抗TNF-α抗體和其用途的製作方法
2023-07-06 10:11:31 5
專利名稱:抗TNF-α抗體和其用途的製作方法
技術領域:
本發明涉及抗TNF-α抗體、包含抗TNF-α抗體的醫藥組合物和所述抗體的治療用途。
背景技術:
腫瘤壞死因子α (TNF-α)為由免疫系統的細胞釋放且與免疫系統的細胞相互作用的促發炎性細胞因子。已顯示TNF-a在包括慢性疾病(諸如類風溼性關節炎、克羅恩氏病(Crohn' s disease)、潰瘍性結腸炎和多發性硬化症)在內的多種人類疾病中上調。舉例來說,TNF-α含量升高可見於類風溼性關節炎患者的滑液中且在作為類風溼性關節炎的標誌的病理性炎症和關節破壞兩者中起重要作用。人類TNF-α為17kDa蛋白質,且活性形式以均三聚體形式存在(佩尼查 (Pennica)等人,1984,自然(Nature) 312 :724_729 ;戴維斯(Davis)等人,1987,生物化學 (Biochemistry) 26 1322-1326 Jones 等人,1989,自然(Nature) 338 :225_228)。TNF-α 通過與共表達於大多數細胞類型上的兩個結構相關但功能不同的細胞表面受體Ρ55和ρ75相互作用來發揮其生物作用(羅伊斯切爾(Loetscher)等人,1990,細胞(Cell) 61 :351_9 ;史密斯(Smith)等人,1990,科學(Science) 248 (4958) 1019-23)。p55 也稱作 p55R、p55TNFR、 CD 120a, TNFR I, TNFR 1 和 TNFRSFIa。p75 也稱作 p75R、p75TNFR、CD120b、TNFR 11, TNFR 2 和TNFRSFIb。這兩種受體也通過蛋白水解以能夠結合TNF-α的可溶性分子形式釋放。作為治療疾病(具體來說,類風溼性關節炎)的方法,對TNF-α活性進行抑制已通過多種不同方式使用諸如抗體和可溶性受體等抑制劑達成。實例包括由伊姆耐斯公司(Immunex Corporation)以ENBREL 出售的依那西普(etanerc印t),其為包含兩個p75 可溶性TNF-受體結構域連接於人類免疫球蛋白Fc部分的重組融合蛋白。由森託科爾公司(Centocor Corporation)以REMICADE 出售的英利昔單抗(Infliximab)為具有鼠類抗TNF-α可變結構域和人類IgGjiS結構域的嵌合抗體。其它抑制劑包括經工程改造的 TNF-α分子,其與天然TNF-α形成三聚體且阻止受體結合(斯蒂德(Steed)等人,2003, 科學(Science)301 1895-1898 ;WO 03/033720 ;WO 01/64889)。這些抑制 TNF-α 活性的當前方法阻斷TNF- α與ρ55和ρ75受體兩者的結合(參見例如密斯(Mease),2005,生物學療法專家觀點(Expert Opin. Biol. Therapy) 5 (11) :1491_1504)。由阿波特實驗室(Abbott Laboratories)以HUMIRA 出售的阿達木單抗(Adalimumab)為重組完全人類抗TNF-α抗體(圖斯羅特(Tussirot)和溫德林(Wendling),2004,藥物療法專家觀點(Expert Opin.Pharmacother.) 5 :581_594)。阿達木單抗特異性結合TNF- α且阻斷其與ρ55和ρ75細胞表面TNF-α受體的相互作用。阿達木單抗也在活體外通過補體依賴性細胞毒性(「⑶C」) 和抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(「ADCC」)溶解表面表達TNF-α的細胞。阿達木單抗不結合淋巴毒素(TNF-β)或不使淋巴毒素(TNF-β)失活。阿達木單抗也調節由TNF誘導或調控的生物反應,所述生物反應包括負責白血球遷移的粘附分子(ELAM-1、VCAM-I和 ICAM-1, IC50 為 1-2Χ I(T10M)的含量變化。儘管阿達木單抗為人類抗體,但當投予人類時,其可能會引發免疫反應。所述免疫反應可能引起免疫複合物介導的抗體或片段從循環中清除,並使反覆投藥不適用於治療 , 從而降低對患者的治療效益且限制抗體的再投予。因此,需要提供克服一種或一種以上這些問題中的改良的抗TNF-α抗體或片段, 例如通過產生親和力比阿達木單抗高從而可以降低的劑量投予的變異體或免疫原性相較於阿達木單抗降低的變異體。對本申請案的第4部分或任何其它部分中的任何參考文獻的引用或標明不應視作承認所述參考文獻可用作本發明的先前技術。
發明內容
本發明涉及相較於D2E7,與TNF-α的結合得到改良和/或免疫原性降低的抗 TNF-α抗體D2E7的變異體。D2E7具有三個重鏈⑶R,本文中稱作(以氨基端至羧基端的順序)CDR-Hl (SEQ ID NO :5)、CDR_H2 (SEQ ID NO :6)禾口 CDR-H3 (SEQ ID NO 7);以及三個輕鏈 CDR,本文中稱作(以氨基端至羧基端的順序)CDR-Ll (SEQ ID NO :8)、CDR-L2 (SEQ ID NO: 9)和CDR-L3(SEQ ID NO: 10)。本發明的抗TNF-α抗體和抗TNF-α結合片段一般相較於 D2E7在至少一個⑶R中具有至少一個胺基酸取代。在某些方面中,至少一個胺基酸取代或取代的組合選自表11、表12和/或表25。 其它突變(包括取代、缺失或插入)可選自表13-25中的一者或一者以上。在某些方面中,本發明涉及相較於D2E7對TNF-α的結合性質得到改良(例如親和力得到改良)的抗TNF- α抗體D2E7的變異體。在特定實施例中,本發明的抗體對TNF- α 的親和力大於D2E7,例如如由BIAcore所測量Kd得到改良和/或如由競爭ELISA所測量親和力得到改良。在某些方面中,抗TNF-α抗體和抗TNF-α結合片段包括至少一個選自以下的取代:CDR-L2(SEQ ID NO 9)中的 S3K、CDR-L2 (SEQ ID NO 9)中的 S3R、CDR-L2 (SEQ ID NO 9)中的 S3N、CDR-L2(SEQ ID NO 9)中的 T4H、CDR_L2 (SEQ ID NO 9)中的 T4Q、CDR_L2 (SEQ ID NO 9)中的 T4V、CDR-L2 (SEQ ID NO 9)中的 T4F、CDR-L2 (SEQ ID NO 9)中的 T4W、 CDR-L2 (SEQ ID NO 9)中的 T4Y、CDR-L2 (SEQ ID NO 9)中的 L5R、CDR-L2 (SEQ ID NO 9) 中的 L5K、CDR-L2(SEQ ID NO 9)中的 Q6K、CDR-L2 (SEQ ID NO 9)中的 Q6R、CDR-Hl (SEQ ID NO 5)中的 DIG、CDR-Hl (SEQ ID NO 5)中的 Y2H、CDR-Hl (SEQ ID NO 5)中的 A3G, 和⑶R-H2(SEQ ID NO 6)中的T3N。其它可併入親和力改良的變異型抗TNF-α抗體和抗 TNF-α結合片段中的突變可為去免疫化取代(諸如表11中所述的取代);以及其它不破壞抗TNF-α抗體和抗TNF-α結合片段結合TNF-α的能力的突變(例如取代),包括(但不限於)表13至24中所述的已知突變或表25中所述的突變。
在某些方面中,抗TNF-α抗體和抗TNF-α結合片段包括至少一個選自以下的取代CDR-L2 中的 T4F、CDR-L2 中的 T4W、CDR_L2 中的 T4Y、CDR_L2 中的 L5R、CDR_L2 中的 L5K、 CDR-L2中的Q6R、CDR-H1中的Y2H、CDR_H1中的A3G,禾口 CDR-H2中的T3N。其它可併入所述抗TNF-α抗體和抗TNF-α結合片段中的突變或突變組合可選自表11和13到25中的一
者或一者以上。,
在某些其它方面中,抗TNF-α抗體和抗TNF-α結合片段包括至少一個選自以下的取代CDR-L2 中的 T4F、CDR-L2 中的 T4W、CDR_L2 中的 T4Y、CDR_L2 中的 L5R、CDR_L2 中的 L5K、CDR-L2 中的 Q6R、CDR-Hl 中的 Y2H、CDR-Hl 中的 A3G,禾口 CDR-H2 中的 T3N。其它可併入所述抗TNF-α抗體和抗TNF-α結合片段中的突變或突變組合可選自表11和13至18中
的一者或一者以上。在其它方面中,抗TNF-α抗體和抗TNF_a結合片段在⑶R-Ll中包括取代 G5S+A11S或G5S+A11G。其它可併入所述抗TNF-α抗體和抗TNF-α結合片段中的突變或突變組合可選自表11到25中的一者或一者以上。在某些方面中,抗TNF-α抗體和抗TNF-α結合片段包括選自⑶R-L2中的S3N、 ⑶R-L2中的T4V、⑶R-L2中的Q6K和⑶R-Hl中的DlG的取代與至少一個選自表11、12和 25中的取代的組合。其它可併入所述抗TNF-α抗體和抗TNF_a結合片段中的突變或突變組合可選自表11到24中的一者或一者以上。在某些方面中,抗TNF-α抗體和抗TNF-α結合片段包括選自⑶R-L2中的S3N、 ⑶R-L2中的T4V、⑶R-L2中的Q6K和⑶R-Hl中的DlG的取代與至少一個選自以下的取代的組合CDR-L2 中的 S3K、CDR-L2 中的 S3R、CDR-L2 中的 T4H、CDR-L2 中的 T4Q、CDR-L2 中的 T4F、CDR-L2 中的 T4W、CDR_L2 中的 T4Y、CDR_L2 中的 L5R、CDR_L2 中的 L5K、CDR_L2 中的 Q6R、CDR-Hl 中的 Y2H、CDR-Hl 中的 A3G,禾口 CDR-H2 中的 T3N。在某些方面中,抗TNF-a抗體和抗TNF_a結合片段包括選自以下至少一者的取代組合:CDR_L2 中的 S3K、T4H、L5R 和 Q6R ;S3K、T4Q、L5R 禾口 Q6K ;S3K、T4Y 禾口 L5K ;S3K 禾口 T4Y ; S3N、T4V、L5R 和 Q6K ; S3N、T4W、L5R 和 Q6R ;S3R、T4F 和 L5R ;S3R、T4F、L5R 和 Q6R ; S3R、T4H 禾口 Q6K ; S3R、T4W、L5K 禾口 Q6R ;T4H、L5K 禾口 Q6K ;T4H、L5K 禾口 Q6R ;T4W、L5R 禾口 Q6R ;禾口 T4Y 禾口 L5R,其中6個⑶R相較於抗體D2E7的⑶R序列總共具有至多17個胺基酸取代。抗TNF-a 抗體或抗TNF-a結合片段任選包括一個或一個以上可選自表11到24中一者或一者以上的其它突變或突變組合。在某些方面中,抗TNF-a抗體和抗TNF_a結合片段包括一個或一個以上選自以下的取代或取代組合CDR_L2 中的 S3K、S3R、S3N、T4F、T4W、T4Y、T4H、T4Q、T4V、L5R、L5K、 Q6R和Q6K。其它可併入所述抗TNF-α抗體和抗TNF-α結合片段中的突變或突變組合可選自表11到24中的一者或一者以上。在其它方面中,本發明涉及相較於D2E7,免疫原性降低的抗TNF-a抗體D2E7的變異體。在某些方面中,抗TNF-a抗體和抗TNF-a結合片段在⑶R-Ll (SEQ ID NO 8)中包括至少一個選自以下的取代或取代組合:R7Q ;AllS ;R7Q+A11S ;N8T ;N8T+A11S ;I6T ;AllG ; I6T+A11G ;Q4G ;Q4G+A11S ;Q4G+A11G ;Q4H;Q4H+A11S ;Q4R ;Q4R+A11S ;G5S ;G5S+A11S ; N8S+A11S ;I6T+A11S ;和N8T+A11G。其它可併入抗TNF-a抗體和抗TNF-a結合片段中使抗原性降低的突變包括改良對TNF-a的結合性質的取代(諸如表12和/或表25中所述的取代);以及其它不破壞抗TNF-α抗體和抗TNF-α結合片段結合TNF-α的能力的突變 (例如取代),包括(但不限於)表13到25中所述的已知突變。 在某些方面中,本發明的抗TNF-α抗體和抗TNF-α結合片段具有與D2E7的VH 和VL序列具有80%至99%序列一致性的VH和VL序列,且相較於D2E7在至少一個⑶R中包括至少一個胺基酸取代。在特定實施例中,重鏈和輕鏈相較於D2E7的VH和VL序列的序列一致性百分比各獨立地選自至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列一致性。在某些方面中,本發明的抗TNF-α抗體和抗TNF-α結合片段在其⑶R中相較於 D2E7的CDR具有至多17個胺基酸取代。具有17個胺基酸取代且保持目標結合能力的變異型抗體已由波斯特羅姆(Bostrom)等人,2009,科學(Science) 323 1610-14產生。本發明的抗TNF- α抗體和抗TNF- α結合片段在其⑶R中相較於抗體D2E7的⑶R序列也可具有至多16個、至多15個、至多14個、至多13個、至多12個、至多11個、至多10個、至多9 個、至多8個、至多7個、至多6個、至多5個或至多4個胺基酸取代。在特定實施例中,本發明的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段獨立地 相較於D2E7的相應⑶R具有至多一個,或至多兩個,或至多三個⑶R-Hl取代; 相較於D2E7的相應⑶R具有至多一個、至多兩個、至多三個、至多四個、至多五個或至多六個⑶R-H2取代; 相較於D2E7的相應⑶R具有至多一個、至多兩個、至多三個、至多四個或至多五個CDR-H3取代; 相較於D2E7的相應⑶R具有至多一個、至多兩個、至多三個或至多四個⑶R-Ll 取代; 相較於D2E7的相應⑶R具有至多一個、至多兩個、至多三個或至多四個⑶R-L2 取代;以及 相較於D2E7的相應⑶R具有至多一個、至多兩個、至多三個或至多四個⑶R-L3 取代。本發明進一步提供醫藥組合物,其包含相較於D2E7對TNF-α的親和力增加和/ 或免疫原性降低的經修飾的抗TNF-α抗體和抗TNF-α結合片段。在某些方面中,本發明的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段可為雙特異性抗體或雙特異性抗體的TNF-α結合片段。所述雙特異性抗體可對TNF-α和另一種促發炎性細胞因子(諸如淋巴毒素、幹擾素-Y或白介素-ι)具有特異性。本文提供包含編碼本發明的抗TNF-α抗體和抗TNF_a結合片段的核苷酸序列的核酸,也提供包含核酸的載體。另外,本文提供經包含編碼抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段的核苷酸序列的載體轉化的原核和真核宿主細胞,以及經工程改造以表達所述核苷酸序列的真核(諸如哺乳動物)宿主細胞。也提供通過培養宿主細胞製備抗TNF-α抗體和抗TNF-α結合片段的方法。本發明的抗TNF-α抗體和抗TNF-α結合片段適用於治療免疫病症,例如全身性紅斑狼瘡、類風溼性關節炎、甲狀腺功能症(thyroidosis)、移植物抗宿主疾病、硬皮病、糖尿病、格雷夫氏病(Grave' s disease)、類肉瘤病、慢性發炎性腸病、潰瘍性結腸炎或克羅恩氏病。應注意,除非本文另外明確規定,否則在本申請案中所使用(在專利申請案中也常見)的不定冠詞「一」和定冠詞「所述」意謂一個(一種)或一個(一種)以上。此外, 在本申請案中所使用(在專利申請案中也常見)的術語「或」意謂轉折連接詞「或」或連接詞「和」。本說明書中所提及的所有出版物以引用的方式併入本文中。本說明書中已包括的對文件、法案、材料、裝置、物品等的任何論述僅出於提供本發明背景的目的。不應視作承認任何或所有這些內容形成先前技術基礎的一部分或為本發明相關領域中的普通常識,因為其在本申請案的優先權日以前即存在。本發明的特徵和優勢將因下列對其實施例的詳細描述而進一步變得顯而易知。
表1分別展示進行免疫原性測試的D2E7 VH肽和D2E7 VL肽。
表2展示D2E7中鑑別出的⑶4+T細胞抗原決定基區域。⑶R區加有下劃線。表3展示對D2E7 VL區肽抗原決定基的反應與第II類HLA的相關性和其相對風險。表4展示D2E7 VL⑶Rl抗原決定基變異體的序列。測試總共99個捐獻者。指示所測試各肽的反應者數目、反應者百分比和平均刺激指數。表5展示⑶R-Ll中降低D2E7的免疫原性的候選突變。表5中胺基酸的編號對應於在D2E7輕鏈情形下的位置。表6展示CDR-Ll中相較於D2E7,不引起結合顯著減少的取代的BIAcore和ELISA 結果。表6中胺基酸的編號對應於D2E7輕鏈情形下的位置。Kd(如由BIAcore所測量)和結合的IC5tl(如由ELISA所測量)的改良由「WTx」指示。CV%是指呈總測量值的百分比形式的標準差。表7展示D2E7抗原決定基的所有單突變和雙重突變的T細胞分析結果。肽1為親本肽。對親本肽的修飾呈黑體字型。表8展示僅基於T細胞分析結果的優選抗原決定基肽變異體。表8中胺基酸的編號對應於D2E7輕鏈情形下的位置。表9展示建構成含有優選變異型抗原決定基肽的抗體的抗增殖生物活性。親本為未經修飾的D2E7抗體。表9中胺基酸的編號對應於D2E7輕鏈情形下的位置。表10展示如由BIAcore所分析D2E7和D2E7變異體針對TNF-α的結合動力學。 表10中胺基酸的編號對應於D2E7輕鏈情形下的位置。表11展示可併入D2E7相關抗體中以降低其免疫原性的⑶R-Ll取代或取代組合。表12展示在CDR-Ll外部,相較於D2E7使Kd (如由BIAcore所分析)、親和力(如由ELISA所測量)或兩者改良的CDR胺基酸取代。表12中胺基酸的編號對應於D2E7輕鏈和重鏈情形下的位置。Kd(如由BIAcore所測量)和結合的IC5tl(如由ELISA所測量)的改良由「WTx」指示。CV%是指呈總測量值的百分比形式的標準差且「ND」意謂「未進行」。表13展示⑶R-Hl中可併入本發明抗體中的已知突變。表14展示⑶R-H2中可併入本發明抗體中的已知突變。單個單元格中包括2個胺基酸指示CDR變異體在CDR中並有添加或插入。單元格的陰影指示CDR變異體缺乏畫有陰
影的胺基酸殘基。
表15展示⑶R-H3中可併入本發明抗體中的已知突變。表16展示⑶R-Ll中可併入本發明抗體中的已知突變。單個單元格中包括兩個胺基酸指示CDR變異體在CDR中並有添加或插入。表17展示⑶R-L2中可併入本發明抗體中的已知突變。單個單元格中包括兩個胺基酸指示CDR變異體在CDR中並有所指示的額外N端胺基酸。
表18展示⑶R-L3中可併入本發明抗體中的已知突變。單個單元格中包括兩個胺基酸指示CDR變異體在CDR中並有所指示的額外N端胺基酸。表19展示⑶R-Hl中可併入本發明抗體中的其它已知突變。表20展示⑶R-H2中可併入本發明抗體中的其它已知突變。表21展示⑶R-H3中可併入本發明抗體中的其它已知突變。表22展示⑶R-Ll中可併入本發明抗體中的其它已知突變。表23展示⑶R-L2中可併入本發明抗體中的其它已知突變。表24展示⑶R-L3中可併入本發明抗體中的其它已知突變。表25展示CDR-L2中相較於D2E7使Kd(如由BIAcore所分析)、親和力(如由 ELISA所測量)或兩者改良的點突變的組合。點突變可單獨或組合併入本發明的抗體中。圖1A-1E。圖IA展示D2E7重鏈和輕鏈的胺基酸序列,其中⑶R區為粗體加下劃線文字。圖IB展示D2E7的⑶R序列和相應序列識別符。圖IC展示重鏈⑶R編號與重鏈卡貝特編號之間的對應表。圖ID展示輕鏈CDR編號與輕鏈卡貝特編號之間的對應表。圖IE 展示如美國專利第6,090, 382號中所公開的D2E7的重鏈和輕鏈可變區的核苷酸序列(分別為 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 3)。圖2展示對D2E7VL肽的反應百分比(下部)和平均刺激指數(上部)。圖3展示對D2E7 VH肽的平均刺激指數(上部)和反應百分比(下部)。在一個捐獻者中第27號肽具有異常刺激指數,且以較暗陰影指示。圖4展示D2E7 VL⑶Rl抗原決定基肽變異體。空心符號(open symbol)指示對數據集中未經修飾親本肽的多次重複測試。實心符號(filled symbol)表示獨特肽丙氨酸掃描變異體。指示反應誘導性降低最多的變異體的序列。圖5展示D2E7VL⑶Rl抗原決定基肽變異體。空心符號指示對數據集中未經修飾親本肽的多次重複測試。實心符號表示獨特肽變異體。反應誘導性降低最多的變異體以圓圈指示。此圖以圖解方式表示表7的數據。圖6展示D2E7變異型抗體的競爭ELISA的結果。用TNF- α塗布ELISA板。所有孔中包括單一濃度的生物素化D2E7,且在其中滴定變異型抗體。計算各抗體的IC5tl值。實驗進行3次。Y軸以親本抗體結合百分比形式展示平均結果。
