生物生產類胡蘿蔔素的改良方法及其所用的生物材料的製作方法

2023-07-22 04:56:51 2

專利名稱：生物生產類胡蘿蔔素的改良方法及其所用的生物材料的製作方法
技術領域：
本發明涉及製備類胡蘿蔔素的分子生物學和用於製備類胡蘿蔔素的生物材料。
已知蝦青素分布於多種生物體中，例如動物(如火烈鳥和朱繯等鳥類和如虹鱒魚和鮭魚等魚類)，藻類和微生物。據認為蝦青素具有較強的針對活性氧類的抗氧化特性，這一特性有望應用於藥物以保護活細胞使其免受一些疾病(如癌症)的侵害。另外，從工業應用的角度出發，將蝦青素用作著色劑的需求日漸增加，在養魚(如鮭魚)業中尤其如此，因為蝦青素使動物變成與眾不同的桔紅色，在市場上更能引起消費者的注意。
已知Phaffia rhodozyma是一種可產生胡蘿蔔素的酵母菌株，它可以特異性地產生蝦青素。與其它產胡蘿蔔素的酵母，即紅酵母屬不同的是，Phaffiarhodozyma (P.rhodozyma)可以發酵一些糖類，如D-葡萄糖。從工業應用的角度出發，這是一個重要的特徵。最近的分類學研究發現Phaffia rhodozyma具有有性繁殖並且其有性形態(telemorphic state)被命名為Xanthophyllomycesdendrorhous(W.I.Golubev；酵母11，101-110，1995)。已進行了一些菌株改良研究，旨在從P.rhodozyma中獲得蝦青素超級生產菌株，但近十年來此類研究僅局限於利用常規的誘變法和原生質體融合。最近，Wery等人使用P.rhodozyma開發了一種宿主載體系統，其中多拷貝的非-複製型質粒被整合至P.rhodozyma基因組中的核糖體DNA基因座上(Wery等，基因，184，89-97，1997)。據Verdoes等報導，他們進一步改良了載體，得到P.rhodozyma轉化子及其3個產胡蘿蔔素基因，所述基因編碼催化香葉基香葉基焦磷酸轉變為β-胡蘿蔔素之反應的酶(國際專利申請WO97/23633)。在不遠的將來，基因工程方法對P.rhodozyma菌株改良研究的重要性將會增加，從而突破通過常規方法達到的生產能力。
很多研究人員推測蝦青素在P.rhodozyma中可能作為抗氧化劑起作用，因為它是在生長的呼吸期而不是發酵期經刺激而產生的。通常，活性氧類趨於在呼吸期內產生，這是由泛醌庫的還原速度和呼吸鏈下遊電子轉移之間的電子轉移失衡所導致的呼吸鏈電子溢流引起的。在此推測中，蝦青素可能會與活生物體中超氧化物歧化酶所作的那樣，淬滅這些活性氧類。
據Schroeder等報導，當刺激產生蝦青素時，處於生長後期的Phaffiarhodozyma呼吸鏈由KCN-敏感型呼吸轉變為KCN-抗性呼吸(生物化學雜誌，270，18374-18379，1995)。KCN-敏感型呼吸鏈是常見的電子轉移鏈，其中泛醌庫內的電子經由分布於多種生物體中的複合物III轉移至複合物IV上。已知此呼吸鏈受KCN或抗黴素A的抑制。另一方面，KCN-抗性呼吸鏈分布於植物和真菌中。在此呼吸鏈中，被稱為選擇性(alternative)氧化酶(AOX)的線粒體膜蛋白在通過使用氧分子作為受體，將泛醌庫內的電子轉移至H2O分子的過程中起著主要作用。已知正丙基沒食子酸(n-PG)或水楊基羥肟酸(SHAM)可抑制AOX活性。
在鑑定Phaffia rhodozyma中的抗黴素-敏感型蝦青素超級生產菌株的研究中，An等人推測這種突變體能產生更多的蝦青素以淬滅可能由電子轉移鏈溢流電子所產生的活性氧類(應用環境微生物學，55，116-124，1989)。
本發明是基於下列假定產生的，即在電子轉移鏈處於還原態的條件下，蝦青素的生物合成可能被上調。所述還原態可以通過加入特異性抑制劑來誘導，所述抑制劑如抗黴素A，KCN，n-PG或SHAM。所述還原態也可以通過一些能導致電子轉移失衡的突變來誘導。
根據本發明，得到了具有SHAM抗性的突變體。與其親代菌株相比，所述突變體的蝦青素生產能力增加了50％。
本發明包括克隆一種基因，所述基因編碼Phaffia rhodozyma中的選擇性(alternative)氧化酶。本發明還包括在適當宿主生物體，如大腸桿菌或釀酒酵母中表達上述基因，然後進行酶鑑定。可使用如此克隆的基因，通過定點誘變啟動子序列或使用反義法來降低適當宿主，如P.rhodozyma中的AOX活性。通過在適當培養條件下，在適當培養基中培養這種轉化子可證實它們對胡蘿蔔素生成的影響。
本發明提供了一種生產類胡蘿蔔素的新方法，所述方法包括培養一種生物體，其可通過在誘導選擇性(alternative)氧化酶活性降低的條件下處理可生產類胡蘿蔔素的親代生物體而得到，並選擇類胡蘿蔔素生產能力增加的生物體。本發明方法中所用的生物體可以是藉助於改變對選擇性(alternative)氧化酶抑制劑的抗性而使類胡蘿蔔素生產能力增加的突變菌株。所述生物體可以是抗選擇性(alternative)氧化酶抑制劑的突變體。根據本發明的方法可以通過使用原生生物界或真菌界的生物體來實現，更優選使用聚球藍細菌屬(Synechococcus)，集胞藍細菌屬(Synechocystis)，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，鏈孢黴屬，紅酵母屬，布拉黴屬或須黴屬，其中最優選的生物體是Phaffia rhodozyma和Xanthophyllomyces dendrorhous的菌株。
可用於本發明的選擇性(alternative)氧化酶的抑制劑可選自正丙基沒食子酸或水楊基羥肟酸。
本發明還提供了建立突變菌株的方法，所述突變菌株相對於親代生物體而言能生產出水平有所增加的類胡蘿蔔素，所述方法包括在降低選擇性(alternative)氧化酶活性的條件下培養可生產類胡蘿蔔素的生物體，並選擇類胡蘿蔔素生產水平比所述親代生物體高的生物體。所述的降低選擇性(alternative)氧化酶活性的條件包括選擇性(alternative)氧化酶抑制劑的存在。用於此目的的選擇性(alternative)氧化酶抑制劑可選自正丙基沒食子酸或水楊基羥肟酸。本發明的突變菌株生物體屬於原生生物界或真菌界，更優選為聚球藍細菌屬，集胞藍細菌屬，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，鏈孢黴屬，紅酵母屬，布拉黴屬或須黴屬，其中最優選的生物體是Phaffia rhodozyma和Xanthophyllomyces dendrorhous的菌株。
另一方面，本發明還涉及可通過上述方法得到的，相對於親代生物體而言能產生水平有所增加的類胡蘿蔔素的生物體的突變菌株。更具體地，所述突變體的特徵在於它們甚至在含有0.3至0.45mg/ml SHAM的培養基中也能以類似於在不含SHAM的培養基中的生長速率生長。
在本發明的一個實施方案中，提供了SHAM-抗性突變體，這些突變體衍生自Phaffia rhodozyma ATCC96594。已於2000年4月3日將這些SHAM-抗性突變體保藏於DSMZ(德國微生物和細胞培養物保藏中心，MascheroderWeg 1b，D-38124 Braunschweig，德國)，保藏號分別為DSM13429，DSM13430和DSM13431。
本發明方法中所用的生物體可以是重組生物體，與親代生物體相比，該重組生物體中的上述選擇性(alternative)氧化酶的基因表達經改變後降低了效力。本發明還提供了相對於宿主生物體而言能產生水平有所增加的類胡蘿蔔素的重組生物體，其特徵在於與該宿主生物體相比，該重組生物體中選擇性(alternative)氧化酶的基因表達經改變後降低了效力。可藉助於選自反義技術，定點誘變，化學誘變等的技術改變這種生物體中選擇性(alternative)氧化酶的基因表達。用於此目的的生物體屬於原生生物界或真菌界，更優選為聚球藍細菌屬，集胞藍細菌屬，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，鏈孢黴屬，紅酵母屬，布拉黴屬或須黴屬，其中最優選的生物體是Phaffia rhodozyma和Xanthophyllomyces dendrorhous的菌株，尤其是上述的保藏菌株。
