抗MUC1α/β抗體的製作方法

2023-09-14 23:46:45 5

專利名稱：抗MUC1 α/β抗體的製作方法
技術領域：
本發明涉及特異和同時結合MUC1的a亞基和j8亞基的抗體。
背景技術：
MUC1是在包括乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、卵巢癌和胰腺癌等 多種人上皮惡性腫瘤中以及多發性骨髓瘤的惡性漿細胞上高表達的糖 蛋白。儘管選擇性剪接可產生多種MUC1亞型，但最深入研究的MUC1 蛋白是I型跨膜蛋白，其由含有串聯重複排列(tandem-repeat-array)的 高度糖基化細胞外結構域、跨膜結構域和細胞質結構域組成 (MUC1/TM)。 MUC1/TM在其合成後不久就被蛋白水解切割，生成兩 個亞基a和j8，它們特異地識別並以強的非共價相互作用結合(參見圖 1， MUC1/TM)。將MUC1切割成為兩個亞基發生在SEA組件中，該 SEA組件為在多種細胞束繂的粘蛋白樣蛋白中發現的高度保守結構域 (Levitin， " a/" J歷o/ CAem (2005) 280:33374-86)。 a亞基從細胞膜上脫 落導致可溶的含串聯重複排列的MUC1處於外周循環中，就是這種分 子被用於確定MUC1陽性惡性腫瘤患者的血清MUC1水平。
存在於循環中的該可溶a亞基MUC1蛋白為遞送足夠量的抗 MUC1抗體以直接靶向表達MUC1的惡性細胞帶來巨大困難。因為 MUC1的最強免疫原性部分為所述串聯重複排列，並且迄今為止基本
上所有產生的抗MUC1抗體僅識別在該免疫原性區的表位。可溶的循 環MUCl a亞基捕獲抗串聯重複抗體嚴重地限制了能夠成功結合細 胞表面的MUCl的抗體含量。此外，抗串聯重複抗體與其可溶的循環 MUCl靶的免疫複合物的沉積可導致顯著的終末器官損傷。
最近幾年，進行了用全長MUC1/TM分子作為免疫原產生有效的 抗MUC1抗體的多種嘗試。阻礙這些嘗試的主要困難在於用整個 MUC1/TM分子免疫總是引起差不多完全由識別該高免疫原性的串聯 重複排列的抗體構成的抗體應答。對於在體內靶向表達MUC1的腫瘤 細胞的最終應用來說，這類抗體顯現出上述抗重複抗體固有的所有缺 點。
識別束綽到細胞表面的MUC1表位的抗體有可能排除這些困難。 儘管概念上簡單，產生針對穩定束綽到細胞表面的MUC1的單克隆抗 體首先需要表徵細胞結合的非脫落表位。由MUCl a亞基結合被膜束 綽的!3亞基形成的連接處(junction)提供了這樣的表位。
發明概述
本發明提供了同時結合完整MUCl蛋白的a亞基和j3亞基的抗體 ("抗MUCl 抗體"，其結合MUCl 亞基連接處，但在MUCl a 亞基和MUCl j8亞基中的一個不存在時所述抗體基本上不結合另一 個)。本發明還提供產生所述抗體的方法和在例如診斷和免疫治療應用 中使用所述抗體的方法。
因此，在第一方面，本發明提供MUC1特異抗體，其結合完整 MUCl蛋白，但須在a亞基和)S亞基中的一個不存在時所述抗體不結 合另一個。
關於所述抗體的實施方案，在一些實施方案中，例如在ELISA中 或通過使用表達MUC1亞型的細胞的流式細胞計量法所測量的，所述 抗體結合亞型MUC1/X但不結合亞型MUC1/Y。在一些實施方案中， 所述抗體結合被切割為截短的a亞基和]3亞基的MUC1/X亞型。
所述抗體可為多克隆的或單克隆的。所述抗體可具有約1(T"M至 約10"M範圍內的解離常數(Kd),例如約l(T M， 10-8M, 10-9M, 10-10M，
10-"M， 1(T12M。所述抗體可具有約1(^M"至約10"M"範圍內的結合 常數(Ka)，例如約106M", 107M-1， lO8]^1, lOH 1010M-1。如在採 用MUC1/TM或MUC1/X作為抗原的ELISA測定中所測量的，所述抗 體可具有約1 : 100或1 :300至約1:30,000或1 :50,000的滴度，例如 約1:300, 1:1000, 1:5000， I:IO，OOO, 1:20,000, 1 :30,000, 1 :50,000。
所述抗體可包含任何天然產生的恆定區或其任意亞類，例如包括 IgA (包括IgAl和IgA2), IgD, IgE, IgG (包括IgGl， IgG2， IgG3，和IgG4), 以及IgM。所述抗體可具有來自任何能產生抗體的動物的恆定區，所 述動物包括哺乳動物或鳥類。可在人和非人哺乳動物中產生所述抗體， 所述非人哺乳動物包括犬、貓、牛、羊、馬、豬和齧齒目，包括兔形 目、家鼠屬、倉鼠、鼠科動物。可在雞中產生所述抗體。
在一些實施方案中，所述抗體為人源化的或人抗體。在一些實施 方案中，所述抗體缺乏恆定區。例如，所述抗體可為Fab片段或單鏈 可變區。所述抗體可為重組產生的。
所述抗體可進一步包含細胞毒性部分，例如蓖麻毒素分子、假單 胞菌屬毒素、放射性同位素。所述抗體可進一步包含標籤部分，例如 放射性同位素、酶、螢光團。
在一些實施方案中，所述抗體防止MUC1 a亞基從/3亞基解離。 在一些實施方案中，所述抗體減少或抑制經由MUC1 j3亞基的細胞內 信號傳導。
在一些實施方案中，所述抗體為DMC209或DMClll。
本發明還提供包含抗MUC1 c^3抗體的細胞。例如，該細胞可為 產生所述抗體的雜交瘤。該細胞還可以是在其表面帶有完整MUC1蛋 白的細胞，其中該MUC1蛋白結合(即附著)到抗MUC1 a/]3抗體。該 細月包還可以^皮重組修飾以表達本發明的抗體。
另一方面，本發明提供通過給予治療足夠量的本發明抗MUC1 a/j8 抗體而將免疫毒素靶向過表達MUC1的癌細胞的方法以及抑制或防止 過表達MUC1的癌細胞的生長的方法。
另一方面，本發明提供產生結合完整MUC1蛋白的MUC1特異抗 體的方法，包括以下步驟
i) 用包含o;亞基串聯重複的MUC1/TM抗原免疫能夠產生抗體的 個體一次或多次，所使用的抗原的量足以生成特異結合完整MUC1蛋 白的MUC1特異性抗體；以及
ii) 選擇結合MUC1/X抗原的抗體；
其中在MUC1 a亞基和i3亞基中的一個不存在時所述抗體不結合 另一個。
在所述方法的另一實施方案中，在用MUC1/TM抗原免疫後，可 以隨後使用亞型MUC1/X抗原免疫所述個體一次或多次。使用MUC1 抗原的免疫可任選地包括佐劑。
可將MUC1/TM和MUC1/X抗原獨立地以核酸或多肽的形式給予 所述個體。在一實施方案中，所述個體首先^皮編碼MUC1/TM抗原的 核酸(例如cDNA)免疫一次或多次，隨後糹皮編碼MUC1/X抗原的核酸 免疫一次或多次。
另一方面，本發明提供篩選結合完整MUC1蛋白的MUC1特異抗 體的方法，但須在a亞基和(8亞基中的一個不存在時所述抗體不結合 另一個，所述方法包括
i) 確定多種抗MUC1產生的抗體對切割的MUC1/X抗原和 MUC1/Y抗原的結合；以及
ii) 選擇特異結合MUC1/X抗原但不顯著結合MUC1/Y抗原的抗體。
在所述方法中產生或使用的抗體的實施方案與以上描述的相同。 在相關方面，本發明提供產生針對目的抗原的抗體的方法，包括 以下步驟
i) 以包含a亞基串聯重複的MUC1/TM抗原和所述目的抗原免疫 個體一次或多次；以及
ii) 用所述目的抗原免疫所述個體一次或多次；由此產生針對所述 目的抗原的抗體。
可將MUC1/TM抗原和所述目的抗原獨立地以核酸或多肽形式給 予所述個體。
在一些實施方案中，將MUC1/TM抗原和目的抗原一起給予。在
一些實施方案中，MUC1/TM抗原和目的抗原通過化學接頭連接。在 一些實施方案中，MUC1/TM抗原和目的抗原作為融合蛋白^皮給予。
所述目的抗原可以是任何抗原性多肽序列或任何編碼抗原性多肽 序列的核酸。目的抗原可以是但不限於人、哺乳動物、動物、植物、 細菌、病毒或合成的。目的抗原可以是腫瘤相關抗原(例如癌胚抗原 (CEA)、糖抗原(CA-125)、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、黑素瘤抗原 (MAGE,MART)。目的抗原可以是感染性疾病相關抗原。
定義
除非本文另有定義，本文使用的所有科技術語都具有本發明所屬 領域普通技術人員通常理解的含義。例如，Co""'se Z)/c"0"a7 o/ 歷o附e&c/"e am/Afo/ecM/ar5/o/ogy (簡明生物醫學和分子生物學詞典)， Juo, Pei-Show， 2nd ed.， 2002， CRC Press; T7ie D/WowaAj 。/Ce〃朋d Mo/ect//w歷o/ogy (細胞和分子生物學詞典)，3rd ed., 1999, Academic Press; k乂及Q^/brt/ ￡)z'c"( w<2A7 Qf 5/ocAe附&,/^爿"^ A/b/ecw/flr (牛津生物化學和分子生物學詞典)，修訂版，2000, Oxford University Press為技術人員提供了用在本發明中的很多術語的通用詞典。
在本文中，提及胺基酸時可使用它們通常已知的三字母符號或使 用IUPAC-IUB生物化學命名法委員會推薦的單字母符號。同樣地，提 及核脊酸時可使用它們的通常接受的單字母代碼。出於本發明的目的， 一些術i吾定義如下。
