將化合物結合到表面的方法

2023-08-10 11:14:21

專利名稱：將化合物結合到表面的方法
技術領域：
本發明涉及一種將化合物結合到至少一部分物體表面的方法，該方法包括將疏水蛋白樣(hydrophobin-like)物質吸附到該表面的步驟。
典型地，疏水蛋白是一類由真菌和細菌分泌的富含半胱氨酸的小分子蛋白質，在遇到親水-疏水界面時會裝配形成兩親性膜。一些疏水蛋白形成的兩親性膜並不穩定，而另一些疏水蛋白則會形成極其穩定的兩親性膜。在壁-空氣界面裝配時，它們中的一些蛋白會形成一個疏水表面，其具有如氣生菌絲和孢子上的棒狀超微結構。有些疏水蛋白可以在水-油界面或者疏水固體界面上裝配形成兩親性膜，並參與粘附現象。疏水蛋白是真菌大量產生的蛋白質中的一種，或許是為了某些特定目的，各個物種都可能含有幾個產生不同疏水蛋白的基因。疏水蛋白現被認為和多種發育過程相關聯，比如氣生菌絲，子實體和分生孢子的形成，並且在真菌生態中發揮重要作用，包括孢子傳播，致病機理和共生。
疏水蛋白在真菌生長和發育過程中的諸多方面都具有功能。比如，它們參與疏水性氣生結構(如氣生菌絲和子實體)的形成，同時還介導菌絲與疏水性的附著而產生形態發生信號。這些功能的機理都是基於疏水蛋白具有在親水-疏水界面自裝配形成兩親性膜的特性。
由水下菌絲分泌的疏水蛋白可以在水環境中散播，並在空氣和培養基的界面上自裝配(self-assemble)。伴隨著水表面張力的驟降，使得這些菌絲可以突破界面從而在空氣中生長。另一方面，由接觸疏水環境的菌絲分泌的疏水蛋白會在菌絲表面自裝配。兩親性膜的親水面和細胞壁的親水性多糖相互作用，而疏水面則會暴露給疏水環境。於是，氣生菌絲和孢子變成了疏水性的，而生長於疏水性物質上的菌絲則更加緊密地附著在上面。因此疏水蛋白在真菌的環境中和菌絲表面是有活性的。而且，它們也在細胞壁的基質中有作用而在某正程度上影響細胞壁的組成。在這種情況下，參與的似乎是單體疏水蛋白，而不是自裝配的疏水蛋白。就通過測試而知的而言，群交裂褶菌(Schizophyllum commune)的SC3是最典型的I類疏水蛋白，該類中的其它成員也具有相似的性質。一旦與親水-疏水性界面相接觸，SC3單體就自裝配形成一10nm厚的兩親性膜。SC3膜的親水面和疏水面具有的水接觸角度分別為36°和110°，使得這樣的界面(碳水化合物相比)更適度的親水及(與特氟隆(teflon)相比)更適度的疏水。SC3在界面上自裝配涉及幾種構象改變。富含β-摺疊的單體一開始採取的是含有較高α-螺旋的構象(α-螺旋狀態)。SC3在水-特氟隆界面上就停滯成為這樣一種中間過渡狀態，而在水-空氣界面上蛋白質卻成為具有較高β-摺疊的形式。起初，所謂的β-摺疊狀態並沒有清晰的超微結構(β-摺疊狀態I)，但在數小時後，卻可以觀察到10nm寬棒狀束的圖案(mosaic)(β-摺疊狀態II)。伴隨這樣的超微結構變化並沒有檢測到相應的二級結構改變。從α-螺旋狀態向β-摺疊狀態的轉變同樣也可以發生在水-固體界面上，但需要通過升高溫度及添加去汙劑來誘導。一旦發生了自裝配，疏水蛋白的性質就會發生改變。β-摺疊狀態的疏水蛋白具有極高的表面活性，而單體卻沒有可檢測的表面活性。而且，凝集素活性也增強了。另外，相對於β-摺疊狀態，α-螺旋狀態形式顯得更加的不穩定。儘管兩種狀態都可以強烈地粘附於疏水性表面，α-螺旋形式卻可以通過用稀釋的冷去汙劑處理來解離並轉化為單體形式。相反，β-摺疊形式的構象及其與疏水性固體的相互作用則不受這樣處理的影響。無論是否經過化學或遺傳學修飾，疏水蛋白都可以用來改變某個表面的生物物理學性質。這樣就可以控制分子或細胞與表面的結合。比如，可以降低致病細菌與導管表面的結合，而也可以增強人成纖維細胞與植入物表面的結合。除了改變生物物理學性質，疏水蛋白還可以用來將某些分子粘附到那些它們通常並不具有高親和力的表面上。粘附可以通過先將疏水蛋白裝配到表面上然後再進行化學交聯來完成。例如，通過希夫鹼反應(Schiff-basereaction)，可以將蛋白質附著於裝配的SC3的親水性表面的甘露糖殘基上。或者，當是蛋白質和多肽時，也可以在製成融合蛋白之後再在感興趣的表面上裝配。本文術語「疏水蛋白樣物質」指本質上分離和純化的兩性蛋白質，它們可以包被某種表面，賦予疏水性表面本質上的親水性，反之亦然，即賦予親水性表面本質上的疏水性，並且這樣的蛋白質不僅包括那些分離自天然的，本質上不含有如碳水化合物聚合物如schyzophylan等真菌組分的疏水蛋白，也包括那些經過化學修飾的已知的典型疏水蛋白或者通過遺傳修飾疏水蛋白基因來獲得目前自然界不存在的遺傳修飾的蛋白質而獲得的物質。已知的典型疏水蛋白(見例如WO96/41882，其提供了獲得遺傳修飾的疏水蛋白樣物質的指導)一般是具有直至125個胺基酸長的蛋白質，具有保守序列Xn-C-X5-9-C-C-X11-39-C-X8-23-C-X5-9-C-C-X6-18-C-Xm，其中X代表任何的胺基酸，n和m各自代表整數，如Wessel等揭示(ref.8)。大多數典型的疏水蛋白都含有8個保守的半胱氨酸殘基，其形成4個二硫鍵。然而，當疏水蛋白的二硫鍵通過化學修飾被還原及巰基被如碘乙醯胺所封閉(blocking)時，在沒有親水-疏水界面時該蛋白就會在水中裝配。這樣的結構與在水-空氣界面上裝配的天然疏水蛋白的結構並不能區分開來。顯然，疏水蛋白的二硫鍵保持了單體在水中的可溶性，例如在產生它們的細胞中或者在親水-疏水界面上發生自裝配的培養基中，但從本質上而言，二硫鍵對疏水蛋白的兩性性質卻非必需的。
已知I類和II類疏水蛋白的長度都大約為100個胺基酸，都具有典型的疏水性模式。大多數，但不是全部，都含有八個保守的半胱氨酸殘基，其形成分子內二硫鍵。疏水蛋白可以被糖基化，但它們所具有的典型的兩性性質卻只和它們的胺基酸序列有關。儘管II類疏水蛋白的胺基酸序列相對來說更保守一些，I類疏水蛋白卻示出低同源性。所以，雖然並非不可能，但是想通過例如聚合酶鏈式反應設計通用引物來獲得I類疏水蛋白基因是相當困難的。
事實上，所有物理分離的疏水蛋白都在親水-疏水界面自裝配形成兩親性膜。疏水蛋白膜的一面具有較高的親水性(水接觸角低於90°，例如介於22°和63°之間)，而另一面的水接觸角則本質上大於90°，例如在93°到140°之間，例如與特氟隆(聚四氟乙烯)和石蠟(水接觸角大約110°)具有同樣的疏水性。由I類疏水蛋白(例如來自於群交裂褶菌的SC3和SC4)所形成的膜是高度不溶性的(在100℃時與2％十二烷基硫酸鈉(SDS)不發生反應)，但卻可被甲酸(FA)和三氟乙酸(TFA)所解離。相反，Ophiostoma ulmi的II類疏水蛋白cerato-ulmin(CU)和板慄疫病菌(Cryphonectria parasitica)的II類疏水蛋白cryparin(CRP)形成的膜卻可以在60％乙醇和2％SDS中容易地解離，而裝配的CU已知可以通過加壓或者降溫的方式解離。疏水蛋白在自裝配時伴隨著構象變化。I類和II類疏水蛋白的單體都富含β-摺疊結構。在水-空氣界面，I類疏水蛋白具有更多的β-摺疊結構(稱為β-摺疊狀態)，而在水和疏水固體之間的界面則可以觀察到具有增多的α-螺旋結構的形式(稱為α-螺旋狀態)。α-螺旋狀態看來是自裝配的一種中間過渡狀態，而β-摺疊狀態則像是穩定的最終形式。在水-空氣界面，I類疏水蛋白的單體在幾秒鐘之內就可以成為α-螺旋狀態，但向β-摺疊狀態的轉變則更緩慢，需要數分鐘到數小時。