新型抗血管生成肽、其編碼多核苷酸和抑制血管生成的方法

2023-07-22 03:07:41

專利名稱：新型抗血管生成肽、其編碼多核苷酸和抑制血管生成的方法
技術領域：
本發明涉及肽化學領域。更具體地講，本發明涉及下述肽的製備和用途，所述肽含有的胺基酸序列與哺乳動物血纖溶酶源的kringle 5區的相應序列大致相似；本發明涉及含有所述肽的藥用組合物、制管張素受體的特異性抗體、制管張素檢測的方法和測定、連接制管張素蛋白的細胞毒性劑和由血管生成引起或惡化的疾病的治療。
背景技術：
血管生成即形成新血管的過程，它是包括生殖、發育和傷口修復在內的正常機體活性所必需的。儘管沒有完全了解該過程，但據信它包括調節內皮細胞(毛細血管的初級細胞)生長的分子的複雜的相互作用。在正常條件下，這些分子似乎將微脈管系統保持在靜止狀態(即沒有任何毛細管生長)，其保持時間可以持續長達數周，在某些情況下長達數十年。必要時(諸如在傷口修復期間)，這些同樣的分子可以在5天內經歷快速增殖和轉換(folkman,J．和Shing,Y.,The Journal ofBiological Chemistry,267(16),10931-10934，以及Folman,J．和Klagsbrun,M.,Science,235,442-447(1987)。
儘管血管生成在正常情況下為高度受調節的過程，但持久的非調節血管生成引起許多疾病(以血管生成疾病為特徵)。另有陳述，非調節的血管生成或者可以直接引特定的疾病，或者可以使現有病況惡化。例如，已經暗示眼新血管形成為眼盲的最常見的原因，並控制大約20種眼病。在諸如關節炎的某些現有疾病中，新形成的毛細血管侵入所述關節並破壞軟骨。在糖尿病中，在視網膜中形成的新毛細管侵入玻璃體、出血並引起眼盲。實體瘤的生長和轉移也依賴於血管生成(Folkman,J.,Cancer Research,46,467-473(1986),Folkman,J.,Journalof the National Cancer Institute,82,4-6(1989)。例如已經表明，增大至2mm以上的腫瘤必須獲得它們自身的血供應，並通過誘導新毛細血管生長而獲得血供應。一旦這些新血管包埋於該腫瘤中，它們則提供腫瘤細胞進入循環的工具，並轉移到諸如肝臟、肺或骨之類的較遠部位(Weidner,N．等,The New England Journal of Medicine,324(1)1-8(1991))。
迄今為止，已經描述和特徵記述了幾種天然產生的血管生成因子(Fidler,J．和Ellis,L.M.,Cell,79:185-189(1994))。最近，O』Reilly等已經從患病腫瘤小鼠的血清和尿中分離並純化了一種抑制內皮細胞增殖的38千道爾頓(kDa)蛋白(O』Reilly,M．等，Cell,79:315-328(1994)和於1995年11月2日公布的國際申請WO 95/29242)。該內皮抑制劑的微序列分析表明與鼠血纖溶酶源內部片段有98％的序列同源性。作為鼠抑制劑片段命名的制管張素為包括鼠血纖溶酶源前四個kringle區的肽。來自人血纖溶酶源同一區的肽片段(即含有kringle 1-4)在體外和體內也強烈地抑制毛細管內皮細胞的增殖。衍生該肽片段的完整的血纖溶酶源不具有有效抑制劑的作用。
目前正在開發用於治療血管生成疾病的幾種血管生成抑制劑(Gasparini,G．和Harris,A.L.，J.Clin,Oncol.,13(3):765-782,(1995))，但這些化合物有一些相關的缺點。例如，蘇拉明是一種有效的抑制劑，但在抗腫瘤活性所需的劑量下引起人嚴重的系統性毒性。諸如retinoid、幹擾素和抗雌激素之類的化合物對於人類使用是安全的，但具有弱抗血管生成作用。另外的化合物可能難以製備或製備成本高。
因此，需要可用於治療哺乳動物血管生成疾病的化合物。更具體地講，需要治療使用安全的血管生成抑制劑，並且所述血管生成抑制劑例如通過選擇性地抑制內皮細胞增殖，同時對正常(即非癌性)細胞不表現出或表現出低程度毒性，對於病理狀態表現出選擇性毒性。這類化合物也應該容易並且成本有效地製備。
發明概述在本發明的基本實施方案中，本發明提供由結構式A-B-C-X-Y(Ⅰ)表示的kringle 5肽化合物或其藥學上可接受的鹽、酯或前體藥物，其中A不存在或為氮保護基團；Y不存在或為羧酸保護基團；B不存在或為相應於SEQ ID NO:1的大約胺基酸位置334至胺基酸位置530序列的1至大約197個天然產生的胺基酸殘基；C為R1-R2-R3-R4，其中R1為賴氨醯；R2為亮氨醯或精氨醯；R3為酪氨醯、3-I-酪氨醯或苯丙氨醯；R4為天冬氨醯；而X不存在或為相應於SEQ ID NO:1的胺基酸位置535至大約胺基酸位置546序列的1至大約12個天然產生的胺基酸殘基或其同源物(homologues)和類似物。
本發明也包括由結構式A-B1-C1-X1-Y(Ⅱ)表示的kringle 5肽化合物或其藥學上可接受的鹽、酯或前體藥物，其中A不存在或為氮保護基團；Y不存在或為羧酸保護基團；B1不存在或為相應於SEQ ID NO1的大約胺基酸位置334至胺基酸位置513序列的1至大約176個天然產生的胺基酸殘基；C1為SEQ ID NO:1的胺基酸位置514至胺基酸位置523的序列；而X1不存在或為相應於SEQ ID NO:1的胺基酸位置524至胺基酸位置533序列的1至大約10個天然產生的胺基酸殘基或其同源物和類似物。
本發明也包括需要抗血管生成療法的病人的治療方法，包括給與該病人含kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白的化合物。
本發明也包括需要抗血管生成療法的病人的治療組合物，它包括含kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白、kringle 5抗血清、kringle 5受體激動劑和拮抗劑以及連接細胞毒性藥物的kringle 5拮抗劑的化合物，所述化合物或者為單獨的或者與藥學上可接受的賦形劑和/或可選的緩釋化合物結合，以形成治療組合物。
本發明也包括選自癌症、結構域、黃斑變性和糖尿病性視網膜病的疾病的治療組合物，它包括含kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白的化合物。
本發明也包括一組合物，它包含分離的編碼kringle5肽片段或融合蛋白的單鏈或雙鏈多核苷酸序列。這樣的多核苷酸最好是DNA分子。本發明也包括含有編碼kringle 5肽片段或融合蛋白的DNA序列的載體，其中該載體存在於細胞中時，能夠表達kringle 5肽片段或kringle5融合蛋白，本發明也包括包含含載體的細胞的組合物，其中所述載體含有編碼kringle 5肽片段和kringle 5融合蛋白的DNA序列。本發明還包括基因治療方法，用此方法，將編碼kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白或kringle 5肽片段綴合物的DNA序列導入病人中，以體內修飾kringle 5水平。
本發明也包括製備kringle 5肽片段的方法，包括步驟(a)將哺乳動物血纖溶酶源以大約1∶100至大約1∶300的比率暴露於人或豬彈性蛋白酶，以形成所述血纖溶酶源和所述彈性蛋白酶的混合物；(b)溫育所述混合物並且(c)從所述混合物中分離所述kringle 5肽片段。
本發明也包括kringle 5肽片段的製備方法，包括步驟(a)將哺乳動物血纖溶酶源以大約1∶100至大約1∶300的彈性蛋白酶血纖溶酶源之比暴露於人或豬彈性蛋白酶，以形成所述血纖溶酶源和所述彈性蛋白酶的混合物；(b)溫育所述混合物；並(c)從所述混合物中分離所述kringle 5肽片段的蛋白綴合物；(d)將所述kringle 5肽片段的蛋白綴合物以1∶0.2的比率暴露於胃蛋白酶，以形成所述胃蛋白酶和所述血纖溶酶源的混合物，並且(d)從所述混合物中分離所述kringle 5肽片段。另一方面，可以用以下方法製備kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白，所述方法包括步驟(a)分離編碼kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白的多核苷酸；(b)將該多核苷酸克隆到表達載體中；(c)將該載體轉化到合適的宿主細胞中；並且讓所述宿主細胞在適於可溶性kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白表達的條件下生長。
附圖簡述

圖1顯示人血纖溶酶源的胺基酸序列(SEQ ID NO:1)。
圖2顯示人(SEQ ID NO:34)、鼠(SEQ ID NO:35)、獼猴(SEQ IDNO:36)、牛(SEQ ID NO:37)和豬(SEQ ED NO:38)kringle5的比較同源性。
圖3顯示人血纖溶酶源的DNA序列(SEQ ID NO:12)。
圖4顯示在體外細胞增殖測定中測試時，單劑量的不同kringle片段對牛毛細管內皮(BCE)細胞的抗增殖活性的圖表。
圖5顯示表達載體pHil-D8的圖譜，該載體含有重組蛋白分泌的前導序列。
圖6顯示表達kringle 5肽片段或融合蛋白的巴斯德畢赤酵母培養物上清液(10微升/泳道)的考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE凝膠照片的掃描。泳道1、6和10陰性對照；泳道2、3和4表達K5A的三種不同克隆；泳道5表達K5F的克隆；泳道7和8表達K4-5A的克隆；泳道9表達K4-5F的克隆。箭頭指示K5A(大約11 kDa)和K4-5F(大約20kDa)的蛋白帶。分子量標準參照物示於前述泳道1和10的泳道中。
圖7顯示表達kringle 5肽片段或融合蛋白的大腸桿菌菌株的掃描考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE凝膠。除非另外陳述，否則每一泳道都含有10 μl相當於A600為10的培養物材料。泳道1低分子量標準參照物；泳道2K5A/pET32a，總培養物；泳道3K5A/pET32a，總培養物(泳道2培養物的1/10)；泳道4K5A/pET32a，可溶性部分；泳道5K5A/pET32a，不溶性部分；泳道6K4-5A/pET32a，總培養物；泳道7K4-5A/pET32a，總培養物(泳道6培養物的1/10)；泳道8K4-5A/pET32a，可溶性部分；泳道9:K4-5A/pET32a，不溶性部分；泳道10:K4-5A/pGEX-4T-2，總培養物；泳道11:K4-5A/pGEX-4T-2，可溶性部分；泳道12:K4-5A/pGEX-4T-2，不溶性部分；泳道13:kringle 5標準；泳道14高分子量標準參照物。
發明詳述本文所用的術語「kringle 5」(下文的K5)是指哺乳動物血纖溶酶源具有三個二硫鍵的區域，該區影響哺乳動物血纖溶酶源分子第五個kringle區限定的特定三圍構象。一個這樣的二硫鍵連接胺基酸位置462和541的半胱氨酸殘基，第二個二硫鍵連接胺基酸位置483和524的半胱氨酸殘基，第三個二硫鍵連接胺基酸位置512和536的半胱氨酸殘基。包括其kringle 5區在內的完整的哺乳動物血纖溶酶源分子(人血纖溶酶源分子)的胺基酸序列示於圖1(SEQ ID NO:1)。
本文所用的術語「kringle 5肽片段」是指4-104胺基酸(包括4和104胺基酸)之間的肽，其序列於人血纖溶酶源相應的肽片段大致同源，在完整哺乳動物血纖溶酶源的大約胺基酸位置443具有α-N末端，在大約位置546具有α-C末端。所述kringle 5肽片段的總長可以隨獲得所述kringle 5肽的方法而變化，或者根據獲得它的物種，在序列中可以略微改變。例如，可以採用人或豬彈性蛋白酶，通過蛋白水解切割glu-血纖溶酶源、lys-血纖溶酶源或小血纖溶酶源(miniplasminogen)，產生某些形式的kringle 5肽片段。當以該方式產生時，所述肽殘基的α-C末端位於SEQ ID NO:1的大約胺基酸543，但所述α-N末端可以開始於胺基酸位置443、449或454。因此，由人或豬彈性蛋白酶消化glu-血纖溶酶源、lys-血纖溶酶源或小血纖溶酶源產生的kringle 5肽片段的總長度可以或者為101個胺基酸、95個胺基酸，或者為90個胺基酸。這些kringle 5肽片段的概述示於表1。當以上述方式產生時，獲得這三種片段的庫，其中大約60％的所述片段的長度為95個胺基酸，大約35％的所述片段的長度為101個胺基酸，大約5％的所述片段的長度為90個胺基酸。需要時，這些不同的片段可以通過本領域技術人員熟知的技術反向HPLC進一步純化。雖然存在這種長度的變化，但本發明的K5肽片段仍然包括或者序列Lys-Leu-Tyr-Asp(即從SEQ ID NO:1的胺基酸位置531至胺基酸位置534)或者Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-Gly-Pro-Trp(即從SEQ ID NO:1的胺基酸位置514至胺基酸位置523)或其類似物。
本文所用的術語「kringle 5融合蛋白」是指包含從兩個或多個單獨的蛋白取出的胺基酸序列的多核苷酸，其中一個胺基酸序列為K5肽片段。將kringle 5肽片段的編碼序列與至少一種其它多肽的編碼序列連接，使得這兩個(或更多)讀框在同一讀框內，通過表達這樣一個多核苷酸形成融合蛋白。優選的kringle 5融合蛋白為其中kringle 5肽片段融合到人血纖溶酶源相應序列的那些kringle 5融合蛋白，所述人血纖溶酶源相應序列諸如為kringle 4(K4)、kringle 3-4(K3-4)、kringle2-4(K2-4)和kringle 1-4(K1-4)。優選的K5融合蛋白是kringle 4-5(K4-5)。本發明kringle 5融合蛋白的其它例子包括K5肽片段或連接到生物標記的K4-5。這種融合蛋白可能能夠或不能切割為分離的衍生它們的蛋白。
本文所用的術語「K5肽片段綴合物」是指化學上於另一蛋白偶聯形成綴合物的kringle 5肽片段。kringle 5肽片段綴合物的例子包括偶聯到白蛋白或哺乳動物血纖溶酶源另一kringle區的肽片段上的kringle 5肽片段。kringle 5肽片段綴合物的分子量為大約1,000至大約25,000 kDa。
本文所用的術語「序列大致同源性」是指人血纖溶酶源相應肽序列大約60％的胺基酸相同，優選至少大約70％的胺基酸相同，更優選大約80％的胺基酸相同，最優選大約95％的胺基酸相同。其序列與人血纖溶酶源大致同源的序列稱為「同源物」。除具有序列大致同源性外，本發明的同源物證明生物學活性(即抗血管生成活性)與本文所述K5肽片段的相似。因為kringle 5肽片段的胺基酸序列或胺基酸數目在種與種之間或不同生產方法之間可以有所不同，所以kringle 5肽片段中的胺基酸總數在某些情況下不能精確地限定。已知這些序列至少73％的胺基酸相同，應該理解，kringle 5肽片段的胺基酸序列在物種之間大致相似，並且kringle 5肽片段的生產方法提供序列與人血纖溶酶源相應胺基酸序列大致同源的kringle 5肽片段。圖2顯示具有95個胺基酸的人kringle 5肽片段的胺基酸序列(SEQ ID NO:34)與鼠(SEQID NO:35)、獼猴(SEQ ID NO:36)、牛(SEQ ID NO:37)和豬(SEQ ID NO:38)血纖溶酶源kringle 5片段序列的比較。
本發明也設想了這樣的胺基酸殘基序列，它們與本文提出的序列類似，使得那些序列(類似物)證明生物學活性與公開的kringle 5肽片段或其融合蛋白的生物學活性相象。本領域眾所周知可以進行修飾和改變，而大致不改變該肽生物學功能。在製造這種改變中，可以在如為其大小、電荷、疏水性、親水性等等的側鏈取代基相對相似的基礎上，進行相象胺基酸殘基的置換。可以進行所述類型的改變，以增強所述肽的效力或對酶促分解或藥物動力學的穩定性。因此，本發明範圍內認定的序列包括特徵為胺基酸殘基序列或類型改變的那些類似物序列，其中所述改變不改變上述K5肽片段和/或融合蛋白的基本性質和生物學活性。
可以在測試其體外抑制牛毛細管(BCE)細胞生長的能力時的效力的基礎上，特徵鑑定本發明的K5肽片段或K5融合蛋白。表1和圖4的數據說明，具有SEQ ID NO:1胺基酸位置443至胺基酸位置543序列的K5肽片段與具有SEQ ID NO:1的胺基酸位置443至胺基酸位置546序列的kringle 5肽片段相比，表現出活性提高大約300倍(即抑制BCE細胞增殖)，與kringle 1-4肽片段相比，活性提高大約800倍。
本文所用的術語「分離的」是指該材料從其原始環境(例如若它是天然產生的，則為所述天然環境)中取出。例如天然產生的多核苷酸或活動物中存在的多肽是不分離的，但從所述天然系統中某些或所有共存材料中分離出來的同一多核苷酸或DNA或多肽則是分離的。這類多核苷酸可以是載體的部分和/或這種多核苷酸或多肽可以是組合物的部分，它們仍是分離的，因為該載體或組合物不是其天然環境的部分。
術語「引物」表示與靶核苷酸序列互補的特定寡核苷酸序列，用來與該靶核苷酸雜交，並用作或者由DNA聚合酶、RNA聚合酶或者由逆轉錄酶催化的核苷酸聚合的起始點。
術語「探針」表示限定的核酸區段(或核苷酸類似物區段，即PNA)，它可以用來鑑別樣品中存在的含有所述互補序列的特定DNA。
本文所用的「重組多肽」是指至少一種多肽，根據其來源或操作，它們不與其天然相連的多肽的所有部分或一部分相連和/或與天然連接多肽以外的肽連接。重組或衍生多肽不必從指定核酸序列翻譯。它也可以以任何方式產生，所述方式包括化學合成或重組表達系統的表達。
