml。外觀呈深棕色澄明液。無沉澱和絮狀物現象，流動性良好，振蕩不起泡沫，避光室溫保存。試驗前直接或以生理鹽水適當稀釋應用。
動物裸鼠為BALB／CA品系，雄性，上海藥物研究所提供。鼠齡4-6周，體重17-20g。共13隻。健康，預飼養7日。
飼養管理條件按SPF動物要求管理飼養。群養，每籠5隻，室內溫度、溼度、光照和通風控制合乎標準。自由攝食充足供水。實驗前觀察1周並記錄相應情況。
腫瘤細胞株瘤源為上海醫科大學中山醫院肝癌研究所LCI-D20□裸鼠肝癌高轉移模型，斷頸處死動物，開腹取腫瘤組織，將其切成0．2×0．2×2cm3大小，置於4℃的生理鹽水中備用。
試驗方法動物模型的製作裸鼠用1％戊巴比妥鈉40-50ng／kg腹腔注射麻醉；左上腹橫切口約1cm，將肝臟暴露於切口處，切開肝包膜0．3cm，將瘤塊植於肝內，8-0無損傷外科縫線縫合肝包膜固定瘤塊，將肝臟輕輕送回腹腔，關腹。麻醉清醒後送回籠內飼養，術後自由進食。
本模型動物於種植後第19天發生轉移。實驗動物隨機分二組，早期癌組於接種後16天行肝癌切除術，晚期肝癌組於接種後22天行肝癌切除術。以上述同樣方法麻醉動物後，取右上腹橫切口，長約1cm，將肝臟暴露於切口下，仔細觀察肝內種植瘤生長的範圍，在距腫瘤邊緣約0．2cm處絞鎖縫合正常肝組織，局部切除肝癌組織。檢查局部無肝癌組織殘留後，按壓片刻，無活動出血後關腹。皮下注射生理鹽水1ml，麻醉清醒後送回籠內飼養，自由進食。
藥物用量與注射方案為增強療效同時合用鈣離子和Vit C。混合溶液配製；尿多酸肽藥物組合物注射液1ml(40mg)+10％葡萄酸鈣0．1ml+Vit C 0．5ml(250mg)。藥量為每隻動物每天皮下注射1．6ml。早期肝癌組在接種後16-24天連續皮下注射共9天，晚期肝癌組接種後23-31天連續皮下注射共9天。對照組注射等容的生理鹽水。
觀察指標於接種後35天，裸鼠稱重後以摘眼球放血的辦法處死動物，取雙肺稱重後，放於10％福馬林溶液中固定，石蠟包埋，每個蠟塊間隔50μm切取5μm厚切片一張，連續10張，雙側肺共20張，記錄轉移灶的數目。完整取出肝組織，記錄肉眼肝內轉移灶數目、分布及切緣復發情況。切緣復發灶大小按(腫瘤最大徑+與其垂直的腫瘤直徑)÷2計算，觀察記錄轉移累及臟器的數目。
試驗結果1．裸鼠體重改變早期肝癌切除對照組平均體重為24．3±2．1g，尿多酸肽藥物組合物組為25．8±1．9g，雖然尿多酸肽藥物組合物組稍高，但經過計量資料t-檢驗統計學處理，差異無顯著性(P＞0．05)。
晚期肝癌切除對照組平均體重為21．3±1．8g，尿多酸肽藥物組合物組為25．1±2．0g。經統計學分析，尿多酸肽藥物組合物組比對照組體重增高差異有顯著性(P＜0．05)。
2．肝內局部轉移復發情況表23不同治療組肝癌內轉移復發情況(x±s)
*與相應對照組比較P＜0．05，**與相應對照組比較P＜0．01正常裸鼠肝臟為7個葉，早期肝癌切除對照組5隻動物均出現肝內轉移灶，轉移灶數目7．2個，累及葉數為3．7個。尿多酸肽藥物組合物組5隻動物有3隻發生轉移，轉移灶數目2．6個，累及葉數1．8個。晚期肝癌切除對照組5隻動物均出現肝內轉移灶，最多為22個，所有7個葉均受累；最少肝內轉移灶1個，但較大同時累及3個葉；平均轉移灶數目8．6個，累及葉數4．6個。尿多酸肽藥物組合物組5隻動物只有3隻發生肝內轉移，轉移灶數目1．0個，累及葉數1．2個。因本組數據離散度較大，未做統計學分析，但從以上數據可看出，尿多酸肽藥物組合物組早期和晚期裸鼠肝癌切除後的肝內轉移均較對照組輕。(見表23)肝溼重早期切除二組無差別(P＞0．05)，晚期切除尿多酸肽藥物組合物組明顯減輕。