本發明還提供了重組DNA序列，該序列編碼衍生自能產生類胡蘿蔔素之生物體的選擇性(alternative)氧化酶。重組DNA可得自屬於原生生物界或真菌界的生物體，更優選為聚球藍細菌屬，集胞藍細菌屬，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，鏈孢黴屬，紅酵母屬，布拉黴屬或須黴屬，其中最優選的生物體是Phaffia rhodozyma和Xanthophyllomycesdendrorhous的菌株，尤其是上述的保藏菌株。本發明的重組DNA序列可以是由SEQ ID NO2鑑定的序列，或者是與SEQ ID NO2的同一性高於55％，更優選高於75％，最優選高於95％的序列。
更具體地，所述重組DNA序列的特徵在於(a)它編碼具有SEQ ID NO1所述胺基酸序列的所述酶，或(b)它編碼所述酶的變體，所述酶變體選自(i)等位基因變體，和(ii)具有一個或多個胺基酸添加，插入，缺失和/或取代並具有所述酶活性的酶。上述特別說明的分離的DNA序列可衍生自Phaffiarhodozyma的基因，該DNA序列可選自(i)SEQ ID NO2所示的DNA序列，(ii)SEQ ID NO2所示DNA序列的同類編碼或等位基因變體，和(iii)SEQ IDNO2所示DNA序列的衍生物，其中添加，插入，缺失和/或取代了一個或多個核苷酸，但仍編碼具有所述酶活性的多肽。
本發明還提供了所述重組DNA轉化宿主生物體的用途。重組DNA的適當形式可以是載體。通過使用重組DNA得到的重組生物體能降低選擇性(alternative)氧化酶的酶活性。被重組DNA轉化的宿主生物體可用於改良類胡蘿蔔素，尤其是蝦青素的生產方法。因此，本發明也提供了這種重組生物體。
另外，本發明提供了用生物學方法生產類胡蘿蔔素的方法，所述方法包括將上述重組DNA導入適當宿主生物體，並培養所得的重組生物體。因此，本發明的一個方面是生產類胡蘿蔔素的方法，其特徵在於在有利於生產類胡蘿蔔素的條件下培養上述重組生物體。該方法可用於生物生產蝦青素。


圖1示出了P.rhodozyma呼吸鏈的工作模型。
如上所述，很多研究人員推測蝦青素在Phaffia rhodozyma中可能作為抗氧化劑起作用，因為它是在生長的需氧呼吸期而不是發酵期經刺激而產生的。通常，活性氧類趨於在該呼吸期內產生，這是由泛醌庫的還原速度和呼吸鏈下遊電子轉移之間的電子轉移失衡所導致的呼吸鏈電子溢流引起的(圖1)。在此推測中，蝦青素可能會與超氧化物歧化酶所作的那樣，淬滅這些活性氧類。
根據此推測，通過抑制Phaffia rhodozyma中的呼吸鏈即可過量產生蝦青素。實際上，An等人從Phaffia rhodozyma中分離出一些突變體，這些突變體的KCN-敏感型呼吸被阻斷，並能產生更多的蝦青素(應用環境微生物學，55，116-124，1989)。
另一方面，據Schroeder等報導，當刺激蝦青素的生產時，處於生長後期的Phaffia rhodozyma的呼吸鏈由KCN-敏感型呼吸轉變為KCN-抗性呼吸(生物化學雜誌，270，18374-18379，1995)。在此上下文中，由選擇性(alternative)氧化酶介導的KCN-抗性呼吸可能會對蝦青素生產期的呼吸產生更大的影響。抑制選擇性(alternative)氧化酶可能會導致蝦青素的過量產生。
為了檢查特異性抑制呼吸活性對Phaffia rhodozyma的蝦青素生產的影響，可以在生長瓊脂培養基中加入連續稀釋的SHAM(已知SHAM能抑制選擇性(alternative)氧化酶)。在研究過程中，出現了幾個自發突變體，它們甚至在含有0.3至0.45mg/ml SHAM的培養基中也能顯示出類似於在不含SHAM的培養基中的生長活性。令人驚奇的是，這種突變體生產出的蝦青素比其親代高50％。運表明一些導致蝦青素過量產生的突變可能通過呼吸鏈還原態補償了生長抑制，所述還原態可能是由選擇性(alternative)氧化酶活性的降低引起的。
本發明提供了由此分離得到的突變體，該突變體抗0.3至0.45mg/mlSHAM(選擇性(alternative)氧化酶的特定抑制劑)。與上文類似，本領域技術人員也易於理解，通過在選擇性(alternative)氧化酶之任何一種或多種抑制劑的存在下培養相應生物體，並篩選在所述抑制劑的存在下顯示出生長活性和比親代生物體的蝦青素生產能力高的生物體，即可建立能以更高生產能力生產蝦青素的突變菌株。通過按實施例2所述，從P.rhodozyma細胞中提取類胡蘿蔔素並測定蝦青素水平即可測定蝦青素的生產能力。選擇相對於親代菌株而言能以較高水平生產蝦青素的突變菌株的標準可以是生產能力增加約10％。可在選擇性(alternative)氧化酶之抑制劑的壓力下再次培養和篩選所得的突變菌株，從而改善生產能力。可在適當培養基中使用所得突變菌株生產蝦青素。
為了降低選擇性(alternative)氧化酶的活性，基因工程所用的方法在幾個方面優於在培養基中加入特定抑制劑，如SHAM的方法。一個優點是經濟上的原因，加入所述抑制劑會增加生產成本。在培養基中加入所述抑制劑還有另一個缺點，該缺點體現在從終產品中除去所加抑制劑的純化步驟中。
另外，本發明提供了分離的重組DNA序列，該序列編碼Phaffiarhodozyma中的選擇性(alternative)氧化酶。
本發明的所述DNA指的是cDNA和基因組DNA，前者僅含有其5』-和3』-非翻譯區的短片段之間側接的開放閱讀框，後者含有其內含子和參與目的基因之表達的調節序列，如其啟動子和終止子。
首先，我們使用簡併PCR法克隆了含有部分AOX基因的部分基因片段。所述簡併PCR是克隆目的基因的方法，其中目的基因的胺基酸序列與得自其它物種的功能相同或相似的已知酶具有較高同源性。通過將胺基酸序列逆翻譯成相應的核苷酸(「簡併的核苷酸」)來設計在簡併PCR中被用作引物的簡併引物。在此簡併引物中，通常使用的是由A，C，G或T中的任一種組成的混合引物，或在多義密碼子處含有肌苷的引物。在本發明中，混合引物被用作簡併引物以克隆上述基因。如下文所述，所用PCR條件根據引物和欲克隆的基因的不同而改變。
將經上述簡併PCR得到的部分DNA片段標記後用作探針，篩選構建於適當宿主中的噬菌體載體或質粒載體上的基因組文庫，從而可從染色體中克隆完整的基因，該基因含有其編碼區，其內含子以及其調節區，如啟動子或終止子。通常，在文庫構建及後續基因操作，如測序，限制性消化，連接等過程中，經常使用大腸桿菌作為宿主菌株，並使用大腸桿菌載體，噬菌體載體，如λ噬菌體載體，或質粒載體，如pUC載體。在本發明中，在λ載體的衍生物λgt11中構建P.rhodozyma的EcoRI基因組文庫。在構建文庫之前，通過Southern印跡雜交測定插入物大小，即必須克隆多長的插入物。在本發明中，根據供應商(Boehringer-Mannheim，Mannheim，德國)提供的方法，用一種類固醇半抗原，即地高辛配基(DIG)替代常規的32P標記來標記用作探針的DNA。通過將經DIG-標記的含有目的基因的一部分的DNA片段用作探針，來篩選構建自P.rhodozyma染色體的基因組文庫。挑選雜交噬斑用於進一步研究。分離出陽性噬斑之後，將插入片段亞克隆至適用於測序的適當質粒載體中。在本發明中，將陽性噬菌體載體中的插入片段亞克隆至pOCUS-2載體，該載體可用於構建插入了轉座子的測序衍生物(Locus Pocus System，Novagene，Madison，美國)。
在本發明中，使用自動化的螢光DNA測序儀，即ALFred系統(Pharmacia，Uppsala，瑞典)和自動循環測序方法，其中在大多數的測序過程中使用的是Taq DNA聚合酶。
