肽序列和組合物的製作方法

2023-07-18 16:21:16 1

專利名稱：肽序列和組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及肽序列，含有這些肽序列的組合物，特別是含有這些序列和組合物的流感疫苗，以及這些序列的用途。具體的，本發明涉及疫苗，其能夠防護抵抗多種流感病毒株，包括跨越不同物種的現有病毒(例如防護抵抗人類流感和禽流感)以及從現有病毒突變的未來病毒(例如容易在人與人之間傳播的禽流感的未來突變形式，其可能引起大流行性流感)。
背景技術：
對疾病的防禦對於所有動物的生存而言是至關重要的，為該目的所採用的防禦機制是動物的免疫系統。因此，對免疫系統的理解是開發用於人類和類似動物的新型和更完善治療的關鍵。免疫系統的運轉機制已經被研究了許多年。該系統由許多細胞類型和多種分子構成，這使得該系統非常複雜。即使多年研究之後，免疫系統組分的整個範圍以及它們相互之間的作用仍未被完全理解。許多年之前，認識到從特定疾病恢復的人將來可能會獲得某些防護抵抗該疾病，但不會抵抗他還未感染過的疾病。那時，免疫系統的這種基本方面被解釋為一旦發生暴露給某些病原體，則免疫系統會獲得某些針對這些病原體的一類「記憶」，該記憶對於某些疾病是特異的。逐漸地，知道暴露到病原體的不大有害變異體會引起針對更有害變異體的防護(例如暴露到牛痘以防護抵抗天花，或者暴露到滅活的炭疽以保護抵抗活的炭疽)。因此，出現了接種疫苗抵抗疾病的觀念。目前已知免疫系統具有至少兩個分支先天性免疫和適應性免疫。在病原體進入免疫系統之前，先天性系統是具有完全功能的，而在病原體進入免疫系統之後，適應性系統才被打開。接著，其產生對病原體的特異性攻擊。先天性系統包括許多組分，包括吞噬細胞如巨噬細胞，其(如名字所暗示的)會「吃掉」或者吞掉外源物體如病原體。通常，但不是排他的，本發明涉及適應性免疫系統，除非特別以其他方式說明，否則本文中的「免疫系統」是指適應性免疫系統。為了更充分地理解免疫系統如何發揮功能，其每個個別組分的作用必須要被仔細考慮。關於適應性免疫系統，眾所周知針對病原體的免疫性是由淋巴細胞的作用提供的，淋巴細胞構成了免疫系統中最常見的細胞類型。存在兩種類型的淋巴細胞B淋巴細胞和T淋巴細胞。通常分別被稱作B細胞和T細胞。B細胞具有發育成漿細胞的能力，所述漿細胞製造抗體。抗體是動物免疫系統非常重要的組分。它們是響應所入侵病原體的某些識別標誌部分(病原體的抗原一抗原在這裡被定義為免疫系統所識別的任何外源物質)而產生的，並且對於該病原體通常是特異性的。然而，如果兩種病原體非常類似，或者至少含有相同的抗原，則針對一種病原體所產生的抗體仍然能夠針對另一種病原體有效(它們可以「交叉反應」)。這解釋了為什麼接種牛痘能夠防護抵抗天花。重要的是意識到抗體僅「識別」病原體的小部分抗原分子，而不是整個病原體。這些部分被稱作抗原決定簇。T細胞不具有抗體或者不產生抗體。而是，它們通過被稱作TCR (T細胞受體)的特化受體來識別與主要組織相容性複合體(MHC)(或者對於人，是人白細胞抗原(HLA))形成複合物的外源抗原的片段(即抗原決定簇)。T細胞自身可以分成多種亞型，其可以具有調節功能或者效應功能。效應細胞參與「實現」清除外源物質。例如，細胞毒性T細胞(CTL)是效應細胞，其能夠殺死被感染的細胞，以及其他多餘的成分例如腫瘤細胞。另一方面，調節性T細胞在輔助效應T細胞和B細胞變得更有效方面發揮作用。由於該功能，這些調節性T細胞通常被命名為「輔助性」T細胞。另一種被命名為「阻抑性」T細胞的調節性T細胞被認為抑制免疫應答，但這些T細胞沒有被充分了解。調節性T細胞也可以與先天性免疫系
統的組分相互作用以加強它們的活性。在正常的健康個體中，免疫系統的淋巴細胞直到免疫應答被觸發前均保持無活性的「靜息」狀態。在需要免疫應答時，淋巴細胞變為被激活、增殖並開始發揮它們被指派的功能。例如，在表面上展示用於識別與MHC分子形成複合物的入侵病原體抗原決定簇的TCR的任何靜息T細胞被激活、增殖(這被命名為克隆擴充)，所得到的後代開始活躍地發揮它們預定的效應功能，所述功能是抗擊入侵的生物體所需的。當免疫應答結束時(B卩，病原體和/或被感染的細胞已經被清除)，則淋巴細胞再次恢復到靜息狀態。然而，該靜息狀態不等同於開始的無活性靜息狀態。以後，響應相同或緊密相關病原體的感染，被激活過但靜息的淋巴細胞，能夠被快速地募集並誘導增殖。在再次遇到入侵的病原體之後，被激活的靜息淋巴細胞這種提供更快和更強應答的能力，有效地為免疫系統提供了 「記憶」。免疫系統記憶的開發是所有長期免疫預防性藥物(例如疫苗)的基礎，並依然是非常長期免疫治療性藥物開發的目標。為了使細胞在複雜的動物系統內發揮功能，細胞需要在其表面上具有「受體」。這些受體能夠「識別」特異性的物質，所述特異性的物質控制各種基本過程，例如激活、增殖和附著到其他細胞或底物上。例如，在免疫系統的情況中，T細胞和B細胞上的受體使它們不僅識別抗原，而且相互作用，從而調節它們的活性。沒有這些受體，這些細胞會缺乏基本的通訊手段，並可能無法有效協調地發揮作用，而這對於多細胞生物體的免疫系統是必要的。為了能夠特異性地識別和處理環境中存在的大量病原體，免疫系統在淋巴細胞上發展出兩種類型的高度可變的抗原受體=B細胞中的抗體以及T細胞中的T細胞受體或TCR。在身體中存在大量不同的可能抗原受體，以使免疫系統能夠識別多種多樣的入侵病原體。事實上，個體中存在大約IO12種不同的B細胞和T細胞受體。每種單獨的B細胞僅有一種類型的受體，以便處理特定的病原體，具有針對那種病原體的抗原的「最佳適合」受體的B細胞必須被選擇。該過程被稱作「克隆選擇」。理論上，根據病原體所表現的抗原/抗原決定簇的數目以及為這些抗原/抗原決定簇所選擇的多種B細胞的特異性，可以僅一種克隆進行應答(單克隆應答)或者幾個(寡克隆應答)或許多(多克隆應答)。在能夠被B細胞和T細胞識別的抗原類型之間存在重大的差別。根據目前已知，只有B淋巴細胞表面上的受體(即抗體)能夠直接識別抗原如病毒和細菌上的蛋白質，或者溶解在體液中的外源分子。