早、晚期切除切緣局部復發尿多酸肽藥物組合物組腫瘤直徑均較對照組小，但與對照組比較早期切除時在統計學上差異有顯著性(P＜0．01)．晚期切除時二組比較差異無顯著性(P＞0．05)。
3．肺遠處血行轉移情況表24不同治療組肝癌肺內轉移情況(x±s)
*與相應對照組相比P＜0．05雙肺共連續切片20張，在光鏡下計數轉移灶發生的數目之和。2個對照組5隻動物均見肺轉移灶，早期肝癌切除尿多酸肽藥物組合物組無肺轉移發生，晚期肝癌切除只有3隻動物有轉移灶，相應的二組比較統計學上均有顯著性．肺溼重治療與否均無差別。
4．轉移灶發生部位肺瘤接種後35天觀察，除上述肝原位轉移灶和肺遠處轉移灶外，尚可見切口、腸繫膜、生殖腺、肝門部、腎下極、脾門、膈肌、胰腺上緣轉移，早、晚期肝癌切除後應用尿多酸肽藥物組合物都可以抑制遠處轉移的程度。結果見表25。
表25不同組轉移灶累及臟器(x±s)
*與相應對照組相比P＜0．05討論與結論惡性腫瘤細胞無論在形態、功能和代謝上均類似於未分化的胚胎細胞，分化誘導劑可使腫瘤細胞的生物學和免疫學特性向正常細胞轉化。目前已取得較好臨床應用的是全反式視黃酸對早幼粒細胞白血病的治療，85．4％的病人可獲完全緩解。研究表現，細胞表面粘附分子在細胞未成熟期表達較高，隨著細胞成熟表達下降。肝癌的高轉移與細胞表面的細胞間粘附分子-1(ICAM-1)高表達有關。
尿多酸肽藥物組合物是一種細胞分化誘導劑，我們希望它能誘導細胞分化成熟，使肝癌切除術後殘留的癌細胞或有癌變傾向的細胞逆轉；也希望因此降低癌細胞表面粘附分子的表達，使其轉移能力下降。
實驗結果表明裸鼠肝癌轉移發生後行局部腫瘤切除後應用尿多酸肽藥物組合物，肝內轉移發生減少，肝溼重降低，切緣局部復發腫瘤也較少，能有效抑制內轉移和復發。反映遠處轉移的肺轉移灶數目和轉移累及的臟器的數目也減少，因此認為尿多酸肽藥物組合物能降低裸鼠晚期肝癌的轉移復發。裸鼠肝癌轉移發生前行局部肝癌切除後行尿多酸肽藥物組合物治療，肝內轉移灶和轉移累及臟器數目也減少，無肺內轉移發生，證明其對裸鼠早期肝癌切除術後的轉移復發也有良好的防治效果。
實施例十七．注射用尿多酸肽藥物組合物逆轉腫瘤耐藥的初步研究受試藥物注射用尿多酸肽藥物組合物由本公司生產提供。批號980508。玻璃瓶膠塞鋁蓋無菌封裝，每瓶100ml。固形物含量40mg／ml。外觀呈棕褐色半透明液。無沉澱和絮狀物現象，流動性良好，振蕩不起泡沫。避光室溫保存。
試驗前直接或以生理鹽水適當稀釋應用。
腫瘤細胞株人口腔磷狀上皮癌細胞(KB)VCR耐用藥株(KBV200)，由軍事醫學科學院附屬醫院腫瘤分子生物學實驗室保存。
人肺癌細胞(H23)，肺癌ADR、CDDP耐藥株(H1435)由臺灣饋贈。
試劑長春新鹼(VCR)北京醫科大學實驗廠產生。
鹽酸阿黴素(ADR)深圳萬樂藥業產品。
順鉑(DDP)齊魯製藥廠產品。
維拉帕米(Ver)江蘇連雲港製藥廠產品。
噻唑蘭(MTT)、異硫氰酸胍、RNasin、AMV逆轉錄酶均系Promega公司產品。
Taq DNA聚合酶寶生生物公司產品。
試驗方法及結果1．試驗方法細胞耐藥逆轉取對數生長期細胞，胰酶消化，調節細胞濃度3-5×104／ml，0．1ml／孔接種於96孔細胞培養板，培養1d，實驗組分別加注射用尿多酸肽藥物組合物0．4、0．8、1．2mg／ml。實驗對照組加Ver 6μg／ml。單獨作用組加抗癌藥。平行3孔。繼續培養3d，棄去培養液，每孔加0．4mg／ml的MTT200μl，培養4h，棄去MTT，每孔加DMSO 150μl，待溶解後，於Anthos2010酶標儀，在570nm處測光吸收值。實驗對照組以單加Ver為對照孔，實驗組以單加注射用尿多酸肽藥物組合物為對照孔，求出半數抑制濃度IC50。
