作為抑制素受體的β聚糖及其用途的製作方法

2023-09-14 04:08:10 1

專利名稱：作為抑制素受體的β聚糖及其用途的製作方法
技術領域：
本發明一般涉及內分泌學領域，生殖生物學和細胞生物學，尤其是關於激素/生長因子信號傳導。更特別的是，本發明涉及抑制素受體的識別及其用途。
相關領域的描述抑制素和活化素最初被認為是性腺起源的蛋白質激素，它們能可逆調節垂體前葉產生促卯泡成熟激素(FSH)(1)。這些蛋白質是相關多肽的二硫鍵連接的二聚體。活化素由兩條β鏈構成，而抑制素具有一條β鏈，它與一條相關的但趨異的α鏈連接(2)。現在已知活化素在生殖和非生殖組織中起到了重要的內分泌、旁分泌和自分泌作用。這些作用調節發育和成年動物中包括激素分泌和細胞增殖和分化過程(1，3)。雖然有抑制素不能封閉活化素反應的系統(5，6)，抑制素通常拮抗活化素的作用(4)。
抑制素和活化素屬於生長和分化因子的轉化性生長因子-β(TGF-β)超家族(7)。與該家族的其它代表性成員一樣，活化素顯示通過兩類跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體傳遞信號(8)。在1991年，克隆和確定了活化素II型受體，稱為ActRII的特徵(9)。ActRII是第一種被確定特徵的脊椎動物受體絲氨酸激酶(RSK)，也是任何TGF-β超家族成員中第一種在分子水平詳細描述的受體。現在超過12種受體絲氨酸激酶家族成員已被鑑定出來，包括第二種II型活化素受體(ActRIIB)(10，11)、II型TGF-β受體(12)和化合物(13，14)和TGF-β(15)的I型受體。
抑制素、活化素和相關因子的廣泛的重要生物學作用，以及其與治療生殖、發育、骨骼、肝臟、造血和中樞神經系統疾病的可能應用的關係，形成了探索其受體、信號傳導機制和調控的強有力的理由。總的說，該工作涉及鑑定多種新的靶分子，並應提供針對治療內分泌疾病和腫瘤病的治療方法的新的基礎。
活化素(β-β)和抑制素(α-β)結構上相關，具有同樣的14kDa β亞基，但是抑制素二聚體還具有不同的18kDa α亞基。從濾泡液中分離了活化素和抑制素的同工型。這些包括活化素A(βA-βA)、活化素B(βB-βB)、活化素AB(βA-βB)、抑制素A(α-βA)和抑制素B(α-βB)。基於序列排列和保守半胱氨酸殘基的定位，認為這些多肽與其它能得到晶體結構信息的TGF-β家族成員結構相似(16，17)。
迄今，已顯示抑制素僅在活化素反應的情況下具有活性，它通常拮抗活化素信號(5，18-20)，雖然近來報導了骨骼中活化素依賴性抑制素作用的抽象的方式。已顯示抑制素可與活化素競爭其靶細胞，抑制素能阻止活化素誘導的受體異源化(5，19)。未標記的抑制素直接與已標記的活化素競爭II型活化素受體，雖然其作為取代劑的能力大約比非標記的活化素低10倍(9，10)。
在活化素和抑制素中同時存在的β亞基將介導與II型活化素受體的結合。活化素與ActRII結合後，活化素-ActRII複合物隨後促進I型活化素受體絲氨酸激酶ALK4的募集和磷酸化(5，8，14)。這導致同源I型受體的磷酸化和下遊Smad蛋白質的激活(21，22)。抑制素還與II型活化素受體結合，但抑制素分子的α亞基不支持I型受體(即ALK4)的募集。這提示抑制素通過直接競爭受體結合位點來封閉信號傳導(5，18，19)，因此防止活化素與II型活化素受體結合(23)。然而，抑制素在一些組織和細胞內不能拮抗活化素，這與抑制素作用需要其它成分的假設一致(5，24，25)。
先前的發現表明抑制素可能需要其它受體成分來與活化素成功競爭與II型活化素受體的接觸，從而功能性拮抗活化素的反應。可能簡單、直接的在活化素和抑制素之間競爭與活化素II型受體的接觸單獨對於揭示抑制素對活化素反應的作用是不夠的。事實上，活化素抑制垂體ACTH分泌的作用不是由於大摩爾過量的抑制素的拮抗(6)。另外，在工程改造過度表達ActRII的K562紅白血病細胞(KAR6細胞)中，提高的ActRII表達即使在存在基本分子過量的抑制素下，也封閉抑制素拮抗活化素信號傳導的能力(5)。
在嘗試鑑定推測的抑制素-特異性受體成分中，用[125I]-標記的活化素和抑制素進行交聯實驗，來標記野生型K562紅白血病細胞和過度表達ActRII的KAR6細胞。結果顯示活化素與兩種細胞系中的I型和II型受體結合，標記的活化素與這兩種受體的結合被過量的未標記的活化素或未標記的抑制素取代(5)。如預期的，標記的抑制素能結合兩種細胞系中的II型受體，但不是I型受體。抑制素與II型受體的結合可被加入的未標記的活化素或抑制素取代。有趣的是，與標記的抑制素交聯的高分子量的蛋白質在這兩個實驗中也是明顯的可通過加入過量未標記的抑制素而不是活化素而能被競爭性的被取代。
總的說，這些結果提示除了與ActRII結合，抑制素還與另一種高分子量的推測共受體結合，它可穩定抑制素-ActRII相互作用，從而防止ActRII結合活化素和調節活化素反應。因此，在某些組織中缺乏抑制素對活化素反應的拮抗可通過缺少這類或類似的抑制素結合共受體成分解釋。卵巢腫瘤細胞系KK-1中類似的高分子量抑制素-結合成分的存在已被確認。高親和力抑制素與非鑑定的高分子量蛋白(24)。
β聚糖是III型TGF-β受體，最初被認為是三種顯示以高親和力結合TGF-β的細胞表面受體中最大的一種(26)。大鼠β聚糖cDNA編碼853個胺基酸的蛋白質，含有一個大胞外結構域、一個單跨膜結構域和一個短C-末端胞質結構域，缺乏可清楚識別的信號傳導基序(27，28)。β聚糖與三種TGF-β同工型以高親和力結合，據信在促進TGF-β與其信號傳導受體的結合中起到了輔助作用(22，29)。
成熟的β聚糖是蛋白聚糖，它含有硫酸乙醯肝素和硫酸軟骨素糖胺聚糖(GAG)鏈，得到在SDS-PAGE凝膠上在250-350kDA之間遷移的分子。不和糖胺聚糖結合的β聚糖核心多肽保留TGF-β活性，並作為100-110kDa的蛋白質遷移(27，30，31)。近來的工作顯示β聚糖在介導對TGF-β的生理反應中的重要性，包括其自分泌調節人乳腺癌細胞增殖(32，33)及其觸發心內膜細胞轉化的能力(34)。
現有技術的缺陷在於，沒有確定介導抑制素和活化素受體的相互作用的蛋白質的特徵。本發明填補了本領域該長期存在的需要和需求。