測定基因組序列之後，使用編碼區的序列克隆相應基因的cDNA。也利用PCR法來克隆cDNA片段。合成PCR引物，其序列等同於開放閱讀框(ORF)的5』-和3』-末端序列，其中還添加了一種適當的限制性位點，使用這些PCR引物進行PCR。在本發明中，在PCR克隆cDNA時將cDNA庫用作模板。所述cDNA庫由通過使用病毒逆轉錄酶和Taq聚合酶(Clontech製備的CapFinder試劑盒，Palo Alto，美國)，將得自P.rhodozyma的mRNA用作模板而在體外合成的多種cDNA組成。由其序列進一步證實所得的所需cDNA。另外，將所得cDNA片段克隆至在大腸桿菌或釀酒酵母中起作用的表達載體，使其受適當啟動子的控制之後，可使用該cDNA證實其酶活性。
為了表達衍生自真核生物的基因，經常使用將cDNA克隆至大腸桿菌或釀酒酵母中的表達載體的方法。這是因為生物體的內含子結構特異性各有不同，不能識別其它物種的內含子序列。實際上，原核生物在其自身的遺傳背景中不含內含子結構。甚至在酵母中，釀酒酵母所屬的子囊菌綱與P.rhodozyma所屬的擔子菌綱的遺傳背景都有所不同。Wery等證實P.rhodozyma的肌動蛋白基因的內含子結構不能被子囊菌綱的釀酒酵母識別和剪接(酵母，12，641-651，1996)。
據一些其它的研究人員報導，某些類型的基因的內含子結構參與其基因表達的調節(Dabeva，M.D等，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，83，5854，1986)。或許，重要的是當目的基因的內含子結構參與其自身基因表達的調節，則在目的基因自我克隆時使用具有其內含子的基因組片段。
為了使用基因工程方法進行菌株改良研究，必須研究其在諸如轉錄和翻譯的事件中的遺傳機制。為了研究遺傳機制，重要的是測定其上遊激活序列(UAS)，即啟動子，內含子結構和終止子的基因序列，而不是僅測定其外顯子的基因序列。
根據本發明，從P.rhodozyma的基因組DNA中克隆出編碼選擇性(alternative)氧化酶的基因，測定其基因組序列，該序列含有選擇性(alternative)氧化酶(AOX)基因，其中包括其5』-和3』-鄰接區以及其內含子結構。
證實酶活性之後，可進行降低選擇性(alternative)氧化酶活性的基因修飾研究。
在本發明中，所述多肽序列包括SEQ ID NO2、其具有AOX活性的片段、及在嚴謹度條件下與SEQ ID NO2雜交的多肽序列，所述嚴謹度足以鑑定針對SEQ ID NO2之特異性結合，且這類雜交體可編碼具有選擇性(alternative)氧化酶功能的多肽。例如，可應用以下雜交條件和洗滌條件的任意組合來獲得所需特異性結合高嚴謹度雜交6X SSC0.5％ SDS100μg/ml變性鮭精DNA50％甲醯胺於42℃輕柔搖動著保溫過夜高嚴謹度洗滌室溫2X SSC，0.5％SDS中洗滌15分鐘1次，然後於室溫0.1X SSC，0.5％SDS中洗滌15分鐘1次。
低嚴謹度雜交6X SSC0.5％ SDS100μg/ml變性鮭精DNA50％甲醯胺於37℃輕柔搖動著保溫過夜低嚴謹度洗滌室溫0.1X SSC，0.5％SDS中洗滌15分鐘1次。
中嚴謹度條件可通過改變上述雜交反應和/或洗滌條件的溫度來獲得。在本發明中，優選使用高嚴謹度雜交條件和洗滌條件。
為了用遺傳學方法降低基因表達，可使用某些方法。一種方法是反義法。反義法是通過導入人工基因片段來降低目的基因之表達的方法，所述人工基因片段的序列與目的基因的序列互補。這種反義基因片段可以在體內與目的基因的成熟mRNA片段形成複合物，結果可抑制mRNA的有效翻譯。為了構建AOX基因的反義RNA，可使用PCR法克隆AOX基因的互補cDNA鏈。
另一種方法是突變啟動子區域。通常，基因由具有各自不同功能的幾個部分組成。在真核生物中，與編碼核糖體RNA(rRNA)，核內小RNA(snRNA)和轉運RNA(tRNA)的基因不同的是，編碼相應蛋白質的基因被轉錄成前信使RNA(pre-mRNA)。儘管RNA聚合酶II(PolII)在此轉錄事件中起主要作用，但PolII不能缺乏順式元件和反式-作用的蛋白質因子而單獨起始轉錄，所述順式元件覆蓋含啟動子和UAS的上遊區域。首先，轉錄起始複合物識別待表達基因之5』-鄰接區中的啟動子序列，所述複合物由幾個蛋白質基本成分組成。在此事件中，當在一些特定調節(如熱休克反應，或對營養飢餓的適應等)下表達基因時，還需要一些其它的參與者。此時，啟動子序列附近的5』-上遊非翻譯區域中需要存在UAS，一些正或負調節蛋白識別並結合該UAS。轉錄起始複合物與啟動子序列結合的強度受啟動子附近反式-作用因子結合的影響，這樣就能調節轉錄活性。
通過磷酸化激活轉錄起始複合物之後，轉錄起始複合物啟動由轉錄起始位點開始的轉錄。轉錄起始複合物的某些部分作為延伸複合物從啟動子區域沿該基因3』-方向脫附(該步驟被稱為啟動子清除事件)，延伸複合物繼續轉錄直至其到達鄰接該基因3』-下遊區域的終止序列。
為了降低目的基因的表達，經常使用常規化學誘變或基因定點誘變來突變含UAS序列的上述目的基因啟動子區域。在此方法中，誘變基因盒，然後將其導入P.rhodozyma，所述基因盒的5』末端含有與目的基因的啟動子區域融合的一個報導基因，其3』末端含有目的基因的終止區域。通過檢測報導基因活性的差異，可以篩選出有效的突變。通過用具有已突變的啟動子區域的重組DNA轉化宿主菌株可以得到目的酶的表達有所降低的突變菌株。
可將含有反義AOX基因或AOX基因之突變型啟動子的構建體作為載體轉移至適當宿主菌株。當使用Phaffia rhodozyma作為宿主菌株時，通過將這類構建體克隆至適當載體即可實現此目的，其中所述載體上含有可在P.rhodozyma中起作用的選擇標記。經常將藥物抗性基因用作選擇標記，所述抗性基因編碼的酶能使宿主在存在毒性抗生素時存活。藥物抗性基因的一個例子是pGB-Ph9上攜帶的G418抗性基因(Wery等，基因，184，89-97，1997)。所述質粒可以通過染色體和質粒之間的同源重組整合至Phaffia rhodozyma的染色體上。
至於轉化方法，可使用LiAc法和電穿孔法(Wery等，基因，184，89-97，1997)轉化P.rhodozyma。
可在適當培養基中培養經基因工程改造的P.rhodozyma並評價其生產蝦青素的能力。
下述實施例將參照附圖進一步闡明本發明。
實施例下述實施例中使用的是下列材料和方法菌株P.rhodozyma ATCC96594 (根據布達佩斯條約於1998年4月8日重新保藏，保藏號為ATCC 74438)E.coli Y1090r-araD139，hsdR(rK-，mK+)，mcrB+，rpsL，supF，trpC12∷Tn10，ΔlacU169，Δlon，F-，λ-，(pMC9)(Clontech)E.coli DH5αF-，φ80d，lacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，hsd(rK-，mK+)，recA1，endA1，deoR，thi-1，gyrA96，relA1(Toyobo，Osaka，日本)E.coliγδ供體Δ(gpt-proA)62，leu，44，ara14，galK2，lacY1，Δ(mcrC-mrr)，(rB-，mB-)，xyl-5，mtl-1，recA13，[F+∷Tn1000(tets)](Novagene)E.coli γδ受體F-，araD139，Δ(ara-leu)7696，galE15，galK16，Δ(lac)X74，(Strr)，hsdR2(rK12-，mK12+)，mcrA，mcrB1∷Tn5(kanr)(Novagene)