術語"特異結合，，或"附著"指，與缺乏特定靶表位的細胞或組 織相比，抗-MUCl a/j(3抗體在整體上或部分地優先與帶有這種靶表位 (例如MUC1 a^3連接處)的細胞或組織締合。顯然，應意識到，在抗體 和非靶表位之間可發生某種程度的非特異性結合。然而，特異結合的 區別可在於通過對耙表位的特異識別而介導。通常，與結合的抗體和 缺乏靶表位的實體(例如，測定孔或細胞)之間的締合相比，特異結合 導致遞送的分子和帶有靶表位的實體(例如，測定孔或細胞)之間強得 多的締合。與缺乏靶表位的細胞或組織相比，特異結合一般導致結合 帶有耙表位的細胞或組織的抗MUC1 c^8抗體的量增加約10倍以上，
並最優選增加IOO倍以上(每單位時間)。兩實體之間的特異結合通常 意味著至少1(^M"的親和力。優選大於18M"的親和力。可採用本 領域中已知的任何抗體結合測定法來確定特異結合，包括Western印 跡、ELISA、流式細力包計量法和免疫組織化學。
用語"基本上不結合"指不超過約10-15%的特異結合靶表位的抗 MUC1 o/|8抗體結合到特定的非靶表位。抗體與缺乏靶表位的實體的 "基本上不結合"比該抗體對帶有該耙表位的相同實體的結合低約10 倍，優選低約100倍。
術語"Mucr或"粘蛋白r指這樣的多態變體、等位基因、突
變體和種間同源物，其(l)與天然MUC1蛋白在約25個胺基酸的區 段上，任選地在約50, 100, 150， 200, 250個胺基酸的區段上具有約85%, 90%, 95%， 96%, 97%， 98%, 99%的胺基酸序列一致性，所述天然MUC1 蛋白例如包括GenBank登錄號NP_002447 (MUC1粘蛋白亞型1)、 NP_001018016 (MUC1粘蛋白亞型2)、 NP_001018017 (MUC1粘蛋白 亞型3)、或NP_001018021 (MUC1粘蛋白亞型4)、亞型MUC1/TM、 亞型MUC1/X、亞型MUC1/Y; (2)特異結合針對包含天然MUC1蛋 白的胺基酸序列(包括糖基化的胺基酸序列)的免疫原和其保守修飾變 體而產生的抗體；或(3)與天然MUC1核酸序列在約25個核酸的區段 上，任選地在約50, 100, 150， 200, 250, 500個核酸的區段上有約85%， 90%， 95%, 96%， 97%， 98%, 99%的核酸序列一致性，所述天然MUC1 核酸序列例如包括GenBank登錄號NM—002456 (MUC1轉錄變體1)、 NM_001018016 (MUC1轉錄變體2)、 NM_001018017 (MUC1轉錄變體 3)、或NM_001018021 (MUC1轉錄變體4)、變體MUC1/TM、變體 MUC1/X、變體MUC1/Y。
MUC1為細胞表面和/或血清腫瘤標誌物糖蛋白，其特徵在於重複 結構域和密集的O糖基化(Baldus， & a/., Oz7及ev C//w (2004) 41:189; Karsten， e"/.， (2005) 26:217)。 MUC1表達在大多數單純上皮 細胞的腔面，並且在多種上皮惡性肺瘤的癌細胞上過表達，包括乳腺 癌、前列腺癌、卵巢癌和胰腺癌以及惡性漿細胞(例如，多發性骨髓瘤) (參見Taylor-Papadimitriou, W a/" / Mam加a^ G7awd 5z'o/ iYeop/aw'a
(2002) 7:209; Denda國Nagai and Irimura， G/戸—J (2000) 17:649)。 MUC1由可溶的a亞基和錨定於細胞的iS亞基構成。MUC1結合細胞 間粘附分子-1 (ICAM-1)、介導細胞-細胞粘附(Baldus, Wa/.，同上以及 Rahn, & a/., J歷o/ CAem (2004) 279:29386)並作為信號分子的停靠蛋白 (docking protein)。 MUC1具有高度保守的胞質尾部，其在受MUC1磷 酸化緊密調節的過程中結合轉錄調節蛋白j8連環蛋白(參見Carraway, W a/.,醜/oessa[ys (2003) 25:66)。
本文中使用的術語"完整MUC1蛋白，，指已被切割為a亞基和j8 亞基的MUC1蛋白，每一亞基具有天然三維摺疊並且亞基間相互作用。 MUC1亞型MUC1/TM和MUC1/X可為完整MUC1蛋白。
"MUC 1/X"亞型在a亞基中缺乏抗原性串聯重複排列並且在SEA 組件中被切割為截短的a亞基和j3亞基(參見Levitin， W a/.,同上)。
"MUC1/Y"亞型在a亞基中缺乏抗原性串聯重複排列並且沒有 在SEA組件中被切割(參見Levitin, " a/.，同上)。
術語"生理條件"指具有使得目的細胞能夠維持生存或生長的條 件(例如溫度、pH和滲透壓)的細胞外環境。
術語"抗體"指通過在體外或體內產生體液應答而獲得的免疫球 蛋白分子，包括多克隆抗體和單克隆抗體。該術語還包括遺傳上改變 的形式，例如嵌合抗體(例如人源化的鼠抗體)、雜偶聯抗體(例如雙特 異性抗體)以及重組單鏈Fv片段(scFv)。術語"抗體，，還包括抗原結合 形式的抗體片段(例如Fab, F(ab)2， VH-VL Fab片段)。
術語"人源化抗體"指包含非人胺基酸序列但其恆定區已被改變 以減少在人體內免疫原性的抗體。
術語"人抗體，，指由人免疫球蛋白基因產生的抗體。可體內產生 人抗體，例如在人中，或通過具有功能性人免疫球蛋白基因的非人動 物(例如小鼠、倉鼠、兔、奶牛)產生。這類轉基因動物在現有技術中 是已知的。例如參見Lonberg, 5fo^c/i (2005) 23:1117; Robl， a a/.， 7Tzmog譜/ogy， (2003) 59: 107;以及Ishida, " a/., Cloning Stem Cells (2002) 4:91。從轉基因小鼠生產全人抗體的公司包括Medarex, Milpitas， CA和Abgenix(現在為Amgen)， Fremont, CA。可體外產生人抗體，例 如從人免疫球蛋白基因的組合文庫。
術語"細胞外"指從包圍細胞的脂雙層向外延伸的區域。
術語"抗原"指能夠特異結合抗體的任何分子。可誘導抗原產生
的抗原稱為"免疫原，，。參見Janeway， & a/., /mmwwo6/o/ogy, 5th Edition, 2001， GarlandPublishing。出於本發明的目的，抗原可為多肽或編碼抗 原性多肽的核酸(例如cDNA)。
術語"表位，，或"抗原決定基"指抗原上的B和/或T細胞所應答 的位點。B細胞表位可從鄰接胺基酸或從通過蛋白的三級摺疊而並置 的非鄰接胺基酸形成。從鄰接胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶 劑時被保留，而通過三級摺疊形成的表位(例如構象決定的)通常在用 變性溶劑處理時丟失。表位通常包括獨特空間構象中的至少3個氨基 酸，更常見地，至少5個或8-10個胺基酸。確定表位空間構象的方法 例如包括x射線晶體學和2維核/磁共振。例如參見￡^7o/7e Map;^wg 屍rofoco/s z'w MeAocfe z. Mo/eoz/ar歷o/ogy， Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)。可在顯示一種抗體阻斷另一種抗體與靶抗原結合的簡單免疫 測定(例如竟爭ELISA或固相放射免疫測定(SPRIA))中鑑定識別相同 表位的抗體。對於CD8細胞，T細胞識別約9個胺基酸的連續表位， 或者對於CD4細胞，T細胞識別約13-15個胺基酸的連續表位。可通 過測量抗原依賴性增殖的體外測定來鑑定識別該表位的T細胞，該抗 原依賴性增殖例如通過測定致敏T細胞響應表位而摻入的311-胸腺嘧 啶核苷(Burke " a/.，丄/"/ 170, 1110-19 (1994))、通過測定抗原依 賴的殺傷(細胞毒性T淋巴細胞測定，Tigges " a/., J. Immunol. (1996) 156:3901-3910)或通過測定細胞因子分泌而確定。
附圖筒要說明


圖1顯示MUC1蛋白亞型或MUC1融合蛋白。含有串聯重複排列 的切割的跨膜MUC1蛋白(MUC 1/TM)顯示在左側。選擇性剪接利用 由S.D.—表示的剪接供體，導致形成MUC1/Y和MUC 1/X亞型的兩 種選擇性剪接受體(S.A.Y—和S.A.X—)之一。如在本文中所描述的， 抗體DMC209識別存在於MUC1/X和MUC1/TM蛋白中的切割的c^S
連接處，但是不與未切割的MUC1/Y蛋白反應。
