包括非天然胺基酸的方法和組合物的製作方法

2023-09-18 20:32:00

專利名稱：：包括非天然胺基酸的方法和組合物的製作方法
技術領域：
：無
背景技術：
：將非遺傳編碼的胺基酸(即，"非天然胺基酸")併入蛋白質中的能力允許引入化學官能團，其可提供天然存在官能團(諸如賴氨酸的s-NH2、半胱氨酸的巰基-SH、組氨酸的亞氨基等)的有價值替代物。已知某些化學官能團對20種常見遺傳編碼胺基酸中存在的官能團為惰性的，但與可結合於非天然胺基酸上的官能團明確且有效地反應以形成穩定鍵聯。如今可用方法來選擇性地引入蛋白質中不存在的對20種常見遺傳編碼胺基酸中所存在的所有官能團呈化學惰性且可用於與包括某些官能團的試劑有效且選擇性地反應以形成穩定共價連接的化學官能團。
發明內容本文中描述且以引用的方式併入用於製造、純化、檢測、表徵以及使用非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽以及經修飾非天然胺基酸多肽的方法、組合物、技術以及策略。本發明提供檢測多肽的方法，其包括檢測多肽中的非天然編碼胺基酸側鏈。在一些實施例中，多肽是由核糖體合成的。本發明也提供檢測多肽的方法，其包括檢測已經翻譯後修飾的多肽中的非天然編碼胺基酸側鏈。也提供檢測所述多肽中非天然編碼胺基酸側鏈的方法，其包括使非天然編碼胺基酸側鏈與包括與非天然編碼胺基酸側鏈特異性相互作用的官能團的分子接觸。也提供純化多肽鏈中具有非天然編碼胺基酸的多肽的方法。在一些實施例中，所述方法包括使多肽和與多肽中的非天然編碼胺基酸側鏈相互作用的物質接觸。在其它實施例中，所述純化多肽鏈中具有非天然編碼胺基酸的多肽的方法包括使多肽沉澱，其中當與多肽鏈中無非天然編碼胺基酸的多肽的溶解性相比時，非天然編碼胺基酸改變多肽的溶解性。也提供純化核糖體製造的多肽側鏈中具有非天然編碼胺基酸的多肽的方法，其包括使多肽電泳，其中當與多肽側鏈中無非天然編碼胺基酸的多肽的電泳遷移率相比時，非天然編碼胺基酸改變多肽的電泳遷移率。在其它實施例中，純化核糖體製造的多肽側鏈中具有非天然編碼胺基酸的多肽的方法包括使多肽透析，其中當與多肽鏈中無非天然編碼胺基酸的多肽的擴散速率相比時，非天然編碼胺基酸改變多肽的擴散速率。、本發明也提供篩檢分子文庫的方法，其包括a)在允許文庫分子與包括非天然編碼胺基酸的多肽相互作用的條件下使包括非天然編碼胺基酸的多肽與文庫分子組合，和b)鑑別與包括非天然編碼胺基酸的多肽相互作用的文庫分子。在一些實施例中，篩檢包括多個具有不同胺基酸序列的多肽的核糖體製造的多肽的文庫，其中各多肽都包括非天然胺基酸。本發明也提供包括以下步驟的方法a)在具有至少一種已知生物活性的預選定多肽中的單個預選定位點處用非天然編碼胺基酸取代天然編碼胺基酸；和b)測量包括非天然編碼胺基酸的預選定多肽的生物活性；以及C)比較步驟b)的預選定多肽與已在預選定多肽鏈的不同位置處用非天然編碼胺基酸取代天然編碼胺基酸的預選定多肽或多肽鏈中無取代非天然編碼胺基酸的預選定多肽的生物活性。在一些實施例中，選擇預選定多肽的供翻譯後修飾的位置的方法包括a)在具有至少一種己知生物活性的預選定多肽中的單個預選定位點處用非天然編碼胺基酸取代天然編碼胺基酸；和b)測量包括非天然編碼胺基酸的預選定多肽的生物活性；以及C)比較步驟b)的預選定多肽與已在預選定多肽鏈的不同位置處用非天然編碼胺基酸取代天然編碼胺基酸的預選定多肽或多肽鏈中無取代非天然編碼胺基酸的預選定多肽的生物活性。應了解，本文中所述且以引用的方式併入的方法和組合物不限於本文中所述的特定方法、方案、細胞株、構築體以及試劑且同樣可改變。同樣應了解，本文中所使用的術語僅出於描述特定實施例的目的，且並非意欲限制本文中所述的方法和組合物的範疇，所述範疇應僅由隨附權利要求書來限制。定義除非上下文另外明確指出，否則如本文中和隨附權利要求中所使用的單數形式"一"和"所述"包含複數提及。除非另外定義，否則本文中使用的所有技術術語和科學術語具有如本文中所述的本發明所屬領域的技術人員通常所了解相同的含義。儘管與本文中所述的那些類似或等效的任何方法、裝置以及材料可用於本文中所述的本發明的實施或測試中，但現在描述優選方法、裝置以及材料。本文中提及的所有公開案和專利是為了描述和揭露(例如)公開案中所述的構築體和方法的目的以引用的方式全部併入本文中，其可結合本文中所述的本發明使用。僅提供本文所討論的公開案在本發明申請日期之前的揭露內容。本文中的任何內容不應被解釋為承認本文所述的發明者因先前發明或任何其它原因而無權提前公開本發明。術語"垸氧基"、"烷基氨基"以及"垸硫基"(或硫代垸氧基)是以其常規意義使用，且指的是分別通過氧原子、氨基或硫原子與分子其餘部分連接的那些垸基。除非另外指出，否則自身或作為另一取代基的部分的術語"烷基"意謂直鏈或支鏈或環狀烴基，或其組合，其可為完全飽和、單不飽和或多不飽和的且可包含具有指定碳原子數目(即Q-do意謂1至IO個碳)的二價基團和多價基團。飽和烴基的實例包含(但不限於)以下基團，諸如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基、環己基、(環己基)甲基、環丙基甲基、(例如)正戊基、正己基、正庚基、正辛基以及其類似基團的同系物和異構體。不飽和垸基為具有一個或一個以上雙鍵或三鍵的垸基。不飽和烷基的實例包含(但不限於)乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-異戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(l,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及更高級的同系物和異構體。除非另外指出，否則術語"烷基"也意謂包含下文中更詳細定義的垸基的那些衍生物，諸如"雜烷基"。限於烴基的垸基稱為"均垸基"。自身或作為另一取代基的部分的術語"亞烷基"意謂衍生自烷烴的二價基團，例如(但不限於)結構-CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-且進一步包含下文中描述為"亞雜垸基"的那些基團。烷基(或亞垸基)通常將具有1至24個碳原子，其中具有10個或10個以下碳原子的那些基團是本文中所述的方法和組合物的特定實施例。"低碳烷基"或"低碳亞烷基"是通常具有8個或8個以下碳原子的較短鏈烷基或亞烷基。術語"胺基酸"指的是天然存在和非天然胺基酸，以及以類似於天然存在胺基酸的方式起作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然編碼胺基酸為20種常見胺基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬醯胺、天冬氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸以及纈氨酸)以及焦賴氨酸和硒半胱氨酸。胺基酸類似物指的是具有與天然存在胺基酸相同的基本化學結構(即，與氫、羧基、氨基以及R基團結合的a-碳)的化合物，諸如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞碸、甲硫氨酸甲基鋶。所述類似物可具有經修飾R基團(諸如，正亮氨酸)或經修飾肽主鏈，但仍保留與天然存在胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸在本文中可由其通常已知的三字母符號或由IUPAC-IUB生物化學命名委員會(IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommission)推薦的單字母符號稱呼。同樣地，核苷酸可由其通常接受的單字母代碼稱呼。"氨基末端修飾基團"指的是可連接至多肽的氨基末端的任何分子。類似地，"羧基末端修飾基團"指的是可連接至多肽的羧基末端的任何分子。末端修飾基團包含(但不限於)各種水溶性聚合物、肽或蛋白質，諸如血清白蛋白或增加肽的血清半衰期的其它部分。除非另有說明，否則術語"芳基"意謂可為單環或稠合在一起或共價連接的多環(包含(但不限於)1至3個環)的多不飽和芳族烴取代基。術語"雜芳基"指的是含有1至4個選自N、O以及S的雜原子的芳基(或環)，其中氮原子和硫原子可視情況經氧化，且氮原子可視情況經季銨化。雜芳基可通過雜原子連接至分子的其餘部分。芳基和雜芳基的非限定性實例包含苯基、l-萘基、2-萘基、4-聯苯基、l-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁哇基、5-異噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡澱基、4-吡啶基、2-嘧澱基、4-嘧啶基、5-苯並噻唑基、嘌呤基、2-苯並咪唑基、5-吲哚基、l-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基以及6-喹啉基。上述芳基和雜芳基環系統中的每一者的取代基是選自下文中所述的可接受的取代基的群組。為了簡便起見，當與其它術語組合使用(包含(但不限於)芳氧基、芳基硫氧基、芳烷基)時，術語"芳基"包含如上所定義的芳基環與雜芳基環。因此，術語"芳垸基"或"垸芳基"意謂包含芳基是連接至烷基的那些基團(其包含(但不限於)苄基、苯乙基、吡啶基甲基以及其類似基團)，其中所述烷基包含碳原子(包含(但不限於)亞甲基)已由(例如)氧原子代替的那些焼基(包含(但不限於)苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(l-萘基氧基)丙基以及其類似基團)。"雙官能聚合物"指的是包括兩個能夠與其它部分(包含(但不限於)胺基酸側基團)特異性反應以形成共價鍵或非共價鍵的離散官能團的聚合物。具有一個與特定生物活性組分上的基團有反應性的官能團和與第二生物組分上的基團有反應性的另一基團的雙官能連接子可用於形成包含生物活性組分、雙官能連接子以及第二生物活性組分的接合物。已知多種用於將各種化合物與肽連接的程序和連接子分子。例如參看歐洲專利申請案第188,256號、美國專利第4,671,958號、第4,659,839號、第4,414,148號、第4,699,784號、第4,680,338號以及第4,569,789號，其是以引用的方式併入本文中。"多官能聚合物"指的是包括兩個或兩個以上能夠與其它部分(包含(但不限於)胺基酸側基團)特異性反應以形成共價鍵或非共價鍵的離散官能團的聚合物。雙官能聚合物或多官能聚合物可具有任何所需長度或分子量，且可經選定以在連接至多肽的一個或一個以上分子與其結合搭配物或多肽之間提供特定所需間隔或構象。當在本文中使用時，術語"生物活性分子"、"生物活性部分"或"生物活性劑"意謂可影響與有機體(包含(但不限於)病毒、細菌、噬菌體、轉座子、朊病毒、昆蟲、真菌、植物、動物以及人類)有關的生物系統、路徑、分子或相互作用的任何物理或生物化學性質的任何物質。具體來說，如本文中所使用的生物活性分子包含(但不限於)意欲用於診斷、治癒、緩解、治療或預防人類或其它動物的疾病，或以其他方式增強人類或動物的身體或精神健康的任何物質。生物活性分子的實例包含(但不限於)肽、蛋白質、酶、小分子藥物、硬藥(harddrug)、軟藥(softdrug)、碳水化合物、無機原子或分子、染料、脂質、核苷、放射性核素、寡核苷酸、毒素、細胞、病毒、脂質體、微粒以及膠團。適用於本文中所述的方法和組合物的生物活性劑的種類包含(但不限於)藥物、前藥、放射性核素、顯像劑、聚合物、抗生素、殺真菌劑、抗病毒劑、消炎藥、抗腫瘤劑、心血管藥物、抗焦慮劑、激素、生長因子、類固醇藥物、微生物來源的毒素以及其類似物。如本文中所使用，"共摺疊"特定地指使用至少兩種彼此相互作用的多肽且使得未摺疊或不當摺疊的多肽轉變為天然的適當摺疊的多肽的再摺疊過程、反應或方法。如本文中所使用，"比較窗"包含提及選自由20至600、通常約50至約200、更通常約100至約150組成的群組的連續位置數目中的任一者的區段，其中可將序列與具有相同數目的連續位置的參考序列在將兩個序列最佳比對後進行比較。用於比較的序列的比對方法在所屬領域中為熟知的。可由以下方法進行用於比較的序列的最佳比對，其包含(但不限於)Smith禾卩Waterman(1970)X;^/.Ma仇2:482c的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(1970)J!Mo/.所o/.48:443的同源性比對算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Ato'/.Sc/.85:2444的相似性搜索方法；所述算法的計算機化實施(WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.，Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA);或手工比對和目測檢査(例如參看Ausubel等人，Ci^/"eW/Vofocokz'"Mo/ecw^w5!'o/ogy(1995增幹U))。適於測定序列一致性百分比和序列相似性的算法的一個實例為BLAST和BLAST2.0算法，其分別描述於Altschul等人，(1997)Wmc.^c/A及m.25:3389-3402和Altschul等人，(1990)乂Mo/.