E.coli TOP10F-，mcrA，Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)，φ80，M15，ΔlacX74，recA1，deoR，araD139，(ara-leu)7697，galU，galK，rpsL(Strr)，endA1，nupG(Invitrogen，NV Leek，荷蘭)載體λgt11(Clontech)pCR2.1-TOPO(Invitrogen)pOCUS-2pBluescript II SK-(Stratagene)pGBPh9(Wery等，酵母，12，641-651，1996)培養基在YPD培養基(DIFCO，Detroit，美國)中常規維持P.rhodozyma菌株。在LB培養基(每升10g細菌用胰蛋白腖(DIFCO)，5g酵母提取物(DIFCO)和5g NaCl)中維持大腸桿菌菌株。在軟瓊脂(0.7％瓊脂；WAKO)中使用NZY培養基(每升5g NaCl，2g MgSO4-7H2O，5g酵母提取物(DIFCO)，10g A型NZ胺(WAKO，Osaka，日本))增殖λ噬菌體。當製備瓊脂培養基時，需添加1.5％瓊脂(WAKO)。水楊基羥肟酸(SHAM)購自Aldrich(Milwaukee，美國)。方法分子遺傳技術的一般方法根據的是分子克隆實驗室手冊，第2版(冷泉港實驗室出版社，1989)中的方法。限制性酶和T4 DNA連接酶購自TakaraShuzo(Ohtsu，日本)。
使用QIAGEN基因組試劑盒(QIAGEN，Hilden，德國)根據廠商提供的方法從P.rhodozyma中分離染色體DNA。用自動化的DNA分離系統(PI-50，Kurabo有限公司，Osaka，日本)少量製備已轉化的大腸桿菌中的質粒DNA。使用QIAGEN柱(QIAGEN)少量製備大腸桿菌轉化子中的質粒DNA。使用QIAquick或QIAEX II(QIAGEN)從瓊脂糖中分離和純化DNA片段。
使用Isogen(Nippon Gene，Toyama，日本)用酚法分離P.rhodozyma的總RNA。使用mRNA分離試劑盒(Clontech)從所得總RNA中純化mRNA。使用CapFinder cDNA構建試劑盒(Clontech)合成cDNA。
使用Gigapack III金包裝提取物(Stratagene，La Jolla，美國)進行體外包裝。根據廠商提供的方法，通過Wizard λ preps DNA純化系統(Promega，Madison，美國)分離λDNA。
用Perkin Elmer 2400型熱循環儀進行聚合酶鏈反應(PCR)。實施例中描述了每個PCR的條件。PCR引物購自供貨商。用自動化的螢光DNA測序儀(ALFred，Pharmacia)進行DNA測序。
DH5α感受態細胞購自Toyobo。除非另有說明，所有化合物均購自WAKO。
實施例1 從P.rhodozyma ATCC 96594中分離SHAM-抗性突變體，SHAMI，SHAM2和SHAM3為了檢查由選擇性(alternative)氧化酶介導的KCN-抗性呼吸的抑制作用對P.rhodozyma生長的影響，在YPD-瓊脂培養基上的P.rhodozyma培養物中加入SHAM。將SHAM溶解於乙醇中，分別以0.05，0.15，0.30，0.45和0.90mg/ml的終濃度加入YPD-瓊脂培養基。經稀釋將2×107個細胞/ml P.rhodozyma ATCC96594塗布在這些培養基上。於20℃培養3天之後，計數所產生的菌落。結果，在含-SHAM的YPD瓊脂上生長的菌落數幾乎與不含SHAM的對照培養基上的相等。但在含-SHAM的培養基上生長的菌落小於對照培養物。表1顯示出與對照菌落相比的相對菌落直徑。
表1在含-SHAM的YPD瓊脂上生長的菌落的相對大小SHAM (mg/ml) 0.05 0.15 0.30 0.45 0.90相對菌落直徑(％)10070403012有趣的是，在含有0.3和0.45mg/ml SHAM的培養基上生長的菌落中，一些菌落顯示出與對照菌落相似的大小。這些菌落也顯示出比對照菌落更深的色素形成。挑出4個與對照菌落大小相似的菌落，在YPD-瓊脂培養基上劃線。甚至在不含SHAM的YPD-瓊脂培養基上，所有菌落都顯示出比對照菌落更深的色素形成。此結果表明這些菌株可能是自發突變體，將它們稱為SHAM1，SHAM2，SHAM3和SHAM4。
實施例2 搖瓶發酵抗性突變體SHAM1，SHAM2和SHAM3為了評價SHAM-抗性突變體SHAM1，SHAM2和SHAM3生產蝦青素的能力，在搖瓶中進行發酵。從新鮮製備的瓊脂培養物中將這些突變體及其親代菌株ATCC96594接種於大小為500ml的帶擋板搖瓶內的50ml YPD培養基中，使最終的660nm OD值為0.05。於20℃以200r.p.m.進行發酵。以適當的間隔取出3ml肉湯培養基，分析細胞量和蝦青素的含量。
將細胞量測定為660nm處的OD值。將1.0ml肉湯置於1.5ml微量離心管中以120℃加熱過夜之後稱重細胞而測定細胞乾重。按下述，用玻璃珠破碎P.rhodozyma細胞，從中提取類胡蘿蔔素之後，用HPLC法測定P.rhodozyma中的蝦青素含量。用蒸餾水將離心1ml肉湯所得的細胞濃縮2倍，在褐色避光試管(13.5mm，11cm)內的細胞懸浮液(0.5ml)中加入10.0g玻璃珠。接著，加入1.5ml丙酮/丁基化羥基甲苯(BHT)/水(45mg BHT溶於450ml丙酮和50ml水中)，然後在水平臺式搖床上將試管振蕩1小時。提取之後，加入5ml含有適當濃度的胭脂樹橙(nacalai tesque，Kyoto，日本)作為內部標準的丙酮/BHT/水。用下列HPLC系統(HPLC系統的硬體購自Tosoh(Tokyo，日本))分析上清液中的蝦青素含量。
HPLC柱YMC-Pak ODS-A(6mm，150mm(YMC公司，Milford，美國)。
溫度室溫洗脫溶劑乙腈/甲醇/異丙醇(85/10/5)注射量10微升流速2.0ml/分鐘檢測471nm的紫外線結果概述於表2。所有突變體顯示出比親代菌株ATCC96594高50％的蝦青素生產能力。由此結果看，這些突變體中可能發生了一些能通過增加蝦青素生產能力來補償選擇性(alternative)氧化酶活性的抑制作用的突變。
表2SHAM-抗性突變體的蝦青素生產能力蝦青素生產能力(mg/L) (mg/g-幹細胞)OD@660nm(小時) 387238 72 3872SHAM-1 1.65 4.07 0.179 0.380 24.5 30.6SHAM-2 2.36 4.43 0.217 0.385 29.5 30.5SHAM-3 2.87 3.97 0.247 0.381 29.2 29.5ATCC96594 2.00 2.76 0.164 0.258 27.4 28.7實施例3從P.rhodozyma中分離mRNA並構建cDNA文庫為了構建P.rhodozyma的cDNA文庫，在破碎細胞之後立即通過苯酚提取法分離總RNA，使用mRNA分離試劑盒(Clontech)純化P.rhodozymaATCC96594菌株的mRNA。
首先，通過離心(1500xg，10分鐘)從10ml已在YPD培養基中培養兩天的培養物中收集ATCC96594菌株的細胞，用提取緩衝液(含有0.7M KCl的10mM檸檬酸鈉/HCl(pH 6.2))將細胞清洗一次。懸浮於2.5ml提取緩衝液中之後，用弗氏壓碎勻漿器(Ohtake Works Corp.，Tokyo，日本)以1500kgf/cm2的壓力破碎細胞，立即根據廠商特別說明的方法與兩倍體積的isogen(Nippon gene)混合。在此步驟中，回收到400微克總RNA。
然後根據廠商特別說明的方法，使用mRNA分離試劑盒(Clontech)純化總RNA。最終從P.rhodozyma ATCC96594菌株中得到16g mRNA。
為了構建cDNA文庫，根據廠商特別說明的方法，使用CapFinder PCRcDNA構建試劑盒(Clontech)。將1微克純化的mRNA用於第一條鏈的合成，接著進行PCR擴增。PCR擴增之後，得到1mg cDNA庫。
實施例4 從P.rhodozyma中克隆部分AOX(選擇性(alternative)氧化酶)基因為了從P.rhodozyma中克隆部分AOX基因，使用了簡併PCR法。下文列出了一些菌種和資料庫的登記號，所述菌種的選擇性(alternative)氧化酶序列被用於多重序列對比分析(ClustalW，Thompson J.D等，核酸研究，22，4673-4680，1994)。