發明簡述在本發明的一個實施例中，描述了一種方法，其中抑制素敏感細胞中活化素誘導的信號傳導可以通過抑制抑制素/β聚糖複合物的形成上調。一種抗血清可以針對β聚糖的胞外表位，來防止抑制素與β聚糖結合。另外，形成抑制素/β聚糖複合物可由減少細胞中β聚糖的表達抑制，通過反義抑制或用同源重組等方法誘變一個或兩個β聚糖等位基因。該方法的一種可能用途是增強垂體細胞中的活化素信號傳導。這應導致促卵泡成熟激素(FSH)產生的增加，和生育力的增強。該方法還可用於治療許多病理性狀況，包括生殖、發育、皮膚、骨骼、肝臟、造血和中樞神經系統疾病，例如前列腺癌。
在本發明的另一個實施例中，提供了針對β聚糖胞外部分的抗血清。該抗血清抑制抑制素與β聚糖的結合，可摻入藥物組合物。
在本發明的另一個實施例中，提供了一種抑制活化素-誘導的信號傳導的方法。這可通過增加抑制素/β聚糖複合物在靶細胞表面的形成實現。一種這樣的方法利用提高β聚糖在靶細胞中的表達，來提供額外β聚糖用於形成這些複合物。該方法還可通過施用額外的抑制素來增強。β聚糖表達可通過用組成型或用誘導型啟動子表達β聚糖的人工構建體轉染靶細胞來提高。該方法還可用於對正常情況下對抑制素不反應的細胞引入抑制素敏感性。可用該方法治療許多病理性狀況，包括生殖、發育、皮膚、骨骼、肝臟、造血和中樞神經系統疾病。實施例包括性腺癌、腎上腺癌和肝臟發育不良。該方法還可用於促進肝臟再生。
本發明的另一個實施例是一種篩選抑制抑制素/β聚糖複合物形成，來增加活化素信號傳導的方法。在可能的抑制素與β聚糖結合的抑制劑存在或不存在的條件下，培育表達β聚糖的細胞膜。進行競爭性結合試驗等試驗，比較結果。抑制抑制素/β聚糖複合物形成的化合物將導致更低水平的抑制素結合。可能的化合物可以是肽、蛋白質或小分子。另外，該方法可用於篩選增加抑制素/β聚糖複合物形成，從而抑制活化素信號傳導的化合物。對此，化合物應提高抑制素與膜的結合。
附圖簡述因此，獲得了上述引用的本發明的特徵、優點和目的，以及其它會變得清楚的方面，並可詳細理解，上面簡單總結的本發明更具體的描述將參考一些實施例並用


。這些附圖是說明書的一部分。然而應注意

了本發明的優選實施例，因此不應認為限制了本發明的範圍。
圖1A和1B顯示β聚糖與抑制素高親和性結合，加強了抑制素與ActRII的結合。
在圖1A中，用磷酸鈣沉澱(35)ActRII-myc、β糖苷(BG)或(ActRII+BG)一起轉染標出的HEK293細胞。分離的細胞膜與約100pM[125I]抑制素A在存在或不存在各種濃度的未標記抑制素A競爭劑下培育。
圖1B顯示標準化的並表示成％特異性結合的圖1A的數據。用Prism軟體分析結合數據。
圖2A和2B說明抑制素與β聚糖(轉染和內源的)共價交聯，提供了ActRII-β聚糖複合物的證據。
在圖2A中，β聚糖增加了抑制素A與ActRII的共價交聯。空載體(pcDNA3)、ActRII-myc、β聚糖(BG)或ActRII和β聚糖同時(BG+ActRII-myc)轉染入HEK293細胞，然後與[125I]-抑制素A和DSS如前對於活化素所述(9)進行交聯。[125I]-抑制素A與表達β聚糖的細胞的結合和交聯在存在或不存在25nM未標記的抑制素A、25nM未標記的活化素A或5nM未標記的TGF-β1的條件下如指出的進行。用抗-β聚糖抗血清(RD Systems，Inc.)或多克隆抗myc抗體(9E10)(Calbiochem，Inc.)免疫沉澱分離的交聯複合物。在還原條件下通過SDS-PAGE分辨交聯的蛋白質，並通過放射性自顯影目測檢驗。標出了ActRII-myc、β聚糖核心多肽(核心)和含糖胺聚糖鏈的β聚糖(BG)的位置。分子量標記表示成Mr×10-3。
圖2B顯示了抑制素A和活化素A與內源β糖苷複合物的共價交聯。[125I]抑制素A和[125I]-活化素A的結合和交聯在存在或不存在25nM未標記的抑制素A或25nM未標記的活化素A的條件下，如標出的在表達內源受體KK-1細胞上進行。用抗-β聚糖抗血清(RD Systems，Inc.)、抗-ActRII抗血清或正常大鼠血清免疫沉澱分離交聯複合物，在還原條件下用SDS-PAGE分辨，並用放射性自顯影目測檢驗。標出了ActRII、β聚糖核心多肽(BG核心)、含糖胺聚糖鏈的β聚糖(BG)和ALK4的位置。分子量標記表示成Mr×10-3。
圖3A-3F顯示了在正常成年大鼠大腦、垂體、卵巢和睪丸中β聚糖的免疫細胞化學定位。高倍亮視野顯微照相顯示前腦(圖3A)、垂體(圖3B和3C)、附睪(圖3D)、睪丸(3E)和卵巢(圖3F)中的β聚糖免疫染色。用箭頭標出了對β聚糖免疫陽性的細胞的典型例子(染成棕色)。條代表50微米。縮寫包括AL，垂體前葉；CT，結締組織；GC，粒層細胞；IL，垂體中葉；LC，睪丸間質細胞；O，卵母細胞；PL，垂體後葉；ST，精小管；TT，Tenia Tecta；TC，卵泡膜細胞。
圖4A-4D顯示β聚糖可在促腎上腺皮質激素、卵巢和紅白血病細胞中介導活化素信號傳導的功能拮抗。
在圖4A中，用3TPLux-報告質粒(7)、CMV-β-半乳糖苷酶(β-GAL)和空載體或β聚糖(BG)cDNA，用Superfect轉染試劑(Qiagen)在優化的條件下轉染AtT20細胞。用或不用2.5nM抑制素A(Inh A)和各種濃度的活化素A(Act A)處理細胞15小時，測量得到的螢光素酶活性。
在圖4B中，如圖4A中所述轉染AtT20細胞，然後用或不用1nN活化素A和一定濃度範圍的抑制素A處理。
在圖4C中，如上所述轉染KK-1卵巢腫瘤細胞，並用或不用0.3nM活化素A和一定範圍濃度的抑制素A處理。
在圖4D中，用β聚糖(BG)或空載體轉染K562-衍生的KAR6細胞，用IPTG處理誘導活化素受體表達，並用0.3nM活化素A和一定範圍濃度的抑制素A處理。螢光素酶活性用任意的螢光素酶單位(L U.)代表，標化到β-GAL活性。
圖5顯示抑制素A抑制大鼠垂體前葉細胞FSH分泌在抗-β聚糖血清的存在下以劑量依賴性方式抑制。大鼠垂體前葉細胞如所述脫離並鋪板(40)。鋪板4天後，洗滌細胞並在0.2％FBS-bPJ(36)中培育24小時。然後用新鮮培養液洗滌細胞，用正常家兔血清(NRS)或來自注射了GST與大鼠β聚糖殘基154-439(Ab-BG)的融合蛋白的家兔的抗血清處理。1小時後，用或不用25pM抑制素A處理細胞，並培育48小時。用放免法試劑盒(NIADDK的國家激素和垂體計劃)測量FSH。報告值表示成三份孔的無抑制素處理的百分數±SEM。