圖2顯示MUC1 /TM 、 MUC1 /X和MUC1 /Y亞型的序列。MUC1 /TM 核苷酸(SEQ ID NO:l)和胺基酸(SEQ ID NO:2)編號分別顯示在序列的 左側和右側。信號肽切割發生在甘氨酸23和絲氨酸24之間，由向上 的紅箭頭表示。N30序列橫跨SGHAS至EKNA。為了清楚，所剪接 出的包含串聯重複排列的中間區及其兩翼序列被刪除，並用虛線表示。 對MUC1/TM的切割發生在甘氨酸357和絲氨酸358之間(在MUC1/X 胺基酸編號62和63之間)並用向上的紅箭頭表示。在核苷酸217處 (gtgag)顯示產生MUC1/X和MUC1/Y的剪接供體位點，產生MUC1/X 和MUC1/Y的剪接受體位點分別位於核苷酸942處(ccccag)和996處 (ctccag)。緊接MUC1/X剪接受體位點C末端的MUC1/X胺基酸以斜 體的1 (以LSTG開始)至120 (SGAG)編號，編號為120的胺基酸緊接 跨膜結構域的N末端。以SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO:4分別表示 MUC1/X的核酸和胺基酸序列。以SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO:6分 別表示MUC1/Y的核酸和胺基酸序列。參見上述Levitin， " a/.。
圖3表示用編碼MUC1/TM或MUC1/X的DNA免疫的小鼠中產 生的抗-MUCl/X抗體。用含有編碼MUC1/TM蛋白(組II)的cDNA或 編碼其中串聯重複被刪除的MUC1/X蛋白(組I，參見圖l)的cDNA的 表達載體免疫小鼠。如實施例中所述，測定血清中針對切割的MUC1/X 蛋白的抗體滴度。所有的組II的小鼠都顯現顯著的抗MUC1/X抗體滴 度，但在組I的小鼠中沒有檢測到抗MUC1/X抗體(A和B)。
圖4顯示在用MUCl/TMcDNA致敏接著用單次MUCl/X蛋白加 強後的小鼠中抗MUC1/X滴度。使用單次MUC1/X蛋白免疫加強之前 用MUC1/TM cDNA免疫致敏的組II的小鼠(見圖2)。如實施例中所述， 在蛋白加強後的18或32天(分別為粉紅色和綠色線)測定血清中抗 MUC1/X反應性。給出了各只小鼠的滴度。
圖5顯示對DMC209和DMC111單克隆抗體識別的表位的詳細分 析。如實施例中所描述的，測定野生型MUC 1/X和MUC1/Y蛋白(A
對DMC209和DMC111抗體的反應性。
圖6顯示DMC209流式細胞計量法分析表達MUC1/TM的細胞。 如實施例中所述，使親本的未轉染的小鼠乳腺肺瘤細胞或經編碼全長 MUC1/TM或其細胞質尾部^皮截去的MUC1/TM的cDNA轉染的細胞 與DMC209反應並用流式細胞計量法分析。類似地，在與DMC209 孵育後分析卵巢癌細胞系HEY和乳腺癌細胞系T47D和MDA231。紅 色和紫色的記錄線分別代表細胞與單獨的經螢光標記的第二抗體或先 與第一 DMC209抗體然後與第二抗體的反應。
圖7顯示流式細胞計量法分析DMC209與從多發性骨髓瘤患者新 獲得的骨髓細胞的反應性。用DMC209和針對CD45、 CD138和CD38 的抗體同時分析骨髓抽吸物。用螢光染料分別標記所述抗體，每一種 以不同的發射波長發螢光。針對CD45 (Al)和DMC209 (A2)進行側向 散射分析。DMC209陽性細胞被指定為Rl， CD38陽性細胞對CD138 陽性細胞(A3)的作圖清楚地顯示DMC209陽性群(紅色標記的細胞)與 CD138陽性細胞一致。
詳細說明
引言
我們研究了由MUC1 a亞基和j8亞基構成的被切割的連接處藉以 形成的機制。在這些研究過程中，我們分析了 MUC1/TM, MUC1/Y和 MUC 1/X蛋白的"可切割性(cleavageability)"(圖1以及Levitin, " a/" / 5/o/ C/ie附，(2005) 280:33374，出於所有目的在此將其整體通過引用 併入本文)。MUC 1/Y和MUC1 /X亞型由在兩個不同位點剪接的mRNA 產生，這兩個位點利用了位於串聯重複排列的上遊和下遊的供體和受 體位點，結果在兩個亞型中串聯重複排列和兩翼序列均被剪接掉(圖1 以及Levitin, d a/.)。由此，MUC1/X和MUC1/Y的細胞外結構域明顯 地沒有大的含串聯重複排列的MUC1/TM蛋白複雜。實際上，在其細 胞外結構域，MUC1/X蛋白僅包含融合到MUC1 30 N末端胺基酸的 120個胺基酸的SEA組件。除了 SEA組件N末端的18個胺基酸的刪 除之外，MUC1/Y與MUC1/X完全相同。重要的是，MUC1/X亞型在 與全長MUC1/TM蛋白相同的位點被切割，由此導致相同的a亞基和 j8亞基非共價相互作用。相反，存在於MUC1/Y亞型中的SEA組件N 末端截短導致形成未切割的蛋白。
為了產生直接靶向癌細胞的抗體，我們推測對MUC1 c^8連接處 特異的抗體("抗MUC1 a/j8抗體(Abs)")將僅靶向膜結合的MUC1。 為了防止生成抗串聯重複排列的抗體，我們使用切割的MUC1/X蛋白 既作為免疫原和又作為篩選試劑。這裡我們公開了一種新的方法，首 先用MUC1/TM(例如DNA)致敏小鼠以引起抗MUC1/TM應答。所產 生的免疫應答含有與MUC1/X亞型反應的抗體。為了進一步增加抗 MUC1/X滴度，用MUC1/X (例如可溶蛋白)加強小鼠。這導致極高的 抗MUC1/X滴度。採用這種方案，我們成功地產生了不僅識別細胞表 面切割的MUC1 a/0連接處，還結合表達全長MUC1/TM的惡性細胞 的單克隆抗體。
因此，本發明提供結合細胞上完整MUC1蛋白的MUC1 a/)8連接 處的抗體，在此稱為"抗MUC1 c^j8 Abs"。該抗體同時結合由完整 MUC1蛋白的a亞基和j3亞基構成的構象上確定的表位。本發明部分 地基於這種令人意外的發現不含免疫原性的串聯重複區的MUC1亞 型MUC1/X有免疫原性，且能夠與全長MUC1亞型MUC1/TM類似地 淨皮切割(參見Levitin， " a/.,同上)。
抗體
抗原和免疫
本發明的抗MUC1 a/j8抗體針對完整MUCl蛋白的a/j8連接處。 通過首先用包含免疫原性的串聯重複序列("VNTR")(參見圖1和 Gendler, ef a/., J醜zo/ CAem (1990) 265:15286; Ligtenberg, & a/。， 7醜zo/ C/zem (1990) 265:5573;以及Wreschner， " a/"五wr /歷oc/^m (1990) 189:463)的MUC1 c^S亞基序歹'J(例如核酸或可溶蛋白)免疫能夠產生抗 體的個體一次或多次，所述序列例如MUC1/TM。任選地，可以通過 一次或多次針對截短的MUC1 亞基序列(例如核酸或可溶蛋白)的 後續免疫加強該個體，其中該截短的MUC1 c^8亞基序列缺失免疫原
性的串聯重複序列，但是保留了可切割的序列片段以切割成a和j8亞 基，例如亞型MUC1/X。參見圖1和Levitin， & a/., J歷o/ C7zew (2005) 280:33374,出於所有目的將其整體通過引用併入本文。
所述抗原通常被製備為可溶的MUC1多肽(即，其缺乏跨膜序列) 或編碼MUC1多肽序列(有或沒有跨膜序列)的核酸。所述抗原，DNA 或蛋白，可從表達或過表達MUC1的細胞分離，或從被修飾為重組表 達MUC1抗原的細胞分離，該細胞例如本領域中公知的細菌、酵母或 哺乳動物細胞表達系統。重組表達的MUC1抗原可方便地具有任選可 去除的純化和/或檢測標籤，包括但不限於FLAG (DYKDDDDK)、連 續組氨酸、免疫球蛋白恆定區(Fc)等。參見Levitin, "a/.，同上。
在一實施方案中，抗MUC1 0^8抗體可通過用MUC1/TM cDNA 進行一次或多次初次免疫，並且用MUCl/XcDNA進行一次或多次二 次免疫或加強免疫而產生。在一實施方案中，抗MUC1 a/j8抗體可通 過用MUC1/TM cDNA進行一次或多次初次免疫，並且用可溶MUC1/X 蛋白進行一次或多次二次免疫或加強免疫而產生。
通常以至少2, 3, 4， 5， 6, 7， 8周的間隔或^L情況以3， 4， 5， 6個月的 間隔對個體進行重複免疫。可以等間隔地給予重複免疫，但不是必須
的。如果需要，可以1,2， 3,4,5次或更多次地給予接受重複免疫的個 體初級抗原(例如MUCl/TM)和/或次級抗原(例如MUC1/X)。
通過選擇同時結合MUC1/X亞型的MUC1 a和jS亞基的抗體來鑑 定抗MUC1 0^3抗體，其中MUC1/X亞型優選為淨皮切割的MUC1/X亞 型。優選的抗體不結合不可切割的MUC1/Y亞型或單獨的a亞基或/3 亞基。
抗體的產生
抗MUC1 a^抗體可為多克隆的、單克隆的、Fab片段(缺失恆定 Fc區)或重組單鏈Fv抗體。本領域技術人員已知產生多克隆和單克隆 抗體的方法。 <列^口參見Coligan， & a/., Ci/zrewf屍ro,oco/s / /mm"wo/ogy (現代免疫學方法)，1991-2006, John Wiley & Sons;以及Harlow and