本文所用的術語「合成肽」是指任何長度的胺基酸聚合形式，它可以用本領域技術人員熟知的方法合成。這些合成肽可用於不同應用。
「純化的多核苷酸」是指基本上是游離的目的多核苷酸或其片段，即含有低於大約50％、優選低於大約70％、更優選低於大約90％的與所述多核苷酸天然相連的蛋白。純化目的多核苷酸的技術是本領域眾所周知的，例如包括用破膜試劑破碎含有所述多核苷酸的細胞，並通過離子交換層析、親和層析和根據密度的沉澱分離所述多核苷酸和蛋白。因此，「純化多肽」是指基本上游離的多肽，即含有低於大約50％、優選低於大約70％、更優選低於大約90％的與所述目的多肽天然相連的細胞組分。純化方法是本領域已知的。
本文所用的「多肽」表示胺基酸分子鏈，不是指該產物的特定長度。因此，肽、寡肽和蛋白都包括在多肽的定義內。該術語也意指該多肽表達後的修飾，例如糖基化、醯化、磷酸化等等。
「重組宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」「細胞培養物」和其它這類表示微生物或作為單細胞實體的高等真核生物細胞系培養物的術語，是指可以用作或已經用作重組載體或其它轉移的DNA的受體的細胞，並包括已經轉染的原始細胞的最初子代。
本文所用的「複製子」是指任何遺傳元件，例如表現為細胞內多核苷酸複製的自主單位的質粒、染色體和病毒。
「載體」為一種複製子，其中連接另一多核苷酸區段，諸如引起複製和/或表達連接的區段。
術語「控制序列」是指實現與其連接的編碼序列表達所需的多核苷酸序列。這類控制序列的性質隨宿主生物而改變。在原核生物中，這類控制序列一般包括啟動子、核糖體結合位點和終止子；在真核生物中，這類控制序列一般包括啟動子、終止子以及在某些情況下的增強子。因此，術語「控制序列」計劃包括其存在對表達是必需的最低限度的所有組分，也可以包括其存在是有利的其它組分，例如前導序列。
「可操作性地(operably)連接的」是指這樣一種情況，在這種情況下所述組分處於允許它們以其計劃的方式起作用的關係之中。因此，例如「可操作性地連接」到一編碼序列的控制序列以這樣的方式連接，使得在與所述控制序列相容的條件下實現該編碼序列的表達。
術語「可讀框」或「ORF」是指編碼多肽的多核苷酸序列區；該區可以代表一部分編碼序列或總編碼序列。
「編碼序列」是置於適當調節序列控制下時轉錄為mRNA並翻譯為多肽的多核苷酸序列。該編碼序列的邊界由所述5』末端的翻譯起始密碼子和所述3』末端的翻譯終止密碼子確定的。編碼序列可以包括但不限於mRNA、cDNA和重組多核苷酸序列。
術語「轉化」是指宿主細胞中的外源多核苷酸插入片段，與插入使用的方法無關。包括例如直接攝取、轉導或f交配。所述外源多核苷酸可以作為例如質粒的非整合載體保持，或者可以整合到宿主基因組中。
「純化的產物」是指產物的製劑，所述產物已經和與其正常相連的細胞組分分離，並和目的樣品中存在的其它類型的細胞分離。
所有肽序列按照普遍接受的慣例書寫，由此所述α-N末端胺基酸殘基在左邊，而所述α-C末端在右邊。本文所用的術語「α-N末端」是指肽中胺基酸的游離α-氨基，術語「α-C末端」是指肽中胺基酸的游離α-羧酸末端。
本文所用的術語「N-保護基團」是指計劃在合成步驟中保護胺基酸或肽的α-N末端或者換句話說保護胺基酸或肽的所述氨基抵抗不良反應的那些基團。在Greene,「Protective Groups In Organic Synthesis,」(John Wiley Sons，紐約(1981))中公開了常用的N-保護基團，該文獻通過引用結合到本文中。另外，保護基團可以用作體內易於例如通過酶促水解切割以釋放生物學活性母體的前體藥物。N-保護基團包括低級鏈烷醯基，諸如甲醯基、乙醯基(「Ac」)、丙醯基、戊醯基、叔丁基乙醯基等等；其它醯基，包括2-氯乙醯基、2-溴乙醯基、三氟乙醯基、三氯乙醯基、鄰苯二醯基、鄰硝基苯氧基乙醯基、α-氯丁醯基、苯甲醯基、4-氯苯甲醯基、4-溴苯甲醯基、4-硝基苯甲醯基等等；磺醯基，諸如苯磺醯基、對甲苯磺醯基等等；氨基甲酸酯形成基團，諸如苄酯基、對氯苄酯基、對甲氧基苄酯基、對硝基苄酯基、2-硝基苄酯基、對溴苄酯基、3,4-二甲氧基苄酯基、3,5-二甲氧基苄酯基、2,4-二甲氧基苄酯基、4-甲氧基苄酯基、2-硝基-4,5-二甲氧基苄酯基、3,4,5-三甲氧基苄酯基、1-(對聯苯基)-1-甲基乙酯基、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基苄酯基、二苯甲酯基、叔丁酯基、二異丙基甲酯基、異丙酯基、乙酯基、甲酯基、烯丙酯基、2,2,2-三氯乙酯基、苯氧羰基、4-硝基苯氧羰基、芴基-9-甲酯基、環戊酯基、金剛烷酯基(adamantyloxycarbony1)、環己酯基、苯硫羰基等等；芳烷基，諸如苄基、三苯甲基、苯氧基甲基、9-芴基甲酯基(Fmoc)等等和甲矽烷基，諸如三甲基甲矽烷基等等。優選的N-保護基團為甲醯基、乙醯基、苯甲醯基、戊醯基、叔丁基乙醯基、苯磺醯基、苄基、叔丁酯基(Boc)和苄酯基(Cbz)。例如可以用酸不穩定基團(例如Boc)保護賴氨酸的α-N末端，用鹼不穩定基團(例如Fmoc)保護ε-N末端，然後在合成期間選擇性地去保護。
本文所用的術語「羧基保護基團」是指羧酸保護性酯或醯胺基團，它們用來阻斷或保護所述羧酸官能度，同時進行涉及該化合物其它官能位點的反應。在Greene，「Protective Groups In OrganicSynthesis，」第152-186頁(1981)中公開了常用的羧基保護基團，該文獻通過引用結合到本文中。另外，羧基保護基團可以用作體內易於例如通過酶促水解切割以釋放生物學活性母體的前體藥物。這類羧基保護基團是本領域技術人員熟知的，已經廣泛用於如美國專利3,840,556號和3,719,667號中所述的青黴素和頭孢黴素領域中的羧基保護中，這些專利說明書通過引用結合到本文中。代表性的羧基保護基團為C1-C8低級烷基(例如甲基、乙基或叔丁基等等)；芳烷基，諸如苯乙基或苄基和其取代衍生物，諸如烷氧基苄基或硝基苄基等等；芳基鏈烯基，諸如苯基乙烯基等等；芳基及其取代衍生物，諸如5-2,3-二氫化茚基等等；二烷基氨基烷基，諸如二甲基氨乙基等等)；鏈烷酸基烷基，諸如乙酸基甲基、丁酸基甲基、戊酸基甲基、異丁酸基甲基、異戊酸基甲基、1-(丙酸基)-1-乙基、1-(戊酸基)-1-乙基、1-甲基-1-(丙酸基)-1-乙基、戊酸基甲基、丙酸基甲基等等；環烷酸基烷基，諸如環丙酸基、環丁醯基甲基、環戊醯基甲基、環己醯基甲基等等；芳酸基烷基，諸如苯甲醯基甲基、苯甲醯基乙基等等；芳烷酸基烷基，諸如苯甲酸基甲基、2-苯甲酸基甲基等等；鏈烷酯基烷基或環烷酯基烷基，諸如甲酯基甲基、環己酯基甲基、1-甲酯基-1-乙基等等；鏈烷氧羰基氧基烷基或環烷酯基氧基烷基，諸如甲氧羰基氧基甲基、叔丁氧羰基氧基甲基、1-乙氧羰基氧基-1-乙基、1-環己氧羰基氧基-1-乙基等等；芳氧羰基氧基烷基，諸如2-(苯氧基羰基氧基)乙基、2-(5-2,3-二氫化氧羰基氧基)乙基等等；烷氧基烷酯基烷基，諸如2-(1-甲氧基-2-甲基丙-2-酯基)乙基等等；芳基鏈烷氧羰基氧基烷基，諸如2-(苄氧羰基氧基)乙基等等；芳基鏈烯氧羰基氧基烷基，諸如2-(3-苯基丙烯-2-基氧羰基氧基)乙基等等；鏈烷氧羰基氨基烷基，諸如叔丁氧羰基氨甲基等等；烷基氨基羰基氨基烷基，諸如甲基氨基羰基氨甲基等等；鏈烷醯基氨基烷基，諸如乙醯基氨基甲基等等；雜環羰基氧基烷基，諸如4-甲基哌嗪基羰基氧基甲基等等；二烷基氨基羰基烷基，諸如二甲基氨基羰基甲基、二乙基氨基羰基甲基等等；(5-(低級烷基)-2-氧代-1,3-二氧雜環戊烯-4-基)烷基，諸如(5-叔丁基-2-氧代-1,3-二氧雜環戊烯-4-基)甲基等等；和(5-苯基-2-氧代-1,3-二氧雜環戊烯-4-基)烷基，諸如(5-苯基-2-氧代-1,3-二氧雜環戊烯-4-基)甲基等等。
代表性的醯胺羧基保護基團為氨基羰基和低級烷基氨基羰基。
本發明的優選羧基保護基團為這樣的化合物，其中受保護的羧基為低級烷基、環烷基或芳烷基酯，例如甲酯、乙酯、丙酯、異丙酯、丁酯、仲丁酯、異丁酯、戊酯、異戊酯辛酯、環己酯、苯甲酯等等或鏈烷酸基烷基、環烷酸基烷基、芳酸基烷基或芳烷基酯基烷基酯。優選的醯胺羧基保護基團為低級烷基氨基羰基。例如可以用酸不穩定基團(例如叔丁基)保護天冬氨酸的α-C末端，用氫化不穩定基團(例如苄基)保護β-C末端，在合成期間選擇性地去保護。
本文所用的術語「低級烷基氨基羰基」是指將合成的kringle 5肽片段的α-C末端封端的-C(O)NHR10基團，其中R10為C1-C4烷基。
本文所用的術語「氨基羰基」表示將合成的kringle 5肽片段的α-C末端封端的-C(O)NH2基團。
本文所用的術語「前體藥物」是指易於在體內例如通過血液中的酶促水解轉化產生母體化合物的化合物。在A.C.S．論文集系列的T.Higuchi和V.Stella,Prodrugs as Novel Delivery Systems，第14卷和Edward B.Roche編輯的Bioreversible Cariers in Drug Design,AmericanPharmaceutical Associtation and Permagon Press,1987中提供了全面的討論，這兩個文獻通過引用結合到本文中。
本文所用的術語「藥學上可接受的前體藥物」是指(1)本發明化合物的那些前體藥物，它們在正確的醫學判斷範圍內，適用於與人類和低等動物的組織接觸，而沒有過度的毒性、刺激、過敏反應等等，與合適的利益與風險之比相稱，並且對於其計劃的用途是有效的，以及(2)兩性離子形式，可能時為母體化合物的兩性離子形式。
本文所用的術語「活化酯衍生物」是指醯基滷，諸如醯基氯，活化酯包括但不限於甲酸和乙酸衍生的酸酐、由諸如異丁醯基氯等等的鏈烷醯基滷衍生的酸酐、N-羥基苯並三唑衍生的酯、N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲醯胺衍生的酯、2,4,5-三氯苯酚衍生的酯等等。
本文所用的術語「抗血管生成活性」是指分子抑制血管生長的能力。
本文所用的術語「內皮抑制活性」是指分子大體上抑制血管生成的能力，例如在成纖維細胞生長因子或其它已知生長因子存在下抑制培養中的牛毛細管內皮細胞生長或遷移的能力。
本文所用的術語「ED50」為kringle 5肽片段或融合蛋白的劑量的縮寫，與在沒有所述抑制劑情況下生長或遷移的情況相比，該劑量在成纖維細胞生長因子或其它已知生長因子存在下，有效地抑制半數血管生長或抑制培養中的半數牛毛細管內皮細胞生長、或抑制半數內皮細胞遷移。
對於大部分而言，本文所用的天然產生的胺基酸和本文所用的氨醯基殘基的名稱採納IUPAC委員會對有機化學命名法和IUPAC-IUB委員會對α-胺基酸命名法(推薦，1974),Biochemistry,14(2),(1975)中提出的生化命名法建議的命名習慣。因此，術語「Ala」、「Arg」、「Asn」、「Asp」、「Cys」、「Gln」、「Glu」、「Gly」、「His」、「Ile」、「Leu」、「Lys」、「Met」、「Phe」、「Pro」、「Ser」、「Thr」、「Trp」、「Tyr」和「Val」是指胺基酸丙氨酸、精氨酸、天冬醯胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸，肽中其相應的氨醯基殘基為L-、D-或D,L-形式。沒有指明具體構象時，本領域技術人員應該理解，本說明書和所附權利要求書中所述肽中胺基酸和氨醯基殘基的α-碳的立體化學為天然產生的構象或「L」構象，非手性分子甘氨酸除外，非手性或者指明為「D-」的任何胺基酸也除外。
本文所用的術語「3-I-Tyr」是指L-、D-或D,L-酪氨醯殘基，其中苯酚羥基鄰位的氫基被碘基取代。所述碘基可以是放射性的或非放射性的。
本發明也設想了具有非天然產生側鏈殘基的胺基酸殘基，諸如高苯丙氨酸、苯基甘氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸、鳥氨酸、噻唑醯基丙氨酸(thiazoylalanine)(2-、4-和5-取代的)等等。
因此應該理解，本發明設想包括kringle 5肽片段和kringle 5融合蛋白具有抗血管生成活性的任何衍生物，包括整類本文所述kringle 5肽片段和融合蛋白及其片段和蛋白的同源物或類似物。因此，本發明不取決於生產kringle 5肽片段或融合蛋白的方式，即通過(1)蛋白水解切割分離哺乳動物血纖溶酶源，(2)通過具有kringle 5肽片段或融合蛋白胺基酸序列的編碼多核苷酸的重組分子的表達，以及(3)本領域技術人員已知的固相合成技術。
在一個實施方案中，本發明提供具有一般結構B-C-X的肽，其中B為88個殘基的肽，它起始於SEQ ID NO:1的Val443，終止於Arg530；C為4個殘基的肽，其中R1和R4為先前定義的，R2為亮氨醯，而R3為酪氨醯；X為9個殘基的肽，它起始於SEQ ID NO:1的Tyr535，終止於Ala543。
在另一實施方案中，本發明提供具有一般結構B-C-X的肽，其中B為82個殘基的肽，它起始於SEQ ID NO:1的Val449，終止於Arg530；C為4個殘基的肽，其中R1和R4為先前定義的，R2為亮氨醯，而R3為酪氨醯；X為9個殘基的肽，它起始於SEQ ID NO:1的Tyr535，終止於Ala543。
在再一個實施方案中，本發明提供具有一般結構B-C-X的肽，其中B為77個殘基的肽，它起始於SEQ ID NO:1的Val454，終止於Arg530；C為4個殘基的肽，其中R1和R4為先前定義的，R2為亮氨醯，而R3為酪氨醯；X為9個殘基的肽，它起始於SEQ ID NO:1的Tyr535，終止於Ala543。
在再一個實施方案中，本發明提供具有一般結構B-C-X的肽，其中B為88個殘基的肽，它起始於SEQ ID NO:1的Val443，終止於Arg530；C為4個殘基的肽，其中R1和R4為先前定義的，R2為亮氨醯，而R3為酪氨醯；X為12個殘基的肽，它起始於SEQ ID NO:1的Tyr535，終止於Phe546。
在再一個實施方案中，本發明提供具有一般結構B-C-X的肽，其中B為82個殘基的肽，它起始於SEQ ID NO:1的Val449，終止於Arg530；C為4個殘基的肽，其中R1和R4為先前定義的，R2為亮氨醯，而R3為酪氨醯；X為12個殘基的肽，它起始於SEQ ID NO:1的Tyr535，終止於Phe546。
在再一個實施方案中，本發明提供具有一般結構B-C-X的肽，其中B為77個殘基的肽，它起始於SEQ ID NO:1的Val449，終止於Arg530；C為4個殘基的肽，其中R1和R4為先前定義的，R2為亮氨醯，而R3為酪氨醯；X為12個殘基的肽，它起始於SEQ ID NO:1的Tyr535，終止於Phe546。
在再一個實施方案中，本發明提供具有一般結構B-C-X的肽，其中B為176個殘基的肽，它起始於SEQ ID NO:1的Val355，終止於Arg530；C為4個殘基的肽，其中R1和R4為先前定義的，R2為亮氨醯，而R3為酪氨醯；X為12個殘基的肽，它起始於SEQ ID NO:1的Tyr535，終止於Ala543。
在再一個實施方案中，本發明提供具有一般結構B-C-X的肽，其中B為176個殘基的肽，它起始於SEQ ID NO:1的Val355，終止於Arg530；C為4個殘基的肽，其中R1和R4為先前定義的，R2為亮氨醯，而R3為酪氨醯；X為12個殘基的肽，它起始於SEQ ID NO:1的Tyr535，終止於Phe546。
在再一個實施方案中，本發明提供具有一般結構A-C-Y的肽，其中A為乙醯基；C為4個殘基的肽，其中R1和R4為先前定義的，R2為亮氨醯，而R3為酪氨醯；Y為氨基羰基。
在再一個實施方案中，本發明提供具有一般結構A-C-X-Y的肽，其中A為乙醯基；C為4個殘基的肽，其中R1和R4為先前定義的，R2為亮氨醯，而R3為酪氨醯；X為酪氨酸；而Y為氨基羰基。
在再一個實施方案中，本發明提供具有一般結構A-B-C-Y的肽，其中A為乙醯基；B為起始於SEQ ID NO:1的胺基酸位置Pro529並終止於胺基酸位置Arg530的二肽；C為4個殘基的肽，其中R1和R4為先前定義的，R2為亮氨醯，而R3為酪氨醯；而Y為氨基羰基。
在再一個實施方案中，本發明提供具有一般結構A-B-C-Y的肽，其中A為乙醯基；B為起始於SEQ ID NO:1的胺基酸位置Pro529並終止於胺基酸位置Arg530的二肽；C為4個殘基的肽，其中R1和R4為先前定義的，R2為亮氨醯，而R3為酪氨醯；Y為氨基羰基。
在再一個實施方案中，本發明提供具有一般結構A-B-C-X-Y的肽，其中A為乙醯基；B為起始於SEQ ID NO:1的胺基酸位置Tyr525並終止於胺基酸位置Arg530的六肽；C為4個殘基的肽，其中R1和R4為先前定義的，R2為亮氨醯，而R3為酪氨醯；X為酪氨醯；Y為氨基羰基。
在再一個實施方案中，本發明提供具有一般結構A-B-C-X-Y的肽，其中A為乙醯基；B為精氨醯；C為4個殘基的肽，其中R1和R4為先前定義的，R2為亮氨醯，而R3為酪氨醯；X為酪氨醯；Y為氨基羰基。
在再一個實施方案中，本發明提供具有一般結構A-B-C-X-Y的肽，其中A為乙醯基；B為起始於SEQ ID NO:1的胺基酸位置Pro529並終止於胺基酸位置Arg530的二肽；C為4個殘基的肽，其中R1和R4為先前定義的，R2為亮氨醯，而R3為酪氨醯；X為3-I-酪氨醯；Y為氨基羰基。
在再一個實施方案中，本發明提供具有一般結構A-B-C-X-Y的肽，其中A為乙醯基；B為起始於SEQ ID NO:1的胺基酸位置Pro529並終止於胺基酸位置Arg530的二肽；C為4個殘基的肽，其中R1和R4為先前定義的，R2為亮氨醯，而R3為酪氨醯；X為酪氨醯；Y為氨基羰基。