在B細胞被激活並發育成漿細胞時，B細胞也能夠產生可溶形式的抗體。這些抗體也被命名為免疫球蛋白(縮寫為Ig)。另一方面，T細胞受體僅識別身體細胞表面上的短肽，也被稱作T細胞抗原決定簇。這些T細胞抗原決定簇是通過較大蛋白質的降解所產生的，所述蛋白質是自身的(即天然存在的體蛋白質)或非自身的(即來自感染身體的外源生物體)。只有來自外源蛋白質的那些，即抗原通常能夠誘導體內的免疫應答。一旦產生，這些抗原決定簇會結合到特定類型的分子MHC (主要組織相容性複合體)上，接著所得到的複合物被呈遞在細胞表面上用於結合T細胞受體。需要理清楚的是，由於免疫應答的破壞性特徵，該應答不得不僅針對外源病原體發揮作用，而不能針對身體自身細胞或蛋白質發揮作用。因此，免疫系統需要區分「自身」和「非自身」。已經提出，儘管產生針對自身反應的淋巴細胞克隆，但它們在能夠發生任何反應 之前就被除去了。該過程被命名為「克隆缺失」。還提出，任何自身反應的淋巴細胞可以被保留但僅處於「關閉」狀態。這種機制被命名為「克隆無反應性」。無論考慮何種過程，仍不清楚精確的基本機制是什麼，使得淋巴組織如胸腺從僅針對非自身反應的T淋巴細胞群中鑑定針對自身反應的個別T細胞克隆。目前本發明人已經更充分地研究了自身/非自身區分的機制，這導致了本發明的開發。目前，本發明人已經建立了一種預測物質如肽的免疫原性的方法，其能夠在大的蛋白質內實現更快地鑑定免疫原性肽序列。許多年來，已知主要組織相容性複合體(MHC)在動物的免疫系統中發揮了關鍵作用。正如上面已經討論的，MHC分子使T細胞能夠識別抗原。存在三種主要類型的MHC分子，I類、II類和III類。I類和II類MHC分子是存在於細胞表面上的糖蛋白，而III類則通常是細胞內存在的可溶分子。存在大量的不同類型的MHC分子。例如，在人類中(在人類中MHC被命名為HLA，人白細胞抗原)，存在數百種不同的編碼MHC分子的等位基因，這意味著在人群中，存在許多不同類型的HLA。通常，根據不同的慣例對不同物種的MHC進行命名，因此，小鼠的MHC被命名為H-2，大鼠是RT1，兔是RLA。個體中編碼不同MHC分子的不同基因區通常被單獨命名，例如在人類中為HLA-A、HLA-C等。MHC分子是重要的免疫系統分子，這是因為是該分子將抗原的抗原決定簇呈遞給免疫系統。例如，如果T細胞將對特定的病原體做出應答，則該病原體必須具有至少一個抗原(例如蛋白質)，該抗原具有至少一個抗原決定簇(例如蛋白質的肽部分)，該抗原決定簇能夠與細胞表面上的MHC分子結合，並因此與能夠結合MHC-肽複合物的T細胞相互作用。因此，該免疫應答依賴於MHC結合於抗原決定簇的能力。如果沒有將與MHC結合的抗原決定簇，或者沒有結合於MHC-肽複合物的T細胞，則不會出現免疫應答。然而，關於「自身」蛋白質，許多抗原決定簇的一種可以能夠結合MHC分子，並因此可能誘導免疫應答。在這些情況中，必須提供特異性的「信號」用於清除或「關閉」與自身反應的淋巴細胞克隆。因此，如上所述，自身和外源(即，非自身)肽都能夠結合MHC分子，各種肽與MHC分子的結合在免疫學領域中已經受到特別詳細的研究。許多研究已經尋求算出或者預測某些MHC(特別是HLA和H-2)類型和肽序列之間結合的強度，以試圖解釋免疫應答或其缺失(即，區分自身和外源所必需的「信號」)。這些研究的例子包括以下Altuvia Y，Schueler O,Margalit H. 1995. 「Ranking potential bindingpeptides to MHC molecules by a computational threading approach (通過計算穿線法排列潛在的與MHC分子結合的肽)」 .J. Mol. Biol.，249:244 250.Altuvia Y，Sette A, Sidney Jj Southwood S，Margalit H. 1997. 「Astructure-based algorithm to predict potential binding peptides to MHCmolecules with hydrophobic binding pockets (用以預測具有與含疏水結合袋的MHC分子結合的潛力的肽的結構算法)」 · Hum. Immunol. 58:1 11.G. E. Meisterj C. G. P. Roberts, J. A. Berzofsky, A. S. De Grootj 「Two novel Tcell epitope prediction algorithms based on MHC—binding motifs;comparisonof predicted and published epitopes from Mycobacterium tuberculosis and HIVprotein sequences (基於MHC結合基序的兩種新型T細胞表位預測算法；來自結核絲桿菌的所預測並公開的表位和HIV蛋白序列的比較)」Vaccine，13:581 591，(1995). Gulukota K, Sidney Jj Sette A, DeLisi C. 1997. 「Two complementary methodsfor predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules(用於預測與主要組織相容性複合分子結合的肽的兩種互補方法)」 .J. Mol. Biol. 267:1258 1267.Pamer EG, Harty JTj Bevan MJ. 「Precise prediction of a dominant classIMHC-restricted epitope of Listeria monocytogenes (單核細胞增生李斯特菌的顯性 I類MHC限制表位的精確預測)'Nature 1991:353:852 855.Parker KCj Bednarek MAj Coligan JE. 1994. 「Scheme for ranking potentialHLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptideside-chains (基於各單獨的肽側鏈的獨立結合來排列潛在的HLA-A2結合肽的方案)