祝o/.215:403-410中。執行BLAST分析的軟體可通過國家生物技術信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)公開獲得。BLAST算法參數W、T以及X確定比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(對於核苷酸序列)使用字長(W)為11、期望值(E)為10、M=5、N=-4以及兩條鏈的比較作為默認值。對於胺基酸序列，BLASTP程序使用字長為3、期望值(E)為10和BLOSUM62計分矩陣(參看Henikoff和Henikoff(1992)Prac.M//,JcW.Sc/.t/&489:10915)比對(B)為50、期望值(E)為10、M=5、N=-4以及兩條鏈的比較作為默認值。BLAST算法通常在"低複雜性"過濾器關閉的情況下執行。BLAST算法也執行兩個序列之間相似性的統計分析(例如參看Karlin和Altschul(1993)Ato/.XcadSc!'.t/&490:5873-5787)。由BLAST算法提供的相似性的一個量度為最小和概率(P(N))，其提供兩個核苷酸或胺基酸序列之間偶然會發生匹配的概率的指示。舉例來說，如果在測試核酸與參考核酸的比較中，最小和概率小於約0.2，小於約O.Ol,或小於約0.001，那麼就認為所述核酸與參考序列相似。術語"保守性修飾變體"適用於胺基酸與核酸序列。對於特定核酸序列來說，"保守性修飾變體"指的是編碼一致或基本上一致的胺基酸序列的核酸，或其中所述核酸不將胺基酸序列編碼成基本上一致的序列。由於遺傳密碼的簡併性，大量功能上相同的核酸編碼任何給定蛋白質。舉例來說，密碼子GCA、GCC、GCG以及GCU都編碼胺基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密碼子指定的每一位置處，密碼子可改變為所述相應密碼子中的任一者而不改變所編碼的多肽。所述核酸變異為"沉默變異"，其為保守性修飾變異中的一種。編碼多肽的本文中的每一核酸序列也描述核酸的每一可能沉默變異。所屬領域的技術人員應認識到，核酸中的各密碼子(除通常僅為甲硫氨酸的密碼子的AUG和通常僅為色氨酸的密碼子的TGG之外)可經修飾以產生功能上相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的各沉默變異在各所述序列中為隱含的。至於胺基酸序列，所屬領域的技術人員應認識到，改變、添加或缺失所編碼序列中單一胺基酸或小百分比的胺基酸的對核酸、肽、多肽或蛋白質序列的個別取代、缺失或添加為變異使得胺基酸經化學上類似的胺基酸取代的"保守性修飾變體"。所屬領域的一般技術人員已知提供功能上類似的胺基酸的保守性取代列表。所述保守性修飾變體是在本文所述方法和組合物的多態變體、種間同源物以及等位基因的範圍之外且不將其排12除在外。以下八組各自含有關於彼此為保守性取代的胺基酸1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);2)天冬氨酸(D)、穀氨酸(E);3)天冬醯胺(N)、穀氨醯胺(Q);4)精氨酸(R)、賴氨酸(K);5)異亮氨酸(1)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);以及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(例如參看Creighton,iVofe/"5viS^w"wesA/o/ecw/ariVopeW/e>s(WHFreeman&Co.;第2版(1993年12月))。除非另外說明，否則自身或與其它術語組合的術語"環烷基"和"雜環烷基"分別表示"烷基"和"雜垸基"的環狀形式。因此，環烷基或雜環垸基包含飽和、部分不飽和以及完全不飽和的環鍵。另外，對於雜環垸基，雜原子可佔據雜環連接至分子的其餘部分的位置。環烷基的實例包含(但不限於)環戊基、環己基、l-環己烯基、3-環己烯基、環庚基以及其類似基團。雜環烷基的實例包含(但不限於)l-(l,2，5,6-四氫吡啶基)、l-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、l-哌嗪基、2-哌嗪基以及其類似基團。另外，所述術語涵蓋雙環和多環結構。類似地，自身或作為另一取代基的部分的術語"亞雜環烷基"意謂衍生自雜環垸基的二價基團，且自身或作為另一取代基的部分的術語"亞環烷基"意謂衍生自環烷基的二價基團。如本文中所使用，"變性劑"經定義為會造成蛋白質可逆性展開的任何化合物或物質。變性劑的強度將由特定變性劑的性質與濃度來決定。合適的變性劑可為離液劑、清潔劑、水可混溶有機溶劑、磷脂或兩種或兩種以上所述試劑的組合。合適的離液劑包含(但不限於)尿素、胍以及硫氰酸鈉。適用的清潔劑可包含(但不限於)強清潔劑，諸如十二垸基硫酸鈉或聚氧乙烯醚(例如Tween或Triton清潔劑)、十二垸基肌氨酸鈉(Sarkosyl);溫和非離子型清潔劑(例如，毛地黃皂苷(digitonin));溫和陽離子型清潔劑，諸如N》2,3-(二油烯氧基)-丙基-N,N,N-三甲基銨；溫和離子型清潔劑(例如膽酸鈉或脫氧膽酸鈉)；或兩性離子型清潔劑，其包含(但不限於)磺酸甜菜鹼(Zwiftergent)、3-(3-氯醯胺基丙基)二甲基銨基-l-丙烷硫酸鹽(CHAPS)以及3-(3-氯醯胺基丙基)二甲基銨基-2-羥基-l-丙垸磺酸鹽(CHAPSO)。水可混溶有機溶劑，諸如乙腈、低碳烷醇(尤其C2-C4垸醇，諸如乙醇或異丙醇)，或低碳烷二醇(尤其C2-Q烷二醇，諸如乙二醇)可用作變性劑。適用於本文中所述的方法和組合物中的磷脂可為天然存在的磷脂，諸如磷脂醯乙醇胺、磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲氨酸以及磷脂醯肌醇；或合成磷脂衍生物或變體，諸如二己醯基磷脂醯膽鹼或二庚醯基磷脂醯膽鹼。如本文中所使用，術語"有效量"指的是會在一定程度上減輕一種或一種以上所治療的疾病、病狀或病症的症狀的所投與的(經修飾)非天然胺基酸多肽的量。可投與含有本文中所述的(經修飾)非天然胺基酸多肽的組合物用於預防性、增強性和/或治療性治療。術語"增強"意謂增加或延長所要效應的效力或持續時間。因此，對於增強治療劑的效應來說，術語"增強"指的是在效力或持續時間方面增加或延長其它治療劑對系統的效應的能力。如本文中所使用，"增強有效量"指的是足以增強另一治療劑在所要系統中的效應的量。當用於患者中時，對於此用途有效的量應視以下因素而定疾病、病症或病狀的嚴重性和病程、先前的治療、患者的健康狀態和對藥物的反應以及主治醫師的判斷。如本文中所使用，術語"真核細胞"指的是屬於種系發生域真核生物域的有機體，諸如動物(包含(但不限於)哺乳動物、昆蟲、爬行動物、鳥類等)、纖毛蟲、植物(包含(但不限於)單子葉植物、雙子葉植物、藻類等)、真菌、酵母、鞭毛蟲、微孢子蟲、原生生物等。術語"官能團"、"活性部分"、"活化基團"、"離去基團"、"反應性位點"、"化學反應性基團"以及"化學反應性部分"在所屬領域和本文中用來指分子的獨特的可定義部分或單元。所述術語在化學領域中在一定程度上同義且在本文中用於指示執行一些功能或活性且可與其它分子反應的分子的部分。術語"滷素"包含氟、氯、碘以及溴。除非另有說明，否則自身或與另一術語組合的術語"雜垸基"意謂穩定的直鏈或支鏈或環狀烴基，或其組合，其由規定數目的碳原子和至少一個選自由O、N、Si和S組成的群組的雜原子組成，且其中氮原子和硫原子可視情況經氧化且氮雜原子可視情況經季銨化。雜原子O、N和S以及Si可位於雜烷基的任何內部位置或位於烷基連接至分子的其餘部分的位置處。實例包含(但不限於)-CH2-CH2-0-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2，-S(0)-CH3、-CH2-CH2-S(0)2-CH3、-CH=CH-0-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH=N-OCH3以及-CHNCH-N(CH3)-CH3。至多兩個雜原子可相鄰，諸如，-CH2-NH-OCH3和-CH2-0-Si(CH3)3。類似地，自身或作為另一取代基的部分的術語"亞雜垸基"意謂衍生自雜烷基的二價基團，例如(但不限於)-CH2-CH2-S-CH2CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。對於亞雜烷基來說，相同或不同的雜原子也可佔據鏈的一端或兩端(包含(但不限於)亞垸基氧基、亞垸基二氧基、亞垸基氨基、亞烷基二氨基、氨基氧基亞垸基以及其類似基團)。此外，對於亞垸基和亞雜烷基鍵聯基團來說，由鍵聯基團的化學式書寫的方向來暗示鍵聯基團的無方向性。舉例來說，式《(0)211'-表示-<:(0)211'-與-r'c(o)2-。術語"一致"或"一致性"百分比在兩個或兩個以上核酸或多肽序列的情況下，指的是相同的兩個或兩個以上的序列或子序列。當經比較窗比較且比對最大符合率或使用以下序列比較算法中的一種或通過手工比對且目測檢查測量指定區域時，如果序列具有相同(即，在指定區域上具有約60%的一致性，視情況約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%的一致性)的胺基酸殘基或核苷酸百分比，那麼序列為"實質上一致"。這一定義也指測試序列的互補序列。一致性可存在於長度為至少約50個胺基酸或核苷酸的區域中，或長度為75-100個胺基酸或核苷酸的區域中，或(在未指定時)在聚核苷酸或多肽的整個序列中。對於序列比較來說，通常一個序列充當測試序列與其進行比較的參考序列。當使用序列比較算法時，將測試序列與參考序列輸入電腦中，必要時指定子序列坐標，且指定序列算法程序參數。可使用默認程序參數，或可指定替代參數。隨後序列比較算法基於程序參數計算測試序列相對於參考序列的序列一致性百分比。當術語"經分離"是應用於核酸或蛋白質時，其表示核酸或蛋白質不含至少一些在天然狀態下與其結合的細胞組分，或核酸或蛋白質已濃縮到大於其活體內或活體外產生的濃度的含量。其可呈均質狀態。經分離物質可為乾燥或半乾燥狀態，或為溶液(包含(但不限於)水溶液)形式。其可為包括其它醫藥學上可接受的載劑和/或賦形劑的醫藥組合物的組分。純度和均質性通常使用分析化學技術測定，所述技術諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相色譜。為製劑中所存在的主要物質的蛋白質實質上經純化。具體來說，經分離基因是自側接基因且編碼蛋白質而非所關注基因的開放閱讀框分離。術語"經純化"表示核酸或蛋白質在電泳凝膠中產生實質上一個條帶。其尤其可意謂核酸或蛋白質至少85%純、至少卯％純、至少95%純、至少99%或更純。術語"鍵"或"連接子"本文中用來指通常因化學反應的結果而形成且通常為共價鍵的基團或鍵。水解穩定鍵意謂所述鍵在水中實質上穩定且在適用pH值下(包含(但不限於)在生理條件下)長期、或許甚至無限期不與水反應。水解不穩定或可降解鍵意謂所述鍵可在水中或水溶液(包含例如血液)中降解。酶促不穩定或可降解鍵意謂所述鍵可由一種或一種以上酶降解。如在所屬領域中所了解，PEG和相關聚合物可在聚合物主鏈中或在聚合物主鏈與聚合物分子的一個或一個以上末端官能團之間的連接子基團中包含可降解鍵。舉例來說，由PEG羧酸或活化PEG羧酸與生物活性劑上的醇基反應所形成的酯鍵通常在生理條件下水解以釋放生物活性劑。其它水解可降解鍵包含(但不限於)碳酸酯鍵；由胺與醛反應形成的亞胺鍵；由醇與磷酸酯基反應形成的磷酸酯鍵；作為醯肼與醛的反應產物的腙鍵；作為醛與醇的反應產物的縮醛鍵；作為甲酸鹽與醇的反應產物的原酸酯鍵；由胺基(包含(但不限於)在諸如PEG的聚合物末端處的胺基)與肽的羧基形成的肽鍵；以及由亞磷醯胺基(包含(但不限於)在聚合物末端處的亞磷醯胺基)與寡核苷酸的5'羥基形成的寡核苷酸鍵。如本文中所使用，術語"培養基"包含可支撐或容納任何宿主細胞的任何培養基、溶液、固體、半固體或剛性支撐物，所述宿主細胞包含細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞、植物宿主細胞、真核宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、CHO細胞、原核宿主細胞、大腸桿菌(￡.co/Z)或假單胞菌(Pseudomonas)宿主細胞以及細胞內含物。因此，這一術語涵蓋宿主細胞已生長於其中的培養基，例如多肽已分泌於其中的培養基，包含增殖步驟之前或之後的培養基。這一術語也可涵蓋含有宿主細胞溶解產物的緩衝液或試劑，諸如在細胞內產生多肽且宿主細胞經溶解或破裂以釋放多肽的情況下。本文中所揭露的(經修飾)非天然胺基酸多肽的"代謝物"是在(經修飾)非天然胺基酸多肽經代謝時形成的(經修飾)非天然胺基酸多肽的衍生物。術語"活性代謝物"指的是在(經修飾)非天然胺基酸多肽經代謝時形成的(經修飾)非天然胺基酸多肽的生物活性衍生物。術語"經代謝"指的是特定物質由有機體改變的過程的總和(包含(但不限於)水解反應和由酶催化的反應)。關於新陳代謝的其它信息可獲自ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,第9版，McGraw-Hill(1996)。