具體實施例方式7.1 抗 TNF-α 抗體本發明提供抗TNF-α抗體。除非另外指示,否則術語「_」 (Ab)是指特異性結合特定抗原或可與特定抗原發生免疫反應的免疫球蛋白分子,且包括抗體的多克隆形式、 單克隆形式、遺傳工程改造形式和以其它方式修飾的形式,包括(但不限於)嵌合抗體、人類化抗體、異源接合抗體(例如雙特異性抗體、雙功能抗體、三功能抗體和四功能抗體),以及抗體的抗原結合片段(包括例如Fab'、F(ab' )2、Fab、Fv、rlgG和scFv片段)。此外, 除非另外指示,否則術語「單克降杭體」(mAb)意欲包括完整分子,以及能夠特異性結合蛋白質的抗體片段(諸如Fab和F(ab' )2片段)兩者。Fab和F(ab『 )2片段缺乏完整抗體的 Fc片段,更迅速地自動物或植物的循環中清除,且相較於完整抗體可具有較少非特異性組織結合(華爾(Wahl)等人,1983,核酸醫學雜誌(J. Nucl. Med.) 24 :316)。術語「s cFv」是指單鏈Fv抗體,其中來自傳統抗體的重鏈和輕鏈的可變結構域已聯接形成一條鏈。提及「亞」是指抗體的免疫球蛋白重鏈(包括Fv、SCFv或Fab的重鏈)的可變區。 提及「YL」是指免疫球蛋白輕鏈(包括FV、SCFV、dSFV或Fab的輕鏈)的可變區。抗體(Ab) 和免疫球蛋白(Ig)為具有相同結構特徵的糖蛋白。雖然抗體對特定目標展現結合特異性, 但免疫球蛋白包括抗體和其它缺乏目標特異性的抗體樣分子兩者。天然抗體和免疫球蛋白通常為約150,000道爾頓(dalton),由兩個相同輕(L)鏈和兩個相同重(H)鏈構成的異四聚體糖蛋白。各重鏈在氨基端具有可變結構域(VH),隨後為多個恆定結構域。各輕鏈在氨基端具有可變結構域(VL)且在羧基端具有恆定結構域。本發明的抗TNF- α抗體在細胞中結合人類TNF- α且抑制TNF- α受體活性。在不受任一理論束縛,本發明者相信抗體減少TNF-α與低親和力TNF-α受體(ρ75)和高親和力TNF-α受體(ρ55)兩者的結合。本發明的抗TNF- α抗體含有序列與抗體D2E7 (也稱作阿達木單抗或HUMIRA ) 的CDR相關的互補決定區(CDR)。CDR在輕鏈和重鏈可變結構域兩者中也稱作高變區。可變結構域的較高度保守部分稱作構架(FR)。如所屬領域中所已知,視上下文和所屬領域中已知的各種定義而定,界定抗體高變區的胺基酸位置/邊界可有所不同。可變結構域中的一些位置可視作雜交型高變位置,因為這些位置按一組準則可視作處於高變區內,而按一組不同準則可視作處於高變區之外。這些位置中的一者或一者以上也可見於擴展的高變區中。本發明提供在這些雜交型高變位置中包含修飾的抗體。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含4個FR區,主要採用β摺疊構型,由三個CDR連接,所述CDR形成連接β摺疊結構的環(且在一些情況下,形成β摺疊結構的一部分)。各鏈中的⑶R由FR區以順序FRl-⑶R1-FR2-⑶R2-FR3-⑶R3-FR4 緊密接近保持在一起且與另一鏈中的CDR—起幫助形成抗體的目標結合位點(參見卡貝 # (Kabat) 入,&貞f 才目白勺 歹U (Sequences of Proteins of Immunological Interest)(國家衛生研究院(National Institute of Health),馬裡蘭州貝賽思達市 (Bethesda,Md.) 1987)) 0如本文所用,除非另外指示,否則根據卡貝特(Kabat)等人的免疫球蛋白胺基酸殘基編號系統對免疫球蛋白胺基酸殘基進行編號。D2E7的重鏈和輕鏈可變區的序列分別由SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4表示,且分別由SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :3編碼。重鏈和輕鏈可變區的序列也描述於圖IA中。D2E7 的CDR序列和其相應識別符提供於圖IB中。D2E7的重鏈和輕鏈可變區的序列(如美國專利第6,090, 382號中所公開)展示於圖IC中。編碼SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4的任何核苷酸序列皆可用於本發明的組合物和方法中。本發明進一步提供包含與D2E7的⑶R序列相關的⑶R序列的抗TNF- α抗體片段。 術語「抗體片段」是指全長抗體的一部分,一般為目標結合區或可變區。抗體片段的實例包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段。「奴」片段為含有完整目標識別和結合位點的最小抗體片段。此區域由緊密非共價締合的一個重鏈可變結構域與一個輕鏈可變結構域的二聚體 (VH-VL 二聚體)組成。在此構型中各可變結構域的三個⑶R相互作用以界定VH-VL 二聚體表面上的目標結合位點。通常,6個⑶R使抗體具有目標結合特異性。然而,在一些情況下, 即使單個可變結構域(或僅包含三個對目標具有特異性的CDR的一半Fv)仍具有識別和結合目標的能力。「單鏈Fv」或「scFv」杭體片段在單個多妝鏈中句,含杭體的VH和VL結構域。 一般說來,Fv多肽在VH與VL結構域之間進一步包含多肽連接子,使scFv能夠形成目標結合所需的結構。「單結構域抗體」由對TNF-α展現足夠親和力的單個VH結構域或VL結構域構成。在一特定實施例中,單結構域抗體為駱駝抗體(參見例如裡奇曼(Riechmarm), 1999,免疫學方法雜誌(Journal of Immunological Methods) 231 :25_38)。Fab片段含有輕鏈的恆定結構域和重鏈的第一恆定結構域(CH1)。Fab'片段因在重鏈CH1結構域的羧基端添加包括一個或一個以上來自抗體鉸鏈區的半胱氨酸的數個殘基而不同於Fab片段。F(ab')片段通過使F(ab' )2胃蛋白酶消化產物的鉸鏈半胱氨酸處的二硫鍵裂解而產生。抗體片段的其它化學偶合為所屬領域的一般技術人員所已知。在某些實施例中,本發明的抗TNF-α抗體為單克隆抗體。如本文所用的術語「垔克降抗體」不限於通過雜交瘤技術產牛的抗體。術語「單克降抗體」是指抗體來源於單一克隆(包括任何真核、原核或噬菌體克隆)而非指其產生方法。關於本發明適用的單克隆抗體可使用所屬領域中已知的多種技術製備,包括使用雜交瘤、重組和噬菌體呈現技術或其組合。本發明的抗TNF-α抗體包括嵌合、靈長類化、人類化或人類抗體。 本發明的抗TNF-α抗體可為嵌合抗體。如本文所用的術語「嵌合」抗體是指具有來源於非人類免疫球蛋白(諸如大鼠或小鼠抗體)的可變序列和通常選自人類免疫球蛋白模板的人類免疫球蛋白恆定區的抗體。產生嵌合抗體的方法在所屬領域中為已知的。 參見例如莫裡森(Morrison),1985,科學(Science) 229 (4719) :1202_7 ;沃伊(Oi)等人, 1986,生物技術(Bio Techniques) 4 :214_221 ;基利斯(Gillies)等人,1985,免疫學方法雜誌(J. Immunol. Methods) 125 :191_202 ;美國專利第 5, 807, 715 號;第 4, 816, 567 號;和第 4,816,397號,所述文獻皆以全文引用的方式併入本文中。本發明的抗TNF-α抗體可為人類化抗體。非人類(例如鼠類)抗體的「人類化」 形式為含有來源於非人類免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2或抗體的其它目標結合子結構域)。一般說來,人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變結構域的實質上全部,其中所有或實質上所有CDR區對應於非人類免疫球蛋白的CDR區,且所有或實質上所有FR區為人類免疫球蛋白序列的 FR區。人類化抗體也可包含免疫球蛋白恆定區(通常為人類免疫球蛋白共同序列的免疫球蛋白恆定區)的至少一部分(Fe)。抗體人類化的方法在所屬領域中為已知的。參見例如裡奇曼(Riechmann)等人,1988,自然(Nature) 332 :323_7 ;美國專利第5,530,101號、第 5,585,089 號、第 5,693,761 號、第 5,693,762 號和第 6,180,370 號(奎恩(Queen)等人); EP 239400 ;PCT 公開案 WO 91/09967 ;美國專利第 5,225,539 號;EP 592106 ;EP 519596 ;帕德蘭(Padlan),1991,分子免疫學(Mol. Immunol.),28 489-498 ;斯塔德尼卡(Studnicka) 等人,1994,蛋白質工程(Prot.Eng.)7 805-814 ;羅古斯卡(Roguska)等人,1994,美國國家科學院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci.)91 :969_973 ;和美國專利第5,565,332號,所有文獻皆以全文引用的方式併入本文中。本發明的抗TNF-α抗體可為人類抗體。完全「人類」抗TNF-α抗體對於治療性治療人類患者可為合乎需要的。如本文所用的「AS^」包括具有人類免疫球蛋白的胺基酸序列的抗體,且包括自人類免疫球蛋白文庫或自一種或一種以上不表達內源性免疫球蛋白的人類免疫球蛋白的轉基因動物分離的抗體。人類抗體可通過所屬領域中已知的多種方法製備,包括使用來源於人類免疫球蛋白序列的抗體文庫的噬菌體呈現方法。參見美國專利第 4,444,887 號和第 4,716,111 號;和 PCT 公開案 W 98/46645 ;WO 98/50433 ;WO 98/24893 ;WO 98/16654 ;WO 96/34096 ;WO 96/33735 ;和 WO 91/10741,各文獻以全文引用的方式併入本文中。人類抗體也可使用不能表達功能性內源性免疫球蛋白但可表達人類免疫球蛋白基因的轉基因小鼠產生。參見例如PCT公開案WO 98/24893 ;WO 92/01047 ;WO 96/34096 ;WO 96/33735 ;美國專利第 5,413,923 號;第 5,625,126 號;第 5,633,425 號;第 5,569,825 號;第 5,661,016 號;第 5,545,806 號;第 5,814,318 號;第 5,885,793 號;第 5,916,771號;和第5,939,598號,所述文獻以全文引用的方式併入本文中。另外,諸如美達斯公司(Medarex)(新澤西州普林斯頓市(Princeton,NJ))、阿斯泰拉醫藥公司(Astellas Pharma)(伊利諾州迪爾菲爾德市(Deerfield,IL))、安進公司(Amgen)(加利弗利亞州橡木城(Thousand Oaks, CA))和裡捷龍公司(Regeneron)(紐約州塔裡頓市(Tarrytown, NY))等公司可從事使用與上文所述類似的技術提供針對所選抗原的人類抗體。識別所選抗原決定基的完全人類抗體可使用稱作「導向詵擇(guided selection) 的技術產生。在此方法中,使用所選非人類單克隆抗體(例如小鼠抗體)來引導對識別相同抗原決定基的完全人類抗體的選擇(傑斯佩爾斯(Jespers)等人,1988,生物技術(BiotechnologyU〗 899-903)。本發明的抗TNF-α抗體可為靈長類化抗體。術語「靈長類化抗體」是指包含猴可變區和人類恆定區的抗體。產生靈長類化抗體的方法在所屬領域中為已知的。參見例如美國專利第5,658,570號;第5,681,722號;和第5,693,780號,所述專利皆以全文引用的方式併入本文中。本發明的抗TNF-α抗體可為雙特異性抗體。雙特異性抗體為對至少兩種不同抗原具有結合特異性的單克隆抗體,通常為人類或人類化抗體。在本發明中,結合特異性中的一者可針對TNF-α,而另一者可針對任何其它抗原,例如針對細胞表面蛋白、受體、受體亞基、組織特異性抗原、病毒來源的蛋白質、病毒編碼的包膜蛋白、細菌來源的蛋白質或細菌表面蛋白等。本發明的抗TNF-α抗體包括衍生化抗體。舉例來說(但不限於),衍生化抗體通常通過糖基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、利用已知保護/阻斷基團衍生化、蛋白水解裂解、連接於細胞配位體或其它蛋白質(參見論述抗體接合物的第7. 6部分)等進行修飾。眾多化學修飾中的任一者可通過已知技術進行,所述已知技術包括(但不限於)特異性化學裂解、乙醯化、甲醯化、代謝性合成衣黴素(tunicamycin)等。另外,例如使用ambrx 技術(參見例如沃爾夫森(Wolfson),2006,化學生物學(Chem.Biol.)13(10) 1011-2),衍生物可含有一個或一個以上非天然胺基酸。在本發明的另一實施例中,抗TNF-α抗體或其片段可為序列已經修飾從而至少一種由恆定區介導的生物效應功能相對於相應野生型序列發生改變的抗體或抗體片段。舉例來說,在一些實施例中,本發明的抗TNF-α抗體可經修飾以使至少一種由恆定區介導的生物效應功能相對於未經修飾的抗體降低,例如與Fc受體(FcyR)的結合減少。可通過使抗體中Fc γ R相互作用所必需的特定區域處的免疫球蛋白恆定區區段突變來減少Fc γ R結合(參見例如坎費爾德(Canfield)和莫裡森(Morrison),1991,實驗醫學雜誌 (J. Exp. Med.) 173 1483-1491 ;和倫德(Lund)等人,1991,免疫學雜誌(J. Immunol.) 147 2657-2662)。降低抗體的Fc γ R結合能力也可降低其它依賴於Fc γ R相互作用的效應功能, 諸如調理作用、吞噬作用和抗原依賴性細胞毒性(「ADCC」)。
在本發明的其它實施例中,抗TNF-α抗體或其片段可經修飾以相對於未經修飾的抗體獲得或改良至少一種由恆定區介導的生物效應功能,例如增強Fc γ R相互作用(參見例如US 2006/0134709)。舉例來說,本發明的抗TNF-α抗體可具有以高於相應野生型恆定區的親和力結合Fc γ RIIA、Fc γ RIIB和/或Fc YRIIIA的恆定區。因此,本發明的抗體在生物活性方面可具有引起調理作用、吞噬作用或ADCC增強或降低的改變。所述改變在所屬領域中為已知的。舉例來說,抗體中降低ADCC活性的修飾描述於美國專利第5,834,597號中。例示性ADCC降低變異體對應於「突變體3」 (展示於美國專利第5,834,597號的圖4中),其中殘基236缺失,且殘基234、235和237 (使用EU 編號)經丙氨酸取代。在一些實施例中,本發明的抗TNF-α抗體具有低含量的巖藻糖或缺乏巖藻糖。 缺乏巖藻糖的抗體與增強的ADCC活性相關,尤其在低抗體劑量下時更是如此。參見謝爾德(Shields)等人,2002,生物學和化學雜誌(J. Biol. Chem.) 277 :26733_26740 ;新川 (Shinkawa)等人,2003,生物學和化學雜誌(J. Biol. Chem.) 278 :3466_73。製備含較少巖藻糖的抗體的方法包括在大鼠骨髓瘤YB2/0細胞(ATCC CRL 1662)中生長。YB2/0細胞表達低含量的編碼α_1,6-巖藻糖基轉移酶的FUT8 mRNA,所述種酶為一種使多肽巖藻糖基化所必需的酶。在另一方面中,抗TNF-α抗體或其片段可為例如通過使胎兒Fc受體FcRn相互作用中所涉及的特定區域處的免疫球蛋白恆定區區段突變而進行修飾從而增強或降低與 FcRn的結合親和力的抗體或抗體片段(參見例如WO 2005/123780)。在特定實施例中,IgG 類別的抗TNF-α抗體經突變以使得重鏈恆定區的胺基酸殘基250、314和428中的至少一者單獨經取代,或以其任何組合形式經取代,諸如在位置250和428處,或在位置250和314 處,或在位置314和428處,或在位置250、314和428處經取代,其中位置250和428為一特定組合。對於位置250,取代的胺基酸殘基可為除蘇氨酸以外的任何胺基酸殘基,包括 (但不限於)丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬醯胺、脯氨酸、穀氨醯胺、精氨酸、絲氨酸、纈氨酸、色氨酸或酪氨酸。對於位置314,取代的胺基酸殘基可為除亮氨酸以外的任何胺基酸殘基,包括(但不限於)丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、 甲硫氨酸、天冬醯胺、脯氨酸、穀氨醯胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸或酪氨酸。 對於位置428,取代的胺基酸殘基可為除甲硫氨酸以外的任何胺基酸殘基,包括(但不限於)丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸、天冬醯胺、脯氨酸、穀氨醯胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸或酪氨酸。適合胺基酸取代的特定組合在美國專利第7,217,797號的表1中標明,所述表格以全文引用的方式併入本文中。所述突變增強抗體與FcRn的結合,保護抗體免遭降解且增加其半衰期。在其它方面中 ,抗TNF-α抗體具有一個或一個以上胺基酸插入其一個或一個以上高變區中,例如如以下文獻中所述瓊格(Jung)和普魯克頓(PlUckthim),1997,蛋白質工程(Protein Engineering) 10 :9,959-966 ;矢崎(Yazaki)等人,2004,蛋白質工程、設計和選擇(Protein Eng. Des Sel.) 17(5) :481_9· Epub 2004 年 8 月 17 日;和美國專利申請案第 2007/0280931 號。7. 2核酸和表達系統本發明涵蓋編碼本發明的抗TNF-α抗體的核酸分子和宿主細胞。本發明的抗TNF-α抗體可通過在宿主細胞中重組表達免疫球蛋白輕鏈和重鏈基因來製備。為重組表達抗體,用一個或一個以上帶有編碼抗體的免疫球蛋白輕鏈和重鏈的 DNA片段的重組表達載體轉染宿主細胞,以使得輕鏈和重鏈在宿主細胞中表達,且任選分泌至培養宿主細胞的培養基中,可從所述培養基回收抗體。使用標準重組DNA方法來獲得抗體重鏈和輕鏈基因,將這些基因併入重組表達載體中和將載體引入宿主細胞中,諸如以下文獻中所述分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning ;A Laboratory Manual),第2 版(薩姆布魯克(Sambrook),弗裡奇(Fritsch)和馬裡亞蒂斯(Maniatis)(編),紐約州冷泉港(Cold Spring Harbor, N. Y.), 1989);分子生物學方案選編(Current Protocols in Molecular Biology) (F. Μ.奧蘇貝爾(Ausubel,F. Μ.)等人編,格林出版社(Greene Publishing Associates),1989);和美國專利第 4,816,397 號。在一實施例中,抗TNF-α抗體類似於D2E7,但在一個或一個以上⑶R中具有變化 (在下文稱作具有「D2E7相關」序列)。在另一實施例中,抗TNF-α抗體類似於D2E7,但在一個或一個以上構架區中具有變化。在另一實施例中,抗TNF-α抗體類似於D2E7,但在一個或一個以上⑶R中和一個或一個以上構架區中具有變化。為產生編碼所述抗TNF-α抗體的核酸,首先獲得編碼輕鏈可變區和重鏈可變區的DNA片段。可通過例如使用聚合酶鏈反應(PCR)擴增和修飾編碼輕鏈可變序列和重鏈可變序列的生殖系DNA或cDNA獲得這些 DNA。人類重鏈可變區基因和輕鏈可變區基因的生殖系DNA序列在所屬領域中為已知的(參見例如「VBASE」人類生殖系序列資料庫;也參見E.A.卡貝特(Kabat,E.A.)等人,1991,免疫學相關蛋白質的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版, 美國衛生和公眾服務部(U. S. D印artment of Health and Human Services), NIH 出版號 91-3242 ;湯姆林森(Tomlinson)等人,1992,分子生物學雜誌(J. Mol. Biol.) 22T :116_198 ; 和考克斯(Cox)等人,1994,歐洲免疫學雜誌(Eur. J. Immunol.) 24 :827_836 ;所述文獻各自的內容以引用的方式併入本文中)。可合成編碼序列展示於圖IC中的D2E7的重鏈可變區或輕鏈可變區的DNA片段且將其用作突變誘發的模板以使用常規突變誘發技術產生如本文所述的變異體;或者,可直接合成編碼變異體的DNA片段。在獲得編碼D2E7或D2E7相關VH和VL區段的DNA片段後,可進一步通過標準重組DNA技術來操作這些DNA片段以例如將可變區基因轉化為全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在這些操作中,使編碼VL或VH的DNA片段可操作地連接於編碼另一蛋白質(諸如抗體恆定區或柔性連接子)的另一 DNA片段。如在此上下文中所用的術語「可操作地連接」欲意謂兩個DNA片段經聯接以使由所述兩個DNA片段編碼的胺基酸序列保持同框。
可通過使編碼VH的DNA可操作地連接於編碼重鏈恆定區(CHpCHyCH3和任選CH4) 的另一 DNA分子來使分離的編碼VH區的DNA轉化為全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因的序列在所屬領域中為已知的(參見例如E.A.卡貝特(Kabat,E.A.)等人,1991,免疫學相關蛋白質的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版,美國衛生和公眾服務部(U. S. D印artment of Health and Human Services),NIH 出版號91_3242), 且涵蓋這些區域的DNA片段可通過標準PCR擴增獲得。重鏈恆定區可為IgGp IgG2, IgG3、 IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區,但在某些實施例中,為IgG1或IgG4恆定區。對於Fab片段重鏈基因,可使編碼VH的DNA可操作地連接於僅編碼重鏈CH1恆定區的另一 DNA分子。