在再一個實施方案中，本發明提供具有一般結構A-B1-C1-X1-Y的肽，其中A為乙醯基；B1和X1不存在，C1為起始於SEQ ID NO:1的胺基酸位置Arg514並終止於胺基酸位置Trp523的10個殘基的肽；Y為氨基羰基。
代表性的本發明化合物包括這樣的化合物，其中A乙醯基，Y為氨基羰基，而B-C-X為(a)SEQ ID NO:1的胺基酸位置355-543的序列；(b)SEQ ID NO:1的胺基酸位置355-546的序列；(c)SEQ ID NO:1的胺基酸位置443-543的序列；(d)SEQ ID NO:1的胺基酸位置449-543的序列；(e)SEQ ID NO:1的胺基酸位置454-543的序列；(f)SEQ ID NO:1的胺基酸位置443-546的序列；(g)SEQ ID NO:1的胺基酸位置449-546的序列；(h)SEQ ID NO:1的胺基酸位置454-546的序列；(i)SEQ ID NO:1的胺基酸位置525-535的序列；(j)SEQ ID NO:1的胺基酸位置529-535的序列；以及(k)SEQ ID NO:1的胺基酸位置530-535的序列。
另一代表性的本發明化合物為下述化合物其中A乙醯基，Y為氨基羰基，而B1-C1-X1為SEQ ID NO:1的胺基酸位置514-523的序列。
通過表達包含其序列編碼具有kringle 5肽片段的蛋白的多核苷酸的重組分子，並且純化表達的肽產物，可以獲得K5片段或K5融合蛋白(參見Menhart,N.等，Biochemistry,32:8799-8806(1993)。已經公布了人血纖溶酶源的DNA序列(Browne,M.J.等，Fiobrinolysis,5(4):257-260(1991)並示於圖3(a-b)(SEQ ID NO:12)中。編碼kringle 5的多核苷酸序列起始於SEQ ID NO:12的大約核苷酸位置1421，並終止於大約核苷酸位置1723。
通過以下步驟，可以從表達高水平人血纖溶酶源或K5融合蛋白的細胞或組織中分離編碼K5肽片段或K5融合蛋白的基因，所述步驟為(1)從所述組織或細胞分離信使RNA，(2)用逆轉錄酶產生相應的DNA序列，並且(3)採用聚合酶鏈式反應(PCR)，用合適的引物擴增編碼所述活性K5胺基酸序列或其融合蛋白的DNA序列。此外，可以將編碼K5肽片段或K5融合蛋白的多核苷酸克隆到任何市售的表達載體(諸如pBR322、pUC載體等等)或表達/純化載體(諸如GST融合載體(Pharmacia,Piscataway,NJ))，然後在合適的原核生物、病毒或真核生物宿主中表達。然後，可以通過常規方法，或在商用表達/純化系統的情況下，按照廠商的說明，完成純化。
也可以用本領域技術人員已知的固相化學的標準方法，合成K5肽片段或K5融合蛋白。例如，可以按照Steward和Young所述步驟(Steward,J.M．和Young,J.D.,Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，Pierce Chemical Company,Rockford,IL,(1984)，用Applied Biosystem的合成儀通過固相化學技術合成kringle 5肽片段。同樣，可以合成多個片段，然後連接在一起，形成更大的片段。也可以製備在特定位置上具有胺基酸置換的這些合成肽片段，以測試體外和體內抗血管生成活性。對於固相肽合成，可以在J.M.Stewart和J.D.Young,Solid PhasePeptide Synthesis,W.H.Freeman Co.(San Francisco),1963和J.Meienhofer,Hormonal Proteins and Peptides，第2卷，第46頁，Academic Press(紐約)，1973中發現所述許多技術的概述。對於典型的溶液合成，參見G.Schroder和Lupke,The Peptides，第1卷，AcacemicPress(紐約)。一般而言，這些方法包括連續將一種或多種胺基酸或適當保護的胺基酸加入生長中的肽鏈。通常，用適當的保護基團保護第一個胺基酸的或者氨基或者羧基。然後，受保護的或衍生的胺基酸或者連接到惰性固相支持體上，或者通過加入該序列中具有適當保護的互補(complimentary)(氨基或羧基)基團的下一個胺基酸，在適於形成醯胺鍵的條件下用於溶液中。然後從該新加入的胺基酸殘基上除去所述保護基團，加入下一個胺基酸(適當保護的)，依次類推。在所有所需胺基酸都已經連接入所述適當序列中後，連續或同時除去任何剩餘的保護基團(和任何固相支持體)，以提供最終的多肽。通過該一般方法的簡單的修改，例如通過將受保護三肽於適當保護的二肽偶聯(在不使手性中心消旋的條件下)，可以一次加入一個以上的胺基酸以使鏈生長，去保護後形成五肽。
特別優選的製備本發明化合物的方法包括固相肽合成，其中用酸或鹼敏感基團保護所述胺基酸的α-N末端。這類保護基團應該具有對肽鍵形成條件穩定的性質，同時易於除去，而不破壞生長中的肽鏈或使其中含有的手性中心消旋。合適的保護基團為9-芴基甲酯基(Fmoc)、叔丁酯基(Boc)、苄酯基(Cbz)、聯苯基異丙酯基、叔戊酯基、異冰片酯基、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基苄酯基、鄰硝基苯亞磺醯基、2-氰基-叔丁酯基等等。9-芴基甲酯基(Fmoc)保護基團特別優選用於kringle 5肽片段的合成。其它優選的側鏈保護基團，對於象賴氨酸和精氨酸的側鏈氨基，為2,2,5,7,8-五甲基苯並二氫吡喃-6-磺醯基(pmoc)、硝基、對甲苯磺醯基、4-甲氧基苯磺醯基、Cbz、Boc和金剛烷酯基；對於象酪氨酸的側鏈基團，為苄基、鄰溴苄酯基、2,6-二氯苄基、異丙基、叔丁基(t-Bu)、環己基、環戊基和乙醯基(Ac)；對於象蘇氨酸的側鏈基團，為叔丁基、苄基和四氫吡喃基；對於組氨酸的側鏈基團，為三苯甲基、苄基、Cbz、對甲苯磺醯基和2,4-二硝基苯基；對於色氨酸的側鏈基團，為甲醯基；對於天冬氨酸和穀氨酸的側鏈基團，為苄基和叔丁基，對於半胱氨酸的側鏈基團，為三苯基甲基(三苯甲基)。在固相肽合成方法中，將所述α-C末端胺基酸連接到適當固相支持體或樹脂上。適用於以上合成的固相支持體是下述材料它們對分步縮合-去保護反應的試劑和反應條件為惰性，並且在所用介質中為不溶性的。優選用於α-C末端羧基肽合成的固相支持體為4-羥甲基苯氧基甲基-共聚(苯乙烯-1％二乙烯苯)。優選用於α-C末端醯胺肽的固相支持體為得自Applied Biosystems(Foster City,CA)的4-(2』,4』-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧基乙醯氨基乙基樹脂。通過N,N』-二環己基碳二亞胺(DCC)、N,N』-二異丙基碳二亞胺(DIC)或O-苯並三唑-1-基-N,N,N』,N』,-四甲基脲鎓-六氟磷酸鹽(HBTU)，加入或不加入4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、1-羥基苯並三唑(HOBT)、苯並三唑-1-氧基-三(二甲基氨基)鏻-六氟磷酸鹽(BOP)或氯化雙(2-氧代-3-噁唑烷基)膦(BOPCl)，將所述α-C末端胺基酸偶聯到所述樹脂上，於10-50℃的溫度下，在諸如二氯甲烷或DMF的溶劑中介導偶聯大約1-24小時。當所述固相支持體為4-(2』,4』-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧基-乙醯氨基乙基樹脂時，在用α-C末端胺基酸按上述偶聯之前，用仲胺、最好是用哌啶切下所述Fmoc基團。優選用於偶聯到去保護4-(2』,4』-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)苯氧基-乙醯氨基乙基樹脂的方法是DMF中的O-苯並三唑-1-基-N,N,N』,N』,-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU,1當量)和1-羥基苯並三唑(HOBT,1當量)。正如本領域眾所周知的，在自動多肽合成儀中可以進行連續受保護胺基酸的偶聯。在最佳實施方案中，所述生長中的肽鏈的胺基酸的α-N末端用Fmoc保護。通過用仲胺，最好是用哌啶處理，完成從所述生長中的肽的α-N末端一側除去所述Fmoc保護基團。然後導入大約過量3倍摩爾濃度的每種受保護胺基酸，最好在DMF中進行所述偶聯。所述偶聯劑通常為O-苯並三唑-1-基-N,N,N』,N』,-四甲基脲鎓-六氟磷酸鹽(HBTU,1當量)和1-羥基苯並三唑(HOBT,1當量)。所述固相合成結束時，或者連續或者在單次操作中，從該樹脂取下所述多肽和去保護。通過用包含硫茴香醚、水、乙二硫醇和三氟乙酸的裂解試劑處理所述樹脂結合的多肽，可以在單次操作中完成取下所述多肽和去保護。當其中所述多肽的α-C末端為鏈烷醯胺時，通過用鏈烷胺氨解切除所述樹脂。另一方面，通過例如用甲醇進行酯基轉移然後氨解，或者通過直接進行醯胺基轉移，可以取下所述肽。所述受保護的肽可以在此時進行純化，或直接開始下一個步驟。採用上述裂解混合劑完成所述側鏈保護基團的除去。通過採用任何或所有以下類型的層析步驟的順序純化所述全面去保護的肽在弱鹼樹脂(乙酸鹽形式)上的離子交換；在未衍生的聚苯乙烯-二乙烯苯(例如Amberlite XAD)上的疏水性吸附層析；矽膠吸附層析；在羧甲基纖維素上的離子交換層析；例如在Sephadex G-25、LH-20上或逆流分布的分配層析；高效液相色譜(HPLC)，尤其是辛基-或十八基甲矽烷基-二氧化矽結合相柱填充的反向HPLC。採用快原子轟擊(FAB)質譜測定這些kringle 5肽片段的分子量。實施例1-12描述了固相kringle 5肽片段的合成。
根據如何生產kringle 5,kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白可以存在或者不存在哺乳動物血纖溶酶源kringle 5區的上述二硫鍵，或在具有其它哺乳動物血纖溶酶源kringle區的的融合蛋白情況下，可以存在或不存在具有相應區的二硫鍵，或可以存在形成與天然哺乳動物血纖溶酶源中發現的三級結構不同的三級結構的二硫鍵。通過用彈性蛋白酶和/胃蛋白酶(在從所述半胱氨酸鍵除去的位點酶切的酶)酶切Glu-血纖溶酶源、Lys-血纖溶酶源或小血纖溶酶源產生的kringle 5肽片段，將含有天然kringle 5蛋白的三級結構；通過固相肽合成製備的kringle 5肽片段可能含有或不含有胱氨醯氨醯基殘基，而通過表達製備的kringle 5肽片段可能在不同於酶切產生的kringle 5肽片段中發現的位置上具有二硫鍵。
包括但不限於所述實施例中具體描述的化合物的本發明化合物具有抗血管生成活性。作為血管生成抑制劑，這類化合物可用於治療下述器官的原發性和轉移的實體瘤和癌症乳腺；結腸；直腸；肺；口咽；咽；食管；胃；胰腺；肝臟；膽囊；膽道；小腸；尿道，包括腎、膀胱和輸尿管(urothelium)；雌性生殖道，包括子宮頸、子宮、卵巢、絨毛癌和妊娠滋養層疾病；雄性生殖道，包括前列腺、精囊、睪丸和生殖細胞腫瘤；內分泌腺，包括甲狀腺、腎上腺和腦垂體；皮膚，包括血管瘤、黑素瘤、由骨或軟組織產生的肉瘤和Kaposi氏肉瘤；腦、神經、眼和腦脊膜的腫瘤，包括星形細胞癌、神經膠質瘤、成膠質細胞瘤、成視網膜細胞瘤、神經瘤、成神經細胞瘤、神經鞘瘤和腦脊膜瘤；由造血器官惡性腫瘤引起的腫瘤，諸如白血病，並包括綠色瘤、漿細胞瘤、斑塊和蕈樣真菌病腫瘤和皮膚T細胞淋巴瘤/白血病；淋巴瘤，包括Hodgkin氏和非Hodgkin氏淋巴瘤；預防自身免疫病，包括類風溼性關節炎、免疫性關節炎和變性關節炎；眼病，包括糖尿病性視網膜病、早熟性視網膜病、角膜移植排斥、晶狀體後纖維組織形成、新血管性青光眼、發紅、由黃斑變性和缺氧引起的視網膜新血管形成；眼的異常新血管形成疾病；皮膚病，包括牛皮癬；血管病，包括血管瘤和動脈粥樣硬化斑內的毛細管增殖；Osler-Webber綜合症；心肌血管生成；斑塊新血管形成(plaque neovascularization)；毛細管擴張；出血性關節；血管纖維瘤；傷口肉芽發生；特徵為內皮細胞過度或異常刺激的疾病，包括腸粘連、節段性迴腸炎、動脈粥樣硬化、硬皮病和肥大瘢痕(即瘢痕瘤)和作為病理結果而具有血管生成的疾病，包括貓爪病(Rochele minalia quintosa)和潰瘍(幽門螺桿菌)。另一用途是抑制排卵和建立胎盤的生育控制劑。
本發明化合物或者單獨使用或者與常規給與病人用於治療血管生成疾病的放療和/或其它化療治療聯用時，也可以用於預防上述腫瘤轉移。例如，當用於治療實體瘤時，本發明化合物可以與化療藥物一起給與，所述化療藥物諸如為α幹擾素、COMP(環磷醯胺、長春新鹼、甲氨蝶呤和強的松)、依託泊苷、mBACOD(甲氨蝶呤、博來黴素、阿黴素、環磷醯胺、長春新鹼和地塞米松)、PRO-MACE/MOPP(強的松、甲氨蝶呤、(W/leucovin拯救)、阿黴素、環磷醯胺、紫杉酚、依託泊苷/氮芥、長春新鹼、強的松和甲基苄肼)、長春新鹼、長春鹼、血管抑制素(angioinhibin)、TNP-470、戊聚糖多硫酸酯、血小板因子4、制管張素、LM-609、SU-101、CM-101、Techgalan、酞胺哌啶酮、SP-PG等等。其它化學藥物包括烷化劑，諸如氮芥，包括氮芥、melphan、苯丁酸氮芥、環磷醯胺和異環磷醯胺；亞硝脲，包括亞硝脲氮芥、環己亞硝脲、甲環亞硝脲和鏈脲黴素(streptozocin)；磺酸烷基酯，包括白消安；三嗪，包括三嗪咪唑胺；吖丙啶(ethyenimine)，包括塞替派和六甲基三聚氰胺；葉酸類似物，包括甲氨蝶呤；嘧啶類似物，包括5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷；嘌呤類似物，包括6-巰基嘌呤和6-硫代鳥嘌呤；抗腫瘤抗體，包括放線菌素D；anthracycline，包括阿黴素、博來黴素、絲裂黴素C和methramycin；激素和激素拮抗劑，包括他莫昔芬和皮質類固醇和各種藥物，包括順鉑和brequinar。例如，可以用外科手術、放射或化療和給與kringle 5，隨後給與kringle 5以延長小轉移瘤(micrometastases)不活性時間，並穩定和抑制任何殘餘原發性腫瘤的生長，以常規治療腫瘤。
可以將諸如蓖麻毒蛋白之類的細胞毒性藥物連接到kringle 5肽片段上，由此提供破壞結合kringle 5的細胞的工具。連接到細胞毒性藥物的肽可以以設計以使到所需位置的傳遞最大化的方式輸注。例如蓖麻毒蛋白連接的高親和性kringle 5片段可以通過插管直接傳遞進入靶或供應所述靶位點的血管。這種藥物也可以通過連接輸注插管的滲透泵以控制方式傳遞。可以將kringle 5拮抗劑的組合物與血管生成刺激劑一起供應，以增強組織的血管形成。該類型的治療方式可以提供一種有效的破壞轉移癌的方法。
本發明化合物可以以衍生自無機酸或有機酸的藥學上可接受的鹽形式使用。「藥學上可接受的鹽」是指那些鹽，它們在正確的醫學判斷範圍內，適用於與人類和低等動物組織接觸，而沒有過度的毒性、刺激、過敏反應等等，與合理的利益/風險比相稱。藥學上可接受的鹽是本領域眾所周知的。例如，S.M.Berge等在J.PharmaceuticalSciences,1977,66:1以及下列等等中詳細地描述了藥學上可接受的鹽，該文獻通過引用結合到本文中。在本發明化合物的最後分離和純化期間可以現場製備所述鹽，或通過將游離鹼官能與合適的有機酸反應，單獨製備所述鹽。代表性的酸加成鹽包括但不限於乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、檸檬酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、二葡糖醛酸鹽、磷酸甘油、半硫酸鹽(hemisulfate)、庚酸鹽、己酸鹽、延胡索酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽(羥乙基磺酸鹽)、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、煙酸鹽、2-萘磺酸鹽、草酸鹽、撲酸鹽(pamoate)、果膠酯酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、磷酸鹽、穀氨酸鹽、碳酸氫鹽、對甲苯磺酸鹽和十一酸鹽。此外，所述鹼性含氮基團可以用諸如以下試劑季銨化低級烷基滷，諸如甲基、乙基、丙基和丁基氯、溴和碘；硫酸二烷基酯，象硫酸二甲酯、二乙酯、二丁酯和二戊酯；長鏈滷化物，諸如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂醯基氯、溴和碘；芳烷基滷，象苄基和苯乙基溴和其它基團。由此獲得水溶性或油溶性或可分散產物。可以用來形成藥學上可接受的酸加成鹽的酸的例子包括諸如煙酸、氫溴酸、硫酸和磷酸之類的無機酸、以及諸如草酸、馬來酸、琥珀酸和檸檬酸之類的有機酸。
在kringle 5的最後分離和純化期間，可以通過將含羧酸部分與合適的鹼或與氨或有機伯胺、仲胺或叔胺反應，現場製備鹼加成鹽，所述合適的鹼諸如藥學上可接受的金屬陽離子的氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽。藥學上可接受的鹽包括但不限於基於鹼金屬或鹼土金屬的陽離子，諸如鋰、鈉、鉀、鈣、鎂和鋁鹽等等；和無毒叔胺和胺離子，包括銨、四甲基銨、四乙基銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺、乙胺等等。可用於形成鹼加成鹽的其它代表性有機胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等等。本發明化合物的優選鹽包括磷酸鹽、tris和乙酸鹽。