引物設計MDR1基因引物取自其cDNA序列5′(2596～2615bp)；(2733～2725bp)；擴增片段167bp。MRP基因引物取自其cDNA序列5′(4670～4691bp)；3′(4988～500bp)；擴增片斷336bp。GST-π基因引物取自其cDNA序列5′(863～882bp)；3′(1192～1213bp)；擴增片段350bp。β-肌動蛋白(β-actin)基因引物取自其cDNA序列5′(346～367bp)；3′(558～580bp)；擴增片斷234bp。上述各引物均為上海醫科大學肝病研究所設計，上海生工公司合成。
細胞總RNA提取接種細胞3-5×105／瓶，貼壁培養48小時，至細胞生長對數期，實驗組給以注射用尿多酸肽藥物組合物至終濃度2mg／ml、4mg／ml。與對照組共同培養48小時後，胰酶消化，PBS洗滌離心後，採用異硫氰酸胍、酚-氯仿一步法提取細胞總RNA。
逆轉錄-PCR方法取細胞總數RNA 1μg，5×RT緩衝液4μl，10μg／ml oligo(dT)，0．5mmol／LdNTP Mix，65預變性5min，冰浴3min，加RNasin 10u，AMV逆轉錄酶10u，42反應60min，合成cDNA第一條鏈。在2μl上述cDNA產物加入10×PCR緩衝液2μl、MDRl、MRP、GST-π、β-actin引物各10pmol／L、Tap DNA聚合酶1u，(總體系統20μl)進行PCR擴增。循環參數為95變性40s，55退火40s，72延伸1min，30個循環，72補平10min。
PCR產物定量分析取擴增產物10μl，行2％瓊脂糖電泳，溴化乙錠染色。Kodak DigitalScience凝膠成像系統照相，1D軟體定量分析各條帶的含量，計算MDR1、MRP、GST-π與β-actin的化值。
2．試驗結果2．1注射用尿多酸肽藥物組合物注射液對腫瘤敏感和耐藥細胞的抑制作用結果列於表26。可知注射用尿多酸肽藥物組合物，對KB和KBV200以及H23和H1435的敏感和耐藥兩類腫瘤細胞株，在抑制作用的敏感性上均無明顯差異。
表26注射用尿多酸肽藥物組合物對各類腫瘤細胞抑制作用的敏感性
2．2注射用尿多酸肽藥物組合物協同化療藥對耐藥逆轉作用的影響實驗中我們以鈣通道阻滯劑維拉帕米(Ver)，作為有效對照組。結果列於表27。可知非毒性濃度6μg／ml的Ver與VCR聯合應用，能有效降低KBV300細胞的IC50值，從4．38μmol／L降至0．083μmol／L，逆轉耐藥倍數為52倍。而0．4mg／ml的注射用尿多酸肽藥物組合物與VCR協同作用，同樣能增強VCR對KBV200耐藥細胞的毒性，使耐受VCR的KBV300的細胞的IC50值從4．38μmol／L降至0．266μmol／L，逆轉耐藥倍數為16倍。與單獨VCR作用組相比，P值＜0．01。0．8mg／ml和1．2mg／ml(IC20、IC30)的注射用尿多酸肽藥物組合物能有效逆轉KBV200對VCR的耐受，介逆轉程度不如0．4mg／ml(IC50)劑量組。
表27注射用尿多酸肽藥物組合物與VCR聯用對KBV200耐藥性的逆轉作用