圖6示意性說明了假定的模型，其中β聚糖(BG)作為抑制素共受體。β聚糖或功能上相似的抑制素共受體的存在增加了與ActRII結合的抑制素，並從而防止活化素與ActRII的結合。除了封閉活化素信號傳導途徑外，抑制素/β聚糖/ActRII複合物的形成可指導新的下遊信號。
發明詳述根據本發明，可使用本領域能力內的常規分子生物學、微生物學和重組DNA技術。這些技術在文獻中有完整的解釋。見例如Maniatis，Fritsch Sambrook，「Molecular CloningA Laboratory Manual」(1982)；「DNA CloningA LaboratoryManual」卷I和II(D.N.Glover編，1985)；「Oligonucleitide Synthesis」(M.J.Gait編，1984)；「Nucleic Acid Hybridization」[B.D.Hames S.J.Higgins編(1985)]；「Animal Cell Culture」[R.I.Freshney編(1986)]；「ImmobilizedCells And Enzymoes」[IRL Press(1986)]；B.Perbal，「A practical Guide ToMolecular Cloning」(1984)。
因此，如果本文出現，下面的術語將具有下列定義。
本文所用的術語「cDNA」應指基因mRNA轉錄物的DNA拷貝。
本文所用的術語「衍生的胺基酸序列」應意味著通過閱讀cDNA中核苷酸鹼基的三個一組的序列確定的胺基酸序列。
本文所用的術語「文庫篩選」指用標記的探針檢查是否在合適的條件下有序列與存在於特定DNA文庫中的探針互補的過程。另外「文庫篩選」可用PCR進行。
本文所用的術語「PCR」指聚合酶鏈式反應，它是Mullis的美國專利號4,683,195和4,683,202的主題，以及其它本領域現在已知的改進。
本文所描述的胺基酸優選是「L」異構形式的。然而「D」異構形式的殘基可取代任何L-胺基酸，只要免疫球蛋白結合的所需的功能被多肽保留。NH2指存在於多肽氨基端的游離氨基。COOH指存在於多肽羧基端的游離羧基。與標準多肽命名法一致，J.Biol.Chem.2433552-59(1969)，胺基酸殘基的縮寫是本領域已知的。
應注意所有胺基酸殘基的序列在本文中是由化學式代表的，其左右朝向是從氨基端到羧基端的常規朝向。另外，應注意胺基酸殘基序列開始和結束處的劃線表示與一個或多個其它胺基酸殘基序列的肽鍵。
「複製子」是任何作為體內的自主DNA複製單元；即能在其自身控制下複製的基因元件(例如質粒、染色體、病毒)。
「載體」是複製子，例如質粒、噬菌體或粘粒，另一條DNA區段與其結合，因此使得結合的區段複製。
「DNA分子」指脫氧核糖核苷酸(腺苷酸、鳥苷酸、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的多聚形式，它可以是單鏈形式或雙鏈螺旋。該術語僅指分子的一級或二級結構，不將其限於任何具體的三級形式。因此，該術語包括雙鏈DNA，尤其是線性DNA分子(例如限制性片段)、病毒、質粒和染色體。在討論中，本文的結構根據正常的常規僅是沿DNA非轉錄鏈的5』-3』方向的序列(即與mRNA序列相同的那條鏈)來給出。
「複製起始點」指參與DNA合成的DNA序列。
DNA「編碼序列」是雙鏈DNA序列，它在體內當置於合適的調控序列控制下時轉錄和翻譯成多肽。編碼序列的邊界是由5』(氨基)端的起始密碼子和3』(羧基)端的翻譯終止密碼子確定的。編碼序列可包括但不限於原核序列、來自真核mRNA的cDNA，來自真核(例如哺乳動物)DNA的基因組DNA序列，和甚至合成的DNA序列。聚腺苷酸信號和轉錄終止序列總在編碼序列3』端。
轉錄和翻譯控制序列是DNA調控序列，例如啟動子、增強子、聚腺苷酸信號、終止子等，提供在宿主細胞中編碼序列的表達。
「啟動子序列」是一種能在細胞中與RNA聚合酶結合，引發下遊(3』方向)編碼序列轉錄的DNA調控區域。為了限定本發明，啟動子序列在其3』末端與轉錄引發位點結合，向上遊(5』方向)延伸，以包括引發在背景以上的可檢測水平的轉錄所需的最少數目的鹼基或元件。在啟動子序列內將發現轉錄起始位點，以及負責結合RNA聚合酶的蛋白質結合域(共有序列)。真核啟動子常常但不總是在-10和-35共有序列中含有Shine-Dalgarno序列。
「表達控制序列」是一種DNA序列，它控制和調節其它DNA序列的轉錄和翻譯。當RNA聚合酶將編碼序列轉錄入mRNA，編碼序列在細胞中的轉錄和翻譯控制序列的「控制下」，然後翻譯成編碼序列編碼的蛋白質。
「信號序列」可包含在編碼序列附近。該序列編碼信號肽，在多肽的N-末端，它與宿主細胞通訊以將多肽定向到細胞表面或將多肽分泌入介質，宿主細胞在蛋白質離開細胞前切下該信號肽。可發現信號肽與各種原核生物和真核生物天然的蛋白質有關。
本文所用的術語「寡核苷酸」在指本發明的探針時，定義為含有兩個或多個核糖核苷酸，優選三個以上的分子。其確切大小將由許多因素決定，它們又依賴於寡核苷酸的最終功能和用途。
本文所用的術語「引物」指寡核苷酸，不論它是以天然的純化的限制性消化產物存在，還是合成產生的，當置於某些條件下能作為合成的起始點，這些條件是誘導與核酸鏈互補的引物延伸產物的合成，即在核苷酸和誘導劑，例如DNA聚合酶和合適的溫度和pH條件下。引物可以是單鏈或雙鏈的，必需足夠長，在誘導劑的存在下引發所需延伸產物的合成。引物的確切長度將依賴於許多因素，包括溫度、引物來源和方法的使用。例如對於診斷用途，由靶序列的複雜性決定，寡核苷酸通常含有15-25個或更長的核苷酸，雖然它可以含有較少的核苷酸。
選擇本文中的引物，使其「基本」與特定靶DNA序列的不同鏈互補。這意味著引物必需足夠互補，與其相應的鏈雜交。因此，引物序列不需要反映模板的確切序列。例如，不互補的核苷酸片段可與引物的5』末端結合，而剩餘的引物序列與該鏈互補。另外，可在引物中插入不互補的鹼基或更長的序列，條件是引物序列足夠與序列互補或與其雜交，從而形成合成延伸產物的模板。
本文所用的術語「限制性內切核酸酶」和「限制性酶」指酶，它們各自在特定核苷酸序列處或附近切割雙鏈DNA。