kringle 5肽片段、kringle 5抗血清、kringle 5受體激動劑、kringle5受體拮抗劑或它們的組合物可以與諸如可生物降解聚合物的藥學上可接受的緩釋基質混合，以形成治療組合物。本文所用的緩釋基質為通常為聚合物的材料製成的基質，它們可由酶促水解或酸鹼水解或通過溶解而降解。所述基質一旦插入機體，酶和體液就會對其產生作用。緩釋基質最好選自生物可相容材料，諸如脂質體、聚交酯(聚乳酸)、聚乙交酯(乙醇酸的聚合物)、聚交酯-co-乙交酯(polylactide co-glycolide)(乳酸和乙醇酸的共聚物)聚酐、聚(正)酯、多肽、透明質酸、膠原蛋白、硫酸軟骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、多胺基酸、胺基酸(諸如苯丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸)、多核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和矽氧烷。優選的生物可降解基質為或者聚交酯、聚乙交酯或者聚交酯-co-乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)之一的基質。
kringle 5肽片段、kringle 5融合蛋白、kringle 5受體激動劑、kringle 5受體拮抗劑或它們的組合物可以與藥學上可接受的賦形劑或載體混合，以形成治療組合物。藥學上可接受的載體或賦形劑是指任何類型的無毒固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、包囊材料或配製輔助劑。所述組合物可以胃腸外、舌下、腦池內、陰道內、腹膜內、直腸、頰或表面給與(如用粉劑、膏劑、滴劑、經皮貼劑或離子電滲療法裝置)。
本文所用的術語「胃腸外」是指給藥模式，包括靜脈內、肌內、腹膜內胸骨內、皮下和關節內注射和輸注。用於胃腸外注射的藥用組合物包含藥學上可接受的無菌水溶液或非水溶液、分散體、懸浮液或乳液以及用於在使用前複製為無菌注射液或分散體的無菌粉劑。合適的水性或非水溶媒、稀釋劑、溶劑或載體的例子，包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)、羧甲基纖維素和它們的合適的化合物、植物油(諸如橄欖油)和可注射有機酯，諸如油酸乙酯。例如可以利用諸如卵磷脂之類的包衣材料，在分散體的情況下通過保持所需的顆粒大小，以及利用表面活性劑，保持適當的流動性。這些組合物也可以含有輔助劑，諸如防腐劑、潤溼劑、乳化劑和分散劑。通過包含各種抗菌劑和抗真菌劑，諸如對羥基苯甲酸酯、三氯丁醇、苯酚山梨酸等等，可以確保防止微生物作用。也可以希望包括等滲劑，諸如糖、氯化鈉等等。通過包含諸如單硬脂酸鋁和明膠的延遲吸收的包埋劑，可以使得可注射藥物形式延緩吸收。通過形成該藥物在可生物降解聚合物中的微膠囊基質，製備可注射植入劑形式，所述可生物降解聚合物諸如為聚交酯-聚乙交酯、聚(正酯)和聚(酐)。根據藥物與聚合物之比和所用特定聚合物的性質，可以控制藥物釋放的速率。也通過將該藥物包載於可與機體組織相容的脂質體或微乳液中，製備植入劑可注射製劑。例如通過截留細菌的濾膜進行過濾，或通過加入無菌固體組合物形式的滅菌劑，可以將可注射製劑滅菌，所述無菌固體組合物在臨用前可以溶於或分散於無菌水或其它無菌可注射介質中。
局部給藥包括給藥皮膚、黏膜和肺表面和眼睛。用於局部給藥的組合物包括吸入組合物，可以加壓或不加壓為製備乾粉。在非加壓粉劑組合物中，粉碎形式的所述活性組分可以與較大的藥學上可接受的惰性載體混合使用，所述惰性載體的大小例如直徑大至100微米。合適的惰性載體包括糖，諸如乳酸。最好是，至少95％(重量)的所述活性組分的顆粒的有效顆粒大小為0.01-10微米。對於眼睛的局部給藥，本發明化合物在藥學上可接受的眼藥載體中傳遞，使得該化合物保持與眼表面接觸足夠的時間，以允許該化合物透過眼睛的角膜區和內部區域，例如前房、後房、玻璃體、水狀液、玻璃體液、角膜、虹膜/睫狀體(cilary)、晶狀體、脈絡膜/視網膜和鞏膜。所述藥學上可接受的眼藥溶媒可以例如膏劑、植物油或包囊材料。另一方面，本發明化合物可以直接注射到玻璃體液和水狀液中。
該組合物可以加壓，含有諸如氮氣的壓縮氣體或液化氣體拋射劑。所述液化拋射劑介質和實際上所述總組合物最好使得所述活性組分基本上不溶於其中。所述加壓組合物也可以含有表面活性劑，諸如液體或固體非離子表面活性劑，或可以為固體陰離子表面活性劑。最好使用鈉鹽形式的固體陰離子表面活性劑。
用於直腸或陰道給藥的組合物最好是栓劑，它可以通過將本發明化合物與合適的非刺激性賦形劑或載體(諸如可可油、聚乙二醇或栓劑蠟)混合來製備，所述非刺激性賦形劑或載體在室溫下為固體，而在體溫下為液體，因此在直腸和陰道腔中融化並釋放該活性組分。
本發明化合物也可以以脂質體形式給與。正如本領域已知的，脂質體通常由磷脂或其它脂質物質衍生。通過分散於水性介質的單層或多層水合液體晶體形成脂質體。可以使用任何無毒的生理上可接受和可代謝的、能夠形成脂質體的脂質。脂質體形式的本發明組合物除含有本發明化合物外，還可以含有穩定劑、防腐劑、賦形劑等等。優選的脂質為磷脂和磷脂醯膽鹼(卵磷脂)，可以是天然的，也可以是合成的。形成脂質體的方法是本領域已知的。參見例如Prescott編輯的Methods in Cell Biology，第ⅩⅣ卷，Academic Press，紐約(1976)，第33頁以及下列等等，該文獻通過引用結合到本文中。
當用於上述治療或其它治療中時，治療有效量的其中一個本發明化合物可以以純形式使用，或存在這類形式時，以藥學上可接受的鹽形式並與或不與藥學上可接受的賦形劑一起使用。「治療有效量」的本發明化合物是指在用於任何醫學治療合理的利益/風險比下，該化合物的量足以治療血管生成疾病(例如限制腫瘤生長或減慢或阻止腫瘤轉移)。然而應該理解，本發明化合物和組合物的總的日用法將由主治醫師在正確的醫學判斷內決定。用於任何特定病人的具體治療有效劑量水平將取決於各種各樣的因素，包括待治療疾病和該疾病的嚴重性；所用特定化合物的活性；所用的特定組合物；該病人的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；給藥時間；給藥途徑；所用特定化合物的排洩速率；治療時間；與所用特定化合物聯用或同時使用的藥物和醫學領域熟知的類似的因素。例如，開始以低於達到所需治療效果需要劑量的水平給藥，並逐漸加大劑量，直至達到所需效果，這正在本領域技術範圍內。局部或系統性地給予人或其它哺乳動物宿主的kringle 5肽片段或融合蛋白總一日量可以為例如每日0.0001-200 mg/kg體重，更通常為1-300 mg/kg體重，總一日量可以為單個劑量或均分量。需要時，可以將有效一日量分為多個劑量用於給藥。因此，單劑量組合物可以含有構成所述一日量的這種量或其約數。
應該理解，可以與本發明化合物聯合用於吸入、治療或預防血管生成疾病的藥物不限於以上所列的藥物，但大體上包括用於治療或預防血管生成疾病的任何藥物。
本發明也提供分離的多核苷酸，它們編碼具有血管生成抑制活性的哺乳動物kringle 5肽片段或融合蛋白。這類多核苷酸可以用於表達重組kringle 5肽片段或用於基因治療(如下述)。
本發明的多核苷酸可以為mRNA或DNA形式。DNA、cDNA、基因組DNA和合成DNA形式的多核苷酸都在本發明範圍內。所述DNA可以是雙鏈或是單鏈的，如果是單鏈，可以是編碼(有義)鏈或非編碼(反義)鏈。本發明的多核苷酸可以是未修飾形式，或包括諸如甲基化或封端的修飾。
編碼所述多肽的編碼序列可以與本文提供的編碼序列相同，或可以是不同的編碼序列，這些不同的編碼序列是由於遺傳密碼的豐餘性和簡併性造成的，並且編碼本文提供的DNA編碼的同一多肽。該多核苷酸可以僅包括所述多肽的編碼序列，或可以包括所述多肽的編碼序列和諸如前導序列或分泌序列的另一序列或蛋白原序列、或所述多肽編碼序列(和可選的另一編碼序列)和非編碼序列，諸如所述多肽編碼序列的5』和/或3』非編碼序列。
另外，本發明包括變異多核苷酸，它們含有諸如多核苷酸缺失、置換或加入的修飾；由所述變異多核苷酸序列產生的任何多肽修飾。本發明的多核苷酸也可以具有本文提供的編碼序列的天然產生的等位基因變異體的編碼序列。
另外，所述多肽的編碼序列可以在同一讀框中與一個有助於宿主細胞表達和分泌多肽的多核苷酸序列融合，其中所述多核苷酸例如為用作控制多肽從所述細胞轉運的分泌序列的前導序列。具有前導序列的多肽為前蛋白，可以具有被所述宿主細胞切割形成所述多肽的前導序列。所述多核苷酸也可以編碼所述蛋白加其它5』胺基酸殘基的蛋白原。具有原序列的蛋白為蛋白原，在某些情況下可以為該蛋白的無活性形式。一旦切割該原序列，則保留活性蛋白。因此，本發明的多核苷酸可以編碼蛋白、或具有原序列的蛋白或具有前序列(前導序列)和原序列的蛋白。
本發明的多核苷酸也可以具有在讀框中與標記序列融合的所述編碼序列，這便於純化本發明的多肽。所述標記序列可以是由pGEX載體供應的GST標記，以保證在細菌宿主的情況下純化與該標記融合的多肽，或例如當使用哺乳動物宿主、例如為COS-7細胞時，該標記序列可以為血凝素(HA)標記。相當於一個表位的HA標記得自流感血凝素蛋白。參見例如Ⅰ.Wilson等，Cell 37∶767(1984)。
該多核苷酸可以以任何方式產生，包括但不限於化學合成、複製、逆轉錄或轉錄，這基於衍生該多核苷酸區域內鹼基序列提供的信息；這樣，它可以表示所述原始多核苷酸的或者有義方向或者反義反向。產生多核苷酸的優選方法是美國專利4,683,195和4,683,202中描述的聚合酶鏈式反應，這些專利通過引用結合到本文中。
我們設想，如果多核苷酸與本文提供的序列的相同性至少為50％，最好至少為70％時，將認為多核苷酸與本文提供的序列雜交。
本發明也提供包含本發明多核苷酸的載體、用本發明載體進行遺傳工程的宿主細胞和通過重組技術生產本發明多肽的方法。這類方法包括在適合kringle 5衍生多核苷酸表達的條件下培養所述宿主細胞，並從所述細胞培養物中回收所述kringle 5衍生多肽。
本發明的多核苷酸可以用於通過重組技術生產多肽。因此，所述多核苷酸序列可以包括在多種表達載體的任何一種中，特別是用於表達多肽的載體或質粒。這類載體包括染色體、非染色體和合成DNA序列，例如SV40的衍生物；細菌質粒；噬菌體DNA；酵母質粒；由質粒和噬菌體DNA、病毒DNA(諸如牛痘、腺病毒、禽痘病毒和假狂犬病的)組合衍生的載體。然而，可以使用任何其它的質粒或載體，只要它可在該宿主中複製和有活力。
可以用各種各樣的方法將合適的DNA序列插入該載體中。一般而言，用本領域已知方法將所述DNA序列插入合適的限制性內切酶位點。這類方法或其它方法相信在本領域技術人員技術範圍內。所述表達載體中的所述DNA序列操作性地連接到合適的指導mRNA合成的表達控制序列(啟動子)上。這類啟動子的代表性例子包括但不限於LTR或SV40啟動子、大腸桿菌lac或trp、噬菌體λP sub L啟動子和已知在原核生物或真核生物細胞或其病毒中控制基因表達的其它啟動子。所述表達載體也含有用於翻譯起始和終止轉錄的核糖體結合位點。該載體也可以包括適用於放大表達的序列。另外，所述表達載體最好含有一個基因，以提供選擇轉化宿主細胞的表型性狀，諸如用於真核細胞培養物的二氫葉酸還原酶或新黴素抗性、或諸如大腸桿菌中的四環素或氨苄青黴素抗性。
含有上述合適DNA序列以及合適啟動子或控制序列的載體可以用來轉化合適的宿主，以允許該宿主表達該蛋白。作為合適宿主的代表性例子，可以提到細菌細胞，諸如大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌；鏈黴菌屬菌種；真菌細胞，諸如酵母；昆蟲細胞，諸如果蠅屬和Sf9；和動物細胞，諸如CHO、COS或Bowes等。從本文提供的內容來看，相信合適宿主的選擇在在本領域技術人員技術範圍內。
更詳細地講，本發明也包括重組構成物(construct)，它包括一個或多個以上廣泛描述的序列。所述構成物包括其它已經正向或反向插入本發明序列的載體，諸如質粒或病毒載體。在該實施方案的優選方面，該構成物還包括調節序列，包括例如可操作性地連接到所述序列的啟動子。大量的合適載體和啟動子是本領域技術人員已知的且已市售。舉例提供以下的載體。細菌pSPORTl(GIBCO BRL,Gaithersburg,MD)、pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)pBs、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pBsKs、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene,La Jolla,CA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核生物pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXTl、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。然而，可以使用任何其它質粒或載體，只要它可在該宿主中複製並有活力。
啟動子區可以用CAT(氯黴素轉移酶)載體或具有可選擇標記的其它載體選自任何所需基因。兩個合適的載體是pKK232-8和pCM7。特別指定的細菌啟動子包括lacI、lacZ、T3、SP6、T7、gpt、λPsub R和trp。真核啟動子包括巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子、單純皰疹病毒(HSV)胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40、來自逆轉錄病毒的LTR和小鼠金屬硫蛋白-1。合適載體和啟動子的選擇完全在本領域技術人員技術範圍內。
在再一實施方案中，本發明提供含有上述構成物的宿主細胞。所述宿主細胞可以是諸如哺乳動物細胞之類的高等真核細胞、或諸如酵母細胞之類的低等真核細胞，或所述宿主細胞可以是原核細胞，諸如細菌細胞。可以通過磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染或電穿孔將該構成物導入所述宿主細胞中(L. Davis等，「Basic Methods inMolecular Biology」，第2版，Appleton和Lang,Paramount Publishing,Easr Norwalk,CT(1994))。
宿主中的所述構成物可以以常規方式使用，以生產該重組序列編碼的基因產物。另一方面，可以用常規肽合成儀合成生產本發明的多肽。
可以在哺乳動物細胞、酵母、細菌或其它細胞中，在合適啟動子控制下表達蛋白。也可以使用細胞轉化系統，用得自本發明DNA構成物的RNA生產這類蛋白。Sambrook等(分子克隆實驗室手冊，第2版，(冷泉港，紐約，1989))描述了用於原核宿主和真核宿主的合適的克隆載體和表達載體，該文獻通過引用結合到本文中。
通過將增強子序列插入該載體中，增加高等真核生物對本發明多肽的編碼DNA的轉錄。增強子為DNA順式作用元件，通常為大約10-300 bp，它作用於啟動子以增加其轉錄。例子包括複製起點後側(第100-270 bp)的SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、其複製起點右側的多形瘤增強子和腺病毒增強子。
一般而言，重組表達載體將包括複製起點和允許該宿主細胞轉化的選擇標記(例如大腸桿菌的氨苄青黴素抗性基因和釀酒酵母TRPl基因)和得自高度表達基因的、指導下遊結構序列轉錄的啟動子。這類啟動子可以得自編碼諸如3-磷酸甘油激(PGK)之類的糖酵解酶的操縱子、α因子、酸性磷酸酶或熱激蛋白，這只是其中之一。將異源結構序列以適合的狀態與轉錄起始和終止序列以及最好和能夠指導翻譯蛋白分泌到內質網空間或胞外介質的前導序列一起裝配。可選地，該異源序列可以編碼包括賦予所需特性的N末端鑑定肽的融合蛋白，所需特性例如為表達的重組產物的穩定或簡化純化。
通過將編碼所需蛋白的結構DNA序列與合適的翻譯起始和終止信號一起插入具有功能啟動子的可讀框中，構建用於細菌的有用表達載體。該載體將包含一個或多個表型選擇標記和一個複製起點，以確保維持該載體以及需要時提供在該宿主內的擴增。用於轉化的合適的原核宿主包括大腸桿菌、枯草桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和假單孢菌屬、鏈黴素屬和葡萄球菌屬內的不同菌種，儘管也可以使用其它菌種作為常規的選擇。
對於細菌使用有用的表達載體包括選擇標記和得自質粒的細菌複製起點，所述質粒包括眾所周知的克隆載體pBR322(ATCC 37017)的遺傳元件。其它載體包括但不限於PKK233-3(PharmaciaFineChemicals,Uppsala,Sweden)和GEMl(Promega Biotec,Madison,WI)。這些pBR322「骨架」部分與一合適啟動子和待表達結構序列結合。