☆指IC50時所需VCR濃度，**P＜0．01*，與單獨VCR組相比2．3注射用尿多酸肽藥物組合物對MDR1、MRP、GST-π耐用藥相關基因表達的影響2．3．1KB和KBV200細胞MDR1、MRP、GST-π基因表達4mg／ml的注射用尿多酸肽藥物組合物作用KB細胞48h後，均誘導出MDR1、MRP、GST-π基因弱表達。KBV200細胞為基因高表達細胞株，隨著注射用尿多酸肽藥物組合物劑量的增加，MDR1基因的表達量有增加趨勢，但差異較小。均未誘導出MRP和GST-π基因的表達。
2．3．2H23和H1435細胞MDR1、MRP、GST-π基因表達H23和H1435細胞在未給藥前均有MRP和GST-π基因的表達，H23細胞H1435基因的表達經注射用尿多酸肽藥物組合物誘導後而消失，對GST-π基因表達影響不大。給藥前後未見MRP基因表達。H1435細胞MDR1和GST-π基因表達量均隨注射用尿多酸肽藥物組合物劑量增加而下降。未誘導出MRP基因的表達。
討論及結論腫瘤多藥耐藥性的分子基礎是多方面的。由於抗腫瘤藥物的長期作用，並誘導細胞相關基因的表達和調控異常，從而引起與耐藥相關的蛋白質在結構、功能及表達水平發生改變，導致耐藥性。耐藥產生的機制主要有(1)P-糖蛋白(P-gp)泵出理論，減少細胞內藥物蓄積，與多耐藥基因(MDR1)和多藥耐藥相關蛋白(MRP)過表達有關。(2)通過細胞內解毒系統，促進藥物代謝或降低細胞內藥物毒性，與穀胱苷肽S-轉移酶(GSTs)表達水平有關。因此，MDR1、MRP、和GST-π在耐藥中起著極其重要的作用。腫瘤多藥耐藥性逆轉，近年研究較多的是針對P-gp通過增加藥物在MDR細胞中的蓄積而增強化療藥物的細胞毒性作用。本實驗是以具有抗腫瘤作用的注射用尿多酸肽藥物組合物藥物，在研究其逆轉腫瘤多藥耐藥性。
我們以Ver為逆轉有效對照組，平行觀察注射用尿多酸肽藥物組合物在耐藥逆轉達中的作用。草藥初步結果表明，0．4mg／ml注射用尿多酸肽藥物組合物能有效地增加VCR對KBV200耐藥細胞的毒性，與VCR聯合作用，使KBV200細胞的IC50值從4．38μmol／L降至0．26μmol／L，逆轉耐藥倍數為16倍。KBV200為耐藥(MDR相關)細胞，其耐藥機理主要是由於P-糖蛋白過表達導致藥物外排的增多所致[1]。我們的實驗結果表明，注射用尿多酸肽藥物組合物並未引起耐藥KBV200細胞中MDR1基因發生明顯變化，也未誘導出MRP和GST-π基因表達。因此，僅從MDR1基因過表達的角度來解釋腫瘤細胞MDR現象是片面的。我們的實驗結果提示，注射用尿多酸肽藥物組合物逆轉MDR介導的多藥耐藥性可能不是依賴P-gp的功能，而是參與其它逆轉耐藥途徑而發揮其作用。
我們的實驗還觀察到，注射用尿多酸肽藥物組合物對逆轉MDR耐藥作用與所需藥物濃度有密切關係，當藥物濃度在IC50即0．4mg／ml時，逆轉耐藥作用最強，優於注射用尿多酸肽藥物組合物的高劑量濃度。這種注射用尿多酸肽藥物組合物劑量增加且逆轉程度降低的現象，可能性是注射用尿多酸肽藥物組合物與VCR藥物的相互作用，抵消了VCR的有效濃度。
從耐藥基因表達的實驗結果表明，注射用尿多酸肽藥物組合物對人肺癌細胞，無論是敏感H23和耐藥H1435細胞中MDR1和GST-π基因的表達量隨著注射用尿多酸肽藥物組合物劑量增加而減弱或消失。均未誘導出MRP基因表達。這一結果提示，注射用尿多酸肽藥物組合物對人肺癌H1435耐藥也可有逆轉腫瘤耐藥的作用。
權利要求