在水-固體界面，該蛋白也很容易成為α-螺旋狀態，但卻認為停滯於這一中間過渡狀態。通過組合應用加熱和稀釋的去汙劑可以使其達到β-摺疊的最終狀態。以上兩種形式的裝配的疏水蛋白都具有兩親性的性質，並可以用TFA解離，TFA使蛋白質解摺疊。在除去溶劑和溶於水後，I類疏水蛋白可以重新摺疊成與純化前或TFA處理前同樣的單體結構。然而，即使通過TFA使膜解離之後，II類疏水蛋白的自裝配和解裝配依然可反覆進行。這說明兩類疏水蛋白對這類處理都具高度的耐受力。I類疏水蛋白的膜特徵在於5-12nm寬的平行棒狀束圖案。相反，在裝配的Claviceps fusiformis的II類疏水蛋白CFTH1、板慄疫病菌的II類疏水蛋白CRP和裡氏木黴(Trichoderma reesei)的II類疏水蛋白HFB1和HFB2的表面上卻並未發現這樣的棒結構。這些棒結構的存在與否或者是棒直徑的不同對它們功能的影響程度目前還不清楚。I類疏水蛋白所具有的棒狀結構，如群交裂褶菌的SC3和SC4，都與由澱粉樣蛋白形成的纖維很相似。它們由兩道直徑約為2.5nm的2-3根原纖維組成，含有高度的β-摺疊結構，可以與螢光染料Thioflavine T(ThT)和剛果紅相互作用。這些染料都可以作為探針來區別α-螺旋狀態和β-摺疊狀態，兩種染料對β-摺疊狀態的染色都具有極高的傾向性，而對α-螺旋狀態或可溶的疏水蛋白樣物質卻不反應或很少反應。另外，通過中間物及超過臨界濃度，SC3和澱粉樣蛋白都會自裝配。這提示對即使不是全部，也是很多多肽鏈而言，澱粉樣纖維的形成是共有的。然而，因為澱粉樣纖維的形成往往伴隨著功能的喪失甚至是疾病(如阿耳茨海默症)，進化上並不會採取形成這種纖維的傾向。然而，一或兩個蛋白質上的突變就足以顯著增加形成澱粉樣纖維的傾向。就我們的知識而言，疏水蛋白是第一個有功能的纖維樣蛋白的實例，其在真菌的發育過程中具有多種功能。最近發現SC3疏水蛋白中的四個二硫鍵的主要作用是在缺乏親水-疏水界面時防止蛋白質形成澱粉樣結構。當二硫鍵被還原及巰基被碘乙醯胺封閉時，蛋白就會自發地在水中進行裝配。於是其結構與在水-空氣界面上裝配的天然SC3的就不能區別開。顯然，疏水蛋白的二硫鍵使得單體在水中可溶(如在細胞內或在培養基中)，並阻止過早的(precocious)自裝配。這可以解釋為什麼自然界中大多數疏水蛋白都具有八個保守的半胱氨酸殘基。疏水蛋白屬於最具有表面活性的分子。在50μg/ml-1時，SC3最大能將水的表面張力從72mJ m-2降低到24mJ m-2，由此SC3是已知最具有表面活性的蛋白。其它的疏水蛋白也具有很高的表面活性。它們的表面降低活性(surface-loweringactivity)至少與傳統的生物表面活性劑相似。與這些表面活性劑不同，表面活性僅由胺基酸序列引起，而不依賴於脂質綴合物。而且，通過傳統的表面活性劑在數秒內最大降低表面張力，而採用I類疏水蛋白時需要數小時的時間。這是因為伴隨著分子內構象變化的自組裝之後，疏水蛋白可以降低水的表面張力。
儘管疏水蛋白具有相當多的種類，但是它們的主要性質都是相似的。它們的適應性可見下述事實通過遺傳工程除去SC3疏水蛋白第一個半胱氨酸殘基之前31個胺基酸中的25個，所獲得的截短的SC3僅會影響裝配好的疏水蛋白親水面的可溼性(wettability)。最具有特點的疏水蛋白是C.fusiformis的三疏水蛋白(trihydrophobin)CFTH1。它含有三個II類疏水蛋白樣單位，每一個之前都具有富含Gly-Asn的重複，並仍然具有和其它II類疏水蛋白一樣的作用。因為疏水蛋白可以通過在界面上自裝配形成兩親性蛋白膜，所以疏水蛋白可以改變表面的可溼性。
如述，一種測量可溼性的方法是估計或測量一滴水與該表面的接觸角。大接觸角(＞90°)說明是疏水的，小接觸角(＜90°)說明是親水表面。而且，在氣/液和液/液體系中，比如劇烈搖晃的水或者是水包油或油包水分散體系，疏水蛋白溶液中的氣泡或油滴可以包被上一層兩親性膜使之穩定。固/液界面也示出相同的穩定作用，例如將一個疏水的塑料如特氟隆薄片(接觸角110°)浸入疏水蛋白中，其會被包被一層具有強烈粘附蛋白的膜，其使得表面完全可溼(接觸角48°)，即使在經過SDS處理後(接觸角62°)，而且疏水蛋白單體從一個親水的表面上乾燥脫離下來，將使得該表面成為疏水性的。
典型的疏水蛋白是i)典型地從如群交裂褶菌等真菌中分離得到的(參考文獻8)，但現在也可以重組製備；或ii)具有與至少一種多肽至少具有40％的相同性和至少5％的相似性的多肽，所述至少一種多肽選自i)SEQ ID NO.1的29-131位胺基酸和ii)SEQ ID NO.2的29-133位胺基酸。這樣的蛋白可以來自絲狀細菌，特別是可形成氣生菌絲的細菌，如放線菌，更特別地，絲狀細菌可以是鏈黴菌。可以從中通過採用標準方法分離疏水蛋白的鏈黴菌是一種轉化了可以從大腸桿菌(E.coli)菌株中分離的構建體的鏈黴菌，其於2000年3月14日保藏在Centraalbureau voor Schimmelcultures(Oosterstraat 1，P.O.Box 273，3740 AG B aarn，the Netherlands)，其保藏號為CBS102638。見於PCT/NL01/00268。Scholtmeijer等(Appl.Environm.Microbiol.68(3)，pp.1367-1373，2002)曾採用疏水蛋白和纖連蛋白的細胞結合結構域的融合蛋白來為疏水蛋白層提供活性化合物(reactivecompound)。
如果不採用融合蛋白，就只可能通過共價偶聯的方式為疏水蛋白層提供活性化合物。考慮到甘露糖是已知疏水蛋白唯一的糖基化形式，它也就成為和疏水蛋白進行共價交聯的靶位置。特別是Wessels等人(Advances in Microbial Physiology，38，pp.1-45(1997))建議通過共價結合為疏水蛋白層附著小配體，或者是將氨基與甘露糖殘基的醛基偶聯(p.35)。那個例子涉及到在金表面上將一種蛋白質偶聯到疏水蛋白層上。除此之外，Scholtmeijer等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.56，pp.1-8，2001)建議將疏水蛋白和活性化合物，或是作為替代物的融合蛋白進行化學交聯。然而，對某些活性化合物來說，如果不破壞活性化合物的功能性，要將這些化合物與疏水蛋白進行交聯或融合是不可能的。
而且，Bilewicz等人在J.Phys.Chem.B 2001，105，9772-9777，2001年8月，描述過一種方法，可以採用小的電活性化合物Q10，偶氮苯或Q0對電極表面進行功能化，說明疏水蛋白HYPDPt-1可以作為分子膠，或者是根據電活性分子的結構作為它們的基質(matrix)。然而，仍需要提供活性化合物給疏水蛋白層的方法，所述化合物對其發揮生物學功能而依賴的結構的變化敏感。
本發明提供了這樣一種提供活性化合物而非小分子電活性化合物給某種物體表面的方法，該方法包括如下步驟用疏水蛋白樣物質包被至少一部分上述表面，並將所述化合物與包被的疏水蛋白樣物質接觸以形成一種塗層，所述塗層包含非共價結合形式的或者至少與疏水蛋白非共價結合的所述化合物。在這裡定義的小分子電活性化合物是可以在氧化狀態，即氧化還原反應中發生改變的化合物，而且它的分子量要小於疏水蛋白的分子量，特別地分子量要小於2000道爾頓，更特別地小於1000道爾頓。在這裡定義的活性化合物包括蛋白質(包括肽和糖蛋白)和核酸。
