蛋白質運輸的調節的製作方法

2023-08-09 22:01:26

專利名稱：蛋白質運輸的調節的製作方法
技術領域：
本發明涉及調節蛋白質運輸和治療或預防以蛋白質運輸受損為特徵的病症的化 合物和方法。
背景技術：
以蛋白質運輸受損為特徵的病症很多，包括遺傳病例如亨廷頓病、泰-薩克斯病、 家族性高膽固醇血症和囊性纖維化。與這些疾病相關的基因突變常導致蛋白質的錯誤摺疊 和/或保留在內質網中。因此，這些蛋白質常過早降解。細胞(例如，在組織中)不能表達足夠量的重要蛋白質例如酶，可導致病症狀態， 所述疾病狀態在蛋白質運輸病症中的表現和嚴重程度不同。例如，囊性纖維化幾乎可影響 整個機體，導致進行性殘疾和早逝。呼吸困難是最常見的症狀，並且是由頻繁的肺部感染引 起的，所述肺部感染可通過抗生素和其它藥物治療。囊性纖維化對身體其它部分的作用可 導致許多其它症狀，包括鼻竇感染、發育不全、腹瀉和不育。囊性纖維化，如同許多以蛋白質 運輸受損為特徵的其它疾病一樣，若不治療則會致命。其他蛋白質運輸病症包括例如a-突觸核蛋白介導的病症或其中涉及a-突觸 核蛋白纖維形成的病症，包括但不局限於帕金森氏疾病(Parkinson』 sdisease)、路易體 痴呆(dementia with Lewy body)、多系統妻縮症(multiplesystem atrophy)禾口阿爾茨海
(the Lewy body variant ofAlzheimer' s disease)。例如，帕金森氏病是神經變性疾病，其病理特徵為胞質內路易體的存在(Lewy in Handbuch der Neurologie, M.Lewandowski, ed. , Springer, Berlin, pp.920-933, 1912 ；Pollanen 等人，J. Neuropath. Exp. Neurol. 52 :183_191，1993)，路易體的主要成分 是由a-突觸核蛋白組成的原纖維(Spillantini等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 6469-6473，1998 ；Arai 等人，Neurosci. Lett. 259 :83_86，1999)，a -突觸核蛋白是 140 個 胺基酸的蛋白質(Ueda 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :11282_11286，1993)。已描述 了導致家族性早發帕金森氏病的a-突觸核蛋白中的兩個顯性突變，表明路易體在帕金 森氏病和相關疾病中的神經元變性中在機理上發揮作用(Polymeropoulos等人，Science 276 :2045-2047，1997 ；Kruger 等人，Nature Genet. 18 106-108，1998 ；Zarranz 等人，Ann. Neurol. 55 164-173, 2004)。a -突觸核蛋白基因的三倍體和雙倍體突變與帕金森氏病的 早發相關(Singleton 等人，Science 302 841,2003 ;0^汁丨61-1^1~1111等人.1^1 ^丨364 1167-1169,2004 ； Ibanez 等人，Lancet 364 1169-1171，2004)。體外研究已表明重組 的a-突觸核蛋白的確可形成路易體樣原纖維(Conway等人，NatureMed. 4 1318-1320, 1998 ；Hashimoto 等人，Brain Res. 799 :301_306，1998 ；Nahri 等人，J. Biol. Chem. 274 9843-9846,1999)。帕金森氏病相關的a -突觸核蛋白突變加速這種聚集過程，表明這種體 外研究與帕金森氏病發病機制有相關性。a「突觸核蛋白聚集和原纖維形成滿足了成核依 賴的聚合過程的標準(Wood等人，J. Biol. Chem. 274 19509-19512，1999)。在此方面，a -突 觸核蛋白原纖維形成與阿爾茨海默病的澱粉樣蛋白(A0)原纖維形成相似。a-突觸 核蛋白的重組蛋白和非-A3成分(又稱NAC)(是a-突觸核蛋白的35個胺基酸的多肽片
14段)，當在37°C時孵育時，均具有形成原纖維的能力，並且澱粉樣蛋白染色陽性，例如剛果 紅染色(當在偏振光下觀察時，表現出紅/綠雙光折射)和硫磺素S染色(表現出陽性熒 光)(Hashimoto 等人，Brain Res. 799 :301_306，1998 ；Ueda 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 11282-11286,1993)。突觸核蛋白(synuclein)為一族包括a-、和Y _突觸核蛋白的小突觸前神 經元蛋白，其中僅a-突觸核蛋白聚集與幾種神經疾病相關(Ian等人，ClinicalNeurosc. Res. 1 445-455, 2001 ；Trojanowski 禾口 Lee，Neurotoxicology23 :457_460，2002)。從一些 觀測中揭示了突觸核蛋白(且尤其是a-突觸核蛋白)在許多神經變性和/或澱粉樣蛋白 病的病因學中的作用。病理學上，將a-突觸核蛋白確定為路易體的主要成分，帕金森氏病 的標誌內含物，且其片段已從不同神經疾病、阿爾茨海默病的澱粉樣斑中分離出。生物化學 上，重組的a-突觸核蛋白表現出形成澱粉樣蛋白樣原纖維，再現了從患有路易體痴呆、帕 金森氏病和多系統萎縮的患者分離出的a-突觸核蛋白的超微結構特徵。而且，在a-突 觸核蛋白基因中的突變的鑑定(雖然僅在少數家族性帕金森氏病病例中)證明突觸核蛋白 病理學和神經變性病之間的明確的聯繫。a-突觸核蛋白與疾病譜，例如帕金森氏病、路易 體痴呆、多系統萎縮和阿爾茨海默病的路易體變型的普遍相關，導致這些疾病被分類到涵 蓋性術語「突觸核蛋白病(synucleinopathy) 」下。a-突觸核蛋白的纖維化和聚集被認為在PD中的神經元功能障礙和多巴胺能神 經元死亡中發揮重要作用。在a-突觸核蛋白中的突變或野生型a-突觸核蛋白的基因組 三倍體(導致其過表達)導致一些罕見家族形式的帕金森氏病。體外和體內模型表明野生 型a-突觸核蛋白的過表達誘導神經細胞死亡。參見，例如Polymersopoulos，等人(1997) Science 276(5321) :2045_7，Kruger,等人(1998) Nat Genet. 18(2) 106-8，Singleton, 等人(2003)Science302(5646) 841, Miller,等人(2004)Neurology 62(10) :1835_8， Hashimoto，等人(2003) Ann N Y Acad Sci. 991 :171_88，Lo Bianco，等人(2002) Proc Natl AcadSci U S A. 99(16) : 10813-8，Lee，等人(2002) Proc Natl Acad Sci U S A. 99(13) 8968-73，Masliah，等人(2000) Science 287(5456) : 1265-9，Auluck，等人(2002) Science 295(5556) :865-8, Oluwatosin-Chigbu ^A (2003)BiochemBiophys Res Commun 309(3) 679-84，Klucken 等人，2004) J Biol Chem. 279 (24) :25497_502。保護神經元免受 a -突觸 核蛋白的毒性作用是治療帕金森氏病和其他突觸核蛋白病例如路易體痴呆的有前景的策 略。因此，為了治療由蛋白質運輸介導的疾病和病症，例如囊性纖維化和帕金森氏病， 需要拯救蛋白質運輸的化合物和組合物。

發明內容
本文提供了化合物和包含這些化合物的組合物，以及使用這些化合物來拯救蛋白 質運輸受損的方法。還提供了治療或改善與蛋白質運輸受損相關的病症的一種或多種症狀 的方法。所述病症包括例如囊性纖維化。所描述的任何化合物在治療或改善與蛋白質運輸受損相關的病症的一種或多種 症狀中的用途也在本文考慮的範圍內。此外，所描述的任何化合物用於製備治療與蛋白質 運輸受損相關的病症的藥物的用途也在本文考慮的範圍內。治療患有以蛋白質運輸受損為
15特徵的病症的受試者的方法，其包括給予受試者以有效量的如下結構式所表示的化合物或 其藥學可接受的鹽
其中所述疾病不是突觸核蛋白病。提高細胞中蛋白質運輸的方法包括使細胞與有效量的以上述結構式表示的化合 物或其藥學可接受的鹽接觸，其中所述細胞不以突觸核蛋白運輸受損為特徵。治療以蛋白質運輸受損為特徵的病症的方法，包括將化合物或其藥學可接受的鹽 向受試者給藥或與細胞接觸，其中所述化合物以上述結構式表示，並且所述病症不是突觸 核蛋白病。在上述方法的各個實施方案中，在以上述結構式表示的化合物中m 為 1 或 2 ；各個X獨立地表示N、CH或C (CrC4烷基)；各個X1獨立地表示N、NR3、CH或烷基)；R1 和 Z 各自獨立地為 R5、C (0) R5、C00R5、C (0) NR5R5 或 S (0) mR5 ；或 NR:Z 整體為 N =
ch-nr5r5 ；R2 和 R3 各自獨立地為 H、滷素、擬滷素、CN、SR5、R5、OR5、0C(0)R5、NR5R5、NR5R6、 C00R5、N02、C (0) R5、C (0) C (0) R5、C (0) NR5R5、S (0) mR5、S (0) mNR5R5、NR5C (0) NR5R5、NR5C (0) C (0) R5、 NR5C (0) R5、NR5 (C00R5)、NR5C (0) R8、NR5S (0) mNR5R5、NR5S (0) mR5、NR5S (0) mR8、NR5C (0) C (0) NR5R5、 NR5C (0) C (0) NR5R6、P (0) R5R5、P (0) (NR5R5) 2、P (0) (NR5R6) 2、P (0) (NR6R6) 2、或 P (0) (OR5) 2 ；R4 獨立地為 H、滷素、擬滷素、CN、SR5、OR5、0C(0)R5、NR5R5、NR5R6、C00R5、N02、C(0) R5、C(0)C(0)R5、C(0)NR5R5、S(0)mR5、S(0)mNR5R5、NR5C (0) NR5R5、NR5C (0) C (0) R5、NR5C(0)R5、 NR5 (C00R5)、NR5C (0) R8、NR5S (0) mNR5R5、NR5S (0) mR5、NR5S (0) mR8、NR5C (0) C (0) NR5R5、或 NR5C (0) C(0)NR5R6 ；或任選取代的烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或雜芳烷基；且各個R5、R6和R8獨立地為H或任選被取代的烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、芳 基、雜芳基或雜環基。在上述方法的一些實施方案中，在以上述結構式表示的化合物中m 為 1 或 2 ；各個X獨立地為N或CH ；各個X1獨立地為N、NR3或CH ；R1 禾口 Z 各自獨立地為 R5、C (0) R5、C00R5、C (0) NR5R5 或 S (0) mR5 ；R2 和 R3 各自獨立地為 H、滷素、擬滷素、CN、SR5、R5、OR5、0C(0)R5、NR5R5、NR5R6、 C00R5、N02、C (0) R5、C (0) C (0) R5、C (0) NR5R5、S (0) mR5、S (0) mNR5R5、NR5C (0) NR5R5、NR5C (0) C (0) R5、 NR5C (0) R5、NR5 (C00R5)、NR5C (0) R8、NR5S (0) mNR5R5、NR5S (0) mR5、NR5S (0) mR8、NR5C (0) C (0) NR5R5、 NR5C (0) C (0) NR5R6、P (0) R5R5、P (0) (NR5R5) 2、P (0) (NR5R6) 2、P (0) (NR6R6) 2、或 P (0) (OR5) 2 ；R4 獨立地為 H、滷素、擬滷素、CN、SR5、OR5、0C(0)R5、NR5R5、NR5R6、C00R5、N02、C(0)R5、C(0)C(0)R5、C(0)NR5R5、S(0)mR5、S(0)mNR5R5、NR5C (0) NR5R5、NR5C (0) C (0) R5、NR5C(0)R5、 NR5 (C00R5)、NR5C (0) R8、NR5S (0) mNR5R5、NR5S (0) mR5、NR5S (0) mR8、NR5C (0) C (0) NR5R5、或 NR5C (0) C(0)NR5R6 ；或任選取代的烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或雜芳烷基；且各個R5、R6和R8獨立地為H或任選被取代的烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、芳 基、雜芳基或雜環基。在一些實施方案中，R2獨立地為H、滷素、擬滷素、(CH2)n_Y或(CH = CH)n_Y，其中 Y可以為未取代的或取代的芳基、雜芳基、烷基或環烷基。在多個實施方案中，Y的取代基獨 立地選自滷素、擬滷素、烷基、環烷基、芳基、芳烷基、N02、烷氧基、芳氧基、芳基烷氧基、CF3、 0CF3、CN、NR5R6、NR5C0R6、(CH2)n0R6、SR6、C02H、C02R6、C0NR6R5、COR6 和 S02NR5R6。在一些實施 方案中，R3獨立地為取代的或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、環烷基、(CH2)n-環烷 基或金剛烷基。在一些實施方案中，R4獨立地為H、NH2、NR5R6、NR5C0R6或未取代的或取代的 烷基或芳基。R\Z、R5和R6可獨立地選自H、未取代的或取代的烷基、芳烷基、芳基、烷芳基 或環烷基、C0R° 7(其中R° 7為未取代的或取代的烷基或芳基)、S02R° 8(其中R° 8為芳 基或取代的芳基)和(CH2)n-環烷基(其中環烷基可被取代)。在一些實施方案中，X獨立 地是CH或N。在一些實施方案中，化合物以下列結構式表示，其中R3獨立地為任選取代的烷基、 環烷基、烷氧基、芳基、芳烷基、雜芳基或雜芳烷基 在一些實施方案中，化合物由下列結構式之一表示 在多個實施方案中，R1和Z各自獨立地選自氫、或取代的或未取代的烷基、烷基 羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、商代芳基羰基、芳基磺醯基、芳烷基磺醯基和商代芳基磺醯 基。在一些實施方案中，R1獨立地為H且Z為H。在一些實施方案中，R1獨立地為甲基且Z 為H。在某些實施方案中，R1是H。在多個實施方案中，R2獨立地為氫、滷素或任選取代的芳基、雜芳基、芳烷基或芳 烯基。在一些實施方案中，R2獨立地為H、滷素、CN、N02、NH2或任選被1-3個獨立的下述基 團取代的 CfQ 烷基滷素、SR5、OR5、0C (0) R5、NR5R5、C00R5、N02、CN、C (0) R5、0C (0) NR5R5 或 C(0)NR5R5。在某些實施方案中，R2 獨立地為 H、F、CI、Br、CF3、CC13、CN、N02、NH2 或 CrQ 烷 基。在多個實施方案中，R2獨立地為芳基、雜芳基、芳烷基或雜芳烷基，各個基團獨立地被下述基團取代H、滷素、SR5、OR5、0C (0) R5、NR5R5、C00R5、N02、CN、C (0) R5、OC (0) NR5R5 或 C (0) NR5R5 ；或芳基、Ci-Q烷基或C2-C1(l烯基，各個基團任選被1-3個獨立的下述基團取代芳基、 滷素、SR5、OR5、0C(0) R5、NR5R5、C00R5、N02、CN、C(0) R5、0C(0)NR5R5 或 C(0)NR5R5。例如在 R2 中，任選被取代的芳基、雜芳基、芳烷基或雜芳烷基可獨立地選自苯基、萘基、苄基、苯基亞 乙基、萘基亞甲基、苯氧基亞甲基、萘氧基亞甲基、批啶基亞甲基、苯並呋喃基亞甲基、二氫 苯並呋喃基亞甲基、苯並二氧雜環戊烯基亞甲基、茚滿基亞甲基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、 苯並噻吩基和苯並呋喃基。對於R2中芳基、雜芳基、芳烷基或雜芳烷基的任選取代基可以獨 立地為H、F、CI、Br、OH、CrC6 烷氧基、氨基、CrC6 烷基氨基、C00H、C00-CrC6 烷基、N02、CN 或(()-(「(；烷基；或CrC6烷基、C2-C6烯基或芳基，其任選被下述基團取代苯基、F、C1、 Br、CrC6 烷氧基、C00H、COO-CfQ 烷基、N02 或 CN。在一些實施方案中，R3獨立地選自取代或未取代的烷基、環烷基、芳基和芳烷基。 在多個實施方案中，R3獨立地為H、C3-C10環烷基、或C2-C1Q炔基；或烷基或C2-C1Q烯 基，各個基團任選被1-3個下述基團取代滷素、CF3、SR5、0R5、0C(0)R5、NR5R5、C00R5、N02、CN、 〇(0)妒、0((0)殿51 5、或((0)殿51 5。在一些實施方案中，R3獨立地為ICi-Qg基，其任選被 1-3 個下述基團取代滷素、(《5、殿51 5、0)( 5、((0)1 5、((0)冊51 5、(2-(6 烯基或 C2-C6 炔基；或 環丙基、環丙基甲基、環丁基、環丁基甲基、環戊基、環戊基甲基、環己基或環己基甲基。在多 個實施方案中，R3獨立地為芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、雜環基或雜環基烷基，各個基 團被下述基團取代H、烷基、滷素、OR5、0C (0) R5、NR5R5、C00R5、N02、CN、C (0) R5、0C (0) NR5R5 或 C(0)NR5R5 ；或任選被取代的芳基、雜芳基或雜環基。例如通過R3表示的芳基、雜芳基、芳烷 基、雜芳烷基、雜環基或雜環基烷基可獨立地選自節基、吡啶基、吡啶基亞甲基、呋喃基、噻 吩基、四氫呋喃基或四氫噻吩基。在某些實施方案中，對於R3表示的芳基、雜芳基、芳烷基、 雜芳烷基、雜環基或雜環基烷基的取代基可以獨立地為H、F、Cl、Br、SR5、0R5、NR5R5、C00R5、 N02、CN、C(0)R5 ；或Q-C；烷基、C2-C6烯基或芳基，其任選被下述基團取代苯基、F、Cl.Br, 5妒、01 5、0)( 5、而2或0叱在一些實施方案中，R4獨立地為H、烷基、環烷基或烷基環烷基。在多個實施方案 中，R4獨立地為芳基；雜芳基A-Q烷基或C2-C1(l烯基，各個基團任選獨立地被1-3個下 述基團取代芳基、或雜芳基；C2-C1(1炔基；滷素；滷代烷基；CF3 ；SR5 ；OR5 ；0C(0)R5 ；NR5R5 ； NR5R6 ； C00R5 ； N02 ； CN ； C(0)R5 ； C(0)C(0)R5 ； C(0) NR5R5 ； S(0)mR5 ； S(0) mNR5R5 ； NR5C(0) NR5R5 ； NR5C (0) C (0) R5 ； NR5C (0) R5 ； NR5 (C00R5) ； NR5C (0) R8 ；NR5S (0) mNR5R5 ； NR5S (0) mR5 ； NR5S (0) mR8 ； NR5C (0) C (0) NR5R5 ；或 NR5C (0) C (0) NR5R6。在一些實施方案中，R4 獨立地為H、OR5、0C (0) R5、 殿5鏟、0)( 5、而2、^((0)1 5、((0)((0)1 5、或((0)殿51 5 ；或 Q-Ci。烷基，其任選被 1-3 個下述 基團取代滷素、OR5、0C (0) R5、NR5R5、C00R5、N02、CN、C (0) R5、0C (0) NR5R5 或 C (0) NR5R5。在某些 實施方案中，R4獨立地為H、CF3、CC13、氨基、&-(；烷氧基、COOHXOO-CfQ烷基、0C(0) -CrC6 烷基、苯氧基，或烷基苯氧基；或Ci-C；烷基，其任選被下述基團取代氨基、C00H、COO-CfQ 烷基或OC^OPCi-C；烷基、或1個或2個(^-(6烷氧基。在一些實施方案中，R4獨立地為任 選取代的芳基、芳烷基、雜芳基或雜芳烷基，其中任選的取代基可包括滷素、CF3、SR5、OR5、 0C (0) R5、NR5R5、C00R5、N02、CN、C (0) R5、0C (0) NR5R5、C (0) NR5R5、N (R5) C (0) R5、N (R5) (C00R5)或 S(0)mNR5R5。例如通過R4表示的芳基、芳烷基、雜芳基和雜芳烷基可獨立地選自苯基、苄基、 吡啶基、批啶基亞甲基、呋喃基、呋喃基亞甲基、噻吩基、噻吩基亞甲基、批唑基和吡唑基亞
19甲基。在多個實施方案中，由R4表示的芳基、芳烷基、雜芳基或雜芳烷基的任選的取代基獨 立地為F、CI、OH、氨基、N02、CrC6烷氧基、Q-Q烷基、苯氧基、或烷基苯氧基；或苯基、咪唑 基、或嗎啉代，其任選被下述基團取代F、C1、氨基、N02、CrC6烷氧基、或(「(；烷基。
在某些實施方案中，化合物選自在圖1A、1B、1C、1D、1E、1F、2、3A、3B、4A、4B、5A、5B、 6、7、8A、8B、8C、9A、9B、9C、或9D中說明的化合物。在某些實施方案中，化合物選自在表I中 說明的化合物。
在多個實施方案中，化合物是由下述結構式所表示或其藥學可接受的鹽
在多個實施方案中，化合物由下列結構式之一表示 NR Z
人嗎X1 ^ 在多個實施方案中，在上述結構式中m 為 1 或 2 ；各個X和X1獨立地為N、CH或C (CrC4烷基)；R1 禾P Z 各自獨立地為 H、R5、C (0) R6、C00R5、C (0) NR6R6 或 S (0) mR5 ；或 NI^Z 整體為 N
=ch-nr5r5 ； R2 為 SR9、OR5、0C (0) R5、NR5R5、NR5R6、C00R5、C (0) R5、C (0) H、C (0) C (0) R5、C (0) NR5R5、 C (0) NR5R6、C (0) NR6R6、S (0) mR9、S (0) mNR5R5、S (0) mNR5R6、NR5C (0) NR5R5、NR6C (0) NR6R6、NR5C (0) C (0) R5、NR5C (0) C (0) R5、NR5C (0) R5、NR6C (0) R5、NR5 (C00R5)、NR6 (C00R5)、NR5C (0) R8、NR6C (0) R8、NR5S (0) mNR5R5、NR6S (0) mNR6R6、NR5S (0) mR5、NR6S (0) mR5、NR5S (0) mR8、NR6S (0) mR8、NR5C (0) C (0) NR5R5、NR6C (0) C (0) NR5R6、或 NR5C (0) C (0) NR5R6 ；R3 為 R10、C00R5、C (0) R5、C (0) C (0) R5、C (0) NR5R5、C (0) NR5R6、C (0) NR6R6、S (0) mR5、S (0) mNR5R5、S (0) mNR5R6、P (0) R5R5、P (0) (NR5R5) 2、P (0) (NR5R6) 2、P (0) (NR6R6) 2、或 P (0) (OR5) 2 ；R4 為 H、滷素、擬滷素、CN、SR5、OR5、0C(0)R5、NR5R5、NR5R6、COOR5、N02、C (0) R5、C (0) C(0)R5、C(0)NR5R5、C(0)NR5R6、C(0)NR6R6、S(0)mR5、S(0)mNR5R5、S(0)mNR5R6、NR5C (0) NR5R5、 NR6C (0) NR6R6、NR5C (0) C (0) R5、NR5C (0) C (0) R5、NR5C (0) R5、NR6C (0) R5、NR5 (COOR5)、NR6 (COOR5)、 NR5C(0)R8、NR6C(0)R8、NR5S(0)mNR5R5、NR6S (0) mNR6R6、NR5S(0)mR5、NR6S(0)mR5、NR5S(0)mR8、 NR6S (0) mR8 ,NR5C (0)C(0) NR5R5 ,NR6C (0)C(0) NR5R6、或 NR5C (0) C (0) NR5R6 ,NR6C (0)C(0) NR5R6、或 NR5C (0) C (0) NR5R6、或任選取代的烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或雜芳烷基；且各個R5獨立地為任選取代的烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、芳基、雜芳基或雜 環基，各個R6和R8獨立地為H或任選取代的烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、芳基、雜 芳基或雜環基，各個R9獨立地為任選取代的含有兩個或更多個碳的烷基、烯基、炔基、環烷基、環 烯基、芳基、雜芳基或雜環基，且
各個R"1獨立地為任選取代的烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、芳基、雜芳基或雜 環基，不包括任選取代的二氫呋喃-2-基和四氫呋喃-2-基。在多個實施方案中，在上述結構式中m 為 1 或 2 ；各個X獨立地表示N、CH或C (CrC4烷基)；各個X1獨立地表示N、NR3、CH或C(CfC4烷基)；R1 和 Z 各自獨立地為 R5、C (0) R5、C00R5、C (0) NR5R5 或 S (0) mR5 ；或 NR:Z 整體為 N =
ch-nr5r5 ；R2為N3-取代的烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、芳基、雜芳基或雜環基，其可任 選被進一步取代；R3 獨立地為 H、滷素、擬滷素、CN、SR5、R5、OR5、0C(0)R5、NR5R5、NR5R6、C00R5、N02、 C (0) R5、C (0) C (0) R5、C (0) NR5R5、S (0) mR5、S (0) mNR5R5、NR5C (0) NR5R5、NR5C (0) C (0) R5、NR5C (0) R5、NR5 (C00R5)、NR5C (0) R8、NR5S (0) mNR5R5、NR5S (0) mR5、NR5S (0) mR8、NR5C (0) C (0) NR5R5、NR5C (0) C (0) NR5R6、P (0) R5R5、P (0) (NR5R5) 2、P (0) (NR5R6) 2、P (0) (NR6R6) 2、或 P (0) (OR5) 2 ；R4 獨立地為 H、滷素、擬滷素、CN、SR5、OR5、0C(0)R5、NR5R5、NR5R6、C00R5、N02、C(0) R5、C(0)C(0)R5、C(0)NR5R5、S(0)mR5、S(0)mNR5R5、NR5C (0) NR5R5、NR5C (0) C (0) R5、NR5C(0)R5、 NR5 (C00R5)、NR5C (0) R8、NR5S (0) mNR5R5、NR5S (0) mR5、NR5S (0) mR8、NR5C (0) C (0) NR5R5、或 NR5C (0) C(0)NR5R6 ；或任選取代的烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或雜芳烷基；且各個R5、R6和R8獨立地為H或任選被取代的烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、芳 基、雜芳基或雜環基。在多個實施方案中，上述化合物滿足下面的條件當R2是C(0)R5時，則R3不是甲基、2-丙基、環戊基或4-哌啶基；當各個X和X1是N並且R3是CH3時，則R4不是N (CH3) 2或S_烷基；當Z、! 1和R4為H ；各個X和X1為N ；R2為以下基團取代的C0 甲基、苯基、4_溴苯 基、4-氯苯基、4-氯苯基、萘-2-基、(3-甲基-5-苯基)噻唑-2-基、4-(哌啶-1-基磺醯 基)苯基、噻吩-2-基、或苯並噻唑-2-基時，則R3不是苯基、4-氯苯基或4-甲基苯基；當Z、R1和R4為H ；各個X和X1為N ;R2為C0NH2時，則R3不是甲基、苯基或
ch2och2ch2oh ；當Z、R1和R4為H ；各個X和X1為N ；R2為烷氧基時，則R3不是叔丁基。當Z、R1和R4為H ；各個X為N 為CH ；R2為被以下基團在間位取代的苯甲醯 基NH2、NHS02-(氯取代的苯基)、NHS02-噻吩-2-基、NHC0NH-(滷素或甲基取代的苯基)、 NHC0NH-(甲基苄基)、NHC0NH-環己基、或NHC0-(氯代苯基)時；則R3不是CH2-環丙基；當Z、! 1和R4為H ；各個X為N 為CH ；R3為CH20_苄基、CH20_烷基、烷基或烯基， 其任選為以下基團取代羥基、烷氧基、羥基烷基或羥基烷氧基；或任選取代的芳烷基時； 則R2不是C0NH2 ；當Z.R1和R4為H ；各個X為N 為CH ；R2為被以下基團取代的S-苯基:NH2、NC (0) 0-叔丁基、NC (0) NH- (2-氟苯基)、NS (0) 2_ (單或二氟苯基)時；則R3不是環戊基；當Z、! 1和R4為H ；各個X和X1為CH ；R3為2_(嗎啉基)亞乙基時；則R2不是 C0-四甲基環丙烷；
當Z、R1和R4為H ；各個X和X1為CH ；R3為甲基時，則R2不是C0H或羧基；當Z、R1和R4為H ；各個X為N ；各個X1為N或CH，並且R3為4_(4_甲基-哌 嗪-1-基)環己基、4-(N-嗎啉基)環己基或苯基時，則R2不是C0NH-(任選取代的苯基) 或N(任選取代的苯基)C(0)(苯基或烷基苯基)；且當各個X和X1為N，R4為H或苯基，Z為H或任選取代的苯基，R1為H，且R2為NH-(吡 啶基或任選取代的苯基)時，則R3不是甲基、羥基烷基、苄基或6-對甲苯基噠嗪-3-基。在一些實施方案中，上述化合物滿足一個或多個下列條件當R2為C(0)R5時，則R3不是甲基、2-丙基、環戊基或4_哌啶基；或在一些實施方 案中，R3不是烷基或哌啶基；當各個X和X1為N並且R3是烷基時，則R4不是N (烷基)2或S-烷基；當Z、R1和R4為H ；各個X和X1為N ;R2為C0R5或C0NH2時，貝丨」R3不是甲基、 CH20CH2CH20H，或任選烷基化或滷化的苯基；或在一些實施方案中，R3不是烷基、羥基烷氧基 烷基或任選烷基化或商化的苯基；當Z、R1和R4為H ；各個X和X1為N ；R2為烷氧基時，則R3不是叔丁基。當Z、! 1和R4為H ；各個X為N丨為CH ；R2是取代的苯甲醯基時；則R3不是烷基-環
燒基；當Z、R1和R4為H ；各個X為N丨為CH ；R3是任選取代的烷基或烯基時；則R2不 是 conh2 ；當Z.R1和R4為H ；各個X為N 為CH ；R2為S_ (取代的苯基)時，則R3不是環烷 基；當Zj1和R4為H時；各個X和X1為CH;R3為烷基或嗎啉基亞乙基時；則R2不是CO-環烷基、C0H或羧基；當Z、R1和R4為H ；各個X為N 為N或CH ；並且R3為苯基或環烷基時，則R2不 是 C0NHR5 或 NR5C (0) R5 ； 當各個X和X1為N，R4為H或苯基，Z為H或任選取代的苯基，R1為H，且R2為NH-(任 選取代的苯基或吡啶基)時，則R3不是甲基、羥基烷基、苄基或6-對甲苯基噠嗪-3-基。在多個實施方案中，本發明化合物排除了一個或多個選自圖1A、1B、1C、1D、1E、1F、 3B、4B、8A、8B、8C、9A、9B、9C、或 9D 中的化合物。在多個實施方案中，化合物在圖2、3A、4A、5A、5B、6或7中說明。在某些實施方案 中，排除了 一個或多個在圖2、3A、4A、5A、5B、6或7中說明的化合物。在一些實施方案中，化 合物選自表I。在多個實施方案中，R2獨立地為 SR9、OR5、0C(0) R5、NR5R5、NR5R6、C00R5、C(0)H、C(0) C (0) R5、C (0) NR5R5、C (0) NR5R6、S (0) mR9、S (0) mNR5R5、S (0) mNR5R6、NR5C (0) NR5R5、NR6C (0) NR6R6、 NR5C (0) C (0) R5、NR5C (0) C (0) R5、NR5C (0) R5、NR6C (0) R5、NR5 (C00R5)、NR6 (C00R5)、NR5C (0) R8、 NR6C(0)R8、NR5S(0)mNR5R5、NR6S (0)mNR6R6、NR5S(0)mR5、NR6S(0)mR5、NR5S(0)mR8、NR6S(0)mR8、 NR5C (0) C (0) NR5R5、NR6C (0) C (0) NR5R6、或 NR5C (0) C (0) NR5R6。在某些實施方案中，R2 獨立 地為 SR9、OR5、0C(0)R5、NR5R5、NR5R6、C00R5、C(0)H、C(0)C(0)R5、S(0)mR9、S(0)mNR5R5、S(0) mNR5R6、NR5C (0) NR5R5、NR6C (0) NR6R6、NR5C (0) C (0) R5、NR5C (0) C (0) R5、NR5C (0) R5、NR6C (0) R5、 NR5 (C00R5)、NR6 (C00R5)、NR5C (0) R8、NR6C (0) R8、NR5S (0) mNR5R5、NR6S (0) mNR6R6、NR5S (0) mR5、NR6S (0) mR5、NR5S (0) mR8、NR6S (0) mR8、NR5C (0) C (0) NR5R5、NR6C (0) C (0) NR5R6、或 NR5C (0) C (0) NR5R6。在一些實施方案中，R2 獨立地為 NR5R5、NR5R6、NR5C(O)NR5R5、NR6C(O)NR6R6、NR5C(O) C (0) R5、NR5C (0) C (0) R5、NR5C (0) R5、NR6C (0) R5、NR5 (C00R5)、NR6 (C00R5)、NR5C (0) R8、NR6C (0) R8、NR5S (0) mNR5R5、NR6S (0) mNR6R6、NR5S (0) mR5、NR6S (0) mR5、NR5S (0) mR8、NR6S (0) mR8、NR5C (0) C (0) NR5R5、NR6C (0) C (0) NR5R6、或 NR5C (0) C (0) NR5R6。在多個實施方案中，R2獨立地為OR5。在一些實施方案中，R2獨立地為SR9。在某 些實施方案中，R2獨立地為NR5R5或NR5R6。在特定的實施方案中，R2獨立地為S(0)mR9、S(0) mNR5R5或S(0)mNR5R6。在多個實施方案中，R5獨立地為任選取代的芳基或雜芳基，或在一些 實施方案中，為任選取代的烷基、環烷基或雜烷基。在多個實施方案中，R9可獨立地包括任 選取代的芳基或雜芳基，或在一些實施方案中，為任選取代的環烷基、雜烷基或具有2個或 更多個碳的烷基。治療以蛋白質運輸受損為特徵的病症的方法，其包括給予受試者以上述實施方案 的任一化合物或使細胞與該化合物接觸。在多個實施方案中，病症為溶酶體貯積症(lysosomal storage disorder)。在 一些實施方案中，所述溶酶體貯積症為法布裡病(Fabry disease)、法韋爾病(Farber disease)、戈謝病(Gaucher disease)、GMi-神經節苷脂 C積病(GMfgangliosidosis)、 泰-薩克斯病(Tay-Sachs disease)、桑德霍夫病(Sandhoffdisease)、GM2 激活劑 病(GM2 activator disease)、克拉伯病(Krabbe disease)、異染性腦白質營養不良 (metachromatic leukodystrophy)、尼曼一皮克二氏病(八、8禾口(型)(Niemann—Pick disease (types A,B,and C))、胡爾勒病(Hurlerdisease)、沙伊病(Scheie disease)、亨特 病(Hunter disease)、桑菲列普病(Sanf ilippo disease)、莫爾丘病(Morquio disease)、 馬 _ (Maroteaux-Lamydisease) ^^BJMStBli^S.S (hyaluronidase deficiency) > 天冬氨醯葡糖胺尿症(aspartylglucosaminuria)、巖藻糖苷貯積症(fucosidosis), 甘露糖苷貯積症(mannosidosis)、欣德勒病(Schindler disease)、1型唾液酸貯積症 (sialidosis typel)、蓬佩病(Pompe disease)、緻密性成骨不全症(Pycnodysostosis)、 蠟樣脂褐質沉積症(ceroid lipofuscinosis)、膽固醇酯貯積症(cholesterol ester storagedisease)、沃爾曼病(Wolman disease)、多種硫酸酉旨酶缺乏症(Multiple sulfatase)、半乳糖涎酸貯積症(galactosialidosis)、粘多糖症(II、III和IV型) (mucolipidosis (types II，III，and IV))、胱氨酸貯積症(cystinosis)、唾液酸貯積症 (sialic acidstorage disorder)、伴隨馬-舍症候群的乳糜微粒滯留病(chylomicron retentiondisease with Marinesco-Sjogren syndrome)、赫曼斯基-普德拉克症候群 (Hermansky-Pudlak syndrome)、切-東二氏症候群(Chediak-Higashi syndrome)、Danon 病(Danon disease)或 Geleophysic 發育不良(Geleophysic dysplasia)。在一些實 施方案中，所述疾病的特徵在於物質向細胞腔隙的遞送受損。溶酶體貯積症綜述於例如 Wilcox(2004) J. Pediatr. 144 :S3_S14 中。在一些實施方案中，以蛋白質運輸受損為特徵的疾病為囊性纖維化。囊性纖維化 的特徵可在於蛋白質運輸受損、囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)活性受損，或在於蛋 白質運輸受損且CFTR活性受損。在一些實施方案中，以蛋白質運輸受損為特徵的疾病為糖尿病類疾病(disbetes)，例如，糖尿病(diabetes mellitus)。在一些實施方案中，以蛋白質運輸受損為 特徵的疾病不是糖尿病類疾病，例如，糖尿病。在一些實施方案中，以蛋白質運輸受損為特徵的疾病的特徵在於物質向細胞腔隙 的遞送受損。在一些實施方案中，以蛋白質運輸受損為特徵的疾病的特徵在於Rab27a突變或 Rab27a缺陷。該病症可以是，例如格裡塞利症候群(Griscellisyndrome)。在多個實施方案中，該病症是突觸核蛋白病。所述突觸核蛋白病可以是帕金森氏 病、家族性帕金森氏病、路易體疾病、阿爾茨海默病路易體變異型、路易體痴呆、多系統萎縮 症或關島震顫麻痺痴呆症候群。突觸核蛋白為一族包括α-、β-和Y-突觸核蛋白的小突觸前神經元蛋白，其 中只有α-突觸核蛋白聚集體與一些神經疾病有關(Ian等人，ClinicalNeurosc. Res. 1 445-455，2001 ；Trojanowski 和 Lee, Neurotoxicology23 :457_460，2002)。從一些觀測中 揭示了突觸核蛋白(且尤其是α-突觸核蛋白)在許多神經變性和/或澱粉樣蛋白病的病 因學中的作用。病理學上，將α-突觸核蛋白確定為路易體的主要成分，帕金森氏病的標誌 內含物，且其片段已從不同神經疾病、阿爾茨海默病的澱粉樣斑中分離出。生物化學上，重 組的α-突觸核蛋白表現出形成澱粉樣原纖維，其再現了從患有伴隨路易體痴呆、帕金森 氏病和多系統萎縮症的患者中分離的α-突觸核蛋白的超微結構特徵。而且，在α-突觸 核蛋白基因中的突變的鑑定(雖然僅在少數家族性帕金森氏病病例中)證明突觸核蛋白 病理學和神經變性病之間的明確的聯繫。在例如帕金森氏病、路易體痴呆(dementia with Lewy bodies)、多系統萎縮症和阿爾茨海默病的路易體變異型的疾病譜中通常涉及α-突 觸核蛋白，已經導致這些疾病分類到涵蓋性的術語「突觸核蛋白病」下。在一些實施方案中， 所述以蛋白質運輸受損為特徵的疾病不是突觸核蛋白病。在多個實施方案中，所述以蛋白質運輸受損為特徵的疾病為遺傳性肺 氣月中(hereditary emphysema)> α -1-抗月夷蛋白醇缺乏症(α -1-antitrypsin deficiency)、遺傳'性血色素沉著病(hereditary hemochromatosis)、目艮皮膚白化病 (oculocutaneous albinism)、蛋白質 C 缺乏(protein C deficiency)、I 型遺傳性血管 性水腫(type I hereditary angioedema)、先天性蔗糖酶異麥芽糖酶缺乏(congenital sucrase-isomaltase deficiency) > II 型克-納症候群(Crigler-Najjar typell)、 拉龍症候群(Laron syndrome)、遺傳性髓過氧物酶(hereditaryMyeloperoxidase)、原 發性甲狀腺機能減退症(primary hypothyroidism)、先天性長QT症候群(congenital long QT syndrome)、甲狀腺素結合的球蛋白缺乏(thyroxine binding globulin deficiency)、家族性高膽固醇血症(familialhypercholesterolemia)、家族性乳糜微 粒血症(familial chylomicronemia)、無 β -月旨蛋白血症(abeta—lipoproteinema)、 低血漿脂蛋白a水平(low plasmalipoprotein a levels)、伴有肝受損的遺傳性 月市氣月中(hereditary emphysema withliver injury)、先天性甲狀腺功能減退症 (congenital hypothyroidism)、成骨不全(osteogenesis imperfecta)、遺傳性低纖 維蛋白原血症(hereditaryhypofibrinogenemia), α-1-抗糜蛋白酶缺乏症(α -1-an tichymotrypsindef iciency)、腎性尿崩症(nephrogenic diabetes insipidus)、垂體 神經性尿崩症(neurohypophyseal diabetes insipidus)、夏科-馬裡-圖思症候群(Charcot-Marie-Tooth syndrome)、ft 禾[I 措伊 Jff __ 茨 EL 赫病(PelizaeusMerzbacher disease)、IIA 型馮·威利布蘭德病(von Willebrand disease type IIA)、結合因子 V 和 VIII 缺乏(combined factors V and VIII deficiency)、脊椎骨飯遲緩性發育不 良(spondylo-epiphyseal dysplasia tarda) > ^C II/JC ^ IM S (choroideremia)、I 細 Ifi 病(I cell disease)、巴藤病(Batten disease)、共濟失調-毛細血管擴張症(ataxia telangiectasias)、急性成淋巴細胞性白血病(acutelymphoblastic leukemia)、急性髓細 胞樣白血病(acute myeloid leukemia)、髓細胞性白血病(myeloid leukemia)、ADPKD-常