本文中所揭露的(經修飾)非天然胺基酸多肽的代謝物可通過將(經修飾)非天然胺基酸多肽投與宿主且分析來自宿主的組織樣品來鑑別，或通過將(經修飾)非天然胺基酸多肽與肝細胞一起活體外培育且分析所得化合物來鑑別。如本文中所使用，術語"經修飾"指的是存在對多肽的翻譯後修飾。形式"(經修飾)"術語意謂所討論的多肽視情況經修飾，即所討論的多肽可經修飾或未經修飾。如本文中所使用，術語"經調節的血清半衰期"意謂(經修飾)多肽相對於其非未經修飾形式的循環半衰期的正改變或負改變。血清半衰期是通過在投與多肽後的各個時間點取血液樣品且測定每一樣品中那種分子的濃度來測量。血清濃度與時間的相關性使16得可以計算血清半衰期。血清半衰期理想地增加至少約兩倍，但較小的增加可能適用，例如當其使得能夠得到令人滿意的給藥方案或避免毒性效應時。在一些實施例中，增加為至少約3倍、至少約5倍或至少約10倍。如本文中所使用，術語"經調節的治療半衰期"意謂治療有效量的(經修飾)多肽相對於其未經修飾形式的半衰期的正改變或負改變。治療半衰期是通過在投藥後的各個時間點測量分子的藥物動力學和/或藥效學性質來測量。增加的治療半衰期理想地使得能夠得到尤其有益的給藥方案、尤其有益的總劑量，或避免不當效應。在一些實施例中，治療半衰期的增加由效力增加、經修飾分子與其標靶的結合增加或降低、酶(諸如蛋白酶)對分子的分解增加或降低或未經修飾分子的另一參數或作用機制的增加或降低而產生。如本文中所使用，術語"非真核生物"指的是非真核有機體。舉例來說，非真核有機體可屬於真細菌(Eubacteria)(其包含(但不限於)大腸桿菌(&c/zm'c//aco//)、嗜熱棲熱菌(77zer附ws^zerwop/zz7w51)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(5ac/〃wi1Wearaf/zer附op/n7M)、螢光假單胞菌(屍seMf/omo^uw/7wo;-esce7S)、銅綠假單胞菌(i^se"do附owawaerwgiwojaO、惡臭假單胞菌(i^e^omo"w/7w"必)等)種系發生域，或古細菌(Archaea)(其包含(但不限於)詹氏甲烷球菌(A/e^2"wococcw51/aww<xycW/)、熱自養甲烷桿菌(Af"/tf"o6flc/en'ww^2er附oaWWrapWcwm)、諸如沃氏嗜鹽富饒菌(//c^o/emxvoZca"")和嗜鹽桿菌(//a/okj"en'ww)物種7^CW的嗜鹽桿菌，閃爍古生球菌(v4rc/meog/oZnw/w/gzWw;0、強烈熾熱球菌(/yococc^s/wn'oras)、掘越氏熱球菌(戶,ococa^/wr/A:(w//0、敏捷氣熱菌"￡wwp_yn/w/)gr"/x)等)禾中系發生域。"非天然胺基酸"指的是不為20種常見胺基酸或焦賴氨酸或硒半胱氨酸中的一種的胺基酸；可與術語"非天然胺基酸"同義使用的其它術語為"非天然編碼胺基酸"、"非天然胺基酸"、"非天然存在胺基酸"以及其各種帶有連字符和不帶連字符的形式。術語"非天然胺基酸"包含(但不限於)通過修飾天然編碼胺基酸(包含(但不限於)20種常見胺基酸或焦賴氨酸和硒半胱氨酸)天然存在但並不通過翻譯複合物自身併入生長中的多肽鏈中的胺基酸。不為天然編碼的天然存在胺基酸的實例包含(但不限於)N-乙醯葡糖氨基-L-絲氨酸、N-乙醯葡糖氨基-L-蘇氨酸以及O-磷醯基酪氨酸。術語"核酸"指的是脫氧核苷酸、脫氧核苷、核苷或核苷酸以及其單鏈或雙鏈形式的聚合物。除非特定限制，否則所述術語涵蓋含有具有與參考核酸類似的結合性質且以類似於天然存在核苷酸的方式代謝的天然核苷酸的已知類似物的核酸。除非特定限制，否則所述術語也指包含PNA(肽基核酸)、反義技術中使用的DNA的類似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯以及其類似物)的寡核苷酸類似物。除非特定限制，否則特定核酸序列也暗示性涵蓋其保守性修飾變體(包含(但不限於)簡併密碼子取代)和互補序列以及明確指定的序列。具體來說，可通過產生一個或一個以上所選(或全部)密碼子的第三位置經混合鹼基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現簡併密碼子取代(Batzer等人，7Vwc/"c爿czWi仏19:5081(1991);Ohtsuka等人，《/所o/.CAe附.260:2605-2608(1985);以及Rossolini等人，Mo/.Ce//.iVo6es8:91-98(1994))。如本文中所使用，術語"氧化劑"在蛋白質再摺疊方面定義為能夠從被氧化的化合物中移除電子的任何化合物或物質。合適的氧化劑包含(但不限於)氧化型穀胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化型二硫蘇糖醇、氧化型赤蘚糖醇(oxidizederythreitol)以及氧。多種氧化劑適用於本文中所述的方法和組合物中。如本文中所使用，術語"聚亞垸基二醇"指的是聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇以及其衍生物。術語"聚亞烷基二醇"涵蓋線性與分枝聚合物且平均分子量介於lkDa與100kDa之間。其它例示性實施例列出於(例如)商業供應商目錄中，諸如ShearwaterCorporation的目錄"用於生物醫學應用的聚乙二醇和衍生物"("PolyethyleneGlycolandDerivativesforBiomedicalApplications")(2001)。術語"多肽"、"肽"以及"蛋白質"在本文中可互換使用，且指胺基酸殘基的聚合物。即，針對於多肽的描述同樣適用於對肽的描述和對蛋白質的描述，且反之亦然。所述術語適用於天然存在胺基酸聚合物以及一個或一個以上胺基酸殘基為非天然胺基酸的胺基酸聚合物。如本文中所使用，所述術語涵蓋具有任何長度的胺基酸鏈，包含全長蛋白質，其中胺基酸殘基通過共價肽鍵連接。術語"經翻譯後修飾"指的是在天然或非天然胺基酸已併入多肽鏈中之後對所述胺基酸進行的任何修飾。僅舉例來說，所述術語涵蓋共翻譯活體內修飾、共翻譯活體外修飾(諸如在無細胞翻譯系統中)、翻譯後活體內修飾以及翻譯後活體外修飾。"前藥"指的是活體內轉變為母體藥物的藥劑。前藥通常適用，因為在一些情形中，其比母體藥物易於投藥。舉例來說，其可通過經口投藥生物利用，而母體藥物不可以。前藥也可具有優於母體藥物的改良的於醫藥組合物中的溶解性。在預防性應用中，將含有(經修飾)非天然胺基酸多肽的組合物投與易患特定疾病、病症或病狀或處於特定疾病、病症或病狀風險中的患者。所述量定義為"預防有效量"。在這一用途中，精確量也視患者的健康狀況、體重以及其類似因素而定。認為通過常規實驗(例如，劑量遞增臨床試驗)確定所述預防有效量完全是在所屬領域的技能範圍內。術語"經保護"指的是存在防止化學反應性官能團在某些反應條件下反應的"保護基"或部分。保護基會根據所保護的化學反應性基團的類型而改變。舉例來說，如果化學反應性基團為胺或醯肼，那麼保護基可選自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群組。如果化學反應性基團為硫醇，那麼保護基可為鄰吡啶基二硫化物。如果化學反應性基團為羧酸(諸如丁酸或丙酸)或羥基，那麼保護基可為節基或烷基，諸如甲基、乙基或叔丁基。本文中所述的方法和組合物中也可使用所屬領域中已知的其它保護基，包含對光不穩定的基團，諸如Nvoc和MeNvoc。僅舉例來說，阻斷/保護基可選自formulaseeoriginaldocumentpage19其它保護基描述於Greene禾口Wuts,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,第3版，JohnWiley&Sons,NewYork,NY，1999中，其是以引用的方式全部併入本文中。術語"重組宿主細胞"或"宿主細胞"指的是包含外源聚核苷酸的細胞，與插入所使用的方法無關，所述方法例如直接吸收、轉導、f配對或產生重組宿主細胞所屬領域中巳知的其它方法。外源聚核苷酸可維持為非整合型載體(例如，質粒)或可整合入宿主基因組中。如本文中所使用，術語"還原劑"在蛋白質再摺疊方面定義為將巰基維持為還原狀態且還原分子內或分子間雙硫鍵的任何化合物或物質。合適的還原劑包含(但不限於)二硫蘇糖醇(DTT)、2-巰基乙醇、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)以及還原型穀胱甘肽。多種還原劑適用於本文中所述的方法和組合物中。如本文中所使用的"再摺疊"描述將含有二硫鍵的多肽由不當摺疊或未摺疊狀態轉變為關於二硫鍵的天然或適當摺疊構象的任何過程、反應或方法。如本文中所使用，短語"與……選擇性(或特異性)雜交"指的是當複雜混合物(包含(但不限於)總細胞或文庫DNA或RNA)中存在特定核苷酸序列時，在嚴格雜交條件下分子僅與所述序列結合、二聯或雜交。短語"嚴格雜交條件"指的是如所屬領域中已知的低離子濃度和高溫度條件。通常，在嚴格條件下，探針會與核酸的複雜混合物(包含(但不限於)總細胞或文庫DNA或RNA)中的其目標子序列雜交，但不與複雜混合物中的其它序列雜交。嚴格條件具有序列依賴性且在不同環境下會不同。較長序列在較高溫度下特異性雜交。對核酸雜交的詳細t旨南可見於Tijssen,Ztf6ora/o^y7fec/mz'《we515foc/e附z'^str;v"awdAfo/ecM/ar5/0/ogy-i/^6n'c/feaf/oww"/ziVwc/e/c7Vo6es，"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"(1993)中。嚴格雜交條件通常經選擇為在確定離子濃度、pH值下比特異性序列的熱解鏈點(Tm)低約5'C-10'C。Tm是與標靶互補的探針的50M與標靶序列雜交處於平衡(當標靶序列過量存在時，在Tm下，平衡時50%的探針被佔據)時的溫度(在確定離子強度、pH值以及核酸濃度下)。嚴格條件可為在pH值為7.0至8.3下鹽濃度小於約l.OM鈉離子、通常約0.01M至1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)且溫度對於短探針(包含(但不限於)10至50個核苷酸)來說為至少約3(TC且對於長探針(包含(但不限於)大於50個核苷酸)來說為至少約6(TC的那些條件。嚴格條件也可通過添加去穩定劑(諸如，甲醯胺)來實現。對選擇性或特異性雜交來說，陽性信號可為至少兩倍背景、視情況10倍背景雜交。例示性嚴格雜交條件可如下50%甲醯胺，5XSSC和1。/。SDS，在42t:下培育，或5XSSC,1%SDS，在65。C下培育，其中在65。C下以0.2XSSC和0.1。/。SDS洗滌。所述洗滌可進行5分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘或更長時間。如本文中所使用，術語"個體"指的是動物，在一些實施例中，指的是哺乳動物，且在其它實施例中，指的是人類，其是治療、觀察或實驗的對象。如本文中所使用，術語"實質上經純化"指的是可實質上或基本上不含與其天然存在環境中可見的蛋白質通常相伴或相互作用的組分的多肽，在重組產生的多肽的情況下，所述環境即天然細胞或宿主細胞。可實質上不含細胞物質的多肽包含具有少於約30%、少於約25%、少於約20%、少於約15%、少於約10%、少於約5%、少於約4%、少於約3%、少於約2%或少於約1%(以乾重計)的汙染蛋白質的蛋白質製劑。當多肽或其變體由宿主細胞重組產生時，蛋白質可佔細胞乾重的約30%、約25%、約20%、約15%、約10%、約5%、約4%、約3%、約2%或約1%或更少。當多肽或其變休由宿主細胞重組產生時，蛋白質可以細胞乾重計以約5g/L、約4g/L、約3g/L、約2g/L、約lg/L、約750mg/L、約500mg/L、約250mg/L、約100mg/L、約50mg/L、約10mg/L或約1mg/L或更低濃度存在於培養基中。因此，如由本文中所述的方法所產生的"實質上經純化"的多肽可具有如由適當方法(諸如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC以及毛細管電泳)所測定至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%的純度，尤其至少約75%、80%、85%的純度，且更尤其至少約90%的純度、至少約95%的純度、至少約99%或更高的純度。術語"取代基"包含(但不限於)"無幹擾取代基"。"無幹擾取代基"是那些產生穩定化合物的基團。合適的無幹擾取代基或基團包含(但不限於)滷基、Q-Cu)垸基、C2-d。烯基、C2-d。炔基、d-do烷氧基、Cs-d2芳垸基、C3-d2環垸基、C4-d2環烯基、苯基、經取代苯基、甲苯基、二甲苯基、聯苯基、C2-Cu烷氧基烷基、C5-Cu垸氧基芳基、Cs-d2芳氧基垸基、C7-d2氧基芳基、d-C6烷基亞磺醯基、d-do烷基磺醯基、-(>Z)假Ai(/f7/ng，Nature370(4):389-391;以及Stemmer，(1994),DiV^4s/iMj9iwgrandom/ragmewfafz.onawdreassem&iy:vz'fnreco附6iwa^'ow/or附o/ecw/arevo/w"o",Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,91:10747-10751。