Lane (1989)爿w"力o&es:爿Za6ora,oo^ Ma"wa/ (抗體實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Press, N. Y.; Harlow and Lane (1998) C/57."g JwZ/Z>od/es.. ^4 丄WomMo7 Ma"w/ (使用抗體實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Press, N.Y.; Stites et al. (eds.) 5awc awe C7zmca/ /mmtmo/ogy (4th ed.)(基石出和 臨床免疫學，第四版)Lange Medical Publications, Los Altos， Calif,以 及其中引用的參考文獻；Goding (1986) Mo薩/麵/顛'fto^fe.. iV/"c*/es朋d(單克隆抗體原理和實踐)(2d ed.) Academic Press, New York, N. Y.;以及Kohler and Milstein (1975) A^m/re 256: 495-497;參見Huse " a/. (1989) Science 246: 1275-1281; Ward, " a/. (1989) Mz^/re 341: 544-546. Birch and Lennox, M woc/o冊/ ^w"'6o^es: 屍n'""》/es awd (單克隆4元體原理和應用)，Wiley-Liss， New
York, N.Y. (1995)。可以在能夠產生抗體的諸如哺乳動物或鳥類的任何 便利的動物中誘導抗MUC1 os/j8抗體和產生抗MUCl c^3抗體的B細 胞。例如，可以方便地在綿羊或山羊(羊)或齧齒動物(兔形目、家鼠屬、 倉鼠、鼠科動物)或雞(原雞屬)中產生抗MUClo/j8抗體。
其它適合的製備抗體的技術包括在噬菌體載體和包括病毒、細菌 和酵母載體的其它載體中選擇包括人免疫球蛋白基因在內的重組免疫
球蛋白基因文庫。通過使用載體展示(例如噬菌體)方法在載體表面表 達例如重組單鏈Fv (scFv)片段或VH-VL Fab片段可快速分離針對 MUC1 a/j8連接處的高親和抗體。簡言之，編碼載體表面蛋白的基因被 改變，以便能夠插入抗體基因，該抗體基因在帶有該基因的栽體表面 作為融合蛋白表達。可以選擇性富集表達所需抗體的載體並藉助其與 MUClo/i3亞基的連接處的親和力/親和性而將其分離。編碼抗體的 DNA被包裝在相同載體中，這使得能夠分離編碼該抗體的基因。多種 這樣的方法在文獻中已有詳細討論並且為技術人員所熟知。例如參見 Winter W a/" v4www.7mmwwo/. 12:433-455 (1994); Marks et a/"丄 Mo/.醜zo/. 222:581-597 (1991); Vaughan & a/.， A^/t/re 5zo&c/mo/ogy 14:309-314 (1996), Hallborn and Carlsson,腸欣/mz々諮，(2002) Suppl:30-7，美國專利第4,642,334號、第4,816,397號、第4,816,567 號、第4,704,692號；WO 86/01533; WO 88/09344; WO 89/00999; WO90/02809; WO 90/04036; EP 0 324 162;以及EP 0 239 400。
優選地，將抗體構建為在宿主中的免疫原性最小化，例如通過使 抗體中存在的自體(自身)序列的數量最大化。因而，具有非異種可變
區的嵌合抗體為優選的。尤其優選使用異種部分被去除或基本上限於 互補決定區的抗體(即"人源化抗體")。
抗體結合測定
可以使用本領域中7>知的技術來確定抗體與完整MUC1蛋白的結 合，所述技術例如ELISA測定、流式細胞計量測定或免疫組化測定。 在進行結合測定時，可將檢驗測定與陽性對照和/或陰性對照進行比 較。
ELISA
關於ELISA測定，可用缺失免疫原性的串聯重複區的可溶MUC1 a/j3亞基蛋白抗原(例如缺失跨膜區的亞型MUC1/X或MUC1/Y)包被 ELISA板。優選地，截短的MUClo/j8亞基蛋白抗原可被切割為截短 的a亞基和/3亞基的細胞外區域(例如亞型MUC1/X)。在包被前，可 以將包被用蛋白抗原切割為a亞基和(3亞基，但不是必須在包被前切 割。蛋白抗原可直接包被在ELISA板上或結合到直接包被在板上的免 疫球蛋白層上。例如，與免疫球蛋白恆定區(Fc)融合的可溶亞型 MUC 1/X和/或MUC 1/Y可以結合到直接包被ELISA板的抗Fc抗體上。 然後，所結合的蛋白抗原可暴露於測試抗體。
目的抗體特異結合亞型MUC1/X和/或MUC1/Y，但是不結合a 亞基免疫原性的串聯重複區、單獨的a亞基或單獨的j3亞基。優選地， 該抗體特異結合MUC1/X,但不結合MUC1/Y。優選地，該抗體特異 結合切割的亞型MUC1/X和切割的亞型MUC1/TM。
ELISA測定糹支術為本領域公知。指導實施ELISA測定的教材例如 包括77^衞a Gm/赫ooA (Elisa指南)，by J. R. Crowther (Editor), Humana Pr (2000年8月)；Delves,々/7//ca"0肌. recAm々m&s (#元體應用關鍵技術)，John Wiley & Sons (1995); Crowther,
五fc『77^o^ 屍rac"ce (Elisa:理論與實踐)，Human Pr (1995); Harlow and Lane, L(s7'"g ^w"力oJ/es: j丄a60ra,07 Maw認/ (使用抗體實 驗室手冊)，Cold Spring Harbor Press (1998);以及Coligan, & a/., O^rew/ iVotoco/s & /mm固o/ogy (免疫學的當前實驗方案)，1991-2006， John Wiley & Sons。
ELISA技術很適合高通量方法，無論是直接標記測試抗體還是標 記次級抗體。被標記的抗體可被酶部分、化學發光部分、螢光部分或 任何其它本領域已知的方便檢測的標籤標記。用於進行高通量ELISA 的產品可商購，例如從Panomics, Redwood City， CA; Sigma-Aldrich， St. Louis, MO和BioMedTech Laboratories, Tampa， FL購得。自動化的高 通量系統也可商購，例如從Caliper Life Sciences, Hopkinton， MA和 BMG Labtech, Durham, NC購得。
流式細力包計量法
還可以使用流式細胞計量法檢測抗體與完整MUC1蛋白的結合。 可以將在其細胞外表面表達MUC1亞型(例如MUC1/TM, MUC1/X， MUC1/Y)的完整細胞，無論天然產生的還是重組修飾的，暴露於抗 MUClo/j3抗體。細胞可以是存活的或被固定的。可通過例如用螢光團 直接標記測試抗體或次級抗體來確定結合。使用流式細胞計量法的優 點在於表達在細胞表面的MUC1抗原為體內MUC1細胞表面抗原的典 型三維構象。目的抗體特異結合亞型MUC1/TM和MUC1/X的a和j3 亞基，並且優選不結合亞型MUC1/Y。流式細胞計量法也很適於高通 量方法。用於高通量流式細胞計量分析的產品和系統可商購，例如從 BD Biosciences, San Jose CA和San Diego, CA; Beckman Coulter, Fullerton, CA; Partec, Mtinster, Germany;以及Amnis Corp., Seattle, WA購得。
流式細胞計量技術為本領域公知。指導實施流式細胞計量法的教 材例如包括Ormerod, F/ow C^ome^y (流式細月包計量法)，Taylor & Francis (1999);Cj^ome^y iVo/oco/s (流式細月包計量法l喿作), Hawley and Hawley (Eds.) Humana Press (2004);以及F/cw C,me^y/" C/z'm'ca/ Z^agwo^(臨床i貪斷中的流式細胞計量法)，Keren， & a/., (Eds.)， ASCP Press (2001)。
免疫組化
還可以採用本領域公知的免疫組化技術檢測抗體與完整MUC1蛋 白的結合。例i口參見Hayat， //awd6ooA; Q/"7m附MWoA/j^oc/ze附/s,^y
Co/orecZa/ Cfl/r/"oma，爿"d屍roWa^ Carcz"o附fl (人類月中瘤的免疫糹JU匕 和原位雜交手冊分子病理學，結腸直腸癌和前列腺癌)，Academic Pr (2004); Hayat, //wwi/woA/Woc/ie/w/s^v iS"t/ /^y6nV//za"ow o///w附aw
Cflm.wom肌.Mo/ecw/flr Gew"/cs朋d 5mwZ Cara'womos (人類腫 瘤的免疫組化和原位雜交手冊分子遺傳學，肺癌和乳腺癌)，Academic Pr (2004);以及Dabbs， Z)/ag"oW/c 7mmwwo/h.WocAem&^y (i貪斷用免疫 組化)，Elsevier Science Health Science (2001)。可將諸如乳腺、卵巢、 前列腺、胰腺、結腸組織等已知表達或過表達MUC1抗原的組織的上 皮切片暴露於抗MUC1 a/j3抗體。該抗體可被直接標記，例如使用酶 部分、化學發光部分、螢光部分。可用顯微鏡技術檢測結合的抗體。
鑑定抗MUC1 a/j8抗體的試-驗