(ADPKD-autosomal dominant polycystic kidney disease)、· 絨毛包含病(microvillus inclusion disease)、結節性硬化症(tuberous sclerosis)、 洛氏眼-腦-腎症候群(oculocerebro-renal syndrome of Lowe)、肌萎縮側索硬化 (amyotrophic lateral sclerosis)、骨髓土曾生異常症候群(myelodysplasticsyndrome)、 裸淋巴細胞症候群(Bare lymphocyte syndrome)、丹吉爾病(Tangierdisease)、家族 性肝內膽汁淤積(familial intrahepatic cholestasis)、X-連鎖腎上腺腦白質營 養不良(X-linked adreno-leukodystrophy)、斯禾鬥特症候群(Scottsyndrome)、1 型 和2型赫曼斯基-普德拉克症候群(Hermansky-Pudlak syndrometypes 1 and 2)、 澤耳韋格症候群(Zellweger syndrome)、肢近端型點狀軟骨發育異常(rhizomelic chondrodysplasia puncta)、常染色體隱性原發性高草酸尿症(autosomal recessive primary hyperoxaluria)、Mohr Tranebjaerg _ ☆ IE (MohrTranebjaerg syndrome)、 脊髓延髓性肌萎縮症(spinal and bullar muscularatrophy)、原發性纖毛運動障 礙(卡塔格納症候群)(primary ciliary diskenesia(Kartagener『 s syndrome))、 米-迪症候群(Miller Dieker syndrome)、無腦回畸形病(Iissenc^phaly)、運動 神經元病(motor neuron disease)、烏其j 赫爾症候群(Usher，s syndrome)、威其jf 科特-奧爾德裡奇二氏症候群(Wiskott-Aldrichsyndrome)、Optiz症候群(Optiz syndrome)、亨廷頓舞蹈病(Huntington，sdisease)、遺傳性胰腺炎(hereditary pancreatitis)、抗磷脂症候群(anti-phospholipid syndrome)、重疊結締組織病 (overlap connective tissuedisease)、舍格倫症候群(Sj6gren，S syndrome)、 δ 本胃☆ IE (stiff-mansyndrome)、Brugada _ ☆ IE (Brugada syndrome)、費氏 天性腎症候群(Finnishcongenital nephritic syndrome)、杜賓-詹森症候群 (Dubin-Johnsonsyndrome)、 X-連鎖低憐血症(X-linked hypophosphosphatemia)、 潘德雷德症候群(Pendred syndrome)、持續性幼兒型胰島素過度分泌低血糖症 (persistenthyperinsulinemic hypoglycemia of infancy)、遺傳j"生球形紅細胞i曾多症 (hereditary spherocytosis)、無銅藍蛋白血症(aceruloplasminemia)、嬰兒型神經元 蠟樣質脂褐質沉積病(infantile neuronal ceroid lipofuscinosis)、假性軟骨發育不 全禾口多重骨Ife (pseudoachondroplasia and multiple epiphyseal)、斯塔力口特樣黃斑營 養不良(Stargardt-like macular dystrophy)、X-連鎖夏科-馬裡-圖思病(X-linked Charcot-Marie-Tooth disease)、常染色體顯性色素性視網膜炎(autosomal dominant retinitis pigmentosa)、Wolcott-Rallison 症候群(WoIcott-RalIison syndrome)、庫 斤文病(Cushing' s disease)、肢帶型月/L營養不良症(limb-girdle muscular dystrophy) > IV型粘多糖病(mucoploy-saccharidosistype IV)、芬蘭型遺傳性家族性澱粉樣變性(Finnish hereditary familialamyloidosis)、IV 型糖原C積症(安德森病)(Glycogen storage disease type IV (Andersen，s disease))、肉瘤(sarcoma)、慢性骨髓單核細 胞性白血病(chronicmyelomonocytic leukemia)、心肌病(cardiomyopathy)、面生殖發 育異常(faciogenital dysplasia)、Torsion 病(Torsion disease)、亨廷頓禾口 脊髓小 腦性共濟失調(Huntington and spinocerebellar ataxias)、遺傳性高同型半胱氨酸血 症(hereditary hyperhomosyteinemia)、多發個生神經病(polyneuropathy)、下位運動神 經元病(lower motor neuron disease)、色素視網膜炎(pigmented retinitis)、血清陰 性多關節炎(seronegative polyarthritis)、間質性月市纖維化(interstitialpulmonary fibrosis)> 雷諾現象(Raynaud， s phenomenon)、韋格納肉芽月中病(ffegner' s granulomatosis)、蛋白尿(preoteinuria)、CDG-Ia> CDG-Ib> CDG-Ic、CDG-Id、CDG-Ie、 CDG-If、CDG-Ila, CDG-Ilb, CDG-IIc, CDG-IId、埃勒斯-當洛斯症候群(Ehlers-Danlos syndrome)、多發性外生骨疣(multipleexostoses)、格裡塞利症候群(Griscelli syndrome，1型或2型)或X-連鎖非特異性智力發育遲緩(X-linked non-specific mental retardation)。以蛋白質運輸受損為特徵的病症綜述於Aridor等人(2000)Traffic 1 836-51 和 Aridor 等人(2002) Traffic 3 :781_90 中。治療以蛋白質運輸受損為特徵的病症的方法，其包括將圖3B、4B、8A、8B、8C、9A、 9B、9C或9D中任何一個所表示的化合物或其藥學可接受的鹽或衍生物給藥於受試者或者 與細胞進行接觸。這些化合物也包括化合物的中性或非鹽形式，例如在所要求保護的化合物和在附 圖、表I或實施例中所公開的具體化合物的中性或非鹽形式。本文也提供了本文所述的化合物的藥學可接受的衍生物，包括其鹽、酯、烯醇醚、 烯醇酯、溶劑合物、水合物和前藥。藥學可接受的鹽包括，但不限於胺鹽，例如但不限制於N， N' - 二苄基亞乙基二胺、氯普魯卡因、膽鹼、氨、二乙醇胺和其它羥基烷基胺、亞乙基二胺、 N-甲基葡萄糖胺、普魯卡因、N-苄基苯乙基胺、1-對氯苄基-2-吡咯烷-1 『-基甲基苯並 咪唑、二乙基胺和其它烷基胺、哌嗪和三(羥基甲基)氨基甲烷；鹼金屬鹽，例如但不限制於 鋰、鉀和鈉；鹼土金屬鹽，例如但不限制於鋇、鈣和鎂；過渡金屬鹽，例如但不限制於鋅，鋁， 和其它金屬鹽，例如但不限制於磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉；且包括但不限制於無機酸鹽，例 如但不限制於鹽酸鹽和硫酸鹽；和有機酸鹽，例如但不限制於乙酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽、酒 石酸鹽、檸檬酸鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、丁酸鹽、戊酸鹽和富馬酸鹽。本發明還提供了含有任何本文所述的化合物和藥學可接受的載體的藥物組合物。 在一種實施方案中，配製該藥物組合物用於單劑量給藥。根據本文所述的方法治療的受試者可以是人或其它哺乳動物，如小鼠、大鼠、牛、 豬、狗、貓和猴。本發明也提供了製備蛋白質的方法，該方法包括下述步驟在本文所述的化合物 存在下(如表I中所述的化合物)培養細胞；純化細胞產生的蛋白質，其中在所述化合物存 在下培養細胞與該化合物不存在下培養細胞相比，導致產生了更多純化的蛋白質。該蛋白 質可以為異源核酸編碼的重組蛋白質。在一些實施方案中，該蛋白質為分泌性蛋白和/或 糖基化的蛋白質。例如，該蛋白質可以為細胞因子、淋巴因子、生長因子或抗體。用於蛋白 質製備方法中的細胞可以為，例如昆蟲細胞、哺乳動物細胞(如中國倉鼠卵巢細胞)、真菌細胞或細菌細胞。在實施該方法時，給予有效量的所述化合物或包含治療有效濃度的所述化合物的 組合物。提供的製品包含包裝物質、本文提供的用於治療或改善蛋白質運輸病症的一種或 多種症狀的化合物或組合物、以及說明所述化合物和組合物用於治療或改善蛋白質運輸病 症的一種或多種症狀的標籤。在所附的附圖和下述說明書中詳細描述了本發明的一種或多種實施方案。通過說 明書和附圖以及權利要求書，本發明的其他特點、目的、和優點將是明顯的。


圖Ia和Ib描述了本文說明的某些化合物例如根據式I的化合物的結構。圖Ic和Id描述了某些化合物的結構。圖Ie描述了一些游離鹼化合物的結構。圖If描述了一些作為鹽酸鹽的化合物的結構。圖2描述了某些化合物的結構。圖3A和3B描述了某些化合物的結構。圖4A和4B描述了某些化合物的結構。圖5A和5B描述了某些化合物的結構。圖6描述了某些化合物的結構。圖7描述了某些化合物的結構。圖8A 8C描述了某些化合物的結構。圖9A 9D描述了某些化合物的結構。圖IOA和1IA顯示了化合物25和5 (見表1中的化合物結構)分別在從0 10 μ M 的不同濃度下的Yptl-ts蛋白質印跡數據與濃度的關係。圖IOB和1IB是來自IOA和1IA的光密度數據曲線。發明詳述A.定義除非另有說明，本文所用的所有技術和科學術語為本發明所屬領域技術人員通常 理解的含義。雖然與本文所述的相似或等價的方法和材料可以用於本發明的實際應用或檢 測，但下述內容描述了優選的方法和材料。所有的專利、申請、公開的申請和其它出版物在 此整個引入作為參考。當本文所用的術語具有多個含義時，除另有說明採用其常用含義。而 且，所述材料、方法和實施例僅是示例性的而不是為了限制。本文也提供了治療或改善蛋白質運輸病症的一種或多種症狀的方法。所述疾病包 括例如囊性纖維化。在一些實施方案中，所述以蛋白質運輸受損為特徵的疾病為糖尿病類疾病，例如， 糖尿病。在一些實施方案中，所述以蛋白質運輸受損為特徵的疾病為突觸核蛋白病。突觸 核蛋白病的實例包括帕金森氏病、路易體病、阿爾茨海默病的路易體變異型、路易體的痴 呆、多系統萎縮症或關島震顫麻痺痴呆症候群。
本文所用的α-突觸核蛋白指結構相關蛋白家族中的一種，這類蛋白主要在中樞 神經系統中表達。聚集的α-突觸核蛋白形成腦損傷，所述腦損傷是一些神經變性疾病 (突觸核蛋白病症)的標誌。對於α-突觸核蛋白的基因(稱作SNCA)，在染色體4q21上。 一種形式的遺傳帕金森氏病是由於SNCA中的突變。另一種形式的遺傳帕金森氏病是由於 SNCA的三倍體化。突觸核蛋白是小、突觸前神經蛋白家族，由α-、β-和Y-突觸核蛋白組 成，其中僅α _突觸核蛋白聚集與幾種神經疾病相關(Ian等人，Clinical Neurosc. Res. 1 445-455,2001 ；Trojanowski 和 Lee，Neurotoxicology 23:457-460,2002)。從一些觀測中 揭示了突觸核蛋白(且尤其是α-突觸核蛋白)在許多神經變性和/或澱粉樣蛋白病的病 因學中的作用。病理學上，確定α-突觸核蛋白是路易體的主要成分，帕金森氏病的標誌 內含物，且其片段從不同神經疾病、阿爾茨海默病的澱粉樣斑中分離。生物化學上，重組的 α-突觸核蛋白表現出形成澱粉樣原纖維，其再現了從患有伴隨路易體痴呆、帕金森氏病和 多系統萎縮症的患者中分離的α-突觸核蛋白的超微結構特徵。而且，在α-突觸核蛋白 基因中的突變的鑑定(雖然僅在少數家族性帕金森氏病病例中)證明突觸核蛋白病和神經 變性病之間的明確的聯繫。α -突觸核蛋白與疾病譜，例如帕金森氏病、路易體痴呆、多系統 萎縮和阿爾茨海默病的路易體變型中的普遍相關，導致這些疾病被分類涵蓋性的術語「突 觸核蛋白病症」下。在一些實施方案中，所述以蛋白質運輸受損為特徵的疾病不是突觸核蛋白病。在一些實施方案中，所述以蛋白質運輸受損為特徵的疾病為溶酶體貯積症 (lysosomal storage disorder)，如法布裡病、法韋爾病、戈謝病、GM1-神經節苷脂貯積病、 泰_薩克斯病、桑德霍夫病、GM2激活劑病、克拉伯病、異染性腦白質營養不良、尼曼_皮克 二氏病(A、B和C型)、胡爾勒病、沙伊病、亨特病、桑菲列普病、莫爾丘病、馬-拉病、透明 質酸酶缺乏症、天冬氨醯葡糖胺尿症、巖藻糖苷貯積症、甘露糖苷貯積症、欣德勒病、1型唾 液酸貯積症、蓬佩病、緻密性成骨不全症、蠟樣脂褐質沉積症、膽固醇酯貯積症、沃爾曼病、 多種硫酸酯酶缺乏症、半乳糖涎酸貯積症、粘多糖症(II、III和IV型)、胱氨酸貯積症、唾 液酸貯積症、伴隨馬_舍症候群的乳糜微粒滯留病、赫曼斯基_普德拉克症候群、切_東二 氏症候群、Danon病或Geleophysic發育不良。溶酶體貯積症綜述於，例如Wilcox (2004) J. Pediatr. 144 :S3_S14 中。在一些實施方案中，以蛋白質運輸受損為特徵的疾病的特徵在於物質向細胞腔隙 的遞送受損。在一些實施方案中，以蛋白質運輸受損為特徵的疾病的特徵在於Rab27a突變或 Rab27a缺陷。該病症可以是，例如格裡塞利症候群(Griscellisyndrome)。在一些實施方案中，所述以蛋白質運輸受損為特徵的疾病為遺傳性肺氣腫、遺 傳性血色素沉著病、眼皮膚白化病、蛋白質C缺乏、I型遺傳性血管性水腫、先天性蔗糖 酶異麥芽糖酶缺乏、II型克-納症候群、拉龍症候群、遺傳性髓過氧物酶(hereditary Myeloperoxidase)、原發性甲狀腺機能減退症、先天性長QT症候群、甲狀腺素結合球蛋白 缺乏、家族性高膽固醇血症、家族性乳糜微粒血症、無脂蛋白血症、低血漿脂蛋白a水 平、伴有肝受損的遺傳性肺氣腫、先天性甲狀腺功能減退症、成骨不全、遺傳性低纖維蛋白 原血症、α-1-抗糜蛋白酶缺乏症、腎性尿崩症、垂體神經性尿崩症、夏科-馬裡-圖思綜 合徵、佩利措伊斯_梅茨巴赫病、IIA型馮·威利布蘭德病、結合因子V和VIII缺乏、脊椎
29骨骺遲緩性發育不良、無脈絡膜症、I細胞病、巴藤病、共濟失調-毛細血管擴張症、急性成 淋巴細胞性白血病、急性髓細胞樣白血病、髓細胞性白血病、ADPKD-常染色體顯性多囊性 腎病、微絨毛包含病、結節性硬化症、洛氏眼-腦-腎症候群、肌萎縮側索硬化、骨髓增生異 常症候群、裸淋巴細胞症候群、丹吉爾病、家族性肝內膽汁淤積、X-連鎖腎上腺腦白質營養 不良、斯科特症候群、1型和2型赫曼斯基-普德拉克症候群、澤耳韋格症候群、肢近端型點 狀軟骨發育異常、常染色體隱性原發性高草酸尿症、Mohr Tranebjaerg症候群、脊髓延髓 性肌萎縮症、原發性纖毛運動障礙(卡塔格納症候群)、米_迪症候群、無腦回畸形病、運動 神經元病、烏斯赫爾症候群、威斯科特-奧爾德裡奇二氏症候群、Optiz症候群、亨廷頓舞 蹈病、遺傳性胰腺炎、抗磷脂症候群、重疊結締組織病、舍格倫症候群、僵體症候群、Brugada 症候群、費氏先天性腎症候群、杜賓-詹森症候群、X-連鎖低磷血症、潘德雷德症候群、 持續性幼兒型胰島素過度分泌低血糖症、遺傳性球形紅細胞增多症、無銅藍蛋白血症、嬰 兒型神經元蠟樣質脂褐質沉積病、假性軟骨發育不全和多重骨骺、斯塔加特樣黃斑營養不 良(Stargardt-like maculardystrophy)、X-連鎖夏科-馬裡-圖思病、常染色體顯性色 素性視網膜炎、Wolcott-Rallison症候群、庫欣病、肢帶型肌營養不良症、IV型粘多糖病 (mucoploy-saccharidosis type IV)、芬蘭型遺傳性家族性澱粉樣變性、IV型糖原貯積症 (安德森病)、肉瘤、慢性骨髓單核細胞性白血病、心肌病、面生殖發育異常、Torsion病、亨 廷頓和脊髓小腦性共濟失調、遺傳性高同型半胱氨酸血症、多發性神經病、下位運動神經元 病、色素視網膜炎、血清陰性多關節炎、間質性肺纖維化、雷諾現象、韋格納肉芽腫病、蛋白 尿(preoteinuria)、CDG-Ia, CDG-Ib, CDG-Ic, CDG-Id, CDG-Ie, CDG-If、CDG-IIa, CDG-IIb, ⑶G-IIc、⑶G-IId、埃勒斯-當洛斯症候群、多發性外生骨疣、格裡塞利症候群(1型或2型) 或X-連鎖非特異性智力發育遲緩。以蛋白質運輸受損為特徵的病症綜述於Aridor等人 (2000) Traffic 1 :836_51 和 Aridor 等人(2002) Traffic 3 :781_90 中。本文所用的化合物的藥學可接受衍生物包括其鹽、酯、烯醇醚、烯醇酯、縮醛、縮 酮、原酸酯、半縮醛、半縮酮、酸、鹼、溶劑合物、水合物或前藥。這些衍生物可以由本領域技 術人員使用對於這些衍生化已知的方法方便地製備。製備的化合物可以給藥至動物或人， 而基本上不會產生毒性作用，且具有藥學活性或為前藥。藥學可接受的酯包括，但不局限於羧酸基團的烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳 烷基、雜芳烷基、環烷基和雜環基酯，包括但不局限於羧酸、磷酸、次膦酸、磺酸、亞磺酸和 硼酸。藥學可接受的烯醇醚包括但不局限於式C = C(OR)的衍生物，其中R為氫、烷基、 烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、環烷基或雜環基。藥學可接受的烯醇酯包括，但不局限於式C = C(OC(O)R)的衍生物，其中R為氫、 烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、環烷基或雜環基。藥學可接受的溶劑合 物和水合物為化合物與一個或多個溶劑或水分子，或1至約100，或1至約10，或1至約2、 3或4個溶劑或水分子的複合物。本發明中也包括所公開化合物的藥學可接受的鹽。這些所公開的化合物具有一 個或多個足夠酸性的質子，其能與適合的有機或無機鹼反應形成鹼加成鹽。當化合物具有 與氧、氮或硫原子相連的氫原子時，認為所述化合物也包括其鹽，其中該氫原子與適合的有 機或無機鹼反應形成鹼加成鹽。鹼加成鹽包括從無機鹼例如銨或鹼金屬或鹼土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽等衍生的，從有機鹼例如醇鹽、烷基醯胺、烷基和芳基胺等衍生的鹼加 成鹽。因此這些用於製備本發明的鹽的鹼包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、碳酸鉀等。例如，所公開化合物藥學可接受的鹽可包括所公開化合物與1當量適合的鹼反應 形成單價鹽(即，所述化合物具有單個負電荷，其通過藥學可接受的相反的陽離子，例如單 價陽離子平衡)或與2當量適合的鹼形成二價鹽(例如，所述化合物具有2個電子的負電 荷，其通過2個藥學可接受的相反的陽離子，例如，2個藥學可接受單價陽離子或單個藥學 可接受二價陽離子平衡)。「藥學可接受」是指適合向受試者給藥的陽離子。實例包括鹼金 屬陽離子，例如但不限於Li+、Na+、K+ ；鹼土金屬陽離子，例如但不局限於Ba2+、Mg2+、Ca2+ ；過 渡金屬陽離子，例如但不局限於Zn2+和其它金屬鹽；和NR4+,其中各個R獨立地為氫、任選 被取代的脂肪族基團(例如，羥基烷基、氨基烷基、或銨烷基)或任選被取代的芳基，或兩個 R基團一起形成任選被取代的非-芳香雜環，其任選與芳環稠合。例如，鹽可以通過與胺形 成，所述胺包括但不局限於N，N' - 二苄基乙二胺、氯普魯卡因、膽鹼、氨、二乙醇胺和其它 羥基烷基胺、乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、普魯卡因、N-苄基苯乙基胺、1-對氯苄基-2-吡咯 烷-1'-基甲基-苯並咪唑、二乙胺和其它烷基胺、哌嗪和三(羥基甲基)氨基甲烷。在一 些實施方案中，所述藥學可接受的陽離子為Li+、Na+、K+、NH3 (C2H5OH) +或N(CH3) 3 (C2H5OH) +。具有足夠鹼性基團(例如胺)的所公開化合物的藥學可接受的鹽，可以通過所公 開化合物與有機或無機酸反應形成酸加成鹽而形成。通常用於與具有鹼性基團的化合物形 成酸加成鹽的酸包括無機酸例如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、磷酸等，和有機酸例如對甲苯 磺酸、甲磺酸、草酸、對溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、檸檬酸、苯甲酸、乙酸等。這些鹽的實例包括 硝酸鹽、硼酸鹽、三氟乙酸鹽、硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磷酸鹽、 磷酸一氫鹽、磷酸二氫鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、乙酸鹽、丙酸 鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、丙烯酸鹽、甲酸鹽、丁酸鹽、戊酸鹽、異丁酸鹽、己酸鹽、庚酸鹽、丙炔酸 鹽、草酸鹽、丙二酸、丁二酸鹽、辛二酸鹽、癸二酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、丁炔-1，4-二酸 鹽、己炔-1，6-二酸鹽、抗壞血酸鹽、水楊酸鹽、苯甲酸鹽、氯苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、二硝 基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、磺酸鹽、苯磺酸鹽、甲苯磺酸 鹽、二甲苯磺酸鹽、苯基乙酸鹽、苯基丙酸鹽、苯基丁酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、γ-羥基丁酸 鹽、乙醇酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、丙磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽、萘-2-磺酸鹽、扁桃酸鹽等。在 一些實施方案中，所公開化合物與下述物質形成藥學可接受HC1、HF、HBr, HI、三氟乙酸或 硫酸。尤其在一些實施方案中，所公開化合物與硫酸形成藥學可接受的鹽。多個實施方案涉及本文所述化合物的藥學可接受的鹽，其分別相對於化合物的遊 離鹼。在一些實施方案中，藥學可接受的鹽為鹽酸鹽。本發明也包括藥學可接受的溶劑合物。本文所用的術語"溶劑合物"指本發明的 化合物或其鹽進一步包括化學計量或非化學計量的溶劑，例如，水或有機溶劑，它們通過非 共價分子內力結合。本文所用的治療指任何方式，其中病症的一種或多種症狀得到改善或以其它方式 得到有利的改變。治療也包括本文化合物和組合物的任何藥物用途，例如治療其中涉及蛋 白質運輸的病症的用途。治療包括對患有蛋白質運輸病症的受試者進行治療性給藥，其中 該所述治療可防止、阻止、延緩、停止、降低或中斷蛋白質運輸疾病的病因、發病率或症狀。 治療也包括對具有患上蛋白質運輸病症風險的受試者或蛋白質運輸病症或症狀發生惡化風險的受試者進行預防性給藥。預防性給藥所述化合物會降低患上蛋白質病症的風險，或 蛋白質運輸病症惡化的風險，其中該預防性給藥會防止、阻止、延緩、停止、降低或中斷上述 風險的病因、發病率或症狀。本文所用的通過給藥特定的化合物或藥物組合物而改善特定 病症的症狀是指任何減輕，永久的或暫時的，持續的或瞬時的，所述減輕歸因於給藥所述組 合物或者與給藥所述化合物有關。本文所用的IC5tl是指實現最大作用的50%抑制時具體檢測化合物的量、濃度或劑量。本文所用的EC5tl是指導致劑量依賴響應為特定作用的50%最大表達的特定檢測 化合物的劑量、濃度或量，所述響應由特定檢測化合物引起、引發或產生，例如在所述作用 的測試中對CFTR(囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白)活性的調節。本文所用的最低拯救濃度(Minimum Rescue Concentration, MRC)是在觀察到細 胞生長或細胞活力恢復高於背景時化合物的最低濃度，觀察到的細胞生長或細胞活力恢復 高於背景作為由特定檢測化合物引起、引發或產生的特定響應。例如，在細胞毒性環境下， 例如在α-突觸核蛋白誘導的細胞毒性中，可以拯救細胞活力或生長。而且，例如可以在溫 度敏感突變體存在時在限制性溫度下測量細胞活力或生長。本文所用的前藥是指一種化合物，其在體內給藥後，通過一個或多個步驟或過程 代謝或其它方式轉化而代謝為生物學、藥學或治療活性形式的化合物。為了製備前藥，修 飾藥學活性化合物使得活性化合物將通過代謝過程再次產生。可以設計前藥以改變藥物 代謝穩定性或轉運特性，以掩蔽副作用或毒性，以改善藥物的味道，或以改變藥物的其它特 性或性質。根據體內藥效學過程和藥物代謝的知識，本領域技術人員在知曉藥學活性化 合物時，便能夠設計該化合物的前藥(參見，例如，Nogrady(1985)Medicinal Chemistry ABiochemical Approach, Oxford University Press, New York,第 388-392 頁)。應該理解本文提供的化合物可以包含手性中心。這些手性中心可以為(R)或⑶ 構型，或可以為其混合物。因此，本文提供的化合物可以為對映體純，或為立體異構或非對 映異構混合物。在胺基酸殘基的情況中，這些殘基可以為L-或D-型。對於天然存在的氨基 酸殘基的構型通常為L。當沒有特定指出時，殘基為L型。本文所用的術語"胺基酸"是指 α-胺基酸，其為外消旋體，或D-或L-構型。胺基酸符號前面的的符號"d"(例如，dAla、 dSer、dVal等)是指胺基酸的D-異構體。胺基酸符號前面的符號"dl"(例如，dlPip) 指胺基酸的L-和D-異構體的混合物。應該理解本文提供的化合物的手性中心在體內可能 產生差向異構化。這樣，本領域技術人員將認識到對於在體內產生差向異構化的化合物來 說，給藥(R)形式的化合物與給藥(S)形式的化合物是相同的。本文所用的基本上純是指足夠的同質化(homogeneous)，使得當通過本領域技術 人員用於檢測雜質的標準分析方法(例如薄層色譜法(TLC)、凝膠電泳、高效液相色譜法 (HPLC)和質譜(MS))檢測時沒有明顯可檢測的雜質，或指足夠純使得進一步純化不能明顯 改變物質的物理和化學性質，例如酶和生物活性。純化化合物以製備基本上化學純的化合 物的方法對於本領域技術人員是已知的。然而基本上化學純的化合物可以為立體異構體的 混合物。在這種情況中，進一步純化可能提高該化合物的比活性。本文所用的「烷基」、「烯基」和「炔基」碳鏈，如果沒有說明，則含有1 20個碳， 或1或2 16個碳，並且在多個實施方案中為直鏈、支鏈或環狀，或在一些實施方案中，為直鏈或支鏈。2 20個碳的烯基碳鏈，在一些實施方案中，含有1 8個雙鍵，且2 16個 碳的烯基碳鏈，在一些實施方案中，含有1 5個雙鍵。2 20個碳的炔基碳鏈，在一些實 施方案中，含有1-8個叄鍵，且2 16個碳的炔基碳鏈，在一些實施方案中，含有1 5個 叄鍵。本文中示例性的烷基、烯基和炔基包括，但不局限於，甲基、乙基、丙基、異丙基、異丁 基、正丁基、仲丁基、叔丁基、異戊基、新戊基、叔-戊基、異己基、烯丙基(丙烯基)和炔丙基 (丙炔基)。本文所用的低級烷基、低級烯基和低級炔基是指具有從約1或約2個碳至約6 個碳的碳鏈。本文所用的"alk(en)(yn)yl"是指含有至少一個雙鍵和至少一個叄鍵的烷 基。本文所用的"環烷基"是指飽和單-或多-環體系，在一些實施方案中包含3 10個碳原子，在另一些實施方案中包含3 6個碳原子；環烯基和環炔基是指單_或多環體 系，其分別包括至少一個雙鍵和至少一個叄鍵。在一些實施方案中，環烯基和環炔基可以含 有3 10個碳原子，對於環烯基，在另一些的實施方案中含有4 7個碳原子，而對於環炔 基，在另外的實施方案中含有8 10個碳原子。環烷基、環烯基和環炔基的環體系可以包 括一個環或2個或更多個環，它們以稠合、橋接或螺合方式連接在一起。「環alk(en)(yn) yl"是指含有至少一個雙鍵和至少一個叄鍵的環烷基。本文所用的"芳基"是指任選被取代的含有6 19個碳原子的芳香單環或多環 基團。「芳基」的實例包括苯基、聯苯基等。芳基也包括稠合多環芳環體系，例如萘基、四氫 萘基、芘基、蒽基、9，10-二氫蒽基、芴基、茚基、茚滿基等，其中碳環芳環與一個或多個其它 芳基、環烷基或脂肪族環稠合。本文所用的"雜芳基"是指任選被取代的單環或多環芳環體系，在某些實施方案 中為約5至約15元環，其中環系統中的一個或多個原子，在多個實施方案中為1 4個，在 一些實施方案中為1 3個環系統中的原子為雜原子，包括但不局限於，氮、氧或硫。雜芳 基可任選與苯環稠合。雜芳基的實例包括任選被取代的吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、吡 喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、四唑基、噻吩基、噻唑基、異 噻唑基、呋喃基、噁唑基、異噁唑基等。雜芳基也包括稠合的多環芳環體系，其中雜芳環與一 個或多個其它雜芳基、芳基、雜環基、環烷基或脂肪族環稠合，例如，任選被取代的喹啉基、 異喹啉基、喹唑啉基、萘啶基、吡啶並嘧啶基、苯並噻吩基、苯並噻唑、苯並異噻唑基、噻吩並 吡啶基、噻唑並吡啶基、異噻唑並吡啶基、苯並呋喃基、苯並噁唑基、苯並異噁唑基、呋喃並 吡啶基、噁唑並吡啶基、異噁唑並吡啶基、噴哚基、異吲哚基、苯並咪唑基、苯並吡唑基、吡咯 並吡啶基、異吡咯並吡啶基、咪唑並吡啶基、吡唑並吡啶基等。作為本文取代基引入的任何環可以通過環中的任何可取代的原子結合。本文所用的"雜芳鐺"為在一個或多個雜原子上帶有正電荷的雜芳基。本文所用的"雜環基"是指任選被取代的單環或多環非芳環體系，在多個實施方 案中，為3 10元環，在另一個實施方案中，為4 7元環，在另一個實施方案中為5 6元 環，其中在環體系中一個或多個，在一些實施方案中為1 4個，在某些實施方案中為1 3 個原子為雜原子，包括但不局限於，氮、氧或硫。雜環基的實例包括噁唑啉基、噻唑啉基、噁 唑烷基、噻唑烷基、四氫呋喃基、四氫噻吩、嗎啉代、硫嗎啉代、吡咯烷基、哌嗪基、哌啶基、噻 唑烷基等。在一些實施方案中，其中雜原子為氮，該氮任選被下述基團取代烷基、烯基、炔 基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、環烷基、雜環基、環烷基烷基、雜環基烷基、醯基、胍基，或該氮可以被季銨化形成銨，其中取代基如上所述選擇。本文所用的「孤對電子」，當涉及氮原子上的取代變量時，指該取代變量表示相應 氮的路易斯結構電子對，且沒有取代官能團與所指位置結合。本文所用的"芳烷基"是指烷基，其中該烷基的一個氫原子被芳基替代。本文所用的"雜芳烷基"是指烷基，其中該烷基的一個氫原子被雜芳基替代。本文所用的"滷〃、「滷素〃或〃滷代〃指F、Cl、Br或I。本文所用的擬滷化物或擬滷素基團為滷化物的生物電子等排體或行為與滷化物 基本上相似的基團。這些化合物可以以與滷素相同的方式使用或處理。擬滷化物包括但不 局限於，氰化物、氰酸鹽(酯)、硫氰酸鹽(酯)、硒氰酸鹽(酯)、三氟甲氧基和疊氮化物。本文所用的"滷代烷基"指烷基，其中一個或多個氫原子被滷素替代。該基團包 括但不局限於，氯甲基、三氟甲基和1-氯-2-氟乙基。本文所用的"滷代烷氧基"指R0-，其中R為滷代烷基。本文所用的〃亞磺醯基〃或〃亞硫醯基〃指-S(O) _。本文所用的〃磺醯基〃或〃 硫醯基"指-s(0)2-。本文所用的"磺基"是指-s(o)2o-。本文所用的〃羧基〃是指二價基團，-C (0)0_。本文所用的〃氨基羰基「是指-C (0) NH2。本文所用的"烷基氨基羰基"是指-C(O)NHR,其中R為烷基，包括低級烷基。本 文所用的「二烷基氨基羰基"是指-C(O)NR' R，其中R'和R獨立地為烷基，包括低級烷 基；「羧醯胺(carboxamide)「是指式-NR' COR基團，其中R'和R獨立地為烷基，包括低
級烷基。本文所用的"二芳基氨基羰基"是指-C(O)NRR'，其中R和R'獨立地選自芳基， 包括低級芳基，例如苯基。本文所用的"芳基烷基氨基羰基"是指-C(O)NRR'，其中R和R'中的一個為芳 基，包括低級芳基，例如苯基，且R和R'中的另一個為烷基，包括低級烷基。本文所用的"芳基氨基羰基"是指-C(O)NHR,其中R為芳基，包括低級芳基，例如苯基。本文所用的本文所用的本文所用的基。本文所用的
如吡啶基。本文所用的基。本文所用的
基，例如苯基。本文所用的"亞烷基"是指直鏈、支鏈或環狀，在一些實施方案中為直鏈或支鏈 的，二價脂肪族烴基，在多個實施方案中具有1至約20個碳原子，在另一個實施方案中， 具有1 12個碳。在另一個實施方案中，亞烷基包括低級亞烷基。在亞烷基中可以任選
羥基羰基〃是指-C00H。
烷氧基羰基"是指-C(O)OR,其中R為烷基，包括低級烷基。 丨芳氧基羰基"是指-C(O)OR,其中R為芳基，包括低級芳基，例如苯
『雜芳氧基羰基」是指-C (0) 0R，其中R為雜芳基，包括低級雜芳基，例
烷氧基"和"烷硫基"是指RO-和RS-，其中R為烷基，包括低級烷
芳氧基"和"芳硫基"是指RO-和RS-，其中R為芳基，包括低級芳插入一個或多個氧、硫，包括S( = 0)和S( = 0)2基團，或取代的或未取代的氮原子，包 括-NR-和-N+RR-基團，其中氮取代基為烷基、芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳烷基或COR'，其 中R'為烷基、芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳烷基、-OY或-NYY，其中Y為氫、烷基、芳基、雜芳 基、環烷基或雜環基。亞烷基包括，但不局限於，亞甲基(-CH2-)、亞乙基(-CH2CH2-)、亞丙基 (-(CH2)3-)、亞甲基二氧基(-O-CH2-O-)、亞乙基二氧基(-0-(CH2)2-0_)。術語〃低級亞烷 基〃是指具有1 6個碳的亞烷基。在一些實施方案中，亞烷基為低級亞烷基，包括1 3 個碳原子的亞烷基。本文所用的〃氮雜亞烷基〃是指-(CRR)n-NR-(CRR)m-,其中η和m各自獨立地為 0 4的整數。本文所用的〃氧雜亞烷基〃是指-(CRR)n-O-(CRR)m-,其中η和m各自獨立 地為0 4的整數。本文所用的〃硫雜亞烷基〃是指-(CRR)n-S-(CRR)m-、_(CRR)n-S( = 0) - (CRR)m-和-(CRR)n-S ( = 0) 2- (CRR)m_，其中η和m各自獨立地為0 4的整數。本文所用的"亞烯基"是指直鏈、支鏈或環狀，在多個實施方案中為直鏈或支鏈 的二價脂肪族烴基，在一些實施方案中具有2至約20個碳原子和至少一個雙鍵，在其它實 施方案中為1 12個碳。在另一些實施方案中，亞烯基包括低級亞烯基。在亞烯基中可以 任選插入一個和多個氧、硫或取代的或未取代的氮原子，其中氮的取代基為烷基。亞烯基包 括，但不局限於，-CH = CH-CH = CH-和-CH = CH-CH2-0術語〃低級亞烯基〃是指具有2 6個碳的亞烯基。在一些實施方案中，亞烯基為低級亞烯基，包括3 4個碳原子的亞烯基。本文所用的"亞炔基"是指直鏈、支鏈或環狀，在一些實施方案中為直鏈或支鏈 的二價脂肪族烴基，在多個實施方案中具有2至約20個碳原子和至少一個叄鍵，在另一個 實施方案中，為1 12個碳。在另一個實施方案中，亞炔基包括低級亞炔基。在亞炔基中 可以任選插入一個和多個氧、硫或取代的或未取代的氮原子，其中氮的取代基為烷基。亞炔 基，包括但不局限於，-C ^ C-C ^ C-、-C ^ C-和-C ^ C-CH2-.術語〃低級亞炔基〃是指 具有2-6個碳的亞炔基。在一些實施方案中，亞炔基為低級亞炔基，包括3-4個碳原子的亞 炔基。本文所用的"alk(en) (yrOylene"是指直鏈、支鏈或環狀，在一些實施方案中為 直鏈或支鏈的二價脂肪族烴基，在多個實施方案中具有2至約20個碳原子和至少一個叄 鍵和至少一個雙鍵；在另一個實施方案中，為1 12個碳。在另一些實施方案中，alk(en) (yn)ylene包括低級alk(en) (yn)ylene。alk(en) (yn)ylene中可以任選插入一個或多個 氧、硫或取代的或未取代的氮原子，其中氮的取代基為烷基。Alk(en) (yrOylene包括但不局 限於，-C = C-(CH2)n-C ε C-，其中η為1或2。術語〃低級alk(en) (yrOylene"是指具有 最多6個碳的alk(en) (yn) ylene.在一些實施方案中，alk (en) (yn) ylene具有約4個碳原 子。本文所用的"亞環烷基"是指二價飽和單-或多環體系，在一些實施方案中為 3 10個碳原子，在其它實施方案中為3 6個碳原子；亞環烯基和亞環炔基是指二價 單_或多環體系，其分別包括至少一個雙鍵和至少一個叄鍵。在一些實施方案中，亞環烯基 和亞環炔基可含有3 10個碳原子，對於亞環烯基，在一些實施方案中含有4 7個碳原 子，且對於亞環炔基，在一些實施方案中含有8 10個碳原子。亞環烷基、亞環烯基和亞環 炔基的環體系可以包含一個環或2個或更多個環，它們可以以稠合、橋接或螺合方式結合 在一起。『『環alk(en) (yrOylene"是指包括至少一個雙鍵和至少一個叄鍵的亞環烷基。