當DNA被引入細胞時，細胞被外源或異源DNA「轉化」。轉化的DNA可以或可以不整合(共價連接)到細胞基因組中。在例如原核生物、酵母和哺乳動物細胞中，轉化的DNA可以維持在游離狀態，例如質粒中。對於真核細胞，穩定轉化的細胞是其中轉化的DNA整合到染色體中，從而它可以通過染色體複製被子代細胞繼承。該穩定性由真核細胞建立含有一群含轉化的DNA的子代細胞的細胞系或克隆來證明。「克隆」是一群通過有絲分裂衍生自單個細胞或祖先的細胞。「細胞系」是一個能在體外穩定生長許多代的祖細胞的克隆。
當至少約75％(優選至少約80％，最優選至少約90％或95％)核苷酸在限定長度的DNA序列中匹配時，兩條DNA是「基本上同源的」。可通過用序列資料庫中標準軟體，或在例如如特定系統限定的嚴格條件下在Southern雜交實驗中比較序列，來鑑定基本同源的序列。限定合適的雜交條件在本領域技術水平內。見例如Maniatis等，見上；DNA Cloning，卷I II，見上；Nucleic Acid Hybridization，見上。
DNA構建物中的「異源」區是在更大的DNA分子中一個可鑑定的DNA區段，它與該更大的分子天然不結合。因此，當異源區編碼哺乳動物基因時，該基因通常側接有在來源生物體的基因組內不側接哺乳動物基因組DNA的DNA。在另一個例子中，編碼序列是一種構建體，其中編碼序列本身在天然中不存在(如基因組編碼序列含有內含子或合成性序列，具有與天然基因不同的密碼子的cDNA)。等位變體或天然存在的突變事件不產生如本文定義的DNA異源區。
通常用於這些研究的標記是放射性元素、酶、當接觸紫外光時發射螢光的化學物質等。許多螢光物質是已知的，並可用作標記。這些包括例如螢光素、羅丹明、金胺、Texas Red、AMCA藍和Lucifer Yellow。特別的檢測物質是在山羊中製備的抗兔抗體，並通過異硫氰酸與螢光素偶聯。
蛋白質還可用放射性元件或酶標記。放射性標記可通過任何目前可得的計數法檢測。優選的同位素可選自3H、14C、32p、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90y、125I、131I和186Re。
酶標記也是有用的，並可用任何現在利用顯色、分光光度、螢光光度、電流測定或氣體定量技術來檢測。酶可以和所選的顆粒通過與橋聯分子，例如碳二亞胺、二異氰酸酯、戊二醛等偶聯。優選的是過氧化物酶、β-葡糖苷酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶+過氧化物酶和鹼性磷酸酶。其它標記物質和方法參考例如美國專利號3,654,090、3,850,752和4,016,043的公開內容。
本領域開發和利用的特定分析系統稱作受體實驗。在受體實驗中，要分析的物質合適標記，然後用一定量的標記接種一些細胞測試集落，然後進行結合研究，測定標記物質與細胞受體結合的程度。用該方法可確定親和力之間的差異。
本領域有用的實驗稱為「順式/反式」實驗。簡單說，該實驗使用兩種基因構建物，其中一種是通常是當轉染入合適細胞系時，連續表達感興趣的特定受體的質粒，第二種是在受體/配體複合物控制下表達報告子，例如螢光素酶的質粒。因此例如，如果需要評估一種作為特定受體的配體的化合物，質粒之一可以是導致在所選細胞系中表達受體的構建體，而第二種質粒將具有與螢光素酶基因連接的啟動子，其中插入了特定受體的反應元件。如果測試的化合物是受體的激動劑，配體將與受體複合，得到的複合物將與反應元件結合，引發螢光素酶基因的轉錄。然後進行光度測定得到的化學發光，獲得劑量應答曲線，並於已知配體的曲線比較。上述方法在美國專利號4,981,784中詳述。
一般說，含有促進插入的DNA片段有效轉錄的啟動子序列的表達載體可與宿主連用。表達載體通常含有複製起始點、啟動子、終止子以及能在轉化的細胞中提供表型選擇的特定基因。轉化的宿主可根據本領域已知的方法發酵和培養，實現最佳細胞生長。
本領域技術人員熟知的方法可用於構建含有合適的轉錄和翻譯控制信號的表達載體。見例如，Sambrook等，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual(第二版)Cold Spring Harbor Press，N.Y.中描述的技術。如果轉錄控制序列有效控制基因轉錄，基因及其轉錄控制序列被定義為「可操縱性連接」。本發明的載體包括但不限於質粒載體和病毒載體。
本發明針對一種通過抑制抑制素/β聚糖複合物的形成，加大活化素誘導的信號傳導的方法。可用針對β聚糖胞外表位的抗血清抑制該複合物的形成。另外，可通過減少細胞中β聚糖的表達限制能形成複合物的β聚糖量。β聚糖的表達可通過抗-β聚糖反義轉錄物，或通過誘變細胞中一個或兩個β聚糖等位基因減少。同源重組是一種可用於使β聚糖突變的方法。垂體細胞是該方法的可能目標，其中放大活化素信號傳導提高了促卵泡成熟激素(FSH)的產生和增強生殖力。另外，該方法可用於治療許多生殖、發育、皮膚、骨骼、肝臟和中樞神經系統疾病，例如前列腺癌。
本發明還針對抗β聚糖抗血清，它抑制抑制素與β聚糖的結合。抗血清可與藥物學上可接受的載體複合，形成藥物組合物。
還提供了通過增強抑制素/β聚糖複合物的形成抑制活化素-誘導的信號傳導的方法。實現該目的的主要方法是通過提高所述細胞中β聚糖的表達。還可施用其它抑制素，來促進複合物的形成。表達可通過轉染含有β聚糖基因的人工構建物來增強。β聚糖基因可以組成型表達或在誘導型啟動子的控制下。該方法還可用於在正常情況下不和抑制素反應的細胞中引入對抑制素的敏感性。該方法可用於治療許多病理情況，包括生殖、反應、皮膚、骨骼、肝臟、造血和中樞神經系統疾病。具體例子包括治療性腺癌、腎上腺癌或肝發育不良。該方法還可用於促進受傷肝組織的再生。
本發明還針對篩選抑制抑制素/β聚糖複合物形成，從而放大活化素信號傳導的化合物的方法。一種抑制素與β聚糖結合的測定法在表達β聚糖的細胞膜上進行。如果化合物在用化合物處理的細胞膜中，比未處理細胞的得到更低水平的抑制素結合，該化合物抑制抑制素/β聚糖複合物的形成，並放大活化素信號傳導。該方法可用於測試許多可能的化合物，包括肽、蛋白質和小分子。另外，該方法可用於篩選化合物，它提高抑制素/β聚糖複合物的形成，從而抑制活化素信號傳導。對此，化合物應提高抑制素與膜的結合。