在此，本發明提供了一個方法，其中第一個(非共價附著的)活性化合物包括例如蛋白質物質，如肽，但更有利的是一種具有比已知疏水蛋白分子量(15kD)更高分子量的多肽，所述多肽仍舊非共價地附著於所述塗層且基本上未失去反應性。令人驚奇的是，通過將所述表面浸入包含所述化合物的溶液就能將這種化合物基本上非共價地附著到表面上，從而優選保留所述化合物的反應性，如酶活性或與配體或抗原結合的傾向性。共價偶聯被傳統地認為主要與糖基化疏水蛋白的存在相關，現在認為當該塗層基本上不含進行這種共價偶聯所需的甘露糖殘基時，所述表面也可以具有更大的分子。這促使使用其它疏水蛋白樣物質包被較大分子附著的物體表面。常規使用SC3，其在自然狀態下具有一個包含糖基化殘基的N端，也可以採用非糖基化物質，如沒有所述糖基化N端的trSC3(截短的SC3)，還可以採用其它具有兩親性蛋白質特性的疏水蛋白樣物質，例如不是所有經典保守半胱氨酸殘基均處於各自位置並能夠提供具有親水朝向的疏水表面的物質，反之亦然。
在一個實施方案中，本發明提供了這樣一個物體，它有至少一部分表面具有兩親性疏水蛋白樣塗層(膜)，其中所述塗層額外具有一種非小分子電活性化合物的活性化合物。令人驚奇的是，發現該活性化合物具有比例如Q10，偶氮苯和Q0大的多的分子量，現在對分子量(MW)大於1千道爾頓(kD)，優選大於2kD，更優選大於15kD，更優選大於50kD的活性化合物可以提供非共價結合。而且，當該塗層基本上不含甘露糖殘基時也具有結合，從而可以結合肽、多肽或者其它蛋白質物質而無需共價交聯到甘露糖殘基，使得有更多的疏水蛋白樣物質可以與活性物質結合而不僅僅是經典已知的糖基化疏水蛋白。如上所述，這樣的結合現在允許酶、受體、抗體、結合分子本身和其它活性蛋白質的結合(或者對核酸而言的雜交)不被其(二級或三級結構)構象限制所阻礙(而這種構象限制的阻礙在傳統的交聯過程中經常碰到)，因此可以保持其完整的反應性。固定化蛋白質，如酶或抗體的優越性在於隨時間的穩定性延長以及觀察到對高溫以及更極端pH值的穩定性增加。
在另一個實例中，一個物體優選包含進行例如基因表達分析的基因晶片或DNA(或RNA或PNA)陣列，其中所述活性化合物包含核酸。非共價結合於所述疏水蛋白樣塗層上的核酸可以用來改進雜交方案。
大體上，本發明提供了具有一種表面的物體，所述表面包含疏水/親水性界面，還包含非小分子電活性化合物的活性化合物，這樣的表面可以包括液/液界面，如油/水界面；也包括固/液界面，如固/水界面，或甚至固/固界面，尤其是其中第一個固體包含疏水性表面，而第二個固體包含親水性表面。本發明提供了獲得一種物體的方法，所述物體在所述界面的至少部分表面具有兩親性疏水蛋白樣塗層，其中所述塗層額外具有活性化合物，使得所述化合物保持反應性，即穩定和有活性，甚至可以在基本上無水或甚至是在包被表面完全乾燥的條件下延長儲存時間，該方法包括如下步驟將所述物體與疏水蛋白樣化合物的溶液接觸以獲得一個包被物體，將所述包被物體與含有至少一種活性化合物的溶液接觸，在適於包被所述表面和將所述活性化合物附著到所述塗層的條件下進行。使用疏水蛋白樣物質的一大優越性是它可以被大量地廉價地生產。疏水蛋白樣物質也可以從自然界分離得到，或者根據Wessels和Wsten等人(Wessels，J.G.，1997，A dv.Microb.Physiol 381-45；Wosten，H.A.B.et al.，1993，The Plant Cell 51567-1574)及其修飾方法通過遺傳修飾的生物體並純化獲得。使用前，冷凍乾燥的疏水蛋白樣物質可以用純TFA解裝配，再用液氮或在空氣中過濾乾燥。單體蛋白可溶解於如50mM磷酸緩衝液或水溶液中。
如前所述，疏水蛋白是真菌分泌的最豐富的蛋白質之一。由於裝配的膜的穩定性，I類疏水蛋白最有應用的希望。這類疏水蛋白在擔子菌的培養基中特別豐富。比如，可以計算出，在生長了4天的群交裂褶菌的培養基中，大約有15％的整合入蛋白質的35S都合成SC3疏水蛋白，基於該蛋白特別的性質，通過簡單的程序從每升培養基中可以輕鬆地純化20mg的SC3，在疏水/親水性界面浸漬可以積聚疏水蛋白樣物質。株系選擇，選擇產生遺傳修飾的疏水蛋白的株系和優化培養條件以及分子遺傳方法，如增加基因劑量和在發酵工業中常用真菌中進行異源生產都可以進一步提高產量。另一個方面，針對某些應用所需的量通常很少。從自然界製造了一種「昂貴的」產物作為改變表面的可溼性的蛋白質來看，就可以容易理解這個問題。事實上，裝配的兩親性膜真正性質需要其以單層存在。用單層的疏水蛋白樣物質包被的表面不僅可以用單一的單層包被，還可以用多個單層所述物質包被。這種單層膜的厚度僅大約為10nm，因此需要極少量的疏水蛋白就可以顯著改變可溼性。例如，從吸附到特氟隆上的SC3分子數中，就能計算出大約1.5mg的SC3疏水蛋白就足夠包被1m2的特氟隆表面，使得該表面的疏水程度從110°降低到48°水接觸角。
從大自然學到的另外重要一課是真菌產生不同的疏水蛋白以作為不同的目的。比如，在群交裂褶菌中，SC3膜是包被氣生菌絲並為這些結構提供了水排斥特性(water-repellent property)，而在子實體的氣道中則排列著SC4疏水蛋白。人們懷疑是否這些膜的生物物理學性質的不同導致了不同的功能，尤其是因為來自於眾多不同物種的疏水蛋白可能比同一個物種的不同疏水蛋白更加密切相關。在為特定目的使用遺傳工程加工疏水蛋白前，這是一個在仿生學上需要認真考慮的一點。
為此，本發明的具有包被的表面的物體發現可以在組織工程中應用，尤其是用於包被疏水性表面以增加它的生物相容性。已指出，疏水蛋白膜與疏水性表面的附著非常牢固，而且顯著地改變了表面可溼性。例如，本發明的具有包被的表面的物體還發現可以應用於提高改善醫學植入物的生物相容性，所述醫學植入物包括人造血管和外科手術器械。而且，如疏水性固體或液體(油)的物體也可以通過用疏水蛋白包被之後分散在水中。用疏水蛋白膜包被的油小泡(oil vesicle)可以例如用來運送親脂性藥物。簡單的說，用劇烈改變表面性質的非常薄的層(大約10nm)包被表面的疏水蛋白的性質使其可以用於納米技術。開始時，單體形式是最水溶性的，然而與裝配狀態(α-螺旋狀態或者β-摺疊狀態)不同，在溶液中可以發現一些四聚體。裝配可以在很大的溫度範圍內進行，然而為包含活性化合物，應該根據這樣的活性化合物熱降解的個體敏感性進行。例如，大多數酶在超過50℃後會變得不穩定；然而，也可以使用熱穩定酶。一般來說，包被隨時間改善，於是一般都是用大約16小時(即過夜)來包被一個表面。然而，根據溶液中單體的濃度，疏水蛋白包被30秒以後就已經發生。如果通過所述化合物的自裝配所述溶液能夠在所述物體的表面上形成上述單層，就獲得了充分的包被。這樣的溶液在每毫升中含有至少100ng，更好是1mg，優選2mg，更優選20-100mg的疏水蛋白樣化合物。從本質上來說，過量通常只會加速包被而不會改善包被。優選一種方法，其中在將所述包被的物體和所述活性化合物接觸之前，用疏水蛋白樣物質預處理所述包被的物體。還優選選擇預處理，其包括將所述包被的物體和去汙劑溶液接觸，如Tween 20(Polysorbate 20)，NP40(Nonidet P-40)或SDS溶液。在用疏水蛋白包被之後，優選在30-80℃在所述溶液中加熱所述包被的物體。或者，可以選擇α-螺旋狀態或者是β-摺疊狀態。