可通過使編碼VL的DNA可操作地連接於編碼輕鏈恆定區CL的另一 DNA分子來使分離的編碼VL區的DNA轉化為全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因的序列在所屬領域中為已知的(參見例如E.A.卡貝特(Kabat,Ε. Α.)等人,1991,免疫學相關蛋白質的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版 (美國衛生和公眾服務部(U. S. D印artment of Health and Human Services),NIH 出版號91-3242)),且涵蓋這些區域的DNA片段可通過標準PCR擴增獲得。輕鏈恆定區可為κ 或λ恆定區,但在某些實施例中,為κ恆定區。為產生scFv基因,使編碼VH和編碼VL的 DNA片段可操作地連接於編碼柔性連接子(例如編碼胺基酸序列(Gly4 Ser) 3)的另一片段,以使得VH序列和VL序列可表達為連續單鏈蛋白質,其中VL區與VH區由柔性連接子聯接(參見例如比爾德(Bird)等人,1988,科學(Science) 242 :423_426 ;哈斯頓(Huston)等人,1988,美國國家科學院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 85 :5879_5883 ;麥克卡費爾蒂 (McCafferty)等人,1990,自然(Nature) 348 :552_554)。為表達本發明的抗TNF-α抗體,將如上文所述獲得的編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA插入表達載體中,以使得基因可操作地連接於轉錄和翻譯控制序列。在此上下文中,術語「可操作地連接」欲意謂將抗體基因連接至載體中以使得載體內的轉錄和翻譯控制序列發揮其調控抗體基因轉錄和翻譯的預期功能。表達載體和表達控制序列選擇為與所用表達宿主細胞相容。可將抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因插入獨立載體中,或者更通常,將兩種基因插入同一表達載體中。通過標準方法(例如連接抗體基因片段與載體上的互補限制性位點,或若不存在限制性位點則連接鈍端)將抗體基因插入表達載體中。在插入D2E7或D2E7相關輕鏈或重鏈序列之前,表達載體可能已具有抗體恆定區序列。舉例來說,將D2E7或D2E7相關VH和 VL序列轉化為全長抗體基因的一種方法為將其分別插入已編碼重鏈恆定區和輕鏈恆定區的表達載體中,以使得VH片段可操作地連接於載體內的CH區段,且使得VL片段可操作地連接於載體內的CL區段。或者或另外,重組表達載體可編碼有助於抗體鏈從宿主細胞分泌出來的信號肽。可將抗體鏈基因克隆至載體中,以使得信號肽同框連接於抗體鏈基因的氨基端。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即來自非免疫球蛋白的蛋白質的信號肽)。除抗體鏈基因外,本發明的重組表達載體還帶有控制抗體鏈基因在宿主細胞中的表達的調控序列。術語「調控序列」意欲包括啟動子、強化子和控制抗體鏈基因轉錄或翻譯的其它表達控制元件(例如聚腺苷酸化信號)。所述調控序列描述於例如古伊德
(Goeddel) g^iiii^ iSI^^^ 185 (Gene Expression Technology =Methods inEnzymology 185)(學院出版社(Academic Press),加利弗利亞州聖地牙哥市(San Diego, CA), 1990)中。所屬領域的技術人員應了解,表達載體的設計(包括調控序列的選擇)可取決於多種因素,例如欲轉化的宿主細胞的選擇、所需蛋白質的表達量等。適用於哺乳動物宿主細胞表達的調控序列包括在哺乳動物細胞中引導高含量蛋白質表達的病毒元件,例如來源於以下的啟動子和/或強化子巨細胞病毒(CMV)(例如CMV啟動子/強化子)、猿猴病毒40 (SV40)(例如SV40啟動子/強化子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP)) 和多瘤病毒。關於病毒調控元件和其序列的進一步描述,參見例如斯廷斯基(Stinski) 的美國專利第5,168,062號;貝爾(Bel 1)等人的美國專利第4,510,245號;和夏弗納 (Schaffner)等人的美國專利第4,968,615號。除抗體鏈基因和調控序列外,本發明的重組表達載體還可帶有其它序列,諸如調控載體在宿主細胞中的複製的序列(例如複製起點)和可選擇標記基因。可選擇標記基因有助於選擇已引入了載體的宿主細胞(參見例如美國專利第4,399,216號、第 4,634,665號和第5,179,017號(皆來自阿克謝爾(Axel)等人))。舉例來說,可選擇標記基因通常使已引入了載體的宿主細胞對諸如G418、嘌呤黴素(puromycin)、殺稻瘟菌素 (blasticidin)、潮黴素(hygromycin)或甲氨蝶呤(me thotrexate)等藥物具有抗性。適合的可選擇標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用於利用甲氨蝶呤選擇/擴增的 DHFR-宿主細胞中)和neo基因(用於G418選擇)。為表達輕鏈和重鏈,通過標準技術將編碼重鏈和輕鏈的表達載體轉染至宿主細胞中。術語「_」的各種形式意欲涵蓋通常用於將外源DNA引入原核或真核宿主細胞中的多種技術,例如電穿孔、脂質體轉染、磷酸鈣沈澱、DEAE-聚葡萄糖轉染等。可在原核宿主細胞或真核宿主細胞中表達本發明的抗體。在某些實施例中,抗體表達在真核細胞(例如哺乳動物宿主細胞)中進行以獲得經適當摺疊的免疫活性抗體的最佳分泌。用於表達本發明重組抗體的例示性哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CH0細胞)(包括烏爾勞勃(Urlaub)和凱辛(Chasin),1980,美國國家科學院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 77 4216-4220中所述的DHFR-CHO細胞,例如如考夫曼(Kaufman)和夏普 (Sharp),1982,分子生物學(Mol. Biol.) 159 601-621中所述,與DHFR可選擇標記一起使用);NSO骨髓瘤細胞;COS細胞;293細胞和SP2/0細胞。當將編碼抗體基因的重組表達載體引入哺乳動物宿主細胞中時,通過將宿主細胞培養足以允許抗體在宿主細胞中表達或允許抗體分泌至培養宿主細胞的培養基中的時間來產生抗體。可使用標準蛋白質純化方法從培養基回收抗體。也可使用宿主細胞來產生完整抗體的部分,諸如Fab片段或scFv分子。應了解,上述程序的變化形式在本發明的範圍內。舉例來說,可能需要用編碼本發明抗 TNF-α抗體的輕鏈或重鏈(但非兩者)的DNA轉染宿主細胞。也可使用重組DNA技術來移除一些或所有編碼對於結合TNF- α不必要的輕鏈和重鏈中的任一者或兩者的DNA。本發明抗體也涵蓋由所述截短型DNA分子表達的分子。另外,可通過標準化學交聯方法使本發明抗體與第二抗體交聯來產生一條重鏈和一條輕鏈為本發明抗體而另一重鏈和輕鏈對除TNF-α以外的抗原具有特異性的雙功能抗體。雙功能抗體也可通過表達經工程改造以編碼雙功能抗體的核酸來製備。在某些實施例中,雙重特異性抗體(即使用同一結合位點結合TNF-α和一不相關抗原的抗體)可通過使輕鏈和/或重鏈CDR中的胺基酸殘基突變來產生。在各種實施例中,結合TNF-α和另一抗原(例如另一促發炎性細胞因子(諸如淋巴毒素、幹擾素-Y或白介素-1))的雙重特異性抗體可通過使抗原結合位點周邊的胺基酸殘基突變來產生(參見例如波斯特羅姆(Bostrom)等人,2009,科學(Science) 323 1610-1614)。雙重功能性抗體可通過表達經工程改造以編碼雙重特異性抗體的核酸來製備。為重組表達本發明的抗TNF-α抗體,可用兩個本發明表達載體共轉染宿主細胞, 第一載體編碼重鏈來源的多肽而第二載體編碼輕鏈來源的多肽。通常,兩個載體各自含有各別可選擇標記。或者,可使用編碼重鏈多肽和輕鏈多肽兩者的單一載體。在產生編碼D2E7或具有與D2E7的⑶R序列相關的⑶R序列的抗TNF- α抗體的一個或一個以上部分的核酸後,可將其它改變或突變引入編碼序列中例如以產生編碼具有不同CDR序列的抗體、對Fc受體的親和力降低的抗體或不同子類的抗體的核酸。本發明的抗TNF-α抗體也可通過化學合成(例如通過固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis),第 2版,1984皮爾斯化學公司(The Pierce Chemical Co.),伊利諾州羅克福德市(Rockford,Ill.)中所述的方法)產生。變異型抗體也可使用無細胞平臺產生(參見例如楚(Chu)等人,生物化學2 (Biochemia No. 2),2001 (羅氏分子生物學(Roche Molecular Biologicals)))。在通過重組表達產生了本發明的抗TNF-α抗體後,可通過所屬領域中已知用於純化免疫球蛋白分子的任何方法,例如通過色譜(例如,離子交換色譜;親和力色譜,尤其在蛋白質A或蛋白質G選擇後通過對TNF- α進行親和力色譜;以及尺寸管柱色譜)、離心、 不同溶解度,或通過任何其它用於純化蛋白質的標準技術對其進行純化。此外,可將本發明的抗TNF-α抗體或其片段融合至本文所述或所屬領域中另外已知的異源多肽序列以促進純化。分離後,必要時,可例如通過高效液相色譜(參見例如費舍爾(Fisher),生物化學禾口分子生物學實驗技術(Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology)(沃爾克(Work)和布爾頓(Burdon)編,愛思維爾(Elsevier),1980))或通過利用 Superdex 75管柱(法瑪西亞生物技術AB公司(Pharmacia Biotech AB),瑞典烏普薩拉 (Uppsala, Sweden))進行凝膠過濾色譜來進一步純化抗TNF-α抗體。7. 3抗TNF- α抗體的生物活性在某些實施例中,本發明的抗TNF- α抗體具有某些生物活性,諸如與D2E7競爭結合TNF-α或中和TNF-α活性。因此,在某些實施例中,本發明的抗TNF-α抗體與D2E7競爭結合TNF-α。可使用競爭分析測試競爭結合TNF-α的能力。在競爭分析的一實例中,通過使板與TNF-α溶液接觸(例如,以於PBS中1 μ g/mL的濃度,在4°C下過夜)使TNF- α粘附於固體表面(例如微孔板)上。洗滌(例如含0. 吐溫20 (Tween 20)的PBS)板並且進行阻斷(例如, 以Superblock,賽默科技公司(Thermo Scientif ic),伊利諾州羅克福德市(Rockford, II))。將ELISA緩衝液(例如含1 % BSA和0. 1 %吐溫20的PBS)中次飽和量的生物素化 D2E7 (80ng/mL)和連續稀釋(例如,濃度為2. 8 μ g/mL,8. 3 μ g/mL或25 μ g/mL)的未經標記D2E7( 「參照」抗體)或競爭性抗TNF-α抗體(「測試」抗體)抗體的混合物添加至各孔中,且各板在和緩振蕩下培育1小時。洗滌各板,將於ELISA緩衝液中稀釋的1 μ g/mL 接合HRP的抗生蛋白鏈菌素(Sti^ptavidin)添加至各孔中且將各板培育1小時。洗滌各板且通過添加底物(例如TMB,百福斯實驗室有限公司(Biofx Laboratories Inc.),馬裡蘭州歐文斯密爾市(Owings Mills, MD))檢測結合的抗體。通過添加停止緩衝液(例如 Bio FX停止試劑,百福斯實驗室有限公司(Biofx Laboratories Inc.),馬裡蘭州歐文斯密爾市(Owings Mills, MD))終止反應且使用微板讀取器(例如VERSAmax,分子裝置公司 (Molecular Devices),加利弗利亞州桑尼維爾市(Sunnyvale,CA))在650nm下測量吸光度。也可使用此競爭分析的變化形式來測試本發明抗TNF-α抗體與D2E7之間的競爭。舉例來說,在某些方面中,將抗TNF-α抗體用作參照抗體而將D2E7用作測試抗體。另外,可使用在培養物中表達於細胞表面(例如哺乳動物細胞,諸如293S)上的膜結合型TNF-α代替可溶性TNF-α。或者,也可使用在培養物中表達於細胞表面(例如哺乳動物 細胞,諸如 293cl8)上的抗體代替可溶性D2E7和測試抗體。一般說來,使用約IO4至IO6個轉染子,例如約IO5個轉染子。其它競爭分析形式在所屬領域中為已知的且可使用。在各種實施例中,當使用濃度為0. 08 μ g/mL、0. 4 μ g/mL、2 μ g/mL、10 μ g/mL、 50 μ g/mL、100 μ g/mL,或濃度在任何上述值之間的範圍內(例如濃度在2 μ g/mL至10 μ g/ mL的範圍內)的抗TNF- α抗體時,本發明的抗TNF- α抗體使經標記D2E7的結合減少至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %,或任何上述值之間的範圍內的百分比(例如,本發明的抗TNF-α抗體使經標記D2E7的結合減少50%至70% )。在其它實施例中,當使用濃度為0. 4 μ g/mL、2 μ g/mL、10 μ g/mL、50 μ g/mL、 250 μ g/mL,或濃度在任何上述值之間的範圍內(例如濃度在2 μ g/mL至10 μ g/mL的範圍內)的D2E7時,D2E7使經標記的本發明抗TNF-α抗體的結合減少至少40%、至少50%、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %,或在任何上述值之間的範圍內的百分比(例如, D2E7使經標記的本發明抗TNF- α抗體的結合減少50%至70% )。在其它方面中,本發明的抗TNF-α抗體在一系列活體外分析中抑制TNF-α活性, 諸如細胞毒性、致有絲分裂作用、細胞因子誘導和誘導粘附分子。或者,可使用天然或重組表達於細胞上的膜結合型TNF-α通過活體外分析測量本發明的抗TNF-a抗體的活性,諸如誘導逆向信號傳導、細胞因子誘導、誘導粘附分子、CDC和ADCC的能力。使用對TNF-α敏感的細胞(例如L929)測量對可溶性TNF-α細胞毒性的抑制作用的例示性TNF-α中和分析描述於下文中。也可使用其它TNF-a細胞毒性分析來評估本發明的抗TNF-α抗體的活性。因此,在一例示性實施例中,抗TNF-α細胞毒性分析需要將3 X IO4個鼠類L929細胞塗鋪於平底96孔微量滴定板的個別孔中。在37°C下在含溼氣5% CO2培育箱中培育細胞過夜。次日,在25 μ L無血清培養基中製備抗TNF- α抗體的連續稀釋液(例如0. 712 μ g/ mL、0. 949 μ g/mLU. 27 μ g/mLU. 69 μ g/mL,2. 25 μ g/mL 或 3 μ g/mL),且將其添加至細胞中 (例如,於 150 μ L 培養物中的最終濃度為 119ng/mL、158ng/mL、211ng/mL、282ng/mL、375ng/ mL或500ng/mL)。在37°C、5% CO2下培育2小時後,添加最終濃度為40ng/mL(例如25 μ L 的240ng/mL)的TNF- α,且在37°C、5% CO2下再培育細胞48小時。使用活力分析(例如 CellTiter-Blue,普洛麥格公司(Promega),威斯康辛州麥迪遜市(Madison)),相較於對照板(其在某些實施例中經TNF-α處理而未與抗TNF-α抗體一起培育(例如與同型對照抗體一起培育)而在其它實施例中經D2E7處理),針對細胞毒性對各孔進行評分。TNF-α中和分析的其它形式在所屬領域中為已知的且可使用。
在各種實施例中,當使用濃度為2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、0. 1 μ g/mL、 0. 2μ g/mL、ly g/mL、2y g/mL、5y g/mL、10y g/mL、20y g/mL,或濃度在任何上述值之間的範圍內(例如,濃度在ι μ g/mL到5 μ g/mL的範圍內)的抗TNF- α抗體時,本發明的抗 TNF-α抗體將TNF-α中和至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少 80%、至少90%,或在任何上述值之間的範圍內的百分比(例如,本發明的抗TNF-α抗體將TNF-α活性中和50%至70% )。在一些實施例中,本發明的抗TNF-α抗體中和TNF_a 的有效性為D2E7的有效性的至少80%、D2E7的有效性的至少90%、D2E7的有效性的至少 100%, D2E7的有效性的至少110%、D2E7的有效性的至少125%或 D2E7的有效性的至少 150%,和達D2E7的有效性的110%、達D2E7的有效性的125%、達D2E7的有效性的150% 或達D2E7的有效性的200%,或在任一對上述值之間的任何範圍內(例如中和TNF-a的有效性為D2E7的有效性的80%至125%或為D2E7的有效性的125%至200% )。在某些實施例中,本發明的抗TNF-α抗體對TNF-α具有高結合親和力。在特定實施例中,本發明的抗TNF-α抗體具有特定締合速率常數0^或1^值)、解離速率常數(k。ff 或kd值)、親和常數(&值)、解離常數(Kd值)和/或IC5tl值。在某些方面中,所述值選自下列實施例。7. 4抗TNF- α抗體的動力學性質在一特定實施例中,本發明的抗TNF- α抗體結合TNF- a,其中k。n為至少 IO5M 1S 人至少5 X IO5IT1 s \ 至少 IO6M 1S 人至少5 X IO6IT1 s \至少IO7M 1S \至少 5 X ΙΟ、-、-1、至少ΙΟΙ、-1,或k。n在任一對上述值之間的任何範圍內(例如5 X IO5至 5 X IO6IT1S-1 或 IO7 至 IO8MY1)。在另一實施例中,本發明的抗TNF-α抗體結合TNF-a,其中k。ff速率為5 X ΙΟ、—1 或 5Χ10-ν 以下、IiT1s-1 或 IiT1s-1 以下、5Χ ICT2s-1 或 5Χ ICT2s-1 以下、ΙΟ、—1 或 ΙΟ、—1 以下、5Χ IiT3s-1 或 5Χ IiT3s-1 以下、ICT3s-1 或 ο、—1 以下、5χ ο、—1 或 5χ ιοΛτ1 以下、ιοΛτ1 或 ICT4S-1 以下、5X1(T5s-1 或 5X1(T5S-1 以下、1(T5S-1 或 1(T5S-1 以下、5X ICTfV1 或 5X ICTfV1 以下、IO-fV1 或 IO-fV1 以下、5X ICT7s-1 或 5X ICT7s-1 以下、ICT7s-1 或 ICT7s-1 以下、5X ICT8s-1 或 5X ΙΟΥ1 以下、ΙΟ、—1 或 ΙΟ、—1 以下、5X ΙΟ、—1 或 5X ΙΟ、—1 以下、ΙΟ、—1 或 ΙΟ、—1 以下、5X IO-ltV1或5Χ IO-ltV1以下、IO-ltV1或IO-ltV1以下,或k。ff速率在任一對上述值之間的任何範圍內(例如5X IO"4至IO-fV1,或5X 10_5至5X ICT8s-1)。在另一實施例中,本發明的抗TNF-a抗體結合TNF-a,其中KA(k。n/k。ff)為至少 ΙΟ^ηΙΤ1、至少 δΧΙΟ^ηΜ-1、至少 ΙΟ12·1、至少 5X Κ^ηΜ—1、至少 ΙΟ13·1、至少 5X1013nM"\M 少 IO14IiM-1、至少 5 X IO14IiM-1、至少 IO15nM-1、至少 5 X IO15nM-1、至少 IO16nM-1、至少 5 X IO16nM-1、 至少 ΙΟ17·1、至少 5Χ1017ηΜ"\ 至少 ΙΟ18·1、至少 5Χ1018ηΜ"\ 至少 ΙΟ19·1、至少 δΧΙΟ^ηΙΤ1、至少 Ι ^ηΜ-1、至少 5 X IO2Vir1、至少 ΙΟ21·1、至少 5 X 10211^人至少 ΙΟ^ηΙΤ1、至少 5 X IO22Iiir1、至少 IO23IiM-1,至少 5 X Κ^ηΜ—1、至少 Κ^ηΜ—1、至少 5 X Ι ^ηΙΤ1,或 Ka 在任一對上述值之間的任何範圍內(例如5 X IO14至IO22nM-1,或1011到5 X ΙΟ18·1)。在其它實施例中,本發明的抗TNF-a抗體結合TNF-a,其中Kd (k。ff/k。n)為 5 X 107nM或 5 X 107nM 以下、107nM或 107nM 以下、5 X 106nM或 5 X 106nM 以下、106nM或 106nM 以下、5 X 105ηΜ 或 5 X 105ηΜ 以下、105ηΜ 或 105ηΜ 以下、5 X 104ηΜ 或 5 X 104ηΜ 以下、104ηΜ 或 104ηΜ 以下、5X103nM 或 5X103nM 以下、103nM 或 103nM 以下、5X 102nM 或 5X 102nM 以下、IOOnM 或IOOnM以下、90nM或90nM以下、80nM或80nM以下、70nM或70nM以下、60nM或60nM以下、 50nM或50nM以下、20nM或20nM以下、15nM或15nM以下、IOnM或IOnM以下、5nM或5nM以下、3. 8nM 或 3. 8nM 以下、2nM 或 2nM 以下、1. 5nM 或 1. 5nM 以下、InM 或 InM 以下、5 X KT1IiM 或 5 X 1 (T1IiM 以下、1 (T1IiM 或 1 (ΓηΜ 以下、5 X 1 (Γ2ηΜ 或 5 X 1 (Γ2ηΜ 以下、1 (Γ2ηΜ 或 1 (Γ2ηΜ 以下、 5Χ1(Γ3ηΜ 或 5Χ1(Γ3ηΜ 以下、1(Γ3ηΜ 或 1(Γ3ηΜ 以下、5X 1θΛιΜ 或 5X 1θΛιΜ 以下、1θΛιΜ 或 ΙΟΛιΜ 以下、5Χ1(Γ5ηΜ 或 5Χ1(Γ5ηΜ 以下、1(Γ5ηΜ 或 1(Γ5ηΜ 以下、5X 1(Γ6ηΜ 或 5X 1(Γ6ηΜ 以下、10_6ηΜ或10_6ηΜ以下,或Kd在任一對上述值之間的任何範圍內(例如5 X IO7至50ηΜ,或 15ηΜ 至 5Χ1(Γ3ηΜ)。