本發明的抗MUC1 a/jS抗體結合MUCl a和jS亞基的連接處，而 不結合單獨的a亞基或)3亞基。這可通過例如進行如上所述的比較 ELISA測定來測量。可用具有a和j8亞基的可溶MUCl蛋白抗原(例 如，MUC1/TM, MUC1/X或MUC1/Y)、單獨的MUC1 a亞基和單獨的 可溶(即缺失跨膜序列)MUC1 j8亞基包被ELISA板孔，然後暴露於抗 MUClas/i8抗體。目的抗體將會特異結合具有ce和jS亞基的MUCl蛋 白抗原，但基本不結合單獨的MUC1 a亞基或單獨的MUC1 /3亞基。 或者，也可4吏用Western印跡來測量。Western印跡為本領域7>知。參 見Coligan, W 同上，以及Harlow and Lane， 1989和1998，同上。
優選地，本發明的抗MUC1 0//3抗體結合亞型MUC1/TM和 MUC1/X，但是基本不結合亞型MUC1/Y。不^皮理論所束縛，據信切
割的MUC1/X反應了細胞表面上MUC1蛋白的MUC1 a和0亞基的 三維連接處。這可通過例如進4於如上所述的比較ELISA測定或比豐支流 式細胞計量測定來測量。在示例性的ELISA測定中，使被抗Fc抗體 包被的ELISA板結合MUC1/TM-Fc (即具有全長a亞基的可溶MUCl ) 或MUC 1/X-Fc以及MUC 1/Y-Fc融合蛋白，然後暴露於抗MUC1 c^j3 抗體。目的抗體特異結合具有結合的MUCl/X-Fc融合蛋白或結合的 MUCl/TM-Fc融合蛋白的孔，但基本不結合具有結合的MUC 1/Y-Fc 融合蛋白的孔。參見下文實施例1。或者，這可在比較流式細胞計量 測定中測量，其中採用在細胞外表面天然或重組表達一種MUC1亞型 的細胞。目的抗體將特異結合表達MUC1/TM或MUC1/X的細胞，但 基本不結合表達MUC1/Y的細胞。
使用抗MUC1 /<3抗體的方法
i貪斷和預後方法
所述抗MUC1 Q/j8抗體可用在診斷過表達MUCl的組織的癌症或 為其提供預後的方法中。通常，該組織為上皮組織，但也可來自血液， 例如漿細胞(即，B淋巴細胞i普系的，例如參見Chapter 98 of i/a 7l50" ，s o//"^nm/ Me^'"'"e (Harrison內科學原理的第98章)，16th Ed., 2005， McGraw-Hill)。這些診斷和預後方法尤其可用於鑑定來自乳 腺、卵巢、前列腺、胰腺、結腸、漿細胞和其它組織的過表達MUC1 的癌症。與來自經證實的正常(即未轉化的，非癌的)組織的相同類型 組織或細胞相比，過表達MUC1的組織或細胞具有至少約20%, 50%， 80%， 1倍，2倍，3倍，4倍或更多可檢測的MUC1。使用如上所述的流 式細胞計量測定和/或免疫組化方法可以方便地進行所述診斷和預後 方法。
癌症免疫治療方法
因為MUC1蛋白在很多癌症中以及多發性骨髓瘤的漿細胞上表達 或過表達，所以其為癌症免疫療法的靶點，其中所述癌症包括但不限 於上皮和笨細胞骨髓瘤，包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、 結腸癌。
因此，本發明提供可全身使用的抗MUC1 a/j8抗體以治療包括乳 腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、結腸癌和漿細胞骨髓瘤癌在內的 癌症。抗MUC1 Q^8抗體還可用於治療多種其它良性和惡性腫瘤。由 此，本發明提供治療易感於或患有表達或過表達MUC1抗原的癌症的 患者的方法，包括向所述患者給予治療有效量的特異結合MUC1 亞基連接處的抗體。在另一方法中，本發明提供抑制表達或過表達 MUC1抗原的腫瘤細胞生長的方法，包括以有效抑制該腫瘤細胞生長 的量對患者給予特異結合MUC1 a^j8亞基連接處的抗體。抗MUC1 c^j8
方法中，包括使有效抑制該細胞的生長或殺傷該細胞的量的抗MUC1 0^/3抗體免疫偶聯物或免疫毒素與該細胞反應。
例如，可將未偶聯的抗MUC1 c^8抗體(包括單克隆的、多克隆的、 嵌合的、人源化的、全長人抗體及其片段(例如重組蛋白))引入患者， 以便該抗體結合癌細胞上的完整MUC1蛋白並介導這類細胞和腫瘤的 生長抑制(包括其破壞)，其中的機制可包括補體介導的細胞溶解、抗 體依賴的細胞毒性、改變MUC1的生理功能和/或抑制配體結合或信號 轉導通路。除了未偶聯的抗MUC1 a/(3抗體、其片段和本發明的重組 蛋白之外，與包括放射性同位素、蓖麻毒素和/或假單胞菌屬毒素在內 的毒性試劑偶聯的抗MUC1 a/j8抗體還可被用於治療性地遞送該毒性 試劑至帶有MUC1的腫瘤細胞並由此殺滅腫瘤。
採用抗MUC1 a^抗體的癌症免疫療法可按照由多種成功用於若 幹類型癌症的方法所形成的教導進行，這些癌症包括但不限於結腸癌 (Arlenetal.， 1998, Cn7及ev/m/m/"o/ 18: 133-138)、多發性骨髓瘤(Ozaki et al., 1997， 90: 3179-3186; Tsunenari et al., 1997, 90:
2437-2444)、胃癌(Kasprzyk et al.， 1992， Cawcw及es 52: 2771-2776)、 B 細胞淋巴瘤(Funakoshi et al" 1996， / 7m細wZAer五附/^肌's Z"謂or /附附wwo/19: 93-101)、白血病(Zhong et al., 1996,丄ed及es 20: 581-589)、 結直腸癌(Moun et al" 1994, C匿er及es 54: 6160-6166); Velders et al" 1995, Cawcer 55: 4398- 4403)以及乳腺癌(Shepard et al., 1991, / C/z7i/附m回o/ 11: 117-127)。針對癌症的免疫毒素療法的更多實例綜述 在侈寸^口 Wong, W a/., Sew/w (9wco/ (2005) 32:591; Chen， & a/.,五x; eW O一 i>wg i)e"v (2005) 2:873j以及Li， " a/" Ce〃 Mo/ 7mm謹/ (2005) 2:106中。
例如， 一種臨床上施用抗MUC1 Q/j8抗體的方式為將它們以未修 飾的形式給藥，使用在體外和/或動物模型(例如參見Hellstrom " a/.， Va" v4aw/. 82:1499-1502 (1985))中顯示抗腫瘤活性(例
如ADCC和CDC活性)和/或內化能力(internalizing ability)的單克隆抗 MUClc^j8抗體。為了檢測ADCC和CDC活性，可以測試單克隆抗體 在4小時的孵育期間溶解培養的"Cr標記的腫瘤靶細胞的能力。靶細 胞被51Cr標記，然後暴露在效應細胞(以使用淋巴細胞分離介質純化的 人淋巴細胞的形式)和抗體的組合中4小時，其中抗體以例如0.1 /tg/ml 至lOpg/ml的濃度加入。測量從靶細胞釋放的51Cr，作為腫瘤細胞溶 解(細胞毒性)的證據。對照包括僅孵育靶細胞或分別與淋巴細胞或單 克隆抗體一起孵育。測量可釋放的51Cr的總量，ADCC被計算為採用 單克隆抗體加上效應細胞時觀察到的殺死的靶細胞相對於單獨孵育的 靶細胞的百分比。除了加入用作補體源的人血清(1:3至l:6稀釋)替代 效應細胞外，用於CDC的方法與用於檢測ADCC的方法相同。
在實施本發明方法時，將能夠抑制在細胞表面表達或過表達 MUC1的腫瘤細胞生長的抗MUC1 c^8抗體以治療有效量給予其腫瘤 表達或過表達MUC1的癌症患者。本發明的抗體治療方法也可以與化 療、；改射和/或其它治療方法聯合。
可用於治療癌症的抗MUC1 c^j8抗體包括能夠引起針對腫瘤的有 效免疫應答的抗體和具有直接細胞毒性的抗體。這方面，抗MUCla//3 抗體可通過補體介導的或抗體依賴的細胞毒性(ADCC)機制引起腫瘤 細胞溶解，其中這二者都需要免疫球蛋白分子的完整Fc部分，用於與 效應細胞Fc受體位點或補體蛋白相互作用。此外，直接對腫瘤生長施 加生物學作用的抗MUC1 a/iS抗體也可用在本發明的實踐中。這類抗 體可以不需要完整的免疫球蛋白來發揮作用。這類直接細胞毒性抗體 起作用的可能機制包括抑制細胞生長、調節細胞分化、調節腫瘤血管 生成因子全貌和誘導細胞凋亡。可使用任意種本領域已知的用來確定
ADCC、 ADMMC、補體介導的細胞溶解的體外測定法來評估特定抗 MUC1 a/j8抗體施加抗腫瘤作用的機制。例如參見CM^reW 7Votoco/ 7mmwwo/ogy ， 同上。
優選採用適合的動物模型在體內評估特定抗MUC1 /|3抗體或抗 MUC1 a/j(3抗體組合的抗腫瘤活性。將人癌移植物或傳代的異種移植物 組織引入免疫低下動物(如棵小鼠或SCID小鼠)的異種癌症模型是尤 其適合且公知的。例如，在Klein et al.， 1997, A^仏re AfW/c/"e 3: 402-408 以及1998年4月23日公開的PCT專利申請WO 98/16628， Sawyers " a/.中描述了人前列腺癌的異種移植物模型(能夠概括原發性腫瘤的發 展、微轉移和晚期疾病特徵性的成骨細胞轉移的形成)。本文提供的實 例詳述了在體內評估抗MUC1 a/j8抗體製劑的抗腫瘤潛力的實驗方法。 設想了其它的體內測定，例如測量已建立腫瘤的退化、妨礙轉移的進 展等等。