類似地，由Genencor開發的DesignPath(可通過全球資訊網在genencor.com上獲得)視情況用於代謝路徑工程化，其包含(但不限於)工程化細胞中產生O-甲基-L-酪氨酸的路徑。此技術使用(包含(但不限於))經由功能基因組學以及分子演化和設計鑑別的新基因的組合在宿主有機體中重建現有路徑。DiversaCorporation(可通過全球資訊網在diversa.com上獲得)也提供用於快速篩檢基因文庫和基因路徑的技術(包含(但不限於))以產生新路徑。通常，利用工程化生物合成路徑產生的非天然胺基酸是以足以進行有效蛋白質生物合成(包含(但不限於)天然細胞量)，但未達到影響其它胺基酸的濃度或耗盡細胞資源的程度的濃度產生。以此方式在活體內產生的典型濃度為約10mM至約0.05mM。一旦細胞用包括用於產生特定路徑所需的酶的基因的質粒轉化且產生非天然胺基酸，那麼視情況使用活體內選擇以進一步優化用於核糖體蛋白質合成與細胞生長的非天然胺基酸的產生。VI.具有非天然胺基酸的多肽美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)和2003/0108885(第10/126,931號)；標題為"SiteSpecificIncorporationofKetoAminoAcidsintoProteins"的WO04/035743和標題為"ExpandingtheEukaryoticGeneticCode"的PCT公開案第WO04/094593號(其是以引用的方式全部併入本文中)中進一步描述的組合物和方法提供將至少一個非天然胺基酸併入多肽中。非天然胺基酸可存在於多肽的任何位置，包含多肽的任何末端位置或任何內部位置。本文中所述的非天然胺基酸多肽可以生物合成或非生物合成方式產生。生物合成意謂利用翻譯系統(細胞或非細胞)的任何方法，包含使用以下組分中的至少一種聚核苷酸、密碼子、tRNA以及核糖體。非生物合成意謂不利用翻譯系統的任何方法這種方法可進一步分成利用固態肽合成方法的方法、固相肽合成方法、利用至少一種酶的方法以及不利用至少一種酶的方法；當然任何所述亞類可重疊且許多方法可利用所述亞類的組合。本文中所述的方法、組合物、策略以及技術不限於多肽或蛋白質的特定類型、種類或家族。實際上，幾乎任何多肽可包含(但不限於)美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；美國專利申請公開案2003細82575(第10/126,927號)和2003/0108885(第10/126,931號)；標題為"SiteSpecificIncorporationofKetoAminoAcidsintoProteins"的WO04/035743、標題為"ExpandingtheEukaryoticGeneticCode"的PCT公開案第WO04/094593號以及標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的PCT公開案第WO05/074650號(其是以引用的方式全部併入本文中)中進一步描述的至少一種非天然胺基酸。所述非天然胺基酸多肽可如美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；美國專利申請公開案2003細82575(第10/126,927號)和2003/0108885(第10/126,931號)；標題為"SiteSpecificIncorporationofKetoAminoAcidsintoProteins"的WO04/035743、標題為"ExpandingtheEukaryoticGeneticCode"的PCT公開案第WO04/094593號以及標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的PCT公開案第WO05/074650號(其是以引用的方式全部併入本文中)中所述進一步修飾或所述非天然胺基酸多肽可不經進一步修飾即使用。一方面，組合物包含至少一種具有至少一個(包含(但不限於)至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或至少十個或十個以上)非天然胺基酸的蛋白質。多肽可包括一個或一個以上天然胺基酸取代。雖然美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號(其是以引用的方式全部併入本文中)中進一步描述的非天然胺基酸多肽的實施例可通過固相肽合成方法(例如，在固體樹脂上)、液相肽合成方法和/或無需酶輔助化學合成，但本文所述的非天然胺基酸多肽的其它實施例允許通過細胞膜、細胞提取物或溶胞物系統或通過活體內系統(即，使用原核或真核細胞的細胞機構)合成。VH.包括核酸和寡核苷酸的組合物和方法A.所用通用重組核酸方法美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；和標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的PCT公開案WO05/074650(其是以引用的方式全部併入本文中)討論編碼所關注的多肽(例如包括GH多肽)的核酸以及可如何使用重組方法將其加以分離、克隆且通常改造。所述實施例用於(包含(但不限於))蛋白質表達或在產生來源於多肽的變體、衍生物、表達序列盒或其它序列的期間使用。在一些實施例中，編碼多肽的序列與異源啟動子可操作性連接。可以母體多肽的胺基酸序列為基礎來合成編碼包括非天然編碼胺基酸的多肽的核苷酸序列，且隨後改變核苷酸序列以實現相關胺基酸殘基的引入(即，併入或取代)或移除(即，缺失或取代)。可根據常規方法通過定點突變誘發來方便地修飾核苷酸序列。或者，核苷酸序列可由化學合成(包含(但不限於)通過使用寡核苷酸合成器，其中寡核苷酸是根據所需多肽的胺基酸序列來設計)來製備，且優先選擇在將產生重組多肽的宿主細胞中偏好的那些密碼子。舉例來說，可通過PCR、連接或連接鏈式反應來合成且組裝編碼所需多肽的部分的若干小寡核苷酸。例如參看Barany等人，Prac.臉f/.88:189-193(1991);U.S.6,521,427，其是以引用的方式併入本文中。B.選擇密碼子美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；和標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的PCT公開案WO05/074650(其是以引用的方式全部併入本文中)中進一步描述的方法和組合物內所涵蓋的選擇密碼子擴展蛋白質生物合成機構的遺傳密碼子框架。舉例來說，選擇密碼子包含(但不限於)獨特三鹼基密碼子、無義密碼子(諸如終止密碼子，包含(但不限於)琥珀密碼子(UAG)或蛋白石密碼子(UGA)、赭石密碼子)、非天然密碼子、四個或四個以上鹼基的密碼子、稀有密碼子或其類似密碼子。可引入所需基因中的選擇密碼子的數目範圍很廣，其包含(但不限於)在編碼所關注多肽的至少一部分的單一聚核苷酸中存在一個或一個以上、兩個或兩個以上、三個或三個以上、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或10個以上。在一些情況下，所述方法涉及使用作為用於在活體內併入一個或一個以上非天然胺基酸的終止密碼子的選擇密碼子。可在真核宿主細胞無顯著擾動的情況下在活體內進行非天然胺基酸的併入。選擇密碼子也包括延長密碼子，包含(但不限於)四個或四個以上鹼基的密碼子，諸如，四個、五個、六個或六個以上鹼基的密碼子。對於給定系統來說，選擇密碼子也可包含天然三鹼基密碼子中的一種，其中內源系統不使用(或很少使用)所述天然鹼基密碼子。選擇密碼子視情況包含非天然鹼基對。所述非天然鹼基對進一步擴展現有遺傳代碼。對於活體內使用來說，非天然核苷可透過膜且經磷酸化以形成相應三磷酸酯。另外，增加的遺傳信息是穩定的且不被細胞酶破壞。翻譯旁路系統(translationalbypassingsystem)也可用於將非天然胺基酸併入所需多肽中。在某些實施例中，所關注蛋白質或多肽(或其部分)是由核酸編碼。通常，核酸包括至少一個選擇密碼子、至少兩個選擇密碼子、至少三個選擇密碼子、至少四個選擇密碼子、至少五個選擇密碼子、至少六個選擇密碼子、至少七個選擇密碼子、至少八個選擇密碼子、至少九個選擇密碼子、十個或十個以上選擇密碼子。VHI.包括非天然胺基酸的多肽的活體內產生可使用經修飾tRNA和tRNA合成酶在活體內產生多肽以加成到在天然存在系統中未編碼的胺基酸上或將其取代。用於在活體內產生包括非天然胺基酸的多肽的所有產生方法、篩檢方法和有機體進一步描述於美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)和2003/0108885(第10/126,931號)；標題為"ExpandingtheEukaryoticGeneticCode"的PCT公開案第WO04/094593號和標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的PCT公開案第WO05/074650號(其是以引用的方式全部併入本文中)中。產生使用在天然存在系統中未編碼的胺基酸的tRNA和tRNA合成酶的方法描述於(例如)美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)和2003/0108885(第10/126,931號)(其是以引用的方式全部併入本文中)中。所述方法涉及產生獨立於翻譯44系統(且因此有時被稱作"正交")的內源性合成酶和tRNA起作用的翻譯機構。在其它或另外實施例中，翻譯系統包括正交tRNA(O-tRNA)和正交氨醯基tRNA合成酶(O-RS)。在所屬
技術領域：
中已描述用於將特定合成胺基酸插入多肽中的多種正交tRNA和氨醯基tRNA合成酶，且其通常適用於產生非天然胺基酸多肽的方法中。使用0-tRNA/氨醯基-tRNA合成酶涉及選擇編碼非天然胺基酸的恃定密碼子。儘管可使用任何密碼子，但通常希望選擇在0-tRNA/氨醯基-tRNA合成酶表達於其中的細胞中很少或從未使用的密碼子。可使用所屬
技術領域：
中已知的突變誘發方法(包含(但不限於)位點特異性突變誘發、序列盒式突變誘發、限制選擇突變誘發等)將特定選擇密碼子引入聚核苷酸編碼序列中的適當位置中。A.在非真核細胞和真核細胞中的表達為獲得所克隆聚核苷酸的高水平表達，通常將編碼所需多肽的聚核苷酸亞克隆至含有指導轉錄的強啟動子、轉錄/翻譯終止子以及(對於編碼蛋白質的核酸來說)用於翻譯啟始的核糖體結合位點的表達載體中。所屬領域中熟知合適的細菌啟動子且其描述於(例如)Sambrook等人和Ausubel等人中。可使用進一步描述於美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)和2003/0108885(第10/126,931號)；標題為"ExpandingtheEukaryoticGeneticCode"的PCT公開案第WO04/094593號和標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的PCT公開案第WO05/074650號(其是以引用的方式全部併入本文中)中的細菌表達系統和真核宿主細胞或非真核宿主細胞系統來以較大適用量生物合成包括非天然胺基酸的蛋白質。1.表達系統、培養以及分離所需多肽可表達於任何數目的合適表達系統(包含(例如)酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞、假單胞菌細胞以及細菌)中。例示性表達系統的描述進一步描述於美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；美國專利申請公開案2003/0082575(第10/126,927號)和2003/0108885(第10/126,931號)；標題為"ExpandingtheEukaryoticGeneticCode"的PCT公開案第WO04/094593號和標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的PCT公開案第WO05/074650號(其是以引用的方式全部併入本文中)中。2.非天然胺基酸多肽的純化通用純化方法可對包括所需多肽的細胞溶胞物、提取物、培養基、包涵體、宿主細胞的周質空間、宿主細胞的細胞質或其它材料或由任何分離步驟得到的混合物執行多種分離步驟中的任一種，所述任何分離步驟包含(但不限於)親和力色譜、離子交換色譜、疏水相互作用色譜、凝膠過濾色譜、高效液相色譜("HPLC")、反相-HPLC("RP-HPLC")、膨脹床吸附或其任何組合和/或重複且以任何適當順序執行。通用純化方法、設備、優選實施例以及其它純化技術進一步描述於美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的WO05/074650(其是以引用的方式全部併入本文中)中。B.活體內翻譯後修飾通過在真核細胞中產生具有至少一個非天然胺基酸的所關注的蛋白質或多肽，蛋白質或多肽包含真核翻譯後修飾。