35
本文所用的"亞芳基"是指單環或多環，在一些實施方案中為單環，二價芳香基 團，在多個實施方案中具有5至約20個碳原子和至少一個芳環，在另一個實施方案中，為 5 12個碳。在另一些實施方案中，亞芳基包括低級亞芳基。亞芳基包括，但不局限於，1， 2-、1，3_和1，4_亞苯基。術語〃低級亞芳基〃是指具有6個碳的亞芳基。本文所用的"亞雜芳基"是指二價單環或多環芳環體系，在多個實施方案中，環 中具有約5至約15個原子，其中環體系中的一個或多個，在一些實施方案中1-3個原子為 雜原子(即非碳元素)，包括但不局限於，氮、氧或硫。術語「低級亞雜芳基」是指在環中具 有5或6個原子的亞雜芳基。本文所用的"亞雜環基"是指二價單環或多環非芳香環體系，在一些實施方案中 為3 10元，在多個實施方案中為4 7元，在另一個實施方案中，為5 6元，其中環體 系中的一個或多個，包括1 3個原子為雜原子(即非碳元素)，包括但不局限於，氮、氧或
硫ο本文所用的〃烷叉基〃是指二價基團，例如=CR' R"，其與另一個基團的一個 原子相鄰，形成雙鍵。烷叉基包括，但不局限於，甲叉基(=CH2)和乙叉基(=CHCH3)。本 文所用的"芳基烷叉基"是指烷叉基，其中R'或R"為芳基。「環烷叉基"為其中R'和 R"相連形成碳環。「雜環叉基"為其中R'和R"中的至少一個在鏈中含有雜原子，且R' 和R"相連形成雜環。本文所用的"醯氨基"是指二價基團_C(0)NH-。「硫代醯氨基"是指二價基 團-C(S)NH-。「氧基醯氨基"是指二價基團-0C(0)NH-。「硫基醯氨基"是指二價基 團-SC (O)NH-。「 二硫醯氨基"是指二價基團-SC (S)NH-。「脲基"是指二價基團-HNC (0) NH-。「硫脲基〃是指二價基團-HNC (S)NH-。本文所用的〃氨基脲〃是指-NHC(0)NHNH-。「羧醯胼基(Carbazate)「是指二價 基團-0C(0)NHNH-。「異硫代羧醯胼基"是指二價基團-SC(0)NHNH-。"硫代羧醯胼基" 是指二價基團-0C(S)NHNH-。「磺醯基胼基"是指二價基團-S02NHNH-。「醯胼基"是指二 價基團-C(0)NHNH-。「偶氮基"是指二價基團-N = N-。「胼基"是指二價基團-NH-NH-。本文所用的"取代的烷基"、「取代的烯基"、「取代的炔基"、「取代的環烷 基〃、「取代的環烯基〃、「取代的環炔基〃、「取代的芳基〃、「取代的雜芳基〃、「 取代的雜環基"、「取代的亞烷基"、「取代的亞烯基"、「取代的亞炔基"、「取代的 亞環烷基〃、「取代的亞環烯基〃、「取代的亞環炔基〃、「取代的亞芳基〃、「取代的 亞雜芳基"和"取代的亞雜環基"是指烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜 芳基、雜環基、亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞環烷基、亞環烯基、亞環炔基、亞芳基、亞雜芳基和 亞雜環基分別被一個或多個，在一些實施方案中被1、2、3或4個取代基取代，其中所述取代 基如本文「任選取代」的定義。對於任何上述基團(例如，烷基、環烷基、脂肪族、脂肪族環、亞烷基、亞烯基、亞炔 基、雜亞烷基、雜亞烯基、雜亞炔基、雜環基、芳基和雜芳基)的可取代原子的適合的任選的 取代基為那些基本上不幹擾所公開化合物藥學活性的取代基。「可取代的原子」為具有一 個或多個可用價鍵或電荷以與取代基形成一個或多個相應共價鍵或離子鍵的原子。例如， 具有一個可用效價的碳原子(例如，-C(-H)=)可以形成單鍵，得到烷基(例如，-C(-烷 基)=)，具有兩個可用效價的碳原子(例如，-C(H2)-)可以形成一個或兩個單鍵，得到一個或兩個取代基(例如，-C (烷基)(H)-、C (烷基)(Br))-)，或形成雙鍵得到一個取代基(例 如，-C ( = 0)-)等。本文考慮的取代僅包括形成穩定化合物的取代。在一些實施方案中， 某些合適的任選取代基可進一步被相應的合適任選取代基取代。在一些實施方案中，合適 的任選取代基未被進一步取代。例如，對於可取代的碳原子適合的任選的取代基包括-F、-Cl、-Br,-I、_CN、-NO2、-N3> -ORa、-C (0) Ra、-OC (0) Ra、-C (0) ORa、-SRa、-C (S) Ra、-OC (S) Ra、-C (S) ORa、-C (0) SRa、-C (S) SRa、-S (0) Ra、-SO2Ra,-S03R\-OSO2Ra, -OSO3Ra、-PO2RaRb、-OPO2RaRb、-PO3RaRb、-OPO3RaRb、-N (RaRb )、-C (O)N(RaRb)、-C (0) NRaNRbSO2Rc、-C (0) NRaSO2Rc,-C (0) NRaCN、-SO2N(RaRb)、-SO2N(RaRb)、-NR cC (0) R\-NRcC (0) 0R\-NRcC (0) N (RaRb)、-C (NRc) -N (RaRb)、-NRd-C (NRc) -N (RaRb)、-NRaN (RaRb)、-CRc = CRaRb、-C = CRa、= 0、= S、= CRaRb、= NRa、= N0Ra、= NNRa、任選被取代的烷基、任選 被取代的環烷基、任選被取代的脂肪族、任選被取代的脂肪族環、任選被取代的雜環基、任 選被取代的苄基、任選被取代的芳基和任選被取代的雜芳基，其中Ra-Rd各自獨立地為-H或 任選被取代的脂肪族、任選被取代的脂肪族環、任選被取代的雜環基、任選被取代的苄基、 任選被取代的芳基、或任選被取代的雜芳基或-N(RaRb) —起形成任選被取代的雜環基。在 某些實施方案中，=0被排除作為合適的任選取代基。對於氮原子(對於其它原子具有兩個共價鍵)適合的取代基包括例 如，任選被取代的烷基、任選被取代的環烷基、任選被取代的脂肪族、任選被取代 的脂肪族環、任選被取代的雜環基、任選被取代的苄基、任選被取代的芳基、任 選被取代的雜芳基、-CN、-N02、-0Ra、-C(0)Ra、-0C(0)Ra、-C(0)0Ra、-SRa、-S(O) Ra、-SO2Ra, -SO3Ra, -N (RaRb)、-C (0) N (RaRb)、-C (0) NRaNRbSO2Rc, -C (0) NRaSO2Rc, -C (0) NRaCN, -S O2N (RaRb)、-SO2N (RaRb)、-NRcC (0) Ra、-NRcC (0) ORa、-NRcC (0) N (RaRb)等。含氮基團，例如，雜芳基或非芳香雜環基可被氧取代形成N-氧化物，例如，吡啶基 N-氧化物、哌啶基N-氧化物等。例如，在多個實施方案中，在含氮雜環基或雜芳基中的環氮 原子可被取代形成N-氧化物。具有3個與其它原子結合的共價鍵的氮原子的適合取代基包括-0H、烷基和烷氧 基(優選C^6烷基和烷氧基)。對於具有3個與其它環原子結合的共價鍵的被取代的環氮 原子帶有正電荷，其通過相應於藥學可接受的鹽中的相反的陰離子平衡，所述藥學可接受 的鹽例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫氟酸鹽、氫碘酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽等。在下述適合的藥理學 可接受的鹽部分中提供了其它適合的相反陰離子的實例。也應該理解一些所公開化合物可以以不同的立體異構體(例如，非對映異構體和 對映異構體)得到，且本發明包括所公開化合物的所有異構體形式和外消旋混合物，和用 純的異構體或其混合物(包括外消旋混合物)治療受試者的方法。立體異構體可以使用任 何適合的的方法，例如色譜法進行分離和拆分。應該理解，一些所公開化合物可以以互變異構體存在或表示為互變異構體。互變 異構體為通過氫原子或質子遷移結合相鄰單鍵和雙鍵的變換相互轉化的化合物。在溶液 中，其中可能互變異構化，可以達到互變異構體的化學平衡。互變異構體的確切比例依賴於 多種因素，包括溫度、溶劑和PH。當沒有說明任何給定的取代基(例如滷代烷基)的數量時，則可能有一個或多個 取代基存在，多至化學上儘可能的取代基的數量。例如「滷代烷基」可包括一個或多個相同或不同的滷素，例如氟代甲基、三氟甲基、氟二氯甲基等。除非另有說明，對於任何保護基、胺基酸和其它化合物，本文所用的縮寫與通常使 用的可識別的縮寫，或與 IUPAC-IUB Commission on BiochemicalNomenclature (參見， (1972)Biochem. 11 :942_944) 一致。B.化合物用於本文提供的組合物和方法中的本文提供的化合物表現出抗蛋白質運輸介導 的疾病和病症的活性。在多個實施方案中，這些化合物可以治療或改善與蛋白質運輸介導 的疾病和病症相關的一種或多種症狀。C.化合物的製備在本文提供的組合物和方法中使用的化合物可以來自市售(例如，Aldrich Chemical Co.，Milwaukee, WI)，可以通過對於本領域技術人員已知的方法製備，或可以通 過本文所述(下述部分和實施例部分)的方法製備。本領域技術人員將能夠通過常規修飾 方法使用適合的起始物質製備本文所用的所有化合物。本文提供的一些化合物可以通過下述合成途徑製備。例如，方案1 28指出了許 多以各種基團(例如R和Ar基團)對雙環母核(例如吡唑並嘧啶)進行一般取代的方法。方案1(方法A)
DEAD, ROH 或 RX,鹼 (X=離去基團， I滷化物，甲磺酸醋等)
CXiN-^
Me2SO4 或 NC R TMS-CHN2
NC OH
H2
HCONH
2
NH2
NIS
NH
〈
N
N
NH2
N R
方案2 (方法B)
ArB(OH)2 Pd(O)
NH2 Ar
N
、N'、K
R
SOCI2 丙二腈 R-COOH - R-COCI -
t-Bu-肼
NC OMe
NH2 R
HCONH2
方案3 (方法C)
NC H
M
NC OEt
-NHNH2 HCI
Et3N1 EtOH
HoN
HCONH
、m'n
2
Br2
NH2 Br
方案4 (方法D)
R-COOH
ArB(OR)2 Pd(O)
R = H1烷基
NH2 Ar
SOCI2
R-COCI
丙二腈
R CN
X
HO CN
Me2SO4 或 TMS-CHN2
R CN
M
MeO CN
N9H4
R
HCONH2
NH2 R
H2N'
,NH
、
DEAD, R1OH 或 R1X,鹼 (X=離去基團， 滷化物，曱磺酸酯等)
NH9 ρ方案5(方法E)
NO2 Ar
H2催化劑
NH2 Ar
方案6 (方法F)
方案7(方法G) 方案8說明了 3-滷素取代的雙環系統，例如所示的3-碘代吡咯並嘧啶，的合成方 法。雖然實施所述的方案8的Mitsimobu型反應並沒有使用保護基團，但是其他反應可受益 於對4-氨基基團的保護，例如使用本領域已知的合適的氨基保護基團和合適的對氨基進 行保護和脫保護策略，例如在 T.W.Greene 和 P. G.M. Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd Ed.，JohnWiley and Sons (1991)中所描述的，將其全部教導引入本文作為 參考。例如，合適的氨基保護基團包括苄氧基羰基、叔丁氧基羰基、叔丁基、苄基和芴基甲氧 基羰基(Fmoc) ο方案8(方法H)
DEAD, ROH 或 RX,鹼 (X=離去基團， 滷化物，甲磺酸酯等)
NC
HCONH
2
H2N'
一NH
NIS
R方案9說明了可用於製備多個本發明化合物的氨基保護的化合物的合成方法。隨 後可對該化合物進行脫保護。方案9(方法I)
X=滷素方案10 15描述了多種在本發明化合物的I-N位引入取代基的方法，或用於制 備本發明化合物的中間體方案10(方法J)保護基
RSO2CI
SO2R
X=滷素對於用於進行方案10中所說明的轉化的反應的說明，參見例如Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,17(14),4075-4079 ；2007 Journal ofMedicinal Chemistry, 50 (1), 10-20 ；2007 ；Bioorganic & Medicinal Chemistry, 14(4), 1078-1088 ； 2006;及PCT Int. Appl. ,2007012953，2007年2月1日。將上述文獻的所有教導引入本文 作為參考。方案11(方法K)
保護基
保護基
RCOCI
COR
X=滷素對於用於進行方案11中所述的轉化的反應的說明，見Tetrahedr0n，31(6)， 587-91 ；1975，將其全部教導引入本文作為參考。方案12 (方法L)
保護基
RNCO
或
保護基
ROCOX
X=滷素對於用於進行方案12中所述的轉化的反應的說明，見例如Journal of theChemical Society, Perkin Transactions 1 Organic and Bio-Organic Chemistry (1972-1999), (11)，2795-802 ；1979，將其全部教導引入本文作為參考。方案13(方法 M)
42Vc'
R2R1N NR1R2
保護基
X=滷素
NR1R2 NR1R2 對於用於進行方案13中所述的轉化的反應的說明，參見例如Journal ofOrganic Chemistry, 53 (4)，794-9 ； 1988，將其全部教導引入本文作為參考。
方案14 (方法N)
保護基
XlR ο R
保護基
X=滷素對於用於進行方案14中所述的轉化的反應的說明，參見例如OrganicLetters， 5(11)，1899-1902 ；2003，將其全部教導引入本文作為參考。方案15 (方法0)
保護基
OcpXI RO' xOR
保護基
X=滷素對於用於進行方案15中所述的轉化的反應的說明，見例如Journal ofOrganic Chemistry, 54 (7)，1664-8 ； 1989，將其全部教導引入本文作為參考。在方案10 15中說明的方法可適用於其他的起始化合物。參見例如Journal of Heterocyclic Chemistry (1969)，6 (2)，207-13，將其全部教導引入本文作為參考，起始物 質諸如5-滷素-4-氨基-吡咯並[2，3-d]嘧啶，例如已知的5-溴-4-氨基-吡咯並[2， 3-d]嘧啶
X=滷素 可以使用的起始物質例如3-溴-4-硝基-吲哚(Albany Molecular Research,
43Albany, NY)和 3-溴-4-硝基-吲唑(參見 Journal of Heterocyclic Chemistry (1979), 16 (8)，1599-603)，將其全部教導引入本文作為參考。
X=滷素 在例如上述的化合物中，硝基可以根據本領域已知的方法還原成氨基。也可參見 例如在方案5和6中描述的方法。方案16說明了在3位以磺醯胺進行衍生化的方法，該方法通過用氯磺酸處理例如 在方案16中所示的未取代的合適保護的起始物質，再用胺處理。方案16(方法P) 參見例如Asian Journal of Chemistry, 17 (2)，980-984 ；2005 和 Tetrahedron, 62 (8)，1699-1707 ；2006，將其全部教導引入本文作為參考。本發明的某些化合物可以從如在方案17和18中所示的式1的化合物開始製備， 其中X是氧或氮。
方案17 (方法Q) 縮合可提供如式2結構所示的期望的吡唑，其在上述方法中可用作起始物質。參 見例如WO 1998014449、WO 1998014450和WO 1996031510，將其全部教導引入本文作為參考。另外，多種化合物可以由在方案19中的式III結構所表示的3-滷代起始物質，使 用金屬催化的偶聯方法合成。方案19(方法S)
ROH, DEAD 或 RX,鹼 (X=離去基團， 滷化物，曱磺酸酯等) 這些方法包括例如Ullman偶聯，例如由Buchwald和Hartwig獨立開發的鈀和/ 或銅。這些偶聯方法例如 JACS 2006,128,8742-8743, JACS 2007，129，3490-3491，和 Topic in Current Chemistry 2002,219,131-209, AngewanteChemie Int. Engl. Ed.2006 45 4321-4326，將其全部教導引入本文作為參考。在這些方法的一些應用中，有用的是使用合 適的羥基或氨基保護基團，這些保護基團可由R'和R"表示。當R'和R"是合適的保護基團時，如本文所述脫保護可得到可被進一步衍生化的中間體，參見例如綜述文章Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 2003，42，5400-5451，將其全部教導引入本文作為參考。如在方案20中描述的硫醚類似物可使用如下方法來完成構建以硫醇、N-甲基嗎 啉和碘化銅在合適的溶劑中在高溫下處理相應的3-滷素(例如碘)取代的化合物。通過 氧化可得到相應的亞碸和碸類似物。參見例如WO 2004056830，將其全部教導引入本文作為 參考。方案20(方法T)
νη2%
在方法T的第一步驟中，也可以分離到二聚體，例如化合物457 如在 Heterocycles (Southwick, P.，Dhawan, B.，1975，11，1999)和 J. Chem. Soc.， Perkin Trans 1 (Hanefeld, U. et al.，1996，1545)中所述，將其全部教導引入本文作為參 考，可通過吡咯或吡唑與合適的腈或脒(方案21)縮合在6位引入取代基。方案21 (方法U)
R4-CN 或
NH
NH2
HoN 方案22描述了一種經關鍵的甲醇中間體製備各種3-取代的吡唑並[3，4_d]嘧啶 的方法。如在 J. Chem. Soc.，Perkin Trans 1 (Hanefeld, U. et al.，1996，1545)中所述，將 其全部教導引入本文作為參考，合成始於保護的醯氯和丙二腈，再製備烯醇醚，該烯醇醚與 合適的胼反應得到取代的吡唑。環化得到吡唑並[3，4-d]嘧啶，在脫除保護(例如苄基) 得到甲醇中間體。該甲醇中間體可被氧化形成甲醯基衍生物，其通過與親核試劑例如格氏 試劑反應得到醇，該醇又可通過本領域技術人員熟知的方法還原成相應的烷基類似物。本 領域技術人員將理解的是例如所述甲醇衍生物、甲醯基衍生物、或醇的中間體也可用作許
46多新穎的化合物的前體。方案22(方法V) 在3位有烷氧基和芳氧基取代的化合物的另一種構建方法(方案23)始於保護的 醇與四氰乙烯的縮合，如 J. Amer. Chem. Soc. (Middleton，W. J. ,Engelhardt, V. Α. , 1958,80, 2788)所述，將其全部教導引入本文作為參考。與合適的胼環化得到吡唑，再形成嘧啶環，從 而提供了得到保護的3-羥基化合物。(本領域技術人員將理解的是始於期望的醇而不是保 護的醇會直接得到最終化合物)。脫除保護後，再烷基化或芳基化，得到期望的化合物。
N-I位雜環取代基衍生化可通過在方案24中所示的方法完成。脫除N雜環已有 的保護基，在通過例如還原性烷基化進行烷基化，或通過在J. Org. Chem. (Ahmed, F. A-M.，et al.，1996，61，3849)和Advanced Organic Chemistry(Smith,Μ. B. ,March J. ,Wiley,2001, P 501-511)中說明的方法芳基化得到期望的衍生物，將兩文獻的全部教導引入本文作為參考。
方案24 (方法X) 方案25簡要地說明了 C-2取代的吡唑並[2，3-d]嘧啶的製備方法。當R4表示氫 時，該方法製備了 C-2未取代的吡咯並[2，3-d]嘧啶。該方法始於合適取代的苯乙酮衍生 的滷化物(X =滷素)，其通過與胺發生親核置換得到氨基_酮化合物，該化合物可以以鹽 (例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽等)或游離鹼形式分離。使氨基-酮化合物與丙二腈，在鹼(例如 甲醇鈉、氫化鈉、氫氧化鉀等)存在時，在有水或無水有機溶劑(例如甲醇、乙醇、四氫呋喃、 二氧雜環己烷、甲苯等)中反應得到2-氨基-3-氰基吡咯衍生物，如在Bioorg. Med. Chem. Lett. (Dropinski，J. F.，2005，15，5035)和 J. Chem. Soc. (Darroll, J. et al.，1960，82，131)
中所述，將其全部教導引入本文作為參考。 嘧啶化合物。方案25(方法Y)
與甲醯胺進行環化得到取代的吡咯並[2，3-d] 在N-I位具有各種取代基的吡咯並[2，3-d]嘧啶的構建方法(方案26)始於六亞 甲基-四胺與滷代苯乙酮的縮合，如在Bioorg. Med. Chem. Lett. (Wilder, L. et al. ,2001, ll，1849 *Altmann，E.et al.，2001，11，853)中所述，將其全部教導引入本文作為參考。 以例如乙醯基保護，再進行兩次環化反應得到未取代的吡咯並[2，3-d]嘧啶。例如通過烷 基化、醯基化、磺醯基化和芳基化的衍生化可通過本領域技術人員已知的方法進行，如在 Bioorg. Med. Chem. Lett. (Altman，E.等，2001，11，853 ;Dropinski，J. F.等，2005，15，5035 ； 及 Arnold，L.D.等，2000，10，2167)中所述。方案26
(方法Z) C-4氨基的衍生化可通過以衍生試劑(例如烷基、芳基或醯基滷化物)在合適的條 件下處理化合物完成，如在 Advanced Organic Chemistry (Smith, Μ. B.，March J.，Wiley, 2001,ρ 501-511)和 J. Org. Chem. (Bio,Μ. Μ.等，2004，69，6257)中所說明的，將其全部教導 引入本文作為參考。在第二步中可引入與首先引入的基團相同或不同的第二基團。
方案27 (方法AA)
R3-X
R4-X一些吡咯並[2，3-d]嘧啶可從C-3滷代的前體方便地構建，如在方案28中所 示。該方法適於未取代的吡咯並[2，3-d]嘧啶的滷化，再通過常規的方法進行N-I衍生 化，常規的方法例如滷化物或含有良好離去基團(例如甲磺酸酯(mesylate)、甲苯磺酸酯 (tosylate)等)的另一化合物的親電烷基化。隨後滷化物與芳基硼酸(或酯)、有機鋅化合 物、有機錫化合物或格氏試劑進行過渡金屬催化偶聯，而形成了 3-芳基取代的吡咯並[2， 3-d]嘧啶。根據常規的方法，金屬催化偶聯滷化物與取代的苯酚、噻吩或苯胺衍生物得到吡 咯並[2，3-d]嘧啶的C-3雜原子連接的芳香族衍生物(Y = 0，S，NR)，如Angewand. Chem. (Burgos, C. H.等，2006，45，4321)，0rg. Lett. (Ma，D.，Cai，Q.，2003，5，3799 和 Buck，Ε·等， 2002,4,1623)中所說明的，將其全部教導引入本文作為參考。方案28(方法 BB) 通過上述方案製備的具體化合物的合成也在實施例中指出。表I顯示了化合物的 編號、結構、測量的熔點、質譜(API-ES)和合成方法。
此外，在合成全部範圍的公開化合物中使用的合成化學官能團的轉換在本領域 是己知的，並且包括例如在 R. Larock, Comprehensive OrganicTransformations, VCH Publishers (1989) ；L.Fieser 禾口 Μ· Fieser,Fieser andFieser『 s reagents for organic Synthesis, John Wiley 禾口 Sons (1994)；以及 L Paquette, ed. , Encyclopedia of reagents for organic Synthesis, John Wiley和Sons (1995)中所描述的。這些文件的全部教導引 入本文作為參考。例如從上述合成開始，可製備具有例如-OH的取代基的終產物。適當的 將-OH基團轉換為另一種公開的取代基例如滷素的技術是已知的。例如，-OH可轉換為-Cl， 例如使用氯化試劑，例如亞硫醯氯或N-氯代琥珀醯亞胺，任選組合使用紫外線照射。對於在合成所公開的化合物中，適當的保護基團和使用保護基團進行保護和 脫保護官能團的策略在本領域是已知的，並且包括例如在T. W. Greene和P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis，第 2 版，John Wiley 和 Sons (I99I)中所描述 的，其全部教導在此引用作為參考。例如，適當的羥基保護基團包括但不局限於取代的甲 基醚類(例如，甲氧基甲基、苄氧基甲基)、取代的乙基醚類(例如，乙氧基甲基、乙氧基乙 基)、苄基醚類(苄基、硝基苄基、滷代苄基)、矽基醚類(例如，三甲基矽基)、酯等。適當胺 保護基團的實例包括苄氧基羰基、叔_ 丁氧基羰基、叔丁基、苄基和芴基甲氧羰基(Fmoc)。 適當的巰基保護基團包括苄基、叔丁基、乙醯基、甲氧基甲基等。本文描述的反應可在對特殊反應中的試劑和產物適當的任何溶劑中進行。適當的溶劑可促進預期反應，但不與反應試劑或產物反應。適當的溶劑可包括，例如醚溶劑，例 如乙醚或四氫呋喃；酮溶劑例如丙酮、甲基乙基酮或乙酸乙酯；滷代溶劑例如二氯甲烷、氯 仿、四氯化碳或三氯乙烷；芳香族溶劑例如苯、甲苯、二甲苯、或吡啶；極性非質子性有機溶 劑例如乙腈、二甲基亞碸、二甲基甲醯胺、N-甲基吡咯烷酮、六甲基磷醯胺、硝基甲烷、硝基 苯等；極性質子性溶劑例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇、四乙二醇等；非極性烴類例如 戊烷、己烷、環己烷、環戊烷、庚烷、辛烷等；鹼性胺溶劑例如吡啶、三乙胺等；和其他本領域 已知的溶劑。對水敏感的反應或試劑可在無水條件下處理。對氧敏感的反應或試劑可在惰性氣 氛下處理，例如氮氣、氦氣、氖氣、氬氣等。對光敏感的反應或試劑可在黑暗中或用適當的濾 過照明中處理。對溫度敏感的反應或試劑，例如對高溫敏感的試劑或放熱的反應可在溫度控制條 件下進行。例如，強烈放熱的反應可在冷卻至較低溫度時進行。沒有強烈放熱的反應可在較高溫度下進行，從而促進目標反應，例如通過加熱至 反應溶劑的回流溫度。反應也可在微波輻射條件下進行。例如在各個方法實施方案中，第 一和第二試劑在微波輻射條件下一起反應。反應也可在大氣壓下、相對於大氣壓的減壓條件、或相對於大氣壓的升壓條件下 進行。例如，還原反應可在氫氣升壓伴隨氫化催化劑存在條件下進行。反應可按試劑的化學計量比，或一種或多種試劑過量的條件下進行。例如，在方案 3方法C的最後一步中，第一個反應物，有機滷素3-溴-1-叔丁基-1H-吡唑並[3，4_d]嘧 啶-4-胺，可按對以々沖(011)2表示的芳基硼酸反應物的摩爾比約為20 1,10 1、5 1、 2.5 1、2 1,1. 5 1,1. 3 1,1. 2 1,1. 1 1、1 1,0.91 1,0.83 1,0. 77 1、 0.67 1,0. 5 1,0. 4 1,0. 2 1,0. 1 1 或 0. 5 1 使用。通常，第一個反應物可按 對第二反應物的摩爾比約為 5 1,2. 5 1、2 1,1. 5 1,1. 3 1,1. 2 1,1. 1 1、 1 1、0. 91 1,0. 83 1,0. 77 1,0. 67 1,0. 5 1,0. 4 1 使用。在一些實施方案 中，第一個反應物可按對第二反應物的摩爾比約為1.5 1,1.3 1,1.2 1,1. 1 1、 1 1、0.91 1,0. 83 1,0. 77 1或0.67 1使用。更優選地，第一個反應物可按對第 二反應物的摩爾比在約在1.1 1和0.9 1之間，通常約1 1使用。在這種或其他反 應中的其他試劑可以以相同或不同比例使用。D.藥物組合物的製劑本文提供的藥物組合物含有治療有效量的一種或多種本文提供的化合物以及藥 學可接受的載體，所述化合物可用於治療或改善與蛋白質運輸相關的病症或其中涉及蛋白 質運輸的病症的一種或多種症狀。適合於本文提供的化合物給藥的藥學載體包括任何本領 域技術人員已知的適於特殊給藥方式的載體。而且，化合物可作為組合物中的單個藥學活性成分進行配製，或可以與其它活性 成分組合。所述組合物含有一種或多種本文提供的化合物。在多個實施方案中，將化合物配 制為適合的藥物製劑，如對於口服給藥的溶液、混懸劑、片劑、分散片劑、九劑、膠囊、散劑、 持續釋放的製劑或酏劑，或對於胃腸外給藥的無菌溶液或混懸劑，以及透皮貼片製劑和幹 粉吸入劑。在多個實施方案中，使用本領域已知的技術和方法將上述化合物配製為藥物組合物(參見例如 Ansellntroduction to Pharmaceutical Dosage Forms,第 4 版，1985, 126)。在組合物中，一種或多種有效濃度的化合物或其藥學可接受衍生物與適當的藥物 載體混合。化合物可在製劑前衍生為如上所述對應的鹽、酯、烯醇醚或酯、縮醛、縮酮、原酸 酯、半縮醛、半縮酮、酸、鹼、溶劑合物、水合物或前藥。組合物中的化合物的濃度對於給藥後 遞送的量是有效的，該量可治療或改善與蛋白質運輸受損相關的或其中涉及蛋白質運輸的 病症的一種或多種症狀。在多個實施方案中，配製該組合物為單一劑量給藥。為配製組合物，將一定重量份 的化合物以有效濃度溶解、混懸、分散或混合入所選的載體中，使得所治療的病況得以緩解 或一種或多種症狀得以改善。在藥學可接受載體中包括的活性化合物的量足夠產生治療有用作用，對治療患者 沒有不期望的副作用。治療有效濃度可通過在本文描述的體外和體內系統中檢測化合物經 驗確定(見，例如，實施例1)和通過美國專利申請號10/826，157，2004年4月16日提交， 和美國專利申請公開號2003/0073610中所述確定，再從其推測人使用劑量。在藥物組合物中活性化合物的濃度依賴於活性化合物的吸收、失活和排洩率，化 合物的物理化學特性，療程劑量和給藥量，以及本領域技術人員已知的其他因素。例如，遞 送量足夠改善本文所描述的與蛋白質運輸有關的或其中涉及蛋白質運輸的病症的一種或 多種症狀。在多個實施方案中，治療有效的劑量應該產生活性成分的血清濃度為約0. lng/ml 至約50 100ii g/ml。在另一個實施方案中，藥物組合物應該提供的劑量為約0. OOlmg至 約2000mg化合物每千克體重每天。製備的藥物劑量單位形式為約0. 01mg、0. lmg或lmg至 約500mg、1000mg或2000mg，且在多個實施方案中為約10mg至約500mg活性成分或主要成 分的組合每劑量單位形式。給藥活性成分可以一次進行或以間隔的時間多次小劑量給藥。應該理解治療的精 確劑量和持續時間依賴所要治療的疾病，且使用已知的檢測方法或通過從體內或體外檢測 數據推測而經驗地確定。應該注意濃度和劑量的值也可以根據待減輕的病症的嚴重程度而 改變。將進一步理解的是對於任何特定的受試者，特定的給藥方法應該根據個體需要和給 藥或指導給藥組合物的人的專業判斷而隨時間調整，且本文所述的濃度範圍僅是示例性的 且不是為了限制要求保護的組合物的範圍或應用。在其中化合物呈現不足的溶解性的情況下，可以使用增溶化合物的方法。這些方 法是本領域技術人員已知的，且包括，但不限於，使用共溶劑，如二甲亞碸(DMS0)；使用表 面活性劑，如TWEEN ;或溶於碳酸氫鈉水溶液中。在配製有效的藥物組合物時，也可以使 用化合物的衍生物，如化合物的前藥。混合或加入化合物後，所得混合物可以為溶液、混懸液、乳液等。所得混合物的形 式依賴於許多因素，包括打算的給藥方式和化合物在所選載體或溶媒中的溶解度。有效濃 度足以改善要治療的疾病、病症或病況的症狀且可以經驗的確定。對於向人和動物給藥，以單位劑型提供藥物組合物，如片劑、膠囊、丸劑、散劑、顆 粒劑、無菌胃腸外溶液或混懸劑，和口服溶液或混懸劑，和含有適合量的化合物或其藥學可 接受的衍生物的油-水乳劑。在多個實施方案中，以單位劑量形式或多劑量形式配製和給藥藥物治療活性化合物及其衍生物。如本領域是已知的，本文所用的單位劑量形式是指用 於人和動物受試者的物理離散的單位和被單個包裝。每個單位劑量含有預定量的治療活性 化合物(其足以產生所需的治療效果)，以及所需的藥物載體、溶媒或稀釋劑。單位劑量形 式的實例包括安瓿和注射劑和單個包裝的片劑或膠囊。單位劑量形式可以以其部分或加倍 給藥。多劑量形式為多個包裝在單個容器中的相同單位劑量形式，以分離的單位劑量形式 給藥。多劑量形式的實例包括藥水瓶、藥片或膠囊瓶、或品脫或加侖瓶。因此，多劑量形式 為多個在包裝中不分離的單位劑量。液體藥物給藥的組合物，可以例如，通過將上述定義的活性化合物，和任選藥物佐 劑溶解、分散或混合到載體中，所述載體例如，水、鹽水、葡萄糖水溶液、甘油、乙二醇、乙醇 等，由此形成溶液或混懸液。如果需要，待給藥的藥物組合物也可以含有少量的無毒輔助物 質，如潤溼齊IJ、乳化齊IJ、助溶劑、PH緩衝劑等，例如，乙酸鹽、檸檬酸鈉、環糊精衍生物、去水山 梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺乙酸鈉、三乙醇胺油酸酯和其它這類試劑。製備這些劑型的實際方法是已知的，或對於本領域技術人員是明顯的；例如，參見 Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company,Easton,Pa.,第 15 版，1975。可以製備含有0.005%至100%活性成分和由無毒載體組成平衡成分的劑型或 組合物。製備這些組合物的方法對於本領域技術人員是已知的。關注的組合物可含有 0. 001% 100%活性成分，在一個實施方案中為0. 1 95%，在另多個實施方案中為75 85%。1.用於口服給藥的組合物口服藥物劑型為固體、凝膠或液體。固體劑型為片劑、膠囊、顆粒劑和整裝散劑。口 服片劑的類型包括壓製片劑、咀嚼錠劑和包衣腸溶衣、糖衣或膜衣的片劑。膠囊可以為硬或 軟明膠膠囊，而顆粒劑和散劑可以以非泡騰或泡騰形式與其它本領域技術人員已知的成分 混合提供。a.用於口服給藥的固體組合物在某些實施方案中，所述製劑為固體劑型，在多個實施方案中，為膠囊或片劑。片 劑、丸劑、膠囊、含片等可以含有一種或多種下述成分或相似性質的化合物粘合劑；潤滑 劑；稀釋劑；助流劑；崩解劑；著色劑；甜味劑；香味劑；潤溼劑；催吐包衣；和膜包衣。粘合 劑的實例包括微晶纖維素、西黃蓍膠、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠溶液、糖蜜、聚乙烯吡 咯烷、聚維酮、交聯聚維酮、蔗糖和澱粉糊。潤滑劑包括滑石粉、澱粉、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、 石松(lycopodium)和硬脂酸。稀釋劑包括，例如，乳糖、蔗糖、澱粉、高嶺土、鹽、甘露醇和磷 酸氫鈣。助流劑包括，但不限於，膠體二氧化矽。崩解劑包括交聯羧甲基纖維素鈉、羧甲基 澱粉鈉、海藻酸、玉米澱粉、土豆澱粉、膨潤土、甲基纖維素、瓊脂和羧甲基纖維素。著色劑包 括，例如，任何批准上市的水溶性FD和C染料，其混合物；和水不溶性的混懸於水合氧化鋁 的FD和C染料。甜味劑包括蔗糖、乳糖、甘露醇和人造甜味劑如糖精和任何量的噴霧乾燥 的矯味劑。香味劑包括從植物(如水果)中提取的天然香味劑和產生舒適的感覺的合成混 合物，如，但不限制於薄荷和水楊酸甲酯。潤溼劑包括丙二醇單硬脂酸酯、去水山梨糖醇單 油酸酯、二甘醇單硬脂酸酯和聚氧乙烯月桂醚。催吐包衣包括脂肪酸、脂肪、蠟、蟲膠、氨基 化的蟲膠和醋酸鄰苯二甲酸纖維素。膜包衣包括羥乙基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙二醇
964000和醋酸鄰苯二甲酸纖維素。化合物，或其藥學可接受的衍生物可以在組合物中提供，該組合物保護化合物不 與胃的酸環境接觸。例如，組合物可以配製在腸溶衣中，其在胃中保持完整且在小腸中釋放 活性化合物。組合物也可以與抗酸劑或其它這類成分組合配製。當劑量單位形式為膠囊時，除上述物料外它可含有液體載體，如脂肪油。而且，劑 量單位形式可以含有多種其它改變劑量單位物理形式的物料，例如，糖和其它腸溶試劑的 包衣。化合物也可以作為酏劑、混懸劑、糖漿劑、薄片(wafer)、噴灑劑、咀嚼膠等的成分給 藥。除活性化合物外，糖漿劑可含有作為甜味劑的蔗糖和一些防腐劑、染料和著色劑、和矯 味劑。活性物質也可以與其它不損害所需作用的活性物質混合，或與補充所需作用的物 質混合，如抗酸劑、H2阻斷劑、和利尿劑。活性成分為本文所述的化合物或其藥學可接受的 衍生物。可以包括較高濃度，最多約98重量％的活性成分。在所有實施方案中，片劑和膠囊製劑可以通過本領域技術人員已知的方法包衣以 改變或保持活性成分的溶出。因此，例如，它們可以用常規腸可消化的包衣來包衣，如水楊 酸苯酯、蠟和醋酸鄰苯二甲酸纖維素。b.用於口服的液體組合物液體口服劑型包括水溶液、乳劑、混懸劑、從非泡騰顆粒重構的溶液和/或混懸 劑、和從泡騰顆粒重構的泡騰製劑。水溶液包括，例如，酏劑和糖漿劑。乳劑為水包油或油 包水。酏劑是澄清的、加甜的含水酒精製劑。在酏劑中使用的藥學可接受的載體包括溶 齊U。糖漿劑為濃縮的糖(例如，蔗糖)水溶液，且可以含有防腐劑。乳劑為二相體系，其中 一種液體以小球形式分散到另一種液體。乳劑中使用的藥學可接受的載體為非水液體、乳 化劑和防腐劑。混懸劑使用藥學可接受的助懸劑和防腐劑。待重構為液體口服劑型的非泡 騰顆粒中使用的藥學可接受的物質包括稀釋劑、甜味劑和潤溼劑。待重構為液體口服劑型 的泡騰顆粒中使用的藥學可接受的物質包括有機酸和二氧化碳源。在所有上述劑型中使用 著色劑和香味劑。溶劑包括甘油、山梨糖醇、乙醇和糖漿。防腐劑的實例包括甘油、對羥基苯甲酸甲 酯和對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸、苯甲酸鈉和酒精。在乳劑中使用的非水液體的實例包括 礦物油和棉子油。乳化劑的實例包括明膠、阿拉伯膠、西黃蓍膠、膨潤土和表面活性劑，如 聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯。助懸劑包括羧甲基纖維素鈉、果膠、西黃蓍膠、矽酸鎂鋁 (Veegum)和阿拉伯膠。甜味劑包括蔗糖、糖漿劑、甘油和人造甜味劑，如糖精。潤溼劑包括 丙二醇單硬脂酸酯、去水山梨糖醇單油酸酯、二甘醇單月桂酸酯和聚氧乙烯月桂醚。有機酸 包括檸檬酸和酒石酸。二氧化碳源包括碳酸氫鈉和碳酸鈉。著色劑包括任何批准上市的水 溶性FD和C染料及其混合物。香味劑包括從植物(如水果)中提取的天然矯味劑，和產生 好的味道感覺的化合物的合成混合物。對於固體劑型，在多個實施方案中，在例如碳酸丙烯(propylenecarbonate)、植物 油或甘油三酯中的溶液或混懸液包裹在明膠膠囊中。這些溶液，及其製備和膠囊化公開於 美國專利4，328，245 ；4, 409，239 ；和4，410，545中。對於液體劑型，為了對於給藥方便測量， 例如，在聚乙二醇中的溶液可以用足量的藥學可接受的液體載體(如水)稀釋。