黑麴黴 AB016540(DDBJ/GenBank/EMBL)白色念珠菌 AF031229(DDBJ/GenBank/EMBL)Chlamydomonas reinhardtiiAF047832(DDBJ/GenBank/EMBL)粗糙鏈孢黴 Q01355(Swissprot)稻(Oryza sativa) AB004813(DDBJ/GenBank/EMBL)Pichia anomala Q00912(Swissprot)Trypanosoma brucei bruceiQ26710(Swissprot)如表3所示，根據其它物種的已知選擇性(alternative)氧化酶基因的共有序列設計和合成兩個混合引物的核苷酸序列。
表3用於克隆AOX基因的引物序列
aox3AAYGARMGNATGCAYYTNYTNACNTT(有義引物)(SEQ IDNO3)aox5GCYTCYTCYTCNARRTANCCNACRAA(反義引物)(SEQ ID NO4)(N＝A，C，G或T；R＝A或G，Y＝C或T，M＝A或C)使用ExTaq(Takara Shuzo)為DNA聚合酶，實施例1中所得的cDNA庫為模板，進行25輪PCR，每輪的條件是95℃30秒，50℃30秒和72℃15秒，然後對反應混合物進行瓊脂糖凝膠電泳。回收具有所需長度的PCR帶，根據廠商提供的方法用QIAquick(QIAGEN)純化，然後連接至pCR2.1-TOPO(Invitrogen)。轉化感受態大腸桿菌TOP10之後，選擇6個白色菌落，用自動DNA分離系統分離質粒。測序後發現3個克隆所具有的序列的推定胺基酸序列類似於已知的選擇性(alternative)氧化酶基因。將此分離的cDNA克隆稱為pAOX514並用於進一步研究。
實施例5 分離P.rhodozyma的基因組DNA為了分離P.rhodozyma的基因組DNA，根據廠商特別說明的方法使用QIAGEN基因組試劑盒。
首先，通過離心(1500xg，10分鐘)從100ml已在YPD培養基中培養過夜的培養物中收集P.rhodozyma ATCC96594菌株的細胞，用TE緩衝液(含有1mM EDTA的10mM Tris/HCl(pH 8.0))將細胞清洗一次。懸浮於QIAGEN基因組試劑盒中的8ml Yl緩衝液之後，以2mg/ml的濃度加入溶細胞酶(SIGMA，St.Louis，美國)以通過酶促降解破碎細胞，於30℃保溫該反應混合物90分鐘，然後進行後續的提取步驟。最終得到20微克基因組DNA。
實施例6使用pAOX514為探針進行Southern印跡雜交進行Southern印跡雜交以克隆含有P.rhodozyma之AOX基因的基因組片段。用EcoRI消化2微克基因組DNA，進行瓊脂糖凝膠電泳，然後進行酸和鹼處理。通過1小時反轉印跡(Joto Rika，Tokyo，日本)將變性的DNA轉移至尼龍膜(Hybond N+，Amersham，Buckinghamshire，英國)。通過熱處理(80℃，90分鐘)固定轉移至尼龍膜上的DNA。通過用DIG多引發法(BoehringerMannheim)標記模板DNA(經EcoRI消化的pAOX514)來製備探針。根據廠商特別說明的方法進行雜交。結果觀察到5.5至7.0千鹼基(kb)的雜交帶。
實施例7 克隆含有AOX基因的基因組片段用EcoRI消化4微克基因組DNA，並進行瓊脂糖凝膠電泳。然後，根據廠商特別說明的方法，用QIAEX II凝膠提取試劑盒(QIAGEN)回收長度為5.0至7.0kb的DNA。通過16℃過夜，將純化的DNA連接至0.5微克經EcoRI-消化和CIAP(牛小腸鹼性磷酸酶)-處理的λgt11(Clontech)，通過Gigapack III金包裝提取物(Stratagene)進行包裝。用經包裝的提取物感染大腸桿菌Y1090菌株，並與NZY培養基一起鋪於LB瓊脂培養基上。使用經EcoRI-消化的pAOX514為探針篩選出約6000個噬斑。1個噬斑與經標記的探針雜交。
使用Wizard λ preps DNA純化系統(Promega)製備含有推定的P.rhodozyma AOX基因的λgt11衍生物。用EcoRI消化，結果發現該λgt11衍生物含有6kb EcoRI插入物。接著，使用該λgt11衍生物為模板，兩個引物aox3和aox5為引物進行PCR。按與實施例4相同的PCR條件進行PCR，結果產生預期的0.3kb帶。這表明該λgt11衍生物可能含有推定的P.rhodozymaAOX基因。使用QIAquick(QIAGEN)純化此λgt11衍生物中的6.0kb EcoRI插入片段，然後使用DH5α為宿主菌株將其亞克隆至pOCUS-2載體(Novagen)，產生pOCUSAOX607。
實施例8含有AOX基因之基因組片段的測序將pOCUSAOX607轉移至感受態的γδ供體細胞，用於製備可用於LocusPocus系統(Novagen)的測序衍生物。製備測序衍生物的方法由廠商提供。至於測序引物，可合成經Cy5-標記的引物(其序列示於表4)並用於通過使用AutoCycle測序試劑盒(Pharmacia)進行測序。
表4測序AOX基因所用引物的序列poc1(Cy5-)AGCTACAACATACGAAAGGG(SEQ ID NO5)poc2(Cy5-)GGGGAACTGAGAGCTCTAAA(SEQ ID NO6)測序的結果測出了含有2561個鹼基對的核苷酸序列，該段序列是含有P.rhodozyma AOX基因的基因組片段。
編碼區位於由10個外顯子和9和內含子組成的1206個鹼基對內。內含子在整個編碼區內都有分布，而無5』或3』偏好。通過使用基因分析軟體GENETYX-SV/RC(軟體開發有限公司，Tokyo，日本)版本4.0.1，發現開放閱讀框由402個胺基酸組成(SEQ ID NO1)，其序列與其它物種的選擇性(alternative)氧化酶的已知胺基酸序列驚人地相似(與黑麴黴的選擇性(alternative)氧化酶有51.5％的同一性)。氨基末端的一段疏水胺基酸殘基有望形成α-螺旋，這表明該氨基末端區域可能是跨膜結構域或是線粒體的轉運肽。PSORTII程序(http∥psort.nibb.ac.jp8800/)預測該蛋白質可能是線粒體蛋白，預測值為82.6％。
實施例9 克隆AOX基因的上遊區域使用Genome Walker試劑盒(Clontech)克隆AOX基因的5』-鄰接區域，因為pAOX514可能具有足夠的長度可以含有AOX基因的啟動子。首先，合成PCR引物，其序列示於表5。
表5 克隆AOX基因的5』-鄰接區域所用引物的序列aox13GTGTCAGAAACCTCAGATCAACAGGC(初始引物)(SEQ IDN07)aox14CAACAGGCAGTACAGTCAGCAGATTC(嵌套引物)(SEQ IDNO8)文庫構建方法和PCR條件與廠商特別說明的相同。將實施例5得到的基因組DNA製品用作PCR模板。回收5』末端具有ScaI位點的PCR片段(1.2kb)和5』末端具有DraI位點的PCR片段(3.0kb)，使用大腸桿菌TOP10為宿主菌株，將上述PCR片段克隆至pCR2.1-TOPO。測定上述2個獨立實驗中的每一個的序列，結果得到被稱為pAOXSc702的質粒，該質粒可用於進一步研究。根據pAOXSc702中插入片段的序列，合成4個PCR引物，其序列列於表6。
表6 克隆AOX啟動子區域所用引物的序列aox15GAATTCAACAGGTCAAATGA(有義引物)(SEQ ID NO9)aox16ATCCACCCACGCCTGTTTCC(反義引物)(SEQ ID NO10)aox17GGAAACAGGCGTGGGTGGAT(有義引物)(SEQ ID NO11)aox18GAATTCAGTAAACGCATTAG(反義引物)(SEQ ID NO12)PCR條件與實施例4所述的相同，不同之處在於HF聚合酶(Clontech)被用作DNA聚合酶。在aox15和aox16的組合中，擴增出長度為0.7kb的片段。在aox17和aox18的組合中，擴增出長度為0.5kb的片段。將這些片段克隆至pCR2.1-TOPO並轉化大腸桿菌TOP10。分別製備6個獨立的白色菌落的質粒並進行測序。結果得到插入片段的序列彼此相同的預期克隆。在aox15和aox16的組合中，所得克隆被稱為pAOX714#1516。在aox17和aox18的組合中，所得克隆被稱為pAOX714#1718。測序的結果測出了含有P.rhodozyma AOX基因之啟動子區域的pAOX714#1516和pAOX714#1718的序列。測出的含有AOX啟動子的序列長度為1406個鹼基對。