在某些實施例中，蛋白質包含至少一個非天然胺基酸和至少一個由真核細胞在活體內產生的翻譯後修飾，其中翻譯後修飾不是由原核細胞產生。舉例來說，翻譯後修飾進一步描述於美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；和標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的WO05/074650(其是以引用的方式全部併入本文中)中。非天然胺基酸的一個優點在於其存在可用於添加其它分子的其它化學部分。所述修飾可在真核或非真核細胞中活體內產生或在活體外產生。因此，在某些實施例中，翻譯後修飾是通過非天然胺基酸進行。IX.在替代系統中的表達己使用若干種策略以在非重組宿主細胞、突變宿主細胞或無細胞系統中將非天然胺基酸引入蛋白質中。所述系統也適用於製造非天然胺基酸多肽。胺基酸經諸如Lys、Cys和Tyr的反應性側鏈衍生化使得賴氨酸轉化為N、乙醯基-賴氨酸。化學合成也提供併入非天然胺基酸的直接方法。通過肽片段的酶促連接和天然化學連接的新近發展，有可能製造較大蛋白質。例如參看P.E.Dawson和S.B.H.Kent,Annu.Rev.Biochem,69:923(2000)。化學肽連接和天然化學連接描述於美國專利第6,184,344號、美國專利公開案第2004/0138412號、美國專利公開案第2003/0208046號、WO02/098902以及WO03/042235中，其是以引用的方式併入本文中。已使用能夠支持蛋白質生物合成的將經所需非天然胺基酸以化學方式醯化的抑制tRNA添加到活體外提取物中的通用活體外生物合成方法將IOO個以上非天然胺基酸位點特異性地併入幾乎任何大小的多種蛋白質中。例如參看V.W.Cornish,D.Mendel以及P.GSchultz,Angew.Chem.Int.Ed.End.1995,34:621(1995);C丄Noren,S丄Anthony-Cahill,M.C.Gri伍th，RGSchultz,Jgewera/w"/zod/orwYe-印ec訴cz'wcor/)on3"owo/w朋^ayi/amz.woa"Wsz'ntopraf".ws,Science244:182-188(1989);以及J.D.Bain,C.GGlabe,T.A.Dix,A.R.Chamberlin,E.S.Diala,5—57'/"e-印e"yc/wco^or加'owo/atw朋a/wfl/a/m.woac/(ia/o/y戸W叔J.Am.Chem.Soc.111:8013-8014(1989)。已將多種官能團引入用於研究蛋白質穩定性、蛋白質摺疊、酶機制以及信號轉導的蛋白質中。已開發被稱作選擇性壓力併入的活體內方法以使用野生型合成酶的雜亂性。例如參看N.Budisa，C.Minks,S.Alefelder,W.Wenger，RM.Dong,L.Moroder以及R.Huber，FASEBJ..13:41(1999)。使向細胞供應特定天然胺基酸的相關代謝路徑已關閉的營養缺陷型菌株生長於含有有限濃度的天然胺基酸的基本培養基中，而標耙基因的轉錄受到抑制。在穩定生長期開始時，天然胺基酸耗盡且由非天然胺基酸類似物代替。重組蛋白質表達的誘導使得含有非天然類似物的蛋白質累積。舉例來說，使用這種策略將鄰氟苯丙氨酸、間氟苯丙氨酸以及對氟苯丙氨酸併入蛋白質中，且其在紫外光譜中顯示兩個可容易地鑑別的特徵性肩，例如參看C.Minks,R.Huber，L.Moroder以及N.Budisa,Anal.Biochem..284:29(2000);三氟甲硫氨酸已用於代替噬菌體T4溶菌酶中的甲硫氨酸以通過19FNMR研究其與殼寡糖配位體的相互作用，例如參看H.Duewel,E.Daub，V.Robinson以及J.F.Honek，Biochemistry,36:3404(1997);且三氟亮氨酸已代替亮氨酸併入，使得亮氨酸拉鏈蛋白質的熱和化學穩定性增加。例如參看Y.Tang,G.Ghirlanda，W.A.Petka,T.Nakajima,W.F.DeGrado以及D.A.Tirrell,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,40:1494(2001)。此外，己將硒代甲硫氨酸和碲代甲硫氨酸併入各種重組蛋白質中以促進X射線結晶學中相的解析。例如參看W.A.Hendrickson,J.R.Horton以及D.M.Lemaster,EMBOL,9:1665(1990);J.O.Boles,K.Lewinski,M.Kunkle,J.D.Odom,B.Dunlap，L.Lebioda以及M.Hatada,Nat.Struct.Biol.,1:283(1994);N.Budisa,B.Steipe,P.Demange,C.Eckerskorn，J.Kellermann以及R.Huber,Eur.J.Biochem.,230:788(1995);以及N.Budisa,W.Karnbrock,S.Steinbacher,A.Humm,L.Prade，T.Neuefeind,L.Moroder以及R.Huber,J.Mol.Biol.,270:616(1997)。具有烯或炔官能團的甲硫氨酸類似物也已有效併入，其允許通過化學方式對蛋白質進行其它修飾。例如參看J.C.M.vanHest和D.A.Tirrell,FEBSLett"428:68(1998);J.C.M.vanHest，K.L.Kiick禾QD.A.Tirrell,J.Am.Chem.Soc.122:1282(2000);以及K.L.Kiick和D.A.Tirrell,Tetrahedron,56:9487(2000);美國專利第6,586,207號；美國專利公開案第2002/0042097號，其是以引用的方式併入本文中。這種方法的成功取決於氨醯基-tRNA合成酶對非天然胺基酸類似物的識別，所述合成酶通常需要高選擇性以確保蛋白質翻譯的保真度。擴展這種方法的範疇的一種方式在於放寬氨醯基-tRNA合成酶的底物特異性，此已在有限數目的情況下達成。舉例來說，在大腸桿菌苯丙氨醯基-tRNA合成酶(PheRS)中由Gly置換Ala294可增加底物結合位點的大小，且導致對-Cl-苯丙氨酸(p-Cl-Phe)對tRNAPhe的醯化。參看，M.Ibba，RKast和H.Hennecke,Biochemistry,33:7107(1994)。含有這種突變型PheRS的大腸桿菌菌株允許對-Cl-苯丙氨酸或對-Br-苯丙氨酸代替苯丙氨酸併入。例如參看M.Ibba和H.Hennecke,FEBSLett..364:272(1995);以及N.Sharma,R.Furter，P.Kast以及D.A.Tirrell,FEBSLett..467:37,0、。類似地，證明大腸桿菌酪氨醯基-tRNA合成酶的胺基酸結合位點附近的點突變Phel30Ser允許重氮酪氨酸比酪氨酸更有效地併入。參看RHamano-Takaku，T.Iwama，S.Saito-Yano，K.Takaku,Y.Monden,M.Kitabatake,D.Soil以及S.Nishimura，J.Biol.Chem.,275:40324(2000)。在活體內將非天然胺基酸併入蛋白質中的另一種策略為修飾具有校對機制的合成酶。所述合成酶不能區分在結構上與同源天然胺基酸類似的胺基酸且因此將其活化。此錯誤在單獨位點上得到修正，使來自tRNA的錯裝配胺基酸去醯基化以保持蛋白質翻譯的保真度。如果合成酶失去校對活性，那麼錯活化的結構類似物可避開編輯功能且被併入。目前已用纈氨醯基-tRNA合成酶(ValRS)證實這種方法。參看V.Doring,H.D.Mootz,L.A.Nangle,T.L.Hendrickson,V.deCrecy-Lagard,P.Schimmel以及P.Marliere,Science,292:501(2001)。ValRS可以Cys、Thr或氨基丁酸(Abu)錯氨醯基化tRNAVal;隨後通過編輯域來水解所述非同源胺基酸。在大腸桿菌染色體的隨機突變誘發之後，選擇在ValRS的編輯位點中具有突變的突變型大腸桿菌菌株。這種編輯缺陷型ValRS錯誤地用Cys裝配tRNAVal。因為Abu與Cys在空間上類似(Cys的-SH基團由Abu中的-CH3代替)，所以當這種突變型大腸桿菌菌株在Abu存在的情況下生長時，突變型ValRS也將Abu併入蛋白質中。質譜分析證明在天然蛋白質中的各纈氨酸位置處約24%的纈氨酸由Abu代替。固相合成和半合成方法也已允許合成含有新穎胺基酸的多種蛋白質。舉例來說，參看以下公開案和其中引用的參考文獻，其為如下Crick,F.H.C.,Barrett,L.Brenner,S.Watts-Tobin，R.Gewera/o/cocfe/orp/"他/肌Nature,192:1227-1232(1961);Hofmann，K.,Bohn,H.poZypeWdes.XOTF7'T7zeo//7>razo/e-z>n'wA"/c卿腦c/^MZn'o/ogz'ca〃_ya"z've/eWdesf"c/wdz'"gAceChemRes,22:47-54(1989);Nakatsuka,T.,Sasaki,T.，Kaiser,E.T.屍e/"'c/esegwe"fco一/"gc加/，c/■ye7m'5>"^"/ce"2y7we//2z'osm6/z7/57'",JAmChemSoc,109:3808-3810(1987);Schnolzer，M.,Kent,SBH.Cow欲t/c"wg&yctoveto'"wgw"/rofe"eds戸f/ie"'cpep"'tfes:6ac化匿-ewgz',^W/fiy戸^ose,Science,256(5054):221-225(1992);Chaiken,I.M.Sew一wA"/c;e/7"'ifesam/prafe/叫CRCCritRevBiochem,11(3):255-301(1981);Offord，R.E./Vo"/"ewg/"ee〃力gc/zew/ca/附ea肌？ProteinEng.,1(3):151-157(1987);以及Jackson,D.Y"Burnier,J.，Quan,C,Stanley,M.,Tom,J.，Wells,J.A.jZ)e^"ecPeWf/eZ/ga>se/or7bto/5ywAe57jo/i/60肌c/eajejw"/CWa/_y"'cScience,266(5183):243(1994)。化學修飾已用於在活體外向蛋白質中引入多種包含輔因子、自旋標記以及寡核苷酸的非天然側鏈。例如參看Corey,D.R.,Schultz，P.G.Ge"era"o"0/ase《wewce邵ec(/cw'wg7e-欲a"(ie(ififeo:c>rz'6owwc/e<xye,Scicnc6,238(4832):1401-1403(1987);Kaiser,E.T.,LawrenceD.S.,Rokita,S.E.7Tec/ew/ca/7w0&yca"0wo/ewzywa/z'c，"yc"y,AnnuRevBiochem,54:565-595(1985);Kaiser，E.T.,Lawrence,D.S.C7e/m'ca/附由,z.owo/e"_yzmeac"'ves/to,Science,226(4674》505-511(1984》Neet，K.E.,NanciA,Koshland，D.E.iVo戸""0/腸/，雄《>,JBiol.Chem,243(24):6392-6401(1968);Polgar,L.etM丄.Bender,爿wewco由/m'wga^w/7z"/co^(y/or/wedwYe.77j/o/^w6n7/w.".J.AmChemSoc.88:3153-3154(1966);以及Pollack,S丄，Nakayama,G.Schultz,P.G./"加^c"'owq/^2wc/eo/7W/ess/ec加5ropz'cpraxesfwfoaw"60辦cow6/m'wgw7m,Science,242(4881):1038-1040(1988)。或者，使用經化學修飾氨醯基-tRNA的生物合成方法已用於將若干種生物物理探針併入在活體外合成的蛋白質中。參看以下公開案和其中所引用的參考文獻Brunner,J.iVew戶/o/"o/a6e"wgam/cmw/z'wAiwg附"/zo叔Annu.RevBiochem,62:483-514(1993);以及Krieg,U.C.,Walter,P.,Hohnson,A.E.i^WocTOw7/whwgo//7esz.gwa/se《wewceo/"oscewf/repra/ac">70/54-h7o^7/towpo/ypeWfife0/w'gwa/recogm'"'o"/w"c/e，Proc.Natl.Acad.Sci,83(22):8604-8608(1986)。先前已證明可通過向由含有所需琥珀無義突變的基因編程的蛋白質合成反應中添加化學氨醯基化的抑制tRNA而在活體外將非天然胺基酸位點特異性地併入蛋白質中。使用所述方法，可使用對特定胺基酸來說為營養缺陷型的菌株，用接近的結構同源物取代20種常見胺基酸中多種胺基酸，例如，用氟苯丙氨酸取代苯丙氨酸。例如參看Noren,C丄,Anthony-Cahill,Griffith,M.C.,Schultz，P.G.