在某些特定實施例中,本發明的TNF-α抗體結合TNF-α,其中KD(k。ff/k。n)介於約 0. InM與約InM之間,或約0. InM與約2nM之間,或約0. InM與約3nM之間,或約0. InM與約4nM之間,或約0. InM與約5nM之間,或約0. InM與約6nM之間,或約0. InM與約7nM之間,或約0. InM與約8nM之間,或約0. InM與約9nM之間,或約0. InM與約ΙΟηΜ,或介於約 0. OlnM與約0. InM之間,或介於約0. OlnM與約InM之間,或介於約0. OlnM與約2nM之間, 或介於約0. OlnM與約3nM之間,或介於約0. OlnM與約4nM之間,或介於約0. OlnM與約5nM 之間,或介於約0. OlnM與約6nM之間,或介於約0. OlnM與約7nM之間,或介於約0. OlnM與約8nM之間,或介於約0. 0 InM與約9nM之間,或介於約0. 6nM與約1. InM之間,或介於約 0. 7nM與約1.2nM之間,或介於約0. 5與約5nM之間。在其它特定實施例中,抗TNF-α抗體結合 TNF-α,其中 KD(k。ff/k。n)為約 5nM、約 3. 5nM、約 1. 5nM、約 InM、約 0. 5nM、約 0. InM、約 0.05nM或約O.OlnM。在特定實施例中,Kd (k。ff/k。n)值是通過所屬領域中熟知或本文所述的分析測定,例如ELISA、等溫滴定熱量測定(ITC)、BIAcore或螢光偏振分析。在一些實施例中,本發明的抗TNF-α抗體結合TNF-α且抑制TNF-α與ρ55、 ρ75或兩者的結合,其中IC5tl值低於5Χ107ηΜ、低於107ηΜ、低於5X 106ηΜ、低於106ηΜ、低於 5Χ 105ηΜ、低於 105ηΜ、低於 5Χ 104ηΜ、低於 104ηΜ、低於 5 X 103ηΜ、低於 103ηΜ、低於 5 X 102ηΜ、 低於ΙΟΟηΜ、低於90nM、低於80nM、低於70nM、65nM、低於60nM、低於50nM、低於40nM、低於30nM、低於25nM、低於20nM、低於15nM、低於12nM、低於ΙΟηΜ、低於5nM、低於InM、低於 5 X Ι ΓηΜ、低於 ΙΟ—ηΜ、低於 5 X 1(Γ2ηΜ、低於 1(Γ2ηΜ、低於 5 X 1(Γ3ηΜ、低於 1(Γ3ηΜ、低於 5Χ 10_4ηΜ或低於10_4ηΜ,或IC5tl在任一對上述值之間的任何範圍內(例如5 X IO7至50ηΜ, 或15ηΜ至5Χ 10_3riM)。IC5tl可根據所屬領域中熟知或本文所述的方法測量,例如ELISA。在其它實施例中,本發明的抗TNF-α抗體結合TNF-α且中和TNF-α,其中IC5tl 值低於5 X 107ηΜ、低於107ηΜ、低於5 X 106ηΜ、低於106ηΜ、低於5 X 105ηΜ、低於105ηΜ、低於 5 X 104ηΜ、低於 104ηΜ、低於 5 X 103ηΜ、低於 103ηΜ、低於 5 X 102ηΜ、低於 ΙΟΟηΜ、低於 90nM、 低於80nM、低於70nM、65nM、低於60nM、低於50nM、低於40nM、低於30nM、低於25nM、低於 20nM、低於15nM、低於12nM、低於ΙΟηΜ、低於5ηΜ、低於InM、低於δΧΙΟΛιΜ、低於ΙΟΛιΜ、低於 5Χ 1(Γ2ηΜ、低於 1(Γ2ηΜ、低於 5Χ 1(Γ3ηΜ、低於 1(Γ3ηΜ、低於 5X 1θΛιΜ 或低於 1θΛιΜ,或 IC5tl 在任一對上述值之間的任何範圍內(例如5Χ107至50ηΜ,或15ηΜ至5Χ1(Γ3ηΜ)。可用於測量抗TNF-α抗體的IC5tl的例示性中和分析描述於下文第7. 5部分中。在某些特定實施例中,抗TNF-α抗體結合TNF-α且抑制TNF-α與ρ55、ρ75或兩者的結合,或在TNF-α中和分析中抑制TNF-α活性,其中IC5tl值介於約InM與約IOnM之間、介於約InM與約15ηΜ之間、介於約InM與約20ηΜ之間、介於約InM與約25ηΜ之間、介於約InM與約30nM之間、介於約InM與約40nM之間、介於約InM與約50nM之間、介於約IOnM 與約102nM之間、介於約102nM與約103nM之間、介於約IOnM與約104nM之間、介於約104nM 與約105nM之間、介於約105nM與約106nM之間,或介於約106nM與約107nM之間。在其它特定實施例中,抗TNF-α抗體結合TNF-α且抑制TNF-α與ρ55、ρ75或兩者的結合,或在TNF- α中和分析中抑制TNF- α活性,其中IC5tl值介於約5ηΜ與約IOnM之間、介於約5ηΜ與約15ηΜ之間、介於約IOnM與約15ηΜ之間、介於約IOnM與約20ηΜ之間、 介於約IOnM與約30ηΜ之間、介於約IOnM與約40ηΜ之間、介於約IOnM與約50ηΜ之間、介於約InM與約IOOnM之間、介於約IOnM與約IOOnM之間、介於約20ηΜ與約IOOnM之間、介於約30ηΜ與約IOOnM之間、介於約40ηΜ與約IOOnM之間、介於約50ηΜ與約IOOnM之間、介於約15ηΜ與約25ηΜ之間,或介於約15ηΜ與約20ηΜ之間。在上述實施例 的某些方面中,在如下濃度的TNF-α存在下測量IC5tl :0. 001 μ Μ、 0. 005 μΜ、0· 01 μ Μ、0· 05 μ Μ、0· 1μΜ、0· 5μΜ、1μΜ、10μΜ、20μΜ、30μΜ、40μΜ、50μΜ、 60 μ Μ、70 μ Μ、80 μ Μ、90 μ Μ、100 μ Μ、200 μ Μ、300 μ Μ、400 μ Μ、500 μ Μ、600 μ Μ、700 μ Μ、 800μΜ、900μΜ、1000μΜ,或任一對上述值之間的任何範圍內(例如0. 01至50μΜ,或 ΙΟμΜ至100 μ Μ)的濃度。在某些實施例中,本發明抗體的動力學性質在類似分析中與D2E7抗體類似或相對於D2E7抗體得到改良。舉例來說,在某些實施例中,本發明的抗TNF-α抗體結合TNF-α, 其中k。n速率在D2E7的k。n的0. 2倍到5倍的範圍內,例如k。n為D2E7的k。n的0. 2倍,k。n 為 D2E7 的 k。n 的 0. 3 倍,k。n 為 D2E7 的 k。n 的 0. 4 倍,k。n 為 D2E7 的 k。n 的 0. 5 倍,k。n 為 D2E7 的 k。n 的 0. 6 倍,k。n 為 D2E7 的 k。n 的 0. 7 倍,k。n 為 D2E7 的 k。n 的 0. 8 倍,k。n 為 D2E7 的 k。n 的 0. 9 倍,k。n 為 D2E7 的 k。n 的 1 倍,k。n 為 D2E7 的 k。n 的 1. 1 倍,k。n 為 D2E7 的 k。n 的 1. 2 倍, k。n 為 D2E7 的 k。n 的 1. 3 倍,k。n 為 D2E7 的 k。n 的 1. 4 倍,k。n 為 D2E7 的 k。n 的 1. 5 倍,k。n 為 D2E7 的 k。n 的 1. 75 倍,k。n 為 D2E7 的 k。n 的 2 倍,k。n 為 D2E7 的 k。n 的 2. 25 倍,k。n 為 D2E7 的 k。n 的 2. 5 倍,k。n 為 D2E7 的 k。n 的 2. 75 倍,k。n 為 D2E7 的 k。n 的 3 倍,k。n 為 D2E7 的 k。n 的 3. 5倍,k。n為D2E7的k。n的4倍,k。n為D2E7的k。n的4. 5倍,k。n為D2E7的k。n的5倍,或 k。n在任一對上述值之間的範圍內,例如k。n為D2E7的k。n的0. 7倍-1. 5倍,k。n為D2E7的 k。n 的 0. 9 倍-1. 3 倍,k。n 為 D2E7 的 k。n 的 0. 8 倍-2 倍,k。n 為 D2E7 的 k。n 的 0. 9 倍-3 倍等。在實施例中,本發明的抗TNF-α抗體結合TNF-α,其中k。ff速率在D2E7的k。ff的
0.2倍到5倍的範圍內,例如k。ff為D2E7的k。ff的0. 2倍,k。ff為D2E7的k。ff的0. 3倍,k。ff 為 D2E7 的 k。ff 的 0. 4 倍,k。ff 為 D2E7 的 k。ff 的 0. 5 倍,k。ff 為 D2E7 的 k。ff 的 0. 6 倍,k。ff 為 D2E7 的 k。ff 的 0. 7 倍,k。ff 為 D2E7 的 k。ff 的 0. 8 倍,k。ff 為 D2E7 的 k。ff 的 0. 9 倍,k。ff 為 D2E7 的 koff 的 1 倍,k。ff 為 D2E7 的 k。ff 的 1. 1 倍,k。ff 為 D2E7 的 k。ff 的 1. 2 倍,k。ff 為 D2E7 的 k。ff 的 1. 3 倍,k。ff 為 D2E7 的 k。ff 的 1. 4 倍,k。ff 為 D2E7 的 k。ff 的 1. 5 倍,k。ff 為 D2E7 的 k。ff 的
1.75 倍,k。ff 為 D2E7 的 k。ff 的 2 倍,k。ff 為 D2E7 的 k。ff 的 2. 25 倍,k。ff 為 D2E7 的 k。ff 的 2. 5 倍,koff 為 D2E7 的 k。ff 的 2. 75 倍,k。ff 為 D2E7 的 k。ff 的 3 倍,k。ff 為 D2E7 的 k。ff 的 3. 5 倍, k。ff 為 D2E7 的 k。ff 的 4 倍,k。ff 為 D2E7 的 k。ff 的 4. 5 倍,k。ff 為 D2E7 的 k。ff 的 5 倍,或 k。ff 在任一對上述值之間的範圍內,例如k。ff為D2E7的k。ff的0. 7倍-1. 5倍,k。ff為D2E7的k。ff 的 0. 9 倍-1. 3 倍,k。ff 為 D2E7 的 k。ff 的 0. 8 倍-2 倍,k。ff 為 D2E7 的 k。ff 的 0. 9 倍-3 倍等。在其它實施例中,本發明的抗TNF-α抗體結合TNF-α,其中KA(k。n/k。ff)在D2E7的Ka的0. 04倍到25倍的範圍內,例如Ka為D2E7的Ka的0. 04倍,Ka為D2E7的Ka的0. 1 倍,Ka為D2E7的Ka的0. 25倍,Ka為D2E7的Ka的0. 5倍,Ka為D2E7的Ka的0. 6倍,Ka為 D2E7 的 Ka 的 0. 7 倍,Ka 為 D2E7 的 Ka 的 0. 8 倍,Ka 為 D2E7 的 Ka 的 0. 9 倍,Ka 為 D2E7 的 Ka 的1倍,Ka為D2E7的Ka的1. 1倍,Ka為D2E7的Ka的1. 25倍,Ka為D2E7的Ka的1. 5倍,Ka 為D2E7的Ka的1. 75倍,Ka為D2E7的Ka的2倍,Ka為D2E7的Ka的2. 5倍,Ka為D2E7的 Ka的3倍,Ka為D2E7的Ka的4倍,Ka為D2E7的Ka的4x%,Ka為D2E7的Ka的5倍,Ka為 D2E7 的 Ka 的 7. 5 倍,Ka 為 D2E7 的 Ka 的 10 倍,Ka 為 D2E7 的 Ka 的 12. 5 倍,Ka 為 D2E7 的 Ka 的15倍,Ka為D2E7的Ka的20倍,Ka為D2E7的Ka的25倍,或Ka在任一對上述值之間的範圍內,例如Ka為D2E7的Ka 的0. 7倍-1. 25倍,Ka為D2E7的Ka的0. 9倍-1. 5倍,Ka為D2E7 的Ka的0. 9倍-2倍,Ka為D2E7的Ka的0. 8倍-1. 75倍,Ka為D2E7的Ka的0. 9倍-5倍, 或任何可由本文所揭示的k。n* k。ff速率計算出的值或範圍。在其它實施例中,本發明的抗TNF-α抗體結合TNF-α,其中KD(k。ff/k。n)在D2E7 的Kd的0. 04倍到25倍的範圍內,例如Kd為D2E7的Kd的0. 04倍,Kd為D2E7的Kd的0. 1 倍,Kd為D2E7的Kd的0. 25倍,Kd為D2E7的Kd的0. 5倍,Kd為D2E7的Kd的0. 6倍,Kd為 D2E7 的 Kd 的 0. 7 倍,Kd 為 D2E7 的 Kd 的 0. 8 倍,Kd 為 D2E7 的 Kd 的 0. 9 倍,Kd 為 D2E7 的 Kd 的1倍,Kd為D2E7的Kd的1. 1倍,Kd為D2E7的Kd的1. 25倍,Kd為D2E7的Kd的1. 5倍,Kd 為D2E7的Kd的1. 75倍,Kd為D2E7的Kd的2倍,Kd為D2E7的Kd的2. 5倍,Kd為D2E7的 Kd的3倍,Kd為D2E7的Kd的4倍,Kd為D2E7的Kd的4x%,Kd為D2E7的Kd的5倍,Kd為 D2E7 的 Kd 的 7. 5 倍,Kd 為 D2E7 的 Kd 的 10 倍,Kd 為 D2E7 的 Kd 的 12. 5 倍,Kd 為 D2E7 的 Kd 的15倍,Kd為D2E7的Kd的20倍,Kd為D2E7的Kd的25倍,或Kd在任一對上述值之間的範圍內,例如Kd為D2E7的Kd的0. 7倍-1. 25倍,Kd為D2E7的Kd的0. 9倍-1. 5倍,Kd為D2E7 的Kd的0. 9倍-2倍,Kd為D2E7的Kd的0. 8倍-1. 75倍,Kd為D2E7的Kd的0. 9倍-5倍, 或任何可由本文所揭示的k。n* k。ff速率計算出的值或範圍。在一些實施例中,本發明的抗TNF-α抗體結合TNF-α且抑制TNF-α與ρ55、ρ75 或兩者的結合,其中IC5tl值在D2E7的IC5tl的50%至200%範圍內,例如IC5tl為D2E7的IC5tl 的 50 %,IC50 為 D2E7 的 IC5tl 的 60 %,IC50 為 D2E7 的 IC5tl 的 70 %,IC50 為 D2E7 的 IC5tl 的 75 %,IC50 為 D2E7 的 IC5tl 的 80 %,IC50 為 D2E7 的 IC5tl 的 90 %,IC50 為 D2E7 的 IC5tl 的 95 %, IC50 為 D2E7 的 IC50 的 100%, IC50 為 D2E7 的 IC50 的 110%,IC50 為 D2E7 的 IC50 的 120%, IC50 為 D2E7 的 IC50 的 125%, IC50 為 D2E7 的 IC50 的 130%, IC50 為 D2E7 的 IC50 的 140%, IC50 為 D2E7 的 IC5tl 的 150%,IC5tl 為 D2E7 的 IC5tl 的 160%,IC5tl 為 D2E7 的 IC5tl 的 170%,IC5tl 為 D2E7 的 IC5tl 的 175%,IC5tl 為 D2E7 的 IC5tl 的 180%,IC5tl 為 D2E7 的 IC5tl 的 190%,IC5tl 為 D2E7的IC5tl的200%,或IC5tl在任一對上述值之間的任何範圍內,例如IC5tl為D2E7的IC5tl 的 75% -125%, IC50 為 D2E7 的 IC5tl 的 90% -130%, IC50 為 D2E7 的 IC5tl 的 95% -125%, IC50 為 D2E7 的 IC5tl 的 90% -110%,IC50 為 D2E7 的 IC5tl 的 90% -180%,或 IC5tl 為 D2E7 的 IC50的80% -175%。在其它實施例中,單個⑶R取代可引起上述相較於D2E7的IC5tl差異, 而本發明的抗TNF- α抗體相較於D2E7可包含所述取代和至多16個其它取代。在其它實施例中,本發明的抗TNF-α抗體結合TNF-α且中和TNF-α,其中IC5tl 值在D2E7的IC50的50%至200%範圍內,例如IC50為D2E7的IC50的50%, IC50為D2E7的 IC50 的 60%,IC50 為 D2E7 的 IC5tl 的 70%,IC50 為 D2E7 的 IC5tl 的 75%,IC50 為 D2E7 的 IC5tl 的80 %,IC50 為 D2E7 的 IC5tl 的 90 %,IC50 為 D2E7 的 IC5tl 的 95 %,IC50 為 D2E7 的 IC5tl 的 100 %, IC50 為 D2E7 的 IC50 的 110%,IC50 為 D2E7 的 IC50 的 120%, IC50 為 D2E7 的 IC50 的 125%, IC50 為 D2E7 的 IC50 的 130%, IC50 為 D2E7 的 IC50 的 140%, IC50 為 D2E7 的 IC50 的 150%, IC50 為 D2E7 的 IC50 的 160%, IC50 為 D2E7 的 IC50 的 170%, IC50 為 D2E7 的 IC50 的 175%, IC50 為 D2E7 的 IC50 的 180%, IC50 為 D2E7 的 IC50 的 190%, IC50 為 D2E7 的 IC50 的 200%, 或IC5tl在任一對上述值之間的任何範圍內,例如IC5tl為D2E7的IC5tl的75% -125%, IC50 為 D2E7 的 IC5tl 的 90% -130%, IC50 為 D2E7 的 IC5tl 的 95% -125%, IC50 為 D2E7 的 IC5tl 的 90% -11 0%, IC50 為 D2E7 的 IC5tl 的 90% -180%,或 IC5tl 為 D2E7 的 IC5tl 的 80% -175%。在其它實施例中,單個⑶R取代可引起上述相較於D2E7的IC5tl差異,然而本發明的抗TNF- α 抗體相較於D2E7可包含所述取代和至多16個其它取代。7. 5抗TNF- α抗體的免疫原性降低在某些方面中,本發明提供相較於D2E7免疫原性有所降低的抗TNF-α抗體。本發明也提供在CDR中相較於D2E7的CDR具有多個胺基酸取代的抗TNF-α抗體,其中至少一個取代相較於D2E7降低抗體的免疫原性。在某些實施例中,降低的免疫原性由一個或一個以上致使消除或減少一個或一個以上T細胞抗原決定基的胺基酸取代所引起。在某些方面中,免疫原性降低的本發明抗TNF- α抗體相較於D2E7具有類似或改良的生物活性,例如對TNF-α的親和力或對TNF-α活性的中和。可例如通過上文第7. 3 部分中所述的方法測試所述性質。在某些實施例中,本發明TNF-α抗體的免疫原性相對於D2E7抗體有所降低。所述抗體一般在對應於SEQ ID NO 81和/或SEQ ID NO 82和/或SEQ ID NO 83的區域中具有相對於重鏈和/或輕鏈可變區的變異型序列。抗體一般在對應於SEQ ID NO 81, SEQ ID N0:82和SEQ ID NO :83的一個、兩個或全部三個序列中具有一個、兩個或三個胺基酸取代,不過本文也涵蓋一個、兩個或全部三個區域中多達四個或五個取代。產生免疫原性相較於D2E7降低的抗體的例示性⑶R-Ll取代列於表11中。本發明的抗體可包含表11中所列的任何取代或取代組合,且任選包含單獨或呈組合形式的一個或一個以上其它取代,諸如表12-25中任一者中的⑶R突變。如本發明中所用,術語「免疫原性降低」指示相較於SEQ ID NO :8USEQ ID NO 82 或 SEQ ID NO 83 變異的序列分別與 SEQ ID NO :81、SEQ ID NO 82 或 SEQ ID NO 83 的肽相比,引起周邊血液單核細胞的增殖反應降低。可用於評估增殖反應的例示性增殖分析在下文第8部分中進行闡述。增殖反應降低可由反應者的百分比、刺激指數或兩者來反映。在其它實施例中,相較於具有SEQ ID NO :81、SEQ ID N0:82或SEQ ID NO :83的序列的肽,變異型序列使反應者減少至少25%,使反應者減少至少30%,使反應者減少至少 35 %,使反應者減少至少40 %,使反應者減少至少45 %,使反應者減少至少50 %,使反應者減少至少60 %,使反應者減少至少65 %,使反應者減少至少70 %,使反應者減少至少75 %, 使反應者減少至少80 %,使反應者減少至少85 %,使反應者減少至少90 %,使反應者減少至少95%,使反應者減少100%,或反應者減少在任何上述值之間的範圍內,例如反應者減少25%-75%,反應者減少50%-90%,反應者減少60% -100%,反應者減少70% -90%等。在其它實施例中,變異型序列所產生的刺激指數比分別由SEQ ID NO :81、SEQ ID NO :82或SEQ ID NO 83的肽引起的刺激指數低至少5%,低至少10%,低至少15%,低至少20%,低至少25%,低至少30%,低至少35%,或低至少40%,或致使刺激指數相較於 SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82或SEQ ID NO :83的肽降低任何上述值之間的範圍,例如降低 5% -20%、降低 10% -30%、降低 25% -35%、降低 30% -40%等。相較於D2E7免疫原性降低的抗TNF- α抗體的例示性實施例包含表11中所述的一個或一個以上⑶R取代或取代組合。7. 6抗體接合物本發明的抗TNF-α抗體包括例如通過將任何類型的分子共價連接於抗體使得共價連接不幹擾與TNF-α的結合而修飾的抗體接合物。在某些方面中,本發明的抗TNF-α抗體可接合於效應部分或標記。如本文所用的術語「效^Μ 」包括例如抗贅生劑、藥物、毒素、生物活性蛋白質(例如酶)、其它抗體或抗體片段、合成或天然產生的聚合物、核酸(例如DNA和RNA)、放射性核種(尤其放射性碘)、 放射性同位素、螯合金屬、納米粒子和報導基團(諸如螢光化合物或可由NMR或ESR光譜法檢測的化合物)。