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通常，現有技術試圖通過計算肽和特定MHC分子的已知結合環境之間的結合強度來預測特定肽的免疫原性。結合環境包括MHC分子中的「袋」，其適合接受一定長度的肽(例如7 15個胺基酸)。通過之前的X-射線晶體學研究已經可以知道所述「袋」的結構。使用原子和分子相互作用的適當運算法則可以在數學上計算這種強度。作為選擇，現有技術試圖根據肽中所存在的基序對肽的結合強度進行「評分」，例如與特定的已知HLA分子結合的在一定長度的肽的特定位置存在的特定胺基酸，例如在八胺基酸肽中位置3上存在的脯氨酸。通常，這些方法已經獲得了有限的成功。本發明人相信他們已經對上述理論進行了改進，其由於更充分地理解了與諸如自身蛋白質等自身物質反應的T細胞如何在它們的消除(克隆缺失)或沉默(克隆無反應性)之前被鑑定出來。因此，發明人已經能夠鑑定特異性的免疫原性肽序列，其可提供針對特異性病原體的防護，並且使用所鑑定的序列已經開發出了針對這些病原體的疫苗。對於本發明，發明人已經開發出了用於引起T細胞應答的流感疫苗的肽。之前，通過鑑定現有的流感病毒株並接著生產對該病毒具有特異性的疫苗，已經開發了流感疫苗。通常，這些疫苗已經基於B細胞(抗體)應答，所述抗體與特異性流感病 毒株的表面抗原(即血凝素和神經氨酸苷酶)具有反應性，針對該流感病毒株已經開發了抗體。典型的是，含有抗原的表面蛋白在流感病毒株之間是可以變化的，這是因為產生新病毒的病毒突變傾向於出現在表面蛋白中。其結果是，傳統的流感疫苗通常僅防護抵抗一種特定的病毒株，並且不會防護抵抗由突變導致的新病毒株。因此，需要新的疫苗防護抵抗出現的病毒株。這種方法的明確問題是在新病毒株的出現以及疫苗的開發之間存在一段時間，在這段時間中，針對該病毒沒有可以利用的防護。如果病毒特別有害，則這能夠引起數百萬人死亡，例如在上世紀出現的重大流行性流感。知道細胞毒性T淋巴細胞可以提供對流感病毒株的免疫應答已經有一段時間了。最近的研究已顯示人類中的CTL應答可以指向多個抗原決定簇。已經暗示，針對HLA-A2限定的M-I 58-66抗原決定簇存在顯著的應答。這些研究包括A. C. Boon等人，J. Virol, 2002 年 I 月，582 90 ;S. Tamura 等人，Jpn. J. Infect. Dis.，2004 年 12 月，236 47 ；G. Deliyannis 等人，J. Virol. , 2002 年 5 月，4212 21 ；C. Gianfrani 等人，Hum.Immunol. , 2000 年 5 月，438 52 ;和 J. Jameson 等人，J. Immunol. , 1999 年 6 月，7578 83。最近還已經有針對特異性免疫原性肽的研究，所述免疫原性肽可能對開發引起T細胞應答的流感疫苗有用。通常，這些工作已經涉及到研究CTL應答以測試例如在轉基因小鼠中的流感肽。所測試的肽傾向於是可以與一種MHC(或HLA)類型反應的短序列，並且從特異性測試流感病毒株中獲得。例如，在Vaccine, 2005, 5231 44中，N. Hu等人公開了在表達HLA-A2、HLA-B7或HLA-B27的HLATg小鼠中測試野生型Ml 58-66肽。這些結果顯示該肽是由表達HLA-A2的轉基因小鼠所識別的流感抗原決定簇。在Clin. Exp. Immunol.，2005年10月，45 52中，A. C. Boon等人公開了 Ml 58-66和NP44-52流感A肽作為在HLA_A*0101和HLA-A*0201個體中所識別的抗原決定簇。在Cell Immunol.，2005年4月，110 123中，E. Cheuk等人公開NP383-391流感A肽作為HLA-B27/H2 I類缺陷小鼠中所識別的抗原決定簇。使用抗原決定簇預測程序，作者鑑定了另外三種B27限制性流感A抗原決定簇BP-2 702-710、PB-I 571-579 和 PB-2 368-376。在 J. Immunol.，2004 年 2 月，2453 60中，A. C. Boon等人公開了對NP 418-426中HLA B*3501限制性抗原決定簇的天然變種特異的人CTL克隆。在J. Immunother. , 2003年I月 2月，41 6中，A. Trojan等人公開了HLA-A3限制性九肽RLEDVFAGK，其能夠誘導特異性的CTL反應性。還公開了 HLA-A2限制性流感病毒 A 基質肽 GILGFVFTL。在 J. Gen. Virol.，2001 年 7 月，1749 55 中，S. Tourdot 等人鑑定了來自於流感病毒株A/PR/8/34聚合酶蛋白PB-I的鼠D(k)限制性抗原決定簇，其對應於胺基酸殘基 349 357 (ARLGKGYMF)。在 J. Immunol.中，2001 年 4 月，4627 33，G.T. Belz等人從流感聚合酶蛋白PB-I鑑定了一種對應於胺基酸殘基703 711的免疫原性肽(SSYRRPVGI)和來自 PB-2 聚合酶的模擬表位(ISPLMVAYM)。PCT/US2005/002954 公開了含有NP 265-273的CTL抗原決定簇，其具有序列ILRGSVAHK，還公開了含有NP 305-313的抗原決定簇。最後，US 6，740325公開了兩種CTL抗原決定簇NP 335-350和NP 380-393。進一步研究已經顯示來自轉基因小鼠的數據提供了可靠的模型以用於研究人類中CTL應答。在Int. Immunol. , 1995年4月，597-605中，S. Man等人已經顯示來自HLA-A2. I轉基因小鼠的HLA-A2. I限制性細胞毒性T淋巴細胞所識別的主要流感A抗原決定簇是基質蛋白I(M-I)肽抗原決定簇，其在人CTL應答中是免疫顯性的。E. J. Bernhard等人(J. Exp. Med.，1998 年 9 月，1157 62)和 E. Cheuk 等人(J. Immunol.，2002 年 11 月，5571 80)已經進行了該領域的進一步研究。然而，儘管已經廣泛地研究了已知的抗原決定簇，但對於形成能夠防護抵抗多於一種流感病毒株的流感疫苗的基礎還沒有令人滿意的。而且，根據這些單個抗原決定簇的疫苗，即使它們提供了某些保護，但仍將對特定的HLA是特異性的，這使得它們在大比例人群中是無效的。因此，無論依賴B細胞還是T細胞應答，已知疫苗的顯著問題是它們僅防護抵抗現有的病毒株，而不提供針對未來可能發展出來的病毒株的防護。隨著禽類中高度危險的H5N1株的出現，在基於H5N1株後續突變的人類大流行病之前變得越來越迫切需要疫苗。而且，根據引起T細胞應答的已知肽的疫苗可能在大部分人群中不會有效。