聯合實施例8和9得到的序列，測出該核苷酸序列(3.7kb)含有AOX基因及其啟動子和終止子(SEQ ID NO2)。
實施例10 構建AOX基因的反義質粒通過PCR法擴增反義基因片段，該片段覆蓋了AOX基因的整個結構基因，將該片段克隆至整合載體中，其中反義AOX基因由P.rhodozyma中的AST啟動子轉錄。
表7 反義構建AOX基因所用引物的序列aox101GGCCATTATGGCCTCAATTGGTCTGAGACATGC(SEQ IDNO13)aox102GGCCGAGGCGGCCATGTCTCTTGCTAGATGTCT(SEQ IDNO14)兩個引物aox101和aox102具有不對稱的限制性酶SfiI識別序列(GGCCNNNNNGGCC)，但它們的不對稱突出序列被設計成不同的序列。這樣就可以定向克隆至在其連接序列中具有相同不對稱序列的表達載體中。
使用HF聚合酶(Clontech)為Taq聚合酶，實施例3中製備的cDNA為模板，在下列條件下進行PCR94℃15秒，55℃30秒和72℃45秒共30輪循環。純化擴增的PCR片段，克隆至pCR2.1-TOPO載體。測序後發現一個克隆具有正確的片段，該克隆被稱為pAOX1007#0102。AOX基因之反義片段的序列示於SEQ ID NO15。
關於驅動反義AOX基因轉錄的啟動子和終止子片段，AST啟動子和終止子克隆自實施例5中製備的染色體。
表8 克隆AST啟動子和終止子所用引物的序列ast49GCGGCCGCACGTACAGACTAAGATCGAC(有義引物)(SEQID NO16)ast50GGCCATAATGGCCATGGAGAAAGTAGGTGGCAA(反義引物)(SEQ ID NO17)ast36CCTGCAGGCCGCCTCGGCCGTTGATTCTTCATATGTTAA(有義引物)(SEQ ID NO18)
ast37GGTACCCTGCAGTCGACAAACATGAA(反義引物)(SEQ IDNO19)PCR條件如下94℃15秒，55℃30秒和72℃90秒共25輪循環。在ast49和ast50的組合中，擴增出長度為1.25kb的片段。在ast36和ast37的組合中，擴增出長度為0.3kb的片段。將這些片段克隆至pCR2.1-TOPO並轉化大腸桿菌TOP10。分別製備6個獨立的白色菌落的質粒並進行測序。結果，選擇具有正確AST啟動子和終止子序列(EP 1035 206 Al)的克隆進行進一步研究(pUAST407-AST啟動子和pAST526#3637-AST終止子)。
接著，通過將NotI+KpnI消化的pAST526#3637和KpnI+SacI消化的pG418Sa330(EP 1 035 206 Al)與NotI和SacI消化的pBluescriptII SK-(Stratagene)連接，使AST終止序列與G418抗性盒融合。將連接混合物轉化至感受態的KB822細胞。經過限制性分析，選擇一個具有正確結構的克隆(pUAST418)進行進一步研究。
然後，將3.1kb含有核糖體DNA(rDNA)基因座(Wery等，基因，184，89-97，1997)的SacI片段插入pUAST418之G418盒的下遊。rDNA片段以多拷貝存在於真核生物的染色體中。經由該rDNA片段的整合事件導致所用宿主染色體上的多拷貝整合，這樣可以使表達載體上攜有的外源基因過量表達。為此，將含有rDNA基因的pGBPh9的SacI片段連接至經SacI消化和細菌鹼性磷酸酶處理的pUAST418中。將連接混合物轉化至感受態的KB822細胞中。經過限制性分析，選擇2個克隆(pURDNA421和pURDNAR421)進行進一步研究，這2個克隆中的rDNA片段以彼此不同的方向插入。
隨後，將AST啟動子插入AST終止子的上遊以構建能在P.rhodozyma中起作用的表達載體。將pUAST407的1.0kb的Notl-和BglII-片段和pUAST407的0.25kb的BglII和PstI片段與經NotI-和Sse8387I-消化的pURDNA421或pURDNAR421連接。用該連接混合物轉化感受態的KB822細胞，對各6個所得菌落進行限制性分析。選擇AST啟動子正確插入的克隆進行進一步研究(pF718和pR718，它們的rDNA片段方向彼此相反)。
最後，通過將pAOX1007#0102的1.2kb SfiI片段插入經SfiI消化的pF718或pR718即可完成反義AOX構建體。所得質粒被稱為pFAOX828和pRAOX828。
實施例11 用AOX-反義載體轉化P.rhodozyma
將AOX反義載體pFAOX828和pRAOX828轉化至P.rhodozyma野生型菌株ATCC96594。根據「分子生物學方法」(Johnson等，53，147-153，1996)中所述的方法進行biolistic轉化。在YPD培養基中將P.rhodozyma菌株ATCC96594培養至穩定期。離心肉湯之後，用無菌水將細胞濃縮10倍，將200微升細胞懸浮液塗布於含有100微克/ml遺傳黴素和0.75M D-甘露糖醇和D-山梨糖醇的YPD培養基上。將5微克質粒包被於1.5mg 0.9微米的金粒上，用作biolistic轉化的供體DNA。選擇出一個遺傳黴素抗性菌落進行進一步的鑑定，該菌落被pFAOX828轉化並顯示出增加的色素形成，鑑定的內容包括該菌落生產蝦青素的能力及其由AOX基因編碼的選擇性(alternative)氧化酶活性的降低。
實施例12 鑑定衍生自P.rhodozyma ATCC96594的pFAOX828整合體於20℃，在500ml錐瓶中的50ml YPD培養基中將P.rhodozyma轉化子ATCC96594∷pFAOX828及其親代菌株ATCC96594培養3天，培養所用的種子培養物是於20℃，在試管(直徑為21mm)中的10mlYPD培養基中培養3天後的培養物。在接種後的不同時間點，例如24，43和65小時，取出適量培養物肉湯，用於分析其在存在或缺乏KCN時的生長、生產蝦青素的能力及其氧攝取活性。24，43和65小時時間點分別對應於其對數生長期後期，穩定中期和穩定晚期。
為了分析生長情況，除了通過將微量離心1ml肉湯所得的細胞置於100℃乾燥1天以測定其細胞乾重外，還通過使用UV-1200光度計(ShimadzuCorp.，Kyoto，日本)測定660nm處的光密度。
為了分析蝦青素和總類胡蘿蔔素的含量，微量離心1.0ml肉湯後從中收集細胞，通過用玻璃珠破碎從P.rhodozyma細胞中提取類胡蘿蔔素。提取之後，離心除去破碎的細胞，用HPLC分析殘留物中的類胡蘿蔔素含量。HPLC條件如下HPLC柱Chrompack Lichrosorb si-60(4.6mm，250mm)溫度室溫洗脫溶劑丙酮/己烷(18/82)加1ml/L水注射量10微升流速2.0ml/分鐘檢測450nm處的紫外光蝦青素參照樣品得自F.Hoffmann-La Roche AG(Basel，瑞士)。
為了通過測定存在或缺乏KCN時的氧攝取活性來測定呼吸活性，使用了B-505型DO計和DO探針GU-BM(由Iijima Electronics公司(Aichi，日本)製備)。用0.5M KPB(pH7.4)重新懸浮收集的細胞，然後，在DO分析小室中用2.3ml水稀釋200微升該細胞懸浮液。在存在或缺乏0.48mM KCN時通過加入0.2ml 1M葡萄糖來啟動測量。
結果概述於表9。
表9