有用的表達載體也可以包含融合部分，以易於純化所需本發明多肽或生產可溶性多肽。市售的融合載體例子包括但不限於pET32a(Novagen,Madison,WI)、pGEX-4T-2(Pharmacia)和pCYB3(NewEngland Biolabs,Beverly,MA)。也可以構建特別用於在細菌細胞中高水平表達kringle 5肽片段或融合蛋白的避免使用融合部分的表達載體。例如可以按Pilot-Matias,T.J.等(Gene,128:219-225(1993))所述製備載體以優化翻譯偶聯，該文獻通過引用結合到本文中。另一方面，本發明的多肽可以與分離的輔助質粒一起共同表達，所述輔助質粒本身編碼蛋白或肽有助於溶解，第一目的肽(參見例如Makrides,S.C.,Microbiological Reviews,60∶512(1996))。例如某些kringle 5肽片段(已經表明作為與硫氧還蛋白的可溶性融合蛋白生產的肽片段(參見實施例20))可以從非融合載體中與(即在相同的宿主細胞中)表達硫氧還蛋白的第二載體同時表達。
在合適的宿主菌株轉化和該宿主菌株生長至合適的細胞密度後，用適當的方法(例如溫度變化或化學誘導)將選定的啟動子去阻遏，並且再培養細胞一段時間。通常通過離心收穫細胞，用物理或化學方法破碎，保留產生的粗提取物用於進一步純化。用於表達蛋白的微生物細胞可以用任何常規方法破碎，包括凍融循環、超聲處理、機械破碎或使用細胞裂解劑；這類方法是普通技術人員熟知的。
各種哺乳動物細胞培養系統也可以用來表達重組蛋白。哺乳動物表達系統的例子包括Gluzman所述的猴腎成纖維細胞COS-7系(Cell 23175(1981)和能夠表達可相容載體的其它細胞系，諸如C127、3T3、CHO、Hela和BHK細胞系。哺乳動物表達載體將包含複製起點、合適的啟動子和增強子以及任何必需的核糖體結合位點、多腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點、轉錄終點序列和5』側翼非轉錄序列。得自SV40病毒基因組的DNA序列，例如SV40序列、早期啟動子、增強子、剪接位點和多腺苷酸化位點可以用來提供所需的非轉錄遺傳元件。有用的代表性載體包括pRc/CMV和pcDNA3(可得自Invitrogen,San Diego,CA)。
本發明也包括基因治療，通過基因治療，調節病人的編碼kringle5肽片段或kringle 5肽片段綴合物的基因。N.Yang的將基因體內轉移到哺乳動物體細胞中(Crit.Rev.Biotechn.12(4):335-356(1992))公開了將DNA轉移或傳遞到細胞用於表達所述基因產物蛋白、或者稱為基因治療的各種方法，該文獻通過引用結合到本文中。基因治療包括將多核苷酸序列加入體細胞或種系細胞中，以用於或者活體外或體內治療。基因治療用來取代基因，以增加正常或異常基因功能和與傳染病及其它病狀戰鬥。
用基因療法治療醫學難題的策略包括治療策略或預防策略，治療策略諸如鑑定缺陷基因，然後加入功能性基因，以或者取代所述缺陷基因的功能，或者增加略微功能性的基因，預防策略諸如加入治療該疾病或使得該組織或器官對治療方法更敏感的蛋白產物的編碼基因。作為預防策略的例子，可以將kringle 5肽片段或kringle 5肽片段綴合物的編碼基因置於病人中，因此防止發生血管生成，或可以插入使腫瘤細胞對放射更敏感的基因，使得對所述腫瘤的放射可能引起更多地殺傷所述腫瘤細胞。
本發明設計了許多方案，用於轉移kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白的編碼DNA或轉移kringle 5肽片段調節序列(或所述融合部分的序列)的DNA。具體與kringle 5肽片段或其它序列連接的啟動子以外的、可以增進kringle 5肽片段生產的啟動子序列的轉染，也作為基因治療方法設計。該技術的一個例子可在Transkaryotic Therapies,Inc.,of Cambridge,Massachusetts中發現，該例子使用同源重組以插入「基因開關」，所述「基因開關」如1995年4月15日的Genetic EngineeringNews中公開的開啟細胞中的紅細胞生成素基因，該文獻通過引用結合到本文中。這類「基因開關」可以用來激活不正常表達這些蛋白的細胞中的kringle 5肽片段(或kringle 5受體)。
基因治療的基因轉移方法分為三大類(1)物理的(例如電穿孔、直接基因轉移和粒子轟擊)，(2)化學的(例如脂質基載體和其它非病毒載體)以及(3)生物的(例如病毒衍生載體)。例如，諸如包被有DNA的脂質體的非病毒載體可以直接靜脈內注射到該病人中。據信所述脂質體/DNA複合物在肝臟中濃縮，在此它們將所述DNA傳遞到巨噬細胞和肝巨噬細胞中。載體或該基因的「裸露」DNA也可以直接注射到所需器官、組織或腫瘤中，以定向傳遞所述治療DNA。
基因治療方法也可以用傳遞位點描述。傳遞基因的基本方法包括活體外基因轉移、體內基因轉移和體外基因轉移。在活體外基因轉移中，從該病人中取出細胞，讓其在細胞培養物中生長。將所述DNA轉移到所述細胞中，大量擴增轉染的細胞，然後再植入該病人中。在體外基因轉移中，所述轉化的細胞為諸如組織培養細胞的培養物中生長的細胞和來自特定病人的非特定細胞。轉染這些「實驗室細胞」，選擇所述轉染的細胞並擴增，或者用於植入病人中或者用於其它用途。體內基因轉移包括當細胞在病人體內時，將所述DNA導入該病人的所述細胞中。上述所有三種基於廣義的類別都可以用來達到體內、活體外和體外基因轉移。
通過將DNA微注射到生殖細胞或體細胞中、諸如用於「基因槍」的金粒子的氣體傳遞的包被DNA的粒子和諸如磷酸鈣轉染的戊基化學方法，可以達到DNA傳遞的機械(即物理)方法。已經發現，將質粒DNA物理注射到肌肉細胞中產生高百分比的、具有持久表達標記基因的轉染細胞。所述質粒DNA可以整合或不整合到所述細胞的基因組中。轉染DNA的非整合將允許基因產物蛋白在終端分化的非增殖性組織中轉染和表達較長時間，而不擔心所述細胞基因組或線粒體基因組的突變的插入、缺失或改變。長期但不必是永久地將治療基因轉染到特定細胞中，可以提供遺傳病的治療或預防用途。可以再周期性地注射所述DNA，以維持該基因產物水平，而不在所述受體細胞的基因組中發生突變。外源DNA的非整合可以允許在一個細胞內存在幾種不同的外源DNA構成物，所有所述構成物都表達不同的基因產物。
粒子介導的基因轉移也可以用於將DNA注射到細胞、組織和器官中。用粒子轟擊裝置或「基因槍」，產生一動力，以將包被DNA的高密度粒子(諸如金或鎢)加速至允許透過靶器官、組織或細胞的高速度。用於基因轉移的電穿孔使用電流以使得細胞或組織對電穿孔介導的基因轉移敏感。用給定場強的短的電脈衝增加膜的通透性，使得DNA分子可以透入到所述細胞中。粒子介導的基因轉移和電穿孔技術是本領域技術人員熟知的。
基因治療的化學方法包括利用諸如脂質體的融合脂小泡或其它用於膜融合的小泡的載體介導的基因轉移。含有目的DNA的載體可以方便地導入體液或血流中，然後位點最特異性地導向機體中的靶器官或組織。例如可以研製攜帶細胞或器官特異性DNA的脂質體，那些特定細胞吸收脂質體攜帶的外源DNA。注射定向到某些細胞上的特異性受體的免疫脂質體可以用作將所述DNA插入帶有該受體的細胞中的便利方法。已經使用的另一載體系統是將DNA攜帶到肝細胞以進行體內基因轉移的脫唾液酸糖蛋白/聚賴氨酸綴合物系統。
轉染的DNA也可以與其它類載體複合，使得所述DNA攜帶到受體細胞，然後貯存在胞質或核質中。DNA可以偶聯到特異性工程改造的小泡複合物中的載體核蛋白上，並直接攜帶到所述核中。
載體介導的基因轉移也可以包括使用非脂質體的脂質基化合物。例如脂轉染劑和細胞轉染劑是脂質基陽離子，它們與帶負電的DNA結合，形成可以攜帶所述DNA跨過細胞膜的複合物。載體介導的基因轉移的另一方法包括基於受體的胞吞作用。在該方法中，製備配體(對細胞表面受體特異性的)以與目的基因形成複合物，然後注射到血流中。具有所述細胞表面受體的靶細胞將特異性地結合該配體，將配體-DNA複合物運送到所述細胞中。
生物基因治療方法使用病毒載體或非病毒載體(諸如配體-DNA綴合物、脂質體和上述脂質-DNA複合物)，以將基因插入細胞中。轉染的細胞可以是得自該病人正常組織的細胞、得自該病人患病組織的細胞或非病人細胞。
可能最好是，將包含kringle 5肽片段DNA序列或kringle 5融合蛋白DNA序列的重組DNA操作性地連接到表達控制序列上，以形成能夠分別表達kringle 5肽片段或融合蛋白的表達載體。另一方面，可以通過給與與kringle 5基因、所述融合部分基因或與所述kringle 5基因相連的控制區或其融合部分的基因結合、或與相應的RNA轉錄物(兩者之一的)結合以調節轉錄或翻譯速率的化合物，完成kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白的基因調節。
已經用於基因治療方案的病毒載體包括但不限於逆轉錄病毒、諸如脊髓灰質炎病毒或辛德畢斯病毒的其它RNA病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、皰疹病毒、SV40、牛痘或其它DNA病毒。複製缺陷型鼠逆轉錄病毒為最廣泛使用的基因轉移載體。鼠白血病逆轉錄病毒包含與核核心蛋白和聚合酶(pol)複合的單鏈RNA，它們由蛋白核心(gag)包住並由決定宿主範圍的糖蛋白被膜(env)包圍。逆轉錄病毒的基因組結構包括gag、pol和env基因，它們包括在5』和3』長末端重複(LTR)上。逆轉錄病毒載體系統利用下述事實假如在包裝細胞系中反式提供所述病毒結構蛋白，那麼含有5』和3』LTR和包裝信號的基本載體(minimal vector)足以允許載體包裝和感染以及整合到靶細胞中。用於基因轉移的逆轉錄病毒載體的基本優點包括在大多數細胞類型中有效的感染和基因表達、單拷貝載體精確地整合到靶細胞染色體DNA中和所述逆轉錄病毒基因組的易操作性。例如，改變的逆轉錄病毒載體已經用於將基因活體外導入外周和腫瘤浸潤的淋巴細胞、肝細胞、表皮細胞、肌細胞或其它體細胞中(然後這些細胞可以導入該病人中，以提供來自插入DNA的基因產物)。
腺病毒包含與核心蛋白複合的線狀雙鏈DNA，並用殼體蛋白包圍。分子病毒學進展已經產生利用這些生物的生物學產生能夠將新遺傳序列體內轉導到靶細胞中的能力。基於腺病毒的載體將表達高水平的基因產物肽。即使用低效價的病毒，腺病毒載體也具有高感染效率。另外，該病毒作為無細胞病毒粒子是完全有感染性的，所以生產細胞系的注射不是必需的。腺病毒載體的另一潛在優點是達到體內長期表達異源基因的能力。
病毒載體已經用來採用體內方案將基因插入細胞中。為了指導組織特異性地表達外源基因，可以使用已知為組織特異性的順式作用調節元件或啟動子。另一方面，採用DNA或病毒載體體內原位傳遞到特定的解剖學位點，可以做到這一點。例如，通過在動脈壁上的選定位點體外植入轉導的內皮細胞達到基因體內轉移到血管。感染的病毒圍繞的細胞再表達該基因產物。病毒載體可以直接傳遞到體內位點(例如通過導管)，由此僅允許某些區域被病毒感染，並提供長期的位點特異性的基因表達。通過將改變的病毒注射到導向所述器官的血管中，也已經證明採用逆轉錄病毒載體在哺乳動物組織和肝組織中的體內基因轉移。
也可以生產kingle 5肽片段並用於多種應用中。作為實例，kringle5的不同肽片段可以用作(1)在kringle 5結合位點有活性的激動劑和拮抗劑，(2)作為開發特異性抗血清的抗原，(3)作為用於診斷試劑盒的肽，以及(4)作為連接或與細胞毒性藥物聯用、以定向殺傷結合kringle5肽片段的細胞的肽。可以根據該分子外部區域上可以結合抗血清的位置、或所述肽片段對由血管生成產生或惡化的過程的抑制效力，選擇包含這些肽片段的胺基酸序列。此外，可以採用蛋白序列資料庫，諸如GenBank、Brookhaven Protein、SWISS-PROT和PIR，將這些肽序列與已知序列比較，以決定潛在的序列同源性。該信息有助於消除表現出與其它分子具有高度序列同源性的序列，由此在kringle 5的抗血清、激動劑和拮抗劑開發中增強高特異性的潛力。
也可以將kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白用作分離kmnigle 5受體的工具，即通過將kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白固定到固相支持體上，例如固定到親和柱上，讓培養的內皮細胞或膜提取物通過該柱。正如本領域已知的，分離和純化kringle 5受體後，可以鑑定胺基酸序列並分離編碼kringle 5受體的多核苷酸。這類多核苷酸可以克隆到合適的表達載體中，並轉染到腫瘤細胞中。所述轉染的腫瘤細胞表達該受體，會增強這些細胞對內源或外源kringle 5肽片段的反應，由此減低轉移生長速率。此外，該載體的重組表達將允許產生更大量的受體，例如產生足夠量，以用於鑑別模擬kringle 5作用的更小的拮抗劑的高生產率的篩選測定。
這些合成肽內的系統胺基酸置換可以產生對所述kringle 5受體高親和性的肽激動劑和拮抗劑，這增強或減低kringle 5肽片段與其受體的結合。這類激動劑可以用來抑制顯微轉移物的生長，並由此限制癌的擴展。在血管形成不充分時，kringle 5肽片段的拮抗劑可以用來阻斷kringle 5肽片段的抑制作用，並促進血管生成。例如，該類型治療在促進糖尿病患者的傷口癒合方面可以具有治療作用。
本發明的kringle 5肽片段或融合蛋白或綴合物也可以用作抗原，產生對所述kringle 5抑制劑特異性的多克隆或單克隆抗體。可以使用這類抗體的一個方法是在檢測或定量體液或組織中kringle 5肽片段的診斷方法和試劑盒。這些試驗的結果可以用來診斷或測定kringle 5肽片段的預後相關性。
kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白可以用放射性同位素(參見實施例13)標記，或化學偶聯到蛋白上形成綴合物。綴合物包括酶、載體蛋白、細胞毒性藥物、螢光分子、化學發光分子和生物發光分子，使用它們有助於測試含kringle 5肽片段的化合物結合kringle 5抗血清的能力、檢測具有kringle 5肽片段的細胞類型或有助於純化kringle 5肽片段。一般在所述kringle 5肽片段序列的胺基酸上可利用的官能團的基礎上，選擇所述偶聯技術，所述官能團包括但不限於烷基、氨基、巰基、羧基、醯胺酚、吲哚基和咪唑基。用來實現這類偶聯的各種試劑包括，這只是其中之一；戊二醛、重氮化聯苯胺、碳二亞胺和對苯醌。採用適於該特定反應的不同技術測定偶聯反應的效率。例如，採用高比活的氯胺T和NaI125，可以完成用I125放射性標記kringle 5肽或其生物學活性片段。用偏亞硫酸氫鈉終止該反應，並在一次性柱上將該混合物脫鹽。從該柱洗脫標記的肽並分部收集。從每一部分中取出數等份並在γ計數器中測定放射性活性。該方法提供不含未反應NaI125的放射性標記的kringle 5肽片段。在另一實施例中，含有偶聯到kringle 4的kringle 5肽片段的血液或組織提取物可以在聚賴氨酸樹脂親和柱上純化，藉此kringle 4-kringle 5肽片段通過kringle 4肽片段對賴氨酸的親和性結合到該樹脂上。洗脫結合蛋白將提供純化的kringle4-kringle 5肽片段。
肽綴合物的另一應用是生產多克隆抗血清。可以採用本領域技術人員所知的已建立的技術，進行抗kringle 5肽片段、kringle 5肽片段類似物和kringle 5受體的抗血清的生產。例如採用戊二醛可以將含有賴氨酸殘基的kringle 5肽片段連接到純化的牛血清白蛋白(BSA)上。可以通過測定放射性標記的肽的摻入，測定該反應的效率。未反應的戊二醛和肽可以通過透析分離，所述綴合物可以用來在兔、羊、山羊或其它動物中產生多克隆抗血清。與諸如BSA之類的載體分子複合的kringle 5肽片段可以與佐劑混合物混合，乳化，並皮下注射到背部、頸部、脅腹以及有時在合適宿主足趾上的多個位點上。一般而言，然後以規律的間隔、諸如每2-4周給與加強注射。每次注射後大約7-10天，通過用例如擴張後的耳緣靜脈靜脈穿刺獲得血樣，讓血樣於4℃過夜凝固，於4℃以大約2400×g離心大約30分鐘。去除血清，分成等份貯存於4℃以立即使用，和貯存於-20℃至-90℃以用於隨後的分析。
產生多克隆抗血清的血清樣或產生單克隆抗血清的介質樣品可以用於測定抗體效價，特別是用於測定高效價抗血清。隨後，可以測試最高效價kringle 5肽片段抗血清，以確立以下(a)用於最高特異性結合所述抗原和最低非特異性結合的最適抗血清稀釋度，(b)在標準置換曲線中結合增加量的kringle 5肽片段的能力，(c)潛在的於相關肽和蛋白的交叉反應性，所述相關肽和蛋白包括相關物種的血纖溶酶原和kringle 5肽片段，以及(d)檢測細胞培養基和血漿、尿和組織提取物中kringle 5肽片段的能力。可以通過本領域技術人員已知的幾種方法，諸如斑點印跡和密度分析以及通過採用A蛋白、第二抗血清、冷乙醇或活性炭-葡聚糖沉澱放射性標記的肽-抗體複合物，然後用γ計數器測定活性，可以確立效價。如果需要，可以在親和柱上純化最高效價的抗血清。例如，可以將kringle 5肽片段偶聯到市售樹脂上，用來形成親和柱。然後，可以將抗血清樣品通過該柱，以使kringle 5抗體結合(通過kringle 5肽片段)到該柱上。隨後將這些結合的抗體洗脫、收集並評價以測定效價和特異性。
也設想測定kringle 5肽片段和kringle 5受體的試劑盒作為本發明的部分。具有高效價和特異性並可以檢測血漿、尿、組織和細胞培養基中的kringle 5肽片段的抗血清可以用來建立快速、可靠、敏感和特異性測定和定位kringle 5肽片段的分析試劑盒。這些分析試劑盒可以用來(但不限於)例如以下技術競爭性和非競爭性測定、放射免疫測定、生物發光和化學發光測定、螢光測定、夾心測定(sandwich assay)、免疫放射測定、斑點印跡、包括ELISA的酶聯測定、微量滴定板、免疫細胞化學和用於快速監測尿或血樣的包被抗體的條帶(strip)或浸棒(dipstick)。對於每種試劑盒，通過本領域技術人員熟知的方法，測定該分析的範圍、敏感性、精確性、可靠性、特異性和重複性。