發明內容
因此，本發明的一個目的是解決與已知的上述現有技術相關的問題。本發明進一步的目的是提供一種多肽，該多肽能夠在脊椎動物中針對多種流感株和/或在表達不同MHC(HLA)的多種個體中引起CTL免疫應答。本發明進一步的目的是提供一種使用本發明的多肽的流感疫苗。優選的是，該疫苗能夠防護抵抗多種流感株和/或在表達不同MHC(HLA)的多種個體中有效。因此，本發明提供了一種具有不超過100個胺基酸的多肽，該多肽含有與SEQ IDI 6任一序列具有至少60%同源性的一條或者多條序列,或者含有兩個或者更多個具有7個胺基酸或更多胺基酸的抗原決定簇，每個抗原決定簇與SEQ ID I 6任一序列的和所述抗原決定簇長度相同的子序列具有至少60%的同源性SEQ ID I DLEALMEffLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSEQ ID 2 LLYCLMVMYLNPGNYSMQVKLGTLCALCEKQASHSSEQ ID 3 DLIFLARSALILRGSVAHKSCSEQ ID 4 PGIADIEDLTLLARSMVVVRP
SEQ ID 5 LLIDGTASLSPGMMMGMFNMLSTVLGVSILNLGQSEQ ID 6 IIGILHLILffILDRLFFKCIYRLF其中，所述多肽在表達主要組織相容性複合體(MHC)等位基因的脊椎動物中是免疫原性的，且其中所述多肽不是完整的流感病毒蛋白。因此，所述多肽是一種可以含有完整的上述序列中任一條序列(或者可以含有上述序列中任一條序列的至少兩種七殘基或者更多殘基部分)，但總體不能具有超過100個胺基酸殘基。所述多肽在表達MHC (人類中為HLA)等位基因的脊椎動物中也必需是免疫原性的。免疫原性多肽在本文中被理解為一種多肽，其在脊椎動物中引發免疫應答，例如通過與脊椎動物MHC結合，並使MHC與細胞毒性T細胞淋巴細胞反應。在下面的實驗I中提出了一種用於確定多肽是否具有免疫原性的方法。然而，本發明不限於這些方法，並且本領域技術人員可以根據需要選擇任何已知的方法用於確定免疫原性。如上所提到的，所述多肽可以是一種含有兩種七殘基或更多殘基的抗原決定簇的 多肽，所述抗原決定簇與一個或者多個MHC反應，這樣引起廣泛的CTL應答。該應答可以在一種個體中，或者可以在至少兩種不同的個體中(並且所述個體可以是相同的物種或不同的物種)。因此，所述多肽可以含有至少兩種不同的七殘基或更多殘基的抗原決定簇，其中每個抗原決定簇獨立地提供了對不同目標的應答。在本發明上下文中抗原決定簇是多肽的一部分，其能夠結合於脊椎動物中的脊椎動物MHC，優選引發免疫應答，例如通過使MHC-抗原決定簇複合物與CTL反應。在下面的實驗I中提出了一種用於確定多肽是否是抗原決定簇或者含有抗原決定簇的方法。然而，本發明不限於這些方法，並且本領域的技術人員可以根據需要選擇任何已知的方法用於確定多肽是否是抗原決定簇或含有抗原決定簇。本發明的發明人已經發現上述序列含有多種CTL抗原決定簇，其可以對群體中多種多樣脊椎動物提供針對流感的防護。另外，發明人已經分析了跨所有物種的所有已知流感病毒株序列，並且已經發現所指定的序列在所有已知的流感病毒株中是非常保守的。同樣地，這些序列在由現有株突變所產生的新株中也不太可能是顯著變化的。因此，這些序列中提供防護作用的抗原決定簇在新株中很可能以未改變的形式存在，這是因為通常突變不會出現這些區域。因此，這些抗原決定簇提供了非常好的機會，不僅用於提供針對現有流感株(例如「鳥流感」的H5N1株)的防護，而且提供針對還未知的病毒株(例如H5N1的突變形式，其能夠容易在人之間傳播，並形成大流行病的基礎)的防護。如上所討論的，在對跨所有物種的所有已知流感病毒株序列進行分析之後，已經鑑定了這些序列。因此，這些序列是從上述分析所得到的共有序列。儘管是共有序列，但在某些情況中，這些序列與某些已知流感病毒株中的天然序列精確對應。由於所有物種中所有病毒間的序列中的顯著保守性，這些共有序列，即使在與實際序列有區別時，也僅在少量殘基中有不同，並因此含有許多較小的抗原決定簇(八胺基酸、九胺基酸、十胺基酸等)，因此與天然序列沒有區別。因此，上述共有序列作為整體含有許多與天然的抗原決定簇相同的有效抗原決定簇，以及與天然抗原決定簇僅稍有不同的有效抗原決定簇。對於本領域技術人員顯而易見的是，本發明不僅擴展到共有序列和它們的抗原決定簇，還擴展到任何流感病毒株中相應的實際序列。因此，與這些共有序列具有某些同源性的序列也在本發明的範圍內。例如，這類同源性允許最高3個胺基酸的取代存在於八胺基酸抗原決定簇中(62. 5%同源性)或九胺基酸、十胺基酸或i^一胺基酸抗原決定簇中。優選在對應SEQ IDI 6全長序列的本發明序列中可以鑑定不超過10個這些取代(對於全長三十個胺基酸是66. 6%的同源性)。優選的是，這些取代是符合已知取代方案的保守取代。考慮到本發明從這些共有序列擴展到對應的天然序列，因此本發明還提供了一種不超過100個胺基酸的多肽，該多肽含有由流感病毒蛋白的下列胺基酸殘基所限定的一條或者多條序列，或者含有兩個或者更多個抗原決定簇，所述抗原決定簇具有來自由流感病毒蛋白的下列胺基酸殘基所限定的序列的7個胺基酸或更多個胺基酸Ml蛋白的殘基36 75 (優選來自流感A株)Ml蛋白的殘基124 158 (優選來自流感B株)NP蛋白的殘基255 275 (優選來自流感A株) NP蛋白的殘基306 326 (優選來自流感B株) PBl蛋白的殘基395 428M2蛋白的殘基32 55其中，所述多肽在表達主要組織相容性複合體(MHC)等位基因的脊椎動物中是免疫原性的，且其中所述多肽不是完整的流感病毒蛋白。對本發明中提及的序列的編號是根據公認的原則所確定的。因此，編號是從公認翻譯起始密碼子(ATG)的I位開始的。對於編碼感興趣蛋白的流感基因組的區段，這對應於甲硫氨酸(M)。換句話說,正如由已列出序列的資料庫(即GenBank, SwissProt等)所使用和限定的，其開始於I位，相對於顯示為感興趣的蛋白質序列中的第一個胺基酸的甲硫氨酸。