給出下列例子是為了說明本發明的各種實施例，而不是要以任何形式限制本發明。
實施例1競爭性結合研究重組人活化素A和抑制素A是用J.Mather(Genetech Inc.)提供的穩定表達活化素的細胞系產生的，該細胞系由Wolfgang Fischer(PBL，Salk Institute)純化。[125I]活化素A和[125I]-抑制素A是用氯亞明T法如前所述(7)製備的。
對於結合研究，用DEAE Dextran和10微克ActRII和/或10微克β聚糖質粒DNA瞬時轉染細胞。用DNA培養細胞4小時，用含10％DMSO的Hepes解離緩衝液(HDB)休克，在37℃和5％CO2下，含有10％胎牛血清和L-穀氨醯胺的DMEM中培養48小時。匯合的單層用Hepes解離緩衝液洗滌兩次，重新懸浮在結合緩衝液(HepesDissociation Buffer，含0.1％BSA，5mM MgSO4和1.8mM CaCl2)中。通過在最終0.4毫升體積的結合緩衝液中存在或不存在各種濃度的未標記抑制素或活化素的條件下，將約2×105個細胞與2×105cpm[125I]-抑制素A(約100pM)一起在室溫下保溫90分鐘，進行結合。結合後，離心沉澱細胞，用結合緩衝液洗滌兩次。用γ計數器定量結合的[125I]-抑制素A，用Prism程序進行結合數據的分析。
實施例2交聯研究在5％CO2下，完全DMEM(含有10％胎牛血清、青黴素、鏈黴素和L-穀氨醯胺)中生長到約40-60％匯合的細胞中進行交聯研究。細胞在10釐米培養皿中生長，然後用磷酸鈣沉澱法，用Hepes緩衝的鹽水(pH7.07)轉染。轉染後，細胞在5％CO2中培養48小時。用Hepes解離緩衝液漂洗各皿收集細胞，然後在含有1mM EDTA的Hepes解離緩衝液中培育10分鐘，釋放細胞。
將約106個重懸浮在Hepes解離緩衝液中的細胞與約2×106cpm[125I]-活化素A在總共500微升體積中室溫孵育1小時，一邊溫和振搖，進行共價交聯。該培養後，在各試管中加入1毫升冷Hepes解離緩衝液，然後離心沉澱細胞，重新懸浮在500微升HDB中，加到0.5mM二琥珀醯辛二酸(DSS)中，在冰上孵育30分鐘。在各試管中加入1毫升TBS淬滅反應。然後離心沉澱細胞，吸取並將沉澱在冰上溶於1毫升裂解緩衝液(20mM Tris-HCl，pH7.5，0.2mM EDTA，1％Triton X-100，1mMAEBSF，1mM EDTA，10微克/毫升亮抑肽酶、10微克/毫升胃酶抑素和1微克/毫升抑酶肽)30分鐘。離心除去TX-100-不溶性物質，在各上清液中加入2微克抗-β聚糖或2微克抗-myc抗體。試管在4℃孵育16小時，在各試管中加入10微升50％蛋白質G瓊脂糖(PGA)漿液沉澱免疫複合物，在4℃再保溫1小時，並離心沉澱固定的免疫複合物。用1毫升裂解緩衝液洗滌各蛋白質G瓊脂糖沉澱三次，然後煮沸10分鐘，在25微升SDS樣品緩衝液中洗脫，通過SDS-PAGE分辨。所有SDS-PAGE在還原條件下，在聚丙烯醯胺3-8％Tris乙酸酯NuPAGE凝膠(Novex)上進行SDS-PAGE。乾燥凝膠，通過放射性自顯影檢測條帶。
實施例3AtT20和KK-1細胞中的螢光素酶測定在瞬時轉染實驗中用良好確定特徵的活化素/TGF-β-反應性螢光素酶報告質粒3TPLux評估β聚糖的功能。測試了兩種小鼠細胞系；AtT20促皮質激素細胞(在DMEM、10％FBS、2mML-穀氨醯胺和慶大黴素中生長)和KK-1卵細胞(在含有10％FBS、L-穀氨醯胺、青黴素和鏈黴素的DMEMF12中生長)。胰蛋白酶消化細胞，以1.5-2×105個細胞/孔的密度在轉染24小時前鋪在6孔平板中。細胞在完全培養基中用約1微克3TPLux、0.1-0.2微克巨細胞病毒(CMV)-β-半乳糖苷酶(β-GAL)和0.1-0.3微克載體或β聚糖質粒DNA轉染。轉染在優化的條件下，用市售的Superfect轉染試劑(Qiagen，Hilden，Germany)進行。在培養2.5小時後，用含2％FBS的培養基洗滌細胞，使其恢復5小時。15小時後用抑制素A和/或活化素A處理細胞15小時，然後收集在裂解緩衝液(1％Triton X-100、25mM甘氨醯甘氨酸，pH7.8，15mM MgSO4，4mM EGTA和1mM DTT)中。螢光素酶報告子活性是通過對相對的β-GAL活性標定確定的。
實施例4免疫細胞化學正常的成年雄性和雌性Sprague-dawley大鼠(175-250克，Sprague Dawley)保持在標準箱、食物和光照條件(23℃，12小時光，12小時暗，早六點開燈)下。如前所述(MacConell等，1998)進行免疫細胞化學實驗(ICC)。簡單說，深度麻醉大鼠，經心臟灌注4％聚甲醛。取出組織(大腦、垂體、睪丸或卵巢)，預先在相同的固定劑中固定1小時。將大腦轉移到10％蔗糖/0.02M磷酸鉀緩衝的鹽水(KPBS)中，4℃過夜儲藏。在顯微切片機上切下30μm冷凍的冠狀切片，如下處理自由漂浮切片，用於ICC分析。垂體、睪丸和卵巢組織被包埋在石蠟中，切下10微米切片，加到Superfrost Plus載玻片(Fish Scientific)上，加工用於ICC分析。所有與使用動物有關的程序是根據聯邦、州和地方法律和團體和NIH規則進行的。
為了減少背景染色，組織切片在1％H2O2中保溫20分鐘，用KPBS漂洗，然後在含有0.3％Triton X-100、10％正常兔血清和2％BSA的KPBS中室溫保溫1小時。切片與25微克/毫升的β聚糖原始抗血清(RD)在加有0.3％Triton X-100、2％正常兔血清和2％BSA的KPBS中4℃過夜溫育(作為對照，相鄰的切片單獨與正常山羊IgG或二抗溫育)。然後用KPBS漂洗組織切片，然後與1∶1,000稀釋的生物素化的家兔抗山羊二抗(Vector)在室溫下溫育1小時。KPBS洗滌過的組織與活化素-生物素-辣根過氧化物酶(Vector)的複合物室溫保溫1小時。然後過氧化物酶反應在0.03％DAB和0.015％H2O2的0.1M Tris-HCl，pH7.4保溫3-5分鐘得到可見的棕色的反應產物。將自由漂浮的腦切片放在Superfrost/Plus載玻片(FisherScientific)上，用光學顯微鏡觀察免疫反應性。