(呼吸活性被表示為nmol O2-攝取/分鐘×mg幹細胞)如表9所示，在培養43小時時，反義AOX轉化子ATCC96594∷pFAOX828顯示出與親代菌株ATCC96594類似的細胞產量，但在第24小時時顯示出較慢的生長。轉化子的蝦青素和類胡蘿蔔素含量增加了15％。就其呼吸活性而言，轉化子具有與其宿主菌株相似的KCN-敏感型呼吸活性(95％)，但在24小時培養物中，由選擇性(alternative)氧化酶介導的KCN-抗性呼吸降低其宿主菌株的20％水平，而在43小時培養物中已完全受損。
此結果表明介導KCN-抗性呼吸的選擇性(alternative)氧化酶活性的降低可能至會導致P.rhodozyma中蝦青素和類胡蘿蔔素的過量產生。
序列表110 F.HOFFMANN-LA ROCHE AG120生物生產類胡蘿蔔素的改良方法及其所用的生物材料130 案號 20685140 -141 -150 00111148.3151 2000-05-24160 12170 patentIn Ver. 2.0210 1211 401212 PRT213 Phaffia rhodozyma400 1Met Ser Leu Ala Arg Cys Leu Val Gln Ala Ser Thr Arg Ser Leu1 5 10 15Ser Arg Thr Val Arg Pro Ser Tyr Leu Thr Pro Leu Thr Val His20 25 30Phe Phe Ser Ser Thr Ile Ser Arg Set Cys Ser Arg Ser Tyr Ser35 40 45Thr Ser Asn Thr Arg Leu Ser Thr Ser Asn Gly Gln Gln Ser Thr50 55 60His His Leu Ala Asp Asn Val Pro Leu Thr Thr Asp Lys Gln Arg65 70 75His Leu Gln Gly Val Ile Gly Gly Glu Gly Met His Gln His Asp80 85 90Ala Thr Thr Val Ala His Thr Asp Pro Leu Ala Ser Val Ile Gln95 100 105Asp Leu Thr Val Pro Thr Asn Gly Ser Trp Val Met His Asn Pro110 115 120Val Tyr Thr Arg Thr Glu Leu Asp Ala Val Gln Val Val His Arg125 130 135Pro Pro Thr Asn Thr Ser Asp Gln Val Ser Thr Lys Leu Val Lys140 145 150Met Leu Arg Trp Gly Phe Asp Leu Val Ser Asn Tyr Lys His Val155 160 165Pro Phe Pro Ala Asn His Lys Glu Leu Ser Val Thr Gln Leu Arg170 175 180Gln Met Gly Cys Leu Leu Ser Pro Asp Gln Trp Met Thr Arg Phe185 190 195Ile Phe Leu Glu Thr Thr Ala Ala Ile Pro Gly Met Val Gly Gly200 205 210Leu Leu Arg His Leu Gln Ser Leu Arg Leu Met Arg Arg Asp Gly215 220 225Gly Trp Ile His Thr Leu Leu Ala Glu Ala Glu Asn Glu Arg Leu230 235 240His Leu Leu Thr Phe Met Ser Met Ala Asn Pro Pro Leu Trp Phe245 250 255Arg Ala Leu Ile Leu Gly Ala Gln Gly Val Phe Tyr Asn Leu Phe260 265 270Phe Ile Thr Tyr Leu Ile Ser Pro Pro Val Ala His Arg Phe Val275 280 285Ala Cys Leu Glu Glu Glu Ala Val Val Thr Tyr Thr Arg Ile Ile290 295 300Ser Asp Ile Glu Asn Gly Tyr Val Pro Glu Trp Glu Lys Leu Pro305 310 315Ala Pro Glu Ile Ala Ile Ser Tyr Trp Arg Leu Pro Pro Asp Ala320 325 330Thr Phe Leu Asp Thr Leu Arg Ala Ile Arg Ala Asp Glu Ala Thr335 340 345His Arg Phe Val Asn His Thr Phe Ala Ser Leu Asp Ser Lys Lys350 355 360Asp Phe Asn Pro Phe Ala Ile Ala Glu Pro Asp Ala Thr Thr Lys365 370 375Gly Ser Val Tyr Gly Phe Thr Arg Asp Glu Ala Ala Ala Phe Ala380 385 390Gln Lys Thr Arg Glu Arg Met Ser Gln Thr Asn395 400210 2211 3724212DNA213 Phaffia rhodozyma220221外顯子222 (1407)..(1674)220221內含子222 (1675)..(1769)220221外顯子222 (1770)..(1873)220221內含子222(1874)..(1948)220221外顯子222 (1949)..(2155)220221內含子222(2156)..(2264)220221外顯子222(2265)..(2295)220221內含子222(2296)..(2372)220221外顯子222(2373)..(2423)220221內含子222(2424)..(2515)220221外顯子222(2516)..(2645)220221內含子222(2646)..(2735)220221外顯子222(2736)..(2831)220221內含子222(2832)..(2914)220221外顯子222(2915)..(2998)220221內含子222(2999)..(3085)220221外顯子222(3086)..(3206)220221內含子222(3207)..(3320)220221外顯子222(3321)..(3434)2202215′UTR222(1295)..(1296)223(實驗型)220221polyA_位點222(3682)..(3683)223(實驗型)4002gaattcaaca ggtcaaatga gaaaggacaa ggtgaagaga tggaaccaga 50agcaatcagc gagagtaaag acgatggttc taaacataca ttgggcacga 100ctcccttgat ccgaggcagg tatacgacca gatacaaaaa caagctgacg 150gtcacggccg aaaataggaa ggagagttgc aacgctcggc taaagaaggt 200ggattcaatc acaacacacg gtcaaggcaa gcatgacata ttgagctttt 250gcttgagtat ctcgcgatca aagtgatgat ggatgcttct aaggatcgtc 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202101021120212DNA213人工序列220223人工序列的描述克隆啟動子區所用的引物(反義引物)40010atccacccac gcctgtttcc 202101121120212DNA213人工序列220223人工序列的描述克隆啟動子區所用的引物(有義引物)40011ggaaacaggc