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或者，液體或半固體口服製劑可以通過將活性化合物或鹽溶解或分散到植物油、 乙二醇、甘油三酯、丙二醇酯(如碳酸丙烯)和其它這類載體中而製備，並將這些溶液或混 懸液包裹在硬或軟明膠膠囊殼中。其它有用的製劑包括美國專利RE28，819和4，358，603 中所述的那些。簡而言之，這些製劑包括，但不限於，含有本文提供的化合物的那些製劑， 二烷基化的單-或多-亞烷基二醇，包括但不限制於，1，2_ 二甲氧基甲烷、二甘醇二甲醚、 三甘醇二甲醚、四甘醇二甲醚、聚乙二醇-350-二甲基醚、聚乙二醇-550-二甲基醚、聚乙二 醇-750-二甲基醚，其中350、550和750是指聚乙二醇近似的平均分子量；和一種或多種抗 氧化劑，如丁基化的羥基甲苯(BHT)、丁基化的羥基苯甲醚(BHA)、沒食子酸丙酯、維生素E、 對苯二酚、羥基香豆素、乙醇胺、卵磷脂、腦磷脂、抗壞血酸、蘋果酸、山梨糖醇、磷酸、硫代二 丙酸及其酯、和二硫代氨基甲酸酯。其它製劑包括但不限於，含醇水溶液包括藥學可接受的縮醛。在這些製劑中使 用的醇為任何具有一個或多個羥基的藥學可接受的與水混溶的溶劑，包括但不限制於，丙 二醇和乙醇。縮醛包括，但不限於，低級烷基醛的二(低級烷基)縮醛，如乙醛縮二乙醇 (acetaldehyde diethyl acetal)02.注射劑、溶液和乳劑在多個實施方案中，本文也考慮胃腸外給藥，其特徵為注射，如皮下、肌內或靜脈 內。注射劑可以常規形式製備，作為液體溶液或混懸劑，適合注射前液體形式的溶液或混懸 液的固體形式，或乳劑。注射劑、溶液和乳劑也含有一種或多種賦形劑。適合的賦形劑為， 例如，水、鹽水、葡萄糖、甘油或乙醇。而且，如果需要，待給藥的藥物組合物也可以含有少量 無毒輔助物質，如潤溼劑或乳化劑、PH緩衝劑、穩定劑、增溶劑和其它這類試劑，例如，乙酸 鈉、脫水山梨醇單月桂酸酯、油酸三乙醇胺和環糊精。本文也考慮了緩釋或持續釋放體系的植入使得維持一定的劑量水平(參見，例如 美國專利3，710，795)。簡而言之，將本文提供的化合物分散到惰性基質中，如聚甲基丙烯 酸甲酯、聚甲基丙烯酸丁酯、增塑或未增塑的聚氯乙烯、增塑的尼龍、增塑的聚對苯二甲酸 乙二酯、天然橡膠、聚異戊二烯、聚異丁烯、聚丁二烯、聚乙烯、亞乙基_乙酸乙烯共聚物、矽 酮橡膠、聚二甲基矽氧烷、矽酮碳酸酯共聚物、親水聚合物如丙烯酸酯和甲基丙烯酸的水凝 膠、膠原、交聯聚乙烯醇和交聯的部分水解的聚醋酸乙烯酯，該基質被外層聚合物膜包裹， 所述聚合物膜如聚乙烯、聚丙烯、亞乙基/亞丙基共聚物、亞乙基/丙烯酸乙酯共聚物、亞乙 基/乙酸乙烯共聚物、矽酮橡膠、聚二甲基矽氧烷、氯丁橡膠、氯化的聚乙烯、聚氯乙烯、氯 乙烯與乙酸乙烯的共聚物、偏二氯乙烯、亞乙基和亞丙基、離子聚合物聚對苯二酸乙烯酯、 丁基橡膠表氯醇橡膠、亞乙基/乙烯醇共聚物、亞乙基/乙酸乙烯/乙烯醇三聚物和亞乙基 /乙烯基氧基乙醇共聚物，該基質不溶於體液。化合物在控制釋放速度的步驟中通過外部聚 合物膜擴散。在這些胃腸外組合物中含有的活性化合物的百分比極大地依賴於其特定的性 質，以及化合物的活性和受試者的需要。組合物的胃腸外給藥包括靜脈、皮下和肌內給藥。胃腸外給藥的製劑包括準備用 於注射的無菌溶液、準備在使用前與溶劑混合的無菌乾燥的可溶物質如凍乾粉末(包括皮 下注射用片劑)、準備用於注射的無菌混懸劑、準備在使用前與溶媒混合的無菌乾燥不溶物 質和無菌乳劑。溶液可以是水溶液或非水溶液。如果靜脈給藥，適合的載體包括生理鹽水或磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS)、和含有增稠劑和增溶劑的溶液，如葡萄糖、聚乙二醇、和聚丙二醇及其混合物。胃腸外製劑中使用的藥學可接受的載體包括水性溶媒、非水溶媒、抗菌劑、等滲試 劑、緩衝劑、抗氧化劑、局麻劑、助懸和分散劑、乳化劑、遮蔽或螯合劑和其它藥學可接受的 物質。水性溶媒的實例包括氯化鈉注射液、林格注射液、等滲葡萄糖注射液、無菌水注射 液、葡萄糖和乳酸鹽林格注射液。非水胃腸外溶媒包括植物源的不揮髮油、棉子油、玉米油、 麻油和花生油。抑制細菌和真菌濃縮物中的抗菌劑必須加入到包裝在多劑量容器中的胃腸 外製劑中，所述抗菌劑包括苯酚或甲酚、汞劑、苄醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯 甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯銨和苄索氯銨。等滲試劑包括氯化鈉和葡萄糖。緩衝劑包括磷酸 鹽和檸檬酸鹽。抗氧化劑包括亞硫酸氫鈉(sodium bisulfate)。局麻劑包括普魯卡因鹽酸 鹽。助懸和分散劑包括羧甲基纖維素鈉、羥丙甲纖維素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化劑包括聚 山梨酯80 (TWEEN 80)。金屬離子的掩蔽或螯合劑包括EDTA。對於水可混溶的溶媒，藥物 載體也包括乙醇、聚乙二醇和丙二醇；和用於調節PH的氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。調節藥物活性化合物的濃度使得注射劑提供有效量以提供所需的藥理學作用。如 在本領域是已知的，使用的劑量依賴於患者或動物的年齡、體重和病況。單位劑量的胃腸外製劑包裝在安瓿、小瓶或有針的注射器中。如本領域是已知和 已使用的，所有胃腸外給藥的製劑必須是無菌的。示例性地，含有活性化合物的無菌水溶液的靜脈或動脈內輸注是有效的給藥方 式。另一個實施方案是含有視需要的可注射活性物質的無菌水性或油性溶液或混懸劑以產 生所需的藥理學作用。將注射劑設計為局部或全身給藥。在多個實施方案中，配製治療有效劑量使所含 濃度為至少約0. 1 % w/w至約90% w/w或更多，在一些實施方案中向被治療的組織給藥多 於w/w的活性化合物。化合物可以以微粒化或其它適合的形式混懸，或可以衍生化以產生更易溶的活性 產物或產生前藥。所得混合物的形式依賴於許多因素，包括打算的給藥方式和化合物在所 選載體或溶媒中的溶解度。有效濃度足以改善病況的症狀，且可以被經驗地確定。3.凍乾粉末本文也關注凍乾粉末，其可以重構作為溶液、乳劑和其它混合物給藥。它們也可以 重構和配製為固體或凝膠。通過將本文提供的化合物或其藥學可接受的衍生物溶解在適合的溶劑中而製備 無菌凍乾粉末。所述溶劑可以含有提高粉末或從粉末製備的重構溶液的穩定性的賦形劑或 其它藥理學成分。可以使用的賦形劑包括，但不限於，葡萄糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖漿、木 糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其它適合的試劑。所述溶劑也可以含有緩衝劑，如檸檬酸鹽、磷 酸鈉或磷酸鉀或其它本領域技術人員已知的緩衝劑，在多個實施方案中，約為中性PH。隨 後，無菌過濾溶液，然後在本領域技術人員已知的標準條件下凍幹得到所需製劑。在多個實 施方案中，將所得溶液均分到用於凍幹的小瓶中。每個小瓶將含有單一劑量或多劑量的化 合物。凍乾粉末可以在適合的條件下儲存，如在約4°C至室溫。用於注射的凍乾粉末與水的重構提供了用於胃腸外給藥的製劑。為了重構，將凍 乾粉末加入到無菌水或其它適合的載體中。精確的量依賴於所選的化合物。該量可以被經
4.局部給藥製備局部混合物，如對於局部和全身給藥所述。所得混合物可以是溶液、混懸劑、 乳劑等，且可以配製為乳膏、凝膠、軟膏、乳劑、溶液、酏劑、洗劑、混懸劑、酊劑、糊劑、泡沫 劑、氣霧劑、衝洗劑、噴霧劑、栓劑、繃帶、皮膚貼片或任何適合局部給藥的製劑。化合物或其藥學可接受的衍生物可以配製為用於局部應用的氣霧劑，如通過吸入 (參見例如美國專利4，044，126,4, 414，209和4，364，923，它們描述了用於遞送甾體的氣霧 劑，用於治療炎症疾病，尤其是哮喘)。這些用於向呼吸道給藥的製劑可以為氣霧劑或用於 噴霧的溶液，或用於吸入的微細粉末，單獨或與惰性載體(如乳糖)組合。在這種情況下， 在多個實施方案中，該製劑的顆粒將具有小於50微米的直徑，在多個實施方案中小於10微 米。化合物可以配製用於部分或局部使用，如對於皮膚和黏膜的局部使用，如用於眼， 以凝膠、乳膏和洗劑的形式，且用於施用到眼或用於腦池內或脊柱內施用。局部給藥被考慮 用於透皮遞送且也用於向眼或黏膜給藥，或用於吸入治療。可以單獨給藥活性化合物的鼻 部溶液或與其它藥學可接受的賦形劑組合給藥。 這些溶液，尤其是打算眼用的溶液，可以與適合的鹽配製為0. 01 % -10 %等滲溶 液，pH約為5-7。5.對於其它給藥途徑的組合物本文也考慮了其它給藥途徑，如包括離子電滲和電泳設備的透皮貼片，和直腸給藥。包括離子電滲和電泳設備的透皮貼片是本領域技術人員已知的。例如，這些貼 片描述於美國專利 6，267，983,6, 261，595,6, 256，533,6, 167，301,6, 024，975,6, 010715、 5，985，317,5, 983，134,5, 948，433 和 5，860，957 中。例如，用於直腸給藥的藥物劑型為直腸栓劑、用於全身作用的為膠囊和片劑。本文 所用的直腸栓劑是指插入到直腸的固體，該固體在體溫下融化或軟化釋放一種或多種藥理 或治療活性成分。在直腸栓劑中使用的藥學可接受的物質為基質或溶媒和提高熔點的試 劑。基質的實例包括可可脂(可可豆油)、甘油_明膠、碳蠟(聚乙二醇)和適合的脂肪酸 單_、二和三甘油酯的混合物。可以使用多種基質的組合。提高栓劑熔點的試劑包括鯨蠟 和蠟。直腸栓劑可以通過壓制方法或模製製備。在多個實施方案中，直腸栓劑的重量為約 2 至 3mg。用於直腸給藥的片劑和膠囊使用與口服給藥的製劑相同的藥學可接受的物質和 方法製備。6.靶向製劑本文提供的化合物或其藥學可接受的衍生物也可以配製為靶向於特定在治療的 受試者的組織、受體或身體其它區域。許多靶向方法是本領域技術人員公知的。本文考慮 所有這些靶向方法用於即用組合物(instantcompositions)中。靶向方法的非限制性實例 參見，例如美國專利 6，316，652,6, 274，552,6, 271，359,6, 253，872,6, 139，865,6, 131，570、 6，120，751,6，071，495,6，060，082,6，048，736,6，039，975,6，004，534,5，985，307, 5，972，366,5, 900，252,5, 840，674,5, 759，542 和 5，709，874。
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在多個實施方案中，脂質體混懸劑，包括靶向組織的脂質體，如靶向腫瘤的脂質 體，也可以適合作為藥學可接受的載體。這些可以根據本領域技術人員已知的方法製備。例 如，脂質體製劑可以如美國專利4，522，811中所述的方法製備。簡而言之，脂質體，如多層 小囊泡(MLV' s)可以通過乾燥卵磷脂醯基膽鹼和腦磷脂醯基絲氨酸(7 3摩爾比)到 燒瓶內側上而成形。加入本文提供的化合物在沒有二價陽離子的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中 的溶液，且振蕩燒瓶直到脂質膜分散。洗滌所得小囊泡以移除未包裹的化合物，通過離心沉 澱，然後再懸於PBS中。7.製品化合物或藥學可接受衍生物可包裝為製品(articles of maufacture)，所述製品 包含包裝材料、本文提供的化合物或藥學可接受衍生物，所述包裝物質中的化合物或藥學 可接受衍生物可有效調節蛋白質運輸，或用於治療或改善涉及蛋白質運輸的病症的一種或 多種症狀，以及說明化合物或組合物或其藥學可接受衍生物的標籤，而這些化合物或組合 物或其藥學可接受衍生物用於調節調節蛋白質運輸，或用於治療或改善涉及蛋白質運輸的 病症的一種或多種症狀。本文提供的製品包含包裝材料。用於包裝藥物產品的包裝材料對於本領域技術人 員是已知的。見，例如美國專利號5，323，907,5, 052，558和5，033，252。藥物包裝材料的實 例包括，但不局限於泡罩包裝、瓶子、導管、吸入器、泵、袋子、小瓶、容器、注射器、瓶子和任 何適於所選製劑和預期給藥方式和治療的包裝物質。本文提供的化合物和組合物的大量制 劑被考慮作為任何涉及蛋白質運輸的病症的多種治療，作為這些症狀或病因的調節劑或作 用劑。8.緩釋製劑本文也提供了持續釋放製劑以高循環濃度(在10_9和10_4M之間)向理想靶點(即 大腦或全身器官，例如肺)遞送化合物。在治療囊性纖維化的某些實施方案中，可維持化合 物的循環濃度，例如高達10_7M。該濃度的化合物可以在患者系統性地循環，或在許多實施 方案中，存在於期望的靶器官中，或在某些實施方案中，位於特定的組織、細胞、病變等中， 例如在期望的靶器官中。要理解的是，在一定時間內維持化合物水平是需要的，且該水平可以由本領域技 術人員簡單地確定。在多個實施方案中，可以給予緩釋製劑使得在48至96小時血清中治 療化合物的一定水平維持在10_8至10_6M。該持續和/或定時(timed)釋放的製劑可以通過本領域技術人員公知的遞送設備 的持續釋放工具製備，如描述於美國專利3，845，770 ；3, 916，899 ；3, 536，809 ；3, 598，123 ； 4，008，719 ；4，710，384 ；5，674，533 ；5，059，595 ；5，591，767 ；5，120，548 ；5，073，543 ； 5，639，476 ；5，354，556和5，733，566中的設備，這些公開內容在此引入作為參考。這些藥
物組合物可以用於提供緩慢或持續釋放一種或多種活性化合物，例如，使用羥丙甲纖維素、 其它聚合物基質、凝膠、滲透膜、滲透體系、多層包衣、微粒、脂質體、微球等。本領域技術人 員已知的適合的持續釋放製劑(包括本文所述的那些)可以根據本文提供的藥物組合物的 使用方便地選擇。因此，本文考慮了適合口服給藥的單一單位劑型，如但不限制於，片劑、膠 囊、軟膠囊、小膠囊、粉末等，它們適合用於持續釋放。在多個實施方案中，持續釋放的製劑含有活性化合物如，但不限制於微晶纖維素、麥芽糊精、乙基纖維素和硬脂酸鎂。如上所述，本文考慮了所有已知的與所公開的化合物的 性質相容的膠囊化方法。持續釋放的製劑通過包衣顆粒膠囊化，或通過本文提供的藥物組 合物顆粒與可變厚度的緩慢溶解的聚合物膠囊化，或通過微囊化。在多個實施方案中，用可 變厚度(如約1微米至200微米)的包衣材料膠囊化持續釋放的製劑，使得藥物組合物在 向哺乳動物給藥約48小時至約72小時後溶解。在另多個實施方案中，包衣材料為食品添 加劑。在其它實施方案中，持續釋放的製劑為基質溶解設備，其通過將藥物與緩慢溶解 的聚合物載體壓製成片而製備。在多個實施方案中，包衣的顆粒具有的粒徑為約0. 1至約 300微米，如美國專利4，710，384和5，354，556所述，將其全部內容引入本文作為參考。每 個顆粒為微基質形式，其中活性成分均勻地分布在聚合物中。本文公開了持續釋放製劑，如美國專利4，710，384所述，將其全部引入作為參考， 該製劑在包衣中具有相對高百分比的增塑劑，使得提供足夠的柔性在壓制期間基本上防止 斷裂。增塑劑的特定的量根據包衣的性質和所用的特定增塑劑改變。該量可以通過檢測形 成的片劑的釋放特性經驗性的方便的確定。如果藥物釋放太快，那麼使用更多的增塑劑。釋 放特性也依賴於包衣的厚度。當使用基本量的增塑劑時，包衣的持續釋放能力降低。因此， 包衣的厚度可以稍微增加以補償增塑劑的量的增加。通常，在該實施方案中的增塑劑將以 包衣中持續釋放物質的約15至30%的量存在，在多個實施方案中為20至25%，且包衣的 量將為活性物質重量的10至25%，且在另多個實施方案中，為活性物質重量的15至20%。 可以向包衣中摻入任何常規藥學可接受的增塑劑。本文提供的化合物可以配製為持續和/或定時釋放的製劑。所有持續釋放的藥物 產品具有的通常的目的是與非持續釋放的類似物相比提高藥物療效。理想地，在藥物治療 中最佳設計的持續釋放製劑的用途的特徵在於使用最少的藥物治癒或控制疾病。持續釋放 的製劑的優點可以包括1)組合物的延長的活性，2)降低劑量頻率，和3)增加患者順應性。 而且，持續釋放製劑可以用於影響發作時間或其它特點，如組合物的血液濃度，且因此能夠 影響副作用的發生。設計本文提供的持續釋放的製劑以初始提供一定量的治療組合物，其迅速產生所 需的治療效果，且逐漸和持續釋放其它量的組合物以在延長的時間內維持產生治療作用的 水平。為了在身體中保持一定水平，治療組合物必須從劑型中以一定速率釋放，新釋放的組 合物將代替被代謝和從身體排洩的組合物。活性成分的持續釋放可以被多種誘導因素影響，例如pH、溫度、酶、水或其它生理 條件或化合物。可以適合的配製口服給藥的製劑以得到控釋的活性化合物。在多個實施方案中， 將化合物配製為分開的微粒的控釋粉末，其可以以液體形式方便地配製。持續釋放的粉末 包含含有活性成分和任選含至少一種無毒聚合物的賦形劑的顆粒。粉末可以分散或混懸於液體溶媒中，且在有用的時間內將維持其釋放特點。這些 分散劑或混懸劑同時具有化學穩定性和溶解速度穩定性。該粉末可以含有含聚合物的賦形 劑，其可以是可溶的、不溶的、可滲透的、不可滲透的或生物可降解的。所述聚合物可以是聚 合物或共聚物。所述聚合物可以為天然或合成的聚合物。天然的聚合物包括多肽(如玉蜀 黍蛋白)、多糖(如纖維素)、和海藻酸。示例性的合成的聚合物包括，但不限制於，美國專
102利5，354，556，第3欄，第33-45行所述的那些，其全部在此引入作為參考。尤其適合的組合 物包括，但不限制於，美國專利5，354，556，第3欄第46行至第4欄第8行所述的那些，其全 部在此引入作為參考。可以配製本文提供的持續釋放的組合物用於胃腸外給藥，例如通過肌內注射或皮 下組織和各種體腔和透皮設備植入。在多個實施方案中，將肌內注射劑配製為水性或油性 混懸劑。在水性混懸劑，持續釋放作用是部分由於當複合後活性化合物的溶解度降低或溶 出速度降低。對於油性混懸劑和溶液使用相似的方法，其中通過將活性化合物分離出油而 進入到周圍水性介質中而確定活性化合物的釋放速度。只有油性可溶且具有所需的分配特 性的活性化合物是適合的。可以用於肌內注射的油包括，但不限於，麻油、橄欖油、花生油、 玉米油、杏仁油、大豆油、棉子油和蓖麻油。在一定時間(幾天至幾年)產生持續釋放的高度發展形式的藥物遞送將帶有藥物 的聚合物設備植入到皮下或多種體腔中。在植入中使用的聚合物材料(其必須是生物相容 的和無毒的)包括，但不限於，水凝膠、矽酮、聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、或生物可降 解的聚合物。E.化合物的活性評價可在本文描述的實驗中測定作為蛋白質運輸調節劑的化合物的活性，所述實驗 評價化合物拯救蛋白質運輸受損的能力。例如，可使用酵母突變細胞系yptlts，確定從突 變YPTl等位基因的致死表型拯救細胞的化合物(參見，例如，Examples和Schmitt等人 (1988)Cell 53 :635_47)。可測量活性，例如，在全酵母細胞測定中使用384孔篩選方法和 光密度測量。表A詳細列出了酵母基因YPTl和SARl的人同源基因。如本文所述，表現出蛋白 質運輸所需蛋白(例如表A中的蛋白質)表達或活性減少的細胞(例如哺乳動物細胞或酵 母細胞)可用於篩選具有從蛋白質運輸缺陷拯救細胞的能力的候選藥物。表A 酵母基因YPTl和SARl的人類的對應物此外，化合物的有效性可在上述測試方式之前(首先)、同時或其後，通過監測，例 如⑴調節(例如改善)運輸缺陷蛋白的穩定性，( )調節(例如改善)運輸缺陷蛋白的 適當的、生理的運輸，(iii)調節(例如恢復)運輸缺陷蛋白的一種或多種功能進行評價。 例如，在一些情況下，蛋白質(例如蛋白突變，例如AF508 CFTR)過早降解。因此，所述化 合物調節蛋白質運輸的有效性可通過在化合物存在時對比無化合物時監測蛋白質的穩定 性來確定。例如，表達運輸缺陷蛋白的細胞(例如內源性表達或表達外源性轉基因編碼運 輸缺陷蛋白，例如AF508 CFTR)可在化合物存在或無化合物時培養至少1小時(例如，至 少2小時、至少4小時、至少6小時、至少8小時，至少12小時、至少16小時、至少24小 時、至少36小時、或至少48小時)。細胞裂解物可由不同細胞群製備，混懸在Laemmli緩 衝液中(有或無還原劑)並進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。使 用特異性識別運輸缺陷蛋白(例如CFTR)的抗體，通過蛋白質印跡或點印跡技術測定在化 合物存在或無化合物時蛋白質的量。在化合物存在時對比無化合物時運輸缺陷蛋白量的 增加說明化合物調節(例如穩定)運輸缺陷蛋白(Vij等人(2006)J.Biol. Chem. 281 (25) 17369-17378)。當蛋白質的修飾狀態(例如糖基化或磷醯化)說明穩定性增加時，蛋白質 修飾狀態的改變也可用於確定是否化合物穩定了運輸缺陷蛋白。例如，糖基化的CFTR(例 如，AF508 CFTR)的量可在化合物存在或無化合物時評價。蛋白質的糖基化形式的增加表明化合物穩定CFTR(例如，AF508 CFTR)。可以理解的是這種實驗的常規改變可用於監測任何運輸缺陷蛋白。此外，也可在 化合物存在或無化合物時監測蛋白質的穩定狀態水平(例如，蛋白質轉換或降解率)(例 如，見 Van Goor 等人(2006) Am. J. Physiol. Lung. CellMol. Physiol. 290 :L1117_L1130)。確定運輸缺陷蛋白調節的另一種方法是原位染色方法(in situ staining)。例 如，當蛋白質(例如，AF508 CFTR或G601S-hERG)在到達細胞表面前過早降解時，可以以 蛋白質的細胞表面表達量的變化(例如增加)確定化合物調節運輸缺陷蛋白的有效性。因 此，在化合物存在時在細胞表面的蛋白表達對比無化合物時表面表達量的增加說明化合物 調節(例如穩定)運輸缺陷蛋白。免疫染色方法是本領域技術人員眾所周知的，並且包括 其中細胞仍存活(例如，活細胞例如哺乳動物細胞的共聚焦顯微鏡觀察)或固定細胞的染 色(例如，免疫組織化學)的實施方案。細胞可附在固體支持物上(例如，組織培養皿或 多聚賴氨酸塗被的玻璃片)或可加至溶液中(例如用於螢光輔助細胞分選(FACS)分析)。 對細胞使用(例如，給藥、運輸、接觸)運輸缺陷蛋白特異性的一抗(primary antibody)。 一抗本身可用可檢測的標記進行標記(例如，不同顏色的螢光團(例如，羅丹明、德克薩斯 紅、FITC、綠色螢光蛋白、Cy3、Cy5))。或者，第二種試劑，例如二抗，可被可檢測地標記而一 抗未標記。一抗也可與結合對的第一個成員(例如，生物素或鏈黴親合素)結合，並且結 合對的第二個成員被可檢測地標記。合適的顯微鏡(例如共聚焦顯微鏡)與合適的濾光 片的使用可確定在指定細胞中標記的抗體的位置。來自細胞表面的可檢測標記信號的增 加表明更多的蛋白在細胞表面表達。當然，可以理解這種方法可用於定位於細胞的其它隔 室(compartment)(例如，細胞器例如核、溶酶體、內質網、高爾基體或線粒體)的運輸缺陷 蛋白。使用另一種抗體或染料確定另一種已知定位於感興趣的指定隔室的對照蛋白是有用 的。通常，第二種蛋白使用與感興趣的運輸缺陷蛋白不同的可檢測標記進行標記。之後通 過前面所述的方法確定兩種標記的位置。當兩種蛋白的位置分別確定時(即，通過抗體結 合確定細胞中它們分別的可檢測標記的位置)，如果發現它們佔據相同位置，稱兩種蛋白為 共定位(co-localize)，並因此運輸缺陷蛋白定位在合適的細胞位置(即，當兩種蛋白在無 化合物時共定位，但在化合物存在時沒有共定位，這說明化合物抑制兩種蛋白之間的相互 作用)。這種方法的實例描述在例如Morello等人(2000) J. Clin. Invest. 105(7) :887_895 和 Liu 等人(2003)Proc. Natl. Acad. Sci. USAlOO (26) 15824-15829 中。任選的，可使用例 如多聚甲醛或甲醛固定細胞，並使用去汙劑(例如Triton-ΧΙΟΟ)透化細胞。化合物調節運輸缺陷蛋白的有效性也可通過監測運輸缺陷蛋白活性的增加評價。 例如，AF508 CFTR是PKA調節的氯通道，並因此可通過例如對福斯高林(forskolin)響 應的膜電位的增加或cAMP介導的氯外流誘導的增加確定CFTR蛋白穩定性的增加(見， 例如 Vij 等人(2006) J. Biol. Chem. 281 (25) :17369_17378 和 Van Goor 等人(2006) Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 290 :L1117_L1130)。α -半乳糖苷酶 Α，法布裡病 中的運輸缺陷蛋白，是代謝特定脂質的酶。因此，可通過評價在化合物存在時對比無化合物 時α-半乳糖苷酶的細胞活性確定化合物調節α-半乳糖苷酶A的有效性。化合物存在時 對比無化合物時活性的增加說明化合物調節(例如，穩定)α-半乳糖苷酶A蛋白。監測細 胞中α -半乳糖苷酶A活性的方法可在例如Ioannou等人(1998) Biochem. J. 332 :789_797 中發現。監測除CFTR和α-半乳糖苷酶A外，為以蛋白質運輸受損為特徵的各個疾病成因
107的運輸缺陷蛋白在體外和體內的酶活性的方法在本領域是已知的。蛋白質運輸(例如，內質網-介導的蛋白質運輸)也可使用體外(無細胞)方法檢 測和測定。因此，化合物調節例如運輸缺陷蛋白或蛋白質運輸的各個步驟(例如COPII囊 泡的形成或停靠(docking))的有效性可使用這種體外方法確定。用於檢測或測定內質網 介導的蛋白質運輸的合適的體外方法描述在例如Rexach等人(1991) J Cell Biol. 114(2) 219-229 ；Segev (1991) Science 252 (5012) 1553-1556 ;Balch 等人(1984) Cell 39(2 Pt 1) 405-416 ；Wattenberg(1991)J Electron Microsc Tech 17(2) 150-164 ；Beckers 等 人(1989) J. Cell Biol. 108(4) 1245-1256 ；和 Moreau 等人(1991) J Biol. Chem 266(7) 4322-4328中，其內容在本文完整引用作為參考。例如，感興趣的蛋白從內質網至高爾基體 的轉運可被檢測或測定。首先，標記細胞內的受體蛋白，例如使用35S-甲硫氨酸通過代謝標 記蛋白，或通過表達細胞內蛋白的可檢測標記形式(包括感興趣的蛋白和綠色螢光蛋白的 融合蛋白)。可從包含標記蛋白的細胞獲得包含內質網的「供體」膜部分。可從不包含標 記蛋白的細胞製備包含高爾基體的「受體」膜部分。標記蛋白的轉運通過翻譯後修飾完成。 報告子蛋白通常是糖蛋白，其糖鏈在內質網至高爾基體的轉運期間被修飾。受體和供體部 分混合併與需要的輔助因子一起孵育。通過標記蛋白翻譯後修飾形式的增加監測轉運。用 於檢測翻譯後修飾的標記蛋白的方法在本文中描述，並包括蛋白質印跡、點印跡、凝集素結 合和對糖苷酶的易感性。當可檢測標記是螢光或發光標記時，可使用螢光計或光度計。當 可檢測標記是放射性標記時(見下)，可使用閃爍計數器、χ-射線片或輻射儀。可以理解蛋 白質不需要可被檢測標記。最初出現在供體部分(例如，特異在供體細胞群中表達的蛋白 質)，但不出現在受體部分的蛋白質可使用例如蛋白印跡技術辨別。用於檢測蛋白質運輸(例如，內質網-介導的蛋白質運輸)的體外方法也可包括 測定囊泡出芽、脫殼、束縛(tethering)或停靠或與高爾基體的融合(見例如Rexach等人， supra，和 Bonifacino 等人(2004)Cell 116:153-166)。為確定是否化合物調節蛋白質從內質網至高爾基體的體外轉運(例如蛋白質從 內質網至高爾基體轉運的任何步驟)，可使化合物與受體部分、供體部分或兩者在孵育之前 或期間接觸。在製備膜部分之前，化合物可加入至供體或受體細胞群。如本文所述(見， 例如實施例)，抑制蛋白酶體的化合物(例如，蛋白酶體表達或活性)也可通過本文所述的 實驗(例如yptlts突變實驗)進行篩選以確定是否化合物拯救內質網-介導的轉運。檢 測和/或測定蛋白酶體活性的體內和體外(基於細胞)的方法在本領域是已知的，並在例 如 Chuhan 等人(2006) Br. J. Cancer 95(8) :961_965 ;Rubin 等人(1998) EMBO J. 17(17) 4909-4919 ；Glickman 等人(1999)Mol. Biol. Rep. 26(1-2) :21_8 ；和 Grimes 等人(2005) Int. J. Oncol. 27 (4) =1047-1052中描述。確定是否候選化合物抑制蛋白酶體，例如蛋白酶 體活性的體外方法可包括候選化合物與離體的蛋白酶體複合物接觸，並測定與候選化合物 接觸的離體的蛋白酶體活性。與化合物接觸的蛋白酶體的活性對比無化合物時蛋白酶體活 性的降低說明候選化合物抑制蛋白酶體的體外活性。確定是否候選化合物抑制蛋白酶體的 體內方法可包括，例如候選化合物與細胞接觸，並測定細胞中蛋白酶體的活性。例如，測定 細胞中已知通過蛋白酶體降解的蛋白質的轉換(turnover)。與化合物接觸的細胞中的蛋白 酶體活性對比無化合物接觸的細胞中的蛋白酶體活性的下降說明候選化合物抑制蛋白酶 體的體內活性。蛋白酶體抑制劑的實例包括，例如MG132、MG15、LLnL、ALLnL、bortezomib/PS-341/Velcade 、NPI-0052、epoxomicin 和乳胞素(Iactacystin) (Myung 等人(2001) Med. Res. Reviews 21(4) 245-273 ；Montagut 等人(2006) Cl in Transl Oncol. 8(5) 313-317 ；和 Chuhan 等人(2006) Br. J. Cancer 95(8) :961_965)。例如，可在標準測定中測量對α -突觸核蛋白毒性的調節(見例如美國專利申請 10/826，157，於2004年4月16日提交；美國專利申請2003/0073610 ；及實施例)。可在整 體酵母細胞實驗中使用384-孔篩選方法和光密度測定來測量活性。人α-突觸核蛋白在 酵母中的表達通過拷貝數依賴方式(見，例如Outeiro，等人(2003) Science 302(5651) 1772-5)抑制生長。一個拷貝的a-syn::GFP的表達對於生長沒有影響，而兩個拷貝導 致完全抑制。生長的停止伴隨a-syn::GFP定位的改變。在具有一個拷貝的細胞中， a-Syn::GFP與質膜以高度選擇性方式相關。當表達加倍時，α-突觸核蛋白遷移至細胞 質，在細胞質中形成與患病神經元中的路易體相似的大包涵體。本文提供的這些化合物可在此測試中篩選具有α-突觸核蛋白毒性拯救活性的 化合物。簡言之，在384-孔板中的人源化的細胞株在誘導α-突觸核蛋白表達的條件下暴 露於化合物。在孵育24或/和48小時後，測量細胞生長。抑制毒性的化合物將使細胞恢 復生長，並檢測濁度的增加(0D_)。可使用其他的實驗來篩選化合物，以評價它們調節a -突觸核蛋白毒性的能力。 這些實驗包括，例如在人神經膠質細胞中(見，例如McLean等人(2004)Biochem Biophys Res Commun. 321(3) 665~69)或在蠕蟲或原代神經元中(見例如Cooper等人(2006) Science 313(5785) :324_8和補充材料)篩選調節α -突觸核蛋白誘導的毒性的化合物。F.蛋白質的製備方法本文所述的的化合物增強內質網-介導的轉運，並因此可在增強細胞中蛋白質產 生的方法中使用。由本方法產生的蛋白質可為天然的，或非天然的蛋白質。蛋白質可由細 胞自然產生(例如，沒有任何細胞的基因操作)、可通過異源核酸導入細胞編碼產生，或可 通過插入或激活調節編碼蛋白質基因的表達後由細胞產生。「異源性核酸」指通過使用重組技術引入細胞的核苷酸序列。因此，出現在指定細 胞中的「異源性核酸」不在細胞中自然產生(例如，在細胞的基因組中沒有對應的相同序 列)，和/或在細胞中在與對應的相同序列自然存在的不同的位置產生(例如，核苷酸序列 在細胞基因組的不同位置出現，或在細胞中以構建體出現而沒有整合入基因組)。由細胞產生的任何蛋白質可在本文所述的方法中使用。例如，可產生蛋白質例如 細胞因子、淋巴因子、和/或生長因子。這種蛋白質的實例包括，但不限制於，紅細胞生成 素、白介素l-α、白介素、白介素-2、白介素_3、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介 素_7、白介素_8、白介素-9、白介素-10、白介素-11、白介素-12、白介素-13、白介素-14、 白介素-15、淋巴細胞趨化因子、淋巴細胞毒素α、單核細胞趨化蛋白-1、單核細胞趨化蛋 白-2、單核細胞趨化蛋白Uegapoietin、抑瘤素Μ、青灰因子、血小板生成素、血管內皮細 胞生長因子、骨形成蛋白、白介素-ι受體拮抗劑、粒細胞集落刺激因子、白血病抑制因子、 粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、巨噬細胞集落刺激因子、幹擾素Y、幹擾素β、成纖維細 胞生長因子、腫瘤壞死因子α、腫瘤壞死因子β、轉化生長因子α、絨促性素、神經生長因 子、血小板衍生生長因子、巨噬細胞炎性蛋白Ia、巨噬細胞炎性蛋白l-β、和Fas配體。產 生上述多肽的非自然發生的、變異體的細胞也可在本文所述的方法中使用。
除上述蛋白質，本文所述的方法也可用於產生融合蛋白，所述融合蛋白包含與指 導來自細胞的融合蛋白質分泌的胺基酸序列融合的全部或部分的指定蛋白質。在一些情況 下，這種融合蛋白可允許從細胞非典型分泌的多肽序列的分泌。例如，蛋白質的全部或部分 (例如，膜相關蛋白，例如受體或細胞內蛋白)可與免疫球蛋白分子的部分融合(例如，與鉸 鏈區和人IgGl重鏈的恆定區CH2和CH3結構域融合)。本文所述的方法產生的蛋白質可為抗體或抗體的抗原結合片段。抗體可定向於抗 原，例如蛋白質抗原，例如可溶性多肽或細胞表面受體。例如，抗體可定向於參與免疫細胞 活化的細胞表面受體(一種疾病相關抗原)、或病原體產生的抗原。術語「抗體」指免疫球 蛋白分子或其抗原結合部分。如本文所使用的術語「抗體」指包含至少一個，例如兩個重鏈 可變區(「VH」)，並且包含至少一個，例如兩個輕鏈可變區(「VL」)的蛋白質。VH和VL區 可進一步再分為高度變異區，又稱「互補性決定區」(「CDR」)；更加保守的散開區，又稱「框 架區」(FR)。抗體還可包括重鏈和輕鏈恆定區，由此分別形成重和輕免疫球蛋白鏈。在一 個實施方案中，抗體為兩個重免疫球蛋白鏈和兩個輕免疫球蛋白鏈的四聚體，其中重和輕 的免疫球蛋白鏈通過例如二硫鍵相互連接。重鏈恆定區包含三個結構域，CH1、CH2、和CH3。 輕鏈的恆定區包含一個結構域，CL0重鏈和輕鏈的可變區包含與抗原相互作用的結合結構 域。蛋白質可為完全人源抗體(例如，在小鼠中從人的免疫球蛋白序列遺傳工程產生 的抗體)、人源化抗體、或非人源抗體，例如齧齒動物(小鼠或大鼠)、山羊或靈長類(例如 猴子)抗體。G.以蛋白質運輸受損為特徵的疾病的治療方法GTP-結合的Rab蛋白，例如Rabl，酵母yptl同系物，參與囊泡轉運的整體調節。 如整個說明書和實施例中所詳述的，在yptts突變拯救篩選實驗中確定的化合物通過例如 調節Rab-yptl通路可用於穩定運輸缺陷蛋白。因此，本文公開的化合物(和包含該化合 物的藥物組合物)可在治療以蛋白質運輸受損為特徵的各種疾病的一種或多種症狀的方 法中使用。如實施例4中所述，使用yptlts突變拯救篩選實驗確定的化合物也可用於穩定 AF508 CFTR0因此，本文所述的化合物在治療或預防囊性纖維化的一種或多種症狀中特別 有用。可通過給藥一種或多種本文所述的化合物(或該化合物的藥物組合物)治療的 以蛋白質運輸受損為特徵的疾病的類型包括，例如遺傳性肺氣腫、遺傳性血色素沉著病、眼 皮膚白化病、蛋白質C缺乏症、I型遺傳性血管性水腫、先天性蔗糖酶異麥芽糖酶缺乏、II 型克-納症候群症候群、拉龍症候群、遺傳性髓過氧物酶症、原發性甲狀腺機能減退症、先 天性長QT症候群、酪氨酸結合球蛋白缺乏症、家族性高膽固醇血症、家族性乳糜微粒血症、 無脂蛋白血症、低血漿脂蛋白a水平、伴隨肝受損的遺傳性肺氣腫、先天性甲狀腺功能 減退症、成骨不全、遺傳性低纖維蛋白原血症、α 1抗糜蛋白酶缺乏症、腎性尿崩症、垂體神 經性尿崩症、夏科_馬裡-圖思症候群、佩利措伊斯_梅茨巴赫病、IIA型馮·威利布蘭德 病、結合因子V和VIII缺乏症、脊椎骨骺遲緩性發育不良、無脈絡膜症、I細胞疾病、巴藤 病、共濟失調-毛細血管擴張症、急性成淋巴細胞性白血病、急性髓細胞樣白血病、髓細胞 性白血病、ADPKD-常染色體顯性多囊性腎病、微絨毛包含病、結節性硬化症、洛氏眼-腦-腎 症候群、肌萎縮側索硬化、骨髓增生異常症候群、裸淋巴細胞症候群、丹吉爾病、家族性肝內膽汁淤積、Χ"連鎖腎上腺腦白質營養不良、斯科特症候群、1型和2型赫曼斯基-普德拉 克症候群、澤耳韋格症候群、肢近端型點狀軟骨發育異常(rhizomelic chondrodysplasia puncta)、常染色體隱性原發性高草酸尿症、Mohr Tranebjaerg症候群、脊髓延髓性肌萎縮 症、原發性纖毛運動障礙(卡塔格納症候群)、米-迪症候群、無腦回畸形、運動神經元病、烏 斯赫爾症候群、威斯科特_奧爾德裡奇二氏症候群、Optiz症候群、亨廷頓舞蹈病、遺傳性胰 腺炎、抗磷脂症候群、重疊結締組織病、舍格倫症候群、僵體症候群、Brugada症候群、芬蘭型 型先天性腎炎症候群、杜賓-詹森症候群、X-連鎖低磷血症、潘德雷德症候群、持續性幼 兒型胰島素過度分泌低血糖症、遺傳性球形紅細胞增多症、無銅藍蛋白血症、嬰兒型神經元 蠟樣質脂褐質沉積病、假性軟骨發育不全和多重骨骺、斯塔加特樣黃斑營養不良、X-連鎖夏 科-馬裡-圖思病、常染色體顯性色素性視網膜炎、Wolcott-Rallison症候群、庫欣病、肢 帶型肌營養不良症、IV型粘多糖病、芬蘭型遺傳性家族性澱粉樣變性、IV型糖原貯積症(安 德森病)、肉瘤、慢性骨髓單核細胞性白血病、心肌病、面生殖發育異常、Torsion病、亨廷頓 和脊髓小腦性共濟失調、遺傳性高同型半胱氨酸血症、多發性神經病、下位運動神經元病、 色素視網膜炎、血清陰性多關節炎、間質性肺纖維化、雷諾現象、韋格納肉芽腫病、蛋白尿、 CDG-Ia, CDG-Ib、CDG-Ic、CDG-IcU CDG-Ie、CDG-If、CDG-Ila, CDG-IIb、CDG-IIc、CDG-IIdJ^ 勒斯_當洛斯症候群、多發性外生骨疣、格裡塞利症候群(1型或2型)、或X-連鎖非特異 性智力發育遲緩。此外、以蛋白質運輸受損為特徵的疾病也可包括溶酶體貯積症，例如但不 限制於法布裡病、法韋爾病、戈謝病、GM1-神經節苷脂貯積病、泰-薩克斯病、桑德霍夫病、 GM2激活劑病、克拉伯病、異染性腦白質營養不良、尼曼_皮克二氏病(A、B和C型)、胡爾勒 病、沙伊病、亨特病、桑菲列普病、莫爾丘病、馬-拉病、透明質酸酶缺乏症、天冬氨醯葡糖胺 尿症、巖藻糖苷貯積症、甘露糖苷貯積症、欣德勒病、1型唾液酸貯積症、蓬佩病、緻密性成骨 不全症、蠟樣脂褐質沉積症、膽固醇酯貯積症、沃爾曼病、多種硫酸酯酶缺乏症、半乳糖涎酸 貯積症、粘多糖症(II、III和IV型)、胱氨酸貯積症、唾液酸貯積症、乳糜微粒滯留病伴隨 馬_舍症候群、赫曼斯基_普德拉克症候群、切_東二氏症候群、Danon病、或Geleophysic 發育不良。以蛋白質運輸受損為特徵的疾病的症狀有許多並且不同，並包括例如貧血、疲勞、 容易擦傷、低血小板、肝增大、脾增大、骨骼虛弱、肺受損、感染(例如，胸感染或肺炎)、腎受 損、進行性腦受損、癲癇發作、胎糞增厚、咳嗽、喘鳴、過量唾液或粘液產生、呼吸急促、腹痛、 腸或消化道閉塞、生育問題、鼻息肉、手指/腳趾指甲和皮膚杵狀變、手或腳痛、血管角質 瘤、排汗減少、角膜和晶狀體混濁、白內障、二尖瓣脫垂和/或反流、心臟肥大、溫度不耐受、 行走困難、吞咽困難、進行性視力喪失、進行性聽力喪失、張力減退、巨舌症、反射消失、下腰 痛、睡眠性呼吸暫停、端坐呼吸、嗜睡、脊柱前凸或脊柱側凸中的一種或多種。可以理解由 於運輸缺陷蛋白的多種特性和所導致的疾病的表型(例如，以蛋白質運輸受損為特徵的疾 病)，指定疾病通常僅展現特殊疾病的症狀特徵。例如，患有囊性纖維化的患者表現特殊亞 型的上述症狀，例如但不限制於，持續咳嗽、過量唾液或粘液產生、喘鳴、咳嗽、呼吸急促、肝 和/或脾增大、鼻息肉、糖尿病、生育問題、感染增加(例如，呼吸道感染，例如肺炎)，或消化 道或腸閉塞。根據疾病的特殊性質，患者可在任何年齡表現出這些症狀。在許多情況下，可在兒 童期或成人早期表現出症狀。例如，當嬰兒的消化道被增厚胎糞阻塞時，通常在出生時表現出囊性纖維化的症狀。對受試者(例如人患者)給藥一種或多種公開的化合物(或藥物組合物)後，可通 過比較患者治療前和後表現出的一種或多種症狀的數量和/或嚴重度，評價治療在改善以 蛋白質運輸受損為特徵的疾病的一種或多種症狀中的有效性。或者，當給藥化合物用於預 防以蛋白質運輸受損為特徵的疾病的發生時，治療效力可評價為以蛋白質運輸受損為特徵 的疾病的一種或幾種症狀的出現延遲或不出現。可通過在治療後的多個時間點評價，例如 一種或多種症狀的數量或嚴重度，確定隨時間(例如，進行性改善)的治療(例如，本文所 述的化合物或組合物)在改善以蛋白質運輸受損為特徵的疾病的一種或多種症狀中的有 效性。例如，受試者(例如患者)可擁有對他或她的疾病的嚴重度(例如，以蛋白質運輸受 損為特徵的疾病的一種或多種症狀的數量或嚴重度)的初始評價，給藥治療，並隨後在治 療兩次或更多次後(例如，在一周和一個月；在一個月、兩個月；在兩周、一個月和六個月； 或六周、六個月和一年)進行評價。當在限定時期內(例如，預先確定的時期)或以限定的 給藥次數對受試者給藥一種或多種化合物或組合物時，可在最終治療後在各個時間點評價 治療對改善以蛋白質運輸受損為特徵的疾病的一種或多種症狀的作用。例如，在一種或多 種化合物的最後給藥劑量後，可在最終治療的一個月(例如，在兩個月、在六個月、在一年、 在兩年、在五年或更長時間)後評價患者症狀的數量和嚴重度。本文所述的一種或多種化合物(或組合物)對以蛋白質運輸受損為特徵的疾病的 一種或多種症狀的治療的有效性可評定為單一治療或作為多重治療方案的一部分。例如， 化合物可與其它臨床相關的用於以蛋白質運輸受損為特徵的疾病的治療結合給藥，所述用 於以蛋白質運輸受損為特徵的疾病的治療包括，但不限制於，物理或呼吸治療、抗生素、抗 哮喘治療、皮質類固醇、維生素補充、阿法鏈道酶治療、Cerezyme 、Ceredase 、My0Zyme 、胰島素、Fabryzyme 、透析、移植物(例如肝或腎)、軟便藥或緩瀉藥、抗_血液凝固試劑 (抗凝劑)、疼痛治療、和/或血管成形術。可以理解由於運輸缺陷蛋白的不同活性和相關 疾病的不同臨床表現(例如，法布裡病、囊性纖維化、戈謝病、蓬佩病等)，「其它臨床相關治 療」也可包括上述治療之外的治療。例如，對於囊性纖維化的其它或另外的臨床相關治療包 括，例如抗生素、阿法鏈道酶治療、維生素補充、軟便藥或緩瀉藥、用於囊性纖維化相關糖尿 病的胰島素、抗哮喘治療、或皮質類固醇。可向受試者給藥本文所述的的化合物或其藥物組合物，作為與其它治療(其它活 性成分)的組合治療，所述其它治療例如以蛋白質運輸受損為特徵的疾病的治療，例如囊 性纖維化或溶酶體貯積病的治療。例如，組合治療可包括向受試者(例如，人患者)給藥一 種或多種其它試劑，所述試劑可向患有，或有風險發展為(或懷疑患有)以蛋白質運輸受損 為特徵的疾病，例如囊性纖維化的受試者提供治療益處。因此，化合物或藥物組合物和一種 或多種其它試劑同時給藥。或者，可首先給藥所述化合物，再給藥一種或多種其它試劑。可 首先給藥一種或多種另外的試劑，再給藥所述化合物。所述化合物可取代或提高之前或同 時給藥的治療(也見下文)。例如，在用本發明的化合物治療後，一種或多種其它試劑的給 藥可停止或減少，例如較低水平給藥。之前的治療給藥也可保持。在一些實例中，之前的治 療可保持，直至化合物水平(例如劑量或給藥時間)到達足夠提供治療作用的水平。兩種 治療可組合給藥。可以理解在一些實例中，當之前的治療毒性特別大時(例如，以蛋白質運輸受損為特徵的疾病的治療伴隨顯著的副作用)或受試者(例如患者)不能耐受時，給藥本發明 的化合物可用於抵消和/或減少之前治療的量，至足夠給予相同的或改善的治療益處，而 不伴隨毒性的水平。在一些實例中，當向受試者給藥本發明的化合物或藥物組合物時，第一種治療停 止。監測受試者的第一種預選擇的結果，例如以蛋白質運輸受損為特徵的疾病的一種或多 種症狀，如任何本文所述的症狀(例如，見上)的改善。在一些情況下，當觀察到第一種預選 擇的結果時，用化合物的治療被減少或停止。之後可在用化合物的治療被停止後監測受試 者的第二種預選擇的結果，例如以蛋白質運輸受損為特徵的疾病的症狀的加重。當觀察到 第二種預選擇的結果時，化合物對受試者的給藥可恢復或增加，或者恢復第一種治療給藥， 或者向受試者同時給藥該化合物和第一種治療，或該化合物和第一種治療方案的量增加。評價治療(例如本發明的化合物或組合物)效果的方法在本領域是已知的，並且 包括評價以蛋白質運輸受損為特徵的疾病的一種或多種症狀，例如本文所述的任一症狀 (見上)的改變(例如，改善)。此外，本發明不限制於任何特殊理論或作用機制，由於本文 確定的化合物可在分子水平發揮作用以糾正以蛋白質運輸受損為特徵的疾病，對患有以蛋 白質運輸受損為特徵的疾病的患者的治療可通過評價例如(i)運輸缺陷蛋白的穩定性的 改善；(ii)運輸缺陷蛋白的適當的、生理的運輸的改善，或者(iii)運輸缺陷蛋白的一種或 多種功能的恢復(見上「化合物活性的評價」中)進行評價。特別的，囊性纖維化治療的有效性(例如給藥本文所述的一種或多種化合物或 藥物組合物)可例如在治療之前和之後通過執行「發汗檢測」進行監測。發汗檢測通常 由醫生或醫務人員進行操作。將無色、無味的化學藥品置於皮膚上，導致發汗，並且用儀 器收集汗液。發汗檢測可花費30分鐘至1小時，這依賴於收集受試者排汗的所花費的 時間。檢測受試者的排汗中的氯水平(例如，使用Sweat-Chek 發汗傳導分析儀(Sweat ConductivityAnalyzer)、Discovery Diagnostics，Ontario，力口拿大)，並且例如 60的評分說明受試者仍患病較重。囊性纖 維化治療的有效性也可使用鼻內電勢差(NPD)檢測。該檢測對於通過發汗檢測確定的具有 正常氯水平的受試者(例如患者)是特別有用的。NPD檢測需要2個電極，與電壓表例如 Tholy-Medicap 儀器連接，一個電極放置於下鼻甲的鼻黏膜上，另一個電極皮下放置於前 臂。通常，認為低於_40mV的讀數是不正常的。因此，認為NPD檢測讀數超過-40mV的患者 疾病改善(參見，例如，Domingo-Ribas 等人(2006)Arch Bronconeumol. 42 :33_38)。