實施例5β聚糖高親和力的結合抑制素，提高抑制素與ActRII的結合。
在一個篩選潛在的抑制素結合蛋白的過程中，在表達β聚糖的細胞中檢測到抑制素結合。圖1顯示從轉染β聚糖的HEK293細胞上分離的膜顯示特異性的、高親和力的抑制素結合[Ki＝0.6(0.5-0.9)nM]，而來自用空載體轉染的細胞膜沒有可檢測的特異性抑制素結合。
為了進一步確定表達ActRII或共表達ActRII和β聚糖的細胞分離物的膜中抑制素的結合，將編碼這些受體的cDNA轉染入HEK 293細胞，並進行競爭性結合試驗。當ActRII單獨表達時，抑制素結合親和力十分低[Ki＝6.3nM(2.9-13.4)nM]，與先前的結果(9)一致，但當ActRII與β聚糖共表達時，增加了30倍[Ki＝0.2(0.1-0.3)nM](圖1B)另外，共表達ActRII和β聚糖使抑制素結合位點相對於單獨表達ActRII或β聚糖的細胞中結合位點數目增加了約12倍或6倍(圖1A)。用β聚糖和ActRIIB進行的實驗有相似結果；然而β聚糖對抑制素親和力和抑制素結合位點的數目的作用沒有如此劇烈(數據未顯示)。與β聚糖結合的活化素在HEK 293細胞中表達過程中檢測不到。另外，β聚糖不增加活化素與ActRII的結合(數據未顯示)，表明β聚糖不能通過增加ActRII表達的方法來增加抑制素結合。
實施例6將抑制素與β聚糖共價交聯，和抑制素與ActRII-β聚糖複合物的共價交聯為了確定抑制素是否能和ActRII一起表達或不表達的β聚糖結合併形成複合物的能力，兩種受體在HEK 293細胞中表達。細胞用[125I]-抑制素，然後用共價交聯劑二琥珀醯辛二酸酯(DSS)處理細胞。然後用針對β聚糖胞外結構域的ActRIImyc表位的抗體免疫沉澱交聯的抑制素-受體複合物。交聯的、免疫沉澱的複合物可通過SDS-PAGE分辨，並用放射性自顯影用肉眼觀察。
圖2A顯示了這樣的交聯實驗的結果，其中單獨用載體(泳道1)、單獨用ActRII(泳道2)、β聚糖(泳道3)或β聚糖和ActRII一起(泳道7-10)轉染細胞。用[125I]-抑制素交聯在SDS-PAGE分析上，在被空載體轉染的細胞中得不到任何可見複合物(圖2A，泳道1)。在被ActRII單獨(圖2A，泳道2)轉染的細胞中檢測到約75-85kDa的共價複合物，與先前報導的抑制素/活化素-ActRII(8，9，18，19)的交聯複合物大小一致。將[125I]-抑制素與單獨用β聚糖轉染的細胞交聯得到約110kDa的複合物，和另一條175-250kDa的擴散條帶(圖2A、泳道3)。先前用[125I]抑制素交聯的β聚糖的實驗已顯示具有相似遷移率(27，28)的複合物，代表β聚糖核心蛋白(約110kDa)和具有糖胺聚糖鏈(200-300kDa)的β聚糖。因此，抑制素標記後所見的條帶含有預測形式的β聚糖。
先前報導了在表達β聚糖的細胞中存在的大小範圍相同的抑制素複合物具有相似的高分子量(5，24，38)。加入25nM未標記的抑制素或5nM未標記的TGF-β防止抑制素與β聚糖交聯(圖2A，泳道4和6)。相反，25nM未標記的活化素沒有作用(圖2A，泳道5)。這些結果說明了活化素缺乏該蛋白聚糖的親和力，和β聚糖與抑制素的α亞基結合的可能性。TGF-β封閉抑制素交聯的能力表明抑制素的結合位點與β聚糖上的至少一種TGF-β結合位點重疊。
當ActRII和β聚糖共表達時，抑制素-交聯受體複合物的水平劇烈增加，[125I]-抑制素和ActRII和β聚糖之間的共價複合物是明顯的(圖2A，泳道7)。預計大小範圍內的抑制素標記的複合物與針對ActRII的抗-myc抗體共同免疫沉澱(圖2A，泳道7)，提供了抑制素、ActRII和β聚糖相互作用，形成寡聚抑制素受體複合物的證據。25nM未標記的抑制素的存在在表達兩種受體的細胞中完全封閉了[125I]-抑制素對ActRII和β聚糖的標記(圖2A，泳道8)。相反加入25nM活化素或5nM TGF-β對用[125I]-抑制素標記的條帶強度幾乎沒有作用(圖2A，泳道9和10)。未標記的TGF-β不能封閉抑制素與和ActRII共表達的β聚糖交聯是和存在ActRII/β聚糖複合物，它與抑制素結合，而不是TGF-β結合一致的。
除了其與重組β聚糖和ActRII在轉染細胞中形成交聯的複合物的能力外，抑制素還與內源β聚糖和ActRII在小鼠卵巢細胞系KK-1中結合併形成交聯的複合物(圖2B)(38)。可在用抗β聚糖抗血清(泳道2)或抗ActRII抗血清(泳道4)免疫沉澱後目測這些複合物。通過與過量的未標記抑制素A溫育，封閉標記的複合物的形成(圖2B)。免疫沉澱的複合物包括β聚糖核心蛋白、具有糖胺聚糖鏈的β聚糖和ActRII，但是活化素I型受體Alk4不存在於複合物中(圖2B)。用125I-活化素標記KK-1細胞，然後交聯和用抗-β聚糖抗體免疫沉澱，顯示內源β聚糖不與活化素形成共價複合物(泳道7和9)。當活化素-交聯的細胞被抗-ActRII抗體免疫沉澱時，可見ActRII和Alk4，而不是β聚糖。
實施例7抑制素應答性組織中β聚糖的表達足夠的證據提示抑制素是一種下丘腦-垂體-性腺軸的重要的旁分泌/自分泌調節劑(39)。因此，用免疫細胞化學來評估是否β聚糖蛋白的組織特異性分布與記錄的有抑制素反應性的組織一致。令人驚奇的是，儘管相當長的時間以來已知β聚糖是一種TGF-β受體，β聚糖體內的組織分布仍然很大程度上未被探索。圖3總結了正常成年大鼠大腦、垂體、卵巢和睪丸中β聚糖的免疫組織化學定位。
可能抑制素最廣為人知的功能是其選擇性抑制垂體前葉FSH分泌(1，40-42)。如圖3B所示，與β聚糖介導抑制素應答的作用一致，在正常成年雄性大鼠垂體腺的整個前葉中的細胞亞類中觀察到強β-聚糖-免疫應答，顯示優勢胞質定位。這些垂體前葉中的β聚糖-免疫陽性細胞類型可代表促性腺激素細胞和促乳激素細胞，因為這些垂體細胞類型主要分別是抑制素和TGF-β靶(43-45)。有趣的是，還在垂體中葉的一大類細胞中發現了強β聚糖-免疫應答(圖3C)。雖然該葉中的細胞上抑制素作用未被記錄，報導了TGF-β1與中葉的促黑激素細胞共同定位，表明它在調節該細胞類型中起到了作用(46)。β聚糖的陽性免疫染色在垂體的後葉中檢測不到(圖3C)。