1．一種尿多酸肽組合物的製備方法，其特徵在於將新鮮尿酸化，使PH小於等於3，以保證其穩定並易於提取；過濾除去酸化尿中的大顆粒；超濾除去酸化尿中分子量較大的有機物質，用醇浸泡吸附劑後用乙醇和去離子水分別洗滌吸附劑，裝吸附柱，以一定的流速將超濾後的酸化尿加入吸附柱內，用吸附劑吸附濾液中的有效成分；酸化尿中的無機鹽離子和有機物在進入吸附劑後未被吸附的積存於柱內，用軟水洗滌未被吸附但殘留在吸附劑中的無機物及親水性有機物，純化有效成分；用醇洗脫吸附在吸附柱上的有效成分；收集有色流出液，除溶劑濃縮後，乾燥得到尿多酸肽幹品，加水溶解，用鹼調整PH至中性，低溫靜置析出濃縮過程中形成的結晶、聚合物，過濾除去結晶及膠體等雜質，得到尿多酸肽藥物組合物中間體，經除熱源、除病毒等工藝進一步純化。
2．根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於所述的酸化可以用鹽酸、硫酸，酸化至PH小於3。
3．根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於酸化至PH1．0-2．5。
4．根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於優選酸化至PH1．2-1．8。
5．根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於用超濾的方法除去分子量大於1萬的有機物質。
6．根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於用超濾的方法除去分子量大於9000的有機物質。
7．根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於用C18、XAD-6、XAD-7和XAD-16作為吸附劑吸附尿中的有效成分，優選C18和XAD-7。
8．根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於用軟水洗滌去除酸化尿中的無機鹽離子，以及在進入矽膠柱後未被吸附而積存於柱內的有機物，以純化有效成分。
9．根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於用乙醇、甲醇洗脫吸附在矽膠柱上的有效成分，優選甲醇。
10．根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於用減壓蒸餾或膜技術除溶劑濃縮收集的有效成分。
11．根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於用冷凍乾燥或真空乾燥的方法乾燥產物，優選冷凍乾燥。
12．根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於用氫氧化鈉、碳酸鈉或碳酸氫鈉調整產物的PH值，優選氫氧化鈉。
13．根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於回收率為投料量體積比的0．2--4％左右。
14．尿多酸肽組合物在用於治療癌症及防止癌症復。
全文摘要
本發明公開了尿多酸肽組合物的製備方法,將新鮮尿酸化,過濾除去酸化尿中的大顆粒;超濾除去酸化尿中分子量較大的有機物質,將超濾後的酸化尿加入吸附柱內,吸附其中的有效成分;用軟水洗滌末被吸附劑吸附但殘留在吸附劑中的無機物及親水性有機物用醇洗脫吸附在吸附柱上的有效成分;收集有色流出液,濃縮後,乾燥得到幹品;加水溶解,用鹼調整pH至中性,低溫靜置析出濃縮過程中形成的雜質,經除熱源、除病毒等工藝進一步純化。
文檔編號A61K35/22GK1294000SQ99122050
公開日2001年5月9日 申請日期1999年10月26日 優先權日1999年10月26日
發明者張銘烈 申請人:合肥永生製藥有限公司