本發明還提供了一種方法，其中在固定活性化合物之後，物體用兩親性疏水蛋白樣化合物固定，至少80％，更好90％或優選99％的α-螺旋狀態，因而為陣列系統提供了一種封閉方法。這樣，本發明提供了一種獲得某種物體的方法，如用於探測核酸(DNA，RNA或PNA)的陣列系統，或者用於免疫分析的分析系統(ELISA板，或者是其它如在抗原抗體之間發生的結合相互作用的表面)，其至少部分表面具有活性化合物，其中所述表面額外具有兩親性疏水蛋白樣包被。這樣的封閉由疏水蛋白樣包被組成，其主要呈α-螺旋狀態。本發明也提供了在此所述的在對物體表面進行包被的方法的應用。所述表面可以是簡單的直線或是複雜的曲面，可以在物體內部也可以在外部。例如，可以通過排列具有本發明的活性化合物的疏水蛋白樣物質的毛細管來調節小管(small tube)、微球體或微海綿的毛細管活性。
在此特別提供了具有蛋白質性質的活性分子的物體表面，這些分子可包括傳統的(多/單克隆)或合成抗體或其片段，如Fab或單鏈抗體或者是其它結合分子(任選還可以包括酶，如過氧化物酶或者螢光基團)，酶，如葡萄糖氧化酶，膽固醇氧化酶，或者是過氧化物酶，或者是本文詳細描述中的單加氧酶，或是鹼性磷酸酶，螢光素酶，酯酶，脂肪酶，或胰蛋白酶，或酶組合，用來測量配體相互作用的受體，光受體或集光複合體，及其組合等。共價結合往往導致反應性的喪失，這些化合物結合本專利的方法可以尤其基本上保持它們對配體、抗原、底物等的反應性，可能是因為它們與包被之間的鍵是非共價的。這樣的反應性可以例如通過表面等離子共振(surface plasmonresonance，SPR，也稱為BIACORE傳感系統)測量，它可以不使用標記而對分子間相互作用進行實時的靈敏檢測。對金物體表面(疏水的)用疏水蛋白溶液包被只需要溫育一會兒即可(一般來說，半小時就足夠了)。然後表面用水清洗以去處任何未結合的疏水蛋白。表面可以用去汙劑處理以獲得β摺疊狀態包被。表面可以直接用於結合小分子(如泛醌)、肽、蛋白質、酶、脂質、核酸等。質量的增加可以被檢測而且是一種定量測定結合到用疏水蛋白包被的一定表面區域的物質量的手段。
本發明也提供了具有一種表面的物體，所述表面可以用來檢測特異的分子間相互作用，比如，在展示技術或ELISA類型的分析中檢測抗原-抗體的相互作用，或者檢測核酸與核酸之間的相互作用，可以是DNA、RNA或PNA。疏水蛋白的兩親性性質使得其成為理想的封閉試劑。用疏水蛋白樣物質包被疏水表面降低了疏水表面「粘性」，從而降低了疏水化合物和疏水區域的α-特異性結合。這將有助於改善如此的檢測方法。本發明提供了具有一種表面的物體，所述表面至少一部分具有活性化合物，其中所述表面還額外具有疏水蛋白樣化合物以降低與所述表面不必要的α-特異性相互作用。在優選的實施方案中，一個固體支持物表面，如ELISA板，用抗體進行包被之後再用疏水蛋白單體的溶液進行處理，使得該化合物的反應性基本保持不變，並降低所述表面的α-特異結合性。特別地，化合物是一種疏水性化合物或含有疏水性錨的化合物。這樣的化合物在疏水蛋白包被中是最穩定保持的一類化合物。認為平面疏水性化合物或錨都是有利的。本申請中術語「錨」指該化合物中的一部分，所述部分具有沒有親水性基團的一側和/或部分。認為正和/或負電荷的缺少或者降低是有利的。如果存在電荷，優選來自弱酸性或鹼性基團，其可以釋放或者接受一個氫離子來消除電荷。
本發明將在此進一步通過實施例進行詳細的描述。
發明詳述1、葡萄糖氧化酶在玻璃碳電極上的固定化通過將電極置於疏水蛋白(100μg/ml)的溶液中溫育15分鐘而將玻璃碳電極(glassy carbon electrode)用疏水蛋白包被，然後用水徹底衝洗電極。隨後，將包被的電極浸入含有葡萄糖氧化酶(SIGMA210,000單位/g固體，終濃度為1.8mg/ml)的溶液中2小時，然後用水衝洗。
將用酶修飾和功能化的電極置於一個三電極系統(three electrodesystem)中，所述系統包括Ag/AgCl參比電極和Pt計數電極(counterelectrode)，使用pH7(25mM)的磷酸緩衝液。當加入葡萄糖時，固定化的葡萄糖氧化酶催化反應形成過氧化氫，其可以被檢測到小電流，該電流與葡萄糖濃度成正比。在疏水蛋白層中固定化的葡萄糖氧化酶還保持活性。將修飾電極於4℃保存在密封容器中，而不是保存於液體中，並且頻繁測試其對葡萄糖的活性和反應。在67天的測試期中，該電極具有活性，並沒有受到頻繁測試的影響。
2、膽固醇氧化酶在玻璃碳電極上的固定化通過將電極置於疏水蛋白(100μg/ml)的溶液中溫育15分鐘將玻璃碳電極用疏水蛋白包被，然後用水充分衝洗電極。隨後，將包被的電極浸入含有膽固醇氧化酶(2mg/ml)的溶液中2小時，然後用水衝洗。將用酶(膽固醇氧化酶0.5U/ml)修飾和功能化的電極置於一個三電極系統中，所述系統包括Ag/AgCl參比電極和Pt計數電極，使用pH7(25mM)的磷酸緩衝液作為電解質。為克服膽固醇在水中的低溶解性，膽固醇溶解於含有異丙醇和Triton的磷酸緩衝液中(Ropers，M-H.et al.，2001，Phys.Chem.Chem.Phys.3240-245)。
在加入膽固醇後，固定化的膽固醇氧化酶催化反應形成過氧化氫。過氧化氫可以在電極上形成可檢測到的小電流，該電流與所加入的膽固醇濃度相關。本實施例證明了膽固醇氧化酶的固定化，而且其依然有活性。
3、葡萄糖氧化酶和過氧化物酶的固定化除了可以在電極表面進行固定化之外，葡萄糖氧化酶還可以在包被的特氟隆(聚四氟乙烯，PTEE)薄片上固定化。包被是在25℃在3ml玻璃管中將特氟隆薄片在2ml的100μg/ml的疏水蛋白溶液(在這裡對SC3，trSC3和SC4進行了分別的實驗)中溫育15分鐘來完成的。這些薄片隨後從疏水蛋白溶液中取出並用大量水洗以去除所有未結合的疏水蛋白。葡萄糖氧化酶的固定化是將這些包被的特氟隆薄片於葡萄糖氧化酶(1mg/ml)的溶液中溫育2小時，然後用水衝洗。
固定化葡萄糖氧化酶的存在與活性是通過將經過處理的特氟隆薄片在含有過氧化氫酶(1520單位/mg，SIGMA；濃度0.4mg/ml)和鄰聯茴香胺(終濃度68μg/ml)的溶液中溫育而測試的，其在氧化時在435nm出現吸收峰並顯色。添加葡萄糖後，在435nm觀測到吸收，其表明過氧化物酶氧化鄰聯茴香胺。鄰聯茴香胺的氧化直接與由葡萄糖氧化酶形成的過氧化氫量相關，因而與葡萄糖濃度相關。
或者，將過氧化物酶固定於特氟隆上，而將葡萄糖氧化酶添加到溶液中。溶液在添加了葡萄糖後的顯色也證明了固定化的過氧化物酶的活性。
或者，將葡萄糖氧化酶固定於特氟隆薄片，而將過氧化物酶固定於另一個特氟隆薄片。將兩片都置於含有鄰聯茴香胺的容器中，在添加葡萄糖後溶液顯色。這證明可以固定化多種可以催化多步反應的酶。將包被的和功能化的特氟隆除去就足以終止反應，說明這些酶並沒有從表面上去吸附。功能化的特氟隆薄片在4℃下保存幾星期後依然有活性。