實施例提供下列實施例僅用於說明目的，並不意圖限制本發明的範圍。實施例1 恢復yptlts突變株生長的化合物酵母突變細胞系yptlts以溫度依賴方式抑制突變YPTl等位基因的顯性致死表型 (Schmitt等人(1988) Cell 53 :635_47)。酵母突變細胞系yptlts包含具有兩個點突變的 YPTl等位基因一個在121位從天門冬醯胺突變為異亮氨酸(W21I)，另一個突變是在161 位從丙氨酸突變為纈氨酸(A161V)。N121I突變引發自身的顯性致死性，但致死性被第二個 突變抑制，導致功能表型在限制性溫度隱性喪失。YPtlts細胞在高達25°C的溫度正常生長， 但在37°C生長停止(Id.)。在非許可溫度37°C，yptlts突變株累積ER膜、小囊泡，和未加工的轉化酶，並表現出細胞骨架缺陷和鈣攝取增強(Id.)。yptlts突變細胞可通過提供細胞外 鈣(Id.)而從細胞生長停滯中恢復。篩選化合物以評價其恢復yptlts細胞生長的能力。對在室溫(許可溫度)、 370C (非許可溫度)和35°C (半許可溫度)培養的yptlts細胞測定化合物的作用。發現 拯救α-突觸核蛋白毒性的某些化合物(和其類似物)也可拯救yptlts毒性。為了確定是否待測化合物可拯救yptlts突變表型，yptlts細胞在補充2%葡萄糖 的合成的完全(SC)培養基中在室溫生長過夜。將對數期細胞稀釋到SC 2%葡萄糖培養基 中至0D600為0. 003。然後在96-孔平底微量滴定板的每個孔中等分加入100 μ L的這種培 養基。向每孔中加入1 μ L的溶解在DMSO中的檢測化合物(濃度範圍在5mM-0. 005mM)或 單獨DMSO (在1 % DMSO中的終濃度為50 μ Μ-0. 05 μ Μ)。通過渦旋混合培養板，並在35°C和 37°C孵育。通過測定培養物的0D_(在600nm的光密度；細胞生長)，測定化合物對yptlts 溫度敏感缺陷的拯救。在35°C孵育的板在孵育24和40小時檢測，而在37°C生長的板在孵 育40小時後檢測。監測拯救yptlts突變株的測定使用溶媒、陽性對照(鈣)、表II中鑑別的化合物 進行。在表II中的相應於yptlts WMRC(最小拯救濃度)的結果，大於或等於50毫摩爾的 標記為+ ；YPtlts的MRC為10 50毫摩爾的標記為++ ；yptlts的MRC小於10毫摩爾的標 記為+++。對於特定化合物的多個結果以逗號分開。上述化合物可拯救yptlts的蛋白質運輸缺陷的發現，說明化合物可用於治療或預 防以蛋白質運輸受損(例如在哺乳動物中或在哺乳動物細胞中)為特徵的多種疾病。雖然 這種酵母測試法對於篩選化合物以鑑別出一些在哺乳動物細胞或哺乳動物中具有活性的 化合物是有用的，但是應注意的是許多化合物在哺乳動物細胞或哺乳動物中可具有活性， 但是其在這種酵母測試中沒有表現出活性。
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實施例2A 化合物可調節AF508 CFTR的活性尤斯室(Ussingchamber)測定如上在 Am J Physiol (1994) 266 L405-413 所述地培養穩定地表達AF508 CFTR(囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白)的Fischer大鼠甲狀腺 (FRT)細胞。單層細胞在可分離插入皿(Snapwell inserts,Corning Inc.)在氣/液界面 處生長。用化合物處理單層細胞24小時。將插入皿安裝在尤斯室(Harvard Apparatus) 中並使用電位鉗裝置(WPI，Inc.)測量短路電流。使氯化物的濃度在黏膜至漿膜之間形成 梯度，並使用兩性黴素使基底外側膜能滲透。通過加入最大激活CFTR的激動劑福斯高林、 異丁基甲基黃嘌呤、和染料木黃酮(genistein)來測量短路電流。在此測定中，化合物25(見表I的結構)在加入所有的三種激動劑後，顯示出約 65uA/cm2的短路電流。這可與在這些試驗中顯示出約70uA/cm2的冷校正對照相比，並表明 了這些化合物能調節AF508 CFTR的活性。實施例2B化合物修復了在AF508 CFTR運輸中的缺陷將穩定表達Δ F508 CFTR的Fisher大鼠甲狀腺(FRT)細胞和黃色螢光蛋白(YFP) 的滷化物敏感的變種加入微量滴定板中，並使之在37°C和5%的CO2中生長24小時。見 Pedemonte 等，J. Clin. Invest. 115 (9) 2564-2571 (2005)，將其全部教導引入本文作為參考。 以化合物的二甲基亞碸(DMSO)溶液預稀釋細胞培養基，從細胞中除去培養基，再加入含有 化合物的新鮮培養基。將細胞在37°C和5%的CO2中再次孵育24小時。除去培養基，以磷酸鹽緩衝鹽水溶液(PBS)洗滌單層細胞，再施加含有福斯高林 和染料木黃酮的PBS，如此測定CFTR的活性。在37°C孵育30分鐘後，將板置於裝有試劑注 射器的螢光分析儀中。在測量起始螢光值後，注射含碘的緩衝液，螢光值降低，激發波長和 發射波長分別為485nm和530nm。修復活性計算如下。標準化的終點螢光通過如下計算注射碘化物後的終點熒 光/讀取的初始螢光X 100%。修復劑的EC5tl值從活性與濃度數據使用四參數對數擬合法 (4-parameter log fit)來計算。曲線的底部被限制為零活性(DMS0對照)，同時將斜率、 EC5tl和曲線的頂部擬合入數據。EC5tl被確定為擬合曲線拐點所對應的濃度。測量各個化合 物的修復劑活性EC5tl值，並按照下列範圍顯示在表III中低於2毫摩爾，以++++表示；2 5毫摩爾，以+++表示；5 10毫摩爾，以++表示；及15毫摩爾或更大，以+表示。對於某些化合物，分析了活性並與DMSO對照做比較，但是沒有獲得EC5tl值。與DMSO 對照相比仍然顯示活性的化合物以#表示，沒有顯示出這種活性的化合物以*表示。與DMSO 對照比較在25毫摩爾下顯示出活性的化合物，將其以#或*標記。與DMSO對照比較在25 和2. 5毫摩爾下，顯示出測試活性的化合物，分別以這兩種符號標記。例如，「#，#」表示在 25和2. 5毫摩爾濃度下均觀察到了活性；「*，#」表示在25毫摩爾下沒有觀察到活性，但是 在2. 5毫摩爾下觀察到了活性；「#，*」表示在25毫摩爾下觀察到活性，但在2. 5毫摩爾下 沒有；「*，*」表示在兩濃度下均沒有觀察到活性。這些結果也顯示在表III中。
實施例2C化合物增強了 AF508CFTR的運輸如上所述，將穩定表達AF508CFTR的Fisher大鼠甲狀腺(FRT)細胞和黃色螢光 蛋白(YFP)的滷化物敏感的變種加入微量滴定板中，並使之在37°C和5%的C02中生長24 小時。以新鮮的培養基替換培養基，並將細胞在27°C在5% C02中再孵育24小時，以提高 細胞表面的變異的CFTR的水平。以化合物的DMS0溶液預稀釋含有福斯高林的磷酸鹽緩衝鹽水溶液(PBS)。除去培 養基，以PBS洗滌單層細胞，再應用稀釋於含有福斯高林的PBS的化合物，如此測定CFTR的 活性。在37°C孵育30分鐘後，將板置於裝有試劑注射器的螢光分析儀中。在測量起始螢光 值後，注射含碘的緩衝液，螢光值降低，激發波長和發射波長分別為485nm和530nm。增強劑活性按照如下計算。標準化的終點螢光通過如下計算注射碘化物後的終 點螢光/讀取的初始螢光X 100。增強劑的EC5(i值按照與修復劑EC5(i值相同的方法計算。 根據上述用於修復活性的相同的符號方案，表IV顯示了各種化合物的增強活性。
實施例2D某㈣化合物H有增強AF508 CFTR的活件和修復AF508 CFTR運輸缺陷的活十牛如上所述，將穩定表達Δ F508 CFTR的Fisher大鼠甲狀腺(FRT)細胞和黃色螢光 蛋白(YFP)的滷化物敏感的變種加入微量滴定板中，並使之在37°C和5%的CO2中生長24 小時。以化合物的DMSO溶液預稀釋細胞培養基，從細胞中除去培養基，應用含有化合物的 新鮮培養基。將細胞在37°C和5%的CO2中再次孵育24小時。加入少量的福斯高林的DMSO原液，再充分混合後，測定CFTR的活性。在37°C孵 育30分鐘後，將板置於裝有試劑注射器的螢光分析儀中。在測量起始螢光值後，注射含碘 的緩衝液，螢光值降低，激發波長和發射波長分別為485nm和530nm。修復劑和增強劑雙重活性按照如下計算。標準化的終點螢光通過如下計算注射 碘化物後的終點螢光/讀取的初始螢光X 100。陰性對照DMSO的活性被指定為0%。雙重 活性EC5tl值通過與修復劑EC5tl值相同的方法計算。以下是一系列通過了測試的化合物(編號與表I對應)。一些化合物在最高測試 濃度下表現出較低的反應。2
5
16
24
25
27
29
31
33
34
67
86
95
97
118
129
165
202
240
242
246265
266
270
271 276
289
290 300 311 315
332
333
336
337
348
349
350
351 355 366 401
實施例3
從α-突觸核蛋白誘導的細胞毒性拯救細胞存活率
以0. 1 μ g/mL的四環素處理TS217細胞3 6天，從而誘導可以是細胞毒性的 α-突觸核蛋白的表達。為確定對α-突觸核蛋白誘導的細胞毒性的抑制，將TS217細胞置 於96孔組織培養板中，在化合物90 (見表I的結構)(0. 08 μ Μ，0. 15 μ Μ，和0. 3 μ Μ)或對照 DMSO存在時，或福斯高林(0·3μΜ，1μΜ，3μ]\υΠ10μΜ)或對照DMSO存在時，以0. 1 μ g/mL 四環素處理5天。在5天的處理後，溶解細胞並測試作為細胞存活率函數的細胞內ATP濃 度。細胞的相對存活率通過使用VIALIGHT Plus Bioassay試劑盒(Cambrex，Rockland, ME)測量細胞裂解液中的細胞ATP水平來評估。細胞相對存活率按照誘導的細胞與對照 細胞(沒有以四環素處理的細胞)的比值來計算，其作為α-突觸核蛋白誘導的細胞毒性 的一個指標。在不存在任何其他毒性誘導試劑時，細胞相對存活率在3 6天內降低超過 50%，表明在這些細胞中僅表達的α-突觸核蛋白就能導致細胞死亡。相對而言，以3μΜ 濃度的化合物90處理的細胞與不含有該化合物的對照孔相比，α -突觸核蛋白誘導的細胞 毒性降低了 45% (P <0.02)。因此，化合物90從α-突觸核蛋白誘導的細胞毒性中拯救 了細胞存活率。
實施例4α-突觸核蛋白(aS)篩選酵母株(YeastStrains)Parental ff303 :MAT a/α ade2-l/ade2_l his3_ll，15/his3_ll，15 leu2-3,112/ leu2-3,112trpl-l/trpl-1 ura3-l/ura3-l canl-100/canl-100表型生長需要腺嘌呤、組氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶。刀豆氨酸抗性。Fx-109 :MAT a/α ade2-l/ade2_l his3_ll，15/his3_ll，15 leu2_3，112/leu2_3， 112trpl-l/trpl-1 GALp-aS-GFP::TRPl/GALp-aS-GFP::TRPl ura3-l/ura3-lGALp-aS-GFP::URA3/GALp_aS_GFP::URA3 canl-100/canl-100pdrl::KanMX/ pdrl::KanMX erg6::KanMX/erg6::KanMX表型由於表達aS，不能在半乳糖上生長。生長需要組氨酸、亮氨酸和腺嘌呤。刀 豆氨酸和卡那黴素抗性。對藥物高度敏感。培養基和試劑根據待檢測菌株的基因型，選擇合適的合成培養基補充物。包含完整構建 體(construct)(例如aS)的菌株可以在保持構建體選擇性的培養基中生長(見下)。 CSM(Qbiogene)是市售的用於釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)生長的胺基酸混合 物。可按需要獲得缺少一種或多種胺基酸的CSM。對於aS和對照株，可使用缺乏色氨酸和 尿嘧啶(-Trp-Ura)的培養基(Qbiogene, Inc.，Carlsbad, CA 有售)。為配製液體合成培養基，混合在表B、C和D中列出的成分。在這些成分溶解後，過 濾滅菌(Millipore Stericup Cat#SCGPUllRE)，放入滅菌瓶中。表B.合成完全培養基
IL表C.碳源 表D. CSM 使用光密度384-孔篩選方法第1 天用Fx-109菌株接種合適體積的SRaffinose-Trp-Ura培養基。在30°C振蕩孵育過夜，直至細胞達到對數或對數中期(0D_0. 5-1. 0 ；0. 1 0D600 對應於 1. 75X10E6個細胞)。第2天在室溫將細胞離心沉降(spin down)，去除培養基，並在等體積 SGalactose-Trp-Ura培養基中再分散。測定0D_並稀釋細胞至0. 001。自動轉移30 μ 1的 細胞懸液(MicroFill, Biotek)至 384-孔板(NUNC 242757)的每孔中。向每孔中加入IOOnl藥物的DMSO(Cybio)溶液(最終濃度17μ g/ml的藥物和 0. 333% 的 DMS0)。對於陽性對照，加入葡萄糖至終濃度的0. 和1%。在30°C，將板在潮溼室不振蕩孵育24和/或48小時。第3天(24小時後)和/或第4天(48小時後)讀數OD65tl(Envision，Perkin Elmer)並肉眼檢查用於酵母培養物生長的孔。實施例57口1廣突變活性化合物可穩定AF508 CTFR對這些化合物可測試其穩定Δ F508 CTFR的能力。CFBE細胞，通過用SV40轉化囊 性纖維化氣管支氣管細胞(AF508 CTFR純合子)產生的細胞系(Bruscia等人(2002) Gene Ther. 9(11) :683_685)，可以用10 μ M的選定化合物、或10 μ M的VRT-325在37°C培養16 小時(VRT-325 在例如 Van Goor 等人(2006)Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290 L1117-L1130中描述)。還可用二甲基亞碸(DMSO)溶劑培養細胞群落，作為對照。在孵育後，裂解細胞，在Laemmli緩衝液中溶解，並加至SDS-PAGE。通過使用對 CFTR特異性抗體進行蛋白質印跡，可視化CFTR蛋白。與化合物25(見表I結構)一起培養 的CFBE細胞增加了細胞AF508 CFTR蛋白的量。該化合物也增加了糖基化形式的AF508 CFTR的量，說明這種蛋白質通過高爾基體的運輸的增加。化合物25在穩定Δ F508 CFTR的 作用相當於或更好於已知的CFTR穩定劑VRT-325。
不同濃度的化合物25對ΔF508 CFTR的作用在劑量響應實驗中進行測試。在存 在0、1. 25,2. 5、5或10 μ M的化合物25時，使CFBE細胞在37°C生長16小時。孵育後，從處 理的細胞製備細胞裂解物，將細胞裂解物溶於Laemmli緩衝液中，再加至SDS-PAGE。通過蛋 白質印跡可視化糖基化和未糖基化的AF508 CFTR蛋白的相對量(圖10A)，並通過掃描和 光密度測定定量帶強度(圖10B)。與不存在化合物25時蛋白質的量相比，對於所測試的濃 度(1. 25 10 μ M)，其表現出糖基化的(帶B)和未糖基化的(帶C) AF508CFTR蛋白質的 增多。也測試了化合物5(表I)。在0、l、2.5、5或10μM的化合物5存在下，CFBE細胞在 37°C生長16小時。孵育後，由處理的細胞製備細胞裂解物，將細胞裂解物溶於Laemmli緩 衝液中，並加至SDS-PAGE。通過蛋白質印跡可視化糖基化的和未糖基化的AF508 CFTR蛋 白的相對量(圖11A)，並通過掃描和光密度測定定量帶強度(圖11B)。與不存在化合物5 時蛋白質的量相比，對於所測試的濃度(1 10 μ M)，其表現出糖基化的(帶B)和未糖基化 的(帶C) AF508 CFTR蛋白質的增多。這些數據表明在yptlts突變拯救篩選實驗中鑑定的例如化合物25可穩定Δ F508 CFTR蛋白，並因此可用於治療囊性纖維化。實施例6化合物可恢復Sarlts突變株的生長Sarlts突變酵母菌株(ATCC，Manassas，VA)攜帶SARl基因的溫度敏感突變等位基 因，可允許菌株在25°C生長，但在35°C或更高溫度下生長停止。在35°C的突變Sarlts蛋白 的失活可阻止在ER的轉運小泡的形成，導致ER至高爾基體運輸的阻斷(Saito等人(1998) J. Biochem. (Tokyo) 124(4) :816_823)。為了鑑別拯救Sarlts突變表型的化合物，突變菌株可首先在25°C在富集的培養基 中生長過夜。菌株可稀釋至含有2%葡萄糖的SC培養基中至OD6tltl為0. 004，並與在含有2% 葡萄糖的SC培養基中多種稀釋濃度的待測化合物(0. 05至50 μ M)混合。細胞可在25°C或 35°C孵育72小時。在檢測化合物存在下與無檢測化合物相比，培養的細胞的0D_(酵母細 胞濃度)的增加時，可認為Sarlts突變表型得到拯救。可以使用可拯救Sarlts突變表型的對照化合物，例如放線菌酮(cycloheximide) 和均黴素。增加0D_濃度的化合物是活性化合物。實施例7化合物可恢復sec23ts突變株的生長sec23-2ts突變酵母菌株攜帶SEC23基因的溫度敏感突變等位基因，可允許菌株 在25°C正常生長，但在30°C或更高生長停止。在限定溫度，Sec23溫度敏感的突變蛋白的 失活可阻止在ER的轉運小泡的形成，導致ER至高爾基的運輸阻斷(見，例如Hicke等人 (1989) EMBO J. 8 (6) 1677-1684 和 Castillo-Flores 等人(2005) J. Biol. Chem. 280(40) 34033-34041)。為了鑑別拯救sec23ts突變表型的化合物，突變菌株可首先在25°C在富集的培養 基中生長過夜。菌株可稀釋至含有2%葡萄糖的SC培養基中至0D_為0. 004，並與在含有 2%葡萄糖的SC培養基中多種稀釋濃度的待測化合物(0. 05至50 μ Μ)混合。細胞可在25°C 或30°C孵育24小時。在檢測化合物存在下與無檢測化合物相比，培養的細胞的0D_的增 加時，可認為sar23ts突變表型得到拯救。OD6tltl濃度增加的化合物是活性化合物。
合成實施例本文說明的化合物使用上述方案和方法製備，並通過以下進一步說明。實施例83-(4-氯-苯基)-1_環丙基甲基-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_基胺(化合物29) 將市售的5-氨基-IH-吡唑-4-腈(16. 22g，0. 15mol)和甲醯胺(84. 6ml)的混合 物在180°C在氮氣氛圍中加熱4小時。將該溶液冷卻至室溫並分離結晶，以水洗滌並乾燥而 提供IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶-4-基胺產物(18. 6g，0. 13mol)。步驟B: 將IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶_4_基胺(11. 75g，0. 09mol)(步驟Α)和N-碘代琥珀醯 亞胺(25. 45g,0. llmol)在二甲基甲醯胺(300ml)中的混合物在50°C加熱24小時。加入第 二批N-碘代琥珀醯亞胺(3. 92g，0. 02mol)並另外攪拌24小時。在室溫下靜置，有沉澱物形 成，通過過濾分離該沉澱物並以二甲基甲醯胺和乙醇洗滌，從而提供10. 05克3-碘-IH-吡 唑並[3，4-d]嘧啶-4-基胺。將濾液真空濃縮至約一半的初始體積，再加入500ml水。過濾 分離沉澱產物並以乙醇洗滌從而得到第二批產物(10.538，共得到20.588，0.08!1101) ；LC/ MS, API-ES, Pos, (M+H)+，262. 1。步驟C 將3-碘-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶_4_基胺(1. Og, 3. 83mmol)(步驟B)、環丙基_甲 醇(0. 83g,11.51mmol)和三苯基膦(2. Olg, 7. 66mmol)溶於無水四氫呋喃(50ml)中並在 0°C進行攪拌。緩慢加入偶氮二甲酸二乙酯(1.33g，7.63mm0l)並在0°C攪拌15分鐘。將該 溶液緩慢溫熱至室溫並攪拌1小時。在真空中蒸除溶劑並將產物吸附在矽膠上。在矽膠上步驟A
進行快速柱色譜分離(洗脫液，己烷乙酸乙酯，50 50 20 80)，在通過與乙腈研磨 提供1-環丙基甲基-3-碘-IH-吡唑並[3，4-d]嘧啶-4-基胺(0. 77g，2. 44mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (Μ+Η).，316· 1。步驟D 在1，2-二甲氧基乙烷(IOml)和水(5ml)中混合1_環丙基甲基_3_碘-IH-吡唑 並[3,4-d]嘧啶-4-基胺(0. 12g，0. 38mmol)(步驟 C)、4_ 氯苯基硼酸(0. 65g，0. 42mmol)、 四(三苯基膦)鈀(0. 03g，0. 02mmol)和碳酸鈉(0. 09g，0. 85mmol)，並將該將溶液在氬氣下 回流6小時。加入水並以乙酸乙酯(2X25ml)萃取產物。蒸除溶劑後，在通過在矽膠上進 行快速柱色譜分離(洗脫液，己烷乙酸乙酯，50 50 10 90)，從而提供標題化合物 (0. 04g,0. 13mmol) ；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)+，300. 1。實施例91-叔丁基-3-(4-氟-苯基)-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶_4_基胺(化合物9) 步驟A 在0°C，向攪拌的丙二腈(2. 08g，31. 5mmol)在50ml無水四氫呋喃中的溶液中緩 慢地分批加入氫化鈉(60%，2. 52g,63mmol)，並將溶液攪拌10分鐘。經加料漏鬥緩慢加 入4-氟-苯甲醯氯(5.0g，31.5mmOl)的四氫呋喃溶液(25ml)，並將該溶液在室溫下攪拌 1小時。加入稀鹽酸(lmol/L，100ml)，並以乙酸乙酯萃取產物。有機層以水、鹽水洗滌，並 蒸發而提供殘餘物，該殘餘物以己烷研磨而提供2- (4-氟-苯甲醯基)-丙二腈(4. 98g， 26. 5mmol) ；LC/MS, API-ES, Neg, (Μ-ΗΓ，187.0。步驟B
OCH3 將2-(4_氟-苯甲醯基)_丙二腈(4.98g，26.47mmol)(步驟Α)溶於無水乙 腈(IOOml)和甲醇(IOml)的混合液中，並加入三甲基矽烷基重氮甲烷(2M的乙醚溶液， 19. 9ml, 39. 8mmol)。在0 °C在氮氣氛圍中攪拌該溶液，並緩慢加入N，N- 二異丙基乙胺 (6.84g，52.9mmol)。將該溶液在室溫下攪拌18小時，並在真空中蒸除溶劑。將殘餘物吸附在矽膠上並以色譜法純化(洗脫液，己烷乙酸乙酯，80 20 70 30)從而提供油狀 的 2-[(4-氟-苯基)-甲氧基-亞甲基]-丙二腈(2. 83g,13. 9mmol) ;LC/MS，API_ES，Pos， (M+H)203. 0。步驟C 將2-[(4_氟-苯基)_甲氧基-亞甲基]-丙二腈(2.80g，13.85mmol)(步驟B) 溶於無水乙醇(75ml)中，加入叔丁基胼鹽酸鹽(1. 73g，13. 88mmol)，再加入三乙胺(1. 54g， 15.27mmol)。將溶液回流2小時後蒸除溶劑。將產物在矽膠上進行快速柱色譜純化(洗 脫液，己烷乙酸乙酯，80 20 30 70)從而提供5-氨基-1-叔丁基-3-(4-氟-苯 基)-IH-吡唑-4-腈(3. 02g, 11. 7mmol) ；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)+，259. 1。步驟D:混合5-氨基-1-叔丁基-3- (4-氟-苯基)-IH-吡唑 _4_ 腈(0. 82g，3. 16mmol)與 甲醯胺(5ml)，並將該混合物在氮氣氛圍中在180°C加熱3小時。經過冷卻後，通過過濾分 離結晶狀的產物，以水洗滌該產物並乾燥從而提供標題化合物(0.73g，2.56mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)286. 1。實施例103-苯並[b]噻吩-2-基-1-叔丁基-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_基胺(化合物 16)步驟A 攪拌叔丁基胼鹽酸鹽(4. 67g，53mmol)和三乙胺(5. 35g，53mmol)在無水乙醇 (250ml)中的混合物，緩慢地分批加入乙氧基亞甲基丙二腈(6.47g，53mmol)。將該混合物
1在回流下加熱3小時。在真空中除去溶劑，從乙酸乙酯-己烷結晶產物，再從乙醚結晶產 物，從而提供淺褐色結晶的5-氨基-1-叔丁基-IH-吡唑-4-腈(5. 6g，34. lmmol) ；LC/MS, API-ES, Neg, (Μ-ΗΓ，163. 0。步驟B 將5-氨基-1-叔丁基-IH-吡唑-4-腈(5. 5g，33. 5mmol)(步驟Α)和甲醯胺(68ml) 的混合物在氮氣氛圍中在185°C加熱3小時。將該混合物劑加入水中，並以乙酸乙酯萃取。 將有機層以飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，再以水和鹽水洗滌。乾燥有機層(無水硫酸鈉)，在真 空中除去溶劑而提供殘餘物，該殘餘物以小量的乙醚結晶而提供1-叔丁基-IH-吡唑並[3， 4-d]嘧啶-4-基胺(化合物 12 ；3. 91g，20. 4mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)+，192. 1。步驟C 將1-叔丁基-IH-吡唑並[3，4-d]嘧啶_4_基胺(1. 6g，8. 37mmol)(步驟B)分散 在水中(30ml)，加入溴(2. 68g，16. 7mmol)。將該混合物在室溫下攪拌1小時，再在100°C攪 拌1小時。在冷卻後，通過過濾分離沉澱的產物。殘餘物在50ml的5%的亞硫酸氫鈉水溶 液中攪拌0. 5小時，並以IOml飽和碳酸氫鈉溶液處理。通過過濾分離沉澱，以水洗滌沉澱 並乾燥從而得到3-溴-1-叔丁基-IH-吡唑並[3，4-d]嘧啶-4-基胺(化合物107 ；1. 46g， 5. 40mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)+，270. 0 和 272. 0。步驟D 在1，2-二甲氧基乙烷(20ml)和(IOml)水中混合3_溴叔丁基-IH-吡唑 並[3，4-d]嘧啶-4-基胺(351mg，1. 3mmol)(步驟C)、苯並[b]噻吩-2-基硼酸(255mg， 1.43mmol)、四(三苯基膦)鈀(90mg，0. 07mmol)和碳酸鈉(330mg，3. 1 lmmol)，並將該溶液 在氬氣中回流6小時。加入水並以乙酸乙酯萃取產物(2X 25ml)。蒸除溶劑，再通過在矽膠 上進行快速色譜分離(洗脫液，己烷乙酸乙酯，80 20 65 35)而得到灰白色粉末狀 標題化合物(136mg,0. 42mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)+，324. 1。實施例111-乙基-3-對甲苯基-IH-吲哚-4-基胺(化合物43)
NH2 Br
143
步驟A 在0°C，向攪拌的4-硝基吲哚(2. 5g，15. 4mmol)的50ml丙酮溶液中加入4. 32克 (76. 9mmol)粉末狀的氫氧化鉀，並將溶液攪拌5分鐘。加入碘乙烷(4. Sg, 30. Smmol)，並將 溶液在室溫下劇烈攪拌15分鐘。加入甲苯(300ml)，並通過過濾除去不溶物。將溶液以5% 的檸檬酸水溶液洗滌，再以水洗滌，乾燥(無水硫酸鈉)，在真空中除去溶劑。以己烷-乙酸 乙酯(7 3)研磨殘餘物，從而得到1-乙基-4-硝基-IH-吲哚(2. 6g，13. 6mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos(M+H)+, 191. 1。步驟B 將1-乙基-4-硝基-IH-吲哚(2. 93g，15. 4mmol)(步驟Α)的無水四氫呋喃溶液 (IOOml)在_78°C進行攪拌。緩慢加入N-溴代琥珀醯亞胺(3. 56g，20. Ommol)，並將溶液在 此溫度下攪拌2小時。加入矽膠(8. Og)，且將溶液在真空中蒸發得到漿液，通過在矽膠上進 行快速色譜分離(洗脫液，己烷乙酸乙酯，90 10至80 20)。分離得到淡黃色固體狀 3-溴-1-乙基-4-硝基-IH-吲哚(2. 48g，9. 22mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)269. 0 和 271. 0。步驟C 在1，2-二甲氧基乙烷(20ml)和水(IOml)中混合3_溴乙基_4_硝基-IH-吲哚(349. 8mg, 1. 3mmol)(步驟B)、4_甲基苯基硼酸(194. 4mg, 1. 43mmol)、四(三苯基膦)鈀 (90. Img, 0. 08mmol)和碳酸鈉(330. 7mg，3. 12mmol)，並將溶液在氬氣下回流6小時。加入 水，並以乙酸乙酯(3X25ml)萃取產物。蒸除溶劑，然後在矽膠上進行快速色譜分離(洗脫 液，己烷乙酸乙酯，90 10 80 20)得到1-乙基-4-硝基-3-對甲苯基-IH-吲哚 (220mg,0. 79mmol) ；LC/MS，API—ES，Pos，(M+H)+，281. 1。步驟D 將1-乙基-4-硝基-3-對甲苯基-IH-吲哚(220mg，0. 78mmol)(步驟C)溶於甲 醇和乙酸乙酯(3 l，50ml)的混合物中，並加入10%Pd/C(22mg)。緩慢鼓入氫氣通過溶 液2小時。通過過濾除去催化劑，並蒸發溶劑。產物通過矽膠快速色譜法(洗脫液，己烷 乙酸乙酯，90 10 80 20)純化得到標題化合物(65mg，0. 26mmol)，為無色油狀物；LC/ MS, API-ES, Pos, (M+H)+，251. 2。實施例121-乙基-3-對甲苯基-IH-吲唑-4-基胺(化合物44)步驟A 在0°C攪拌2-甲基-3-硝基-苯基胺(5. 5g，36. 15mmol)在冰醋酸(250ml)中的 溶液。將亞硝酸鈉(2.5g，36. 15mmol)溶於水(6ml)中，並一次性加入該攪拌的溶液中，再 繼續攪拌15分鐘。通過過濾濾除並丟棄黃色的沉澱物，並將溶液在室溫下攪拌4小時。真 空中除去溶劑，並加入水(20ml)。通過過濾分離沉澱並乾燥得到粗產物。矽膠色譜法純化 (洗脫液，己烷:乙酸乙酯，70 30 50 50)得到4-硝基-IH-吲唑(4.0g，24.52mmol)。步驟B 將氫化鈉(60%，0.40g，10mmol)分散在無水二甲基甲醯胺(8ml)中，並在_10°C攪 拌。緩慢加入溶於二甲基甲醯胺(8ml)的4-硝基-IH-吲唑(1.0g，6. 13mmol)(步驟A)，並溶液在此溫度下攪拌20分鐘。滴加碘乙烷(1. 05g, 6. 73mmol)，並將溶液在環境溫度下攪拌 2小時。然後將溶液傾倒至冰-水上，且用二氯甲烷萃取產物。TLC和LC-MS分析表明存在 兩種異構體產物，通過矽膠柱色譜法(洗脫液，己烷乙酸乙酯，80 20 60 40)分離 得到 1-乙基-4-硝基-IH-吲唑(0. 43g，2. 24mmol)，LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)+，192. 1，禾口 異構體 2-乙基-4-硝基-2H-吲唑(0. 48g，2. 51mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)192. 1。
步驟 C 將1-乙基-4-硝基-IH-吲唑(0. 43g，2. 26mmol)(步驟B)溶於冰醋酸(15ml) 中，並加入溴(0.47g，2.94mmol)。溶液於80°C攪拌30分鐘，並加入第二批溴(0. Ilg, 0.68mmol)，且將溶液再攪拌30分鐘。將溶液加入到飽和碳酸氫鈉水溶液中，且用二氯 甲烷萃取產物。有機層用水洗滌，並乾燥(無水硫酸鎂)，並在真空中蒸發溶劑得到粗產 物。3-溴-1-乙基-4-硝基-IH-吲唑通過矽膠快速色譜法(洗脫液，己烷乙酸乙酯， 80 20 70 30)純化(0. 59g，2. 18mmol) ；LC/MS，API_ES，Pos，(M+H)+，270. 0 和 272. 0。步驟D 在1，2-二甲氧基乙烷(20ml)和水(IOml)中混合3_溴-1-乙基-4-硝基-IH-吲 唑(0.59g，2. 18mmol)(步驟C)、4-甲基苯基硼酸(0. 36g，2. 65mmol)、四(三苯基膦)鈀 (0. 15g，0. 13mmol)和碳酸鈉(0. 55g，5. 19mmol)，並將溶液在氬氣下回流8小時。加入水，並 以乙酸乙酯(3X25ml)萃取產物。蒸除溶劑，然後在矽膠上進行快速色譜分離(洗脫液，己 烷乙酸乙酯，90 10 80 20)得到1-乙基-4-硝基-3-對甲苯基-IH-吲唑(0.50g， 1. 77mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)282. I0步驟E 將1-乙基-4-硝基-3-對甲苯基-IH-吲唑(0. 50g, 1. 77mmol)(步驟D)溶於甲 醇(80ml)和乙酸乙酯(20ml)的混合物中，並加入10% Pd/C(50mg)。緩慢鼓入氫氣通過溶 液，同時在環境溫度下攪拌2小時。通過經硅藻土的過濾除去催化劑，並在真空中蒸發濾 液。通過矽膠快速色譜法(洗脫液，己烷乙酸乙酯，90 10 85 15)純化得到標題化 合物(0. 33g, 1. 31mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)252. 1。實施例131-叔丁基-3-(4-氟-苯基)-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4，6_ 二胺(化合物116)
將5-氨基-1-叔丁基-3- (4-氟-苯基)-IH-吡唑 ~4~ 腈(1. Og, 3. 87mmol)，碳酸 胍(1.22g，6. 77mmol)和三乙胺(5ml)的混合物在密封管中於205°C加熱2. 5小時。加入 水，並以乙酸乙酯(4X30ml)萃取產物。有機層用水和鹽水洗滌，乾燥(無水硫酸鈉)並蒸 發。將粗產物級分(1/4)以反相製備型HPLC分離，並合併所需的峰(水-乙腈梯度，0.05% 三氟乙酸，70 30 10 90，20分鐘，線性梯度；流速，15ml/分鐘；色譜柱，Phenomenex Luna 5 μ C18，IOOx 21. 2mm ；UV 254和218nm)。蒸發溶劑然後從乙醚中結晶得到標題化合 物(55mg，0. 18mmol) ；LC/MS，API-ES，Pos，(Μ+Η)+，301· 1。實施例14[1-叔丁基-3-(4-氟-苯基)-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_基]-甲基-胺(化 合物38)和[1-叔丁基-3- (4-氟-苯基)-IH-吡唑並[3，4-d]嘧啶_4_基]-二甲基-胺 (化合物39)將氫化鈉(60%，22mg，0. 55mmol)分散在無水二甲基甲醯胺(5ml)中，並在0°C進 行攪拌。加入1-叔丁基-3-(4-氟-苯基)-IH-吡唑並[3，4-d]嘧啶-4-基胺(142. 6mg, 0. 5mmol)溶於Iml 二甲基甲醯胺的溶液，並攪拌溶液10分鐘。加入碘甲烷(354. 9mg， 2. 5mmol)，並將溶液在環境溫度下攪拌過夜。加入水，且用乙酸乙酯萃取產物。有機層用水 和鹽水洗滌，乾燥(無水硫酸鈉)並蒸發得到產物混合物。進行矽膠快速色譜法(洗脫液， 己烷乙酸乙酯，90 10 70 30)得到標題化合物[1-叔丁基-3-(4_氟-苯基)-1Η-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_基]-二甲基-胺 (66. 5mg，0. 2Immo 1)，LC/MS，API-ES，Pos, (Μ+Η)+，314· 1 及[1-叔丁基-3- (4-氟-苯基)-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_基]-甲基-胺 (41. 5mg，0. 14mmol)，LC/MS，API-ES，Pos, (Μ+Η)+，300· 1。實施例15N-[1-叔丁基-3-(4-氟-苯基)-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶_4_基]-乙醯胺(化合 物118)和N-乙醯基-N- [1-叔丁基-3- (4-氟-苯基)-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶-4-基]-乙