值得注意的是，使用鼠科或其它非人和嵌合(單克隆的)抗體可能 在一些患者中誘導中度至強烈的免疫應答。在最嚴重的病例中，這種 免疫應答可能導致廣泛形成免疫複合物，其可能引起腎衰。因此，用 在本發明治療方法實踐中的優選的(單克隆的)抗體為全長人或人源化 的並且以高親和力特異結合完整MUC1抗原靶但在患者中顯示低或無 抗原性的抗體。
本發明的方法涉及給予單一的抗MUC1 a^抗體，以及給予不同 的諸如識別不同表位的單個(單克隆的)抗體的組合或"混合物 (cocktails)"。這類抗體混合物可能具有某些優勢，因為它們含有結合 不同表位和/或利用不同效應機制的抗體或將直接細胞毒性抗體與依 賴於免疫效應功能的抗體聯合。這種抗體聯合可能顯示協同治療作用。 此外，抗MUC1 a/j3抗體的給藥可與其它治療劑聯合，這些治療劑包 括但不限於各種化療劑、雄激素阻斷劑、免疫調節劑(例如IL-2, GM-CSF)、其它治療性抗體(例如針對MUC1上其它表位、針對除 MUC1之外的腫瘤相關抗原、針對其它治療上有用的表位)、以及針對 感染性和其它疾病的試劑。抗MUC1 0//3抗體能以"棵的"或非偶聯 形式給藥，或者可以在其上偶聯有治療劑。
用在本發明方法實踐中的抗MUC1 a^8抗體可^皮組方為藥物組合 物，該藥物組合物包含用於所希望的遞送方法的生理上相容的載體。 適合的載體包括當與抗MUC1 a/i8抗體組合時保留該抗體的抗腫瘤功 能並且與個體的免疫系統無反應性的任何物質。實例包括但不限於多 種標準藥物載體中的任意一種，例如無菌磷酸鹽緩衝鹽水溶液、抑菌 7jc等(通常參見及em/"g/ow: <Sc/ewce awd /Vac"ce o/ /^armac;; (Remington:藥劑科學與實踐)，Gennaro (Editor) Lippincott Williams & Wilkins (2003))。
可通過任何能夠將該抗體遞送到腫瘤位點的途徑給予抗MUC1 a/j8抗體製劑。可能有效的給藥途徑包括但不限於靜脈內、腹膜內、肌 內、腫瘤內、真皮內給藥等等。優選的給藥途徑為靜脈內注射。優選 的用於靜脈內注射的製劑包含抗MUC1 a^抗體的保存的抑菌水、無 菌的未保存水的溶液和/或稀釋在含有0.9%無菌注射用氯化鈉(USP)的 聚氯乙烯或聚乙烯袋中的抗MUC1 a/j8抗體。該抗MUC1 a/j3抗體制 劑可被凍幹並作為無菌粉末保存，優選在真空下保存，然後在注射前 在含有例如千醇防腐劑的抑菌水或在無菌水中重建。
治療一般涉及通過可接受的諸如靜脈內注射(IV)的給藥途徑重複 給予有效劑量的抗MUC1 c^8抗體。劑量將取決於本領域技術人員通 常已知的多種因素，包括但不限於腫瘤的類型和嚴重性、等級或癌症 的階段、所用抗體的結合親和力和半衰期、患者中MUC1表達的程度、 循環的脫落MUC1 a亞基抗原的程度、所期望的穩態抗體濃度、治療 的頻率以及與本發明治療方法聯合使用的化療劑的影響。通常，日劑 量可以在約0.1 mg/kg至100mg/kg之間。儘管甚至更高的周劑量可以 是適合的和/或良好耐受的，但每周10-500 mg抗體範圍內的劑量能夠 有效並且良好耐受。確定合適劑量的主要決定因素為在特定情況下使 治療有效時所需的特定抗體的量。為了實現腫瘤抑制或消退，可以要 求重複給藥。起始負載劑量可以較高。起始負載劑量可以通過輸注給 藥。如果起始劑量被良好耐受，則可以類似地給予周期性的維持劑量。
直接給予抗MUC1 a^抗體也是可能的，並且在某些情況下可能 具有優勢。例如，對於治療卵巢癌，可將抗MUC1 a^抗體直接注射
進腹膜內空間。
連接生物活性組分與抗體
連接生物活性組分(例如細胞毒性部分)與抗體的方法隨該組分的 化學結構而變化。通常，抗體含有多種官能團，它們可用於與生物活 性分子上的適合官能團反應以將該試劑結合於其上。或者，可以衍生 抗體和/或生物活性組分以暴露或連接其它的反應性官能團。該衍生可
能涉及連接多種接頭分子中的任意一種，例如那些可從Pierce Chemical Company, Rockford 111得到的。用在此處的"接頭"指用於 共價或非共價地連接抗體和生物活性組分的分子。適合的接頭為本領 域技術人員所公知，包括但不限於直鏈或支鏈碳接頭、雜環碳接頭或 肽接頭。例如參見Birch and Lennox, Mowoc/o a/ y4w"6c^&y: /Vz'Mc^ /es aw J y4/7/ "ca"o"s (單克隆抗體原理和應用)，第4章，Wiley-Liss， New York, N. Y. (1995);美國專利第5,218,112號、第5,090,914號； Hermanson， 5/oco")wg她J"ecAm々Mes (生物偶聯技術)，Academic Press, San Diego， Calif. (1996)。
當兩種分子都為多肽時，所述接頭可以通過它們的側鏈基團連接 到成分胺基酸(例如通過二硫鍵至半胱氨酸)。雙功能接頭具有一個與 特定生物活性組分上的基團反應的官能團和另一個與抗體反應的基 團，可被用於形成所期望的偶聯物。在一些實施方案中，雙功能接頭 可用於連接兩種抗體，例如抗MUC1 os/j(3抗體和另一種抗體。或者， 衍生可能涉及對所述組分進行化學處理；例如，用高碘酸鹽造成糖蛋 白抗體的糖部分的甘醇斷裂以生成游離的醛基團。抗體上的該游離的 醛基團可以與試劑上的游離氨或肼基團反應以便結合該試劑。(參見美 國專利第4,671,958號)。在抗體或抗體片段上生成游離巰基的方法也 是已知的(參見美國專利第4,659,839號)。已知許多用於連接各種化合 物和諸如抗體的蛋白的方法和接頭分子，所述化合物包括放射性核素
金屬螯合物、毒素和藥物。例如參見第188,256號歐洲專利申請；美 國專利第4,671,958號、第4,659,839號、第4,414,148號、第4,699,784 號、第4,680,338號、第4,569,789號和第4,589,071號；以及Borlinghaus
et al。 Ca"cw Was. 47: 4071-4075 (1987))。化學接頭可以商購，例如從 Pierce Biotechnology, Rockford，獲得。
有時希望在其到達靶位點時釋放偶聯的分子。因此，可以使用包含 在耙位點附近可被切割的鍵的偶聯物。可以由酶活性或由該偶聯物所 處的乾細胞內或靶位點附近的條件促進切割該鍵以從抗體釋放生物活 性組分。當靶位點為肺瘤時，可使用在腫瘤位點處的條件(例如當暴露 於腫瘤相關酶或酸性pH時)下可被切割的接頭。順烏頭酸間隔物可用 於在內體(endosome)內釋放生物活性組分。類似地，二硫鍵可在內體 的還原性環境中斷裂。
本領域技術人員已知多種不同的可斷裂接頭。參見美國專利第 4,618,492號、第4，542，225號和第4,625,014號。用於從這些接頭基團 釋放試劑的機制例如包括照射光敏鍵和酸催化的水解。美國專利第 5,141,648號公開了包含具有特定化學結構的接頭的免疫偶聯物，其中 鍵在體內斷裂，由此釋放連接的化合物(放射治療劑、藥物、毒素等)。 該接頭易於在溫和酸性pH時斷裂，並被認為在向靶細胞的細胞質中 轉運期間斷裂，由此在靶細胞內釋放生物活性化合物。美國專利第 4,671,958號包括對包含接頭的免疫偶聯物的描述，其中該接頭在體內 靶位點處被患者補體系統的蛋白水解酶切割。考慮到已經報導了大量 用於將多种放射診斷化合物、放射治療化合物、藥物、毒素和其它組 分與抗體連接的方法，本領域技術人員能夠確定用於將給定組分與本 發明抗體進行連接的合適方法。
刺激針對目的抗原的免疫應答的方法
技術領域：
本發明還提供通過免疫能夠產生抗體的個體而引起免疫應答或改 善免疫應答或培育針對任何目的抗原的抗體的方法，其通過(i)首先用 包含免疫原性的串聯重複序列的MUCl抗原和目的抗原免疫能夠產生 抗體的個體一次或多次，和(ii)其次用該目的抗原加強一次或多次。 MUCl抗原和目的抗原可獨立地作為多肽或編碼該多肽的核酸淨皮給 予。可將MUC1抗原和目的抗原作為不連接的分子、作為通過接頭(如 上所述)連接的分子、或作為融合蛋白同時給予。 目的抗原可以是任何抗原性序列，包括但不限於人、哺乳動物、 動物、植物、細菌、病毒或合成來源的抗原性序列。
目的抗原可以包括任何胂瘤相關抗原，包括腫瘤胚胎抗原、癌基 因產物、組織譜系抗原、病毒抗原。示例性的腫瘤相關抗原包括癌胚
抗原(CEA)、糖抗原(CA-125)、 MUC1、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、 前列腺幹細胞抗原(PSCA)、前列腺特異性抗原(PSA)、黑素細胞抗原(例 如MART-1/Melan A、酪氨酸酶、gp100和TRP-1 (gp75))、腫瘤胚胎 抗原(OFA)、 Her2/"ew。
目的抗原可以是感染性疾病相關抗原，例如來自寄生蟲、細菌、 病毒。例如，已經描述了可用於引發針對瘧疾的免疫應答的抗體，例