4、不同種酶在特氟隆表面的固定化通過SC3疏水蛋白將氧化還原酶(葡萄糖氧化酶，過氧化物酶，漆酶)、水解酶(脂肪酶，酯酶)和蛋白酶(胰蛋白酶)在特氟隆上固定。首先將表面通過浸入到所述蛋白水溶液(0.3mg/ml)中大約30分鐘進行包被。隨後將獲得的修飾表面再次浸入到酶的水溶液中約30分鐘。在每步之後，特氟隆表面都要用足夠的緩衝液衝洗。在將功能化表面浸入到相應底物的溶液中之後，固定化酶的活性通過分光光度計在412nm和435nm進行測定。這些溶液的光密度值在這些功能化表面浸入後升高，在移出後保持不變。這些實驗示出固定化酶並沒有變性和從表面上去吸附。功能化特氟隆於4℃儲存於含有緩衝溶液的Eppendorf管中。幾星期後，不同的表面依然是功能化的。
所採用的酶來自於黑麴黴(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶(SIGMA；210U/mg固體，終濃度1.0mg/mL)，辣根過氧化物酶(SIGMA；1520U/mg固體，終濃度0.14mg/mL)，來自Trametes sp.的漆酶(Biocatalysts，Wales；終濃度2.1mg/mL)，來自Candidacylindracea的脂肪酶(Biocatalysts，Wales，終濃度0.25mg/mL)，豬肝酯酶(SIGMA；41U/mg固體，終濃度2.4mg/mL)，牛胰胰蛋白酶(SIGMA；8,750U/mg固體)。
底物在pH7葡萄糖用於葡萄糖氧化酶；在milli-Q水中鄰聯茴香胺用於過氧化物酶和漆酶；在pH7.7對硝基苯辛酸(p-nytrophenyl-caprylate)用於脂肪酶；在pH7.7對硝基苯乙酸用於酯酶以及N-α-苯甲醯基-d，l-精氨酸對硝基醯苯胺鹽酸(N-α-benzoyl-d，l-arginine p-nitroanilide hydrochloride)用於胰蛋白酶。
5、抗體和第二種酶的固定化包被有疏水蛋白的特氟隆薄片如上述製備。特氟隆薄片在25℃在100μg/ml的含有等摩爾量的葡萄糖氧化酶抗體和過氧化物酶或僅含有過氧化物酶的溶液中溫育2小時。將聚有固定化抗體和/或過氧化物酶的疏水蛋白包被的特氟隆薄片用水認真清洗以去除所有未結合的蛋白。將這些薄片在4℃在不同濃度(很稀)的葡萄糖氧化酶溶液中溫育1小時。然後將這些薄片用水清洗以去除沒有結合的酶，並將薄片置於含有1ml過氧化物酶活性溶液(4-氨基比林(4-aminophenazone)和酚)的1.5ml比色皿中(與光路平行)。反應從向比色皿中加入葡萄糖儲存溶液開始，之後在515nm處顯色。
沒有葡萄糖氧化酶抗體的特氟隆薄片在與低濃度葡萄糖氧化酶溫育後，幾乎未示出任何葡萄糖的轉化，而具有固定化葡萄糖氧化酶抗體的特氟隆薄片在與同樣低濃度葡萄糖氧化酶溫育後卻示出極高的活性。這個實例說明在疏水蛋白層上的固定化抗體可以用來在傳感器表面上從高度稀釋的樣品中富集某一種酶。
6、抗體的固定化在酶標板的孔中加入疏水蛋白溶液(100μg/ml)溫育15分鐘後用水充分清洗。然後將含有Oregon green488山羊抗兔抗體(O6381，Molecular Probes)(Ab1)的溶液加入孔中。溫育15分鐘後將其倒空並用水充分清洗。抗體的固定是根據Oregon green標記抗體供應商提供的方案通過螢光分析並與未包被孔的螢光(吸收/發射最大波長～496/524nm)比較。抗體Ab1固定化的飽和度是由抗體Ab1濃度滴定和螢光強度來研究的。
固定化抗體與包被表面相結合的效果是通過對其它兩種抗體來研究的，一種是不與Ab1相互作用的Ab2a，另一種是與Ab1相互作用的Ab2b。為了避免Ab2直接在疏水蛋白包被上固定化，如上述處理孔並使用具有最大量的固定化抗體Ab1的孔。加入含有不同濃度抗體Ab2a和抗體Ab2b的溶液並在溫育15分鐘後去除，並清洗孔。抗體Ab2a和抗體Ab2b與Ab1相比具有不同的吸收/發射最大波長，從而可以獨立於Ab1而通過螢光檢測。
或者，如上述將抗綠色螢光蛋白(GFP)的Living ColorsTM抗體固定於疏水蛋白包被的孔中。在孔中加入GFP並溫育15分鐘。在充分清洗後這些小孔還保持有螢光，說明固定化的(非螢光)抗體保持了其與GFP結合的能力。陰性對照是疏水蛋白包被的孔，用前述Oregon green 488山羊抗兔抗體處理，其不會固定化GFP。
或者，如上述，將抗半乳糖苷酶抗體固定於疏水蛋白包被，並加入β-半乳糖苷酶。在充分清洗之後，酶活性通過加入X-gal來測試。陰性對照是疏水蛋白包被的孔，用前述Oregon green 4山羊抗兔抗體處理，其不會固定化半乳糖苷酶。
疏水蛋白SC3存在的效果通過將孔與疏水蛋白SC3，SDS在80℃與溫育1小時後來研究。並進行了上述同樣的實驗。同樣地，通過滴定抗體Ab1和額外的疏水蛋白SC3單體的量研究了加入單體疏水蛋白的阻斷效果。根據標準的ELISA方法，進行了同樣的實驗，說明通過疏水蛋白進行的非共價固定化效果更加敏感和方便。標準的ELISA方法由如下步驟組成固定化100μl抗半乳糖苷酶抗體(10μg/ml的10mM pH7.2磷酸緩衝液)，室溫溫育3小時。之後倒空酶標板並拍幹殘留液體。用0.1M含有1M NaCl，0.02％(w)Tween-20的磷酸緩衝液，pH7.2洗5次。加入300μl封閉液(BSA，脫脂牛奶和酪蛋白都經過測試)溫育15分鐘。倒空孔，拍幹，洗3次。封閉之後，將不同濃度的β-半乳糖苷酶混合物加入到不同的孔中。清洗之後，如前述測定孔的β-半乳糖苷酶活性。這個方法可以與在疏水蛋白包被的孔中抗半乳糖苷酶抗體的固定化相比較。β-半乳糖苷酶低濃度敏感性則可以和ELISA方法比較。
7、疏水蛋白的封閉效果本發明還提供了一種物體，其具有可以用來檢測特異的分子結合作用的表面，比如在展示技術中或是在ELISA類型分析中檢測抗原-抗體相互作用；或是檢測核酸-核酸相互作用，如DNA，RNA或PNA。疏水蛋白的兩親性特性使得它可以理想的封閉劑。用疏水蛋白樣物質包被疏水表面可以降低該疏水表面的「粘性」，從而減少疏水性化合物與疏水性區域的α-特異性結合。這將改良這種檢測方法。本發明提供了一種物體，它至少一部分表面具有活性化合物，其中所述表面還具有疏水蛋白樣化合物以降低與所述表面不必要的α-特異性相互作用。在優選的實施方案中，某種固體支持物表面，例如ELISA酶標板，由一種抗體包被，之後該表面進一步用單體疏水蛋白溶液處理，保留了該化合物的反應性基本不變並降低該表面的α-特異性結合性質。我們將標準的ELISA分析稍作修飾，將已知的封閉劑如BSA，脫脂牛奶，酪蛋白和明膠與疏水蛋白的封閉性質進行了比較ELISA酶標板的孔用包被液處理，所述包被液含有pH7.2的10mM磷酸緩衝液和10μg/ml抗半乳糖苷酶抗體，室溫溫育1小時，然後拍幹液體而倒空孔。用含有1M NaCl、pH7.2的0.1M磷酸緩衝液洗5次。通過加入幾種濃度的BSA、脫脂牛奶、酪蛋白和單體疏水蛋白，溫育15分鐘進行封閉，隨後拍幹液體倒空孔並洗3次。封閉後，將不同濃度和比例的β-半乳糖苷酶和GFP加入不同孔中，濃度範圍介於β-半乳糖苷酶∶GFP為1000∶1到GFP∶β-半乳糖苷酶為1000∶1。用含有1M NaCl+0.02％(v/v)Tween-20的0.1M磷酸緩衝液洗5次。清洗之後通過螢光分析測試孔的GFP，表明如前述α特異結合和β-半乳糖苷酶活性以測試感興趣蛋白的結合。GFP的存在和β-半乳糖苷酶可以用封閉類型比較，說明疏水蛋白的極好封閉能力。
8、通過非共價結合配體進行的靶向通過遺傳工程構建，疏水蛋白被認為是多樣的，可以形成疏水蛋白和配體的融合蛋白。或者，融合可以在翻譯後發生，如通過交聯。本實例描述了與疏水蛋白非共價結合的配體，其甚至可以進一步增加疏水蛋白的多能性和易用性。