在一實例中,抗TNF-α抗體可接合於效應部分(諸如細胞毒性劑、放射性核種或藥物部分)以改變指定生物反應。效應部分可為蛋白質或多肽,諸如(而不限於)毒素(諸如相思子毒素(abrin)、蓖麻毒素A(ricin Α)、綠膿桿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin) 或白喉毒素(Diphtheria toxin));信號傳導分子(諸如α -幹擾素、β -幹擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子或組織纖維蛋白溶酶原活化因子);血栓形成劑或抗血管生成劑(例如血管抑制素(angiostatin)或內皮抑制素(endostatin));或生物反應調節劑,諸如細胞因子或生長因子(例如白介素-1 (IL-I)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、粒細胞巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞群落刺激因子(G-CSF)或神經生長因子(NGF))。在另一實例中,效應部分可為細胞毒素或細胞毒性劑。細胞毒素和細胞毒性劑的實例包括紫杉醇(taxol)、細胞鬆弛素B (cytochalasin B)、短桿菌肽D (gramicidin D)、溴化乙錠、吐根素(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、鬼臼噻吩苷(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼 (colchicin)、小紅莓(doxorubicin)、道諾黴素(daunorabicin)、二輕基炭疽菌素二酮 (dihydroxy anthracin dione)、米託惠酉昆(mitoxantrone)、光神霄素(mithramycin)、 放射菌素Dbctinomycin D)、1-去氫睪酮、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、四卡因 (tetracaine)、利多卡因(Iidocaine)、普萘洛爾(propranolol)和嘌呤黴素,和其類似物或同系物。效應部分也包括(但不限於)抗代謝物(例如甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺(5_fluorouracil decarbazine));烷化劑(例如氮芥(mechlorethamine)、噻替派(thio印a)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine,BSNU)和洛莫司汀(lomustine,CCNU)、環硫磷醯胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈佐黴素(str印tozotocin)、絲裂黴素C5和順-二氯二胺鉬(II) (DDP)順鉬(cisplatin));蒽環黴素(anthracycline)(例如道諾黴素(先前稱作柔紅黴素(daunomycin))和小紅莓); 抗生素(例如放線菌素DWactinomycin)(先前稱作放射菌素(actinomycin))、博萊黴素 (bleomycin)、光神黴素、安麴黴素(anthramycin,AMC)、卡奇黴素(calicheamicin)或倍癌黴素(duocarmycin));和抗有絲分裂劑(例如長春新鹼和長春鹼)。其它效應部分可包括放射性核種(諸如(但不限於)mIn和9°Y、Lum、鉍213、鉲252、 銥192和鎢188/錸188)和藥物(諸如(但不限於)烷基磷酸膽鹼、拓撲異構酶I抑制劑、紫杉烷(taxoid)和舒拉明(suramin))。用於將所述效應部分接合於抗體的技術在所屬領域中為熟知的(參見例如海爾斯特羅姆(Hellstrom)等人,受控藥物傳遞(Controlled Drug Delivery),第2版, 第623-53頁(羅賓 遜(Robinson)等人編,1987));索普(Thorpe)等人,1982,免疫學綜述(Immunol. Rev.)62 119-58 ;和杜波維基奇(Dubowchik)等人,1999,藥理學和治療學 (Pharmacology and Therapeutics) 83 :67_123)。在一實例中,抗體或其片段通過共價鍵(例如肽鍵)經所述抗體的N端或C端或內部融合於另一蛋白質(或其部分,例如蛋白質的至少10個、20個或50個胺基酸部分)的胺基酸序列。抗體或其片段可在所述抗體的恆定結構域的N端連接於另一蛋白質。例如如 WO 86/01533和EP 0392745中所述,可使用重組DNA程序產生所述融合體。在另一實例中, 效應分子可增加活體內半衰期,和/或增強抗體穿過上皮對免疫系統的屏障的傳遞。適合的此類型效應分子的實例包括聚合物、白蛋白、白蛋白結合蛋白或白蛋白結合化合物,諸如 WO 2005/117984中所述的那些分子。在某些方面中,抗TNF-α抗體接合於小分子毒素。在某些例示性實施例中,本發明的抗TNF-α抗體接合於海兔毒素(dolastatin)或海兔毒素肽類似物或衍生物,例如奧瑞他汀(auristatin)(美國專利第5,635,483號和第5,780,588號)。海兔毒素或奧瑞他汀藥物部分可通過抗體的N(氨基)端、C (羧基)端或內部連接於抗體(W0 02/088172)。例示性奧瑞他汀實施例包括如美國專利第7,498,298號(其以全文引用的方式併入本文中, 揭示例如連接子和製備接合於連接子的單甲基纈氨酸化合物(諸如MMAE和MMAF)的方法) 中所揭示的N端連接型單甲基奧瑞他汀藥物部分DE和DF。在其它例示性實施例中,小分子毒素包括(但不限於)卡奇黴素、美登素 (maytansine)(美國專利第5,208,020號)、單端孢黴烯族毒素(trichothene)和CC1065。 在本發明的一實施例中,抗體接合於一個或一個以上美登素分子(例如,每個抗體分子接合約1至約10個美登素分子)。可例如將美登素轉化為May-SS-Me,May-SS-Me可還原為May_SH3且與抗體反應(查瑞(Chari)等人,1992,癌症研究(Cancer Research) 52 127-131),產生類美登素(maytansinoid)-抗體或類美登素-Fc融合接合物。也可使用的卡奇黴素結構類似物包括(但不限於)Y/、Y ^ Y ^N-乙醯基-Y/、PSAG和θ/(辛曼(Hinman)等人,1993,癌症研究(Cancer Research) 53 :3336_3342 ;羅德(Lode)等人, 1998,癌症研究(Cancer Research) 58 :2925_2928 ;美國專利第5,714,586號;美國專利第 5,712,374號;美國專利第5,264,586號;美國專利第5,773,001號)。本發明的抗體也可接合於脂質體以用於靶向傳遞(參見例如帕克(Park)等人,1997,藥理學進展(Adv. Pharmacol.) 40 :399_435 ;馬蒂(Marty)和施文登耐爾 (Schwendener),2004,分子醫學方法(Methods in Molecular Medicine) 109 :389_401)。在一實例中,本發明的抗體可連接於聚(乙二醇)(PEG)部分。在一特定實例中, 抗體為抗體片段且PEG部分可通過位於抗體片段中的任何可用胺基酸側鏈或末端胺基酸官能團(例如任何自由氨基、亞氨基、硫醇、羥基或羧基)連接。所述胺基酸可天然存在於抗體片段中,或可使用重組DNA方法工程改造至片段中。參見例如美國專利第5,219,996 號。可使用多個位點來連接兩個或兩個以上PEG分子。PEG部分可通過位於抗體片段中的至少一個半胱氨酸殘基的硫醇基以共價方式連接。在使用硫醇基作為連接點時,可使用經適當活化的效應部分(例如,硫醇選擇性衍生物(諸如順丁烯二醯亞胺)和半胱氨酸衍生物)。在一特定實例中,抗TNF-α抗體接合物為例如根據EP 0948544中所揭示的方法進行聚乙二醇化的經修飾Fab'片段,即其具有PEG(聚(乙二醇))與其共價連接。也參見聚(乙二醇)化學的生物技術和生物醫學應用(Poly(ethyleneglycol)Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications) (J .米爾頓 哈裡其jf (J. Milton Harris)編, 普萊南出版社(Plenum Press),紐約(New York),1992);聚(乙二醇)化學和生物學應用 (Poly (ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications) (J.米爾頓 哈裡斯 (J. Milton Harris)和 S.澤裡普斯基(S. Zalipsky)編,美國化學學會(American Chemical Society),華盛頓特區(Washington D. C.),1997);和生物醫學中的生物接合蛋白質偶合技術(Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences) (M.阿斯拉姆(M.Aslam)和Α.鄧特(A.Dent)編,格羅夫出版社(Grove Publishers), 紐約(New York), 1998);和查普曼(Chapman),2002,藥物傳遞進展綜述(Advanced Drug Delivery Reviews) 54 :531_545。PEG可連接於絞鏈區中的半胱氨酸。在一實例中,經PEG 修飾的Fab'片段具有順丁烯二醯亞胺基團共價連接於經修飾絞鏈區中的單個硫醇基。賴氨酸殘基可共價連接於順丁烯二醯亞胺基團且賴氨酸殘基上的各氨基可連接於分子量為約20,OOODa的甲氧基聚(乙二醇)聚合物。連接於Fab'片段的PEG的總分子量因此可為約 40,OOODa。「標記」 一詞在本文使用時是指可肓接或間接接合於本發明的抗TNF-Ci抗體的可檢測化合物或組合物。標記自身可為可檢測的(例如,放射性同位素標記或螢光標記),或在酶標記的情況下,可催化可檢測的底物化合物或組合物發生化學變化。適用的螢光部分包括(但不限於)螢光素(fluorescein)、異硫氰酸螢光素(fluorescein isothiocyanate)、若丹明(rhodamine)、5_ ^甲月安 _1_ 蔡石黃酉先氣、藻紅素(phycoerythrin) 等。適用的酶標記包括(但不限於)鹼性磷酸酶、辣根過氧化酶、葡萄糖氧化酶等。其它尤其適用於診斷目的的抗TNF-α抗體接合物描述於下文第7. 7部分中。7. 7抗TNF- α抗體的診斷用途本發明的抗TNF-α抗體(包括已例如經生物素化、辣根過氧化酶或任何其它可檢測部分(包括第7. 6部分中所述的部分)修飾的抗體)可適用於診斷目的。具體來說,抗TNF-α抗體可用於例如(但不限於)純化或檢測TNF-α,包括活體外和活體內診斷方法兩者。舉例來說,抗體可用於定性和定量測量生物樣品中TNF-a 的含量的免疫分析中。參見例如哈洛(Harlow)等人,抗體實驗室手冊(Antibodies :A Laboratory Manual),第 2 版(冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),1988),其以全文引用的方式併入本文中。在一實施例中,本發明的抗TNF-α抗體可用於檢測和定量血清中TNF-α的含量。本發明進一步涵蓋接合於診斷劑的抗體或其片段。所述抗體可用於診斷以便例如檢測相關目標於特定細胞、組織或血清中的表達;或作為臨床測試程序的一部分監測免疫反應的發展或進展以便例如判斷指定治療方案的功效。可通過將抗體偶合至可檢測物質來促進檢測。可檢測物質的實例包括各種酶、輔基、螢光物質、發光物質、生物發光物質、放射性物質、使用各種正電子發射斷層攝影術的正電子發射金屬,和非放射性順磁性金屬離子。可使用所屬領域中已知的技術將可檢測物質直接偶合或接合於抗體(或其片段),或通過中間物(諸如,所屬領域中已知的連接子)間接偶合或接合於抗體(或其片段)。酶標記的實例包括螢光素酶(Iuciferase)(例如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶;美國專利第4,737,456號)、發光素(Iuciferin) ,2,3- 二氫酞嗪二酮、蘋果酸去氫酶、尿素酶、過氧化酶(諸如辣根過氧化酶(HRPO))、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、乙醯膽鹼酯酶、葡萄糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸去氫酶)、雜環氧化酶(諸如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化酶、微過氧化酶等。適合輔基複合物的實例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素;適合螢光物質的實例包括傘酮(umbelliferone)、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明、二氯三嗪基胺、螢光素、丹醯氯 (dansyl chloride)或藻紅素;發光物質的實例包括魯米諾(luminol);生物發光物質的實例包括螢光素酶、發光素和水母發光蛋白(aequorin);且適合放射性物質的實例包括 1251、 131I、mIn 或"Tc。本發明提供對TNF-α表達的檢測,其包含使用一種或一種以上本發明的抗 TNF-α抗體(任選接合於可檢測部分)接觸生物樣品(個體的細胞、組織或體液),和檢測樣品關於TNF-α表達是否呈陽性,或檢測樣品相較於對照樣品是否具有改變(例如減少或增加)的表達。可使用本發明方法診斷的疾病包括(但不限於)本文所述的疾病。在某些實施例中,組織或體液為周邊血液、周邊血液白血球、活組織檢查組織(諸如肺或皮膚活組織檢查)以及組織。7. 8使用抗TNF-α抗體的治療方法7. 8.1臨床效益本發明的TNF-α抗體適用於治療各種免疫和自體免疫性病變以及發炎性疾病的病症或症狀。可用本發明的抗TNF-α抗體治療的TNF-α相關病變和疾病包括(但不限於)以下 急性和慢性免疫和自體免疫性病變,諸如全身性紅斑狼瘡、類風溼性關節炎、甲狀腺功能症、移植物抗宿主疾病、硬皮病、糖尿病、格雷夫氏病等; 感染,包括(但不限於)敗血症綜合症;惡病質;由急性或慢性細菌感染所致的循環性虛脫和休克;急性和慢性寄生蟲和/或細菌、病毒或真菌感染性疾病,諸如AIDS (包括後遺症,諸如惡病質、自體免疫性病症、AIDS痴呆綜合症和感染); 發炎性疾病,諸如慢性發炎性病變和血管發炎性病變,包括諸如類肉瘤病、慢性發炎性腸病、潰瘍性結腸炎和克羅恩氏病等慢性發炎性病變,和諸如(但不限於)散播性血管內凝血、動脈粥樣硬化和川崎氏病(Kawasaki' s pathology)等血管發炎性病變; 神經退化性疾病,包括(但不限於)脫髓鞘疾病,諸如多發性硬化症和急性橫貫性脊髓炎;錐體外和小腦病症,諸如皮質脊髓系統的病變;基底神經節病症或小腦病症;過動性運動障礙,諸如亨廷頓氏舞蹈病(Huntington' s Chorea)和老年性舞蹈病;藥物誘發性運動障礙,諸如由阻斷CNS多巴胺受體的藥物誘發的運動障礙;運動不足性運動障礙,諸如帕金森氏症(Parkinson' s disease);進行性核上麻痺;小腦和脊髓小腦病症,諸如小腦結構性病變;脊髓小腦退化(脊髓性共濟失調、弗裡德裡希氏共濟失調(Friedreich' s ataxia)、小腦皮質退化、多系統退化(門則病(Mencel)Jf 哲因-託馬斯病(Dejerine-Thomas)、史德爾格病(Shi-Drager)和馬查多-約瑟夫病 (Machado-Joseph));和全身性病症(雷夫蘇姆氏病(Refsum' s disease)、無β脂蛋白血症、共濟失調、毛細血管擴張和線粒體多系統病症);脫髓鞘核心病症,諸如多發性硬化症、 急性橫貫性脊髓炎;運動單位病症,諸如神經性肌肉萎縮(前角細胞退化,諸如肌萎縮性側索硬化、嬰兒脊髓性肌肉萎縮和青少年脊髓性肌肉萎縮);阿茲海默氏症(Alzheimer' s disease);中年唐氏綜合症(Down 『 s Syndrome in middle age);泛發性路易體疾病 (Diffuse Lewy body disease);足各胃個生;(Senile Dementia of Lewy body type);韋尼克-科爾薩科夫綜合症(Wernicke-Korsakoff syndrome);慢性酒精中毒;庫賈氏症(Creutzfeldt-Jakob disease);亞急性硬化性全腦炎;哈洛弗登-史巴茲氏蒼白球色素退化症(Hallerrorden-Spatz disease);和拳擊員痴呆;或其任何子集; 涉及TNF- α分泌 性腫瘤的惡性病變或其它涉及TNF- α的惡性疾病,諸如(但不限於)白血病(急性、慢性髓細胞性、慢性淋巴細胞性和/或脊髓發育不良性綜合症); 淋巴瘤(霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin' s lymphoma)和非霍奇金氏淋巴瘤(non_Hodgkin' s lymphoma),諸如惡性淋巴瘤(伯基特氏淋巴瘤(Burkitt' s lymphoma)或蕈樣真菌病 (Mycosis fungoides)),禾口 酒精誘發性肝炎。在某些特定實施例中,本發明的抗體用於治療以下一者或一者以上 成人的中度至重度類風溼性關節炎(RA);· 4歲和4歲以上兒童的中度至重度多關節型青少年特發性關節炎(JIA); 成人的牛皮癬性關節炎(PsA); 成人的僵直性脊椎炎(AS)。 對常規治療反應不良的成人的中度至重度克羅恩氏病(CD); 成人的中度至重度慢性斑塊型牛皮癬(Ps)。因此,本發明提供治療有需要的患者的任何上述疾病的方法,其包含向所述患者投予本發明的抗TNF-α抗體。所述投藥任選例如在1天、2天、3天、5天、1周、2周、3周、 1個月、5周、6周、7周、8周、2個月或3個月後重複。重複投藥可以相同劑量或不同劑量進行。投藥可重複1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或10次以上。舉例來說,根據某些給藥方案,患者長期接受抗TNF- α治療,歷時例如6個月、1年或1年以上。 向患者投予的抗TNF-α抗體的量在某些實施例中為治療有效量。如本文所用,「治療有效」 量的TNF-α抗體可以單一劑量形式或經歷治療方案的時程,例如經歷1周、2周、3周、1個月、3個月、6個月、1年或更久的時程投予。例示性治療方案描述於下文第7. 11部分中。根據本發明,治療疾病涵蓋治療已診斷罹患任何形式的處於任何臨床階段或表現的疾病的患者;延遲疾病的症狀或徵兆的發作或演變或加重或惡化;和/或預防疾病和/ 或減輕疾病的嚴重度。投予本發明的抗TNF- α抗體的「土體」或「患盍」優選為哺乳動物,諸如非靈長類動物(例如母牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)或靈長類動物(例如猴或人類)。在某些實施例中,個體或患者為人類。在某些方面中,人類為兒科患者。在其它方面中,人類為成人患者。7. 9醫藥組合物和投藥途徑本文提供包含本發明的抗TNF-α抗體且任選包含一種或一種以上其它治療劑 (諸如下文第7. 10部分中所述的組合治療劑)的組合物。組合物通常將作為通常包括醫藥學上可接受的載劑的無菌醫藥組合物的一部分供應。此組合物可呈任何適合形式(視將其投予患者的所需方法而定)。可通過多種途徑(諸如經口、經皮、皮下、鼻內、靜脈內、肌肉內、眼內、局部、鞘內和腦室內)向患者投予本發明的抗TNF-α抗體。在任何指定情況下最適於投藥的途徑將視特定抗體、個體和疾病的性質和嚴重度以及個體的身體狀況而定。為治療本文所述的適應症,本發明的抗TNF-α抗體的有效劑量可在每單次(例如大丸劑(bolus))投藥、多次投藥或連續投藥約0. 001至約75mg/kg的範圍內,或可達成每單次(例如大丸劑)投藥、多次投藥或連續投藥0. 01-5000 μ g/mL血清濃度的血清濃度,或為其中任何有效範圍或值,視所治療的病狀、投藥途徑和個體的年齡、體重和狀況而定。在一特定實施例中,各劑量可在每公斤體重約0. 5 μ g至約50 μ g,例如每公斤體重約3 μ g至約30μ g的範圍內。抗體可調配成水溶液且通過皮下注射投予。醫藥組合物可以每劑含有預定量的本發明抗TNF-α抗體的單位劑型方便地提供。所述單位可含有例如(但不限於)5mg至5g,例如IOmg至lg,或20至50mg。用於本發明中的醫藥學上可接受的載劑可採用多種形式,視例如欲治療的病狀或投藥途徑而定。本發明抗TNF-α抗體的治療調配物可通過混合具有所需純度的抗體與任選所屬領域中通常使用的醫藥學上可接受的載劑、賦形劑或穩定劑(在本文中皆稱作「載劑」) (即,緩衝劑、穩定劑、防腐劑、等滲劑、非離子型清潔劑、抗氧化劑和其它各種添加劑)來製備成凍幹調配物或水溶液以供儲存。參見雷明頓醫藥科學(Remington' s Pharmaceutical Sciences),第16版(歐索爾(Osol)編,1980)。所述添加劑在所用的劑量和濃度下須對接受者無毒。 緩衝劑幫助使pH值維持於接近生理條件的範圍內。其可以約2mM至約50mM範圍內的濃度存在。適用於本發明的緩衝劑包括有機酸和無機酸兩者和其鹽,諸如檸檬酸鹽緩衝液(例如檸檬酸單鈉_檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸_檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸_檸檬酸單鈉混合物等)、丁二酸鹽緩衝液(例如丁二酸_ 丁二酸單鈉混合物、丁二酸_氫氧化鈉混合物、丁二酸-丁二酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩衝液(例如酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸_酒石酸鉀混合物、酒石酸_氫氧化鈉混合物等)、反丁烯二酸鹽緩衝液(例如反丁烯二酸_反丁烯二酸單鈉混合物、反丁烯二酸_反丁烯二酸二鈉混合物、反丁烯二酸單鈉_反丁烯二酸二鈉混合物等)、葡糖酸鹽緩衝液(例如葡糖酸_葡糖酸鈉混合物、葡糖酸_氫氧化鈉混合物、葡糖酸_葡糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩衝液(例如草酸_草酸鈉混合物、草酸_氫氧化鈉混合物、草酸_草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩衝液(例如乳酸_乳酸鈉混合物、 乳酸_氫氧化鈉混合物、乳酸_乳酸鉀混合物等),和乙酸鹽緩衝液(例如乙酸_乙酸鈉混合物、乙酸_氫氧化鈉混合物等)。