參考後面的附圖僅以實施例的方式對本發明進行更充分地描述，其中圖I中的IA IF顯示根據下面實施例I所描述的方案，FLU-ν和NRP疫苗接種的小鼠的原代脾細胞培養物所產生的IFN-Y，所述原代脾細胞培養物被下列所刺激ConA(10μ g/ml)、可溶性溶菌酶(5μ g/ml)、純化的可溶性多肽(Pl (圖I中的1A)、P2 (圖I中的1B)、P3 (圖 I 中的 1C)、P4 (圖 I 中的 1D)、P5 (圖 I 中的 1E)和 P6 (圖 I 中的 lF)；5y g/ml)和被溶菌酶？1、？2、？314、？5或？6所轉染的HLA-匹配的Tl (Tl)和不匹配的JURKAT(Ju)人細胞(脾細胞與轉染細胞的比例是10 :1)。IFN-Y的產生被表示為響應所考慮抗原的產生水平減去響應可溶性溶菌酶或轉染溶菌酶的相應細胞所產生的IFN-Y之間的差異。溶菌酶介導的IFN-Y的產生的背景水平對於可溶性抗原是25±10pg/ml，對於Tl中的抗原是316±43pg/ml,對於 Jurkat 中的抗原是 19±6pg/ml ；圖2顯示根據下面實施例I所描述的方案，FLU-v和NRP疫苗接種的小鼠的原代脾細胞培養物所產生的IFN-Y，所述原代脾細胞培養物被被下列所刺激Con A (10 μ g/ml),可溶性溶菌酶(5 μ g/ml)、純化的可溶性FLU-v多肽製備物(PU P2、P3、P4、P5和P6，全部為5μ g/ml)和HLA匹配的Tl (Tl)和不匹配的JURKAT (Ju)人細胞，所述人細胞被感染流感病毒株 A/New_Caledonia/20/99、A/NYMC/X_147 或 B/Johannesburg/5/99,或轉染溶菌酶(脾細胞感染/轉染細胞的比例為10 1) ；IFN-Y的產生被表示為響應所考慮抗原的產生水平減去響應可溶性溶菌酶或轉染溶菌酶的相應細胞所產生的IFN-Y之間的差異；溶菌酶介導的IFN-Y的產生的背景水平對於可溶性抗原是25±10pg/ml，對於Tl中的抗原是316±43pg/ml,對於 Jurkat 中的抗原是 19±6pg/ml ;以及
圖3中的3A和3B顯示在使用流感A/PR/8/34進行致死攻擊之後，動物的存活率；在第I和15天，動物被皮下免疫FLU-v或NRP-v，第20天，在麻醉下，用45 μ I病毒(每劑量為5Χ IO7Pfu)對所有的動物進行鼻內攻擊；在第19和22天，將圖3中的3Α中的動物腹腔內接種100 μ g的大鼠抗小鼠CD8血清；在第19和22天，將圖3中的3B中的動物腹腔內接種無關大鼠血清；箭頭表示鼻內攻擊的日期；而菱形表示動物接種抗CD8血清的日期。
具體實施例方式上面所描述的多肽通常含有一個或者多個(優選2個或者更多個)抗原決定簇。優選的是，這些抗原決定簇是T細胞抗原決定簇，例如細胞毒性T淋巴細胞(CTL)抗原決定簇。通常，所述多肽對於流感病毒株是免疫原性的，並優選對於多種流感病毒株是免疫原性的。在本文中，對流感病毒株是免疫原性的多肽被理解為意味著所述多肽作為流感病毒蛋白一部分，並能夠引起免疫系統應答，例如通過在結合MHC時表現CTL反應性。下面的實驗I中提出了一種用於確定多肽是否具有這類免疫原性的方法。然而，本發明並不限於這些方法，本領域技術人員可以根據需要選擇任何已知的方法用於確定免疫原性。
在本發明中，所述多肽含有上述的兩條或者更多條序列。通常，如果需要，在多肽中可以存在兩條、三條、四條、五條或者更多條這樣的序列。所存在的這類抗原決定簇越多，則在具有不同HLA或MHC的人和/或動物個體群體中提供的保護幅度就越大。如果需要，根據本發明的多肽還可以包含一條或者多條不是抗原決定簇的其他序列。通常，所述其他序列來自於一個或者多個流感病毒蛋白。這些序列可以位於上述兩條或者更多條序列(抗原決定簇)之間，或者可以位於多肽的一個或者兩個末端。這些其它序列的存在不應該影響所述多肽的功能，倘若所述多肽作為整體不會變得太大，幹擾脊椎動物的免疫系統中抗原決定簇的呈遞。在本發明的具體實施方式
中，當所述多肽與SEQ ID I同源時，則優選所述其他序列是來自流感Ml蛋白(優選來自流感A株)的一條或者多條序列；當所述多肽與SEQ ID 2同源時，則優選所述其他序列是來自流感Ml蛋白(優選來自流感B株)的一條或者多條序列；當所述多肽與SEQ ID 3同源時，則優選所述其他序列是來自流感NP蛋白(優選來自流感A株)的一條或者多條序列；當所述多肽與SEQ ID 4同源時，則優選所述其他序列是來自流感NP蛋白(優選來自流感B株)的一條或者多條序列；當所述多肽與SEQ ID 5同源時，則優選所述其他序列是來自流感PBl蛋白的一條或者多條序列；當所述多肽與SEQ ID 6同源時，則優選所述其他序列是來自流感M2蛋白的一條或者多條序列。