在睪丸內，在大鼠睪丸間質細胞中觀察到輕微的β聚糖染色，但在支持細胞或精細胞中在任何階段沒有可見的可辨別染色(圖3D)。另外，附睪間質染成對β聚糖陽性(圖3E)。β聚糖對睪丸間質細胞的免疫定位與由睪丸支持細胞分泌的抑制素局部作用，以調節睪丸膠質細胞中的類固醇生成作用的事實(47，48)，以及抑制素特異性結合位點被定位到該細胞類型的事實(49)一致。然而，精細胞上不能染色根據抑制素對配子聲稱的作用的報導，有些出乎意料(50，51)。
在粒層細胞、卵泡膜細胞和間隙細胞中觀察到卵巢內陽性β聚糖免疫染色(圖3F)。與睪丸中的發現類似，該定位與記載的抑制素對大鼠卵泡膜細胞的雄激素生產的作用相符(47)。
在成年雄性大鼠大腦中，在前腦的tenia tecta中β聚糖-免疫反應性(ir)纖維(圖3A)。還在大鼠前腦的中隔海馬回核中發現β聚糖-ir纖維(數據未顯示)。值得注意的是，該β聚糖在tenia tecta中的中心定位對應於抑制素/活化素α-和βA-亞基mRNA在該相同區域中的存在(52)。因此可能大腦區域中分泌的成熟抑制素與類似定位的β聚糖相互作用。雖然α、βA和βB亞基蛋白和mRNA廣泛分布在大鼠大腦的整個rostrocaudal extent中(雖然是低水平)，β聚糖-ir纖維的檢測限於這兩個大腦區域，在大鼠大腦的任何區域未觀察到β聚糖的核周體染色。可能β聚糖在其它大腦區域中的表達由於低翻譯、迅速蛋白質降解或蛋白質的快速運輸在免疫組織化學的可檢測水平之下，表明大鼠的秋水仙素處理可能是目測對β聚糖免疫陽性細胞體必需的。還可能在這些區域內表達與β聚糖不同的相關抑制素受體成分，進行與β聚糖類似的介導抑制素反應的功能。
實施例8β聚糖介導促腎上腺皮質激素細胞和卵巢細胞系中活化素信號傳導的拮抗。
雖然許多活化素反應被抑制素有效封閉，還有抑制素對活化素反應沒有可測量作用的情況(5，6，53，54)。已顯示例如在過度表達ActRII的K562紅白血病細胞中，3TPLux報告質粒活化素介導的誘導不受加入高濃度抑制素的影響(5)。先前描述了活化素A抑制促腎上腺皮質激素細胞系AtT20中鹼性ACTH的分泌的能力，其中抑制素類似的被發現對活化素反應沒有作用(6)。
為了直接測試β聚糖是否能介導抑制素封閉活化素信號傳導，將大鼠β聚糖cDNA和3TPLux報告子質粒轉染入AcT20細胞，來確定是否β聚糖能對這些細胞賦予抑制素反應性。在轉染後，測量抑制素封閉活化素誘導螢光素酶的活性。
圖4A顯示當AtT20被空3TPLux載體或表達β聚糖xDNA的3TPLux載體共轉染後，提高的活化素A濃度導致3TPLux活性劑量依賴性的增加。然而當另外用2.5nM抑制素處理細胞時，β聚糖轉染的細胞中活化素的反應大大下降，而被空載體轉染的細胞中活化素反應不受抑制素的影響(圖4A)。
為了測量該β聚糖介導的抑制素作用的劑量依賴性，再次用空載體或含有β聚糖的3TPLux質粒轉染細胞。用一定範圍濃度的抑制素A(圖4B)在存在或不存在1nM活化素A的情況下處理轉染的細胞。如圖4B所示，抑制素封閉3TPLux的活化素誘導的活性是劑量依賴性的，並且需要β聚糖。抑制素在表達β聚糖的細胞中的該作用是濃度依賴性的，抑制素的估計IC50具有8-10pM(圖4B)。
還測試了β聚糖對兩種其它細胞系的抑制素反應性的作用。雖然發現卵巢細胞系KK-1具有弱抑制素反應性(數據未顯示)，但是被β聚糖cDNA轉染的KK-1細胞變得對抑制素高度敏感。在過度表達活化素受體的K562紅白血病細胞(KAR6)中，3TPLux報告子質粒的活化素介導的誘導在很大程度上未受加入高濃度抑制素的影響(5)。圖4D顯示KAR6細胞還顯示活化素誘導的螢光素酶報告活性在轉染β聚糖cDNA後，而不是在轉染空載體後抑制素依賴性的減少。
聯合結合和交聯結果，這些結果進一步支持了一種模型，其中β聚糖作為抑制素受體，初始抑制素與ActRII結合，從而限制活化素與ActRII的接觸，並拮抗活化素信號傳導。值得注意的是雖然β聚糖/ActRII的抑制素估計的親和力是約200pM，抑制素對功能性實驗中測試的這三種細胞類型的反應的IC50值範圍低得多(5-50pM)。在一些實驗中，在未加入抑制素時，β聚糖過度表達可變的抑制活化素誘導的報告子活性，提示β聚糖與ActRII在不存在抑制素的情況下相互作用，來幹涉活化素信號傳導。不能排除可能抑制素/ActRII/β聚糖複合物還可引發新的與活化素誘導的不同的信號來產生不依賴於活化素或其受體複合物的抑制素反應。
實施例9
抗-β聚糖抗血清實驗為了研究內源β聚糖在介導抑制素作用中的可能的生理學重要性，對β聚糖胞外功能域的一部分產生抗體，檢測了這些抗體對抑制素的生物反應的作用。在家兔中產生抗-β聚糖抗血清(Ab-BG)，針對之前報導得到的序列，得到能封閉β聚糖-依賴性TGF-β信號傳導的抗體(34)。圖5顯示抑制素將FSG分泌減少到對照或正常家兔血清(NRS)處理的細胞中測量的約30％。加入Ab-βG以劑量依賴形式逆轉該抑制素作用，而以等劑量加入的正常加入血清(NRS)沒有作用。這些數據表明β糖苷免疫中和抑制抑制素抑制原代垂體細胞分泌FSH的能力。這支持了β聚糖或免疫學上相關的蛋白質與抑制素對垂體的作用有關的猜想。
實施例10抑制素與β聚糖和ActRII的相互作用的可能模型幾種生長因子和細胞因子需要細胞表面的蛋白聚糖來獲得與其相關的信號傳導受體的接觸，並施加生物應答(55)。本文列出的數據與一種模型(圖6)一致，其中抑制素/β聚糖複合物與活化素競爭與ActRII的接觸。這因此可以防止活化素/ActRII複合物的形成，這種複合物是隨後ALK4的補充和活化素信號傳導級聯必需的。該模型與對於TGF-β信號傳導提出的機制類似但結果不同，在後者中β聚糖濃縮細胞表面的TGF-β，將其遞呈給其協同II型受體來增強信號傳導(56)。近來提出的有關紅木(Mahogany)的蛋白聚糖促進拉美刺鼠的MSH拮抗劑與MSH受體(57，58)結合的作用最可能是與β聚糖對於本文報導的抑制素作用的影響。
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本說明書中提到的任何專利表明了本發明涉及的領域的技術人員的水平。這些專利和出版物在此引入以供參考，其程度如同各獨立出版物特別並分別表明引入以供參考。