另外,可使用磷酸鹽緩衝液、組氨酸緩衝液和三甲胺鹽 (諸如 Tris)。可添加防腐劑以阻礙微生物生長,且可以0. 2% -1% (w/v)範圍內的量添加。適用於本發明的防腐劑包括苯酚、苯甲醇、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯化十八基二甲基苯甲基銨、滷化苯甲烴銨(benzalconium halide)(例如氯化苯甲烴銨、 溴化苯甲烴銨和碘化苯甲烴銨)、氯化六羥季銨和對羥基苯甲酸烷酯(諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯)、兒茶酚、間苯二酚、環己醇和3-戊醇。可添加有時稱作「穩定齊U」的等滲劑以確保本發明的液體組合物的等滲性,且所述等滲劑包括多元糖醇,例如三元或更高級糖醇,諸如甘油、赤藻糖醇(erythritol)、阿拉伯糖醇(arabitol)、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。穩定劑是指廣泛類別的賦形劑,其功能範圍可為膨化劑至溶解治療劑或幫助防止變性或粘附至容器壁的添加劑。典型穩定劑可為多元糖醇(上文所列舉);胺基酸,諸如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、穀氨酸、蘇氨酸等;有機糖或糖醇,諸如乳糖、海藻糖、水蘇糖、甘露糖醇、 山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油等,包括環糖醇(諸如肌醇 (inositol));聚乙二醇;胺基酸聚合物;含硫還原劑,諸如脲、穀胱甘肽、硫辛酸、硫代羥乙酸鈉、硫代甘油、α _單硫代甘油和硫代硫酸鈉;低分子量多肽(例如具有10個或10個以下殘基的肽);蛋白質,諸如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白;親水性聚合物,諸如聚乙烯吡咯烷酮;單糖,諸如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖;二糖,諸如乳糖、麥芽糖、 蔗糖;和三糖,諸如棉子糖;和多糖,諸如聚葡萄糖。穩定劑可以每重量份活性蛋白質0. 1至 10,000重量份的範圍存在。可添加非離子型界面活性劑或清潔劑(也稱作「溼潤劑」)來幫助溶解治療劑以及保護治療蛋白質避免攪動誘發的聚集,其也允許調配物暴露於受到應力的剪切表面而不引起蛋白質變性。適合的非離子型界面活性劑包括聚山梨醇酯(聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80等)、泊洛沙姆(polyoxamer)(泊洛沙姆184、泊洛沙姆188等)、普洛尼克多元醇 (Pluronic polyols)、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單醚(吐溫 -20、吐溫 -80等)。非離子型界面活性劑可以約0. 05mg/mL至約1. 0mg/mL,例如約0. 07mg/mL至約0. 2mg/mL的範圍存在。其它各種賦形劑包括膨化劑(例如澱粉)、螯合劑(例如EDTA)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、甲硫氨酸、維生素E)和共溶劑。其它適於本發明的抗TNF-α抗體的調配物揭示於美國專利申請案第2004/0033228Α1號中,其內容以全文引用的方式併入本文中。除本發明的抗TNF-α抗體外,本文的調配物還可含有組合治療劑。適合的組合治療劑的實例提供於下文第7. 10部分中。皮下投藥的給藥時程變化可為每6個月、每5個月、每4個月、每3個月、每2個月
一次、1個月一次至每兩周一次、每周一次或每日一次,視包括疾病類型、疾病嚴重度和患者對抗TNF-α抗體的敏感性在內的多種臨床因素而定。欲投予的本發明抗TNF-α抗體的劑量將根據特定抗體、自體免疫或發炎性疾病的類型、個體以及疾病的性質和嚴重度、個體的身體狀況、治療方案(例如,是否使用組合治療劑)和所選的投藥途徑而變化;適合的劑量可由所屬領域的技術人員輕易地確定。為治療和/或預防人類和動物的自體免疫或發炎性疾病,可使用任何適合的投藥途徑(諸如注射和所屬領域中已知用於基於抗體的臨床產品的其它投藥途徑)向患者(例如人類個體)投予治療或預防有效劑量(例如,使自體免疫或發炎性疾病得到抑制和/或減輕自體免疫或發炎性疾病症狀的劑量)的包含抗TNF-α抗體的醫藥組合物。所屬領域的技術人員應了解,本發明抗TNF-α抗體的最佳量和個別劑量的間隔將由所治療病狀的性質和程度、投藥的形式、途徑和部位以及所治療特定個體的年齡和狀況決定,且醫師將最終決定所用的適合劑量。此劑量可適當重複多次。若產生副作用,則可根據常規臨床實踐改變或降低給藥的量和/或頻率。7. 10組合治療下文描述可利用本發明的抗TNF-α抗體的組合方法。本發明的組合方法涉及向患者投予至少兩種藥劑,其中第一藥劑為本發明的抗TNF- α抗體,而其它藥劑為組合治療齊U。抗TNF-α抗體和組合治療劑可同時、相繼或分開投予。
本發明的組合治療方法可產生大於相加作用的作用,從而提供抗TNF-α抗體和組合治療劑兩者皆不以單獨使用時治療有效的量投予的治療效益。在本發明方法中,可共同(同時或依次)投予本發明的抗TNF-α抗體和組合治療齊U。如本文所用,若例如在同一次患者就診期間的同一天向患者投予本發明的抗TNF-α抗體和組合治療劑,則稱本發明抗TNF-α抗體和組合治療劑是依次投予。依次投藥可相隔1、 2、3、4、5、6、7或8小時進行。相比之下,若在不同日期向患者投予本發明的抗TNF-α抗體和組合治療劑,例如可以1天、2天或3天、1周、2周或一個月的時間間隔投予本發明的抗 TNF-α抗體與組合治療劑,則稱本發明的抗TNF-α抗體和組合治療劑是分開投予。在本發明的方法中,可在投予組合治療劑之前或之後投予本發明的抗TNF-α抗體。作為一非限制性實例,可在一段時間中同時投予本發明的抗TNF-α抗體和組合治療劑,隨後在第二段時間中交替投予本發明抗TNF-α抗體和組合治療劑。由於投予本發明抗TNF-α抗體和組合治療劑的潛在協同效應,所以所述藥劑可以在單獨投予所述藥劑中的一者或兩者時無治療有效性的量投予。在某些方面中,組合治療劑為抗風溼藥物、消炎劑、化學治療劑、放射治療劑、免疫抑制劑或細胞毒性藥物。抗風溼藥物包括(但不限於)金諾芬(auranofin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、 氯喹(chloroquine)、D-青黴胺(D-penicillamine)、硫代蘋果酸金鈉(gold sodium thiomalate)、羥基氯喹(hydroxychloroquine)、硫代苯酸金鈉(Myocrisin)和柳氮磺胺吡啶(sulfasalzine)、甲氨蝶呤。消炎劑包括(但不限於)地塞米松(dexamethasone)、頗得斯安(pentasa)、 美色拉嗪(mesalazine)、阿腸克(asacol)、磷酸可待因(codeine phosphate)、撲炎痛 (benory late)、芬布芬(fenbufen)、萘普生(naprosyn)、雙氯芬酸(diclofenac)、依託度酸 (etodolac)和吲哚美辛(indomethacin)、阿司匹靈(aspirin)和布洛芬(ibuprofen)。化學治療劑包括(但不限於)放射性分子、毒素(也稱作細胞毒素或細胞毒性齊U,其包括任何對細胞活力有害的藥劑)、含有化學治療化合物的藥劑和脂質體或其它囊泡。適合化學治療劑的實例包括(但不限於)1-去氫睪酮、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、放射菌素D、阿黴素(adriamycin)、阿地白介素(aldes 1 eukin)、烷化劑、別嘌醇鈉(allopurinol sodium)、六甲蜜胺(altretamine)、氨磷汀(amifostine)、 安美達錠(anastrozole)、安麴黴素(anthramycin,AMC))、抗有絲分裂劑、順二氯二胺鉬 (II) (DDP)順鉬)、二氨基二氯鉬、蒽環黴素、抗生素、抗代謝物、天冬醯胺酶、活BCG(膀胱內)、倍他米松磷酸鈉(betamethasone sodium phosphate)和乙酸倍他米松、比卡魯胺(bicalutamide)、硫酸博萊黴素、白消安、甲醯四氫葉酸鈣(calcium leucouorin),卡奇黴素、卡培他濱(capecitabine)、卡鉬(carboplatin)、洛莫司汀(CCNU)、卡莫司汀(BSNU)、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉曲濱(Cladribine)、秋水仙鹼、接合雌激素、環磷醯胺 (Cyclophosphamide)、環硫磷醯胺、阿糖胞苷、阿糖胞苷、細胞鬆弛素B、癌得星(Cytoxan)、 達卡巴嗪(Dacarbazine)、放線菌素D、放線菌素D(先前稱作放射菌素)、鹽酸道諾黴素(daunirubicin HCL)、梓樣酸道諾黴素(daunorucbicin citrate)、地尼白介素 (denileukin diftitox)、右雷佐生(Dexrazoxane)、二溴甘露醇、二羥基炭疽菌素二酮、多烯紫杉醇(Docetaxel)、甲磺酸多拉司瓊(dolasetron mesylate)、鹽酸小紅莓、屈大麻酚 (dronabinol)、大腸桿菌(E. coli) L-天冬醯胺酶、伏洛昔單抗(eolociximab)、吐根素、依泊丁 _ α (epoetin- α )、伊文氏桿菌L-天冬醯胺酶(Erwinia L-asparaginase)、酯化雌激 、 二酉享(estradiol) ^ii^WltTi^SI^ (estramustine phosphate sodium)、_UZi|£、 炔雌醇(ethinyl estradiol)、依替膦酸鹽(etidronate)、依託泊苷嗜橙菌因子(etoposide citrororum factor)、磷酸依託泊苷、非格司亭(filgrastim)、氟尿苷(floxuridine) > 氟康唑(fluconazole)、磷酸氟達拉濱(f ludarabine phosphate)、氟尿嘧啶、氟他胺 (flutamide)、醛葉酸、鹽酸吉西他濱(gemcitabine HCL)、糖皮質激素、乙酸戈舍瑞林 (goserelin acetate)、短桿菌肽D、鹽酸格拉司瓊(granisetron HCL)、羥基脲、鹽酸黃膽素 (idarubicin HCL)、異環磷醯胺(ifosfamide)、幹擾素 α-2b、鹽酸伊立替康(irinotecan HCL)、來曲唑(Ietrozole)、甲醯四氫葉酸鈣(leucovorin calcium)、乙酸亮丙瑞林 (leuprolide acetate)、鹽酸左旋咪唑(levamisole HCL)、利多卡因、洛莫司汀、類美登素、 鹽酸氮芥、乙酸甲輕助孕酮(medroxyprogesterone acetate)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、鹽酸美法侖、巰基嘌呤(mercaptipurine)、美司鈉(mesna)、甲氨蝶呤、甲基睪酮(methyltestosterone)、光神黴素、絲裂黴素C、米託坦(mitotane)、米託蒽醌、尼魯 (nilutamide) > ZigU^ ffili (octreotide acetate) > ik Ip ^J- W] (ondansetron HCL)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、帕米膦酸二鈉(pamidronate disodium)、噴司他丁(pentostatin)、鹽酸毛果芸香鹼(pilocarpine HCL)、吡利黴素(plimycin)、聚苯丙生20與卡莫司汀植入物(polifeprosan20 with carmustine implant)、卟吩姆鈉 (porfimer sodium)、普魯卡因、鹽酸丙卡巴胼(procarbazine HCL)、普萘洛爾、利妥昔單抗 (rituximab)、沙格司亭(sargramostim)、鏈佐黴素、他莫西芬(tamoxifen)、紫杉醇、替尼泊苷(teniposide)、鬼臼噻吩苷、睪內酯(testolactone)、四卡因、噻替派苯丁酸氮芥、硫鳥嘌呤、噻替派、鹽酸拓撲替康(topotecan HCL)、檸檬酸託瑞米芬(toremifene citrate)、 曲妥珠單抗(trastuzumab)、維甲酸(tretinoin)、戊柔比星(valrubicin)、硫酸長春鹼、硫酸長春新鹼和酒石酸長春瑞濱(vinorelbine tartrate)。 在本發明的其它方面中,組合治療劑為除本發明抗TNF-α抗體以外的TNF_a 拮抗劑。所述TNF-α拮抗劑的實例包括(但不限於)可溶性TNF-α受體;依那西普(ENBREL ;伊姆耐斯公司(Immimex))或其片段、衍生物或類似物;英利昔單抗 (REMICADE, ;森託科爾公司(Centacor))或其衍生物、類似物或抗原結合片段;IL-10, 其已知通過幹擾素-Y活化的巨噬細胞阻斷TNF-α產生(歐斯瓦爾德(Oswald)等人, 1992,美國國家科學院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)89 :8676_8680),TNFR-IgG(阿什肯納茲(Ashkenazi)等人,1991,美國國家科學院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)88 10535-10539);鼠類產品TBP-1 (雪蘭諾公司(Serono)/耶達公司(Yeda));疫苗CytoTAb (普羅薛瑞克斯公司(Protherics));反義分子104838 (伊希斯公司(ISIS));肽 RDP_58(桑斯塔特公司(SangStat));沙立度胺(thalidomide)(賽爾金公司(Celgene)); CDC-801(賽爾金公司(Celgene)) ;DPC-333 (杜邦公司(Dupont)) ;VX-745 (弗爾泰克斯公司(Vertex)) ;AGIX-4207 (阿什洛基因公司(AtheroGenics)) ;ITF-2357 (伊塔法瑪可公司(Italfarmaco)) ;NPI-13021-31 (耐瑞烏斯公司(Nereus)) ;SCI0-469 (賽奧斯公司(Scios)) ;TACE靶向劑(伊姆尼克斯公司(Immimix)/美國家用產品公司(AHP)); CLX-120500 (卡利克斯公司(Calyx));噻唑普瑞(Thiazolopyrim)(迪納法科斯公司(Dynavax));金諾芬(瑞得(Ridaura))(史密斯科林比徹姆醫藥公司(SmithKline Beecham Pharmaceuticals));查納克林(quinacrine) ( 二氣水合美中白克林(mepacrine dichlorohydrate));替尼達普(tenidap)(伊納布利克斯公司(Enablex));黑色素(大型生物學公司(Large Scale Biological));和抗p38 MAPK劑(烏利亞齊公司(Uriach))。適用於與抗TNF-α抗體組合的其它第二治療劑以及與所述第二治療劑的組合治療適用的特定適應症揭示於WO 2004/004633中,其以全文引用的方式併入本文中。7. 11治療方案本發明提供涉及投予本發明抗TNF-α抗體的治療方案。治療方案將視患者的年齡、體重 和疾病病況而變化。治療方案可持續2周至無限期。在特定實施例中,治療方案持續2周至6個月、3個月至5年、6個月至1年或2年、8個月至18個月等。治療方案可為非可變劑量方案或多可變劑量方案,例如如WO 2005/110452中所述,其以全文引用的方式併入本文中。對於下文所述的例示性給藥方案,抗TNF-α抗體可以用於皮下投藥的無菌無防腐劑溶液形式投予。在某些實施例中,藥物產品以內部封裝有ImL預填充玻璃注射器的一次性預填充注射筆形式,或以單一劑量ImL預填充玻璃注射器形式供應。對於成人患者,在某些實施例中,注射器傳遞0.8mL包含本發明抗TNF-α抗體的醫藥學上可接受的溶液。在一特定實施例中,除抗體外,溶液還含有4. 93mg氯化鈉、0. 69mg 二水合磷酸二氫鈉、1. 22mg 二水合磷酸氫二鈉、0. 24mg檸檬酸鈉、1. 04mg單水合檸檬酸、9. 6mg甘露糖醇、0. 8mg聚山梨醇酯80和注射用水(USP)以及必要時添加以調節pH值的氫氧化鈉。對於兒科患者,在某些實施例中, 注射器傳遞0.4mL包含本發明抗TNF-α抗體的醫藥學上可接受的溶液。在一特定實施例中,除抗體外,溶液還含有2. 47mg氯化鈉、0. 34mg 二水合磷酸二氫鈉、0. 6Img 二水合磷酸氫二鈉、0. 12mg檸檬酸鈉、0. 52mg單水合檸檬酸、4. Smg甘露糖醇、0. 4mg聚山梨醇酯80和注射用水(USP)以及必要時添加以調節pH值的氫氧化鈉。為治療類風溼性關節炎、牛皮癬性關節炎和僵直性脊椎炎,可每隔一周投予劑量為 10 至 50mg(例如 10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg 或 50mg)的本發明的抗 TNF-α抗體。在以本發明的抗TNF-α抗體治療期間,甲氨蝶呤、糖皮質激素、水楊酸鹽、非類固醇消炎藥(NSAID)、鎮痛劑或其它疾病改善性抗風溼藥(DMARD)可繼續使用。在類風溼性關節炎中,一些未伴隨服用甲氨蝶呤的患者可因將給藥頻率從每兩周一次增加至每周一次而獲得額外益處。為治療青少年特發性關節炎,本發明抗TNF-α抗體的投予劑量可視患者的體重而定。在某些非限制性實施例中,用於體重為15公斤(33磅)至30公斤(66磅)以下的兒科患者的劑量在每隔一周5至25mg的範圍內(例如5mg、7. 5mg、10mg、12. 5mg、15mg、20mg或 25mg)。在某些非限制性實施例中,用於體重高於30公斤(66磅)的兒科患者的劑量在每隔一周 10 至 50mg 的範圍內(例如 1011^、1511^、2011^、2511^、3011^、3511^、4011^、4511^或5011^)。
在以抗TNF-α抗體治療期間,甲氨蝶呤、糖皮質激素、水楊酸鹽、NSAID或鎮痛劑可繼續使