在最優選的實施方式中，來自上述蛋白質的所述其他序列是下列共有序列內的序列，或者與下列共有序列內的序列具有至少60%的同源性的序列Ml流感A共有序列-SEQ ID 7MSLLTEVETYVLSIVPSGPLKAEIAQRLEDVFAGKNTDLEALMEWLKTRPILSP LTKGILGFVFTLTVPSERGLQRRRFVQNALNGNGDPNNMDKAVKLYRKLKREITFH GAKEIALSYSAGALASCMGLIYNRMGAVTTEVAFGLVCATCEQIADSQHRSHRQM VATTNPLIKHENRMVLASTTAKAMEQMAGSSEQAAEAMEIASQARQMVQAMRTVGTHPSSSTGLRDDLLENLQTYQKRMGVQMQRFKMl流感B共有序列-SEQ ID 8MSLFGDTIAYLLSLTEDGEGKAELAEKLHCWFGGKEFDLDSALEWIKNKRCL TDIQKALIGASICFLKPKDQERKRRFITEPLSGMGTTATKKKGLILAERKMRRCVSF HEAFEIAEGHESSALLYCLMVMYLNPGNYSMQVKLGTLCALCEKQASHSHRAHS RAARSSVPGVRREMQMVSAMNTAKTMNGMGKGEDVQKLAEELQSNIGVLRSLG ASQKNGEGIAKDVMEVLKQSSMGNSALVKKYLNP流感A共有序列-SEQ ID 9MASQGTKRSYEQMETD⑶RQNATEIRASVGKMIDGIGRFYIQMCTELKLSDY EGRLIQNSLTIEKMVLSAFDERRNRYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVDGKWMREL VLYDKEEIRRIffRQANNGEDATAGLTHMMIffHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPR MCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGIGTMVMELIRMIKRGINDRNFWRGENGRKTR SAYERMCNILKGKFQTAAQRAMVDQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAH KSCLPACVYGPAVSSGYDFEKEGYSLVGIDPFKLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLV WMACHSAAFEDLRLLSFIRGTKVSPRGKLSTRGVQIASNENMDNMGSSTLELRSG YWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISVQPTFSVQRNLPFEKSTVMAAFTGNTEGRTSD MRAEIIRMMEGAKPEEVSFRGRGVFELSDEKATNPIVPSFDMSNEGSYFFGDNAEE YDNNP流感B共有序列-SEQ ID 10 MSNMDIDGINTGTIDKTPEEITSGTSGTTRPIIRPATLAPPSNKRTRNPSPERATT SSEADVGRKTQKKQTPTEIKKSVYNMVVKLGEFYNQMMVKAGLNDDMERNLIQ NAHAVERILLAATDDKKTEFQKKKNARDVKEGKEEIDHNKTGGTFYKMVRDDKT IYFSPIRITFLKEEVKTMYKTTMGSDGFSGLNHIMIGHSQMNDVCFQRSKALKRVGLDPSLISTFAGSTLPRRSGATGVAIKGGGTLVAEAIRFIGRAMADRGLLRDIKAKTAY EKILLNLKNKCSAPQQKALVDQVIGSRNPGIADIEDLTLLARSMVVVRPSVASKVV LPISIYAKIPQLGFNVEEYSMVGYEAMALYNMATPVSILRMGDDAKDKSQLFFMSC FGAAYEDLRVLSALTGTEFKPRSALKCKGFHVPAKEQVEGMGAALMSIKLQFffAP MTRSGGNEVGGDGGSGQISCSPVFAVERPIALSKQAVRRMLSMNIEGRDADVKGN LLKMMNDSMAKKTNGNAFIGKKMFQISDKNKTNPVEIPIKQTIPNFFFGRDTAEDY DDLDYPBl流感共有序列-SEQ ID 11MDVNPTLLFLKVPAQNAISTTFPYTCDPPYSHGTGTGYTMDTVNRTHQYSEK GKffTTNTETGAPQLNPIDGPLPEDNEPSGYAQTDCVLEAMAFLEESHPGIFENSCL ETMEVVQQTRVDKLTQGRQTYDffTLNRNQPAATALANTIEVFRSNGLTANESGRLI DFLKDVMESMDKEEMEITTHFQRKRRVRDNMTKKMVTQRTIGKKKQRVNKRGYLIRALTLNTMTKDAERGKLKRRAIATPGMQIRGFVYFVETLARSICEKLEQSGLPVG GNEKKAKLANVVRKMMTNSQDTELSFTITCDNTKWNENQNPRMFLAMITYITKN QPEWFRNILSIAPIMFSNKMARLGKGYMFESKRMKLRTQIPAEMLASIDLKYFNES TRKKIEKIRPLLIDGTASLSPGMMMGMFNMLSTVLGVSILNLGQKKYTKTTYffffD GLQSSDDFALIVNAPNHEGIQAGVDRFYRTCKLVGINMSKKKSYINKTGTFEFTSFF YRYGFVANFSMELPSFGVSGINESADMSIGVTVIKNNMINNDLGPATAQMALQLFI KDYRYTYRCHRGDTQIQTRRSFELKKLWDQTQSKAGLLVSDGGPNLYNIRNLHIPE VCLKWELMDEDYRGRLCNPLNPFVSHKEIESVNNAVVMPAHGPAKSMEYDAVATT HSffIPKRNRSILNTSQRGILEDEQMYQKCCNLFEKFFPSSSYRRPVGISSMVEAMVS RARDARDFESGRIKKEEFSEIMKICSTIEELRRQKKM2流感共有序列-SEQ ID 12MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDPLVVAASIIGILHLILWILDRLFFKCIYRLFK HGLKRGPSTEGVPESMREEYRKEQQNAVDADDSHFVSIELE關於這些序列與上面的同源性優選為75%、85%、95%或基本上為100%。在本發明中，流感株不受到特別限制，所述多肽可以對任何已知的流感株是免疫原性的，和/或來自任何已知的流感株。然而，優選的是，相關的株是流感A株或流感B株。已從任何現有株突變得到的未來流感株也可以是以下流感株所述多肽針對該流感株為免疫原性的，或者所述多肽來自該流感株。