如Scholtmeijer等(Scholtmeijer，K.，et al.，2002，A ppl.Environ.Microbiol 681367-1373)所述用未修飾的疏水蛋白的修飾方法進行實驗，所述疏水蛋白在裝配後與含有RGD肽的溶液溫育。如述進行成纖維細胞的生長和活性測定和其餘樣品的測定。重要地，如述用疏水蛋白包被特氟隆薄片並與含有包含RGD(RGD肽)的胺基酸序列的多肽的溶液接觸以在包被表面固定化含有RGD的肽。以7500細胞/cm2將成纖維細胞(細胞系L292，來源於小鼠肺泡脂肪組織)接種於24孔板，其中已經放置了包被的或裸露的特氟隆薄片，以及含有添加了10％胎牛血清、1×104u ml-1的青黴素、1×104u ml-1鏈黴素和穀氨醯胺溶液(1∶100；Gibco BRL USA)的RPMI 1640培養基。在陽性對照中，成纖維細胞在不含有特氟隆薄片的情況下生長。生長情況分別在24、48、72和96小時評價。在顯微鏡下對在不同表面上觀察培養物的鋪滿來評價生物相容性。結果表明，含有RGD肽的非共價固定化可以用來產生一種修飾的表面，這種改造導致增加的生物相容性。其結果說明非共價相互作用也能用於產生一種修飾的表面。
或者，如Wosten等(Wosten，H.A.B.et al.，1994，EMBO J.135848-5854)所述製備疏水蛋白小泡，使用如Wang等(Wang，X.et al.，2002，Prot.Science.111172-1181)所述用丹醯化標記的trSC3檢測螢光。疏水蛋白小泡在含有RGD肽的溶液中溫育，洗滌，然後與成纖維細胞溫育。在將成纖維細胞從未結合的疏水蛋白小泡中分離後，細胞級分中的小泡可由螢光測定，並與沒有結合RGD序列的對照疏水蛋白小泡比較。
9、酯酶、脂肪酶和胰蛋白酶的固定化在3ml玻璃管中，將膠狀特氟隆(150nm)和特氟隆薄片，聚乙烯薄片和玻璃薄片(0.8×2.5cm)在25℃於2ml的100μg/ml疏水蛋白溶液中(可以是SC3，trSC3或SC4中的任何一種)溫育，時間從10分鐘到16小時不等。將這些薄片從疏水蛋白溶液中取出，立即用大量水衝洗以去除任何未結合的疏水蛋白(5×50ml水，5分鐘)；這些包被被認為是α-螺旋狀態；部分薄片在2％SDS溶液中煮沸10分鐘，然後將薄片用水充分清洗；這些包被被認為是β-摺疊狀態。膠狀特氟隆通過溫和的離心來收集(2000rpm，2分鐘)，將上清液去除，用2ml純水重懸特氟隆沉澱並再次離心。如此用水將特氟隆沉澱洗5次以去除所有未結合的疏水蛋白。
在3ml玻璃管中，將裸露和疏水蛋白包被的薄片(α-螺旋狀態和β-摺疊狀態)置於2ml的酶溶液中在25℃溫育2小時。所用的酶溶液為100μg/ml的60KD酯酶(豬肝)，40KD脂肪酶(小麥胚乳)或25KD胰蛋白酶(牛胰)。隨後這些薄片用水徹底清洗以去除所有未結合的酶。
將這些具有和不具有固定化酶的薄片用來進行顯色分析。在1.5ml的比色皿中加入1ml 5mM4-硝基苯乙酸溶液(酯酶底物)，5mM的Nα-苯甲醯基-DL精氨酸對硝基苯胺(胰蛋白酶底物)，或在適當緩衝液中標記的5mM的1，2-二-O-癸醯基外消旋甘油-3-戊二酸-試滷靈(1，2-di-O-decanoyl-rac-glycero-3-glutaric acid-resorufin)。將比色皿放入分光光度計中，通過將具有或無固定化酶的疏水蛋白包被薄片放入與光路平行的比色皿時開始反應。隨後隨時間在適當波長出現光吸收。溫育1小時後，將這些薄片從比色皿中取出，比色皿繼續反應24小時。薄片用水清洗後轉移到另一個含有新鮮底物的新比色皿中再次反應。薄片1天中在新鮮底物中溫育3次，在1天後，1周後和1月後通過測定薄片活性和在從混合物中移走薄片後的剩餘活性來確定包被的穩定性。結果表明酯酶、脂肪酶和胰蛋白酶都可以以α-螺旋狀態和β-摺疊狀態附著於裸露的薄片和疏水蛋白包被的薄片上。然而，附著於裸露薄片上的酶是沒有活性的，但附著於疏水蛋白包被薄片上的酶不但具有活性，而且可以在4℃在緩衝液中或乾燥條件下穩定直至1個月。將薄片從底物溶液中取出後，反應完全停止，說明固定化的酯酶、脂肪酶和胰蛋白酶牢固附著於薄片上。採用圓二色譜測定法，包被了疏水蛋白的膠狀特氟隆用於葡萄糖氧化酶、酯酶、脂肪酶和胰蛋白酶的結合實驗。400ul的100μg/ml的上述酶溶液被加入到1mm比色皿中，在190和250nm記錄圓二色譜。向這樣的溶液中加入升高濃度的純膠狀特氟隆和疏水蛋白包被的特氟隆並通過記錄CD光譜了解變化。通過具有和沒有特氟隆的可溶酶的CD光譜的差異判斷酯酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶和胰蛋白酶在與裸露的特氟隆結合時都發生了結構變化。當用疏水蛋白包被的特氟隆加入到酶溶液中時，CD信號變化並不明顯(在與疏水蛋白信號進行校正以後)。而且通過離心膠狀特氟隆部分酶會從溶液中去除，說明這些酶固定在特氟隆球上。更進一步，油滴也可以用疏水蛋白來包被。在3ml水中通過超聲乳化100μl油(礦物油或石蠟油)，再加入3ml疏水蛋白(200μg/ml)水溶液來包被油滴。或者可以將油直接在疏水蛋白溶液中乳化再加入3ml。在室溫或者在60℃在含有0.02％NaN3時放置過夜後，乳狀液在10,000g離心30分鐘，並用水通過離心將油滴洗4次以去除可溶性疏水蛋白。然後將裝配的疏水蛋白的油滴重懸於小體積水中(總體積200μl)。
20μl疏水蛋白包被的油滴在1ml的100μg/ml酯酶、脂肪酶和胰蛋白酶溶液中在25℃溫育2小時。溫育後，將這些油滴按前述方法用水離心洗滌5次以去除所有未結合的酶。將與酶結合、洗過的SC3包被的油滴轉移到含有1ml上述適合於特氟隆，聚乙烯和玻璃薄片的適當的底物溶液的1.5ml比色皿中。在分光光度反應1小時後，將油滴從比色皿中吸出，剩餘溶液繼續反應24小時。
結果表明脂肪酶、酯酶和胰蛋白酶都可以被固定於SC3包被的油滴上，即使經受了高強度的清洗，這些酶依然附著在上面。往比色皿中加入這些包被的油滴可以馬上啟動底物的轉化反應，說明這些固定化酶是具有催化活性的。將這些油滴移開，立刻就終止轉化反應，說明所有的酶都通過去除油滴而被有效去除。
10、螢火蟲螢光素酶的固定化向2塊酶標板中加入150μl的100μg/ml疏水蛋白溶液(SC3，TrSC3和SC4中的任意一種)或150μl的水。在25℃溫育，時間從10分鐘到16小時。將孔用水充分洗以去除任何未結合的疏水蛋白；這些包被認為是α-螺旋狀態。向其中一塊酶標板中疏水蛋白包被和未包被的孔中加入2％SDS熱溶液，並置於60℃20分鐘。將SDS處理的孔用水充分洗。這些包被認為是β-摺疊狀態。往裸露和疏水蛋白包被的孔(α-螺旋和β-摺疊)中加入150μl的10-100μg/ml的螢火蟲螢光素酶溶液(Roche，Cat No.411523)，並在0℃溫育2-16小時。這些孔用0.5M pH7.5的Tris-乙酸緩衝溶液漂洗以去除所有未結合的酶。為了分析固定化酶的活性，向螢火蟲螢光素酶包被的空中加入100μl於0.5M pH7.5的Tris-乙酸緩衝溶液(底物，Roche，ATPBioluminescence Assay試劑盒CLS II，1號瓶，Cat.No.1 699 695)。通過向孔中加入50μl系列稀釋(3×10-5-3×10-10M)的ATP儲存液(Roche，ATPBioluminescence Assay試劑盒CLS II，2號瓶，Cat.No.1699 695)起始反應。根據方法，使用MTP-format發光儀隨時間測量記錄發光。