醯胺(化合物117)
將1-叔丁基-3-(4_ 氟-苯基)-1Η-吡唑並[3，4_d]嘧啶 _4_ 基胺(142. 6mg， 0. 5mmol)溶於2ml無水吡啶中，並在0°C攪拌該溶液。滴加乙醯氯(196. 3mg，2. 5mmol)，且 溶液在環境溫度下攪拌過夜。加入水，且用乙酸乙酯萃取產物。有機層用水和鹽水洗滌，幹 燥(無水硫酸鈉)並蒸發得到產物混合物。進行矽膠快速色譜法(洗脫液，己烷乙酸乙 酯，90 10 70 30)得到標題化合物N-乙醯基-N-[1-叔丁基-3-(4-氟-苯基)-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_基]-乙 醯胺(45. Omg, 0. 12mmol)，LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)370. 1及N-[l_叔丁基-3-(4_氟-苯基)-1Η-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_基]-乙醯胺 (12. 7mg，0. 04mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)+328. 1。實施例16N-[1-叔丁基-3-(4-氟-苯基)-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_基]-苯甲醯胺(化 合物40)將1-叔丁基-3_(4-氟-苯基)-1Η-吡唑並[3，4_d]嘧啶 _4_ 基胺(142. 6mg, 0. 5mmol)溶於2ml無水吡啶中，並在0°C攪拌該溶液。滴加苯甲醯氯(351. 4mg, 2. 5mmol)， 且溶液在環境溫度下攪拌過夜。加入水，且用乙酸乙酯萃取產物。有機層用水和鹽水洗滌， 乾燥(無水硫酸鈉)並蒸發得到產物混合物。殘餘物在乙腈中攪拌，並通過過濾分離沉澱。 通過矽膠快速色譜法(洗脫液，己烷乙酸乙酯，90 10 70 30)純化得到標題化合物 (75. Omg, 0. 19mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)390. I0實施例171-叔丁基-3- (4-氯-苯基)-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_基胺鹽酸鹽(化合物 407) 將1-叔丁基-3-(4_氯-苯基)-1Η-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_基胺(IOOmg, 0. 33mmol)溶於3ml的無水氯仿中，並加入HCl乙醚溶液(1M溶液，0. 4ml, 0. 4mmol)。在環 境溫度下靜置溶液1小時。蒸發部分溶劑後，生成沉澱，通過傾析分離，且殘餘物用少量乙 醚和二氧雜環己烷洗滌得到標題化合物(80mg，0. 24mmol)，LC/MS，API-ES, Pos, (M+H)+，遊 離鹼的母離子峰，302. 1。實施例184-(4-氨基-1-叔丁基-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶_3_基)-苯甲酸乙酯(化合物 123)在1，2_ 二甲氧基乙烷(20ml)和水(IOml)中混合3_溴叔丁基-IH-吡唑 並[3,4-d]嘧啶-4-基胺(351mg，1.3mmol)、4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧雜硼雜環 戊-2-基)苯甲酸乙酯(395mg，L43mmol)、四(三苯基膦)鈀(90mg,0. 07mmol)和碳酸鈉 (330mg,3. llmmol)，並將溶液在氬氣下回流6小時。加入水，並以乙酸乙酯(3X25ml)萃取 產物。蒸發溶劑，然後進行矽膠快速色譜法(洗脫液，己烷乙酸乙酯，80 20 60 40) 得到標題化合物，其從甲醇(80mg,0. 24mmol)中結晶；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)340. 1。實施例194-氨基-1-叔丁基-3-對甲苯基-IH-吡唑並[3，4_b]吡啶_5_甲酸(化合物45) 步驟A 將亞硫醯氯(22. 3ml，0. 3mol)加入到4-甲基-苯甲酸(27. lg，0. 2mol)的乙醇 (200ml)溶液中，並攪拌溶液過夜。蒸除溶劑得到4-甲基-苯甲酸乙酯(30g，0. 18mol)，為 粘稠狀液體。步驟B 向攪拌的乙腈(48ml，0.92mol)和甲苯(IOOml)的溶液中，分份加入氫化鈉(22g， 0.92mol)。在50°C攪拌2小時後，加入4-甲基-苯甲酸乙酯(30g，0. 18mol)(步驟A)的 甲苯(IOOml)溶液，並回流4小時。然後在真空下蒸發溶劑。殘餘物用冰(200ml)淬滅，並 用乙酸乙酯萃取。有機層用鹽水洗滌，在無水硫酸鈉上乾燥，濃縮，並通過柱色譜純化得到 3_氧代-3-對甲苯基-丙腈(22g，0. 14mol)。步驟C 將3-氧代-3-對甲苯基-丙腈(22g，0. 14mol)(步驟B)溶於異丙醇(500ml)中， 加入三乙胺(40ml，0. 28mol)，且攪拌混合物5分鐘，然後加入叔丁基胼鹽酸鹽，混合物在氮 氣下回流5小時。將反應冷卻至室溫，並真空除去溶劑。將殘餘物溶於乙酸乙酯中，用水、 鹽水洗滌，並在無水硫酸鈉上乾燥。過濾有機層，真空下濃縮，負載到矽膠柱上，並純化得到 2-叔丁基-5-對甲苯基-2H-吡唑-3-基胺(24g，0. llmol)。步驟D 將2-叔丁基-5-對甲苯基-2H-吡唑-3-基胺(10g，0. 044mol)(步驟C)與(乙氧 基亞甲基)丙二酸二乙酯(9. 5g，0. 044mol) 一起在120°C攪拌4小時。將混合物溶於二氯甲 烷中，吸附在矽膠上，並通過柱色譜純化得到2-[ (2-叔丁基-5-對甲苯基-2H-吡唑-3-基 氨基)-亞甲基]-丙二酸二乙酯(10g，0.03mol)。步驟Ε: 在190°C，將2-[ (2-叔丁基_5_對甲苯基_2H_吡唑_3_基氨基)_亞甲基]-丙二 酸二乙酯(5g，12.5mmol)(步驟D)在二苯基醚(75ml)中攪拌48小時。將所得溶液冷卻至 室溫，緩慢傾倒至矽膠柱上，並用石油醚洗脫得到1-叔丁基-4-羥基-3-對甲苯基-IH-吡 唑並[3,4-b]吡啶-5-甲酸乙酯(1. Ig, 3. Ilmmol)。步驟F 將1-叔丁基-4-羥基-3-對甲苯基-IH-吡唑並[3，4_b]吡啶_5_甲酸乙酯(1. Ig, 3. Immol)(步驟E)在POCl3中回流4小時。真空下濃縮混合物以除去P0C13。殘餘物用水 稀釋，並用乙酸乙酯萃取。乾燥萃取液(無水硫酸鈉)，過濾並濃縮濾液，然後通過柱色譜 純化得到1-叔丁基-4-氯-3-對甲苯基-IH-吡唑並[3,4-b]吡啶-5-甲酸乙酯(0. 8g， 2. 15mmol)。步驟G 在密封的鋼容器中，在110°C，將1-叔丁基-4-氯-3-對甲苯基-IH-吡唑並[3， 4-b]吡啶-5-甲酸乙酯(0. 8g，2. 2mmol)在25ml用氨飽和的乙醇中攪拌12小時。濃縮 冷卻的反應混合物，並用乙醚研磨殘餘物，並過濾。乾燥濾液(無水硫酸鈉)，過濾並濃縮 濾液，然後通過柱色譜純化得到4-氨基-1-叔丁基-3-對甲苯基-IH-吡唑並[3，4-b]吡 啶-5-甲酸乙酯(化合物45 ；0. 5g，1. 42mmol)。步驟H 將4-氨基-1-叔丁基-3-對甲苯基-IH-吡唑並[3，4_b]吡啶_5_甲酸乙酯 (0. 5g，1. 4mmol)在乙醇(95% )和氫氧化鈉中於50°C攪拌過夜。濃縮混合物，將殘餘物溶 於水(600ml)，過濾並以乙酸酸化。收集形成的沉澱，用水洗滌並在空氣中乾燥得到4-氨基-1-叔丁基-3-對甲苯基-IH-吡唑並[3,4-b]吡啶-5-甲酸(0. 3g，0. 92mmol)，為白色 固體；LC/MS, APCI, Neg, (M-H)323. 3。實施例201-叔丁基-3-對甲苯基-IH-吡唑並[3，4-b]吡啶_4_基胺(化合物69). 將4-氨基-1-叔丁基-3-對甲苯基-IH-吡唑並[3,4-b]吡啶_5_甲酸(0. Ig, 0. 3mmol)在氮氣氛圍中於180°C加熱48小時。所得產物通過柱色譜法純化得到1_叔丁 基-3-對甲苯基-IH-吡唑並[3,4-b]吡啶-4-基胺(20mg，0. 07mmol)，為淡棕色固體；LC/ MS, APCI, Pos, (Μ+Η)+，281· 5。實施例211-叔丁基-3-苯氧基-IH-吡唑並[3，4-d]嘧啶_4_基胺(化合物90) 將3-溴-1-叔丁基-IH-吡唑並[3，4-d]嘧啶~4~基胺(540mg, 2mmol)(實施例 10，步驟C)和苯酚(753mg，8mmol)與幾滴1_戊醇混合，並在120°C加熱5分鐘。加入碳酸 鉀(1. lg,8mmol)和銅粉(51mg，0. 8mmol)，並將混合物在195°C加熱1小時。加入水，且用二 氯甲烷萃取產物。有機層以水洗滌，乾燥(無水硫酸鈉)並蒸發得到殘餘物，該殘餘物以反 相製備性HPLC分離(水-乙腈梯度，0.05%三氟乙酸，70 30 10 90，20分鐘，線性梯 度；流速，15ml/ 分鐘；色譜柱，Phenomenex Luna 5 μ C18, IOOx 21. 2mm ；UV 254 和 218nm)。 合併期望的峰，並在真空中蒸除溶劑。將殘餘物溶於二氯甲烷中，溶液以飽和碳酸氫鈉水 溶液洗滌，再以水洗滌，蒸除溶劑得到標題化合物(50mg，0. 18mmol) ；LC/MS, API-ES，Pos, _)+，284· 2。實施例223-苄基-1-叔丁基-IH-吡唑並[3，4-d]嘧啶~4~基胺(化合物11)步驟A
將丙二腈(8. 95g，135. 4mmol)溶於無水的四氫呋喃(400ml)中，所得溶液在冰水 浴中攪拌。分批加入氫化鈉(60%在礦物油中，10.8g，270mmol)，然後滴加苄氧基乙醯氯 (25g，135.4mmol，在四氫呋喃中，50ml)。將溶液在環境溫度下攪拌2小時。加入IM的鹽酸 (500ml)，且溶液以乙酸乙酯(3X250ml)萃取。有機層以水洗滌，乾燥(無水硫酸鈉)並在 真空中蒸發得到殘餘物，該殘餘物以己烷研磨得到2-(2_苄氧基乙醯基)_丙二腈，為無定 形粉末，其以這種形式直接用於下一步；LC/MS，API-ES，Pos, (M+H)+，215. 2。步驟B 將在二氧雜環己烷(500ml)中的在上一步中得到的2_(2_苄氧基乙醯基)-丙二 腈(135. 4mmol)、碳酸鉀(31.7g，230. 2mmol)和硫酸二甲酯(23. 9g，189. 5mmol)在 85°C攪 拌3小時。將溶液過濾並蒸除溶劑得到殘餘物，該殘餘物經矽膠色譜法分離(洗脫液；己 烷-乙酸乙酯梯度)得到2-(2_苄氧基-1-甲氧基-亞乙基)-丙二腈(12.9g，56.5mm0l)； LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)+，229. 2。步驟C 將在無水乙醇(300ml)中的2_ (2_苄氧基甲氧基-亞乙基)-丙二腈(12. 9g， 56. 5mmol)、叔丁基胼鹽酸鹽(6. 95g，55. 7mmol)和三乙胺(7. 3g，72. Immo 1)加熱回流2小 時。經過濾除去不可溶物質，在真空中除去溶劑得到殘餘物，該殘餘物以快速矽膠色譜法分 離。以己烷-乙酸乙酯的梯度洗脫得到5-氨基-3-苄氧基甲基-1-叔丁基-IH-吡唑-4-腈 (12. Ig, 42. 5mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)285. 3。步驟D
將在甲醯胺(170ml)中的5_氨基_3_苄氧基甲基叔丁基_1Η_吡唑_4_腈 (12. Ig, 42. 5mmol)在185°C加熱2. 5小時。將所得溶液在室溫下靜置過夜，通過過濾分離沉 積的晶體物質。晶體以甲醯胺洗滌，再以水洗滌，在空氣中乾燥而得到3-苄氧基甲基-1-叔 丁基-IH-吡唑並[3，4-d]嘧啶-4-基胺(化合物 81 ；9. 2g，29. 5mmol) ；LC-MS, API-ES, Pos,(Μ+Η).，312· 3。步驟E 將3-苄氧基甲基-1-叔丁基-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_基胺(4. 0g，12. 9mmol) 溶於無水二氯甲烷中(130ml)並在_78°C攪拌。在攪拌時滴加三氯化硼(1M的庚烷溶 液，51. 8ml，51. 8mmol)，並將溶液溫熱至0°C，並在此溫度下攪拌15分鐘。將該溶液冷卻 至-78°C並加入甲醇(71ml)。將溶液溫熱至0°C，並以氫氧化銨中和至pH為7。將溶液過 濾，濾液在真空中蒸發得到殘餘物，該殘餘物從少量乙醚和己烷結晶得到(4-氨基-1-叔丁 基-IH-吡唑並[3，4-d]嘧啶-3-基)-甲醇(化合物 148 ；2. 4g, 10. 8mmol) ；LC-MS，API-ES， Pos，(Μ+Η)+，222· 2。步驟F 將(4-氨基-1-叔丁基-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶_3_基)-甲醇(2.93g，13. 2mmol) 溶於氯仿(150ml)中，並加入二氧化錳(11.5g，132. 3mmol)。將溶液在室溫下攪拌20小時， 並通過一層硅藻土過濾。在真空中蒸發濾液，殘餘物從乙腈中結晶得到4-氨基-1-叔丁 基-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶-3-甲酸(化合物 149 ;2. 3g，10. 4mmol) ；LC-MS,API-ES,Pos, _)+，220· 2。步驟G: 在0°C，向攪拌的4-氨基-1-叔丁基-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶_3_甲醛 (0. 49g，2. 2mmol)的無水四氫呋喃溶液中滴加苯基溴化鎂(1M的四氫呋喃溶液，2. 45ml, 2.45mmol)。將該溶液在0°C攪拌0. 5小時，然後在環境溫度下攪拌1. 5小時。加入飽和的 氯化銨溶液(50ml)，並以二氯甲烷萃取產物。有機層以水洗滌，乾燥(無水硫酸鈉)並蒸 發溶劑得到殘餘物，該殘餘物經快速矽膠色譜法純化(洗脫液，己烷_乙酸乙酯梯度)得到 (4-氨基-1-叔丁基-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶-3-基)-苯基-甲醇(化合物82 ；0. 19g， 0. 64mmol) ；LC-MS, API-ES, Pos, (M+H)+，298. 3。步驟H 將(4-氨基-1-叔丁基-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶_3_基)_苯基-甲醇(20mg,
0. 06mmol)溶於三氟乙酸中(Iml)，並在冰浴中冷卻此溶液。加入三乙基矽烷(23mg， 0. 20mmol)，並將混合物攪拌過夜。蒸除溶劑，殘餘物在真空中乾燥並以己烷研磨，得到標題 化合物，為灰白色固體(15mg，0. 05mmol) ；LC-MS，API-ES，Pos，(M+H)+，282. 3。實施例23 (4-氨基-1-叔丁基-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶_3_基)-苯基-甲酮(化合物83)將(4-氨基-1-叔丁基-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶_3_基)_苯基_甲醇(90mg, 0. 27mmol)(實施例19，步驟G)溶於無水二氯甲烷中(5ml)並在0°C攪拌。加入Dess-Martin 試劑(Dess-Martin periodinane)溶液(0. 3M 的二氯甲烷溶液，1. 85ml, 0. 55mmol)，並將溶 液在此溫度下攪拌1. 5小時。先後以亞硫酸鈉水溶液(1. 3M的溶液，4ml)、飽和碳酸氫鈉溶 液(4ml)淬滅反應，並在0°C攪拌0.5小時。溶液以二氯甲烷萃取，以水洗滌，乾燥(無水 硫酸鈉)，並在真空中除去溶劑得到殘餘物，該殘餘物以快速矽膠色譜法純化(洗脫液，己 烷-乙酸乙酯梯度)得到標題化合物(42mg，0. 14mmol) ；LC-MS, API-ES, Pos, (M+H)296. 3。實施例24 4-氨基-1-叔丁基-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶_3_甲酸(化合物85)將4-氨基-1-叔丁基-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶 _3_ 甲醛(150mg，0. 68mmol)溶 於丙酮(5ml)中，加入高錳酸鉀(216mg，1.36mm0l)的丙酮-水(1 1,2ml)的溶液。溶液 在環境溫度下攪拌過夜。加入乙酸(3ml)，並以二氯甲烷萃取產物。有機層以水洗滌，乾燥 (無水硫酸鈉)並在真空中蒸發得到殘餘物，該殘餘物從乙腈-甲醇中結晶得到標題化合物 (80mg,0. 34mmol) ；LC-MS, API-ES, Pos, (M+H)236. 2, API-ES, Neg, (M-H)233. 90實施例25 4-氨基-1-叔丁基-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶_3_羧酸苄基醯胺(carboxylic acidbenzylamide)(化合物 160)將4-氨基-1-叔丁基-IH-吡唑並[3，4-d]嘧啶_3_甲酸(47mg，0. 2mmol)和苄胺 (24mg，0. 22mmol)溶於無水二甲基甲醯胺(2ml)中。加入二異丙基乙基胺(77mg，0. 6mmol) 和2-(1Η-苯並三唑-1-基)_1，1,3,3-四甲基鑠六氟磷酸鹽(HBTU，83mg，0. 22mmol)，並將溶液在環境溫度下攪拌過夜。將溶液過濾並以反相製備型HPLC分離(水-乙腈梯度， 0.05%甲酸，80 20 10 90，20分鐘，線性梯度；流速，15ml/分鐘；色譜柱，Phenomenex Luna 5μ C18,100x21. 2mm ；UV 254 和 218nm)，得到標題化合物(31mg，0. lmmol，從乙腈結 晶)，LC-MS, API-ES, Pos, (Μ+Η)+，325· 3。實施例26 4-氨基-1-叔丁基-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶_3_腈(化合物159) ·步驟A: 在冰冷卻下，向攪拌的精細研磨的叔丁基胼鹽酸鹽(12.5g，0. Imol)的乙醇 (95%, 100ml)混懸液中，加入NaOH(4. Og,0. Imol)的乙醇(150ml)溶液。加入精細研磨的四 氰基乙烯(12. 8g，0. lmol)，以約IOml乙醇完成轉移。將混合物在環境溫度下攪拌0. 5小時， 從深紅色溶液中過濾出白色沉澱(由產物和NaCl組成)，並以最少量的乙醇(5-10ml)洗 滌。沉澱以乙腈(5X50ml)徹底洗滌並過濾。濾液在真空下濃縮並以乙醚重結晶得到5-氨 基-1-叔丁基-IH-吡唑-3,4- 二腈(8. 63g，45. 6mmol)，為淡粉紅色固體；LC-MS, API-ES, Neg, (Μ-ΗΓ，187. 9。步驟B: 將5-氨基-1-叔丁基-IH-吡唑-3，4_ 二腈(6. 56g，35mmol)在原甲酸三乙酯 (60ml,350mmol)中回流3天，直至反應完成(LCMS)。濃縮混合物並在真空下乾燥。所得黃 色固體[N- (2-叔丁基-4，5- 二氰基-2H-吡唑-3-基)-甲醯胺]無需另外的純化，而用於 下一步驟；LC-MS API-ES, Neg, (M-H)215. 9。步驟C:將N-(2-叔丁基-4，5- 二氰基_2H_吡唑_3_基)-甲醯胺(35mmol，步驟B)溶於 甲醇(150ml)中。向溶液中加入氨溶液(7N的甲醇溶液，6.0ml，42mmol)，並將混合物攪拌2 小時。在真空中濃縮混合物並通過矽膠色譜法分離(洗脫液，二氯甲烷_甲醇，100 0 80 20)，得到標題化合物，為黃色固體。從乙酸乙酯重結晶得到分析樣品，為灰白色固體 (3. 67g, 16. 9mmol) ；LC-MS，API-ES，Pos.，(M+H)+，217. 2。實施例27 4-氨基-1-叔丁基-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶_3_甲醯胺(化合物89) ·將4-氨基-1-叔丁基-IH-吡唑並[3，4-d]嘧啶_3_腈(216mg，Immo 1)與濃縮的 氫氧化銨水溶液(28%，4ml)和過氧化氫(30-35%，Iml)混合。混合物攪拌過夜，過濾，以 水洗滌得到標題化合物(207mg，0. 88mmol)，為灰白色固體；LC-MS，API-ES, Pos.，(M+H)+， 235· 2 ο實施例28 1-叔丁基-3- (3-三氟甲基-苯硫基)-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_基胺(化合 物 244)將3-溴-1-叔 丁 基-IH-吡唑並[3，4-d]嘧啶-4 基胺(0. 50g, 1. 85mmol)、 CuI (0. 0176g，0. 093mmol)、碳酸鉀粉末(0. 511g，3. 70mmol)、乙二醇(0. 21ml, 3. 70mmol)、 2_丙醇(1.86ml)和3-三氟甲基苯硫酚(0. 33g, 1. 85mmol)置於盛有磁力攪拌子的微波反 應管中，脫氣，並在微波反應器中在130°C加熱30分鐘。將反應混合物加入飽和的硫代硫 酸鈉水溶液中，並以二氯甲烷(3X15ml)萃取。有機層用水、鹽水洗滌，並在無水硫酸鈉上 乾燥，過濾，濃縮，通過快速矽膠柱色譜法純化(洗脫液，己烷_乙酸乙酯)，然後通過製備 型RPHPLC純化(水-乙腈梯度，0. 05%甲酸)，而獲得1-叔丁基_3-(3_三氟甲基-苯硫 基)-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶-4-基胺(0. 30g，0. 82mmol) ；LC-MS, API-ES, Pos.，(M+H) 340.1。實施例293-苯磺醯基-1-叔丁基-IH-吡唑並[3，4-d]嘧啶_4_基胺(化合物191)步驟A 向攪拌的1-叔丁基-3-苯硫基-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_基胺(380mg， 1. 27mmol)的氯仿(30ml)溶液中，加入3-氯過氧苯甲酸(70-75 %，1. 56g，6. 35mmol)，將 混合物回流1天，直至起始原料已經消耗(LCMS)。將所得的氧化物的混合物以飽和碳酸氫 鈉水溶液(IOOml)洗滌，水層以二氯甲烷(3X20ml)萃取，萃取液以鹽水(20ml)洗滌，在 硫酸鎂上乾燥，在真空下濃縮，並在矽膠上純化(50g，洗脫液，二氯甲烷-乙腈，100 0 0 100)而得到兩種氧化物3_苯磺醯基-1-叔丁基-IH-吡唑並[3，4-d]嘧啶_4_基胺 (152mg, 0. 46mmol)和3-苯亞磺醯基叔丁基-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶-4-基胺(化合 物 173，217mg，0. 69mmol)，為白色固體，LC/MS, API-ES, Pos, (Μ+Η)+，316· 1。步驟B 將3-苯亞磺醯基-1-叔丁基-IH-吡唑並[3，4-d]嘧啶_4_基胺(370mg， 1. 17mmol)溶於乙腈(20ml)中，加入4-甲基嗎啉N-氧化物(0. 56g，4. 8mmol)和四氧化 鋨溶液(2. 5%的丁醇溶液，0. 13ml,0. Olmmol)，並將混合物在微波反應器中在70°C加熱 90分鐘，直至反應完成(LCMS)。在真空下濃縮混合物，以二氯甲烷稀釋(20ml)，以水進行 分配(100ml)，水層以二氯甲烷(2X15ml)萃取。合併的有機萃取液以鹽水(15ml)洗滌， 在硫酸鎂上乾燥，並在真空下濃縮。殘餘物通過矽膠色譜法純化(洗脫液，二氯甲烷-乙 腈，100 0 0 100)得到3-苯磺醯基-1-叔丁基-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶-4-基胺 (223mg，0. 67mmol)，為灰白色晶體；LC/MS，API-ES，Pos，(Μ+Η)+，332· 1。實施例30
1-叔丁基-3-(異喹啉-1-基氧基)-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_基胺(化合物 370)步驟A 將四氰基乙烯(12. 8g，IOOmmol)與在(50ml)甲醇中的脲(2. 0g，33. 3mmol)在 50°C攪拌0. 5小時。加入乙醚(250ml)並將溶液冷凍至_78°C。在冰冷狀態下通過過濾分離 沉澱，而得到2- 二甲氧基亞甲基-丙二腈(5. 6g，40. 5mmol)，為灰白色固體，LC/MS，API-ES， Pos, (M+H)+，139. 1。處理母液，另外得到 2. Ig 產物(15mmol)。步驟B: 將2-二甲氧基亞甲基-丙二腈(4. 26g，30.9mmol)(步驟A)、三乙胺(4. 07g，40. 2mmol)和叔丁基胼鹽酸鹽(3. 86g，30. 9mmol)在甲醇(100ml)中的混合物在回流下加 熱2小時。過濾溶液，並在真空中蒸除溶劑得到殘餘物，該殘餘物經快速矽膠柱色譜法純化 (洗脫液，己烷乙酸乙酯，90 10 10 90)得到5-氨基-1-叔丁基-3-甲氧基-IH-吡 唑-4-腈(3. 83g, 19. 7mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)+，195. 3。步驟C 將5-氨基-1-叔丁基-3-甲氧基-IH-吡唑_4_腈(3. 8g，19. 6mmol)(步驟B)和 甲醯胺(50ml)的混合物在185°C加熱2小時。將混合物冷卻至環境溫度，並通過過濾分離 沉澱的固體。該固體以甲醯胺洗滌，再以水洗滌，在空氣中乾燥而得到1-叔丁基-3-甲氧 基-IH-吡唑並[3，4-d]嘧啶-4-基胺(化合物 312 ；2. 83g, 12. 8mmol) ；LC/MS，API_ES，Pos， (M+H)222. 3。步驟D 向1-叔丁基-3-甲氧基-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶 ~4~ 基胺(2. 83g，12. 8mmol) (步驟C)和碘化鈉(3.83g，25.6mmol)在乙腈(IOOml)中的混合物中加入三甲基氯矽烷 (2. 78g，25. 6mmol)，並將溶液在氬氣下回流過夜。LC-MS分析顯示約有20%的未反應的起 始原料存在。加入第二批碘化鈉(0. 58g，3. 8mmol)和三甲基氯矽烷(0. 42g，3. 8mmol)，並 將溶液另外回流12小時。過濾溶液，在真空中除去溶劑得到殘餘物。從乙腈和水結晶得到 4-氨基-1-叔丁基-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶-3-醇(化合物 325 ；2. 2g，10. 6mmol) ；LC/ MS, API-ES, Pos, (M+H)208. 30步驟E 將4-氨基-1-叔丁基-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶_3_醇(步驟D)(104mg,0. 5mmol)、 1-氯異喹啉(98mg，0. 6mmol)與碳酸鉀(83mg，0. 6mmo)在無水二甲基亞碸(2ml)中的混 合物在130°C攪拌4小時。加入水(15ml)，並以乙酸乙酯(3X10ml)萃取產物。合併的 有機層用水洗滌，乾燥(無水硫酸鈉)並在真空中蒸發。殘餘物以反相製備型HPLC分離 (水-乙腈梯度，0.05%甲酸，80 20 10 90，20分鐘，線性梯度；流速，15ml/分鐘；色 譜柱，PhenomenexLuna 5μ C18,100X21. 2mm ；UV 254 和 218nm)，得到 1-叔丁基 _3_(異喹 啉-1-基氧基)-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶-4-基胺(23mg,0. 07mmol) ；LC-MS,API-ES,Pos, (M+H)335. 3。實施例31
NH2 OH
159
1-[4-氨基-3-(4-氯-苯基)-吡唑並[3，4-d]嘧啶基]-乙酮(化合物181).向3-(4-氯苯基)-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶 _4_ 胺(IOOmg, 0. 41mmol)的二 甲基甲 醯胺(5ml)的混懸液中，加入吡啶(39mg，0. 49mmol)。滴加在Iml DMF中的乙醯氯(35mg， 0. 45mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌1小時。另外加入1. 2當量的吡啶和1. 1當量的 乙醯氯，並將溶液攪拌1小時。重複此過程一次，並將混合物傾入水中，以乙酸乙酯萃取。 有機層用水洗滌，乾燥(無水硫酸鈉)並蒸發。從丙酮結晶殘餘物得到標題化合物(40mg， 0. 14mmol) ；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)+，288. 0，290. 0。實施例32 4-氨基-3-(4-氯-苯基)-吡唑並[3，4-d]嘧啶甲酸甲酯(化合物186).向3-(4-氯苯基)-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶 _4_ 胺(200mg, 0. 81mmol)的二 甲基甲 醯胺(5ml)的混懸液中，加入吡啶(77mg，0.98mmol)。滴加氯甲酸甲酯(84mg，0. 90mmol)。 另外加入1. 2當量的吡啶和1. 1當量的氯甲酸甲酯，隨後攪拌1小時。重複此過程兩次。將 混合物傾入水中，並用乙酸乙酯萃取。有機層用水洗滌，乾燥(無水硫酸鈉)並蒸發。以乙 酸乙酯研磨得到標題化合物(57mg，0. 19mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)+，304. 0，306. 0。實施例33 1-叔丁基-3-(萘-1-基氧基)-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶~4~基胺(化合物198) ·將3-溴-1-叔丁基-IH-吡唑並[3，4-d]嘧啶 ~4~ 基胺(500mg, 1. 85mmol)(實施 例 10，步驟 C)、2，2，6，6-四甲基-庚烷-3，5-二酮(34. Img, 0. 18mmol)、氯化亞銅(91. 6mg， 0. 92mmol)和碳酸銫(1. 21g，3. 71mmol)在N-甲基吡咯烷酮(4ml)中的混合物在120°C在氬 氣氛圍中加熱18小時。加入水，且用二氯甲烷萃取產物。有機層以水洗滌，乾燥(無水硫 酸鈉)並在真空中蒸發得到殘餘物，該殘餘物經矽膠快速柱色譜法純化(洗脫液，己烷-乙 酸乙酯梯度)。合併含有期望物質的級分，並蒸發溶劑。殘餘物經反相製備型HPLC分離，並 收集基於在254nm下的紫外吸收的峰(水-乙腈梯度，0.05%甲酸，80 20 10 90,20 分鐘，線性梯度；流速，15ml/ 分鐘；色譜柱，PhenomenexLuna 5μ C18,100X21. 2mm ；UV 254 和218nm)。合併含有期望物質的級分，並在真空中蒸發溶劑。以乙腈研磨得到標題化合物 (9mg，0. 19mmol) (9mg，0. 03mmol)，LC/MS, API-ES, Pos, (Μ+Η)+，334· 2。實施例34 3- (4-氯-苯基)-1-甲磺醯基-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶~4~基胺(化合物203) ·向3-(4-氯苯基)-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶 _4_ 胺(200mg, 0. 81mmol)的二氯甲 烷(5ml)的混懸液中，加入吡啶(77mg，0. 98mmol)，然後加入甲磺醯氯(102mg，0. 90mmol)。 1. 5小時後，加入另外的1. 2當量吡啶，並將反應攪拌過夜。加入1. 1當量的甲磺醯氯和1. 2 當量的吡啶，並將反應在環境溫度下攪拌4小時。反應以5ml水淬滅，並以二氯甲烷萃取。 有機層以水洗滌，乾燥(無水硫酸鈉)並蒸發得到殘餘物，該殘餘物經矽膠柱色譜法分離 (洗脫液；二氯甲烷-甲醇梯度)得到標題化合物(33mg，0. 1 Ommol) ；LC/MS, API-ES，Pos, (M+H)324. 0,326. 0。實施例35N-乙醯基-N-[5-(4-氯-苯基)-7-乙基-7H-吡咯並[2，3_d]嘧啶_4_基]-乙 醯胺(化合物211).向攪拌的5-(4-氯-苯基)-7_乙基-7H-吡咯並[2, 3-d]嘧啶_4_基胺(42mg， 0. 15mmol)的吡啶(2ml)溶液中，加入乙醯氯(0. 15ml, 1. 5mmol)，並將反應混合物在60°C攪 拌1天直至反應完成(LCMS)。混合物在真空中濃縮並通過矽膠色譜法純化(10g，洗脫液， 己烷-乙酸乙酯100 0 0 100)得到標題化合物(36mg，0. lOmmol)，為白色固體；LC/ MS, API-ES, Pos, (M+H)+,357. 1,359. 1。實施例36 4-氨基-3-(4-氯-苯基)-吡唑並[3,4-d]嘧啶甲酸乙基醯胺(carboxylic acidethylamide)(化合物 213)步驟A 向3-(4-氯苯基)-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶 _4_ 胺(500mg，2. 04mmol)的二甲基 甲醯胺(7ml)混懸液中，加入吡啶(193mg，2. 44mmol)和甲磺醯氯(257mg，2. 24mmol)。在環 境溫度下攪拌1小時後，另外加入吡啶(193mg,2. 44mmol)和甲磺醯氯(257mg，2. 24mmol), 並將溶液攪拌2小時。將反應混合物傾入水中，並以20ml飽和碳酸氫鈉水溶液鹼化。沉 澱產物通過過濾分離並以丙酮洗滌，得到N' -[3-(4_氯-苯基)-1Η-吡唑並[3，4-d] 嘧啶-4-基]-N，N- 二甲基-甲脒，為棕色固體(397mg, 1. 32mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)+,301. 0,303. 1。步驟B 向N' -(3-(4-氯苯基)-1Η-吡唑並[3，4_d]嘧啶-4-基)-N，N-二甲基甲 脒(200mg，0.67mmol)的二氧雜環己烷(8ml)的混懸液中，加入異氰酸乙酯(0.05ml， 0. 67mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌1小時，再在60°C加熱2小時。將混合物在20°C 攪拌過夜，另外加入1. 2當量的異氰酸乙酯，再在40°C攪拌8小時。在真空中蒸發混合物， 殘餘物以丙酮研磨得到3- (4-氯苯基)-4- ( 二甲基氨基-亞甲基氨基)-吡唑並[3，4-d] 嘧啶-1-甲酸乙基醯胺(180mg，0. 48mmol)。步驟C:將3-(4-氯-苯基)-4-( 二甲基氨基-亞甲基氨基)_吡唑並[3，4-d]嘧啶甲 酸乙基醯胺(150mg，0.40mmOl)溶於1摩爾的鹽酸乙腈溶液(IOml)中。將混合物在25°C攪 拌過夜。然後將混合物在減壓下濃縮，以飽和碳酸鈉水溶液(PH 8)中和並過濾。固體從丙 酮研磨得到標題化合物(60mg，0. 18mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)+，316. 7，318. 9。實施例37 3- (3-氯-苯氧基)-1H-吡唑並[3,4-d]嘧啶~4~基胺(化合物220)在0°C，向攪拌的濃硫酸中分批加入1-叔丁基-3-(3_氯-苯氧基)-lH_吡唑 並[3，4-d]嘧啶-4-基胺(lg，3. 3mmol)(根據與實施例21相似的方法從3-氯苯酚和 3-溴-1-叔丁基-1H-吡唑並[3，4-d]嘧啶-4-基胺製備)。將溶液在此溫度下攪拌15分 鍾，再在環境溫度下攪拌30分鐘。將溶液緩慢傾入在冰上，並通過過濾分離沉澱物。過濾 的水溶液以碳酸鈉水溶液中和，並通過過濾分離沉澱。合併的沉澱以水洗滌並空氣乾燥。 以少量的甲醇研磨得到標題化合物(化合物220 ；0. 61g,2. 48mmol) ；LC/MS, API-ES，Pos， (M+H)262. 0,264. 0。實施例38 3-(3-氯-苯氧基)-1-環戊基_111-吡唑並[3,4-d]嘧啶_4_基胺(化合物221).將3-(3-氯-苯氧基)-lH-吡唑並[3,4-d]嘧啶 _4_ 基胺(150mg，0. 57mmol)，溴 代環戊烷(169. 9mg,l. 14mmol)和碳酸鉀(173. lmg, 1. 25mmol)在無水二甲基甲醯胺(2ml) 中的混合物在70°C攪拌4小時。加入水，且用二氯甲烷萃取產物。有機層用水洗滌，乾燥 (無水硫酸鈉)並在真空中蒸發。殘餘物經反相製備型HPLC分離(水-乙腈梯度，0.05% 甲酸，80 20 10 90，20分鐘，線性梯度；流速，15!111/分鐘；色譜柱，？11611011161^^ Luna 5uC18,100X21. 2mm ；UV 254和218nm)。合併含有期望物質的級分，並在真空中蒸發溶劑 得到標題化合物(19mg,0. 06mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)330. 1,332.實施例39 1-乙基-N3-苯基-1H-吡唑並[3,4-d]嘧啶-3,4- 二胺(化合物223) 步驟A 將2-(雙-甲基硫基-亞甲基)-丙二腈(3. 40g,20mmol)和苯胺(1. 82ml,20mmol) 在乙醇(50ml)中回流1. 5小時，直至反應完成(LCMS)。冷卻混合物，過濾形成的沉澱，以乙 醇(3X7ml)洗滌，在空氣中乾燥得到2-(甲基硫基-苯基氨基-亞甲基)_丙二腈(2. 97g， 13. 8mmol)，為灰白色固體。步驟B 向攪拌的2-(甲基硫基-苯基氨基-亞甲基)_丙二腈(215mg，1.0mmOl)和乙基 胼草酸鹽(150mg, 1. Ommol)的乙醇混懸液(20ml)中，加入三乙胺(0. 14ml，1. Ommol)，並將 混合物回流15小時，冷卻，並在真空中濃縮。LCMS分析顯示有兩種異構體產物存在，通過矽 膠柱色譜法分離兩種異構體(50g，洗脫液，己烷-乙酸乙酯100 0至0 100)得到5-氨 基-1-乙基-3-苯基氨基-1H-吡唑-4-腈(93mg，0. 41mmol)，為白色低熔點固體，LCMS， 3. 42分鐘，API-ES，Pos，(M+H)+，228. 1 ；以及異構體3-氨基-1-乙基-5-苯基氨基-1H-吡 唑-4-腈(39mg，0. 17mmol)，為灰白色固體，LC/MS，3. 18 分鐘。步驟C 將5-氨基-1-乙基-3-苯基氨基-1H-吡唑-4-腈(92mg，0. 40mmol)在190°C在甲 醯胺(6ml)中攪拌6小時。以水(10ml)稀釋混合物，過濾，以水洗滌(3X5ml)，乾燥，再溶 解於THF中(20ml)，以活性炭處理，通過硅藻土過濾，在真空中濃縮，並在通過矽膠色譜法 純化(10g，洗脫液，二氯甲烷-甲醇，100 0 80 30)得到1-乙基-N3-苯基-1H-吡唑 並[3,4-d]嘧啶-3，4-二胺(41mg，0. 16mmol)，為灰白色固體，LC/MS，API-ES，Pos，_)+， 255. 1。實施例401-嘧啶-2-基-3-對甲苯基-1H-吡唑並[3,4-d]嘧啶~4~基胺(化合物229) 將3-對甲苯基-1H-吡唑並[3,4-d]嘧啶_4_基胺(245. 6mg，lmmol)，2-氯嘧啶 (137. 4mg, 1. 2mmol)和碳酸鉀(165. 6mg，1. 2mmol)在無水二甲基亞碸(2ml)中的混合物在 110°C在氬氣氛圍中攪拌2小時。加入水，且用二氯甲烷萃取產物。有機層用水洗滌，乾燥 (無水硫酸鈉)並在真空中蒸發。殘餘物以乙腈研磨，並經反相製備型HPLC分離(水-乙 腈梯度，0.05%甲酸，80 20 10 90，20分鐘，線性梯度；流速，15ml/分鐘；色譜柱， PhenomenexLuna 5u C18,100X21. 2mm ；UV 254 和 218nm)。合併含有期望物質的級分，並 在真空中蒸發溶劑得到標題化合物(33mg，0. 1 Ommol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)+，324. 0， 326.0。實施例41 1-[1-叔丁基-3-(4-氯-苯基)-lH_吡唑並[3,4-d]嘧啶~4~基]_3_苯基-脲 (化合物230).將1-叔丁基 _3-(4-氯苯基)-111-吡唑並[3,4-d]嘧啶 _4_胺(100mg，0. 33mmol) 和苯異氰酸酯(39.5mg，0.33mmol)在二氧雜環己烷中(2ml)的混合物在室溫下攪拌過 夜。在真空中除去溶劑，並以丙酮研磨殘餘物得到標題化合物(60mg，0. 14mmol) ；LC/MS, API-ES, Neg, (M-H)_，419. 3，421. 2。實施例42 N' -[1-叔丁基 _3-(4-氯-苯基)-111-吡唑並[3,4-d]嘧啶 _4_ 基]_N，N_ 二甲 基-甲脒(化合物232).將1-叔丁基 _3-(4-氯苯基)-111-吡唑並[3,4-d]嘧啶-4-胺(150mg，0. 50mmol) 溶於2ml 二甲基甲醯胺二甲縮醛中。混合物在室溫下攪拌過夜。在真空中蒸發溶劑，產物 經矽膠柱色譜法純化(洗脫液；二氯甲烷甲醇，10 1)得到產物，為粘性固體。該物質 以己烷在超聲波浴中處理。分離得到產物，為沉澱，該沉澱通過過濾收集得到標題化合物 (84mg,0. 24mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)+，357. 3，359. 3。實施例43 (1-叔丁基-3-對甲苯基-1H-吡唑並[3，4_d]嘧啶-4-基)_嘧啶-2-基-胺(化 合物234).步驟A: 將3-溴-1-叔丁基-1H-吡唑並[3,4-d]嘧啶-4-基胺(1. 35g，5. Ommol)(實施例 10，步驟C)，2-氯嘧啶(1. 15g,10. Ommol)和碳酸鉀(1. 38g, 10. Ommol)在無水二甲基亞碸 (10ml)中的混合物在120°C在氬氣氛圍中攪拌12小時。加入水，且用二氯甲烷萃取產物。有 機層用水洗滌，乾燥(無水硫酸鈉)並蒸發。殘餘物在環境溫度下在乙腈中攪拌，沉澱物質 通過過濾分離，在空氣中乾燥得到(3-溴-1-叔丁基-1H-吡唑並[3，4-d]嘧啶-4-基)-嘧 啶-2-基-胺(0. 69g，1. 98mmol)。該化合物如此直接用於下一步驟。步驟B 將(3-溴-1-叔丁基-1H-吡唑並[3，4-d]嘧啶-4-基)-嘧啶_2_基-胺 (348. 2mg，lmmol)、4-甲基苯硼酸(149. 6mg，1. lmmol)、碳酸鈉(254. 4mg，2. 4mmol)和四 (三苯基膦)鈀(69. 3mg，0.06mmol)在乙二醇二甲基醚(25ml)和水(12.5ml)中的混合物 在氬氣氛圍中回流加熱6小時。加入水，且用二氯甲烷萃取產物。有機層用水洗滌，乾燥 (無水硫酸鈉)並在真空中蒸發。殘餘物經反相製備型HPLC分離(水-乙腈梯度，0. 05% 甲酸，80 20 10 90，20分鐘，線性梯度；流速，15!111/分鐘；色譜柱，？11611011161^^ Luna 5uC18,100X21.2mm;UV 254和218nm)。合併含有期望物質的級分，並在真空中蒸發。以 甲醇研磨，再以乙腈研磨，得到標題化合物(113mg,0. 31mmol) ；LC/MS,API-ES,Pos, _)+， 360.1。實施例445-(4_氯-苯基)-7_環丙基甲基-7H-吡咯並[2，3_d]嘧啶_4_基胺(化合物 242).步驟A 向六亞甲基四胺(17. 6g,125. 5mmol)的乙醇(500ml)溶液中滴加2_溴_4』_氯苯 乙酮(26. 6g，114. lmmol)的氯仿(60ml)溶液。在1小時後加入碘化鈉(17. lg，114. lmmol)。 將混合物在室溫下攪拌24小時。過濾沉澱並以冰乙醇洗滌。該物質以乙醇(100ml)和濃 鹽酸(36. 5ml,433mmol)稀釋，並在55°C加熱30分鐘。冷卻混合物並使其蒸發24小時。 固體以己烷稀釋，攪拌15分鐘，過濾得到2-氨基-l-(4-氯-苯基)-乙酮鹽酸鹽(15. 9g，