本領域技術人員將不難理解本發明適合實施目的並獲得提到的結果和優點，以及那些本文中提到的目的、結果和優點。本文的實施例以及方法、程序、療法、分子和本文所述的具體化合物是優選例的代表，是示範性的，不意味著限制本發明的範圍。對於本領域技術人員可進行改變和其他用途，這些在權利要求限定的本發明的精神內。
權利要求
1.一種增加細胞中活化素誘導的信號傳導的方法，其特徵在於，該方法包括步驟抑制所述細胞表面抑制素/β聚糖複合物的形成。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述抑制素/β聚糖複合物的形成被針對β聚糖的胞外表位的抗-β聚糖抗血清所抑制。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述細胞中β聚糖的表達被抑制。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，β聚糖的表達被β聚糖的反義轉錄物抑制。
5.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，β聚糖的表達被所述細胞中至少一個β聚糖等位基因的誘變抑制。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述β聚糖等位基因通過同源重組突變。
7.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述細胞是垂體細胞。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，活化素信號傳導的增強提高了所述細胞中促卵泡成熟激素的產生。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述方法增加了生育力。
10.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述活化素信號傳導的增加減輕了所述細胞中的病理狀況。
11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述病理狀況選自生殖、發育、皮膚、骨骼、肝臟、造血和中樞神經系統疾病。
12.如權利要求11所述的方法，其特徵在於，所述病理狀況是前列腺癌。
13.一種針對β聚糖胞外部分的抗血清，其特徵在於，所述抗血清抑制抑制素與β聚糖的結合。
14.一種藥物組合物，其特徵在於，該藥物組合物含有權利要求13所述的抗血清和藥物學載體。
15.一種抑制細胞中活化素誘導的信號傳導的方法，其特徵在於，該方法包括步驟增加所述細胞表面形成的抑制素/β聚糖複合物。
16.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述抑制素/β聚糖複合物的形成是通過提高所述細胞中β聚糖的表達增加的。
17.如權利要求16所述的方法，其特徵在於，該方法還包括步驟對所述細胞施用其它抑制素。
18.如權利要求16所述的方法，其特徵在於，通過用含有β聚糖基因的人工構建物轉染所述細胞增加β聚糖表達。
19.如權利要求18所述的方法，其特徵在於，所述β聚糖基因組成型表達。
20.如權利要求18所述的方法，其特徵在於，所述β聚糖基因是由誘導型啟動子表達的。
21.如權利要求18所述的方法，其特徵在於，所述方法用於在活化素信號傳導不受抑制素正常影響的細胞中引起對抑制素的敏感性提高。
22.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述活化素信號傳導的抑制減輕了所述細胞中的病理狀況。
23.如權利要求22所述的方法，其特徵在於，所述病理狀況選自生殖、發育、皮膚、骨骼、肝臟、造血和中樞神經系統疾病。
24.如權利要求23所述的方法，其特徵在於，所述病理狀況選自性腺癌、腎上腺癌和肝臟發育不良。
25.如權利要求23所述的方法，其特徵在於，該方法用於促進受傷肝臟中的肝臟再生。
26.一種篩選抑制抑制素/β聚糖複合物形成，從而提高活化素信號傳導的化合物的方法，其特徵在於，該方法包括步驟a)在所述化合物存在或不存在下培育來自表達β聚糖的細胞的膜；b)進行試驗，測量抑制素對β聚糖的結合；c)比較與所述化合物一起培養的細胞對未處理細胞的試驗結果，其中抑制抑制素/β聚糖複合物形成的化合物將導致更低水平的抑制素結合。
27.如權利要求26所述的方法，其特徵在於，所述化合物選自肽、蛋白質和小分子。
28.如權利要求26所述的方法，其特徵在於，所述試驗是標記和未標記抑制素之間的競爭性結合試驗。
29.一種用權利要求26所述的方法鑑定出的化合物。
30.一種篩選化合物的方法，該化合物提高抑制素/β聚糖複合物的形成，來抑制活化素信號傳導，其特徵在於，該方法包括步驟a)在所述化合物存在或不存在下培育來自表達β聚糖的細胞的膜；b)進行試驗，測量抑制素與β聚糖的結合；c)比較與所述化合物一起培養的細胞對未處理細胞的試驗結果，其中提高抑制素/β聚糖複合物形成的化合物將導致更高水平的抑制素結合。
31.如權利要求30所述的方法，其特徵在於，所述化合物選自肽、蛋白質和小分子。
32.如權利要求30所述的方法，其特徵在於，所述試驗是標記和未標記抑制素之間的競爭性結合試驗。
33.一種用權利要求30所述的方法鑑定出的化合物。
全文摘要
抑制素和活化素是可逆調控多種調節系統的蛋白質激素。競爭性結合實驗揭示了β聚糖、III型TGF－β受體，還起到了抑制素受體的作用。β聚糖上調抑制素與ActRII活化素受體的結合。通過上調抑制素與ActRII的結合，β聚糖有效隔絕了ActRII與活化素結合，從而減弱了活化素信號傳導。另外，ActRII－β聚糖複合物可產生與通過ActRII和ALK4的活化素信號傳導不同的新信號。β聚糖在大鼠大腦的不連續核和成年大鼠的垂體、睪丸和卵巢內的特定類型細胞中產生。抑制素－反應性組織和細胞類型中β聚糖的存在，以及該蛋白聚糖能結合抑制素，並賦予抑制素敏感性的能力，與β糖苷作為抑制素特異性受體，調節各種組織中抑制素反應的作用一致。
文檔編號A61K48/00GK1450907SQ00818570
公開日2003年10月22日 申請日期2000年12月14日 優先權日1999年12月15日
發明者W·韋爾, P·C·格雷, A·L·布倫特, K·A·劉易斯, L·M·比利齊吉 申請人:研究發展基金會