用。 為治療克羅恩氏病,在某些非限制性實施例中,可如下投予本發明的抗TNF-α抗體最初(在第1天或在第1天與第2天之間分次)給與40-280mg (例如40mg、80mg、100mg、 12011^、14011^、16011^、18011^、20011^、24011^或28011^)的劑量,繼而在 2 周后(第 15 天)給與初始劑量的約40%至60% (例如50%)的劑量。2周後(第29天),每隔一周投予初始劑量的20%至30% (例如25%)的維持劑量。在以抗TNF-α抗體治療期間,氨基水楊酸鹽、皮質類固醇和/或免疫調節劑(例如6-巰基嘌呤和硫唑嘌呤)可繼續使用。為治療斑塊狀牛皮癬,在某些非限制性實施例中,可如下投予本發明的抗TNF-a 抗體最初給與40-160mg (例如40mg、80mg、100mg、120mg、140mg或160mg)的劑量,繼而從初始劑量後1周開始每隔一周給與初始劑量的一半。7. 12診斷和醫藥試劑盒本發明涵蓋含有本發明的抗TNF-α抗體(包括抗體接合物)的醫藥試劑盒。醫藥試劑盒為包含本發明的抗TNF-α抗體(例如呈凍幹形式或呈水性溶液形式)和以下一者或一者以上的包裝 例如如上文第7. 10部分中所述的組合治療劑; 用於投予抗TNF-α抗體的裝置,例如注射筆、針和/或注射器;和 在抗體呈凍幹形式情況下用以再懸浮抗體的醫藥級水或緩衝液。在某些方面中,各單位劑量的抗TNF- α抗體分開封裝,且試劑盒可含有一個或一個以上單位劑量(例如2個單位劑量、3個單位劑量、4個單位劑量、5個單位劑量、8個單位劑量、10個單位劑量或10個以上單位劑量)。在一特定實施例中,一個或一個以上單位劑量各自容納於注射器或注射筆中。本文還涵蓋含有本發明的抗TNF-α抗體(包括抗體接合物)的診斷試劑盒。診斷試劑盒為包含本發明的抗TNF-α抗體(例如呈凍幹形式或呈水性溶液形式)和一種或一種以上適用於進行診斷分析的試劑的包裝。在抗TNF-α抗體經酶標記的情況下,試劑盒可包括酶所需要的底物和輔因子(例如提供可檢測發色團或螢光團的底物前驅物)。另外, 可包括其它添加劑,諸如穩定劑、緩衝液(例如阻斷緩衝液或溶解緩衝液)等。在某些實施例中,診斷試劑盒中所包括的抗TNF-α抗體固定於固體表面上,或試劑盒中包括可用於固定抗體的固體表面(例如載片)。各種試劑的相對量可廣泛變化以提供實質上使分析靈敏度最優化的試劑於溶液中的濃度。在一特定實施例中,抗體和一種或一種以上試劑可以包括賦形劑的乾燥粉末(通常為凍乾粉末)形式提供(個別地或組合),其在溶解時將提供具有適合濃度的試劑溶液。8.實例1 鑑別去免疫化的D2E7變異體8. 1材料和方法8. 1. 1 肽肽由米莫託普斯公司(Mimotopes)(澳大利亞阿德萊德市(Adelaide,Australia))使用多中心(multi-pin)格式合成。D2E7輕鏈和重鏈可變區的序列合成為具有12個胺基酸重疊的15聚體肽(圖1和表1),總共69個肽。將肽凍幹且以約l-2mg/mL 再懸浮於DMSO(西格瑪阿德裡奇公司(Sigma-Aldrich))中。儲備肽在_20°C下保持冷凍。8. 1. 2人類周邊血液單核細胞社區捐獻者白血球層產品購自斯坦福血液中心(Stanford Blood Center),加利弗利亞州帕洛阿爾託市(Palo Alto, CA)。用不含鈣或鎂的DPBS以1 1 (ν ν)稀釋白血球層物質。將經稀釋的白血球層物質(25-35mL)置於含12. 5mL FicollPaque-PLUS(GE 醫療公司(GE Healthcare))的50mL錐形離心管(薩斯迪德公司(Sarsted)或科斯塔公司(Costar))下層。在室溫下將樣品以900g離心30分鐘。從界面收集周邊血液單核細胞 (PBMC)。添加DPBS以使最終體積達到50mL且將 細胞以350g離心5分鐘。使細胞集結塊再懸浮於DPBS中且進行計數。8. 1. 3樹突狀細胞為分離樹突狀細胞,將含IO8個新鮮分離的PBMC的總體積為30mL的AIM V培養基(英傑公司(Irwitrogen))接種於T75培養瓶(科斯塔公司(Costar))中。將過量的 PBMC於90%胎牛血清(FCS)、10% DMSO中以5X IO7個細胞/毫升在-80°C下冷凍。T75培養瓶在37°C、5%C02下培育2小時。移除未附著的細胞,且用DPBS洗滌附著的單層。為區分樹突狀細胞與單核細胞,添加30mL含有800單位/毫升GM-CSF (R&D系統公司(R and D Systems))和 500 單位 / 毫升 IL-4(R&D 系統公司(R and D Systems))的 AIM V 培養基。 培育培養瓶5天。在第5天,添加IL-I α (恩杜金公司(Endogen))和TNF- α (恩杜金公司 (Endogen))達到50pg/mL和0. 2ng/ml。再培育培養瓶2天。在第7天,通過添加3mL含有 0. 5至1. Omg絲裂黴素C (西格瑪阿德裡奇公司(Sigma-Aldrich))的IOOmM EDTA,使EDTA 的最終濃度為IOmM並且絲裂黴素C的最終濃度為16. 5至33 μ g/mL來收集樹突狀細胞。或者,可以4,000拉德(rad)照射樹突狀細胞以進行固定。在37°C和5% CO2下再培育培養瓶1小時。收集樹突狀細胞,且在AIM V培養基中洗滌2-3次。8. 1.4細胞培養在第7天,在37°C水浴中使先前冷凍的自體性PBMC快速解凍。將細胞立即稀釋於 DPBS或AIM V培養基中且以350g離心5分鐘。通過使用磁性珠粒(Easy-S印⑶4+試劑盒, 幹細胞技術公司(Stem Cell Technologies))進行陰性選擇使CD4+細胞富集。在96孔圓底板(科斯塔9077)中以每孔每2 X IO4個樹突狀細胞2 X IO5個CD4+T細胞共培養自體性 ⑶4+T細胞與樹突狀細胞。添加約5 μ g/mL的肽。對照孔含有單獨0. 25 % ν vDMSO (西格瑪公司(Sigma))媒劑。陽性對照孔含有0. 25%的DMSO和1 μ g/mL的破傷風類毒素(tetanus toxoid)(李斯特生物公司(List Biologicals)或卡爾生物化學公司(CalBioChem))。培育培養物5天。在第5天,每孔添加0. 25 μ Ci的氚化胸苷(安瑪西亞公司(Amersham)或 GE醫療公司(GE Healthcare))。在第6天,使用Packard Filtermate細胞收集器將培養物收集至過濾墊(filtermat)上。使用Wallac MicroBeta 1450閃爍計數器(皮爾金埃爾墨公司(Perkin Elmer))進行閃爍計數。8. 1. 5數據分析通過計算來自6至12次重複實驗的個別結果的平均值來計算平均背景CPM值。計算4個陽性對照孔的CPM值的平均值。計算各肽的兩個重複孔或三個重複孔的平均值。通過用平均實驗CPM值除以平均對照值來計算陽性對照和肽孔的刺激指數值。為納入數據集中,需要破傷風類毒素陽性對照孔中刺激指數大於3. O。記錄產生2. 95或2. 95以上的刺激指數的任何肽的反應。使用來自一組81名捐獻者的周邊血液樣品對肽進行測試。彙編對所有肽的反應。對於所測試的各肽,計算以2. 95或2. 95以上的刺激指數反應的捐獻者組的百分比。另外,計算所有捐獻者的平均刺激指數。8. 1. 6HLA基因型分析使用市售Dynal RELI分型試劑盒(英傑公司(Invitrogen),英國(UK))確定各捐獻者的HLA DRBl和HLA DQBl等位基因。報導低嚴格度SSO結果。使用卡方分析 (Chi-squared analysis)(—個自由度)確定對任何指定肽的反應性的HLA相關性。在等位基因在反應者和非反應者群體兩者中皆存在時,報導相對風險值。 8. 1. 7D2E7變異型抗體的競爭ELISA通過在4°C下使板與濃度為1 μ g/mL的TNF- α的PBS溶液接觸過夜來使TNF- α 粘附於微孔板上。在含0. 吐溫20的PBS中洗滌板,且在Superblock(賽默科技公司 (Thermo Scientific),伊利諾州羅克福德市(Rockford,IL))中阻斷。將ELISA緩衝液 (例如含1 % BSA和0. 1 %吐溫20的PBS)中次飽和量的生物素化D2E7 (80ng/mL)與連續稀釋(濃度為2. 8 μ g/mL,8. 3 μ g/mL或25 μ g/mL)的未經標記D2E7 ( 「參照」抗體)或競爭性抗TNF-α抗體(「測試」抗體)抗體的混合物添加至各孔中,且在和緩振蕩下培育各板1小時。洗滌各板,將稀釋於ELISA緩衝液中的1 μ g/mL接合HRP的抗生蛋白鏈菌素添加至各孔中,且培育各板1小時。洗滌各板且通過添加TMB(百福斯實驗室有限公司(Biofx Laboratories Inc.),馬裡蘭州歐文斯密爾市(Owings Mills,MD))檢測結合的抗體。通過添加停止緩衝液(例如Bio FX停止試劑,百福斯實驗室有限公司(Biofx Laboratories Inc.),馬裡蘭州歐文斯密爾市(Owings Mills, MD))終止反應且使用微板讀取器(例如 VERSAmax,分子裝置公司(Molecular Devices),加利弗利亞州桑尼維爾市(Sunnyvale, CA))在650nm下測量吸光度。計算各抗體的IC5tl值。實驗進行3次,且平均結果表示為親本抗體結合結果的百分比。8. 1.8生物分析將3 X IO4個鼠類L929細胞塗鋪於平底96孔微量滴定板的個別孔中。在37°C下於含溼氣5% CO2培育箱中培育細胞過夜。次日,在25 μ L無血清培養基中製備抗TNF-α抗體的連續稀釋液(例如 0. 712 μ g/mL、0. 949 μ g/mLU. 27 μ g/mLU. 69 μ g/mL,2. 25 μ g/mL 或3μ g/mL),且添加至細胞中(以使得於150 μ L培養物中的最終濃度為119ng/mL、158ng/ mL、211ng/mL、282ng/mL、375ng/mL 或 500ng/mL)。在 37 °C、5 % CO2 下培育 2 小時後,添加 25μ L的240ng/mL TNF-α溶液至40ng/mL的最終濃度,且在37°C、5% CO2下再培育細胞 48小時。使用CellTiter-Blue活力分析(普洛麥格公司(Promega),威斯康辛州麥迪遜市 (Madison)),相較於對照板(其經TNF- α處理但與同型對照抗體或與親本抗體D2E7 —起培育)針對細胞毒性對各孔進行評分。測定IC5tl值且表示為親本D2E7結果的百分比。8. 1. 9通過BIAcore對D2E7變異體進行動力學分析使用BIAcore 2000和3000表面等離子體激元共振系統(BIAcore,GE醫療公司 (GE Healthcare),新澤西州皮斯卡塔韋市(Piscataway,NJ))測量抗TNF-α抗體的結合親和力。首先使用標準BIAcore胺偶合試劑(N-乙基-N' -二甲基氨基-丙基碳化二亞胺,EDC ;N-羥基丁二醯亞胺,NHS;和鹽酸乙醇胺,pH 8. 5)將多克隆山羊抗人類Fc抗體(傑克遜免疫研究公司(Jackson Immunoresearch))固定於生物傳感器表面,繼而在5微升/分鐘的低流動速率下將抗TNF- α抗體(D2E7和D2E7變異體)捕捉於平行表面上。保持低RL以達成25-60RU的低Rmax。參照表面上不進行抗體捕捉以用作陰性對照。隨後,將TNF-α以 80微升/分鐘的流動速率注射至所有流槽中歷時3分鐘以監測締合,繼而使HBS-P操作緩衝液(IOmM HEPES、150mM氯化鈉、0. 005% P-20,pH 7.4)流動30分鐘以監測解離相。在各循環,將TNF-α (R&D系統公司(R&D systems),明尼蘇達州明尼阿波利斯市(Minneapolis, MN))以處於OnM與128nM之間的範圍內且具有四倍增量的6種不同TNF濃度注射於表面上。在各循環結束時以100微升/分鐘的流動速率用1. 5% H3PO4以2次短暫的脈衝使表面再生。通過使用BIA評估程序對由不同濃度TNF- α收集的傳感器圖譜數據進行整體分析來計算各TNF-α與抗體對的結合動力學。在各分析中應用雙重參照以消除來自參照表面和僅有緩衝液的對照物(OnM TNF-α)的背景反應。通過使用一對一朗繆耳結合質量轉移模型(1 1 Langmuir binding with mass transfer model)同時擬合傳感器圖譜的締合和解離相獲得各結合對的解離常數(Kd)、締合速率常數(k。n)和解離速率常數(k。ff)。各組實驗單獨進行3次。8. 2 結果8. 2. 1鑑別D2E7VH和VL區中的CD4+T細胞抗原決定基通過分析一組81名捐獻者中對肽反應的百分比來鑑別⑶4+T細胞抗原決定基肽。 計算所測試的描述D2E7重鏈和輕鏈的所有肽的平均反應百分比和標準差。反應率大於或等於平均背景反應加上3個標準差視作潛在CD4+T細胞抗原決定基。對於D2E7輕鏈可變區,測試32個肽(圖2),其產生5. 09+3. 53%的平均背景反應百分比。高於背景3個標準差經測定為15.68%。在D2E7輕鏈肽數據集中一個處於位置8的肽呈現此反應程度,反應率為17. 28% (圖2)。另外,處於位置11的肽呈現12. 35%的極高反應率。對於D2E7重鏈可變區,測試37個肽(圖3)。平均背景反應百分比為2. 64+2. 04%。高於背景3個標準差為8. 78%。D2E7重鏈數據集中的一個肽(第20號)達到8. 64%的反應百分比(圖3)。計算數據集中所有肽的平均刺激指數。第8號輕鏈肽具有1. 97+0. 08s. e. m的高平均刺激指數。處於第11號位置的肽產生1.63+0. 32s. e.m的平均刺激指數。輕鏈數據集中的第27號肽具有1. 83的平均Si。此歸因於單個捐獻者對此肽具有29的極高刺激指數。 第20號重鏈肽具有1. 34+0. 05s. e. m的平均刺激指數值。所有這些值皆顯著高於兩個數據集中所有肽的平均刺激指數(所有68個重鏈和輕鏈肽的平均刺激指數為1. 02+0. 02)。這些數據指示在D2E7中存在兩個主要⑶4+T細胞抗原決定基區域(表2)。在VH 區中,發現抗原決定基位於涵蓋構架2與⑶R2的接合點的肽位置20處。在表2中,來源於 CDR的胺基酸加有下劃線。在輕鏈中,可含有一個以上CD4+T細胞抗原決定基的大區域包括第8號和第11號肽。這些肽涵蓋輕鏈的構架1、⑶Rl和構架2的部分。8. 2. 2對VL抗原決定基肽的反應的HLA相關性使用基於低嚴格度SSO PCR的方法測定肽數據集中所有81名捐獻者的第II類 HLA基因型。通過卡方分析測定特定HLA等位基因的存在與對2種VL肽的反應之間的相關性。測定所有HLA類型和2種肽的費氏P值(Fischer P value)和相對風險(表3)。任何HLA DR或DQ類型與對VL第8號肽(T22-Y36)的反應之間不存在顯著相關性。此結果表明所述肽能夠以廣泛不同的方式結合第II類HLA分子。CD4+T細胞回應於VL第11號肽(N31-K45)的增殖反應與HLA-DQ2的存在密切相關(ρ = 0. 003 ;相對風險=7. 7)。由於HLA-DR3與HLA-DQ2存在連鎖不平衡,所以對此肽的反應與HLA-DR3之間存在相關性, 但不具有統計顯著性(P = 0. 10 ;相對風險為3. 3)。除HLA-DQ2外,也發現HLA-DRl2與對 Ν31-Κ45的反應之間存在相關性(ρ = 0. 03 ;相對風險為5. 2)。由於總共存在極少的反應者,所以未測試HLA對VH第20號肽的反應。由於對2種VL肽的反應者為離散的,所以可推斷出所述2種VL肽代表兩個各別肽抗原決定基。因此,D2E7VH和VL區含有3個主要肽抗原決定基區域。8. 2. 3鑑別免疫原性降低的變異體丙氨酸掃描修飾D2E7輕鏈的21個胺基酸的序列涵蓋處於T22-Y36和N31-K45 處的抗原決定基。所選的21個胺基酸的序列為C23-K45。在各胺基酸處併入丙氨酸修飾 (表4)。用變異型肽測試一組99名捐獻者(圖4)。在肽組中產生親本21聚體4次。這些 4次重複用作對照以獲得分析再現性。平均親本肽反應為8.3%,其中30%。因此, 具有低於5. 8%的平均百分比的變異型肽可視作具有降低的反應率。降低最多的變異體為 C23A(2.02% )和P40A(3.03%,參見圖4)。位置23處的半胱氨酸為恆定的,且因此不為用於在整個蛋白質中進行修飾的良好候選者。由於脯氨酸殘基的獨特性質,所以對此殘基的修飾也不可能產生功能性變異型抗體。第三候選者為Y32A(4.04%)。另外,有多種變異體產生5. 05%的平均反應率。這些變化也可能有效,但需要針對降低的免疫原性和功能活性測試整個蛋白質分子。也測試一組基於D2E7VH抗原決定基肽序列的丙氨酸修飾肽(數據未展示)。未經修飾的親本肽在重複測試中的反應率極低。因此,不再研究此肽。抗原結合研究對D2E7抗體的CDR-Ll區進行綜合突變分析。基於聯合突變分析進行的抗原結合研究,鑑別出CDR-Ll區內不顯著降低抗體對TNF-α的親和力的一組候選胺基酸取代(表5)。使用BIAcore和ELISA分析若干含有候選⑶R-Ll取代的變異型抗體 (表6)。產生在CDR-Ll區內含有具有改變胺基酸序列的同時保持整體抗體分子的親和力的性質的胺基酸修飾的肽(表7)。測試單胺基酸修飾或雙重修飾形式的經修飾的抗原決定基肽。雙重修飾含有位置32處的穀氨醯胺或甘氨酸,或位置34處的絲氨酸或甘氨酸。測試總共79個肽,包括兩個親本21聚體肽合成物。用變異型肽測試總共102名捐獻者,且結果展示於圖5中。親本肽的平均反應百分比為10. 3+2.1%。關於低於親本3個標準差的反應率百分比,反應率將低於4%。親本肽的平均刺激指數為1.49+0. 15。關於達到低於親本反應3個標準差的刺激指數,其將為1. 03或低於1. 03。隨後對Y32G和Y32Q突變的親和力測量顯示此胺基酸修飾對抗原結合具有負面影響。因此,從分析中移除所有帶有此修飾的肽。選擇總共10個肽以供進一步研究。所有所選的肽具有低於4%的反應率。然而,肽中無一者顯示低於平均親本反應3個標準差的刺激指數(表8)。8. 2. 4經修飾D2E7變異型抗體的親和力和生物活性測試將10個變異型D2E7VL區構築體與未經修飾的VH區一起克隆至含人類IgG1的質體中,通過短暫轉染使其在293T/17細胞系中表達,且通過蛋白質A或蛋白質G親和力純化抗體。在競爭ELISA分析中測試經純化抗體與TNF-α的結合。所有10個變異體皆與未經修飾的D2E7抗體競爭結合TNF- α。然而,呈現一系列親和力,自Q27R+A34S變異體的大致相等親和力至自N31S+A34S變異體的親和力降至1/10 (圖6)。進行TNF-α毒性生物分析。將L292細胞接種於96孔板中,且將恆定濃度的 TNF-α添加至培養基中。將變異型抗體滴定至培養基中。測定各變異體的EC5tl值(表9)。 類似地,變異體Q27R+A34S呈現大致等於親本D2E7抗體的EC5tl值。最後,通過BIAcore分析測定抗體對TNF- α的親和力(表10)。在所測試的10個變異體中,Q27H+A34S、Q27R+A34S和G28S+A34S變異體皆呈現類似於D2E7的締合和解離速率。變異體的最終親和力值在130pM範圍內,相比而言,D2E7在這些實驗中的實測親和力為 114pM。9.實例2 鑑別對TNF-α的親和力增加的D2E7變異體對D2E7抗體進行綜合突變分析以鑑別相較於D2E7對TNF- α的親和力增加的突變體。通過ELISA和BIAcore分析相較於D2E7,候選突變體對TNF- α的親和力增加以確定候選突變體特徵。9.1材料和方法9. 1. 2 競爭 ELISA如第8. 1.7部分中所述進行競爭ELISA分析。重複ELISA兩次且平均IC5tl改良倍數表示為WT/x。9. 1. 2BIAcore如第8. 1. 9部分中所述進行BIAcore分析。9. 2 結果相對於D2E7而言,Kd得到改良(如由BIAcore所測量)、在ELISA中競爭能力得到改良,或兩者皆得到改良的D2E7的CDR變異體展示於表12和25中。10.特定實施例、參考文獻的引用本申請案中所引用的所有出版物、專利、專利申請案和其它文獻出於所有目的以全文引用的方式併入本文中,其程度如同各個別出版物、專利、專利申請案或其它文獻個別地指示為出於所有目的以引用的方式併入本文中一般。雖然已說明和描述了各種特定實施例,但應了解可在不背離本發明的精神和範圍下進行各種改變。
權利要求
1.一種抗TNF-α抗體或抗體的抗TNF-α結合片段,其包含具有對應於SEQ ID NO 5 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 6 (CDR-H2)、SEQ ID NO 7 (CDR-H3)、SEQ ID NO 8 (CDR-Ll)、SEQ ID NO :9(CDR-L2)和SEQ ID NO :10(CDR_H3)的胺基酸序列的6個互補決定區(「CDR」),所述 ⑶R序列為抗體D2E7的所述⑶R序列,其中所述⑶R包括至少一個選自以下的取代⑶R-L2 中的 S3K、CDR-L2 中的 S3R、CDR-L2 中的 T4H、CDR_L2 中的 T4Q、CDR_L2 中的 T4F、CDR_L2 中的 T4W、CDR-L2 中的 T4Y、CDR-L2 中的 L5R、CDR_L2 中的 L5K、CDR_L2 中的 Q6R、CDR-Hl 中的 Y2H、⑶R-Hl中的A3G和⑶R-H2中的T3N,和任選一個或一個以上選自表11和13到25中一者或一者以上的其它突變或突變組合,其中所述6個CDR相較於所述抗體D2E7的CDR序列總共具有至多17個胺基酸取代。
2.一種抗TNF-α抗體或抗體的抗TNF-α結合片段,其包含具有對應於SEQ ID NO 5 (CDR-Hl)、SEQ ID NO :6(CDR_H2)、SEQ ID NO :7(CDR_H3)、SEQ ID NO 8 (CDR-Ll)、SEQ ID N0:9(CDR-L2)和SEQ ID NO : 10 (CDR-H3)的胺基酸序列的6個CDR,所述CDR序列為抗體D2E7的所述⑶R序列,其中所述⑶R包括至少一個選自以下的取代⑶R-L2中的T4F、 CDR-L2 中的 T4W、CDR-L2 中的 T4Y、CDR-L2 中的 L5R、CDR-L2 中的 L5K、CDR-L2 中的 Q6R、 ⑶R-Hl中的Y2HWDR-Hl中的A3G和⑶R-H2中的T3N,和任選一個或一個以上選自表11和 13到25中一者或一者以上的其它突變或突變組合,其中所述6個CDR相較於所述抗體D2E7 的CDR序列總共具有至多17個胺基酸取代。
3.一種抗TNF-α抗體或抗體的抗TNF-α結合片段,其包含具有對應於SEQ ID Ν0 5 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 6 (CDR-H2)、SEQ ID NO :7(CDR_H3)、SEQ ID NO 8 (CDR-Ll)、SEQ ID N0:9(CDR-L2)和SEQ ID NO 10 (CDR-H3)的胺基酸序列的6個CDR,所述CDR序列為抗體D2E7的所述⑶R序列,其中所述⑶R包括至少一個選自以下的取代⑶R-L2中的T4F、 CDR-L2 中的 T4W、CDR-L2 中的 T4Y、CDR-L2 中的 L5R、CDR-L2 中的 L5K、CDR-L2 中的 Q6R、 ⑶R-Hl中的Y2HWDR-Hl中的A3G和⑶R-H2中的T3N,和任選一個或一個以上選自表11禾口 13到18中一者或一者以上的其它突變或突變組合,其中所述6個CDR相較於所述抗體D2E7 的CDR序列總共具有至多17個胺基酸取代。
4.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其中所述6個⑶R相較於所述抗體D2E7的⑶R序列總共具有至多16個、至多15個、至多14 個、至多13個、至多12個、至多11個、至多10個、至多9個、至多8個、至多7個或至多6 個胺基酸取代。
5.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其中任何個別CDR相較於所述抗體D2E7的相應CDR序列具有不超過3個胺基酸取代。
6.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其中任何個別CDR相較於所述抗體D2E7的相應CDR序列具有不超過2個胺基酸取代。
7.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其相較於D2E7的CDR-L2在CDR-L2中具有所述取代S3K。
8.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其相較於D2E7的CDR-L2在CDR-L2中具有所述取代S3R。
9.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其相較於D2E7的CDR-L2在CDR-L2中具有所述取代Τ4Η。