溫育1小時後，將底物溶液從孔中除去，並用0.5M pH7.5的Tris-乙酸緩衝溶液衝洗孔3次。往孔中加入新鮮的底物和ATP溶液，並測定反應。一天之內將這些孔在新鮮的底物中溫育3次，1天後，1周後和1月後通過孔中的反應活性測定來確定包被的穩定性。
結果說明螢火蟲螢光素酶可以附著到裸露的和疏水蛋白包被的孔上(α-螺旋狀態和β-摺疊狀態)。然而，附著到裸露孔的酶沒有活性，而附著到疏水蛋白包被孔上的酶有活性並可以穩定保持直至1個月。
(注意濃度為1mg/ml的濃縮螢光素酶當以50μl每份冷凍時可以穩定數個月，稀釋溶液不穩定，應保存於冰浴。還注意其對振動及於塑料管中保存敏感！)。
11、鹼性磷酸酶的固定化向2塊酶標板的孔中加入150μl的100μg/ml疏水蛋白溶液(SC3，TrSC3和SC4中的任一種)或150μl的水。在25℃溫育，時間從10分鐘到16小時。將孔用水充分洗以去除任何未結合的疏水蛋白；這些包被認為是α-螺旋狀態。向一塊酶標板中疏水蛋白包被的和沒包被的孔中加入2％SDS熱溶液，並將其置於60℃20分鐘。將SDS處理的孔用水充分洗。這些包被認為是β-摺疊狀態。在提供的稀釋緩衝溶液中製備從5到100倍稀釋的人胎盤鹼性磷酸酶(4u/ml，Roche，SEAPchemiluminescent Reporter gene assay，Cat.No.1 779 842)。往裸露和疏水蛋白包被的孔(α-螺旋狀態和β-摺疊狀態)中加入150μl每種稀釋液，並在25℃溫育2小時。這些孔用稀釋緩衝溶液充分洗以去除所有未結合的酶。
為了分析固定化酶的活性，將50μl底物試劑和100μl稀釋緩衝溶液(Roche，SEAP chemiluminescent Reporter gene assay，Cat.No.1 779842)加入到鹼性磷酸酶包被的孔中，並在25℃溫育10分鐘。根據MTP-format發光儀操作手冊測量記錄發光現象。
溫育2小時後，將底物溶液從孔中除去，並用稀釋緩衝溶液衝洗孔。往孔中加入新鮮的底物和稀釋緩衝溶液，並進行反應。一天內將這些孔在新鮮的底物中溫育2次，1天後，1周後和1月後通過測定孔中的活性確定包被的穩定性。
結果說明鹼性磷酸酶可以附著到裸露的和疏水蛋白包被的孔上(α-螺旋狀態和β-摺疊狀態)。然而，附著到裸露孔的酶沒有活性，而附著到疏水蛋白包被孔上的酶有活性並可以穩定直至1個月。
12、捕光複合物(light harvesting complex，LHC)的固定化用疏水蛋白(SC3，TrSC3和SC4中的任意一種)在100μg/ml疏水蛋白溶液中包被三種不同的電極底物(親水性的GE和疏水性的GCE或TMFE)並將2種置於水中。在25℃溫育，時間從10分鐘到16小時。電極用水衝洗以去除任何未結合的疏水蛋白；這些包被稱為α-螺旋狀態。將每種類型的一個疏水蛋白包被的和一個裸露的電極分別在2％SDS溶液中煮沸10分鐘。將SDS處理過的電極用水充分衝洗。這些包被稱為β-摺疊狀態。如Bilewicz等，J.Phys.Chem.B 2001，105，9772-9777)所述將不同類型的包被和裸露電極裝入電活性化合物Q10、偶氮苯或Q0，或者介質，如亞甲藍。將多種包被或裸露的電極，無論是否裝入電活性化合物，都在25℃在根據Rhiel等人方法(Rhiel E.et al.，1997，Botanica Acta 110，109-117)分離的Cyclotellacryptica的不同濃度的LHC中溫育2小時。用適當的緩衝液衝洗電極。
為了分析固定化LHC的活性，電極(在合適的緩衝液中)被置於黑暗中，隨後轉移至光線中，進而測量電流。這樣的暗-光循環在同一天內重複數次，在1天後，1周後和1月後確定固定化LHC的穩定性。
13、固定化DNA除了蛋白質，還可以固定化其它一些分子。作為例子，描述DNA的固定化。
儘管熟知固定化DNA的方法，但大多數固定化DNA的方法都是基於共價結合，因此需要一個活性基團，通常是DNA分子的5』末端。在疏水蛋白包被固定化DNA同樣很牢固，但不需要DNA末端的活性基團，因此具有更通用。同時，相對於線性共價結合的DNA來說，固定化不容易斷裂。本實施例描述了DNA的固定化與結合時的可及性(accessibility)。
PCR管(聚丙烯，Sarstedt)用50μl的100μg/ml的SC3疏水蛋白溶液在25℃包被16小時。將SC3疏水蛋白溶液去除，並加入100μl1％SDS，加熱至80℃處理10分鐘，這樣可以得到β-摺疊。或者是加入100μl水，在80℃加熱10分鐘(α-螺旋狀態)。這些管用100μl水洗滌5次後加入含有質粒的溶液，溫育15分鐘後，再用200μl水洗滌10次以洗掉未結合的DNA。具有固定化DNA的管在用特異於固定化DNA的引物的PCR反應中作為反應管。在管中進行標準的PCR(50μl，96℃1分鐘，60℃30秒，72℃4分鐘，25個循環)，產物通過凝膠分析。沒有包被的管裡沒有PCR產物，說明DNA被衝洗掉了。具有α-螺旋的包被的管裡有PCR產物，說明質粒DNA被固定化於疏水蛋白包被。具有β-摺疊的包被的管裡沒有DNA固定化，說明不同包被類型具有不同的特異性。
所得PCR產物不僅證明了疏水蛋白固定化DNA的能力，還證明固定化的DNA依然可以和寡核苷酸和酶類相接觸，如聚合酶。
14、CYP2D6和CYP2C19在特氟隆表面的固定化細胞色素P450是含有血紅素單加氧酶的一個超家族。在它們的活性中心有一個鐵原子，可以氧化形式(Fe3+)和底物相結合。而發生還原反應時則成為Fe2+。用分子氧可以將Fe2+再次氧化為Fe3+，同時釋放出新的氧化產物。細胞色素P450的兩個實例是CYP2D6和CYP2C19，存在於人肝臟中並參與代謝生物異源物質，如藥物。
如上述，通過將特氟隆在具有疏水蛋白(100μg/ml)的溶液中溫育，用具有細胞色素的溶液清洗之後再次清洗，就在特氟隆薄片上固定化了細胞色素CYP2D6和CYP2C19。用結合到特氟隆上的CYP2D6和CYP2C19包被的特氟隆薄片在含有NADPH和模型底物右美沙芬(dextromethorphan)和美芬妥英(mephenytoin)的培養基中溫育。溫育了幾個時間階段之後，底物右美沙芬和美芬妥英及其代謝產物右啡烷(dextrorphan)和4-羥基美芬妥英(4-hydroxymephenytoin)一同被測定。每一種固定化細胞色素的代謝程度可以根據底物和產物的比值來計算出來。
15、CYP2D6和CYP2C19在電極表面的固定化將玻璃碳電極通過浸入含有疏水蛋白(100μg/ml)的溶液中15分鐘用疏水蛋白進行包被。隨後徹底洗滌電極。通過將電極分別在含有CYP2D6或CYP2C19的溶液中溫育15分鐘後洗滌，將細胞色素CYP2D6和CYP2C19分別結合到每種疏水蛋白包被的電極上。將修飾過的電極置於含有NADPH和模型底物右美沙芬和美芬妥英的培養基中。測量在溫育期間通過與底物右美沙芬和美芬妥英接觸而誘導的電勢。電勢大小反映了同工酶的代謝。溫育1小時後，將電極移開並定量底物(右美沙芬和美芬妥英)和產物(右啡烷和4-羥基美芬妥英)。兩者的比值就是細胞色素活性的反映，並與所測定的電勢相關。