通常用於研究和臨床中的測定試劑盒的一個例子是放射免疫測定(PIA)試劑盒。以以下方式建立kringle 5肽片段RIA成功的放射性碘化和純化kringle 5肽片段後，以幾個稀釋度將具有最高效價抗kringle5肽片段抗體的抗血清加入含有適當緩衝系統中的相對恆定量的放射活性(諸如10,000 cpm)的試管中。(將緩衝液或免疫前血清加入其它試管中，以測定非特異性結合)。於4℃保溫24小時後，將A蛋白加入所有試管中，將試管渦旋混合，於室溫保溫90分鐘，然後於4℃以大約2000-2500×g離心，以沉澱結合標記抗原的抗體的複合物。通過吸取取出上清液，在γ計數器中計數所述沉澱的放射活性。在減去所述非特異性結合後，選擇結合大約10-40％標記肽的抗血清稀釋液用於進一步特徵鑑定。
下一步，通過將已知量的所述肽加入含有放射性標記的肽和抗血清的試管中，評價用於研究抗血清的kringle 5肽片段的稀釋範圍(大約為0.1 pg-10ng)。保溫期(例如24小時或48小時)後，加入A蛋白，將試管離心，取出上清液，計數沉澱的放射性活性。用未標記kringle 5肽片段(標準)置換放射性標記kringle 5肽片段的結合，提供標準曲線。另外，將幾種濃度的其它kringle 5肽片段、血纖溶酶原、來自不同物種的kringle 5肽片段和同源肽加入所述測定試管中，以特徵鑑定所述kringle 5肽片段抗血清的特異性。
此後，採用已經成功地用來提取kringle 5肽片段的提取技術，製備各種組織提取物，包括但不限於原發性和繼發性腫瘤、Lewis肺癌、產生kringle 5肽片段的細胞培養物、胎盤、子宮和其它組織，諸如大腦、肝臟和腸。處理組織提取物後，加入測定緩衝液，將不同等份置於RIA試管中。已知的產生kringle 5肽片段的細胞的提取物產生的置換曲線與標準曲線平行，而不產生kringle 5肽片段的組織提取物不置換來自所述kringle 5肽片段抗血清的放射性標記的kringle 5肽片段。這種置換曲線表明kringle 5肽片段測定測定組織和體液中kringle 5肽片段的實用性。
也可以通過將數等份注射到反向HPLC中，特徵鑑定含有kringle5肽片斷的組織提取物。收集洗脫部分，在Speed Vac中乾燥，在RIA緩衝液中重建，並在kringle 5 RIA中分析。在這種情況下，將最大量的kringle 5肽片段的免疫反應性定位於kringle 5肽片段的相應洗脫位置的部分中。
上述測定試劑盒提供說明、抗血清、kringle 5肽片段和可能的放射性標記kringle 5肽片段和/或用於沉澱結合kringle 5肽片段/kringle 5抗體複合物的試劑。這樣的試劑盒將可用於生物學流體和具有或不具有腫瘤的動物和人類的組織提取物中kringle 5肽片段的測定。
另一試劑盒可以用來使kringle 5肽片段在組織和細胞中可見或定位。例如免疫組織化學技術和使用這種技術的試劑盒是本領域技術人員熟知的。正如本領域已知的，免疫組織化學試劑盒將提供kringle 5肽片段抗血清和可能的封閉血清和第二抗血清，所述第二抗血清連接到螢光分子(諸如異硫氰酸螢光素)或用來使第一抗血清可見的某些其它試劑上。採用這種方法，可以檢查活檢腫瘤生產kringle 5肽片段的位置或kringle 5肽片段受體的位置。另一方面，試劑盒可以供應放射性標記的核酸，以用於與kringle 5肽片段信使RNA的探針的原位雜交。
採用本領域技術人員熟知的方法，可以製備本發明化合物。(參見例如Sottrup-Jensen等，Progess in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis,第3卷，Davidson,J.F.,Rowan,RM.,Samama,M.M．和Desnoyers,P.C.編輯，Raven Press，紐約，1978。製備kringle 5肽片段的一種方法是酶切天然蛋白(glu-血纖溶酶原)或其變異體(是指適合於酶消化切割並包含至少一個上述kringle 5序列的全長蛋白的截短形式，諸如lys-血纖溶酶原或小血纖溶酶原)。該方法首先需要在沒有血纖溶酶抑制劑的情況下，從人血漿中分離該蛋白，由此促進glu-血纖溶酶原轉化為lys-血纖溶酶原(參見Novokhatny,V和Kudinov,SA.,J.Mol.Biol.179215-232(1984)。隨後，用蛋白水解酶以足以從所述多肽切割kringle 5肽片段的濃度處理所述截短的分子，然後用本領域技術人員已知的方法，從剩餘片段中純化。優選的蛋白水解酶是人或豬彈性蛋白酶，它切割血纖溶酶原和其kringle區3-4和4-5之間的截短變異體(由此能夠形成含有kringle 1-3和1-4或單獨的kringle 4或5的肽片段)。例如，可以用豬或人類中性白細胞(neutrophyl)彈性蛋白酶以大約1∶100-1∶300的lys-血纖溶酶原彈性蛋白酶的比率(緩衝液(諸如Tris-HCl、NaCl、磷酸鈉等等))中的優選比率為1∶150-1∶250，最優選1∶150的比率)處理lys-血纖溶酶原或glu-血纖溶酶原。另一方面，該彈性蛋白酶可以首先固定(諸如固定到樹脂上)，以便於純化所述切割產物。根據所需的切割程度，glu-血纖溶酶原或lys-血纖溶酶原一般用人類或豬彈性蛋白酶於10-40℃的溫度範圍內處理，處理時間取決於所需切割程度，範圍為大約4小時至24小時。為了達到用人或豬彈性蛋白酶完全消化glu-血纖溶酶原、lys-血纖溶酶原或小血纖溶酶原，需要將這些多肽於室溫下暴露於該酶之中至少大約12小時。改變pH和對該酶的暴露時間，導致在一個或多個敏感切割位點上切割較少或部分切割。然後將切割產物用本領域熟知的方法(諸如柱層析)進行純化。優選的純化流程包括如實施例14所述將切割產物上賴氨酸-Sepharose柱。
kringle 5肽片段的固相合成以下實施例用來進一步說明本發明新化合物的製備實施例1N-Ac-Val-Leu-Leu-Pro-Asp-Val-Glu-Thr-Pro-Ser-Glu-Glu-Asp-NH2將醯胺肽合成柱(Applied Biosystems)置於Perkin Elmer/AppliedBiosynthesis的「Synergy」肽合成儀的肽合成柱位置中，使用以下合成順序1．用DMF將該樹脂溶劑化大約5分鐘；2．用含20％哌啶的DMF將Fmoc基團從該樹脂結合的胺基酸的α-N末端去封閉大約15分鐘；3．用DMF洗滌該樹脂大約5分鐘；4．用含HBTU(25μmol)和HOBT(25 μmol)的0.2 M DMSO-NMP(N-甲基吡咯烷酮)的溶液和含二異丙基乙胺(25μmol)的0.4 M DMSO-NMP溶液活化第一號胺基酸(Fmoc-Asp(β-OtBu),25 μmol)的α-C末端，並將所述活化胺基酸偶聯到該樹脂上；5．在DMF中將所述活化Fmoc保護的胺基酸(在步驟5中製備的)偶聯到所述樹脂結合的胺基酸(在步驟2中製備的)大約30分鐘；6．用DMF洗滌5分鐘；7．用以下胺基酸重複步驟3-6編號胺基酸2Fmoc-Glu(γ-OtBu)3Fmoc-Glu(γ-OtBu)4Fmoc-Ser(tBu)
5Fmoc-Pro6Fmoc-Thr(tBu)7Fmoc-Glu(γ-OtBu)8Fmoc-Val9Fmoc-Asp(β-OtBu)10Fmoc-Pro11Fmoc-Leu12Fmoc-Leu13Fmoc-Val8．將乙酸通過步驟4和步驟5的條件，偶聯到所述樹脂結合的肽的α-N末端上。
9．用THF洗滌該樹脂大約5分鐘，以除去DMF並收縮該樹脂，然後用氬氣將該樹脂乾燥10分鐘，用氮氣乾燥10分鐘或更長時間，以提供乾淨的樹脂結合肽。
10．通過與切割試劑(新鮮製備的硫代茴香醚(100μl)、水(50 μl)、乙二硫醇(50 μl)和三氟乙酸(1.8ml)，按以上順序於-5℃至-10℃混合)於0℃一起攪拌大約10-15分鐘，然後於環境溫度下再攪拌1.75小時(如果存在，每個Arg(Pmoc)再加上0.5小時)，從所述樹脂上切割所述肽，同時伴隨胺基酸側鏈的去保護。用以下公式確定所用的切割試劑的量具有結合肽的樹脂的重量(mg)切割試劑的量(μl)0-10 10010-25 20025-50 40050-100 700100-200 120011．過濾並用純淨的三氟乙酸洗滌該產物，以每份0.5 ml將該濾液加入含約8ml冷乙醚的離心管中，離心並傾析，重複該過程直至所有該肽沉澱(如果加入乙醚時該肽不沉澱，那麼用30％乙酸水溶液(3×1 ml)萃取該混合物，將合併的含水提取物凍幹，以提供該產物)。
12．使用粗肽，或通過HPLC用7 μm Symmetry Prep C18柱(7.8×300 mm)，用以5％至100％乙腈-(水、0.1％TFA)的梯度改變的溶劑混合物，在50分鐘內純化，然後凍幹，以提供35 mg N-Ac-Val-Leu-Leu-Pro-Asp-Val-Glu-Thr-Pro-Ser-Glu-Glu-Asp-NH2。
實施例2N-Ac-Met-Phe-Gly-Asn-Gly-Lys-Gly-Tyr-Arg-Gly-Lys-Arg-Ala-Thr-Thr-Val-Thr-Gly-Thr-Pro-NH2採用實施例1所述合成順序，並採用Fmoc-Pro作為第一號胺基酸，製備標題化合物。採用指定條件加入以下胺基酸，以提供35 mgN-Ac-Met-Phe-Gly-Asn-Gly-Lys-Gly-Tyr-Arg-Gly-Lys-Arg-Ala-Thr-Thr-Val-Thr-Gly-Thr-Pro-NH2編號 胺基酸2． Fmoc-Thr(tBu)3． Fmoc-Gly4． Fmoc-Thr(tBu)5． Fmoc-Val6． Fmoc-Thr(tBu)7． Fmoc-Thr(tBu)8． Fmoc-Ala9． Fmoc-Arg(Pmc)10． Fmoc-Lys(Boc)11． Fmoc-Gly12． Fmoc-Arg(Pmc)13． Fmoc-Tyr(tBu)14． Fmoc-Gly15． Fmoc-Lys(Boc)16． Fmoc-Gly17． Fmoc-Asn(Trt)18． Fmoc-Gly19． Fmoc-Phe
20．Fmoc-Met實施例3Ac-Gln-Asp-TrP-Ala-Ala-Gln-Glu-Pro-His-Arg-His-Ser-Ile-Phe-Thr-Pro-Glu-Thr-Asn-Pro-Arg-Ala-Gly-Leu-Glu-Lys-Asn-Tyr-NH2採用實施例1所述合成順序，並採用Fmoc-Tyr(tBu)作為第一號胺基酸，製備標題化合物。採用指定條件加入以下胺基酸，以提供40mg N-Ac-Gln-Asp-Trp-Ala-Ala-Gln-Glu-Pro-His-Arg-His-Ser-lle-Phe-Thr-Pro-Glu-Thr-Asn-Pro-Arg-Ala-Gly-Leu-Glu-Lys-Asn-Tyr-NH2編號胺基酸2．Fmoc-Asn(Trt)3．Fmoc-Lys(Boc)4．Fmoc-Glu(γ-OtBu)5．Fmoc-Leu6．Fmoc-Gly7．Fmoc-Ala8．Fmoc-Arg(Pmc)9．Fmoc-Pro10． Fmoc-Asn(Trt)11． Fmoc-Thr(tBu)12． Fmoc-Glu(γ-OtBu)13． Fmoc-Pro14． Fmoc-Thr(tBu)15． Fmoc-Phe16． Fmoc-Ile17． Fmoc-Ser(tBu)18． Fmoc-His(Trt)19． Fmoc-Arg(Pmc)20． Fmoc-His(Trt)21． Fmoc-Pro22． Fmoc-Glu(γ-OtBu)23． Fmoc-Gln(Trt)24． Fmoc-Ala25．Fmoc-Ala26．Fmoc-Trp27．Fmoc-Asp(β-OtBu)28．Fmoc-Gln(Trt)實施例4N-Ac-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-Gly-Pro-Trp-NH2採用實施例1所述合成順序，並採用Fmoc-Trp作為第一號胺基酸，製備標題化合物。採用指定條件加入以下胺基酸，以提供20 mgN-Ac-Arg-Asn-Pro-Asp-Gly-Asp-Val-Gly-Gly-Pro-Trp-NH2編號胺基酸2．Fmoc-Pro3．Fmoc-Gly4．Fmoc-Gly5．Fmoc-Val6．Fmoc-Asp(β-OLBu)7．Fmoc-Gly8．Fmoc-Asp(β-Ot-Bu)9．Fmoc-Pro10． Fmoc-Asn(Trt)11． Fmoc-Arg(Pmt)實施例5N-Ac-Tyr-Thr-Thr-Asn-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH2採用實施例1所述合成順序，並採用Fmoc-Tyr(tBu)作為第一號胺基酸，製備標題化合物。採用指定條件加入以下胺基酸，以提供10 mgN-Ac-Tyr-Thr-Thr-Asn-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH2編號胺基酸2．Fmoc-Asp(β-OtBu)3．Fmoc-Tyr(tBu)4．Fmoc-Leu5．Fmoc-Lys(Boc)6．Fmoc-Arg(Pmc)7． Fmoc-Pro8． Fmoc-Asn(Trt)9． Fmoc-Thr(tBu)10．Fmoc-Thr(tBu)11．Fmoc-Tyr(tBu)實施例6N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH2採用實施例1所述合成順序，並採用Fmoc-Tyr(tBu)作為第一號胺基酸，製備標題化合物。採用指定條件加入以下胺基酸，以提供N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH2(4 mg)編號 胺基酸2． Fmoc-Asp(β-OtBu)3． Fmoc-Tyr(tBu)4． Fmoc-Leu5． Fmoc-Lys(Boc)6． Fmoc-Arg(Pmc)7． Fmoc-ProMS(FAB)m/z 995(M+H)+.
實施例7N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-NH2採用實施例1所述合成順序製備標題化合物。採用指定條件加入以下胺基酸，以提供N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-NH2(6 mg)編號 胺基酸2． Fmoc-Tyr(tBu)3． Fmoc-Leu4． Fmoc-Lys(Boc)5． Fmoc-Arg(Pmc)6． Fmoc-LeuMS(ESI)m/z 832(M+H)+.
實施例8N-Ac-Pro-Glu-Lys-Arg-Tyr-Asp-Tyr-NH2採用實施例1所述合成順序，並採用Fmoc-Tyr(tBu)作為第一號胺基酸，製備標題化合物。採用指定條件加入以下胺基酸，以提供N-Ac-Pro-Glu-Lys-Arg-Tyr-Asp-Tyr-NH2(6 mg)編號 胺基酸2． Fmoc-Asp(β-OtBu)3． Fmoc-Tyr(tBu)4． Fmoc-Arg(Pmc)5． Fmoc-Lys(Boc)6． Fmoc-Glu7． Fmoe-ProMS(FAB)m/z(1101)(M+H)+.
實施例9N-Ac-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH2採用實施例1所述合成順序，並採用Fmoc-Tyr(tBu)作為第一號胺基酸，製備標題化合物。採用指定條件加入以下胺基酸，以提供N-Ac-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-Tyr-NH2(8 mg)編號胺基酸2．Fmoc-Asp(β-OtBu)3．Fmoc-Tyr(tBu)4．Fmoc-Leu5．Fmoc-Lys(Boc)6．Fmoc-Arg(Pmc)MS(ESI)m/z 898(M+H)+.
實施例10N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I-Tyr-Asp-Tyr-NH2(SEQ ID NO:13)
採用實施例1所述合成順序，並採用Fmoc-Tyr(tBu)作為第一號胺基酸，製備標題化合物。採用指定條件加入以下胺基酸，以提供N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I-Tyr-Asp-Tyr-NH2(2 mg)編號 胺基酸2． Fmoc-Asp(β-OtBu)3． Fmoc-3-I-Tyr(tBu)4． Fmoc-Leu5． Fmoc-Lys(Boc)6． Fmoc-Arg(Pmc)7． Fmoc-ProMS(ESI)m/z(1121)(M+H)+.
實施例11N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-I-Tyr-NH2(SEQ ID NO:14)採用實施例1所述合成順序，並採用Fmoc-3-I-Tyr(tBu)作為第一號胺基酸，製備標題化合物。採用指定條件加入以下胺基酸，以提供N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-I-Tyr-NH2(2.5 mg)編號 胺基酸2． Fmoc-Asp(β-OtBu)3． Fmoc-Tyr(tBu)4． Fmoc-Leu5． Fmoc-Lys(Boc)6． Fmoc-Arg(Pmc)7． Fmoc-ProMS(ESI)m/z 1121(M+H)+.