定義本發明多肽的序列所位於其中的蛋白質選自任何流感病毒株(特別是A株和B株)的Ml、NP、PB和M2蛋白(如上所述，其為所有分析序列的共有序列，或者作為選擇，其位置位於所述蛋白質內)。發明人對下列特異性的蛋白進行了分析，優選本發明中所提到的流感病毒蛋白選自這些特定蛋白，或者來自這些蛋白的突變體。因此，上面所描述的與SEQID I 6同源的特定序列優選是在下列蛋白內適當位置上的。類似的，由任何流感株的蛋白內殘基位置所限定的本發明的序列，即Ml蛋白的殘基36 75 (特別是流感AMI)，Ml蛋白的殘基124 158 (特別是在流感B Ml中)，NP蛋白的殘基255 275 (特別是在流感ANP中)，NP蛋白的殘基306 326 (特別是在流感B NP中)，PBl蛋白的殘基395 428和M2蛋白的殘基32 55優選是位於下列特定蛋白質中的序列。該列表是以I版本號(gi號)I資料庫識別碼(例如對於GenBank是gb) NCBI索取號|可選擇的其他信息(例如，產生蛋白序列的核苷酸序列的索取號)的形式。這些序列和產生它們的對應流感株可以全部在公共NCBI蛋白質資料庫中發現,其可以通過以下URL地址在線進入http://www. ncbi.nlm. nih. gov/entrez/query/static/help/helpdoc. html#Protein.該蛋白質資料庫含有來自GenBank、EMBL和DDBJ中DNA序列經過翻譯的編碼區的序列數據，以及提交到蛋白質信息資源(Protein Information Resource,PIR)、SWISS_PR0T、蛋白質研究基金會(PRF)和蛋白質數據銀行(Protein Data Bank, PDB)(來自經解釋的結構的序列)的蛋白質序列的 序列數據。Ml 蛋白27530653|dbjIBAC54009. I ； |27530634|dbj|BAC53998. I ； 53829719|gb|AAU94746.11;I 53829716|gb|AAU94744. 11 ； |53829713|gb|AAU94742. 11 ； |53829710|gbAAU94740. 11;|53829707|gb|AAU94738.11 ； |53829704|gb|AAU94736.11 ； |538297011 gb IAAU94734. 11;|53829698|gb|AAU94732.11 ； |53829695|gb|AAU94730.11 ； |53829692
gbIAAU94728. 11;|53829689|gb|AAU94726.11 ； |53829686|gb|AAU94724. 11 ； |53829683 IgbIAAU94722. 11;|8486160|ref|NP_056664. 11 ； |30466242|ref|NP_848689. 11 ； |30349250|gb|AAP22121. l| ; |3046621l|ref|NP_848672. l| ;
30349219|gbIAAP22104. 11; 4761025|gb|AAD29208. I|AF100392_11 ； |4761022|gb|AAD29206.I|AF100391_11; 4761019|gb|AAD29204. 11AF100390_11 ； |4761016|gb|AAD29202. I|AF100389_l ; 4761013|gbIAAD29200. 11AF100388_11 ； |4761010|gb|AAD29198. I|AF100387_11; 4761007|gbIAAD29196. I|AF100386_11 ； |4761004|gb|AAD29194.11 AF100385_11; 4761001|gb|AAD29192. I|AF100384_11 ； |4760998|gb|AAD29190. I|AF100383_11; 4760995|gbIAAD29188. 11AF100382_11 ； |4760992|gb|AAD29186. 11AF100381_11;|4760989|gb|AAD29184. I|AF100380_11 ； |4760986|gb|AAD29182. 11AF100379_11; 4760983|gb|AAD29180. I|AF100378_lI ； 4760980|gb|AAD29178. I AF100377_1| ; 4760977|gb|AAD29176. I|AF100376_l| ; |4760974|gb|AAD29174. I|AF100375_1| ; 4760971|gb|AAD29172. I|AF100374_lI ；112862823|dbj|BAB32623. 11; 112862820|dbj|BAB32621. 11 ；
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權利要求
1.一種具有不超過100個胺基酸的多肽，所述多肽含有與SEQ ID 2或SEQ ID 4具有至少85%同源性的一條或者多條序列，或者含有兩個或者更多個具有7個胺基酸或更多胺基酸的抗原決定簇，每個抗原決定簇與SEQ ID 2或SEQ ID 4的和所述抗原決定簇長度相同的子序列具有至少85%的同源性，其中，所述多肽在表達主要組織相容性複合體(MHC)等位基因的脊椎動物中是免疫原性的。
2.如權利要求I所述的多肽，所述多肽含有細胞毒性T淋巴細胞(CTL)抗原決定簇。