(疾疾的不能承受之重II,什麼是新的，什麼是所需要的)，Breman," a/.， editors, The American Society of Tropical Medicine and Hygiene (2004)。已經描述了可用於引起針對HIV的抗體應答的抗原，例如在 Burton, W a/.， iVoc ^cad <SW (2005) 102:14943中。
實施例
提供以下實施例用以說明而不是限制所要求保護的發明。 實施例1:產生抗MUClot^抗體
以下實施例證實通過首先用MUC1/TM cDNA抗原免疫然後用 MUC1/X蛋白抗原的細胞外結構域加強來產生抗MUC1 a^抗體。通 過在ELISA測定中篩選結合MUC1 /X免疫球蛋白恆定區融合蛋白的那 些來選擇抗體。
實驗操作
材料和抗體
除非另外指出，試劑和化學品都從Sigma (St Louis, MO)獲得。抗 MUC1串聯重複抗體(抗EMA，上皮膜抗原，Mc5)從Chemicon International (Temeluca, CA)獲得。
細胞培養
在補充有10%熱滅活胎牛血清、2mM L-穀氨醯胺、100IU/ml青 黴素和25 jng/ml鏈黴素的培養基中，在37°C和5% C02下培養細胞。 在Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)中培養DA3小鼠乳腺腫瘤細 胞和人胚腎細胞HK293。使用磷酸釣方法將表達構建體轉染進這些細 胞。
產生表達MUC1/TM的穩定DA3小鼠乳腺腫瘤細胞轉化體
用真核表達質粒pCL-MUCl/TM (或在細胞質PvuII位點截短的 pCL-MUC/TM)和pSVneo (編碼新黴素抗藥性)共轉染DA3細胞。用新 黴素選擇穩定的轉化體。通過對細胞溶解物的免疫印跡分析來鑑定表 達MUC1蛋白的轉化體，該免疫印跡分析使用親和純化的針對MUC1 細胞質結構域的多克隆抗體。
產生MUC1/X和MUC1/Y真核表達構建體和融合蛋白
在這項研究中使用的MUC1抗原多肽包括MUC1/X免疫球蛋白恆 定鏈融合蛋白("Flag-Yex-hFc")和MUC1/Y免疫球蛋白恆定鏈融合蛋 白("Flag-Xex-hFc")，在圖1和Levitin， " a/.同上中對它們進行了描 述。如前所述，使用標準分子生物學方法產生所有的構建體，(參見 Levitin， eZ a/.， 同上)。
產生表達Flag-MUCl/Xex-hFc和Flag-MUCl/Yex-hFc融合蛋白的 HK293轉化體並純化hFc標記的融合蛋白
使用磷酸鉤用編碼Flag-Xex-hFc、 Flag-Yex-hFc或突變MUC1/X 蛋白的真核pCMV3表達載體(6 pg DNA/25cm2並瓦)瞬時轉染HK293 (人腎)細胞。為了獲得穩定的轉化體，在將新黴素加入至培養基後分 離抗新黴素的克隆。將含有分泌的MUC1融合蛋白的條件培養基(CM) 以15,000 rpm離心20分鐘，並用0.45 /mi過濾器過濾上清液並保存在 -75。C。 使用Protein A-Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)純化C末端hFc標記的Flag-Xex(Yex)-hFc蛋 白。
確定抗MUC1抗體(雜交瘤上清液)結合MUC1/X (MUC1/Y)蛋白和結 合MUC1 a^S連接處的ELISA測定
用多克隆山羊抗人Fc (Ga-hFc, 4/xg/ml)包被ElisalmmunoAssay板 (Costar, Corning, NY)，隨後用PBS-Tween20 (0.05%)洗滌並用 PBS-Tween+5%脫脂乳(Blotto)封閉。然後，向孔中施加用過的含有 Flag-Xex(或Yex)-hFc蛋白(突變體和野生型)的培養基使得 Flag-Xex(Yex)-hFc蛋白結合。孵育後，移除樣品並用PBS/Tween洗滌 孔。然後先用小鼠單克隆抗體(或雜交瘤上清液)再用HRP偶聯的抗小 鼠抗體孵育。
免疫小鼠和產生雜交瘤
用皮內DNA免疫以21天的間隔連續免疫小鼠。所注射的DNA 是pCL-MUCl/TM或pCL-MUCl/X表達載體質粒。最後用與不完全弗 氏佐劑一起注射的MUC1/X蛋白的細胞外結構域加強小鼠。將骨髓瘤 細胞系與免疫脾細胞融合併通過ELISA測定篩選(如上)來製備雜交
結果
用MUC1/TM cDNA而不是用MUC1/X cDNA免疫誘導抗MUC1 a/ j3 連接處的抗體
用含有編碼MUC1/TM蛋白的cDNA或含有編碼MUC1/X亞型 的cDNA的表達載體免疫小鼠，MUC1/TM蛋白含有a鏈串聯重複排 列，MUC1/X亞型中串聯重複被刪除(圖1)。在四次連續的DNA免疫 後，測定血清中針對MUC1/X的抗體。將與全長MUC1/TM分子在相 同位點被切割的MUC1 /X亞型用作篩選蛋白以鑑別抗MUC1 a/ jS連接 處的抗體。這提供了若干優點。由於MUC1/X細胞外結構域缺失中間 的串聯重複排列，針對高免疫原性的串聯重複排列表位的抗體將不會 被檢測到。更重要的是，由於MUC 1/X僅由形成天然a/)3連接處的兩
個小的相互作用的MUC 1/Xa和j8亞基構成，因而只有針對MUC 1/X 和MUC1/TM共同具有的表位的抗體會被檢測到。天然MUC1 Q^3連 接處就是一個這樣的主要表位，使得這種篩選方法成為檢測結合此目 的關鍵區域的抗體的簡單檢測系統。
出乎意料的是，用MUCl/XcDNA免疫的所有小鼠(5隻中的5隻) 都沒有產生顯著的抗MUC1/X抗體滴度(圖2A和圖2B)。相反，用 MUC1/TM cDNA免疫的5隻小鼠中的5隻都產生了不多但有很好重 復性的抗MUC1/X抗體滴度(圖2A和圖2B)。這些結果表明儘管用 MUC1/TM cDNA免疫可誘導識別MUC1/X和MUC1/TM蛋白共同具 有的表位的抗體，但用MUC1/X cDNA免疫僅引起少量滴度的抗 MUC1/X抗體。
由於我們的主要目標是產生識別c^3連接處的單克隆抗體，因此 需要具有高得多的抗MUC1/X滴度的小鼠。為了產生高滴度的抗 MUC1/X，我們用MUC1/X蛋白加強MUC1/TM cDNA致敏的小鼠。 在單次MUC1/X蛋白加強後，所有免疫的小鼠都顯示了抗MUC1/X滴 度的100倍的增加，從1:300 (在MUC1/TM cDNA單獨免疫後)至 MUC1/X蛋白加強後最小的1:30,000 (圖3A-D)。在MUC1/X蛋白加強 後18天觀察到高滴度，其在第32天甚至更高(圖3A-D)。用於形成雜 交瘤的剩餘未處死小鼠甚至在最初的單一MUC1/X蛋白加強後的6個 月仍保持了高抗MUC1/X蛋白滴度。為了最好地產生抗a/j8結合處的 特異性抗體，我們用表現最高抗MUC1/X抗體滴度的小鼠的脾細胞來 形成雜交瘤。
產生識別切割的a/i8連接處的DMC209單克隆抗體
測定來自10個含有融合脾-骨髓瘤細胞的96孔板的用過的培養基 中識別切割的a/j8連接處的抗體。為了鑑定這類抗體，平行篩選抗切 割的MUC1/X蛋白和結構上類似但未切割的MUC1/Y亞型(圖l)的雜 交瘤上清液。儘管MUC1/X在與全長MUC1/TM蛋白相同的位點被切 割導致形成相互作用的a和(3亞基，^旦未^^皮切割的MUC1/Y不含 MUCl a//5連接處表位。我們選擇MUC1/X陽性和MUC1/Y陰性的雜 交瘤。
對950個雜交瘤上清液的篩選得到兩個對MUC1/X蛋白有高反應 性但對MUC1/Y無反應性的雜交瘤。有限的細胞稀釋得到純克隆，將 其命名為DMC209和DMC 111, DMC209為IgM抗體，DMC111為Ig^2a 抗體。
DMC209和DMC111反應性的詳細表位分析
對克隆的DMC209和DMC 111產生的單克隆抗體的特異性的分析 i正實二者均為MUC1/X陽性和MUC1/Y(-A 1-18，圖4B)陰性。另夕卜， DMC209和DMC1U也對未切割的A 1-11蛋白無反應性(圖4F)，但與 切割的△ 1-7 MUC1/X蛋白反應(圖4E)。其它的分析顯示儘管DMC209 和DMClll同樣好地結合野生型MUC1/X蛋白以及切割的S63—C和 S63—T突變蛋白(圖4C)，但所有其它S63突變的未切割MUC1/X蛋 白(圖4D)與DMC209完全無反應性。相反，DMC111與切割的MUC1/X 蛋白(野生型和切割的S63—C和S63—T突變蛋白，圖4D)和未切割 的S63突變蛋白同樣好地反應(圖4D)。這些結果證實由兩種單克隆抗 體識別的表位是不同的。更重要的是，只有DMC209的反應性完全依 賴於MUC1切割。重要的是，當對每一個單獨測試時，DMC209與 MUC1 a亞基和j8亞基均無反應；只有當它們作為相互作用的實體時 DMC209才與兩亞基反應。這些分析提供強有力的證據表明DMC209 (i)是切割依賴的和(ii)識別相互作用的a亞基和j8亞基的連接處。進一 步的分析(在下文中描述)揭示DMC209牢固結合表達主要MUC1亞型 MUC1/TM的細胞，而非切割依賴的DMC111抗體則顯著較少結合。 此後我們報導的分析將限制在切割依賴的抗體DMC209 。
DMC209與完整細胞上的MUC1/TM的結合