實施例12N-Ac-Lys-Leu-Tyr-Asp-NH2採用實施例1所述合成順序，並採用Fmoc-Asp(β-OtBu)作為第一號胺基酸，製備標題化合物。採用指定條件加入以下胺基酸，以提供2mg N-Ac-Lys-Leu-Tyr-Asp-NH2(2 mg)編號 胺基酸2． Fmoc-Tyr(tBu)3． Fmoc-Leu4． Fmoc-Lys實施例13分別製備並分離N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-I125-Tyr535-NH2和N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I125-Tyr533-Asp-Tyr-NH2(SEQ ID NO:13)和(SEQ ID NO:14)的混合物。
向含30 μg N-乙醯-脯氨醯-精氨醯-賴氨醯-亮氨醯-酪氨醯-天冬氨醯-酪氨醯胺的80 ml磷酸緩衝鹽水(PBS)溶液中，加入一個碘粒(iodobead)(Pierce,Rockford,IL)和100μCi NaI125。10分鐘後，通過將反應混合物上Waters C1 8-Light SepPack柱，除去過量的NaI125，用水洗脫，然後用含0.1％TFA的1∶1 CH3CN/水洗脫，收集3×200μl部分，提供Tyr533-和Tyr535-放射性標記的肽的混合物。
將該熱混合物共注射到用等摩爾冷載體N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-I-Tyr-NH2和N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I-Tyr-Asp-Tyr-NH2的溶液的C18 HPLC柱上，其洗脫時間已經分別預定為36分鐘和38分鐘。重複用實施例1中的溶劑系統洗脫，並凍幹所述合併的相關部分，提供具有最小量雜質N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I-Tyr-Asp-Tyr-NH2的所需化合物N-Ac-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-I-Tyr-NH2。
一般方法學實施例14分離和純化kringle 5肽片段用Powell等方法(Arch Biochem.Biophys.248(1)390-400(1986)，該文獻通過引用結合到本文中)的修改方法，由豬彈性蛋白酶(SIGMA,St.Louis,MO)消化Lys血纖溶酶原(Lys-HPg,Abbott Laboratories,Abbott Park,IL)製備所述kringle 5肽片段。1.5 mg豬彈性蛋白酶與含200 mg Lys-HPg的50 mM Tris-HCl pH 8.0一起保溫，並於室溫下振蕩過夜。加入DPF(氟磷酸二異丙酯，SIGMA)至終濃度為l mM終止該反應。將該混合物再振蕩30分鐘，對50 mM Tris-HCl pH 8.0透析過夜並濃縮。將切割的血纖溶酶原置於2.5 cm×15 cm的賴氨酸-Sepharose4B柱(Brockway,W.J.和Castellino,F.J.,Arch.Biochem.Biophys.151194-199(1972)，該文獻通過引用結合到本文中)上，並用50 mM TrispH8.0平衡直至達到0.05的吸收值(在280nm)。(進行這步可除去含有kringle l區和/或kringle 4區(這兩者都結合賴氨酸)的任何片段)。所述非吸收kringle 5肽片段對50 mM pH 5.0 Na2PO4緩衝液透析，然後上用同一緩衝液平衡的BioRad Mono-S柱。用0-20％、20-50％和50-70％的階梯梯度的20 mM磷酸鹽/1 M KCI pH 5.0洗脫切割的kringle 5部分；未切割小HPg和其餘的蛋白酶域部分。正如凝膠電泳測定的，所述kingle 5肽片段在50％階梯洗脫。收集的峰對20 mM Tris pH 8.0透析過夜。
通過FPLC層析和用銀染(考馬斯亮藍)的DodSO4/PAGE測定所述分離的kringle 5肽片段的純度至少為95％。所述純化片段的氨基末端部分的序列分析揭示，存在三個具有α-N末端序列VLLPDVETPS、VAPPPVVLL和VETPSEED的多肽，這三個序列分別相應於SEQ IDNO:1的胺基酸部分Val449-Ser458、Val443-Leu450和Val454-Asp461。
實施例15內皮增殖測定按Lingen等在Laboratory Investigation,74:476-483(1996)中所述，用細胞效價96水性非放射性細胞增殖測定試劑盒(PromegaCorporation,Madison,WI)測定內皮細胞的體外增殖，該文獻通過引用結合到本文中。將牛毛細管(腎上腺)內皮細胞在96孔板含10％供體小牛血清和1％BSA(牛血清白蛋白，GIBCO BRL,Gaithersburg,MD)的Dulbecco氏修改Eagle培養基(DMEM)中以1000細胞/孔的密度鋪平板。8小時後，在含0.1％BSA的DMEM中飢餓所述細胞，然後再用含特定濃度的抑制劑和5 ng/ml bFGF(鹼性成纖維細胞生長因子)的培養基飼養。對作為基線的未刺激細胞(即未加入bFGF)和作為最大增殖的僅用bFGF刺激的細胞(即未加入抑制劑)更正該測定的結果。當組合多個實驗時，所述結果以與單獨的bFGF相比的細胞數變化的百分比表示。
實施例16內皮細胞遷移測定基本上按Polverini,P.J.等，Methods Enzymol.198∶440-450(1991)所述進行內皮細胞遷移測定，該文獻通過引用結合到本文中。簡單地說，將牛毛細管(腎上腺)內皮細胞(BCE，哈佛大學醫學院Judah Folman提供)在含0.1％牛血清白蛋白(BSA)的DMEM中飢餓過夜。然後用胰蛋白酶收穫細胞，將其以1.5×106細胞/ml的濃度再懸浮於含0.1％BSA的DMEM中。將細胞加入48孔修改的Boyden小室(NucleoporeCorporation,Cabin John,MD)的底部。裝配該小室，並將其反轉，讓細胞於37℃粘附到聚碳酸酯趨化膜(5 μm孔徑大小)上2小時，該膜已經於0.1％明膠中浸泡過夜並乾燥。然後將該小室再反轉，將測試物質加入上部小室的孔中(至50μ1的終體積)；然後將該裝置於37℃溫育4小時。回收膜，固定，染色(DiffQick,Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)並在每10個高倍視野下計數遷移到上部小室的細胞數。減去向DMEM+0.1％BSA的背景遷移，該數據以每10個高倍視野(400×)遷移的細胞數表示，或當綜合多個實驗的結果時，該數據以與陽性對照相比的遷移抑制百分比表示。結果示於表1。
實施例17kringle 5肽片段對內皮細胞體外增殖的作用用上述內皮細胞增殖測定測定kringle 5肽片段對內皮細胞體外增殖的作用。對於這些實驗，如實施例1-14所述製備kringle 5肽片段，並以大約100-1000pM的濃度範圍的不同濃度與用作最大增殖對照的bFGF一起測試。kringle 5肽片段SEQ ID NO:3以劑量依賴性方式有效地抑制BCE細胞增殖。到達50％抑制(ED50)所需的krinigle 5肽片段SEQ ID NO:3的濃度測定為大約300 pM。相反，kringle 1-4的ED50表明為135 nM。
其它kringle肽片段對BCE細胞增殖的抑制作用的總結示於表1。kringle 3肽片段抑制BCE細胞增殖的效率最低(ED50=460 nM)，然後是kringle 1肽片段(ED50=320 nM)、kringle 1-4肽片段(ED50=135 nM)和kringle 1-3肽片段(ED50=75 nM)。kringle 5肽片段最有效地抑制BCE細胞增殖，ED50為0.3 nM。
實施例18kringle 5肽片段對內皮細胞體外遷移的作用也採用上述內皮細胞遷移測定測定了kringle 5肽片段對內皮細胞體外遷移的作用。kringle 5肽片段以劑量依賴性方式抑制BCE細胞遷移，ED50為大約300 pM。在最大抑制BCE細胞所需的kringle 5肽片段的濃度下，也抑制PC-3細胞和MDA 486細胞。該結果結合實施例2的結果，表明kringle 5肽片段對BCE細胞受刺激增殖和遷移的抑制都有效，並且對內皮細胞為特異性的，對正常細胞或腫瘤細胞無特異性。
以上僅僅是本發明的說明，無意將本發明限制在公開的化合物上。對本領域技術人員明顯的變化和改變在所附的權利要求書定義的本發明的範圍和性質內。
表1顯示由各種kringle片段體外對BCE細胞增殖和細胞遷移的抑制獲得的ED50的總結。在該表中，kringle肽片段按照與SEQ ID NO:1的相應序列同源性進行標記。符號「*」表示得自Marti,D.等，Eur.J.Biochem.,219∶455-462(1994)的數據，該文獻通過引用結合到本文中，而符號「-」表示無數據。
表1

實施例19kringle 5片段在巴斯德畢赤酵母中的重組表達A．通過PCR生產編碼kringle 5片段的cDNA用PCR來產生具有(1)SEQ ID NO:1的胺基酸位置450-543胺基酸序列(下文為K5A),(2)SEQ ID NO:1的胺基酸位置450-546胺基酸序列(下文為K5F),(3)SEQ ID NO:1的胺基酸位置355-543胺基酸序列(下文為K4-5A)和(4)SEQ ID NO:1的胺基酸位置355-546胺基酸序列(下文為K4-5F)的kringle 5肽片段的編碼cDNA片段，以用於在真核宿主和原核宿主中克隆和表達。用人血纖溶酶原的編碼cDNA(得自紐約州立大學E.Reich博士，Stony Brook,NY)作為模板和示於以下的數套正向和反向引物(得自Operon Technologies,Inc.Alameda,CA)產生DNA片段

採用引物組SEQ ID NO:2和SEQID NO:4(用於K5A)、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:5(用於K5F)、SEQ ID NO3和SEQ ID NO:8(用於K4-5A)和SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5(用於K4-5A)，在標準PCR條件下進行PCR擴增，所述條件為總體積為100 μl，含有每種dNTP200 μM，其中N為A、T、G和C，每種引物0.2μM，大約10 ng模板DNA和1單位VentDNA聚合酶(New England Biolabs)。在DNA熱循環儀480(Perkin Elmer,Foster City,CA)上擴增總共25個循環(1個循環=94℃1分鐘，48℃2分鐘，72℃1分鐘)。擴增後，凝膠純化PCR產物，用BamHⅠ和XhoⅠ(New England Biolabs)消化，連接到用同一酶切割的修飾的畢赤酵母屬表達載體(pHil-D8，參見以下)中，並通過電穿孔轉化到HB101細胞(BioRad)中。從各個克隆製備DNA，經過限制酶消化和序列分析，以鑑定含有具有正確序列並且方向正確的插入片段的克隆。然後，按照廠商的指示，將來自陽性鑑定克隆的質粒轉化到巴斯德畢赤酵母菌株GSll5(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。為了鑑定畢赤酵母屬中的陽性克隆，讓細胞於29℃過夜生長於5 mlBMGY培養基(Invitrogen)中，通過離心收集細胞，將其再懸浮於0.5mlBMMY培養基(Invitrogen)中用於表達。於29℃溫育2天後，收集培養物上清液，按照已知技術將數等份經過SDS-PAGE和Western印跡分析。一個SDS-PAGE凝膠示於圖6。
B．表達載體pHil-D8的構建通過修飾載體pHil-D2(Invitrogen)，使其包括用於分泌重組蛋白的合成前導序列，構建畢赤酵母屬表達載體pHil-D8(參見圖5)。前導序列5』-ATGTTCTCTCCAATTTTGTCCTTGGAAATTATTTTAGCTTTGGCTACTTTGCAATCTGTCTTCGCTCAGCCAGTTATCTGCACTACCGTTGGTTCCGCTGCCGAGGGATCC-3』(SEQ ID NO:9)編碼一個碼操作性地連接到用於KEX2切割的前肽序列(粗體)的PHO1分泌信號(單下劃線)。為了構建pHil-D8，採用pHil-S1(Invitrogen)作為模板進行PCR，因為該載體含有編碼PHOl的序列，採用相應於pHil-Sl的核苷酸509-530的正向引物(SEQ ID NO:7)和具有PHO1分泌信號後一部分(SEQ ID NO:9的核苷酸45-66)的編碼核苷酸序列的反向引物(SEQ ID NO:8)和所述前肽序列(SEQ ID NO:9的核苷酸67-108)。所述引物序列(得自OperonTecnologies,Inc.Alameda,CA)如下

如實施例19所述擴增25個循環。將PCR產物(大約500 bp)凝膠純化，用BlpⅠ和EcoRⅠ切割，並連接到用同樣的酶切割的pHil-D2中。將所述DNA轉化到大腸桿菌HB101細胞中，通過限制酶消化和序列分析鑑別陽性克隆。一個具有合適序列的克隆命名為pHil-D8。
實施例20kringle 5肽片段在細菌中的重組表達所用的限制酶和其它修飾酶以及其它試劑都得自商業來源。於Abbott實驗室，在自動合成儀上用本領域已知的標準方法合成引物。
也通過PCR擴增產生kringle 5肽片段的DNA，以在細菌細胞(大腸桿菌)中克隆和表達。採用的一般方法是產生具有或不具有終止密碼子的所需編碼區的PCR片段，用激酶處理所述末端，將所述片段克隆到選擇的載體中。然後將載體構成物轉化到合適的宿主細胞中，並通過PCR，用載體引物篩選菌落，以證實插入片段的存在。為了確定插入片段的方向，用1個載體引物和1個插入引物，將表現出插入片段陽性克隆的PCR反應物進行定向PCR。
A．平端磷酸化載體的製備表2顯示用於細菌生產kringle 5肽片段的表達載體的描述。
表2

所有載體都首先用Qiagen柱按照廠商的說明(QIAGEN,Inc.,SantaClarita,CA)進行分離和純化。載體DNA(lμg)用合適的限制酶(參見表2)，在含有100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)的20μl NEB4緩衝液(NewEngland Biolabs)中進行消化。將反應物簡單地離心，加入20μl去離子水、0.4μldNTP混合物(Pharmacia；dNTP各20 mM)和0.25μl克隆的pfu DNA聚合酶(Stratagene；2.5單位/μl)，將該反應混合物於65℃溫育20分鐘，以填滿該載體末端。再將反應物簡單地離心，加入4μl稀釋的牛小腸磷酸酶(GIBCO BRL,Gaithersburg,MD；總共5單位)。然後於50℃將該混合物溫育1小時。加入5個5μl 10％SDS、2μl 5MNaCl、2μl 0.5M EDTA和45μl水，簡單地將該反應物離心，然後於65℃溫育20分鐘。然後用緩衝液飽和的苯酚-氯仿(GIBCO BRL)抽提3次該反應物，用氯仿抽提一次。水相通過CHROMA SPINTM100 TE柱(CLONTECH,Palo Alto,CA)純化。
B.通過PCR產生DNA片段根據公開的人血纖溶酶原的序列(參見SEQ ID NO:12)設計和orderPCR引物，並示於下面

>除非另外陳述，否則用pfu DNA聚合酶和緩衝液(Stragene)，採用dNTP各200μM和每種引物各lμM進行所有PCR。所用的引物組為SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13(用於K5A)以及SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:13(用於K4-5A)。含有K4-5A的載體pHil-D8(實施例19所述)用作模板。在用作模板前，該DNA用Dral(它在所述kringle區外產生多個切口)消化，以消除由pHil-D8在轉化中引起的背景。每50μlPCR反應物用大約10 ng模板。PCR反應於94℃進行2分鐘；然後以94℃30秒、49℃1分鐘、72℃4分鐘進行15個循環，以及於72℃7分鐘。在PCR反應後，加入0.5μl100 mM ATP和5單位T4激酶，該反應物於37℃保溫20分鐘，以用激酶處理所述末端。然後將該反應物於68℃加熱15分鐘，在S400-HR spin柱(Pharmacia)純化以用於連接。
C．將PCR片段連接到表達載體中如下製備6個重組構成物(具體為(ⅰ)UpET-PS3中的K5A,(ⅱ)pET32a中的K5A,(ⅲ)在UpET-PS3中的K4-5A,(ⅳ)在UpET-Ubi中的K4-5A,(ⅴ)pET32a中的K4-5A和(ⅵ)pGEX-4T-2中的K4-5A)將平端、磷酸酶處理的載體(來自以上步驟A的1μl)和PCR片段(來自以上步驟B的1μl)在5.5μl的總體積中，用快速連接試劑盒按照廠商的說明(BOEHRINGER-MANNHEIM Corp.,Indianapolis,IN)進行連接。然後將連接混合物(1μl)按照廠商的說明轉化到20μl的感受態細胞(XLl-Blue超感受態細胞或XL2-Blue超感受態細胞(Stratagene)。在LB-Amp瓊脂平板(MicroDiagnostics,Lombard,IL)上選擇重組細胞。
D．表達研究在大腸桿菌XLl-Blue和XL2-Blue中表達pGEX載體。分離所有其它載體，並按照廠商的說明轉化到大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen)中。將各個菌落接種到2.5ml LB/Amp中，以225rpm、37℃振蕩過夜。然後，將過夜培養物(0.5 ml)接種到250 ml燒瓶中的50 ml LB/Amp中，以225rpm、37℃振蕩至OD600為05～0.6。然後加入異丙基-1-硫-B-D-吡喃半乳糖糖苷(IPTG,100mM)至最終濃度為lmM。培養物以225 rpm、30℃振蕩3小時，然後離心。按照已知技術製備用於SDS-PAGE的樣品。初步實驗表明，具有K5A/pET32a、K4-5A/pET32a和K4-5A/pGEX的細胞產生大多數重組蛋白。然後通過SDS-PAGE分析這些克隆的培養物的可溶性對不溶性的表達。如圖7所示，K5A/pET32a產生的重組蛋白完全可溶(比較Trx-K5A的泳道S和P)，而K4-5A/pET32a和K4-5A/pGEX產生大約75％的可溶性蛋白。
E． Abbott修飾載體的構建i．VB1、VB2、VB3和VB4盒的製備VB1、VB2、VB3和VB4作為合成DNA用本領域技術人員熟知的技術合成。synVB1、synVB2、synVB3和synVB4的序列示於以下<

將每種合成序列製備成雙鏈，並按照廠商的說明克隆到pCR-Script CamTM中；然後通過標準方法分離具有正確序列的克隆。在含20μl反應物、100μg/ml BSA的1×NEB4緩衝液中將5μg純化的DNA用8單位BsmBⅠ於55℃消化。簡單地離心該反應物，加入20μl去離子水、0.4μl dNTP混合物(Pharmacia；每種dNTP 20 mM)和0.25μl克隆的pfu DNA聚合酶(atratagene；每μl2.5單位)，將該反應物於65℃保溫20分鐘，以填滿所述末端。然後該DNA在含3％MetaPhorTM瓊脂糖凝膠(FMC,Rockland,Maine)的0.5×Tris-乙酸鹽-EDTA緩衝液(TAE)中電泳。切下所述盒條帶，通過冷凍該凝膠，然後通過UltrsfreeTMProbind cartridge(MILLIPORE Corp.,Bedford,MA)離心緩衝液來洗脫所述DNA，接著用Pellet PaintTM(Novagen)作為載體進行異丙醇沉澱。該DNA(cfVB1、cfVB2、cfVB3和cfVB4)用70％乙醇衝洗，簡單地乾燥，再懸浮於25μlTris-EDTA(TE)緩衝液中。
ⅱ．UpET的構建載體pET21d(Novagen)用SapⅠ消化，首先用T4 DNA聚合酶+dGTP處理，然後用Mung Bean核酸酶處理，然後用DNA聚合酶Ⅰ克列諾片段處理，然後再連接。篩選各個菌落，以選擇已經消除現有SapⅠ位點的質粒。然後，該DNA用NcoⅠ+BamHⅠ消化，並連接到5』-CATGTGAAGAGC-3』(SEQ ID NO:19)+5』-GATCGCTCTTCA-3』(SEQ ID NO:20)，以導入一個單一的SapⅠ位點。純化的證實的克隆DNA用SapⅠ+HindⅢ切割，按上述將其平端化和用磷酸酶處理，與cfVBl盒連接，轉化到大腸桿菌中，在LB-Amp平板上鋪平板。用無菌移液管頭在LB-Amp瓊脂平板上挑出菌落，接種到 Costar Thermowell板中的20μl AmpliTaqPCR mix(Perkin ELmer)中，板中含有載體引物5』-AGATCTCGATCCCGCGAA-3』(正向引物，SEQ ID NO:21)和5』-ATCCGGATATAGTTCCTC-3』(SEQ ID NO:22)各1 μM。將反應物加熱至94℃5分鐘，然後用GeneAmp 9600熱循環儀進行30個循環94°30秒，40°1分鐘，72°2分鐘。將每種反應物10μl在瓊脂糖凝膠上電泳。為了確定該盒的方向，將具有正確大小的PCR篩選物0.25μl加入含有反向載體引物和盒引物5』-CGGGCTTTTTTTTGCTCTTCA-3』(SEQ ID NO:23)的新鮮反應中。反應按上述再循環10個循環。用標準方法對最終的載體進行測序，一個克隆命名為UpET。
ⅲ．UpET-HTh的構建UpET用SapⅠ消化，製備用於平端、磷酸酶處理的克隆。如以上cfVB1連接所述，將其連接到cfVB2盒中，進行轉化、篩選菌落並對其測序。
ⅳ．UpET-H的構建UpET用SapⅠ消化，製備用於平端、磷酸酶處理的克隆。如以上cfVB1連接所述，將其連接到cfVB3盒中，進行轉化、篩選菌落並對其測序。