3.如前述任一項權利要求所述的多肽，其包含2、3、4、5或更多個抗原決定簇。
4.如前述任一項權利要求所述的多肽，其對SEQID 2或SEQ ID 4的序列內的抗原決定簇是免疫原性的。
5.如前述任一項權利要求所述的多肽，其對流感病毒株是免疫原性的。
6.如權利要求5所述的多肽，其對多種流感病毒株是免疫原性的。
7.如權利要求5所述的多肽，其中所述流感病毒株是流感A株或流感B株。
8.如前述任一項權利要求所述的多肽，其還含有一條或者多條來自流感病毒蛋白的其他序列。
9.如權利要求8所述的多肽，其中所述蛋白是流感NP蛋白。
10.如前述任一項權利要求所述的多肽，其中所述同源性基本上為100%。
11.如前述任一項權利要求所述的多肽，其中所述抗原決定簇包含8、9、10或11個胺基酸或者更多個胺基酸。
12.如前述任一項權利要求所述的多肽，其具有不超過50個胺基酸殘基。
13.如前述任一項權利要求所述的多肽,其包含15 35個胺基酸殘基。
14.一種多肽組合物，其含有兩種或者更多種如前述任一項權利要求所述的多肽。
15.如權利要求14所述的多肽組合物，序列為SEQID 2和SEQ ID 4的多肽存在於所述多肽組合物中。
16.如權利要求14所述的多肽組合物，序列為SEQID 2和SEQ ID 4 6的多肽全部存在於所述多肽組合物中。
17.如權利要求I至13中任一項所述的多肽，所述多肽用於藥物中。
18.如權利要求14至16中任一項所述的多肽組合物，所述多肽組合物用於藥物中。
19.一種產生權利要求I至13中任一項所述的多肽的方法，所述方法包括將兩個或更多個抗原決定簇組合以形成所述多肽。
20.一種多肽構建體，所述構建體包含載體和權利要求I至13中任一項所述的多肽。
21.如權利要求20所述的多肽構建體，其中所述載體是輔助劑和/或賦形劑。
22.—種產生權利要求20或21所述的多肽構建體的方法，所述方法包括將兩個或者更多個抗原決定簇和/或多肽與所述載體組合。
23.—種針對流感的藥物組合物，其包含權利要求I 13中任一項所述的多肽，以及適當的賦形劑和/或輔助劑。
24.—種針對流感的藥物組合物，其包含權利要求14 16中任一項所述的多肽組合物，以及適當的賦形劑和/或輔助劑。
25.—種針對流感的藥物組合物，其包含權利要求20或21所述的多肽構建體。
26.如權利要求23至25中任一項所述的針對流感的藥物組合物，其中所述流感是流感A株或流感B株。
27.一種製備權利要求23至26中任一項所述的所述的藥物組合物的方法，所述方法包括將權利要求I 13中任一項所述的多肽或權利要求14 16中任一項所述的多肽組合物或權利要求20或21所述的多肽構建體與適當的賦形劑和/或輔助劑進行混合。
28.—種針對流感的疫苗組合物，其包含權利要求I 13中任一項所述的多肽，以及適當的賦形劑和/或輔助劑。
29.—種針對流感的疫苗組合物，其包含權利要求14 16中任一項所述的多肽組合物，以及適當的賦形劑和/或輔助劑。
30.一種針對流感的疫苗組合物，其包含權利要求20或21所述的多肽構建體。
31.如權利要求28至30中任一項所述的針對流感的疫苗組合物，其中所述流感是流感A株或流感B株。
32.—種製備權利要求28至31中任一項所述的疫苗組合物的方法，所述方法包括將權利要求I 13中任一項所述的多肽或權利要求14 16中任一項所述的多肽組合物或權利要求20或21所述的多肽構建體與適當的賦形劑和/或輔助劑進行混合。
33.權利要求I 13中任一項所述的多肽在製備有效治療或預防流感的藥物或疫苗中的應用。
34.權利要求14至16中任一項所述的多肽組合物在製備有效治療或預防流感的藥物或疫苗中的應用。
35.權利要求20或21所述的多肽構建體在製備有效治療或預防流感的藥物或疫苗中的應用。
36.權利要求23 26中任一項所述的藥物組合物在製備有效治療或預防流感的藥物或疫苗中的應用。
37.權利要求28 31中任一項所述的疫苗組合物在製備有效治療或預防流感的藥物或疫苗中的應用。
38.如權利要求33 37中任一項所述的應用，其中所述流感是脊椎動物的流感。
39.如權利要求38所述的應用，其中所述脊椎動物選自哺乳動物、鳥、爬行動物和魚。
40.如權利要求38所述的應用，其中所述脊椎動物是人或養殖的動物。
41.如權利要求38所述的應用，其中所述脊椎動物是家養的動物。
42.如權利要求38所述的應用，其中所述脊椎動物是牛類動物或家禽。
43.如權利要求38所述的應用，其中所述脊椎動物選自雞、鴨、鵝、豬、馬、牛、狗或貓。
44.如權利要求33至37中任一項所述的應用，其中所述流感是流感A株或流感B株。
全文摘要
本發明提供了肽序列和組合物，具體而言本發明提供了一種具有不超過100個胺基酸的多肽，所述多肽含有與SEQ ID 1～6任一序列具有至少60%同源性的一條或者多條序列，或者含有兩個或者更多個具有7個胺基酸或更多胺基酸的抗原決定簇，每個抗原決定簇與SEQ ID 1～6任一序列的和所述抗原決定簇長度相同的子序列具有至少60%的同源性SEQ ID 1 DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVP；SEQ ID 2 LLYCLMVMYLNPGNYSMQVKLGTL CALCEKQASHS；SEQ ID 3 DLIFLARSALILRGSVAHKSC；SEQ ID 4 PGIADIEDLTLLARSMVV VRP；SEQ ID 5 LLIDGTASLSPGMMMGM FNMLSTVLGVSILNLGQ；SEQ ID 6 IIGILHLILWILDRLFFKCIYRLF；其中，所述多肽在表達主要組織相容性複合體(MHC)等位基因的脊椎動物中是免疫原性的，且其中所述多肽不是完整的流感病毒蛋白。
文檔編號C07K14/11GK102807608SQ201210252429
公開日2012年12月5日 申請日期2007年2月5日 優先權日2006年2月7日
發明者格雷戈裡·艾倫·斯特洛夫, 威爾遜·羅梅羅·卡帕羅斯-萬德雷 申請人:派特塞爾有限公司