10.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其相較於D2E7的CDR-L2在CDR-L2中具有所述取代T4Q。
11.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其相較於D2E7的CDR-L2在CDR-L2中具有所述取代T4F。
12.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其相較於D2E7的CDR-L2在CDR-L2中具有所述取代T4W。
13.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其相較於D2E7的CDR-L2在CDR-L2中具有所述取代Τ4Υ。
14.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其相較於D2E7的CDR-L2在CDR-L2中具有所述取代L5R。
15.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其相較於D2E7的CDR-L2在CDR-L2中具有所述取代L5K。
16.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其相較於D2E7的CDR-L2在CDR-L2中具有所述取代Q6R。
17.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其相較於D2E7的⑶R-Hl在⑶R-Hl中具有所述取代DIG。
18.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其相較於D2E7的⑶R-Hl在⑶R-Hl中具有所述取代Υ2Η。
19.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其相較於D2E7的⑶R-Hl在⑶R-Hl中具有所述取代A3G。
20.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其相較於D2E7的CDR-H2在CDR-H2中具有所述取代Τ3Ν。
21.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其分別為單克隆抗體或單克隆抗體的抗TNF-α結合片段。
22.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其分別為人類或人類化抗體,或人類或人類化抗體的抗TNF- α結合片段。
23.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其為 IgG0
24.根據權利要求23所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其為IgG115
25.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其在Fc區中包括一個或一個以上增強ADCC活性的突變。
26.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其未經巖藻糖基化。
27.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其在所述Fc區中包括一個或一個以上增強與Fc γ R的結合的突變。
28.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其在所述Fc區中包括一個或一個以上降低ADCC活性的突變。
29.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其除所述一個或一個以上突變以外具有對應於SEQ ID NO 2的Vh序列和對應於SEQ ID NO 4的Vl序列。
30.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其親和力為具有對應於SEQ ID NO :2 序列和對應於SEQ ID NO :4的八序列的抗體親和力的1. 1倍到4倍。
31.根據權利要求30所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其親和力為具有對應於SEQ ID NO 2的Vh序列和對應於SEQ ID NO 4的\序列的抗體的親和力的1. 5倍到 3倍。
32.根據權利要求30或權利要求31所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其中所述親和力為競爭ELISA的測量值、通過BIAcore分析的Kd的測量值,或兩者。
33.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其經純化。
34.根據權利要求33所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其純化到至少85%、 至少90%、至少95%或至少98%均質度。
35.一種抗TNF-α抗體或抗體的抗TNF-α結合片段,其包含具有對應於SEQ ID NO: 5 (CDR-Hl)、SEQ ID NO :6(CDR_H2)、SEQ ID NO :7(CDR_H3)、SEQ ID NO 8 (CDR-Ll)、SEQ ID NO :9(CDR-L2)和SEQ ID NO : 10 (CDR-H3)的胺基酸序列的6個CDR,所述CDR序列為抗體D2E7的所述⑶R序列,其中所述⑶R包括選自以下的取代或取代組合⑶R-Ll中的 R7Q、A11S、R7Q+A11S、N8T、N8T+A11S、I6T、A11G、I6T+A11G、Q4G、Q4G+A11S、Q4G+A11G、Q4H、 Q4H+A11S、Q4R、Q4R+A11S、G5S+A11S、N8S+A11S、I6T+A11S、N8T+A11G,和任選一個或一個以上選自表12到25中一者或一者以上的其它突變或突變組合,其中所述6個CDR相較於所述抗體D2E7的CDR序列總共具有至多17個胺基酸取代。
36.一種抗TNF-α抗體或抗體的抗TNF-α結合片段,其包含具有對應於SEQ ID Ν0: 5 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 6 (CDR-H2)、SEQ ID NO 7 (CDR-H3)、SEQ ID NO 8 (CDR-Ll)、SEQ ID NO :9(CDR-L2)和SEQ ID NO 10 (CDR-H3)的胺基酸序列的6個CDR,所述CDR序列為抗體D2E7的所述⑶R序列,其中所述⑶R包括選自以下的取代或取代組合⑶R-Ll中的 R7Q、A11S、R7Q+A11S、N8T、N8T+A11S、I6T、A11G、I6T+A11G、Q4G、Q4G+A11S、Q4G+A11G、Q4H、 Q4H+A11S、Q4R、Q4R+A11S、G5S+A11S、N8S+A11S、I6T+A11S、N8T+A11G,和任選一個或一個以上選自表12到18中一者或一者以上的其它突變或突變組合,其中所述6個CDR相較於所述抗體D2E7的CDR序列總共具有至多17個胺基酸取代。
37.根據權利要求35或36所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其中所述6個 ⑶R相較於所述抗體D2E7的⑶R序列總共具有至多16個、至多15個、至多14個、至多13 個、至多12個、至多11個、至多10個、至多9個、至多8個、至多7個或至多6個胺基酸取代。
38.根據權利要求35或權利要求36所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其中任何個別CDR相較於所述抗體D2E7的相應CDR序列具有不超過3個胺基酸取代。
39.根據權利要求35或權利要求36所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其中任何個別CDR相較於所述抗體D2E7的相應CDR序列具有不超過2個胺基酸取代。
40.根據權利要求35到39中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其中⑶R-Ll相較於D2E7的⑶R-Ll具有所述取代Q4R+A11S。
41.根據權利要求35到39中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其中CDR-Ll相較於D2E7的CDR-Ll具有所述取代Q4G+A11G。
42.根據權利要求35到39中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其中⑶R-Ll相較於D2E7的⑶R-Ll具有所述取代Q4H+A11S。
43.根據權利要求35到39中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其中CDR-Ll相較於D2E7的CDR-Ll具有所述取代G5S+A11S。
44.根據權利要求35到43中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF- α結合片段,其分別為單克隆抗體或單克隆抗體的抗TNF-α結合片段。
45.根據權利要求35到44中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF- α結合片段,其分別為人類或人類化抗體,或人類化或人類化抗體的抗TNF-α結合片段。
46.根據權利要求35到45中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF- α結合片段,其為IgG。
47.根據權利要求46所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其為IgG115
48.根據權利要求35到47中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF- α結合片段,其在Fc區中包括一個或一個以上增強ADCC活性的突變。
49.根據權利要求35到48中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF- α結合片段,其未經巖藻糖基化。
50.根據權利要求35到49中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF- α結合片段,其在所述Fc區中包括一個或一個以上增強與Fc γ R的結合的突變。
51.根據權利要求35到50中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其在所述Fc區中包括一個或一個以上降低ADCC活性的突變。
52.根據權利要求35到51中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其除所述一個或一個以上突變以外具有對應於SEQ ID NO :2序列和對應於SEQ ID NO :4的Vl序列。
53.根據權利要求35到52中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其對TNF-α的親和力為具有對應於SEQ ID NO :2的Vh序列和對應於SEQ ID NO :4的 Vl序列的抗體的親和力的0. 75倍到1. 5倍。
54.根據權利要求35到53中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其對TNF-α的親和力為具有對應於SEQ ID NO :2的Vh序列和對應於SEQ ID NO :4的 Vl序列的抗體的親和力的1. 1倍到3倍。
55.根據權利要求53或權利要求54所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其中所述親和力為競爭ELISA的測量值、通過BIAcore分析的Kd的測量值,或兩者。
56.根據權利要求35到55中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其經純化。
57.根據權利要求56所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其純化到至少85%、 至少90%、至少95%或至少98%均質度。
58.一種抗TNF-α抗體或抗體的抗TNF-α結合片段,其包含具有對應於SEQ ID NO: 5 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 6 (CDR-H2)、SEQ ID NO 7 (CDR-H3)、SEQ ID NO 8 (CDR-Ll)、SEQ ID NO :9(CDR-L2)和SEQ ID NO 10 (CDR-H3)的胺基酸序列的6個⑶R,所述CDR序列為抗體D2E7的所述⑶R序列,其中所述⑶R包括⑶R-Ll中的取代G5S+A11S,以及任選一個或一個以上選自表11到25中一者或一者以上的其它突變或突變組合,其中所述6個CDR相較於所述抗體D2E7的CDR序列總共具有至多17個胺基酸取代。
59.一種抗TNF-α抗體或抗體的抗TNF-α結合片段,其包含具有對應於SEQ ID NO: 5 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 6 (CDR-H2)、SEQ ID NO 7 (CDR-H3)、SEQ ID NO 8 (CDR-Ll)、SEQ ID NO 9 (CDR-L2)和SEQ ID NO 10 (CDR-H3)的胺基酸序列的6個CDR,所述CDR序列為抗體 D2E7的所述⑶R序列,其中所述⑶R包括⑶R-Ll中的取代G5S+A11G,以及任選一個或一個以上選自表11到25中一者或一者以上的其它突變或突變組合,其中所述6個CDR相較於所述抗體D2E7的CDR序列總共具有至多17個胺基酸取代。
60.一種抗TNF-α抗體或抗體的抗TNF-α結合片段,其包含具有對應於SEQ ID NO: 5 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 6 (CDR-H2)、SEQ ID NO 7 (CDR-H3)、SEQ ID NO 8 (CDR-Ll)、SEQ ID NO :9(CDR-L2)和SEQ ID NO 10 (CDR-H3)的胺基酸序列的6個⑶R,所述CDR序列為抗體 D2E7的所述CDR序列,其中所述CDR包括至少一個選自CDR-L2中的S3N、CDR_L2中的T4V、 ⑶R-L2中的Q6K和⑶R-Hl中的DlG的取代,以及至少一個選自表11、12和25的取代或取代組合,以及任選一個或一個以上選自表11到25中一者或一者以上的其它突變或突變組合,其中所述6個CDR相較於所述抗體D2E7的CDR序列總共具有至多17個胺基酸取代。
61.根據權利要求60所述的抗TNF-α抗體或抗體的抗TNF-α結合片段,其中所述 CDR包括至少一個選自CDR-L2中的S3N、CDR_L2中的T4V、CDR_L2中的Q6K禾Π CDR-Hl中的 DlG的取代,以及至少一個選自以下的取代CDR_L2中的S3K、CDR-L2中的S3R、CDR-L2中的 T4H、CDR-L2 中的 T4Q、CDR_L2 中的 T4F、CDR_L2 中的 T4W、CDR_L2 中的 T4Y、CDR_L2 中的 L5R、CDR-L2 中的 L5K、CDR-L2 中的 Q6R、CDR-Hl 中的 Y2H、CDR-Hl 中的 A3G 和 CDR-H2 中的 T3N,其中所述6個CDR相較於所述抗體D2E7的CDR序列總共具有至多17個胺基酸取代。
62.一種抗TNF-α抗體或抗體的抗TNF-α結合片段,其包含具有對應於SEQ ID NO: 5 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 6 (CDR-H2)、SEQ ID NO 7 (CDR-H3)、SEQ ID NO 8 (CDR-Ll)、SEQ ID NO :9(CDR-L2)和SEQ ID NO :10(CDR_H3)的胺基酸序列的6個互補決定區(「CDR」),所述 ⑶R序列為抗體D2E7的所述⑶R序列,其中所述⑶R-L2⑶R包括至少一個選自以下的取代組合a.S3K、T4H、L5R 和 Q6R ;b.S3K、T4Q、L5R 和 Q6K ;c.S3K、T4Y和 L5K ;d.S3K 和 T4Y ;e.S3N、T4V、L5R 和 Q6K ;f.S3N、T4W、L5R 和 Q6R ;g.S3R、T4F 和 L5R ;h.S3R、T4F、L5R 禾口 Q6R ;i.S3R、T4H 和 Q6K ;j. S3R、T4W、L5K 和 Q6R ;k. T4H、L5K 和 Q6K ;.1. T4H、L5K 和 Q6R ;m. T4W、L5R 禾口 Q6R ;禾口η. Τ4Υ 和 L5R,任選其中所述抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段包含一個或一個以上選自表11到 24中一者或一者以上的其它突變或突變組合,其中所述6個CDR相較於所述抗體D2E7的 CDR序列總共具有至多17個胺基酸取代。
63.根據權利要求58到62中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF- α結合片段,其中所述6個⑶R相較於所述抗體D2E7的⑶R序列總共具有至多16個、至多15個、至多14個、至多13個、至多12個、至多11個、至多10個、至多9個、至多8個、至多7個或至多6個胺基酸取代。
64.根據權利要求58到63中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF- α結合片段,其中任何個別CDR相較於所述抗體D2E7的相應CDR序列具有不超過3個胺基酸取代。
65.根據權利要求58到64中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其中任何個別CDR相較於所述抗體D2E7的相應CDR序列具有不超過2個胺基酸取代。
66.根據權利要求58到65中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF- α結合片段,其分別為人類或人類化抗體,或人類化或人類化抗體的抗TNF-α結合片段。
67.根據權利要求58到66中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF- α結合片段,其除所述一個或一個以上突變以外具有對應於SEQ ID NO :2序列和對應於SEQ ID NO :4的Vl序列。
68.根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其為雙特異性抗體或雙特異性抗體的TNF-α結合片段。
69.根據權利要求68所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其中所述雙特異性抗體對TNF-α和另一促發炎性細胞因子具有特異性。
70.根據權利要求69所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段,其中所述促發炎性細胞因子為淋巴毒素、幹擾素-Y或白介素-1。
71.—種醫藥組合物,其包含根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段和醫藥學上可接受的載劑。
72.一種核酸,其包含編碼根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段的核苷酸序列。
73.—種載體,其包含根據權利要求72所述的核酸。
74.一種原核宿主細胞,其經根據權利要求73所述的載體轉化。
75.一種真核宿主細胞,其經根據權利要求73所述的載體轉化。
76.一種真核宿主細胞,其經工程改造以表達根據權利要求72所述的核苷酸序列。
77.根據權利要求76所述的真核宿主細胞,其為哺乳動物宿主細胞。
78.一種製備抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段的方法,其包含(a)培養根據權利要求76或權利要求77所述的真核宿主細胞,和(b)回收所述抗TNF-α抗體或抗TNF-α 結合片段抗體。
79.一種治療免疫病症的方法,其包含向有需要的人類患者投予治療有效量的根據權利要求1到70中任一權利要求所述的抗TNF-α抗體或抗TNF-α結合片段或根據權利要求71所述的醫藥組合物。
80.根據權利要求79所述的方法,其中所述免疫病症為全身性紅斑狼瘡、類風溼性關節炎、甲狀腺功能症(thyroidosis)、移植物抗宿主疾病、硬皮病、糖尿病、格雷夫氏病 (Grave' s disease)、類肉瘤病、慢性發炎性腸病、潰瘍性結腸炎或克羅恩氏病(Crohn' s disease)0
全文摘要
本發明涉及針對腫瘤壞死因子α(「TNF-α」)的抗體,和所述抗體例如用於治療與TNF-α的活性和/或過量產生相關的疾病的用途。
文檔編號C07K16/24GK102439040SQ201080020704
公開日2012年5月2日 申請日期2010年4月16日 優先權日2009年4月16日
發明者大衛·B·鮑爾斯, 羅伯特·B·迪布裡吉, 菲奧娜·A·阿爾丹, 赤松謙子 申請人:亞培生物醫療股份有限公司