77.2mmol)。該化合物如此直接用於下一步驟。步驟B 向冷卻至0°C的乙酸酐(30. 5ml，323. 2mmol)中加入2_氨基(4_氯-苯基)-乙 酮鹽酸鹽(15. 9g，77. 2mmol)，再加入醋酸鈉(12. 6g，154. 3mmol)在水(30ml)中的溶液。將 溶液在0°C保持30分鐘。溫熱至室溫，攪拌4小時，並以1N的鹽酸稀釋。水層以二氯甲烷 萃取。有機層以鹽水洗滌、乾燥(MgS04)，並在真空中濃縮得到N-[2-(4-氯-苯基)-2_氧 代-乙基]-乙醯胺(13. 0g，61. 4mmol)。該化合物如此直接用於下一步驟。步驟C: 向N-[2_(4-氯-苯基)_2_氧代-乙基]-乙醯胺(13.0g，61.4mmOl)的甲醇 (100ml)溶液中加入丙二腈(5. 5g，83. lmmol)。將溶液冷卻至0°C，並加入50 %的氫氧化 鉀水溶液直至PH達到10 12。將此深色溶液在0°C攪拌20分鐘，然後在65°C加熱6小 時。將混合物冷卻至室溫並傾倒在冰上。過濾沉澱，以水洗滌，在真空中乾燥得到2-氨 基-4-(4-氯-苯基)-111-吡咯-3-腈(10.4g，47.8mmol)。該化合物如此直接用於下一步 馬聚o步驟D
2-氨基-4-(4-氯-苯基)-111-吡咯-3-腈(3.6§，16.5_01)以甲醯胺(25ml， 628. 3mmol)稀釋，並在185°C加熱4小時。將該溶液冷卻至室溫，以水稀釋，並以乙酸乙酯 萃取。濃縮有機層。所得固體以水-丙酮(4 1)研磨，過濾，再次以乙醚研磨。固體在真 空中乾燥得到5-(4-氯-苯基)-7H-吡咯並[2，3-d]嘧啶-4-基胺(2. 9g，11. 9mmol)。該 化合物如此直接用於下一步驟。步驟E 向在DMF (3ml)中的5_ (4_氯-苯基)~7H~吡咯並[2，3-d]嘧啶_4_基胺(190mg， 0. 78mmol)中加入乙醇鈉(64mg，0. 94mmol)。將混合物在室溫下攪拌15分鐘，再加入溴代 甲基環丙烷(115mg，0. 86mmol)。將溶液攪拌16小時。粗產物經反相製備型LC/MS純化 (水-乙腈梯度，0.05%甲酸，95 5 5 95，14分鐘，線性梯度；流速，42ml/分鐘；色譜柱，Phenomenex Luna 5u C18(2), 100X 30mm ；UV 254 和 218nm)。合併含有期望物質的級 分，並在真空中蒸發得到標題化合物(16mg，53. 5mmol) ；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)+，299. 1。實施例45 N-[5_(4-氯-苯基)-7_乙基-7H-吡咯並[2, 3-d]嘧啶_4_基]-乙醯胺(化合 物 246).在0°C，向5-(4-氯-苯基)_7_乙基_7H_吡咯並[2, 3-d]嘧啶_4_基胺(50mg, 184mmol)的乙酸酐(1ml)溶液中加入醋酸鈉(30mg，368mmol)。將溶液溫熱至室溫並攪拌4 小時。粗產物經反相製備型LC/MS純化(水-乙腈梯度，0.05%甲酸，95 5 5 95，14分 鍾，線性梯度；流速，42ml/ 分鐘；色譜柱，PhenomenexLuna 5u C18(2)，100X 30mm ；UV 254 和218nm)。合併含有期望物質的級分，並在真空中蒸發得到標題化合物(18mg，57mmol)； LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)+，315. 1。實施例46 1-乙基-N-甲基-N-苯基-1H-吡唑並[3,4-d]嘧啶-3,4- 二胺(化合物248) 向 1-乙基-N3-苯基-1H-吡唑並[3,4-d]嘧啶-3,4- 二胺(lOOmg,0. 4mmol)和碳 酸鉀(70mg,0. 5mmol)在無水DMF(3ml)中的攪拌混合物中，加入碘甲烷(25 yl，0. 4mmol)， 並將混合物在封閉的容器中在40°C攪拌1天。加入另外量的碘甲烷(25ia，0.4mmOl)，並 將混合物在40°C另外攪拌4天。過濾所得產物的混合物，並在C18反相矽膠柱上通過製備 型-HPLC 純化(洗脫液，H20-CH3CN-HC00H，95 5 0. 05 5 95 0.05)，在從乙腈重 結晶得到標題化合物(18mg，0. 067mmol)，為白色粉末；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)+，269. 1。實施例47 1-環丁基-N3-苯基-1H-吡唑並[3,4-d]嘧啶-3,4- 二胺(化合物253) 步驟A 將2_(甲硫基-苯基氨基-亞甲基)_丙二腈(2.07g，9.6mmol)(實施例39，步驟 A)和水合胼(0.45ml，10mmol)的無水乙醇(50ml)溶液在惰性氣體氛圍中回流2小時(由 LCMS確證完全轉化)。所得混合物在真空中濃縮得到純的5-氨基-3-苯基氨基-IH-吡 唑-4-腈(1.88g，9. 4mmol)，為灰白色固體。步驟B 藉助回流冷凝器，將5-氨基-3-苯基氨基-IH-吡唑-4-腈(1. 88g，9. 4mmol)和 甲醯胺(30ml)的混合物在190°C攪拌3小時(由LCMS控制)。將反應混合物冷卻，過濾沉 澱，以水(3X7ml)和乙醚(2X5ml)洗滌，並在真空中乾燥得到純的N3-苯基-IH-吡唑並 [3,4-d]嘧啶-3，4-二胺(1.88g,8. 3mmol)，為淺褐色固體。步驟C 在氬氣下，向攪拌的N3-苯基-IH-吡唑並[3，4-d]嘧啶-3，4_ 二胺(226mg，
1.Ommol)和碳酸鉀(276mg，2. Ommol)的無水DMF(3ml)混懸液中加入環丁基溴(200 μ 1,
2.Ommol)，將所得混合物在密封的容器中在70°C攪拌12小時，過濾，並在反相C18柱上通過 製備型 HPLC 純化(洗脫液，H20-CH3CN-HC00H，95 5 0. 05 5 95 0.05)，再從乙腈 重結晶得到標題化合物1-環丁基-N3-苯基-IH-吡唑並[3，4-d]嘧啶-3，4-二胺(133mg， 0. 48mmol)，為灰白色固體；LC/MS, API-ES, Pos, (Μ+Η)+，281· 1。實施例48N-[l-叔丁基-3-(4-氯-苯基)-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶~4~基]_N_甲基-乙 醯胺(化合物259).步驟A:
向攪拌的1-叔丁基-3-(4-氯-苯基)-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_基胺(302mg， 1. Ommol)的吡啶混懸液中加入乙酸酐(0. 30ml, 3. 2mmol)，將混合物在密封瓶中在70°C加 熱1小時(由LCMS控制)，在真空中濃縮，經矽膠色譜法純化(20g，洗脫液，己烷-乙酸乙 酯，100 0 50 50)，再以乙腈研磨得到N-[1-叔丁基-3-(4-氯-苯基)-IH-吡唑並 [3,4-d]嘧啶-4-基]-乙醯胺(化合物2 ;180mg，0. 52mmol)，為灰白的固體，還伴隨有二乙 醯化的副產物(化合物97 ；91mg,0. 24mmol)。步驟B 向攪拌的N-[l-叔丁基-3-(4-氯-苯基)-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶_4_基]-乙 醯胺(68mg,0. 2mmol)和碳酸鉀(41mg,0. 3mmol)的無水DMF(3ml)混懸液中，加入碘甲 烷(19 μ 1,0. 3mmol)，並將混合物在環境溫度下攪拌過夜，並在反相C18柱上通過製備 型-HPLC純化(洗脫液H20-CH3CN-HC00H，95 5 0. 05 5 95 0. 05)，得到 N_[l_叔丁 基-3-(4-氯-苯基)-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶-4-基]-N-甲基-乙醯胺(47mg，0. 13mmol), 為白色固體；LC/MS, API-ES, Pos, (Μ+Η)+，358· 1,360. 1。實施例497-叔丁基-5- (4-氯-苯基)-7Η-吡咯並[2，3-d]嘧啶~4~基胺(化合物261) ·步驟A 在0 °C，向攪拌的叔丁胺(6. 8g,30mmol)的甲苯溶液(20mL)中滴加 4』-氯-2-溴-苯乙酮(2. 3g，20mmol)的甲苯溶液(15mL)，歷時5分鐘。將溶液在0°C攪 拌1. 5小時。加入濃鹽酸至pH為1 2，並將混合物在0°C攪拌15分鐘。過濾所得沉澱， 並以乙醚洗滌。該物質[2-叔丁基氨基-1-(4-氯-苯基)-乙酮]如此直接用於下一步。步驟B 在0°C，向 2-叔丁基氨基-1-(4-氯-苯基)_ 乙酮(0.98g，3. 72mmol)、丙二腈 (0. 32g，4. 84mmol)在甲醇(IOml)中的混合物中，加入50%的氫氧化鉀水溶液至pH為10 12。將深色溶液在65°C加熱4小時，同時保持pH不變。將該物質傾倒至碎冰上。收集沉澱， 以水洗滌，得到2-氨基-1-叔丁基-4- (4-氯-苯基)-IH-吡咯-3-腈(0. 35g，1. 28mmol)。步驟C 將攪拌的2-氨基-1-叔丁基-4-(4_氯-苯基)-1Η-吡咯-3-腈(0. 23g，0. 86mmol) 和甲醯胺(5ml)的混合物加熱至180°C，保持4小時。冷卻溶液，以水稀釋，並以二氯甲烷萃 取。濃縮有機層並經反相製備型HPLC純化(水-乙腈梯度，0.05%甲酸，80 20 10 90， 20 分鐘，線性梯度；流速，15ml/分鐘；色譜柱，Phenomenex Luna 5 μ C18,100X 21. 2mm ； UV 254和218nm)。合併含有期望物質的級分，並在真空中蒸發得到標題化合物(16mg， 53mmol) ；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)+，301. 1。實施例503-[4-氨基-3-(4-氯-苯基)-吡唑並[3，4_(1]嘧啶基]-氮雜環丁烷甲 酸叔丁酯(化合物267).步驟A 在0°C，向氮雜環丁烷-3-醇鹽酸鹽(1.00g，9. 13mmol)的乙醇溶液(18ml)中加 入三乙胺(3. 80ml, 27. 4mmol)，再加入二碳酸二叔丁酯(2. 18g，10. Ommo 1)。將該混合物在 室溫下攪拌30分鐘。在減壓下濃縮該溶液，並將殘餘物溶於乙酸乙酯，以10%的檸檬酸洗 滌，再以鹽水洗滌。乾燥有機層(無水硫酸鈉)，並在真空中除去溶劑。粗產物經快速矽膠 色譜法純化(洗脫液；己烷-乙酸乙酯級分)得到3-羥基-氮雜環丁烷-1-甲酸叔丁酯 (0. 8g，4. 62mmol)，為無色油狀物。步驟B 向3-羥基-1-氮雜環丁烷甲酸叔丁酯(770mg，4. 45mmol)的乙酸乙酯(7ml)溶液 中，加入三乙胺(0. 80ml, 5. 78mmol)，再加入甲磺醯氯(0. 41ml, 5. 34mmol)。將混合物在0°C 攪拌1小時。過濾溶液，殘餘物以乙酸乙酯洗滌。在真空中蒸發有機濾液得到3-甲磺醯氧 基-氮雜環丁烷-1-甲酸叔丁酯(lg，3.98mm0l)，為黃色油狀物。步驟C 將3-(4-氯苯基)-1Η-吡唑並[3，4_d]嘧啶 ~4~ 胺(684mg，2. 79mmol)、3_ 甲磺 醯氧基-氮雜環丁烷-1-甲酸叔丁酯(700mg,2. 79mmol)和碳酸銫(1. 18g,3. 62mmol)的 混合物於90°C在二甲基醯胺(14ml)中在氬氣下加熱24小時。將混合物冷卻至室溫，傾入 冰水中，並以5%的甲醇-二氯甲烷萃取。乾燥有機層(無水硫酸鈉)，並在減壓下蒸發。 產物經快速矽膠色譜法純化(洗脫液，二氯甲烷-甲醇梯度)，得到標題化合物(600mg， 1. 49mmol) ；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)+，400. 9，402. 9。實施例51 N-[1-叔丁基-3-(4-氯-苯基)-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_基]-甲磺醯胺(化 合物274). 在0°C，向攪拌的1-叔丁基-3-(4-氯苯基)-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_胺 (100mg,0. 33mmol)的二甲基甲醯胺(1.5ml)溶液中，加入氫化鈉(60%，在礦物油中， 40. Omg, 0. 85mmol)。攪拌20分鐘後，緩慢加入甲磺醯氯(80. Omg, 0. 66mmol)，並將混合物在 環境溫度下攪拌1小時。加入冰水淬滅反應，並以乙酸乙酯萃取。將合併的有機層用水洗 滌，再以鹽水洗滌，乾燥(無水硫酸鈉)並在真空中濃縮。殘餘物經矽膠色譜法純化(二氯 甲烷-甲醇梯度)，得到標題化合物(65mg,0. 17mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)+，380. 0， 382. O0實施例52 3-[4-氨基-3-(4-氯-苯基)-吡唑並[3，4_(1]嘧啶基]-氮雜環丁烷甲 酸乙基醯胺(化合物275)向1_(氮雜環丁烷-3-基)-3-(4-氯苯基)-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_胺二鹽 酸鹽(200mg，0. 54mmol)的二氧雜環己烷(5ml)溶液中，加入吡啶(0. 14ml, 1. 71mmol)和異 氰酸乙酯(0. Ilm, 1. 34mmol)。將混懸液在室溫下攪拌24小時。加入二甲基甲醯胺(3ml)， 並將混合物在室溫下另外攪拌24小時。加入水，以乙酸乙酯萃取產物，乾燥(無水硫酸鈉) 並在真空中除去溶劑。粗產物經矽膠柱色譜法純化(洗脫液，二氯甲烷甲醇，25 1)得 到標題化合物(100mg,0. 27mmol) ；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)372. 1,374. 1。實施例53 [1-叔丁基-3-(4-氯-苯基)-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_基]-氨基甲酸甲酯 (化合物294)向 1-叔丁基-3-(4-氯苯基)-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶 _4_ 胺(200mg，0. 66mmol) 的二甲基甲醯胺(2ml)溶液中，加入氫化鈉(60%，在石蠟中，40.0mg，0. lOmmol)，再加入氯 甲酸甲酯(0.06ml，0.80mmol)。將混合物在環境溫度下攪拌3小時。另外再加入氫化鈉 (20. Omg,0. 50mmol)和氯甲酸甲酯(0. 03ml,0. 40mmol)，並將混合物攪拌3小時。混合物用 水稀釋，並用乙酸乙酯萃取產物。有機層在無水硫酸鈉上乾燥，並在真空中除去溶劑。殘餘 物經柱色譜法分離(二氯甲烷-甲醇梯度)，再經製備型環形薄層色譜(Chromatotron)分 離，得到標題化合物(60mg，0. 17mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)360. 1,362. 1。實施例54 1-{3-[4-氨基-3_(4-氯-苯基)-吡唑並[3，4_d]嘧啶基]-氮雜環丁 烷-1-基}-乙酮(化合物295).向1_(氮雜環丁烷-3-基)-3-(4-氯苯基)-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_胺二鹽 酸鹽(200mg，0. 54mmol)的二甲基甲醯胺(5ml)溶液中，加入吡啶(0. 14ml，1. 71mmol)和乙 醯氯(0. 11ml, 1. 60mmol)。將混合物在環境溫度下攪拌2. 5小時。混合物用水稀釋，並用乙 酸乙酯萃取。有機層以鹽水洗滌，乾燥(無水硫酸鈉)，並在真空中除去溶劑。以丙酮研磨 得到標題化合物(64mg，0. 19mmol) ；LC/MS，API—ES，Neg，(Μ—ΗΓ，341. 3，343. 4。實施例55 3-(4_氯-苯基)-1-(1-甲基-氮雜環丁烷-3-基)-1Η-吡唑並[3，4_d]嘧 啶-4-基胺(化合物296).以碳酸鈉水溶液中和1_(氮雜環丁烷-3-基)-3-(4_氯苯基)-1Η-吡唑並[3， 4-d]嘧啶-4-胺二鹽酸鹽(150mg，0.40mmOl)的水溶液。沉澱通過過濾分離，並分散在5ml 乙腈中。向此混懸液中加入甲醛(0. 16ml，1.61mmol，37%的水溶液)和NaBH3CN(40. Omg， 0. 64mmol)。通過加入乙酸將溶液的pH值維持在7，並攪拌2小時。在真空中濃縮混合物並將 殘餘物溶於乙酸乙酯中，再以碳酸鈉水溶液洗滌。乾燥有機層(無水硫酸鈉)，並在真空中 除去溶劑。殘餘物經矽膠柱色譜法純化(洗脫液，二氯甲烷甲醇氨水，100 1 0.5) 得到標題化合物(37mg，0. 12mmol)。實施例56 3-(4_氨基-3-萘-1-基甲基-吡唑並[3，4_d]嘧啶基)_氮雜環丁烷羧 酸叔丁酯(化合物297).將3-((萘-1-基)甲基)-1Η-吡唑並[3,4-d]嘧啶 _4_ 胺(5. OOg, 18. 2mmol), 碳酸銫(7.69g，23.6mmol)和1_ (叔丁氧基羰基)氮雜環丁烷_3_基-甲磺酸酯(5. 02g， 20. Ommol)在二甲基甲醯胺(200ml)中的混合物在85°C攪拌過夜。將混合物加入到水中， 並用乙酸乙酯萃取。有機層以水、鹽水洗滌，乾燥(無水硫酸鈉)，並在真空中除去溶劑。 殘餘物經矽膠柱色譜法純化(洗脫液，二氯甲烷甲醇，50 1)得到標題化合物(5.8g， 13. 5mmol) ；LC/MS，API—ES，Pos，(M+H)+，431. 1。[1012]實施例57 [1-叔丁基-3-(4-氯-苯基)-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_基]-氨基甲酸四氫 呋喃-3-基酯(化合物301).步驟A: 向(S)-四氫呋喃-3-醇(88. Omg, 1. Ommol)的二氯甲烷(2ml)溶液中，加入三光 氣(133mg，0. 45mmol)。將溶液冷卻至_40°C，並緩慢加入吡啶(105mg, 1. 33mmol)的二氯甲 烷(2ml)溶液，用時5分鐘。將混合物在室溫下攪拌3. 5小時，並在真空中除去溶劑得到粗 制(S)-四氫呋喃-3-基氯甲酸酯。步驟B:向1-叔丁基-3-(4-氯苯基)-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶 _4_ 胺(150mg，0. 50mmol) 在5ml的二甲基甲醯胺(5ml)的混懸液中，加入氫化鈉(60 %,在礦物油中，40mg， l.OOmmol)。將混合物在環境溫度攪拌5分鐘，並加入(S)-四氫呋喃_3_基氯甲酸酯。攪拌 過夜後，加入3當量的(S)-四氫呋喃-3-基氯甲酸酯和4當量的氫化鈉，並將混合物攪拌24 小時。加入水，以乙酸乙酯萃取產物，乾燥(無水硫酸鈉)並在真空中除去溶劑。殘餘物經矽 膠柱色譜法純化(洗脫液，二氯甲烷甲醇，100 1)，再經製備型環形TLC (Chromatotron) 純化得到標題化合物(20mg,0. 05mmol) ；LC/MS，API-ES，Neg，(M-H)414. 3,416. I0實施例58 3-(4-氯-苯基)-1-(1-異丙基-氮雜環丁烷-3-基)-IH-吡唑並[3,4-d]嘧 啶-4-基胺(化合物304).通過加入碳酸鈉水溶液鹼化(pH 8)1_(氮雜環丁烷-3-基)-3-(4_氯苯 基)-1Η-吡唑並[3,4-d]嘧啶-4-胺二鹽酸鹽(150mg,0. 40mmol)在1，2_ 二氯乙烷中的
0^混懸液。白色固體通過過濾分離，並分散在5ml的1，2_ 二氯乙烷中。加入丙酮(0.03ml， 0. 41mmol)、NaBH(OAc)3(119mg，0. 56mmol)和乙酸(0. 02ml,0. 40mmol)，並在環境溫度下攪 拌24小時。混合物以碳酸鈉水溶液稀釋，以二氯甲烷萃取，乾燥(無水硫酸鈉)和蒸發。殘 餘物經矽膠柱色譜法純化(洗脫液，二氯甲烷甲醇氨水，100 1 0.5)得到標題化合 物(20mg,0. 06mmol) ；LC/MS，API-ES，Pos，(M+H)+，343. 3，345. 2。 [1024] 實施例59^[5-(4-氯-苯基)-7-乙基_7!1-吡咯並[2, 3-d]嘧啶_4_基]-甲磺醯胺(化 合物305) ·向5-(4-氯苯基)-7-乙基-7!1-吡咯並[2, 3-d]嘧啶 _4_ 胺(0. IOg, 0. 37mmol)的 無水二甲基醯胺(IOml)溶液中緩慢加入氫化鈉(60%，在礦物油中，0.028，0.7311111101)。攪 拌0.5小時後，加入甲磺醯氯(0. 08g，0. 73mmol)。在溶液攪拌2小時後，加入兩摩爾當量的 氫化鈉，再加入兩摩爾當量的乙磺醯氯，並將溶液攪拌過夜。加入水，且產物用乙酸乙酯萃 取。在真空中除去溶劑，殘餘物經矽膠柱色譜法純化(己烷-丙酮梯度)，再以己烷研磨得 到標題化合物(28mg,0. 08mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)351. 0,353. I0實施例60 3-(4-氨基-3-苯硫基-吡唑並[3，4_d]嘧啶基)_氮雜環丁烷甲酸叔丁 酯(化合物320).將3-(4-氨基-3-碘-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶基)氮雜環丁烷甲酸叔 丁 酉旨(2. Og, 4. 8mmol)、苯硫酚(1. 06g, 9. 60mmol)、K2CO3 (2. 66g, 19. 2mmol)和銅(0. 12g, 1. 90mmol)在25ml甲苯中的混合物加熱回流並攪拌3小時。濃縮混合物，用水稀釋，並用 乙酸乙酯萃取。合併的有機相以鹽水洗滌，乾燥(無水硫酸鈉)，並在真空中除去溶劑。殘 餘物經矽膠柱色譜法純化(二氯甲烷-甲醇梯度)，得到標題化合物(1.2g，3.01mmOl) ；LC/ MS, API-ES, Pos, (Μ+Η)+，399· 0。實施例61 N-[1-叔丁基-3-(3-氯-苯氧基)-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_基]-苯甲醯胺 (化合物332).將1-叔丁基-3-(3-氯-苯氧基)-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_基胺(200mg, 0. 63mmol)溶於無水二甲基甲醯胺(5ml)和二異丙基乙基胺(244. 2mg，1. 89mmol)中，並 加入苯甲酸(184.6mg，1.51mm0l)。攪拌溶液，加入0_(7_氮雜苯並三唑-1-基)-N，N，
N' , N'-四甲基#六氟磷酸鹽(HATU) (622. 8mg, 1. 63mmol)，並將溶液在環境溫度下攪
拌24小時。加入水，且用二氯甲烷萃取產物。有機層以水洗滌，乾燥(無水硫酸鈉)並 在真空中蒸發得到殘餘物，該殘餘物以反相製備型HPLC分離(水-乙腈梯度，0. 05%甲 酸，80 20 10 90，20分鐘，線性梯度；流速，15ml/分鐘；色譜柱，Phenomenex Luna 5yC18,100x21.2mm;UV 254和218nm)。合併含有期望物質的級分，並在真空中蒸發，再 從乙腈中重結晶得到標題化合物(18mg，0. 04mmol) ；LC-MS, API-ES, Pos，(M+H)+，422. 1， 424. 1。實施例62 3-(4-氨基-3-苯氧基-吡唑並[3，4_d]嘧啶基)_氮雜環丁烷甲酸叔丁 酯(化合物341).將3-(4-氨基-3-碘-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶基)氮雜環丁烷甲酸 叔丁酯(300mg，0. 72mmol)、苯酚(140mg，1. 4mmol)、碳酸銫(700mg，2. 2mmol)、催化量的 Cul(14mg,0. 072mmol)和N，N-二甲基甘氨酸鹽酸鹽(30mg，0. 22mmol)依次加入二氧雜環 己烷(5ml)中。將混合物在真空中脫氣，以氬氣衝洗，並在90°C加熱攪拌過夜。將冷卻的 混合物通過一層硅藻土過濾，在以乙酸乙酯洗滌。合併的濾液以鹽水洗滌，乾燥(無水硫酸 鈉)，並在真空中除去溶劑。殘餘物經矽膠柱色譜法純化(己烷-乙酸乙酯梯度)，再經反 相製備型 HPLC 純化得到標題化合物(18mg，0. 05mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)+，383. 2。實施例63 3-[4_氨基-3_(3-氯-苯硫基)_吡唑並[3，4_d]嘧啶基]-氮雜環丁烷甲 酸乙酯(化合物345).向3-(3_氯苯硫基)-1_(氮雜環丁烷-3-基)-1Η-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_胺 (0. IOg,0. 30mmol)的二甲基甲醯胺(15ml)溶液中，加入吡啶(0. 07g,0. 90mmol)和氯甲酸 乙酯(0.04g，0.36mmol)。將混合物在環境溫度下攪拌3小時。混合物用水稀釋，並用二氯 甲烷萃取。合併的有機層以鹽水洗滌，乾燥(無水硫酸鈉)，並在真空中除去溶劑。殘餘物 經矽膠柱色譜法純化(二氯甲烷-甲醇梯度)，得到標題化合物(69mg，0. 17mmol) ；LC/MS, API-ES, Neg, (M-H) _，403. 3，405. 1。實施例64 3-[4_氨基-3_(3-氯-苯硫基)_吡唑並[3，4_d]嘧啶基]-氮雜環丁烷甲 酸乙基醯胺(化合物346).向3-(3_氯苯硫基)-1_(氮雜環丁烷-3-基)-1Η-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_胺 (0. IOg,0. 30mmol)的二甲基甲醯胺(15ml)溶液中，加入吡啶(0. 07g,0. 90mmol)和異氰酸 乙酯(0.03g，0.39mmol)。將混合物在環境溫度下攪拌4小時。混合物用水稀釋，並用二氯 甲烷萃取。合併的有機層以鹽水洗滌，乾燥(無水硫酸鈉)，並在真空中除去溶劑。殘餘物 經矽膠柱色譜法純化(二氯甲烷-甲醇梯度)，得到標題化合物(68mg，0. 16mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)+，404. 1,406. 1。實施例65 3-苯並噁唑-2-基-1-叔丁基-IH-吡唑並[3，4-d]嘧啶_4_基胺(化合物355).步驟A[1052] 向攪拌的二甲基甲醯胺二甲縮醛(291. 2mg，2. 22mmol)的甲苯(20ml)溶液中，加 Λ 3-溴-1-叔丁基-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶-4"基胺(500. Omg, 1. 85mmol)。將此溶液在 110°C攪拌5小時。在真空中除去溶劑，產物通過矽膠色譜法純化(己烷-乙酸乙酯梯度)得 到N' -(3-溴-1-叔丁基-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶-4-基)-N，N-二甲基甲脒(420. Omg, 1. 29mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)+，325. 1，327. 1。步驟B將三苯基膦(160mg，0.61mmol)、苯並噁唑(185mg，1.54mmol)、碳酸銫(1. 0g， 3. Immo 1)和N' -(3-溴-1-叔丁基-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶-4-基)-N，N- 二甲基甲脒 (600mg, 1. 8mmol)依次加入IOml無水無氧的二甲基乙醯胺中。混合物以氬氣衝洗，並加入 催化量的Pd(OAc)2(35mg，0. 15mmol)。將混合物在真空中脫氣，以氬氣衝洗，並在120°C加 熱攪拌過夜。冷卻所得混合物，並以二氯甲烷稀釋，經一層硅藻土過濾。濾液以鹽水和水洗 滌，用無水硫酸鈉乾燥，再在真空中蒸發。殘餘物經矽膠柱色譜法純化(己烷-乙酸乙酯梯 度)，再經製備型環形TLC(Chromatotron)純化(己烷-乙酸乙酯梯度)。從乙醚和己烷中 結晶得到標題化合物(0. 2g，0. 64mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)+，309. 1。實施例66 3-(4-氯-苯基)-l-(l-甲基-吡咯烷-3-基)-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶-4-基 胺(化合物356).步驟A: 在氬氣氛圍下，將3-碘-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶~4~基胺(200mg，0. 766mmol)、 PPh3 (400mg, 1. 5mmol)、(S)-I-甲基 _3_ 吡咯燒醇(160mg, 1. 5mmol)在無水 THF(IOmL)中的 混懸液冷卻至0°C，並向混合物中加入DEAD(270mg, 1. 5mmol)。加入後，將反應混合物在環 境溫度下攪拌3小時。對混合物進行TLC分析顯示起始原料消失。將所得混合物在真空中濃縮以除去溶劑，產物經矽膠柱色譜法純化(二氯甲烷-甲醇梯度)得到3-碘-1-(1-甲 基-吡咯烷-3-基)-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶-4-基胺，為淺黃色固體(135mg，0. 39mmol)。步驟B:向攪拌的3-碘-1-(1-甲基-吡咯烷-3-基)-1Η-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_基 胺(130mg，0.37mmOl)(步驟A)的DME (4ml)和水(2ml)的溶液中，依次加入4-氯苯基 硼酸(71mg,0. 45mmol)和Na2CO3(80mg，0. 76mmol)。混合物以氬氣衝洗，再加入催化量的 Pd(PPh3)4(44mg，0.038mmol)。將混合物脫氣、氬氣充氣三次。將混合物加熱回流3小時。 加入水，且產物用乙酸乙酯萃取。合併的萃取液以鹽水洗滌，在無水硫酸鈉上乾燥，過濾， 濃縮得到殘餘物，該殘餘物經矽膠柱色譜法純化(二氯甲烷-甲醇梯度)，在通過製備型環 形TLC (Chromatotron) (二氯甲烷甲醇，15 1)純化得到標題化合物(30mg，0. 09mmol)； LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)329. 2,331. 2。實施例67 N-(1-叔丁基-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶_4_基)-苯甲醯胺(化合物388)向1-叔丁基-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶 ~4~ 胺(IOOmg, 0. 52mmol)的吡啶(2ml)溶 液中加入苯甲醯氯(110mg，0. 78mmol)。將反應混合物在環境溫度下攪拌3小時。加入水， 且產物用乙酸乙酯萃取。分離有機層，乾燥(無水硫酸鈉)並在真空中蒸發。產物經矽膠 柱色譜法純化(己烷-乙酸乙酯梯度)，並重結晶(己烷和丙酮)，得到標題化合物(lOOmg， 0. 34mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)296. I0實施例68 N-[1-叔丁基-3-(4-氯-苯基)-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_基]_2_氧代_2_苯 基-乙醯胺(化合物395).向乾燥的圓底燒瓶中加入苯甲醯甲酸(99mg，0. 66mmol)、HATU(252mg，0. 66mmol) 和二甲基甲醯胺(3ml)。將此溶液在25°C攪拌15分鐘，再加入1-叔丁基-3-(4-氯-苯 基)-IH-吡唑並[3，4-d]嘧啶-4-基胺(lOOmg，0. 33mmol)和 DIEA (220 μ L，1. 33mmol)。將 所得混合物在25°C攪拌16小時。粗產物經反相製備型HPLC-MS純化，濃縮，並以乙腈研磨 得到標題化合物(17mg,0. 04mmol) ；LC/MS, API-ES, Pos, (M+H)434. 9,436. 90實施例69 1-[1_叔丁基-3-(4-氯-苯基)-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_基]_3_甲基-硫 脲(化合物397).將1-叔丁基-3- (4-氯-苯基)-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶_4_基胺(IOOmg, 0. 33mmol)溶於無水二氧雜環己烷中(5ml)並將溶液在0°C攪拌。加入氫化鈉(60%，在石 蠟油中，15. 8mg,0. 4mmol)，並將溶液攪拌5分鐘。加入異硫氰酸甲酯(28. 9mg,0. 39mmol)， 並將溶液在環境溫度下攪拌30分鐘。加入水，並以二氯甲烷萃取產物。有機層用水洗滌， 乾燥(無水硫酸鈉)並在真空中蒸發。殘餘物經反相製備型HPLC純化(水-乙腈梯度， 0.05%甲酸，80 20 10 90，20分鐘，線性梯度；流速，15ml/分鐘；色譜柱，Phenomenex Luna 5yC18,100X21.2mm;UV 254和218nm)。合併含有期望物質的峰，並在真空中蒸發溶 劑得到殘餘物，該殘餘物從乙腈中結晶得到標題化合物(16mg，0. (Mmmol) ；LC/MS, API-ES， Pos, (Μ+Η).，375· 0,377. O。實施例70 7-乙基-5-苯硫基-7Η-吡咯並[2，3-d]嘧啶~4~基胺(化合物333) ·將7-乙基-5-碘-7H-吡咯並[2, 3-d]嘧啶 ~4~ 胺(0. IOg, 0. 35mmol)、苯硫酚 (0. 08g，0. 69mmol)、銅(0. Olg, 0. 14mmol)和碳酸鉀(0. 19g, 1. 39mmol)在 IOml 甲苯中的混 合物在iio°c攪拌過夜。在過濾和濃縮後，殘餘物經矽膠柱色譜法純化(己烷丙酮梯度， 10 1,8 1,6 1)得到標題化合物，為灰色固體(35mg，0. 13mmol) ；LC/MS,API-ES,Pos, _)+，271· 5。實施例71 4-氨基-N-苄基-3-(4-氯苯基)-IH-吡唑並[3，4_d]嘧啶甲醯胺(化合物 213)[1089]向N' _(3-(4-氯苯基)-1Η-吡唑並[3，4_d]嘧啶-4-基)-N，N-二甲基甲 脈(200mg,0. 67mmol)的二氧雜環己烷(15ml)的混懸液中，加入異氰酸苄酯(88. Omg， 0. 67mmol)。將反應混合物在50°C加熱1小時。TLC(CH2C12 MeOH = 15 1)顯示有兩個 新點(Rf = 0.4，弱；Rf = 0.5，強)，並且起始原料還未完全消失。2小時後，將反應混合物 在80°C加熱3小時。將反應在室溫下攪拌過夜。TLC顯示仍然有少量的起始原料。然後力口 入1當量異氰酸苄酯，並將反應在80°C加熱2小時，直至反應完成。冷卻反應混合物。濾 除沉澱，以丙酮洗滌而得到標題化合物，為黃色固體(248mg，85% )。MS(ESI，pos.)，m/z, 433. 9 (MH+, 100% ), 435. 8 (ΜΗ+, 37% ), 866. 4 (2ΜΗ+, 41 % ), 868. 4 (2ΜΗ+, 30% )。步驟C:步驟A 向3-(4-氯苯基)-IH-吡唑並[3,4-d]嘧啶 _4_ 胺(500mg,2. 04mmol)的二甲基 甲醯胺(7ml)混懸液中，加入吡啶(193mg，2. 44mmol)和甲磺醯氯(257mg，2. 24mmol)。1小 時後，TLC(CH2C12 MeOH = 15 1)顯示有新點(Rf = 0. 6)，並且起始原料還未完全消失。 然後，每1小時加入1. 2當量的吡啶和1. 1當量的甲磺醯氯。在加入兩次後，起始原料完全 消失。將反應混合物傾入水中，但是沒有沉澱。然後加入20ml飽和NaHCOyK溶液。產物 通過過濾分離，以丙酮洗滌而得到標題化合物，為棕色固體(397mg，64% )。MS(ESI，pos.)， m/z, 301. 0 (MH+, 100% ), 303. 1 (ΜΗ+,27% )。步驟B: 將N-苄基-3-(4-氯苯基)-4-((E)-甲醯氨基)_1Η_吡唑並[3，4_d]嘧啶甲 醯胺(60. Omg, 0. 14mmol)溶於IOml的HC1/CH3CN溶液中(IM)。將反應混合物在25°C攪拌過 夜。TLC(CH2C12 MeOH= 15 1)顯示反應完成。然後濃縮反應混合物，以飽和NaHCO3水溶 液中和從而調節PH至7 8。濾除沉澱，以丙酮洗滌而得到標題化合物，為白色固體(40mg， 76 % )。MS (ESI，pos.)，m/z, 378. 9 (MH+, 14 % )，441. 4 (MNa++CH3CN，83 % )，778. 8 (2MNa+， 100 % ) ；1H 匪R(C5D5N, 400MHz,080128 BL-13-007_2_1H) δ = 9. 98 (t, J = 6. OHz, 1Η), 8. 65 (s，1Η)，7. 87 (d, J = 8. 8Ηζ,2Η)，7. 62 (d, J = 7. 2Ηζ,2Η)，7. 36-7. 41 (m, 4Η)，7. 29 (dd, J = 7. 2,7. 6Hz, 1Η)，4· 92 (d, J = 6. 0Ηζ，2Η)。因為改變將對本領域技術人員是明顯的，因此本發明意圖僅通過所附權利要求書 的範圍限定。