^4gewera/mW/zod/or57Ye邵ec(/k/wcor/ora"'owo/w朋她ra/ac/<iy/論pra/^/wi1,Science,244:182-188(1989);M.W.49Nowak等人，Science268:439-42(1995);Bain，J.D.,Glabe,C.G,Dix，T.A.，Chamberlin，A.R.，Diala，E.S.5/05jwAWcw'/"e邵ec訴c/"cor/om"'owo/awow-wa^a/otw/wo/Woa/o/y;ep"We,J.AmChemSoc.111:8013-8014(1989);N.Budisa等人，FASEBJ.13:41-51(1999);Ellman,J.A.,Mendel,D.,Anthony-Cahill,S.,Noren,C丄，Schultz,P.G5—"、w"/od/or/w/ro<^c/"gm朋加wm/歸/wo"Ye邵e"yca/(y/w/ojrato'叫MethodsinEnz"301-336(1992);以及Mendel,D.,Cornish,V.W.以及Schultz,P.G.S"e-Dzre"ec/Mi/togewew'sawExpawcfec/Cew"/cCWe，AnnuRevBiophvs.BiomolStruct.24，435-62(1995)。舉例來說，製備識別終止密碼子UAG的抑制tRNA且用非天然胺基酸使其化學氨醯基化。常規定點突變誘發用於在蛋白質基因中的所關注位點處引入終止密碼子TAG。伊J女口參看Sayers，J.R.,Schmidt,W.Eckstein,F.5'-3'Exowwc/eose/7/2(wjp/zo;"oA/oc^e-6a5^f/o"gwowc/eWzWe-力re"eJNucleicAcidsRes,16(3):791隱802(1988)。當將醯基化抑制tRNA和突變型基因組合於活體外轉錄/翻譯系統中時，回應UAG密碼子而併入非天然胺基酸，此舉得到在指定位置處含有所述胺基酸的蛋白質。使用^H]-Phe的實驗以及使用a-羥基酸的實驗證實所需胺基酸僅在由UAG密碼子指定的位置處併入且此胺基酸未在蛋白質中的任何其它位點處併入。例如參看Noren等人，同上文；Kobayashi等人，(2003)NatureStructuralBiology10(6):425-432;以及Ellman,J.A.,Mendel,D.,Schultz,P.GS"e-5pe"ycZwcorpora/7'owo/wove/6ac&6owe欲wc^wes/"fo;rato'"j1,Science,255(5041):197-200(1992)。tRNA可通過任何方法或技術(包含(但不限於)化學或酶促氨醯基化)經所需胺基酸氨醯基化。可由氨醯基tRNA合成酶或其它酶促分子(包含(但不限於)核糖核酸酶(ribozyme))來實現氨醯基化。術語"核糖核酸酶"可與"催化性RNA"互換。Cech和同事(Cech,1987，Science,236:1532-1539;McCorkle等人，1987,ConceptsBiochem.64:221-226)證實可充當催化劑(核糖核酸酶)的天然存在RNA的存在。然而，儘管僅已展示所述天然RNA催化劑作用於核糖核酸底物上以進行裂解和剪接，但關於核糖核酸酶的人工演化的新近發展己擴展對各種化學反應的催化作用的清單。研究已鑑別出可在其自身(2')3'-末端上催化氨醯基-RNA鍵的RNA分子(Illangakekare等人，1995Science267:643-647)，以及可將胺基酸自一個RNA分子轉移到另一個RNA分子的RNA分子(Lohse等人，1996,Nature381:442-444)。美國專利申請公開案2003/0228593(其是以引用的方式併入本文中)描述建構核糖核酸酶的方法和其在以天然編碼和非天然編碼胺基酸氨醯基化tRNA中的用途。可氨醯基化tRNA的底物固定形式的酶性分子(包含(但不限於)核糖核酸酶)可使得能夠進行氨醯基化產物的有效親和力純化。合適底物的實例包含瓊脂糖、瓊脂糖凝膠以及磁性珠粒。用於氨醯基化的底物固定形式的核糖核酸酶的製備和使用描述於ChemistryandBiology2003,10:1077-1084以及美國專利申請公開案2003/0228593中，其是以引用的方式併入本文中。化學氨醯基化方法包含(但不限於)由Hecht和同事(Hecht，S.M.Ace.Chem.Res.1992,25,545;Heckler,T.G.;Roesser，J.R.;Xu，C;Chang,P.;Hecht,S.M.Biochemistry1988,27，7254;Hecht,S.M.;Alford，B.L.;Kuroda,Y.;Kitano，S.J.Biol.Chem.1978,253，4517)以及由Schultz、Chamberlin、Dougherty以及其它人(Cornish,V.W.;Mendel,D.;Schultz，P.G.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995,34,621;Robertson,S.A.;Ellman,J.A.;Schultz,P.G.J.Am.Chem.Soc.1991，113,2722;Noren,C.J.;Anthony-Cahill,S.J.;Griffith,M.C;Schultz,P.G.Science1989，244,182;Bain,J.D.;Glabe，C.G.;Dix,T.A.;Chamberlin,A.R.J.Am.Chem.Soc.1989，111,8013;Bain,J.D.等人，Nature1992,356，537;Gallivan，J.P.;Lester,H.A.;Dougherty,D.A.Chem.Biol.1997,4，740;Turcatti等人，J.Biol.Chem.1996,271,19991;Nowak，M.W.等人，Science,1995,268,439;Saks,M.E.等人，J.Biol.Chem.1996,271,23169;Hohsaka,T.等人，J.Am.Chem.Soc.1999,121,34)介紹的那些方法，以避免在氨醯基化中使用合成酶。所述方法或其它化學氨醯基化方法可用於氨醯基化本發明的tRNA分子。用於產生催化性RNA的方法可涉及產生隨機化核糖核酸酶序列的單獨集合，對集合執行定向演化，就所需氨醯基化活性篩檢集合，且選擇展現所需氨醯基化活性的那些核糖核酸酶的序列。核糖核酸酶可包括有利於醯化活性的基元和/或區域，諸如GGU基元和富含U的區域。舉例來說，已報導富含U的區域可有利於胺基酸底物的識別，且GGU基元可與tRNA的3'末端形成鹼基對。GGU基元和富含U的區域組合起來同時促進胺基酸與tRNA的同時識別，且從而促進tRNA的3'末端的氨醯基化。可通過使用與tRNAAsncccxj接合的部分隨機化r24mini進行活體外選擇，接著系統性工程化在活性克隆中發現的一致序列來產生核糖核酸酶。由這種方法獲得的例示性核糖核酸酶被稱作"Fx3核糖核酸酶"且描述於美國公開申請案第2003/0228593號(其內容是以引用的方式併入本文中)中，其充當用於合成各種裝配有同源非天然胺基酸的氨醯基-tRNA的通用催化劑。可將氨醯基化tRNA核糖核酸酶固定於底物上以使得能夠有效親和力純化氨醯基化tRNA。合適底物的實例包含(但不限於)瓊脂糖、瓊脂糖凝膠以及磁性珠粒。可利用RNA的化學結構將核糖核酸酶固定於樹脂上，諸如RNA的核糖上的3'-順式二醇可經高碘酸鹽氧化以產生相應二醛以促進RNA在樹脂上的固定。可使用各種類型的樹脂(包含廉價醯肼樹脂)，其中還原性胺化使樹脂與核糖核酸酶之間的相互作用產生不可逆鍵聯。可通過此柱上氨醯基化技術顯著促進氨醯基-tRNA的合成。Kourouklis等人，Methods2005;36:239-4描述以管柱為基礎的氨醯基化系統。可以多種方式實現氨醯基化tRNA的分離。一種合適方法為以緩衝液從管柱洗提氨醯基化tRNA,其中所述緩衝液諸如具有10mMEDTA的乙酸鈉溶液、含有50mMN-(2-羥基乙基)哌嗪-N'-(3-丙烷磺酸)、12.5mMKCl(pH7.0)、10mMEDTA的緩衝液或簡單經EDTA緩衝的水(pH7.0)。可將氨醯基化tRNA添加到翻譯反應中以在由翻譯反應產生的多肽中的所選位置中併入用以氨醯基化tRNA的胺基酸。可使用本發明的氨醯基化tRNA的翻譯系統的實例包含(但不限於)細胞溶胞物。細胞溶胞物提供自所輸入mRNA活體外翻譯多肽所必需的反應組分。所述反應組分的實例包含(但不限於)核糖體蛋白質、rRNA、胺基酸、tRNA、GTP、ATP、翻譯起始和延伸因子以及與翻譯相關的其它因子。另外，翻譯系統可為分批翻譯或區隔式翻譯。分批翻譯系統將反應組分組合於單一隔室中，而區隔式翻譯系統將翻譯反應組分與可抑制翻譯效率的反應產物隔開。所述翻譯系統在市面上有售。此外，可使用偶合轉錄/翻譯系統。偶合轉錄/翻譯系統允許將所輸入DNA轉錄為相應mRNA，其轉而由反應組分進行翻譯。市售偶合轉錄/翻譯的實例為快速翻譯系統(RapidTranslationSystem;RTS，RocheInc.)。所述系統包含含有大腸桿菌溶菌液以提供諸如核糖體和翻譯因子的翻譯組分的混合物。另外，包含RNA聚合酶以將所輸入DNA轉錄為用於翻譯的mRNA模板。RTS可經由反應隔室(包含供應/廢料隔室和轉錄/翻譯隔室)之間插入的膜使用反應組分的區隔化。可由其它試劑(包含(但不限於)轉移酶、聚合酶、催化性抗體、多官能蛋白質以及其類似物)進行tRNA的氨醯基化。Stephan於Scientist2005年10月；第30-33頁中描述將非天然編碼胺基酸併入蛋白質中的其它方法。Lu等人在MolCell.2001年10月；8(4);759-69中描述將蛋白質與含有非天然胺基酸的合成肽化學連接(所表達蛋白質連接)的方法。微注射技術也已用於將非天然胺基酸併入蛋白質中。例如參看M.W.Nowak,P.C.Kearney,J.R.Sampson,M.E.Saks,C.G.Labarca,S.K.Silverman,W.G.Zhong,J.52Thorson,J.N.Abelson,N.Davidson,P.G.Schultz，D.A.Dougherty以及H.A.Lester,Science,268:439(1995);以及D.A.Dougherty,Curr.Opin.Chem.Biol.,4:645(2000)。向爪蟾(Xenopus)卵母細胞中共注射在活體外產生的以下兩種RNA物質在所關注胺基酸位置處具有UAG終止密碼子的編碼標靶蛋白質的mRNA和經所需非天然胺基酸氨醯基化的琥珀抑制tRNA。卵母細胞的翻譯機構隨後在由UAG指定的位置處插入非天然胺基酸。這種方法已允許通常不適用於活體外表達系統的整合膜蛋白質的活體內結構-功能研究。實例包含將螢光胺基酸併入速激肽神經激肽-2受體中以通過螢光共振能量轉移測量距離，例如參看G.Turcatti,K.Nemeth，M.D.Edgerton，U.Meseth,F.Talabot，M.Peitsch,J.Knowles,H.Vogel以及A.Chollet,J.Biol.Chem..271:19991(1996);併入生物素化胺基酸以鑑別離子通道中的表面暴露殘基，例如參看J.P.Gallivan,H.A.Lester以及D.A.Dougherty,Chem.Biol..4:739(1997);使用籠蔽酪胺酸類似物以實時監控離子通道中的構象變化，例如參看J.C.Miller,S.K.Silverman,P.M.England,D.A.Dougherty以及H.A.Lester,Neuron,20:619(1998);以及使用a羥基胺基酸以改變用於探測其選通機制的離子通道主幹。例如參看P.M.England,Y.Zhang,D.A.Dougherty以及H.A.Lester,￡^i，96:89(1999);以及T.Lu,A.Y.Ting，J.Mainland,L.Y.Jan,P.GSchultz和J.Yang,Nat.Neurosci.,4:239(2001)。在活體內直接將非天然胺基酸併入蛋白質中的能力提供以下優點突變型蛋白質的產率高、技術簡便、在細胞中或可能在活有機體中研究突變型蛋白質的可能性以及在治療性治療中使用所述突變型蛋白質。將具有各種大小、酸度、親核性、疏水性以及其它性質的非天然胺基酸包含入蛋白質中的能力可極大地擴展我們合理且系統性地操縱蛋白質結構的能力，以探測蛋白質功能且產生具有新穎,質的新蛋白質或有機體。然而，這一過程很困難，因為需要tRNA合成酶的複雜性質以在蛋白質翻譯中實現高保真度。在位點特異性地併入對-F-Phe的一次嘗試中，在對-F-Phe抗性、Phe營養缺陷型大腸桿菌菌株中使用酵母琥珀抑制tRNAPheCUA/苯丙氨醯基-tRNA合成酶對。例如參看R.Furter,ProteinSci.,7:419(1998)。使用無細胞(活體外)翻譯系統獲得聚核苷酸的表達也是可能的。翻譯系統可為細胞或無細胞翻譯系統，且可為原核或真核翻譯系統。細胞翻譯系統包含(但不限於)所需核酸序列可轉錄為mRNA且mRNA可翻譯的全細胞製劑，諸如滲透細胞或細胞培養物。無細胞翻譯系統在市面上有售且熟知許多不同類型和系統。無細胞系統的實例包含(但不限於)原核溶胞物，諸如大腸桿菌溶菌液；以及真核溶胞物，諸如麥芽提取物、昆蟲細胞溶胞物、兔網狀細胞溶胞物、兔卵母細胞溶胞物和人類細胞溶胞物。