16、BSA、纖連蛋白和RPMI培養基中蛋白質的固定化將BSA(牛血清白蛋白)和纖連蛋白固定在包被的特氟隆薄片上。在3ml玻璃管中，通過將特氟隆在2ml的100μg/ml的疏水蛋白溶液(SC3或是trSC3)中在25℃溫育15分鐘進行包被。將薄片從疏水蛋白溶液中取出後立即用大量水洗滌以去除任何未結合的疏水蛋白。將包被的和裸露的特氟隆薄片在含有BSA或纖連蛋白的溶液(50μg/ml)中溫育14小時後用水洗滌。裸露的和包被的特氟隆上的BSA或纖連蛋白通過用TFA提取所有蛋白質，蒸發TFA及在SDS-PAGE上上樣並按照標準程序進行染色來檢測。結果說明BSA和纖連蛋白沒有被固定化在裸露的特氟隆上，卻可以被固定在包被的特氟隆上。而且，在SC3包被的和TrS3包被的特氟隆薄片上存在不同量的BSA或纖連蛋白。另外，還用補充的RPMI培養基(SIGMACat No.R0883)代替BSA或纖連蛋白如上述進行了相似的實驗。同樣沒有在裸露的特氟隆上發現有蛋白質的固定化，而在SC3和TrSC3包被的特氟隆上檢測到了蛋白質量的不同。
17、在生物傳感器系統中的應用本發明的另一項應用涉及一種提供傳感器的方法，所述傳感器具有用作生物傳感器的良好特徵。生物傳感器使用生物分子來檢測其它的生物分子或化學物質。生物傳感器可以例如使用單克隆抗體來檢測抗原，或者用小的合成DNA分子去檢測DNA。生物傳感器是一種裝置，它包括了一個與信號轉導器非常接近(in close proximity to)或與其集成的生物識別(傳感)元件，以產生一種特異於靶化合物(分析物)的一種無試劑傳感系統。轉導器是傳感器的物理性成分，其對生物傳感過程的產物產生響應，其可以是光學的，電化學的，熱力學的，壓電學的或是磁力的，對輸出反應的形式可以是被放大的，儲存的和顯示的。生物識別元件可以是一種生物材料或是仿生學材料(比如，組織，微生物，細胞器，細胞受體，酶，抗體，核酸等)。生物感受元件的優勢就在與它們區別感興趣的分析物和相似物質時的非凡能力。生物傳感僅當分析物被生物元件特異性識別時發生。使用生物傳感器，可以非常精確地測量特異的分析物。優選生物元件以非共價的方式結合於傳感器表面，如同本發明所提供的方法一樣，保持這些生物化合物的二級和三級結構完整，進而允許最佳的生物識別。
對一種給定的分析物-識別元件反應來說，可以應用幾種轉導方式。在電壓恆定的條件下採用安培計來檢測電流的變化。用電導儀來檢測兩個電極之間電導率的變化。用電壓計來檢測電流恆定(通常為零)時的電壓變化。根據光學結構，可以將光學轉導器主要分為兩種模式(非本徵(extrinsic)和本徵的(intrinsic))。在本徵模式中，入射波並不能穿透樣本，但卻可在倏逝場中延入射波方向進行傳播並與樣品在表面相互作用。生物識別光學檢測的其它表面方法是基於對入射光在不同材料的界面上產生的激發場進行調節。比如，BIAcore系統就是通過表面等離子共振檢測儀(surface plasmon resonancedetector)來監測生物特異性相互作用。質量檢測器通常是基於石英晶體，其可預知受表面微小變化而影響的頻率變化，如抗體與表面固定化抗原的結合。
生物傳感器概念的實施在很大程度上依賴於以「非反應物」形式製造組分和進行組裝的關鍵技術。「非反應物」形式，在大多情況下，是通過將生物識別元件固定在傳感器表面來完成的。有利地，用允許非共價附著生物識別分子的化合物包被生物感應器表面。比如，將金傳感器表面(疏水性的)用疏水蛋白溶液僅僅通過溫育一段時間進行包被。然後用水清洗表面以去除任何未結合的疏水蛋白。再用去汙劑處理該表面以獲得β-摺疊狀態包被，所述包被的表面可以直接用於結合生物識別分子，如抗體、酶、肽、脂質、核酸或碳水化合物。通常，固定化基質可以僅起到支持物的作用，或其也可以涉及與生物傳感元件識別分析物相關的信號介導。
優選固定化基質不會影響生物傳感器的敏感性。然而只採用疏水蛋白包被傳感器表面會減弱信號傳導，我們發現可以向上述疏水蛋白包被中摻入一種化合物來增強傳感器的性能。例如本文提供的，這種化合物是可以摻入疏水蛋白包被中以與不含有所述化合物的疏水蛋白包被相比可以改良傳感器敏感性的電活性化合物。在優選的實施方案中，本發明提供了一種方法，其提供了具有疏水蛋白樣物質的傳感器表面，其中所述包被還具有一種活性化合物以改良傳感器的靈敏度，也稱為信號轉導器，以及具有非共價結合的生物識別化合物。
權利要求
1.一種物體，其至少有一部分表面具有疏水蛋白樣包被(或膜)，其中所述包被還額外具有一種活性化合物。
2.根據權利要求1所述的物體，其中所述活性化合物分子量(MW)大於1千道爾頓(1Kd)。
3.根據權利要求1或2所述的物體，其中所述包被基本上不含有甘露糖殘基。
4.根據權利要求1-3中的任一項所述的物體，其中所述活性化合物含有蛋白質物質。
5.根據權利要求1-4中的任一項所述的物體，其中所述活性化合物包含酶。
6.根據權利要求1-4中的任一項所述的物體，其中所述活性化合物包含抗體或其片段。
7.根據權利要求1-3中的任一項所述的物體，其中所述活性化合物包含核酸。
8.根據權利要求1-7中的任一項所述的物體，其中所述活性化合物被非共價地結合到所述包被上。
9.根據權利要求1-8中的任一項所述的物體，其中所述表面包含液/液界面。
10.根據權利要求1-8中的任一項所述的物體，其中所述表面包含固/液界面。
11.一種向物體表面提供活性化合物的方法，該方法包括如下步驟將物體表面的至少一部分用疏水蛋白樣物質塗層進行包被，並將該化合物與包被的疏水蛋白樣物質相接觸以在所述疏水蛋白樣物質和所述化合物之間形成非共價鍵。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述物質可以在所述物體表面通過所述物質的自裝配形成單層。
13.根據權利要求11或12所述的方法，其中在所述包被的物體與所述活性化合物相接觸之前，對所述包被的物體進行預處理。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述包被的物體用去汙劑溶液進行預處理。
15.根據權利要求11-14任一項所述的方法，包含將所述包被的物體的表面加熱到30-80℃的範圍。
16.一種向物體表面提供活性化合物的方法，該方法包括如下步驟將物體表面的至少一部分用活性化合物塗層進行包被，並進一步地將該表面與疏水蛋白樣物質的溶液相接觸以在所述疏水蛋白樣物質和所述表面之間形成非共價鍵，保持所述化合物的反應性基本不變。
全文摘要
本發明涉及將化合物結合到物體表面至少一部分的方法，所述方法包括將疏水蛋白樣(hydrophobin－like)物質吸附到所述表面上的步驟。本發明提供了向物體表面提供活性化合物的方法，該方法包括如下步驟至少將物體表面的一部分用疏水蛋白樣物質塗層進行包被，並將該化合物與包被的疏水蛋白樣物質相接觸以在所述疏水蛋白樣物質和所述化合物之間形成非共價鍵。
文檔編號G01N33/543GK1675238SQ03819807
公開日2005年9月28日 申請日期2003年6月13日 優先權日2002年6月21日
發明者哈爾姆·揚·赫託克, 裡克·林克, 卡琳·朔爾特邁耶, 約翰內斯·韋爾默, 艾娃·瑪麗亞·羅加斯卡, 阿蘭·喬治·吉蘭·瓦爾卡裡烏斯 申請人:應用超微系統股份有限公司