權利要求
治療患有以蛋白質運輸受損為特徵的病症的受試者的方法，其包括給予受試者有效量的以如下結構式所表示的化合物或其藥學可接受的鹽其中m為1或2；每個X獨立地表示N、CH或C(C1 C4烷基)；每個X1獨立地表示N、NR3、CH或C(C1 C4烷基)；R1和Z各自獨立地為R5、C(O)R5、COOR5、C(O)NR5R5或S(O)mR5；或NR1Z整體為N＝CH NR5R5；R2和R3各自獨立地為H、滷素、擬滷素、CN、SR5、R5、OR5、OC(O)R5、NR5R5、NR5R6、COOR5、NO2、C(O)R5、C(O)C(O)R5、C(O)NR5R5、S(O)mR5、S(O)mNR5R5、NR5C(O)NR5R5、NR5C(O)C(O)R5、NR5C(O)R5、NR5(COOR5)、NR5C(O)R8、NR5S(O)mNR5R5、NR5S(O)mR5、NR5S(O)mR8、NR5C(O)C(O)NR5R5、NR5C(O)C(O)NR5R6、P(O)R5R5、P(O)(NR5R5)2、P(O)(NR5R6)2、P(O)(NR6R6)2、或P(O)(OR5)2；R4獨立地為H、滷素、擬滷素、CN、SR5、OR5、OC(O)R5、NR5R5、NR5R6、COOR5、NO2、C(O)R5、C(O)C(O)R5、C(O)NR5R5、S(O)mR5、S(O)mNR5R5、NR5C(O)NR5R5、NR5C(O)C(O)R5、NR5C(O)R5、NR5(COOR5)、NR5C(O)R8、NR5S(O)mNR5R5、NR5S(O)mR5、NR5S(O)mR8、NR5C(O)C(O)NR5R5、或NR5C(O)C(O)NR5R6；或任選取代的烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或雜芳烷基；且各個R5、R6和R8獨立地為H或任選取代的烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、芳基、雜芳基或雜環基，其中所述疾病不是突觸核蛋白病。FPA00001178852800011.tif
2.提高細胞內蛋白質運輸的方法，其包括使細胞與有效量的以下結構式所表示的化合 物或其藥學可接受的鹽接觸其中m為1或2 ；各個X獨立地表示N、CH或C (C1-C4烷基)； 各個X1獨立地表示N、NR3, CH或C (C1-C4烷基)；R1 和 Z 各自獨立地為 R5、C (0) R5、COOR5、C (0) NR5R5 或 S (0) mR5 ；或 NR1Z 整體為 N = CH-NR5R5 ；R2 和 R3 各自獨立地為 H、滷素、擬滷素、CN、SR5、R5、OR5、OC (0) R5、NR5R5、NR5R6、COOR5、NO2、 C (0) R5、C (0) C (0) R5、C (0) NR5R5、S (0) mR5、S (0) mNR5R5、NR5C (0) NR5R5、NR5C (0) C (0) R5、NR5C (0)R5、NR5 (C00R5)、NR5C (0) R8、NR5S (0) mNR5R5、NR5S (0) mR5、NR5S (0) mR8、NR5C (0) C (0) NR5R5、NR5C (0) C (0) NR5R6、P (0) R5R5、P (0) (NR5R5) 2、P (0) (NR5R6) 2、P (0) (NR6R6) 2、或 P (0) (OR5) 2 ；R4 獨立地為 H、滷素、擬滷素、CN、SR5、OR5、OC (0) R5、NR5R5、NR5R6、COOR5、NO2、C (0) R5、C (0) C (0) R5、C (0) NR5R5、S (0) mR5 ,S(O) mNR5R5、NR5C (0) NR5R5、NR5C (O)C(O) R5, NR5C (0) R5、NR5 (C00R5)、 NR5C (0) R8、NR5S (0) mNR5R5、NR5S (0) mR5、NR5S (0) mR8、NR5C (0) C (0) NR5R5、或 NR5C (0) C (0) NR5R6 ；或 任選取代的烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或雜芳烷基；且各個R5、R6和R8獨立地為H或任選取代的烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、芳基、雜芳 基或雜環基，其中所述細胞不以突觸核蛋白運輸受損為特徵。
3.治療患有以蛋白質運輸受損為特徵的病症的受試者的方法，其包括給予受試者有效 量的以如下結構式所表示的化合物或其藥學可接受的鹽其中 m為1或2 ；各個X獨立地為N或CH ； 各個X1獨立地為N、NR3或CH ；R1 禾口 Z 各自獨立地為 R5、C (0) R5、COOR5、C (0) NR5R5 或 S (0) mR5 ； R2 和 R3 各自獨立地為 H、滷素、擬滷素、CN、SR5、R5、OR5、OC (0) R5、NR5R5、NR5R6、COOR5、NO2、 C (0) R5、C (0) C (0) R5、C (0) NR5R5、S (0) mR5、S (0) mNR5R5、NR5C (0) NR5R5、NR5C (0) C (0) R5、NR5C (0) R5、NR5 (C00R5)、NR5C (0) R8、NR5S (0) mNR5R5、NR5S (0) mR5、NR5S (0) mR8、NR5C (0) C (0) NR5R5、NR5C (0) C (0) NR5R6、P (0) R5R5、P (0) (NR5R5) 2、P (0) (NR5R6) 2、P (0) (NR6R6) 2、或 P (0) (OR5) 2 ；R4 獨立地為 H、滷素、擬滷素、CN、SR5、OR5、OC (0) R5、NR5R5、NR5R6、COOR5、NO2、C (0) R5、C (0) C (0) R5、C (0) NR5R5、S (0) mR5 ,S(O) mNR5R5、NR5C (0) NR5R5、NR5C (O)C(O) R5, NR5C (0) R5、NR5 (C00R5)、 NR5C (0) R8、NR5S (0) mNR5R5、NR5S (0) mR5、NR5S (0) mR8、NR5C (0) C (0) NR5R5、或 NR5C (0) C (0) NR5R6 ；或 任選取代的烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或雜芳烷基；且各個R5、R6和R8獨立地為H或任選取代的烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、芳基、雜芳 基或雜環基，其中所述疾病不是突觸核蛋白病。
4.提高細胞內蛋白質運輸的方法，其包括使細胞與有效量的以下結構式所表示的化合 物或其藥學可接受的鹽接觸各個X獨立地為N或CH ； 各個X1獨立地為N、NR3或CH ；R1 禾口 Z 各自獨立地為 R5、C (0) R5、COOR5、C (0) NR5R5 或 S (0) mR5 ； R2 和 R3 各自獨立地為 H、滷素、擬滷素、CN、SR5、R5、OR5、OC (0) R5、NR5R5、NR5R6、COOR5、NO2、 C (0) R5、C (0) C (0) R5、C (0) NR5R5、S (0) mR5、S (0) mNR5R5、NR5C (0) NR5R5、NR5C (0) C (0) R5、NR5C (0) R5、NR5 (C00R5)、NR5C (0) R8、NR5S (0) mNR5R5、NR5S (0) mR5、NR5S (0) mR8、NR5C (0) C (0) NR5R5、NR5C (0) C (0) NR5R6、P (0) R5R5、P (0) (NR5R5) 2、P (0) (NR5R6) 2、P (0) (NR6R6) 2、或 P (0) (OR5) 2 ；R4 獨立地為 H、滷素、擬滷素、CN、SR5、OR5、OC (0) R5、NR5R5、NR5R6、COOR5、NO2、C (0) R5、C (0) C (0) R5、C (0) NR5R5、S (0) mR5 ,S(O) mNR5R5、NR5C (0) NR5R5、NR5C (O)C(O) R5, NR5C (0) R5、NR5 (C00R5)、 NR5C (0) R8、NR5S (0) mNR5R5、NR5S (0) mR5、NR5S (0) mR8、NR5C (0) C (0) NR5R5、或 NR5C (0) C (0) NR5R6 ；或 任選取代的烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或雜芳烷基；且各個R5、R6和R8獨立地為H或任選取代的烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、芳基、雜芳 基或雜環基，所述細胞不以受損的突觸核蛋白運輸為特徵。
5.權利要求1 4中任一項所述的方法，其中所述化合物由以下結構式表示
6.權利要求1 5中任一項所述的方法，其中所述化合物由以下結構式表示
7.權利要求1 6中任一項所述的方法，其中R3選自取代或未取代的烷基、環烷基、芳 基禾口芳燒基。
8.權利要求1 7中任一項所述的方法，其中R2是氫或滷素，或者任選取代的芳基、雜 芳基、芳烷基或芳烯基。
9.權利要求1 8中任一項所述的方法，其中R1和Z各自獨立地選自氫，或者取代或 未取代的烷基、烷基羰基、芳基羰基、芳烷基羰基、商芳基羰基、芳基磺醯基、芳烷基磺醯基 和滷芳基磺醯基。
10.權利要求1 9中任一項所述的方法，其中R1是H，且Z是H。
11.權利要求1 9中任一項所述的方法，其中R1是甲基，且Z是H。
12.權利要求1 11中任一項所述的方法，其中R4是H、烷基、環烷基或烷基環烷基。
13.權利要求1 12中任一項所述的方法，其中所述化合物選自在圖1A、1B、1C、1D、 1E、1F、2、3A、3B、4A、4B、5A、5B、6、7、8A、8B、8C、9A、9B、9C 或 9D 中說明的化合物。
14.權利要求1 4中任一項所述的方法，其中所述化合物由以下結構式之一表示
15.權利要求1 4中任一項所述的方法，其中所述化合物由以下結構式之一表示
16.權利要求14或15所述的方法，其中R1是H。
17.權利要求14或15所述的方法，其中R2為H、滷素、CN、N02、NH2或C1-Cltl烷基，所述C1-Cltl烷基任選被1 3個獨立的下述基 團取代滷素、SR5、OR5、OC (0) R5、NR5R5、COOR5、NO2, CN、C (0) R5、OC (0) NR5R5 或 C (0) NR5R5。
18.權利要求17所述的方法，其中R2為H、F、Cl、Br、CF3>CC13、CN、NO2, NH2或C1-C6烷基。
19.權利要求14或15所述的方法，其中R2是芳基、雜芳基、芳烷基或雜芳烷基，各個均 為以下基團取代H、滷素、SR5、OR5、OC (0) R5、NR5R5, COOR5、NO2、CN、C (0) R5、OC (0) NR5R5、或 C (0) NR5R5 ；或 芳基、C1-C10烷基、或C2-Cltl烯基，所述芳基、C1-C10烷基、或C2-Cltl烯基任選被1 3個 獨立的下述基團取代芳基、滷素、SR5、OR5、OC (0) R5、NR5R5、COOR5、NO2、CN、C (0) R5、OC (0) NR5R5 或 C(O)NR5R5tj
20.權利要求19所述的方法，其中在R2中，任選取代的芳基、雜芳基、芳烷基或雜芳烷 基選自苯基、萘基、苄基、苯基亞乙基、萘基亞甲基、苯氧基亞甲基、萘氧基亞甲基、吡啶基 亞甲基、苯並呋喃基亞甲基、二氫苯並呋喃基亞甲基、苯並二氧雜環戊烯基亞甲基、茚滿基 亞甲基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、苯並噻吩基和苯並呋喃基。
21.權利要求19所述的方法，其中對於R2中芳基、雜芳基、芳烷基或雜芳烷基的任選取 代基是H、F、Cl、Br、OH、C1-C6 烷氧基、氨基、C1-C6 烷基氨基、C00H、COO-C1-C6 烷基、NO2, CN、或 C(O)-C1-C6 烷基；或C1-C6烷基、C2-C6烯基、或芳基，所述C1-C6烷基、C2-C6烯基、或芳基任選被苯基、F、Cl、 Br、C1-C6 烷氧基、C00H、COO-C1-C6 烷基、NO2 或 CN 取代。
22.權利要求19所述的方法，其中R3是H、C3-C10環烷基或C2-Cltl炔基；或C「C1(1烷基或C2-Cltl烯基，各個任選被1 3個下述基團取代商素丄&、3鏟、(《5、0((0) R5、NR5R5, COOR5, NO2, CN、C (0) R5、OC (0) NR5R5 或 C (0) NR5R5。
23.權利要求19所述的方法，其中R3為H或C1-C8烷基，其任選為1 3個下述基團取代滷素、0R5、NR5R5、C00R5、C(0)R5、C(0) NR5R5、C2-C6烯基、或C2-C6炔基；或環丙基、環丙基甲基、環丁基、環丁基甲基、環戊基、環戊基甲基、環己基或環己基甲基。
24.權利要求17所述的方法，其中R3是芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、雜環基或雜環 基烷基，各個均為以下基團取代H、烷基、滷素、OR5、OC (0) R5、NR5R5、COOR5、NO2, CN、C (0) R5、OC (0) NR5R5 或 C (0) NR5R5 ；或任選取代的芳基、雜芳基或雜環基。
25.權利要求24所述的方法，其中通過R3表示的芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、雜環 基或雜環基烷基選自苄基、吡啶基、吡啶基亞甲基、呋喃基、噻吩基、四氫呋喃基或四氫噻吩基。
26.權利要求25所述的方法，其中由R3表示的芳基、雜芳基、芳烷基或雜芳烷基、雜環 基或雜環基烷基的取代基是H、F、Cl、Br、SR5、OR5、NR5R5、COOR5、NO2, CN、C(0) R5 ；或C1-C6烷基、C2-C6烯基或芳基，所述C1-C6烷基、C2-C6烯基或芳基任選被苯基、F、Cl、Br、 SR5、OR5、COOR5、NO2 或 CN 取代。
27.權利要求1 17中任一項所述的方法，其中R4獨立地為芳基；雜芳基K1-Cltl烷基 或C2-Cltl烯基，各個基團任選獨立地被1-3個下述基團取代芳基或雜芳基；C2-C1(I炔基；商 素；滷代烷基；CF3 ； SR5 ；OR5 ；OC (O)R5 ；NR5R5 ；NR5R6 ；COOR5 ；NO2 ；CN ；C (O)R5 ；C (O)C(O) R5 ；C(O) NR5R5 ； S(O) mR5 ； S(O) mNR5R5 ；NR5C (0) NR5R5 ；NR5C (0) C (0) R5 ； NR5C (0) R5 ； NR5 (C00R5) ；NR5C (0) R8 ； NR5S (0) mNR5R5 ；NR5S (0) mR5 ；NR5S (0) mR8 ；NR5C (0) C (0) NR5R5 ；或 NR5C (0) C (0) NR5R6。
28.權利要求27所述的方法，其中R4是H、OR5、OC (0) R5、NR5R5、COOR5、NO2, CN、C (0) R5、C (0) C (0) R5 或 C (0) NR5R5 ；或C1-C10烷基，其任選被1 3個下述基團取代滷素、OR5、OC(O)R5、NR5R5、COOR5、NO2、CN、 C (0) R5、OC (0) NR5R5 或 C (0) NR5R5。
29.權利要求27所述的方法，其中R4是H、CF3> CCl3、氨基、C1-C6 烷氧基、C00H、COO-C1-C6 烷基、OC(O) -C1-C6 烷基、苯氧基或烷 基苯氧基；或C1-C6烷基，其任選被下述基團取代氨基、COOHjOO-C1-C6烷基或OC(0)-C1-C6烷基、或 1 2個(^-(6烷氧基。
30.權利要求27所述的方法，其中R4是任選取代的芳基、芳烷基、雜芳基或雜芳烷基，其中在 R4 中任選的取代基是滷素、CF3> SR5、OR5、OC(O) R5, NR5R5、COOR5、NO2, CN、C(O) R5, OC (0) NR5R5、C (0) NR5R5、N (R5) C (0) R5、N (R5) (C00R5)、或 S (0) mNR5R5。
31.權利要求30所述的方法，其中由R4表示的芳基、芳烷基、雜芳基和雜芳烷基選自 苯基、苄基、批啶基、批啶基亞甲基、呋喃基、呋喃基亞甲基、噻吩基、噻吩基亞甲基、批唑基 和吡唑基亞甲基。
32.權利要求30所述的方法，其中由R4表示的芳基、芳烷基、雜芳基或雜芳烷基的任選 取代基是F、Cl、0H、氨基、NO2, C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、苯氧基、或烷基苯氧基；或苯基、咪唑基或嗎啉代，其任選被下述基團取代F、C1、氨基、NOyC1-C6烷氧基、或C1-C6焼基。
33.權利要求1 4中任一項所述的方法，其中所述化合物選自在表I中鑑別的化合物。
34.由下述結構式表示的化合物或其藥學可接受的鹽其中 m為1或2 ；各個X和X1獨立地為N、CH或C (C1-C4烷基)；R1 和 Z 各自獨立地為 H、R5、C(O)R6, COOR5、C(O)NR6R6 或 S(O)mR5 ；或 NR1Z 整體為 N = CH-NR5R5 ；R2 為 SR9、OR5、OC (0) R5、NR5R5、NR5R6、COOR5、C (0) R5、C (0) H、C (0) C (0) R5、C (0) NR5R5、C (0) NR5R6、C (0) NR6R6、S (0) mR9、S (0) mNR5R5、S (0) mNR5R6、NR5C (0) NR5R5、NR6C (0) NR6R6、NR5C (0) C (0) R5、NR5C (0) C (0) R5、NR5C (0) R5、NR6C (0) R5、NR5 (C00R5)、NR6 (C00R5)、NR5C (0) R8、NR6C (0) R8、 NR5S (O)mNR5R5、NR6S (O)mNR6R6、NR5S(O)mR5, NR6S(O)mR5, NR5S (O)mR8, NR6S(O)mR8, NR5C(O)C(O) NR5R5、NR6C (0) C (0) NR5R6、或 NR5C (0) C (0) NR5R6 ；R3 為 Rici、COOR5、C(O) R5, C(O)C(O) R5, C(O) NR5R5、C(O) NR5R6、C(O) NR6R6、S(O)mR5, S(O) mNR5R5 ,S(O) mNR5R6、P (0) R5R5、P (0) (NR5R5) 2、P (0) (NR5R6) 2、P (0) (NR6R6) 2、或 P (0) (OR5) 2 ；R4 為 H、滷素、擬滷素、CN、SR5、OR5、OC(O) R5、NR5R5, NR5R6, C00R5, N02、C(O) R5、C(O)C(O) R5、C (0) NR5R5、C (0) NR5R6、C (0) NR6R6、S (0) mR5、S (0) mNR5R5、S (0) mNR5R6、NR5C (0) NR5R5、NR6C (0) NR6R6、NR5C (0) C (0) R5、NR5C (0) C (0) R5、NR5C (0) R5、NR6C (0) R5、NR5 (C00R5)、NR6 (C00R5)、NR5C (0) R8、NR6C (0) R8、NR5S (0) mNR5R5、NR6S (0) mNR6R6、NR5S (0) mR5、NR6S (0) mR5、NR5S (0) mR8、NR6S (0) mR8、 NR5C (0) C (0) NR5R5、NR6C (0) C (0) NR5R6、或 NR5C (0) C (0) NR5R6、NR6C (0) C (0) NR5R6、或 NR5C (0) C(O) NR5R6、或任選取代的烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或雜芳烷基；及各個R5獨立地為任選取代的烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、芳基、雜芳基或雜環基， 各個R6和R8獨立地為H或任選取代的烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、芳基、雜芳基 或雜環基，各個R9獨立地為任選取代的含有兩個或更多個碳的烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、 芳基、雜芳基或雜環基，各個Rltl獨立地為任選取代的烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、芳基、雜芳基或雜環 基，不包括任選取代的二氫呋喃-2-基和四氫呋喃-2-基； 其中當R2是C(O) R5時，R3不是甲基、2-丙基、環戊基或4-哌啶基； 當各個X和X1是N並且R3是CH3時，R4不是N(CH3)2或S-烷基； 當Z、R1和R4為H時; 各個X和X1為N ；R2是被下述基團取代的CO 甲基、苯基、4-溴苯基、4-氯苯基、4-氯苯基、萘-2-基、 (3-甲基-5-苯基)噻唑-2-基、4-(哌啶-1-基磺醯基)苯基、噻吩-2-基、或苯並噻 唑-2-基時，則R3不是苯基、4-氯苯基或4-甲基苯基； R2是CONH2時，則R3不是甲基、苯基或CH2OCH2CH2OH ； R2是烷氧基時，則R3不是叔丁基； 各個X是N A1是CH ；R2是被以下基團在間位取代的苯甲醯基NH2、NHSO2 -(氯取代的苯基)、NHSO2 -噻 吩-2-基、NHCONH-(滷素或甲基取代的苯基)、NHCONH-(甲基苄基)、NHCONH-環己基、或 NHCO-(氯代苯基)時；則R3不是CH2-環丙基；R3是CH2O-苄基、CH2O-烷基、烷基或烯基，其任選被以下基團取代羥基、烷氧基、羥基 烷基或羥基烷氧基；或任選取代的芳烷基時；則R2不是CONH2 ；R2是被以下基團取代的S-苯基NH2、NC(O)O-叔丁基、NC (O)NH-(2-氟苯基)、 NS (O)2-(單或二氟苯基)時；則R3不是環戊基； 各個X和X1是CH ；R3是2-(嗎啉-1-基)亞乙基時；則R2不是CO-四甲基環丙烷； R3是甲基時，則R2不是COH或羧基；各個X是N，X1是N或CH，並且R3是4- (4-甲基-哌嗪-1-基)環己基、4- (N-嗎啉基) 環己基或苯基時，則R2不是CONH-(任選取代的苯基)或N(任選取代的苯基)C(O)(苯基 或烷基苯基)；當各個X和X1為N，R4為H或苯基，Z為H或任選取代的苯基，R1為H，且R2為NH-(吡 啶基或任選取代的苯基)時，R3不是甲基、羥基烷基、苄基或6-對甲苯基噠嗪-3-基。
35.權利要求34所述的化合物，其中所述化合物以下述結構式表示
36.權利要求34所述的化合物，其中所述化合物以下述結構式表示
37.權利要求34所述的化合物，其中所述化合物以下述結構式表示
38.權利要求34所述的化合物，其中所述化合物以下述結構式表示
39.權利要求34所述的化合物，其中所述化合物以下述結構式表示
40.權利要求34所述的化合物，其中所述化合物以下述結構式之一表示 NR1Z R2 NR1Z r2 NH2 r2
41.權利要求34所述的化合物，其中所述化合物以下述結構式之一表示
42.權利要求34 41中任一項所述的化合物，其中R2為SR9、OR3、OC(O)R5、NR5R5、NR5R6、 COOR5, C(O) H、C(O)C(O) R5, C(O) NR5R5, C(O) NR5R6, S(O)mR9, S(O)mNR5R5, S(O)mNR5R6, NR5C(O) NR5R5、NR6C (0) NR6R6、NR5C (0) C (0) R5、NR5C (0) C (0) R5、NR5C (0) R5、NR6C (0) R5、NR5 (C00R5)、 NR6(O)OR5)、NR5C(O) R8、NR6C(O) R8、NR5S (0) mNR5R5、NR6S(O)mNR6R6, NR5S (O)mR5、NR6S (O)mR5、 NR5S (0) mR8、NR6S (0) mR8、NR5C (0) C (0) NR5R5、NR6C (0) C (0) NR5R6、或 NR5C (0) C (0) NR5R6。
43.權利要求34 41中任一項所述的化合物，其中R2為SR9、OR5、OC(O)R5、NR5R5、 NR5R6, COOR5, C(O) H、C(O)C(O) R5, S(0)mR9、S(O)mNR5R5, S(0)mNR5R6、NR5C(O) NR5R5, NR6C(O) NR6R6、NR5C (0) C (0) R5、NR5C (0) C (0) R5、NR5C (0) R5、NR6C (0) R5、NR5 (C00R5)、NR6 (C00R5)、NR5C (0) R8、NR6C (0) R8、NR5S (0) mNR5R5、NR6S (0) mNR6R6、NR5S (0) mR5、NR6S (0) mR5、NR5S (0) mR8、NR6S (0) mR8、 NR5C (0) C (0) NR5R5、NR6C (0) C (0) NR5R6、或 NR5C (0) C (0) NR5R6。
44.權利要求34 41中任一項所述的化合物，其中R2獨立地為NR5R5、NR5R6,NR5C(O) NR5R5、NR6C (0) NR6R6、NR5C (0) C (0) R5、NR5C (0) C (0) R5、NR5C (0) R5、NR6C (0) R5、NR5 (C00R5)、 NR6(O)OR5)、NR5C(O) R8、NR6C(O) R8、NR5S (0) mNR5R5、NR6S(O)mNR6R6, NR5S (O)mR5、NR6S (O)mR5、 NR5S (0) mR8、NR6S (0) mR8、NR5C (0) C (0) NR5R5、NR6C (0) C (0) NR5R6、或 NR5C (0) C (0) NR5R6。
45.權利要求34 41中任一項所述的化合物，其中R2是0R5。
46.權利要求45所述的化合物，其中R5是任選取代的芳基或雜芳基。
47.權利要求45所述的化合物，其中R5是任選取代的烷基、環烷基或雜烷基。
48.權利要求34 41中任一項所述的化合物，其中R2是SR9。
49.權利要求48所述的化合物，其中R9是任選取代的芳基或雜芳基。
50.權利要求49所述的化合物，其中R9是任選取代的環烷基、雜烷基或具有2個或更 多個碳的烷基。
51.權利要求34 41中任一項所述的化合物，其中R2是NR5R5或NR5R6。
52.權利要求51所述的化合物，其中R5是任選取代的芳基或雜芳基。
53.權利要求51所述的化合物，其中R5是任選取代的烷基、環烷基或雜烷基。
54.權利要求34 41中任一項所述的化合物，其中R2是S(O)mR9、S(O)fflNR5R5^S(O) mNR5R6。
55.權利要求54所述的化合物，其中R5是任選取代的芳基或雜芳基。
56.權利要求54所述的化合物，其中R5是任選取代的烷基、環烷基或雜烷基。
57.權利要求54所述的化合物，其中R9是任選取代的芳基或雜芳基。
58.權利要求54所述的化合物，其中R9是任選取代的環烷基、雜烷基或具有2個或更 多個碳的烷基。
59.在圖2、3A、4A、5A、5B、6、或7中的任一幅所說明的化合物。
60.治療以蛋白質運輸受損為特徵的病症的方法，包括給予受試者權利要求的34 59 中任一項所述的化合物，或使細胞與權利要求的34 59中任一項所述的化合物接觸。
61.權利要求1 33或60中任一項所述的方法，其中所述病症是溶酶體貯積症。
62.權利要求61所述的方法，其中所述溶酶體貯積症為法布裡病、法韋爾病、戈謝病、 GM1-神經節苷脂貯積病、泰-薩克斯病、桑德霍夫病、GM2激活劑病、克拉伯病、異染性腦白質 營養不良、尼曼_皮克二氏病(A、B和C型)、胡爾勒病、沙伊病、亨特病、桑菲列普病、莫爾 丘病、馬_拉病、透明質酸酶缺乏症、天冬氨醯葡糖胺尿症、巖藻糖苷貯積症、甘露糖苷貯積 症、欣德勒病、1型唾液酸貯積症、蓬佩病、緻密性成骨不全症、蠟樣脂褐質沉積症、膽固醇酯 貯積症、沃爾曼病、多種硫酸酯酶缺乏症、半乳糖涎酸貯積症、粘多糖症(Π、ΙΙΙ和IV型)、 胱氨酸貯積症、唾液酸貯積症、伴隨馬_舍症候群的乳糜微粒滯留病、赫曼斯基_普德拉克 症候群、切-東二氏症候群、Danon病或Geleophysic發育不良。
63.權利要求1 33或60中任一項所述的方法，其中所述病症的特徵在於物質向細胞 腔隙的遞送受損。
64.權利要求1 33或60中任一項所述的方法，其中所述病症的特徵在於Rab27a突 變或Rab27a的缺陷。
65.權利要求64所述的方法，其中所述病症是格裡塞利症候群。
66.權利要求1 33或60中任一項所述的方法，其中所述病症是囊性纖維化。
67.權利要求1 33或60中任一項所述的方法，其中所述病症是以蛋白質運輸受損為 特徵的囊性纖維化。
68.權利要求1 33或60中任一項所述的方法，其中所述病症是以囊性纖維化跨膜傳 導調節蛋白(CFTR)活性受損為特徵的囊性纖維化。
69.權利要求1 33或60中任一項所述的方法，其中所述病症是以蛋白質運輸受損和 囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)活性受損為特徵的囊性纖維化。
70.權利要求1 33或60中任一項所述的方法，其中所述病症是糖尿病類疾病。
71.權利要求70所述的方法，其中所述糖尿病類疾病是糖尿病。
72.權利要求1 33或60中任一項所述的方法，其中所述病症為遺傳性肺氣腫 (α -1-抗胰蛋白酶缺乏症)、遺傳性血色素沉著病、眼皮膚白化病、蛋白質C缺乏、I型遺傳 性血管性水腫、先天性蔗糖酶異麥芽糖酶缺乏、II型克-納症候群、拉龍症候群、遺傳性髓 過氧物酶、原發性甲狀腺機能減退症、先天性長QT症候群、甲狀腺素結合的球蛋白缺乏、家 族性高膽固醇血症、家族性乳糜微粒血症、無脂蛋白血症、低血漿脂蛋白a水平、伴有 肝受損的遺傳性肺氣腫、先天性甲狀腺功能減退症、成骨不全、遺傳性低纖維蛋白原血症、 α -1-抗糜蛋白酶缺乏症、腎性尿崩症、垂體神經性尿崩症、夏科_馬裡-圖思症候群、佩利 措伊斯_梅茨巴赫病、HA型馮·威利布蘭德病、結合因子V和VIII缺乏、脊椎骨骺遲緩性 發育不良、無脈絡膜症、I細胞病、巴藤病、共濟失調-毛細血管擴張症、急性成淋巴細胞性 白血病、急性髓細胞樣白血病、髓細胞性白血病、ADPKD-常染色體顯性多囊性腎病、微絨毛 包含病、結節性硬化症、洛氏眼-腦-腎症候群、肌萎縮側索硬化、骨髓增生異常症候群、裸淋巴細胞症候群、丹吉爾病、家族性肝內膽汁淤積、X-連鎖腎上腺腦白質營養不良、斯科特 症候群、1型和2型赫曼斯基_普德拉克症候群、澤耳韋格症候群、肢近端型點狀軟骨發育 異常、常染色體隱性原發性高草酸尿症、Mohr Tranebjaerg症候群、脊髓延髓性肌萎縮症、 原發性纖毛運動障礙(卡塔格納症候群)、米_迪症候群、無腦回畸形病、運動神經元病、烏 斯赫爾症候群、威斯科特_奧爾德裡奇二氏症候群、Optiz症候群、亨廷頓舞蹈病、遺傳性胰 腺炎、抗磷脂症候群、重疊結締組織病、舍格倫症候群、僵體症候群、Brugada症候群、費氏先 天性腎症候群、杜賓-詹森症候群、X-連鎖低磷血症、潘德雷德症候群、持續性幼兒型胰 島素過度分泌低血糖症、遺傳性球形紅細胞增多症、無銅藍蛋白血症、嬰兒型神經元蠟樣質 脂褐質沉積病、假性軟骨發育不全和多重骨骺、斯塔加特樣黃斑營養不良、X-連鎖夏科-馬 裡_圖思病、常染色體顯性色素性視網膜炎、Wolcott-Rallison症候群、庫欣病、肢帶型肌 營養不良症、IV型粘多糖病、芬蘭型遺傳性家族性澱粉樣變性、IV型糖原貯積症、肉瘤、慢 性骨髓單核細胞性白血病、心肌病、面生殖發育異常、Torsion病、亨廷頓和脊髓小腦性共 濟失調、遺傳性高同型半胱氨酸血症、多發性神經病、下位運動神經元病、色素視網膜炎、血 清陰性多關節炎、間質性肺纖維化、雷諾現象、韋格納肉芽腫病、蛋白尿、CDG-Ia, CDG-Ib, CDG-Ic, CDG-IcU CDG-Ie, CDG-If、CDG-IIa, CDG-IIb, CDG-IIc, CDG-IIcU埃勒斯-當洛斯綜 合徵、多發性外生骨疣、格裡塞利症候群(1型或2型)或X-連鎖非特異性智力發育遲緩。
73.治療以蛋白質運輸受損為特徵的病症的方法，包括給予受試者以圖3B、4B、8A、8B、 8C、9A、9B、9C、或9D中任一幅所表示的化合物或其藥學可接受的鹽或衍生物，或使細胞與 圖3B、4B、8A、8B、8C、9A、9B、9C、或9D中任一幅所表示的化合物或其藥學可接受的鹽或衍生 物接觸。
74.權利要求63或73所述的方法，其中所述病症為突觸核蛋白病。
75.權利要求74所述的方法，其中所述突觸核蛋白病是帕金森氏病、家族性帕金森氏 病、路易體疾病、阿爾茨海默病路易體變異型、路易體痴呆、多系統萎縮症或關島震顫麻痺 痴呆症候群。
76.權利要求1 33或63 75中任一項所述的方法，其中所述受試者是人。
77.權利要求1 59中任一項所說明的化合物在製備用於治療蛋白質運輸病症的藥物 中的用途，其中所述病症不是突觸核蛋白病。
78.權利要求34 59或73中任一項所述的化合物在製備用於治療蛋白質運輸病症的 藥物中的用途。
79.蛋白質的製備方法，該方法包括在權利要求1 59、73或86中任一項所述的化合物存在時培養細胞；及純化由細胞產生的蛋白，其中與所述化合物不存在時培養細胞相比，在所述化合物存在時培養細胞會得到較高 產率的純化蛋白。
80.權利要求79所述的方法，其中所述蛋白質是由異源核酸編碼的重組蛋白質。
81.權利要求79或80所述的方法，其中所述蛋白質是分泌性蛋白質。
82.權利要求79 81中任一項所述的方法，其中所述蛋白質是糖基化蛋白。
83.權利要求79 82中任一項所述的方法，其中所述蛋白質是細胞因子、淋巴因子、生 長因子或抗體。
84.權利要求79 84中任一項所述的方法，其中所述細胞是昆蟲細胞、哺乳動物細胞、 真菌細胞或細菌細胞。
85.權利要求84所述的方法，其中所述細胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
86.由下述結構式表示的化合物或其藥學可接受的鹽 其中m為1或2 ；各個X獨立地表示N、CH或C (C1-C4烷基)；各個X1獨立地表示N、NR3, CH或C (C1-C4烷基)；R1 和 Z 各自獨立地為 R5、C (0) R5、COOR5、C (0) NR5R5 或 S (0) mR5 ；或 NR1Z 整體為 N = CH-NR5R5 ；R2為N3-取代的烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、芳基、雜芳基或雜環基，其可任選被 進一步取代；R3 獨立地為 H、滷素、擬滷素、CN、SR5、R5、OR5、0C(0)R5、NR5R5、NR5R6、COOR5、NO2, C(O) R5、C(O)C(O) R5, C(O) NR5R5、S(O)mR5, S (O)mNR5R5、NR5C (0) NR5R5、NR5C (O)C(O) R5, NR5C(O) R5、 NR5 (C00R5)、NR5C (0) R8、NR5S (0) mNR5R5、NR5S (0) mR5、NR5S (0) mR8、NR5C (0) C (0) NR5R5、NR5C (0) C (0) NR5R6、P (0) R5R5、P (0) (NR5R5) 2、P (0) (NR5R6) 2、P (0) (NR6R6) 2、或 P (0) (OR5) 2 ；R4 獨立地為 H、滷素、擬滷素、CN、SR5、OR5、OC (0) R5、NR5R5、NR5R6、COOR5、NO2、C (0) R5、C (0) C (0) R5、C (0) NR5R5、S (0) mR5 ,S(O) mNR5R5、NR5C (0) NR5R5、NR5C (O)C(O) R5, NR5C (0) R5、NR5 (C00R5)、 NR5C (0) R8、NR5S (0) mNR5R5、NR5S (0) mR5、NR5S (0) mR8、NR5C (0) C (0) NR5R5、或 NR5C (0) C (0) NR5R6 ；或 任選取代的烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或雜芳烷基；且各個R5、R6和R8獨立地為H或任選被取代的烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、芳基、雜 芳基或雜環基。
87.藥物組合物，其包含權利要求34 59或86中任一項所述的化合物和藥學可接受 的鹽。
全文摘要
本發明提供了治療或改善一種或多種以蛋白質運輸受損為特徵的病症的化合物和組合物。還提供了以蛋白質運輸受損為特徵的病症的治療方法，其包括給予受試者以式I的化合物或其藥學可接受的鹽或衍生物，或使細胞與式I的化合物或其藥學可接受的鹽或衍生物接觸。
文檔編號C07D487/04GK101917999SQ200880124202
公開日2010年12月15日 申請日期2008年11月7日 優先權日2007年11月7日
發明者丹·艾爾鮑姆, 克裡斯琴·E·布拉瓦, 麥可·德維特 申請人:弗爾德裡克斯製藥股份有限公司