ⅴ．UpET-Ubi的構建用Ultma DNA聚合酶和緩衝液(PerkinElmer)、dNTP各40 μM、引物5』-CAGATTTTCGTCAAGACTT-3』(Ubi-5p,SEQ ID NO:24)和5』-ACCACCTCTTAGCCTTAG-3』(Ubi-3p,SEQ ID NO:25)各lμM和1.75μg酵母DNA，於94℃2分鐘，然後於94℃1分鐘、40℃1分鐘、72℃2分鐘進行25個循環，然後於72℃7分鐘，產生釀酒酵母遍在蛋白的PCR片段。用引物5』-CATGGTATATCTCCTTCTT-3』(pET3p-ATG,SEQ ID NO:26)和5』-TGAGCAATAACTAGCATAAC-3』(T7RevTerm,SEQ ID NO:27)，於94℃2分鐘，然後於94℃45秒、42℃1分鐘、72℃15分鐘進行10個循環，然後於72℃7分鐘，由20 ng pET15b(Novagen)產生一PCR片段。將遍在蛋白和pET15b衍生的PCR片段進行凝膠純化，並用BRLT4連接酶和連接酶緩衝液將它們連接在一起。然後用該連接物作為模板，使用Ultma DNA聚合酶和引物5』-AGATCTCGATCCCGCGAA-3』(pET5p,SEQ ID NO:28)和SEQ ID NO:25，於94℃2分鐘，然後於94℃30秒、42℃1分鐘、72℃3分鐘進行25個循環，然後於72℃7分鐘，產生T7啟動子-遍在蛋白(T7-遍在蛋白)PCR片段。凝膠純化T7-遍在蛋白PCR片段。
使用Ultma DNA聚合酶(如上)和引物5』-TTAGGTCTCAGGGGAGT-3』(Strom-3p,SEQ ID NO:29)和激酶處理的引物5』-TTCAGAACCTTTCCTGGCA-3』(Strom-5p,SEQ ID NO:30)和大約20 ng模板(即克隆到pET3b(Novagen)的Stromelysin)，於94℃2分鐘，然後於94℃1分鐘、44℃1分鐘、72℃2分鐘進行15個循環，然後於72℃7分鐘，產生成熟的人Stromelysin的PCR片段。將stromelysin PCR反應物(10 μl)在40μl BRL連接酶和連接酶緩衝液中，與100 pMol退火寡聚物5』-AGCGGCGACGACGACGACAAG-3』(Ek-Cut-5p,SEQ IDNO:31)和5』-CTTGTCGTCGTCGTCGCCGCT-3』(Ek-Cut-3p,SEQ IDNO:32，編碼腸激酶酶切位點)連接。用lμl該連接物作為模板，用引物SEQ ID NO:29和激酶處理的SEQ ID NO:31、Ultma DNA聚合酶和緩衝液，於94℃2分鐘，然後於94℃1分鐘、44℃1分鐘、72℃2分鐘進行10個循環，然後於72℃7分鐘，產生腸激酶位點-成熟stromelysin(Ek-Stromelysin)PCR片段。凝膠純化Ek-stromelysin PCR片段。
將T7-遍在蛋白和Ek-stromelysin PCR片段在連接酶和連接酶緩衝液中連接在一起。然後，用該連接物作為模板，使用Ultma DNA聚合酶和引物SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29，於94℃2分鐘，然後於94℃30秒、42℃1分鐘、72℃6分鐘進行25個循環，然後於72℃7分鐘，產生T7-遍在蛋白-Ek-stromelysin PCR片段。
用stromelysin-pET3b質粒模板與引物SEQ ID NO:26和SEQ IDNO:30以及Klen Taq(AB肽，St.Louis,MO)和pfu DNA聚合酶，於94℃2分鐘，然後於94℃30秒、42℃2分鐘、68℃20分鐘進行15個循環，產生一PCR片段。將該PCR片段與T7-遍在蛋白-Ek-stromelysin PCR片段混合，轉化到BRL DH5α最大效率的感受態細胞中。通過如上述研究的分離質粒DNA，轉染到BL21(DE3)中並進行表達，鑑別正確的克隆。
用引物SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:32以及ppfu DNA聚合酶，於94℃2分鐘，然後於94℃30秒、40℃1分鐘、72℃3分鐘進行20個循環，然後於72℃7分鐘，由正確的T7-遍在蛋白-Ek-stromelysin表達質粒產生遍在蛋白-Ek的PCR片段。在Pharmacia S-400HR Spin柱上純化該片段，用快速DNA連接試劑盒將其連接到VBC1盒中。用該連接物作為模板，使用引物SEQ ID NO:24和5』-TGAAGAGCAAAAAAAAGCCCG-3』(SEQ ID NO:33)和pfuDNA聚合酶，於94℃2分鐘，然後於94℃30秒、40℃1分鐘、72℃2分鐘進行20個循環，然後於72℃7分鐘，產生一PCR片段。將該PCR片段用激酶處理，將其連接到製備的Uper-H上，用於平端、磷酸酶處理的克隆。將該連接物轉化到感受態細胞中，通過PCR如上篩選菌落。對質粒DNA測序，以鑑別正確的UpET-Ubi克隆。
權利要求
1．具有式(Ⅰ)的化合物或其藥學上可接受的鹽、酯或前體藥物，A-B-C-X-Y(Ⅰ)其中，A不存在或為氮保護基團；Y不存在或為羧酸保護基團；B不存在或為相應於SEQ ID NO:1的大約胺基酸位置334至胺基酸位置530序列的1至大約197個天然產生的胺基酸殘基；C為R1-R2-R3-R4，其中R1為賴氨醯；R2為亮氨醯或精氨醯；R3為酪氨醯、3-I-酪氨醯或苯丙氨醯；R4為天冬氨醯；以及X不存在或為相應於SEQ ID NO:1的胺基酸位置535至大約胺基酸位置546序列的1至大約12個天然產生的胺基酸殘基及其同源物(homologues)和類似物。
2．權利要求1的化合物，其中B存在，而A、C、X和Y如其中定義的。
3．權利要求2的化合物，其中X存在，而A、B、C和Y如其中定義的。
4．權利要求3的化合物，其中A和Y存在，而B、C和X如其中定義的。
5．權利要求3的化合物，其中A和Y如其中定義的，而B-C-X選擇以下(a)SEQ ID NO:1的胺基酸位置355-543的序列；(b)SEQ ID NO:1的胺基酸位置355-546的序列；(c)SEQ ID NO:1的胺基酸位置443-543的序列；(d)SEQ ID NO:1的胺基酸位置449-543的序列；(e)SEQ ID NO:1的胺基酸位置454-543的序列；(f)SEQ ID NO:1的胺基酸位置443-546的序列；(g)SEQ ID NO:1的胺基酸位置449-546的序列；(h)SEQ ID NO:1的胺基酸位置454-546的序列；(i)SEQ ID NO:1的胺基酸位置525-535的序列；(j)SEQ ID NO:1的胺基酸位置529-535的序列；以及(k)SEQ ID NO:1的胺基酸位置530-535的序列。
6．權利要求5的化合物，其中A為N-Ac，而Y為-NH2。
7．權利要求1的化合物，其中X不存在，而A、B、C和Y如其中定義的。
8．權利要求7的化合物，其中X、A和Y如其中定義的，而B-C為SEQ ID NO:1胺基酸位置529-534的序列。
9．權利要求1的化合物，其中B和X不存在，而A、C和Y如其中定義的。
10．權利要求9的化合物，其中C為SEQ ID NO:1胺基酸位置531-534的序列。
11．權利要求1的化合物，其中所述化合物的分子量通過還原聚丙烯醯胺凝膠電泳或質譜分析測定為0.5-25,000千道爾頓，其胺基酸序列與SEQ ID NO:1的相應胺基酸序列大致相似。
12．權利要求1的化合物，它對內皮細胞遷移抑制的ED50大約為100至大約500 pM。
13．權利要求1的化合物，它對內皮細胞增殖抑制的ED50大約為100至大約500 pM。
14．具有式(Ⅱ)的化合物或其藥學上可接受的鹽、酯或前體藥物，A-B1-C1-X1-Y(Ⅱ)其中A不存在或為氮保護基團；Y不存在或為羧酸保護基團；B1不存在或為相應於SEQ ID NO:1的大約胺基酸位置334至胺基酸位置513序列的1至大約176個天然產生的胺基酸殘基；C1為SEQ ID NO:1的胺基酸位置514至胺基酸位置523的序列；而X1不存在或為相應於SEQ ID NO:1的胺基酸位置524至胺基酸位置533序列的1至大約10個天然產生的胺基酸殘基及其同源物和類似物。
15．權利要求14的化合物，其中B1和X1不存在，而A、C1和Y如其中定義的。16．權利要求8或10或15的化合物，其中A為N-Ac，而Y為-NH2。
17．kringle 5肽片段，它與選自人、鼠、牛、獼猴和豬血纖溶酶源的血纖溶酶源片段具有大致的序列同源性。
18．kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白，其中所述kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白與人血纖溶酶源具有大致的序列同源性。
19．在需要抗血管生成療法的病人中治療疾病的方法，包括給與人或動物治療有效量的哺乳動物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白。
20．權利要求19的方法，其中所述哺乳動物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白選自人、鼠、牛、獼猴和豬kringe 5肽片段或融合蛋白。
21．權利要求20的方法，其中所述kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白為人kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白。
22．權利要求19的方法，其中所述哺乳動物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白為具有下式的化合物或其藥學上可接受的鹽、酯或前體藥物，A-B-C-X-Y(Ⅰ)其中，A不存在或為氮保護基團；Y不存在或為羧酸保護基團；B不存在或為相應於SEQ ID NO:1的大約胺基酸位置334至胺基酸位置530序列的1至大約197個天然產生的胺基酸殘基；C為R1-R2-R3-R4，其中R1為賴氨醯；R2為亮氨醯或精氨醯；R3為酪氨醯、3-I-酪氨醯或苯丙氨醯；R4為天冬氨醯；X存在或為相應於SEQ ID NO:1的胺基酸位置535至大約胺基酸位置546序列的1至大約12個天然產生的胺基酸殘基及其同源物或類似物。
23．權利要求22的方法，其中所述哺乳動物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白為所述化合物，其中A和Y如其中定義的，而B-C-X選擇以下(a)SEQ ID NO:1的胺基酸位置355-543的序列；(b)SEQ ID NO:1的胺基酸位置355-546的序列；(c)SEQ ID NO:1的胺基酸位置443-543的序列；(d)SEQ ID NO:1的胺基酸位置449-543的序列；(e)SEQ ID NO:1的胺基酸位置454-543的序列；(f)SEQ ID NO:1的胺基酸位置443-546的序列；(g)SEQ ID NO:1的胺基酸位置449-546的序列；(h)SEQ ID NO:1的胺基酸位置454-546的序列；(i)SEQ ID NO:1的胺基酸位置525-535的序列；(j)SEQ ID NO:1的胺基酸位置529-535的序列；以及(k)SEQ ID NO:1的胺基酸位置530-535的序列。
24．權利要求22的方法，所述化合物為所述哺乳動物kringle 5肽片段，其中X不存在，A和Y如其中定義的，而B-C為SEQ ID NO:1胺基酸位置529-534的序列。
25．權利要求22的方法，其中所述化合物為所述哺乳動物kringle5肽片段，其中X和B不存在，而A、C和Y如其中定義的。26．權利要求23或24或25的方法，其中A為N-Ac，而Y為-NH2。
27．權利要求19的方法，其中所述疾病選自癌症、關節炎、黃斑變性和糖尿病性視網膜病。
28．權利要求27的方法，其中所述疾病為癌症。
29．權利要求28的方法，其中所述疾病選自原發性和繼發性實體瘤、癌、肉瘤、淋巴瘤、牛皮癬和血管瘤。
30．權利要求19的方法，其中所述哺乳動物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白為具有下式的化合物或其藥學上可接受的鹽、酯或前體藥物，A-B1-C1-X1-Y(Ⅱ)其中A不存在或為氮保護基團；Y不存在或為羧酸保護基團；Bl不存在或為相應於SEQ ID NO:1的大約胺基酸位置334至胺基酸位置513序列的1至大約176個天然產生的胺基酸殘基；Cl為SEQ ID NO:1的胺基酸位置514至胺基酸位置523的序列；而Xl不存在或為相應於SEQ ID NO:1的胺基酸位置524至胺基酸位置533序列的1至大約10個天然產生的胺基酸殘基及其同源物和類似物。
31．權利要求30的方法，所述化合物為所述哺乳動物kringle 5肽片段，其中B1和X1不存在，而A、C1和Y如其中定義的。
32．包含分離的單鏈或雙鏈多核苷酸序列的組合物，其中所述多核苷酸序列編碼具有血管生成抑制活性的kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白。
33．權利要求32的組合物，其中所述多核苷酸序列為DNA序列。
34．權利要求33的組合物，其中所述DNA序列編碼選自以下的胺基酸序列(a)SEQ ID NO:1的胺基酸位置443-543的序列；(b)SEQ ID NO:1的胺基酸位置449-543的序列；(c)SEQ ID NO:1的胺基酸位置454-543的序列；以及(d)SEQ ID NO:1的胺基酸位置355-543的序列。
35．權利要求33的組合物，其中所述多核苷酸序列編碼選自SEQID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37的胺基酸序列。
36．組合物，包含kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白和藥學上可接受的賦形劑。
37．包括植入包含載體的人類或非人類動物細胞的方法，其中所述載體含有編碼kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白的DNA序列，並且其中所述載體存在於所述細胞中時，能夠表達所述kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白。
38．製備kringle 5肽片段的方法，包括以下步驟(a)將哺乳動物血纖溶酶源以大約1∶100至大約1∶300的比率暴露於彈性蛋白酶，以形成所述血纖溶酶源和所述彈性蛋白酶的混合物；(b)溫育所述混合物；並且(c)從所述混合物中分離所述kringle 5肽片段。
39．分離的單鏈或雙鏈多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有血管生成抑制活性的kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白。
40．權利要求39的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼的所述哺乳動物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白選自人、獼猴、牛、鼠和豬kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白。
41．權利要求40的多核苷酸，其中所述哺乳動物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白為人kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白。
42．權利要求39的多核苷酸，其中所述哺乳動物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白為具有式B-C-X或Bl-Cl-Xl的化合物，其中B不存在或為相應於SEQ ID NO:1的大約胺基酸位置334至胺基酸位置530序列的1至大約197個天然產生的胺基酸殘基；C為R1-R2-R3-R4，其中R1為賴氨醯；R2為亮氨醯或精氨醯；R3為酪氨醯或苯丙氨醯；以及R4為天冬氨醯；X不存在或為相應於SEQ ID NO:1的胺基酸位置535至大約胺基酸位置546序列的1至大約12個天然產生的胺基酸殘基；B1不存在或為相應於SEQ ID NO:1的大約胺基酸位置334至胺基酸位置513序列的1至大約176個天然產生的胺基酸殘基；C1為SEQ ID NO:1的胺基酸位置514至胺基酸位置523的序列；而X1不存在或為相應於SEQ ID NO:1的胺基酸位置524至胺基酸位置533序列的1至大約10個天然產生的胺基酸殘基及其互補物。
43．權利要求42的多核苷酸，其中所述哺乳動物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白為這樣的化合物，其中B存在，而C和Y如其中定義的。
44．權利要求42的多核苷酸，其中所述哺乳動物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白為這樣的化合物，其中X存在，而B和C如其中定義的。
45．權利要求42的多核苷酸，其中所述哺乳動物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白為這樣的片段，其中B和X存在，而C如其中定義的。
46．權利要求39的多核苷酸，其中所述哺乳動物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白選自(a)SEQ ID NO:1的胺基酸位置355-543的序列；(b)SEQ ID NO:1的胺基酸位置355-546的序列；(c)SEQ ID NO:1的胺基酸位置443-543的序列；(d)SEQ ID NO:1的胺基酸位置449-543的序列；(e)SEQ ID NO:1的胺基酸位置454-543的序列；(f)SEQ ID NO:1的胺基酸位置443-546的序列；(g)SEQ ID NO:1的胺基酸位置449-546的序列；以及(h)SEQ ID NO:1的胺基酸位置454-546的序列。
47．權利要求42的多核苷酸，其中所述哺乳動物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白為這樣的片段，其中X不存在，而B和C如其中定義的。
48．權利要求39的多核苷酸，它為DNA分子。
49．權利要求39的多核苷酸，它為RNA分子。
50．包含一多核苷酸的載體，所述多核苷酸編碼具有血管生成抑制活性的kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白。
51．權利要求50的載體，它為表達載體。
52．權利要求51的載體，其中所述多核苷酸編碼的所述哺乳動物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白為具有式B-C-X或B1-C1-X1的化合物，其中B不存在或為相應於SEQ ID NO:1的大約胺基酸位置334至胺基酸位置530序列的1至大約197個天然產生的胺基酸殘基；C為R1-R2-R3-R4，其中R1為賴氨醯；R2為亮氨醯或精氨醯；R3為酪氨醯或苯丙氨醯；以及R4為天冬氨醯；X不存在或為相應於SEQ ID NO:1的胺基酸位置535至大約胺基酸位置546序列的1至大約12個天然產生的胺基酸殘基；B1不存在或為相應於SEQ ID NO:1的大約胺基酸位置334至胺基酸位置513序列的1至大約176個天然產生的胺基酸殘基；C1為SEQ ID NO:1的胺基酸位置514至胺基酸位置523的序列；而X1不存在或為相應於SEQ ID NO:1的胺基酸位置524至胺基酸位置533序列的1至大約10個天然產生的胺基酸殘基或其互補物。
53．權利要求52的載體，其中所述哺乳動物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白為這樣的化合物，其中B和X存在，而C如其中定義的。
54．權利要求52的載體，其中所述哺乳動物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白為這樣的化合物，其中X不存在，而B和C如其中定義的。
55．權利要求52的載體，其中所述哺乳動物kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白選自(a)SEQ ID NO:1的胺基酸位置355-543的序列；(b)SEQ ID NO:1的胺基酸位置355-546的序列；(c)SEQ ID NO:1的胺基酸位置443-543的序列；(d)SEQ ID NO:1的胺基酸位置449-543的序列；(e)SEQ ID NO:1的胺基酸位置454-543的序列；(f)SEQ ID NO:1的胺基酸位置443-546的序列；(g)SEQ ID NO1的胺基酸位置449-546的序列；以及(h)SEQ D NO:1的胺基酸位置454-546的序列。
56．權利要求52的載體，選自pHil-D8、pET32a、pGEX-4T-2、Up-ET、UpET-Ubi和pCYB3。
57．權利要求52的載體，還包括用所述載體轉化的宿主細胞。
58．權利要求57的載體，其中所述宿主細胞為真核細胞。
59．權利要求58的載體，其中所述真核細胞為巴斯德畢赤酵母。
60．權利要求57的載體，其中所述宿主細胞為大腸桿菌原核細胞。
61．製備可溶性kringle 5肽片段或kringle 5融合蛋白的方法，包括以下步驟(a)分離編碼所述kringle 5肽片段的多核苷酸；(b)將所述多核苷酸克隆到表達載體中；(c)將所述載體轉化到合適的宿主細胞中；以及(d)讓所述宿主細胞在適於所述可溶性kringle 5肽片段或kringle5融合蛋白的表達的條件下生長。
62．選自以下的化合物(a)A-Pro-Arg-Lys-Leu-Tyr-Asp-3-I-Tyr-Y；(b)A-Pro-Arg-Lys-Leu-3-I-Tyr-Asp-Tyr-Y；(c)A-Pro-Glu-Lys-Arg-Tyr-Asp-Tyr-Y；和(d)A-Gln-Asp-Trp-Ala-Ala-Gln-Glu-Pro-His-Arg-His-Ser-Ile-Phe-Thr-Pro-Glu-Thr-Pro-Glu-Thr-Asn-Pro-Arg-Ala-Gly-Leu-Glu-Lys-Asn-Tyr-Y。
全文摘要
公開了治療血管生成疾病的哺乳動物kringle(5)片段和kringle(%)融合蛋白。也公開了抑制血管生成疾病的方法和組合物。
文檔編號A61K38/48GK1223690SQ97195989
公開日1999年7月21日 申請日期1997年5月5日 優先權日1996年5月3日
發明者D·J·達維森, 王結義, E·J·格賓斯 申請人:艾博特公司