當所得蛋白質經糖基化、磷酸化或以其它方式修飾時，可優選真核提取物或溶胞物，因為許多所述修飾僅可能在真核系統中發生。一些所述提取物和溶胞物在市面上有售(Promega;Madison,Wis.;Stratagene;LaJolla,Calif.;Amersham;ArlingtonHeights,111.;GIBCO/BRL;GrandIsland,N.Y.)。也可用膜提取物(諸如含有微粒體膜的犬胰腺提取物)，其適於翻譯分泌型蛋白質。在可包含mRNA作為模板(活體外翻譯)或DNA作為模板(組合型活體外轉錄和翻譯)的所述系統中，由核糖體指導活體外合成。對於開發無細胞蛋白質表達系統已作出相當大的努力。例如參看Kim,D.M.和J.R.Swartz,am/74:309-316(2001);Kim，D.M.和J.R.Swartz，萬她c/wo/ogy22,1537-1542，(2000);Kim,D.M.和J.R.Swartz,16，385-390,(2000》Kim,D.M.和J.R.Swartz,所o^c/mo/ogv朋d5/oe"g/"eer/"g,66,180-188,(1999);以及Patnaik,R.和J.R.Swartz,所o^c/zm々薦24,862-868,(1998);美國專利第6,337,191號；美國專利公開案第2002/0081660號；WO00/55353;WO90/05785,其是以引用的方式併入本文中。可應用於非天然胺基酸多肽的表達的另一種方法包含mRNA-肽融合技術。例如參看R.Roberts和J.Szostak,屍rac.iVW/Jca^.Sc/,94:12297-12302(1997);A.Frankel等人，C&w&^y&10:1043-1050(2003)。在這種方法中，在核糖體上將與嘌呤黴素(puromycin)鍵聯的mRNA模板翻譯為肽。如果一種或一種以上tRNA分子己經修飾，那麼非天然胺基酸也可併入肽中。在已讀取最後一個mRNA密碼子之後，嘌呤黴素捕獲肽的C末端。如果發現所得mRNA-肽接合物在活體外檢定中具有引人關注的性質，那麼易於自mRNA序列揭示其特性。用這種方式，可篩檢非天然胺基酸多肽的文庫以鑑別具有所需性質的多肽。最近，已報導利用經純化組分的活體外核糖體翻譯，其允許合成經非天然編碼胺基酸取代的肽。例如參看A.Forster等人，/Voc.iV加/JcadScZ.100:6353(2003)。也可使用重構翻譯系統。經純化翻譯因子的混合物也已成功地用於將mRNA翻譯為蛋白質以及溶胞物或補充有經純化翻譯因子(諸如起始因子-l(IF-l)、IF-2、IF-3(a或0)、延伸因子T(EF-Tu)或終止因子)的溶胞物的組合。無細胞系統也可為偶合轉錄/翻譯系統，其中將DNA引入系統中，轉錄為mRNA且翻譯mRNA，如CwreWPwtoco"/"A/o/ecw/w(F.M.Ausubel等人編輯，WileyInterscience,1993)中所述，其是以引用的方式特定地併入本文中。於真核轉錄系統中轉錄的RNA可為異核RNA(hnRNA)或5'-端帽(7-甲基鳥苷)和3'-端polyA尾成熟mRNA的形式，此在某些翻譯系統中可為優點。舉例來說，在網狀細胞溶胞物系統中加帽mRNA以高效率翻譯。多肽的非天然胺基酸組分的翻譯後修飾已開發在蛋白質的活體內翻譯期間位點特異性地併入非天然胺基酸的方法、組合物、技術以及策略。這一技術通過併入具有與天然存在的胺基酸的側鏈化學正交的側鏈化學的非天然胺基酸，使得重組蛋白質的位點特異性衍生化成為可能。結果，方法、組合物、技術以及策略的主要優點在於現在可以確定的均質產物形式製備衍生蛋白質。上述非天然胺基酸多肽適用於(包含(但不限於))新穎療法、診斷學、催化性酶、工業酶、結合蛋白質以及(包含(但不限於))蛋白質結構和功能的研究。例如參看Dougherty,(2000)f/"MafMra/爿/m'wo^4c/cfeaw7Vo6eso//Vo/e/wS"M"wreFimc/iow,CurrentOpinioninChemicalBiology,4:645-652。上述非天然胺基酸多肽的其它用途包含(僅舉例來說)基於檢定、化妝品、植物生物學、環境、能量產生和/或軍事的用途。然而，上述非天然胺基酸多肽可經受進一步修飾以併入新的或經修飾的官能團，包含操縱多肽的治療功效、改良多肽的安全性概況、調節多肽的藥物動力學、藥理學和/或藥效學(例如，增加水溶性、生物可用性、增加血清半衰期、增加治療半衰期、調節免疫原性、調節生物活性或延長循環時間)、向多肽提供其它官能團、在多肽中併入標籤、標記或可檢測信號、易化多肽的分離性質以及前述修飾的任何組合。本文中所述的方法、組合物、策略以及技術不限於多肽或蛋白質的特定類型、種類或家族。實際上，幾乎任何多肽可包含至少一個非天然胺基酸。組合物可包含至少一種具有至少一個(包含(但不限於)至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或至少十個或十個以上)已經翻譯後修飾的非天然胺基酸的蛋白質。經翻譯後修飾的非天然胺基酸可相同或不同，包含(但不限於)在蛋白質中可存在包括l、2、3、4、5、6、7、8、9或10或10個以上不同經翻譯後修飾非天然胺基酸的l、2、3、4、5、6、7、8、9或10或10個以上不同位點。組合物可包含蛋白質中存在的特定胺基酸中的至少一個(但少於全部)經翻譯後修飾非天然胺基酸取代的蛋白質。對於具有超過一個翻譯後修飾非天然胺基酸的給定蛋白質來說，翻譯後修飾非天然胺基酸可相同或不同(包含(但不限於)所述蛋白質可包含兩個或兩個以上不同類型的翻譯後修飾非天然胺基酸，或可包含兩個相同的翻譯後修飾非天然胺基酸)。對於具有兩個以上翻譯後修飾非天然胺基酸的給定蛋白質來說，翻譯後修飾非天然胺基酸可相同、不同或為相同種類的多個翻譯後修飾非天然胺基酸與至少一個不同的翻譯後修飾非天然胺基酸的組合。舉例來說，翻譯後修飾可通過親核-親電子反應進行。目前用於選擇性修飾蛋白質的大多數反應涉及親核與親電子反應搭配物之間的共價鍵形成，其包含(但不限於)a-滷代酮與組氨酸或半胱氨酸側鏈的反應。在所述情況下通過蛋白質中親核殘基的數目和可接近性來確定選擇性。在本發明的蛋白質中，可使用其它選擇性更大的反應，諸如在活體外和活體內的非天然酮基胺基酸與醯肼或氨基氧基化合物的反應。例如參看Cornish等人，(1996)J.Am.Chem.Soc,118:8150-8151;Mahal等人，(1997)Science,276:1125-1128;Wang等人，(2001)Science292:498-500:Chin等人，(2002)J.Am.Chem.Soc.124:9026-9027:Chin等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci..99:11020-11024;Wang等人,(2003)Proc.Natl.Acad.Sci..100:56-61;Zhang等人，(2003)Biochemistry,42:6735-6746;以及Chin等人，(2003)Science,301:964-7。此允許用包含螢光團、交聯劑、糖衍生物以及細胞毒性分子的大量試劑選擇性標記幾乎任何蛋白質。也參看標題為"Glycoproteinsynthesis"的美國專利第6,927,042號，其是以引用的方式併入本文中。A.非天然胺基酸組分的修飾非天然胺基酸組分(其包含非天然胺基酸以及多肽或其它聚合物的非天然胺基酸部分)的各種修飾包含(但不限於)(i)使含羰基非天然胺基酸組分與含羥胺試劑反應以形成含肟非天然胺基酸組分；(ii)使含羥胺非天然胺基酸組分與含羰基試劑反應以形成含肟非天然胺基酸組分；(iii)通過肟交換反應，使由如(i)和(ii)中的羰基與羥胺的反應形成的含肟非天然胺基酸組分與不同含羰基試劑反應以形成新的含肟非天然胺基酸組分；(iv)使含二羰基非天然胺基酸組分與含羥胺試劑反應以形成含肟非天然胺基酸組分；(v)使含羥胺非天然胺基酸組分與含二羰基試劑反應以形成含肟非天然胺基酸組分；(vi)通過肟交換反應，使由如(iv)和(v)中的二羰基與羥胺的反應形成的含肟非天然胺基酸組分與不同含二羰基試劑反應以形成新的含肟非天然胺基酸組分；所述反應描繪於圖2中，其中經翻譯併入(或以其他方式併入)多肽中的胺基酸官能團(A)與反應物(B)反應以產生經修飾多肽。所述反應可進一步與聚合物(包含(例如)聚核苷酸、聚核苷、多糖或其組合)上的胺基酸官能團(A)發生，其中與反應物(B)的反應產生經修飾聚合物。為方便起見，本部分和本文中其它部分中所述的修飾使用(例如)"多肽"來說明各種修飾。然而，本文中所述的修飾同樣適用於併入其它分子(包含(但不限於)聚核苷酸、聚核苷、多糖、合成聚合物或其組合)中的非天然胺基酸。如本文所使用，術語"組分"指的是非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、含有非天然胺基酸的聚合物、含有選擇密碼子的核酸序列、與聚合物連接的非天然胺基酸多肽、與含有非天然胺基酸的聚合物連接的非天然胺基酸多肽、與核酸序列連接的非天然胺基酸多肽、與核酸序列連接的非天然胺基酸多肽；其各自可獨立地為多肽、非天然胺基酸多肽、核酸序列或聚合物的一部分或併入多肽、非天然胺基酸多肽、核酸序列或聚合物中。所述各個反應流程的描述己揭露於美國臨時專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號和第60/696,068號中，其各以引用的方式全部併入本文中。各以上臨時專利申請案中所提供的揭露內容全部適用於本文中所述的製備、檢測、純化、表徵以及使用非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽以及經修飾非天然胺基酸多肽的方法、組合物、技術以及策略中，適用的程度就如同所述揭露案完全呈示於本文中。使含羰基非天然胺基酸組分與含羥胺試劑反應以形成含肟非天然胺基酸組分可將具有含親電子劑側鏈(包含(但不限於)羰基，諸如醛、酯、硫代酯以及酮)的非天然胺基酸併入多肽中。將具有所述親電子側鏈的所述非天然胺基酸併入多肽中使得通過親核攻擊羰基使這一側鏈位點特異性衍生化成為可能。當攻擊親核試劑為羥胺時，將產生肟衍生多肽。用於衍生化和/或進一步修飾的方法可用在衍生化步驟之前或衍生化步驟之後純化的多肽進行。另外，衍生化步驟可在適度酸性到弱鹼性的條件(包含(例如)介於約2到約10的pH值之間，或介於約2到約8的pH值之間，或介於約4到約8的pH值之間)下進行。用含羥胺試劑或具有類似化學反應性的其它官能團修飾併入多肽中的非天然胺基酸的羰基側鏈產生含肟鍵的經修飾多肽。所述反應和所述經修飾多肽的所得結構展示於圖3中。本文中所述的某些實施例為含有具有包括肟基團的側鏈的非天然胺基酸的多肽。在其它實施例中，所述肟基團可經進一步修飾，僅舉例來說，諸如形成經掩蔽肟基團(其可容易地轉化為肟基團)、經保護肟基團(其在去保護之後，可容易地轉化為可用於其它化學反應的肟基團)或通過肟交換反應形成新的肟基團。所述經修飾多肽肟鍵的非限定性實例展示如下formulaseeoriginaldocumentpage58使含羥胺非天然胺基酸組分與含羰基試劑反應以形成含肟非天然胺基酸組分將含羥胺基團的非天然胺基酸併入多肽中允許與多種親電子基團(包含(但不限於)羰基，諸如酮、酯、硫代酯以及醛)反應。羥胺基團的親核性準許其在溫和條件下在水性溶液中與含有羰基官能團或具有類似化學反應性的其它官能團的多種分子有效且選擇性地反應以形成相應肟鍵。這一通過親核攻擊羰基進行的所述側鏈的位點特異性衍生化和/或進一步修飾可用在衍生化步驟之前或衍生化步驟之後純化的多肽進行。另外，衍生化步驟可在適度酸性到弱鹼性的條件(包含(例如)介於約2到約10的pH值之間，或介於約2到約8的pH值之間，或介於約4到約8的pH值之間)下發生。用含羰基試劑修飾併入多肽中的非天然胺基酸的羥胺基團得到含肟鍵的經修飾多肽。所述反應和所述經修飾多肽的所得結構展示於圖4中。本文中所述的某些實施例為含有具有包括肟基團的側鏈的非天然胺基酸的多肽。在其它實施例中，所述肟基團可經進一步修飾，僅舉例來說，諸如形成經掩蔽肟基團(其可容易地轉化為肟基團)、經保護肟基團(其在去保護之後，可容易地轉化為可用於其它化學反應的肟基團)或通過肟交換反應形成新的肟基團。所述經修飾多肽後鍵的非限定性實例展示如下"^^^T^5多肽或聚合物^o^V"多肽或聚合物"t多肽或聚合物"&通過肟交換反應，使由羰基與羥胺的反應形成的含肟非天然胺基酸組分與不同含羰基試劑反應以形成新的含肟非天然胺基酸組分含肟基團的非天然胺基酸允許與含有某些反應性羰基(包含(但不限於)醛、酯、硫代酯以及酮)的多種試劑反應以形成包括新肟基團的新的非天然胺基酸(其可併入多肽中)。所述肟交換反應允許使非天然胺基酸多肽進一步官能化。用含羰基試劑或具有類似化學反應性的其它官能團修飾併入多肽中的非天然胺基酸的肟側鏈產生含新肟鍵的經修飾多肽。所述反應和所述經修飾多肽的所得結構展示於圖5中。本文中所述的某些實施例為含有具有包括肟基團的側鏈的非天然胺基酸的多肽。在其它實施例中，所述肟基團可經進一步修飾，僅舉例來說，諸如形成經掩蔽肟基團(其可容易地轉化為肟基團)、經保護肟基團(其在去保護之後，可容易地轉化為可用於其它化學反應的肟基團)或通過肟交換反應形成新的肟基團。