MUC1/TM是所有MUC1亞型中的主要MUC1蛋白，由與被膜束 縛的a亞基非共價結合的含有大、串聯重複排列的a亞基構成。其在許 多腺癌中由細胞作為細胞表面異二聚體以高水平表達(圖1)。由於 DMC209識別位於MUC1/X蛋白中的切割的0^3連接處，而且該切割
位點被證實與在全長MUC1/TM蛋白中發現的相同，所以確定 DMC209是否與存在於完整細胞表面的MUC1/TM蛋白結合是極其重 要的。我們通過首先研究不表達人MUC1/TM的小鼠細胞在轉染人 MUC1/TM後是否變得與DMC209反應來著手研究這個問題。儘管未 轉化的親本小鼠乳腺腫瘤細胞完全不與DMC209反應(圖5A)，但 DMC209顯然與表達全長MUC1/TM蛋白(圖5B)或缺失MUC1/TM細 胞質結構域的亞型(圖5C)的相同細胞結合。為了證實MUC1/TM在這 些細胞上表達，如所預料的，用針對a鏈串聯重複排列的抗體進行的 對照證實了 MUC1在轉化的細胞上表達(圖511)。
在確定DMC209 mAbs在轉化細胞中結合MUCl/TM後，我們繼 續研究了這些抗體是否也結合已知表達MUC1/TM的腫瘤細胞系。 HEY(卵巢癌細胞系)和乳腺癌細胞系T47D和MDA231都證實有顯著 的DMC209結合(分別見圖5C、圖5D和圖5E)。
DMC209結合新鮮的骨髓抽吸物中表達MUC1的多發性骨髓瘤細胞
對於最終的臨床應用，針對MUC1 c^3連接處的抗體必須能夠靶 向表達MUC1的惡性細胞。為了研究DMC209抗體能否在類似體內的 環境中選擇性結合腫瘤細胞，使用從患有多發性骨髓瘤的患者中新獲 得的骨髓抽吸物中的惡性漿細胞。抽吸物中的異質性細胞群使得能夠 直接評估DMC209的結合特異性。DMC209應該結合已知高表達 MUC1的多發性骨髓瘤細胞而不結合或極少結合存在相同吸出物樣品 中的不表達MUC1的細胞。此外，使用同時染色能夠容易地比較抽吸 物中的DMC209細月包結合和/>認的骨髓瘤標誌物抗syndecan (CD 138)。
以側向散射(反映細胞顆粒性)對CD45陽性細胞作圖評估了存在 於骨髓抽吸物中的混合細胞群的組成(圖6A)。這證實骨抽吸物由預料 中的異質細胞群組成，包括粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、單核 細胞、有核紅細胞和惡性漿(骨髓瘤)細胞(圖6A)。用紅色螢光標記的 DMC209抗體進^f亍的同時分析揭示了顯示顯著DMC 209反應性的個 別細胞群。這種選擇的細胞群稱為Rl (圖6B)，顯示和針對
syndecan-CD138的抗體完全一致(圖6C)。對於從患有多發性骨髓瘤的 患者中新獲得的其它三個骨髓抽吸物而言，從三個骨髓抽吸物都獲得 了相似的結果。在相同的新鮮的、未處理的抽吸物樣品中對表達MUC1 的惡性漿細胞的識別而缺乏對不表達MUC1的細胞鐠系的結合加強了 DMC209抗c^j3連接處抗體在區分表達MUC1的腫瘤細胞方面的精確 特異性。
用dmc209抗q/|8連接處抗體免疫組化染色乳腺癌組織
為了使dmc209與存在於乳腺癌組織中的表達muc1的腫瘤細胞 的免疫反應性可見，對來自相同手術切除樣品的惡性乳腺組織和正常 乳腺組織進行了免疫組化分析。平行地，用識別MUC1串聯重複的抗 體(a-EMA-抗上皮膜抗原，參見實驗操作)對切片進行免疫組化分析。 a國EMA和DMC209抗c^3連接處抗體均與惡性乳腺癌細胞強烈反應。 在非惡性的正常乳腺組織中觀察到明顯較少的染色。
隨後，我們使用分別用紅色和綠色螢光標記的DMC209和抗串聯 重複抗體進行了同時的雙重染色。使用紅色標記的dmc209在惡性乳 腺組織的冷凍切片中容易地檢測到MUC1免疫反應性。在惡性乳腺上 皮細胞上看到強烈的抗MUC1免疫反應性，並且在加入未標記的 DMC209抗體後基本上所有的免疫反應性都^皮竟爭除去，由此證實了 免疫反應性的特異性。在嵌入結締組織的成纖維細胞中沒有看到染色， 在結締組織自身中也沒有看到染色。如所預料的，代表與抗串聯重複 抗體的免疫反應性的綠色標記與所看到的紅色標記的DMC209共定 位。
應理解，本文描述的實施例和實施方案僅用於解釋說明的目的， 本領域技術人員將會提出根據這些內容的多種修飾或變化，它們被包 括在本申請的精神和範圍內以及所附的權利要求的範圍內。出於所有 目的，將本文引用的所有出版物、專利和專利申請以其整體通過引用 在此併入。
權利要求
1.特異結合完整MUC1蛋白的MUC1特異性抗體，條件是在α亞基或β亞基中的一個不存在時所述抗體基本上不結合另一個。
1. 特異結合完整MUCl蛋白的MUCl特異性抗體，條件是在a 亞基或/3亞基中的一個不存在時所述抗體基本上不結合另 一個。
2. 如權利要求1所述的抗體，其中所述抗體結合亞型MUC1/X但 基本上不結合亞型MUC1/Y。
3. 如權利要求2所述的抗體，其中所述亞型MUC1/X被切割為截 短的a亞基和j8亞基。
4. 如權利要求l所述的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
5. 如權利要求1所述的抗體，其中所述抗體具有約1:300至約 1:30,000的滴度。
6. 如^l利要求1所述的抗體，其中所述抗體是IgM。
7. 如權利要求l所述的抗體，其中所述抗體是DMC209。
8. 如權利要求l所述的抗體，其中所述抗體是IgG。
9. 如權利要求l所述的抗體，其中所述抗體是DMClll。
10. 如權利要求l所述的抗體，其中所述抗體是人源化的。
11. 如權利要求l所述的抗體，其中所述抗體是人的。
12. 如權利要求1所述的抗體，其中所述抗體是抗體的重組單鏈 可變區片段。
13. 如權利要求l所述的抗體，還包含細胞毒性部分。
14. 如權利要求l所述的抗體，還包含標籤部分。
15. 如權利要求1所述的抗體，其中所述抗體防止所述a亞基從 所述/3亞基解離。
16. 包含權利要求1的抗體的細胞。
17. 如權利要求16所述的細胞，其中所述細胞是雜交瘤細胞。
18. 如權利要求16所述的細胞，其中所述細胞在其表面包含結合 權利要求1的抗體的完整MUC1蛋白。
19. 將免疫毒素耙向過表達MUC1的癌細胞的方法，包括給予權 利要求1的抗體。
20. 產生結合完整MUC1蛋白的MUC1特異性抗體的方法，包括 步驟i) 用包含a亞基串聯重複的MUC1/TM抗原以足以產生特異結合 所述完整MUC1蛋白的MUC1特異性抗體的量免疫具有產生抗體的能 力的個體；以及ii) 選擇結合MUC1/X抗原的抗體；其中在所述MUC1 a亞基或/3亞基中的一個不存在時所述抗體基 本上不結合另一個。
21. 如權利要求20所述的抗體，其中所述抗體結合亞型MUC1/X 但基本上不結合亞型MUC1/Y。
22. 如權利要求21所述的抗體，其中所述亞型MUC1/X被切割 為截短的a亞基和i8亞基。
23. 如權利要求20所述的方法，其中所述MUC1/TM抗原是 MUC1/TM多肽。
24. 如權利要求20所述的方法，其中所述MUC1/TM抗原是編碼 MUC1/TM多肽的核酸。
25. 如權利要求20所述的方法，在步驟i)之後還包括用MUC1/X 抗原免疫所述個體的步驟。
26. 如權利要求25所述的方法，其中所述MUC1/X抗原是 MUC1/X多肽。
27. 如權利要求25所述的方法，其中所述MUC1/X抗原是編碼 MUC1/X多肽的核酸。
28. 篩選特異結合完整MUC1蛋白的MUC1特異性抗體的方法， 條件是在所述a亞基或所述/3亞基中的一個不存在時所述抗體基本上 不結合另一個，所述方法包括i) 確定多種產生的抗MUC1抗體對切割的MUC1/X抗原和 MUC1/Y抗原的結合；以及ii) 選擇特異結合所述MUC1/X抗原但不明顯結合所述MUC1/Y 抗原的抗體。
29. 產生針對目的抗原的抗體的方法，包括步驟i) 用包含a亞基串聯重複的MUC1/TM抗原和所述目的抗原免疫 個體；以及ii) 用所述目的抗原免疫所述個體； 由此產生針對所述目的抗原的抗體。
30. 如4又利要求29所述的方法，其中所述MUC1/TM抗原是 MUC1/TM多肽。
31. 如權利要求29所述的方法，其中所述MUC1/TM抗原是編碼 MUC1/TM多肽的核酸。
32. 如權利要求29所述的方法，其中所述目的抗原是多肽。
33. 如權利要求29所述的方法，其中所述目的抗原是編碼所述目 的抗原的核酸。
34. 如權利要求29所述的方法，在步驟i)中進一步包括用包含 MUC1/TM目的抗原的融合抗原免疫個體。
35. 如權利要求29所述的方法，其中所述目的抗原選自人、動物、 植物、細菌、病毒或合成抗原。
36. 如權利要求29所述的方法，其中所述目的抗原為腫瘤相關抗原。
37. 如權利要求29所述的方法，其中所述目的抗原為感染性疾病 相關抗原。
全文摘要
本發明提供同時結合完整MUC1蛋白的α亞基和β亞基的抗體，以及製備和使用這些抗體的方法。
文檔編號C12N15/12GK101175855SQ200680003496
公開日2008年5月7日 申請日期2006年1月27日 優先權日2005年1月28日
發明者丹尼爾·B·魯賓斯坦, 丹尼爾·H·雷施納 申請人:特拉維夫大學拉莫特有限公司;拜奧摩迪範有限公司