gtgggtggat 202101221120212DNA213人工序列220223人工序列的描述克隆啟動子區所用的引物(反義引物)40012gaattcagta aacgcattag 202101321133212DNA213人工序列220223人工序列的描述構建反義AOX基因所用的引物(有義引物)40013ggccattatg gcctcaattg gtctgagaca tgc 332101421133212DNA213人工序列220223人工序列的描述構建反義AOX基因所用的引物(反義引物)40014ggccgaggcg gccatgtctc ttgctagatg tct 33210152111232212DNA213Phaffia rhodozyma40015ggccattatg gcctcaattg gtctgagaca tgcgttctct cgtcttctga 50gcgaaggcgg cggcctcgtc ccgtgtgaaa ccatataccg agcctttagt100agtggcgtct ggctcggcta tcgcaaatgg attgaagtct ttcttagagt150ccaggctggc aaatgtgtga ttcacgaatc gatgagtggc ctcatctgct200cggatggctc gcagtgtgtc caaaaaggta gcatcgggag gaagtcgcca250gtaagatata gcaatctcgg gagcgggaag cttttcccat tcaggtacat300agccgttctc gatatcactg ataattcttg tgtaagtaac gacagcttct350tcctccaggc aggcaacgaa tcgatgagcc accggcgggg aaattaaata400agttatgaag aacaggttat aaaaaacccc ttgagctccc 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1.生產類胡蘿蔔素的方法，所述方法包括處理可生產類胡蘿蔔素的親代生物體，以誘導選擇性氧化酶活性降低，培養所得到的生物體，並選擇類胡蘿蔔素生產能力增加的生物體。
2.根據權利要求1的方法，其中生物體可以是藉助於改變對選擇性氧化酶之抑制劑的抗性而使類胡蘿蔔素生產能力增加的突變菌株。
3.根據權利要求1或2的方法，其中生物體是抗選擇性氧化酶之抑制劑的突變體。
4.根據權利要求2或3的方法，其中所述生物體屬於原生生物界或真菌界，更優選為聚球藍細菌屬，集胞藍細菌屬，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，鏈孢黴屬，紅酵母屬，布拉黴屬或須黴屬。
5.根據權利要求2至4中任一項的方法，其中所述生物體是Phaffiarhodozyma的菌株。
6.根據權利要求2至5中任一項的方法，其中所述生物體是選自DSM13429，13430和13431的菌株。
7.根據權利要求2至6中任一項的方法，其中所述選擇性氧化酶的抑制劑可選自正丙基沒食子酸和水楊基羥肟酸。
8.建立突變菌株的方法，所述突變菌株相對於親代生物體而言能生產出水平有所增加的類胡蘿蔔素，所述方法包括在降低選擇性氧化酶活性的條件下培養可生產類胡蘿蔔素的生物體，並選擇類胡蘿蔔素生產水平比所述親代生物體高的生物體。
9.根據權利要求8的方法，其中降低選擇性氧化酶活性的條件包括選擇性氧化酶之抑制劑的存在。
10.根據權利要求9的方法，其中所述選擇性(alternative)氧化酶之抑制劑選自正丙基沒食子酸和水楊基羥肟酸。
11.根據權利要求8至10中任一項的方法，其中所述生物體屬於原生生物界或真菌界，更優選為聚球藍細菌屬，集胞藍細菌屬，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，鏈孢黴屬，紅酵母屬，布拉黴屬或須黴屬。
12.根據權利要求8至11中任一項的方法，其中所述生物體是Phaffiarhodozyma的菌株。
13.根據權利要求8至12中任一項的方法，其中所述生物體是選自DSM13429，13430和13431的菌株。
14.一種生物體的突變菌株，其可通過權利要求8至13中任一項所限定的方法得到，其相對於親代生物體而言能產生水平有所增加的類胡蘿蔔素。
15.根據權利要求14的突變菌株，其中所述生物體屬於原生生物界或真菌界，更優選為聚球藍細菌屬，集胞藍細菌屬，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，鏈孢黴屬，紅酵母屬，布拉黴屬或須黴屬。
16.根據權利要求14或15的突變菌株，其中所述生物體是Phaffiarhodozyma的菌株。
17.根據權利要求1的方法，其中所述生物體是重組生物體，與親代生物體相比，該重組生物體中的選擇性氧化酶的基因表達經改變後降低了效力。
18.根據權利要求17的方法，其中藉助於選自反義技術，定點誘變，化學誘變等技術改變這種生物體中選擇性氧化酶的基因表達。
19.根據權利要求17或18的方法，其中所述生物體屬於原生生物界或真菌界，更優選為聚球藍細菌屬，集胞藍細菌屬，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，鏈孢黴屬，紅酵母屬，布拉黴屬或須黴屬。
20.根據權利要求17至19中的任一項的方法，其中所述生物體是Phaffiarhodozyma的菌株。
21.根據權利要求17至20中任一項的方法，其中所述生物體是選自DSM13429，13430和13431的菌株。
22.相對於宿主生物體而言能產生水平有所增加的類胡蘿蔔素的重組生物體，其特徵在於與宿主生物體相比，該重組生物體中的選擇性氧化酶的基因表達經改變後降低了效力。
23.根據權利要求22的重組生物體，其中藉助於選自反義技術，定點誘變，化學誘變等技術改變這種生物體中選擇性氧化酶的基因表達。
24.根據權利要求22或23的重組生物體，其中所述生物體屬於原生生物界或真菌界，更優選為聚球藍細菌屬，集胞藍細菌屬，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，鏈孢黴屬，紅酵母屬，布拉黴屬或須黴屬。
25.根據權利要求22至24中任一項的重組生物體，其中所述生物體是Phaffia rhodozyma的菌株。
26.根據權利要求22至25中任一項的重組生物體，其中所述生物體是選自DSM13429，13430和13431的菌株。
27.重組DNA序列，該序列編碼衍生自能產生類胡蘿蔔素之生物體的選擇性氧化酶。
28.根據權利要求27的重組DNA序列，其中所述生物體屬於原生生物界或真菌界，更優選為聚球藍細菌屬，集胞藍細菌屬，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，鏈孢黴屬，紅酵母屬，布拉黴屬或須黴屬。
29.根據權利要求27或28的重組DNA序列，其中所述生物體是Phaffiarhodozyma的菌株。
30.根據權利要求27至29中任一項的重組DNA序列，其中所述序列由SEQ ID NO2鑑定，或與SEQ ID NO2的同一性高於55％。
31.根據權利要求27至29中任一項的重組DNA序列，其推定的胺基酸序列由SEQ ID NO1鑑定，或與SEQ ID NO1的同一性高於51.5％。
全文摘要
生產類胡蘿蔔素的方法,所述方法包括在誘導選擇性(alternative)氧化酶活性降低的條件下對可生產類胡蘿蔔素的親代生物體進行處理,對得到的生物體進行培養,並選擇類胡蘿蔔素生產能力增加的生物體。
文檔編號C12N15/09GK1340628SQ01119510
公開日2002年3月20日 申請日期2001年5月24日 優先權日2000年5月24日
發明者星野立夫, 小島一之, 瀨戶口豐 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司