使含二羰基非天然胺基酸組分與含羥胺試劑反應以形成肟可將具有含親電子劑側鏈的非天然胺基酸併入多肽中，所述含親電子劑側鏈包含(但不限於)二羰基(諸如二酮基、酮醛基、酮酸基、酮酯基以及酮硫代酯基)、類二羰基(其具有類似於二羰基的反應性且在結構上類似於羰基)、經掩蔽二羰基(其可容易地轉化為二羰基)或經保護二羰基(其在去保護後具有類似於二羰基的反應性)。將具有所述親電子側鏈的所述非天然胺基酸併入多肽中使得通過親核攻擊羰基使這一側鏈位點特異性衍生化成為可能。當攻擊親核試劑為羥胺時，將產生肟衍生多肽。用於衍生化和/或進一步修飾的方法可用在衍生化步驟之前或衍生化步驟之後純化的多肽進行。另外，衍生化步驟可在適度酸性到弱鹼性的條件(包含(例如)介於約2到約10的pH值之間，或介於約2到約8的pH值之間，或介於約4與約8的pH值之間)下發生。用含羥胺試劑或具有類似化學反應性的其它官能團修飾併入多肽中的非天然胺基酸的二羰基側鏈產生含新後鍵的經修飾多肽。所述反應和所述經修飾多肽的所得結構展示於圖6中。本文中所述的某些實施例為含有具有包括肟基團的側鏈的非天然胺基酸的多肽。在其它實施例中，所述肟基團可經進一步修飾，僅舉例來說，諸如形成經掩蔽肟基團(其可容易地轉化為肟基團)、經保護肟基團(其在去保護之後，可容易地轉化為可用於其它化學反應的肟基團)或通過肟交換反應形成新的肟基團。所述經修飾多肽肟鍵的非限定性實例展示如下-ON多肽或聚合物N.0多肽或聚合物多肽或聚合物R廣O、NO多肽或聚合物多肽或聚合物0NR廣o、NO多肽或聚合物多肽或聚合物zt"Q多肽或聚合物\G使含羥胺非天然胺基酸組分與含二羰基試劑反應以形成肟將含羥胺基團的非天然胺基酸併入多肽中允許與多種親電子基團反應，所述親電子基團包含(但不限於)二羰基(諸如二酮基、酮醛基、酮酸基、酮酯基以及酮硫代酯基)、類二羰基(其具有類似於二羰基的反應性且在結構上類似於羰基)、經掩蔽二羰基(其可容易地轉化為二羰基)或經保護二羰基(其在去保護後具有類似於二羰基的反應性)。羥胺基團的親核性準許其在溫和條件下在水性溶液中與含有所述二羰基官能團或具有類似化學反應性的其它官能團的多種分子有效且選擇性地反應以形成相應s虧鍵。這一通過親核攻擊二羰基進行的所述側鏈的位點特異性衍生化和/或進一步修飾可用在衍生化步驟之前或衍生化步驟之後純化的多肽進行。另外，衍生化步驟可在適度酸性到弱鹼性的條件(包含(例如)介於約2到約10的pH值之間，或介於約2到約8的pH值之間，或介於約4到約8的pH值之間)下發生。用含二羰基試劑修飾併入多肽中的非天然胺基酸的羥胺基團得到含肟鍵的經修飾多肽。所述反應和所述經修飾多肽的所得結構展示於圖7中。本文中所述的某些實施例為含有具有包括肟基團的側鏈的非天然胺基酸的多肽。在其它實施例中，所述肟基團可經進一步修飾，僅舉例來說，諸如形成經掩蔽後基團(其可容易地轉化為肟基團)、經保護肟基團(其在去保護之後，可容易地轉化為可用於其它化學反應的肟基團)或通過肟交換反應形成新的肟基團。所述經修飾多肽肟鍵的非限定性實例展示如下多欣或聚合物一"N^^nA^多肽或聚合物一N^Ok60通過肟交換反應，使由二羰基與羥胺的反應形成的含肟非天然胺基酸組分與含羰基或不同含二羰基的試劑反應以形成新肟含肟基團的非天然胺基酸允許與含有某些反應性二羰基的多種試劑反應，所述反應性二羰基包含(但不限於)二酮基、酮醛基、酮酸基、酮酯基以及酮硫代酯基、類二羰基(其具有類似於二羰基的反應性且在結構上類似於羰基)、經掩蔽二羰基(其可容易地轉化為二羰基)或經保護二羰基(其在去保護後具有類似於二羰基的反應性)，從而形成包括新肟基團的新非天然胺基酸(其可併入多肽中)。所述肟交換反應允許使非天然胺基酸多肽進一步官能化。用含二羰基試劑或具有類似化學反應性的其它官能團修飾併入多肽中的非天然胺基酸的肟側鏈產生含新肟鍵的經修飾多肽。所述反應和所述經修飾多肽的所得結構展示於圖8中。本文中所述的某些實施例為含有具有包括肟基團的側鏈的非天然胺基酸的多肽。在其它實施例中，所述肟基團可經進一步修飾，僅舉例來說，諸如形成經掩蔽後基團(其可容易地轉化為肟基團)、經保護肟基團(其在去保護之後，可容易地轉化為可用於其它化學反應的肟基團)或通過肟交換反應形成新肟基團。B.增強對血清白蛋白的親和性各種分子也可與本文中所述的非天然胺基酸多肽融合以調節在血清中的半衰期。在一些情況下，使分子與本文中所述的(經修飾)非天然胺基酸多肽連接或融合以增強對動物中內源血清白蛋白的親和性。舉例來說，在一些情況下，製造多肽與白蛋白結合序列的重組融合體。在其它情況下，使本文中所述的(經修飾)非天然胺基酸多肽經脂肪酸醯化。在其它情況下，使本文中所述的(經修飾)非天然胺基酸多肽直接與血清白蛋白(包含(但不限於)人類血清白蛋白)融合。所屬領域的技術人員應認識到多種其它分子也可與如本文中所述的經修飾或未經修飾的非天然胺基酸多肽連接以調節與血清白蛋白或其它血清組分的結合。關於增強對血清白蛋白的親和性的其它討論描述於美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的PCT公開案WO05/074650中，其是以引用的方式全部併入本文中。C.本文中所述的非天然胺基酸多肽的糖基化本文中所述的方法和組合物包含並有一個或一個以上帶有糖殘基的非天然胺基酸的多肽。糖殘基可為天然(包含(但不限於)N-乙醯基葡糖胺)或非天然(包含(但不限於)3-氟半乳糖)糖殘基。糖可通過N或O鍵聯糖苷鍵(包含(但不限於)N-乙醯基半乳糖-L-絲氨酸)或非天然鍵(包含(但不限於)肟或相應C或S鍵聯糖苷)與非天然胺基酸連接。可在活體內或活體外將糖(包含(但不限於)糖基)部分添加到非天然胺基酸多肽上。在一些情況下，使包括含羰基非天然胺基酸的多肽經以氨基氧基衍生化的糖修飾以產生通過肟鍵鍵聯的相應糖基化多肽。一旦糖連接於非天然胺基酸，則其可通過用糖基轉移酶和其它酶處理而進一步修飾以產生與非天然胺基酸多肽結合的寡糖。例如參看H.Liu等人，爿附.C/zem.Soc.125:1702-1703(2003)。D.鍵聯基團和應用(包含多肽二聚體和多聚體)的用途除將官能團直接添加到非天然胺基酸多肽上外，可首先用多官能(例如，雙、三、四)連接子分子修飾多肽的非天然胺基酸部分，然後接著進一步修飾多官能連接子分子。即，使多官能連接子分子的至少一個末端與多肽中的至少一個非天然胺基酸反應且多官能連接子的至少一個其它末端可用於進一步官能化。如果多官能連接子的所有末端相同，那麼(視化學計量條件而定)可形成非天然胺基酸多肽的均多聚體。如果多官能連接子的各末端具有不同化學反應性，那麼使多官能性連接子基的至少一個末端與非天然胺基酸多肽結合且另一末端可接著與不同官能團反應，所述不同官能團包含(僅舉例來說)標記；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交聯劑；細胞毒性化合物；藥物；親和性標記；光親和性標記；反應性化合物；樹脂；第二蛋白質或多肽或多肽類似物；抗體或抗體片段；金屬螯合劑；輔因子；脂肪酸；碳水化合物；聚核苷酸；DNA;RNA;反義聚核苷酸；糖；水溶性樹枝狀聚合物；環糊精；抑制性核糖核酸；生物材料；納米粒子；自旋標記；螢光團；含金屬部分；放射性部分；新穎官能團；與其它分子共價或非共價相互作用的基團；光籠蔽部分；可光化輻射激發的部分；可光異構化部分；生物素；生物素類似物；結合有重原子的部分；可化學裂解的基團；可光裂解的基團；延長側鏈；碳鍵聯糖；氧化還原活性劑；氨基硫代酸；毒性部分；經同位素標記的部分；生物物理探針；磷光基團；化學發光基團；電子緻密基團；磁性基團；插入基團；發色團；能量轉移劑；生物活性劑；可檢測標記；小分子；量子點；納米傳遞素；以及上述各者的任何組合。鍵聯基團和應用(包含多肽二聚體和多聚體)的其它用途進一步描述於美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的PCT公開案WO05/074650中，其是以引用的方式全部併入本文中。62E.添加官能團的實例易化多肽的分離性質出於多種原因，包含(但不限於)多肽的溶解性或結合特徵，可能難以從樣品中分離出天然存在的或非天然胺基酸多肽。舉例來說，在製備用於治療用途的多肽中，可從已工程化以過量產生多肽的重組系統中分離所述多肽。然而，由於多肽的溶解性或結合特徵，因此通常證明難以達成所需純度通常。進一步描述於美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的PCT公開案WO05/074650(其是以引用的方式全部併入本文中)中的方法、組合物、技術以及策略提供這一情形的解決方案。F.添加官能團的實例檢測多肽的存在出於多種原因，包含(但不限於)缺乏可容易地與多肽結合的試劑或標記，可能檢測樣品(包含活體內樣品和活體外樣品)中天然存在的或非天然胺基酸多肽。進一步描述於美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的PCT公開案WO05/074650(其是以引用的方式全部併入本文中)中的方法、組合物、技術以及策略提供這一情形的解決方案。G.添加官能團的實例改良多肽的治療性質天然存在的或非天然胺基酸多肽將能夠向患有特定病症、疾病或病狀的患者提供某種治療益處。所述治療益處將視許多因素而定，包含(僅舉例來說)多肽的安全性概況和多肽的藥物動力學、藥理學和/或藥效學(例如，水溶性、生物可用性、血清半衰期、治療半衰免疫原性、生物活性或循環時間)。另外，向多肽提供其它官能團可為有利的，所述其它官能團諸如連接的細胞毒性化合物或藥物，或可能希望連接其它多肽以形成本文中所述的均多聚體和雜多聚體。所述修飾優選不破壞原始多肽的活性和/或三級結構。進一步描述於美國專利申請案第60/638,418號、第60/638,527號、第60/639,195號、第60/696,210號、第60/696,302號以及第60/696,068號；標題為"ModifiedFourHelicalBundlePolypeptidesandTheirUses"的PCT公開案WO05/074650(其是以引用的方式全部併入本文中)中的方法、組合物、技術以及策略提供所述問題的解決方案。X.經修飾多肽的治療用途發現本文中所述的(經修飾)非天然胺基酸多肽(包含其均多聚體和雜多聚體)具有多種用途，包含(但不限於)治療、診斷、基於檢定、工業、化妝品、植物生物學、環境、能量產生和/或軍事的用途。以非限定性說明形式，提供(經修飾)非天然胺基酸多肽的下列治療用途。本文中所述的(經修飾)非天然胺基酸多肽適用於治療多種病症。投與本文中所述的(經修飾)非天然胺基酸多肽產品在人類中產生市售多肽製劑所顯示的任何活性。(經修飾)非天然胺基酸多肽產品的平均量可變化且尤其應以合格醫師的推薦和處方為基礎。(經修飾)非天然胺基酸多肽的確切量和與諸如所治療的病狀的確切類型、所治療患者的狀況以及組合物中的其它成分的因素一致的順序有關。所欲給予的量可由基於利用(經修飾)非天然胺基酸多肽的療法的領域內的技術人員容易地確定。A.投藥和醫藥組合物如本文中所述的經修飾或未經修飾非天然胺基酸多肽(包含(但不限於)包括一個或一個以上非天然胺基酸的合成酶、蛋白質等)視情況(包含(但不限於))與合適醫藥載劑組合用於治療用途。所述組合物(例如)包括治療有效量的如本文中所述的經修飾或未經修飾非天然胺基酸多肽和醫藥學上可接受的載劑或賦形劑。所述載劑或賦形劑包含(但不限於)鹽水、緩衝鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇和/或其組合。製備適用於投藥模式的調配物。一般來說，所屬領域中熟知投與蛋白質的方法且其可應用於投與如本文中所述的經修飾或未經修飾非天然胺基酸多肽。根據所屬領域的一般技術人員已知的方法，包括一種或一種以上如本文中所述的經修飾或未經修飾非天然胺基酸多肽的治療組合物視情況在一種或一種以上適當活體外和/或活體內動物疾病模型中進行測試以確認功效、組織代謝且估算劑量。具體來說，劑量初始可通過非天然胺基酸與天然胺基酸同源物相比(包含(但不限於)比較包含一個或一個以上非天然胺基酸的(經修飾)多肽與天然胺基酸多肽)(即，在相關檢定中)的活性、穩定性或其它合適量度來確定。通過通常用於引入分子以最終與血液或組織細胞接觸的任何途徑進行投藥。如本文中所述的經修飾或未經修飾非天然胺基酸多肽是視情況與一種或一種以上醫藥學上可接受的載劑以任何合適方式一起投與。可使用向患者投與如本文中所述的經修飾或未經修飾非天然胺基酸多肽的合適方法，且儘管可使用一種以上途徑來投與特定組合物，但特定途徑通常可提供比另一種途徑更直接且更有效的作用或反應。醫藥學上可接受的載劑部分由欲投與的特定組合物以及由用於投與組合物的特定方法決定。因此，存在多種本文中所述的醫藥組合物的合適調配物。可由適用於蛋白質或肽的任何常規途徑(包含(但不限於)非經腸，例如包含(但不限於)皮下或靜脈內注射或任何其它形式的注射或輸液)來投與非天然胺基酸多肽。可由包含(但不限於)口服、靜脈內、腹膜內、肌肉內、經皮、皮下、局部、舌下或經直腸方式的多種途徑投與多肽組合物(包含本文中所述的各種多肽)。包括如本文中所述的經修飾或未經修飾非天然胺基酸多肽的組合物也可通過脂質體投與。所屬領域的技術人員通常已知所述投藥途徑以及適當調配物。非天然胺基酸多肽可單獨使用或與其它合適組分(諸如醫藥載劑)組合使用。單獨或與其它合適組分組合的如本文中所述的經修飾或未經修飾非天然胺基酸多肽也可製成通過吸入投與的氣溶膠調配物(即，其可"霧化")。氣溶膠調配物可置於加壓的可接受推進劑(諸如二氯二氟甲垸、丙垸、氮氣以及其類似物)中。適用於非經腸投藥(諸如，通過關節內(在關節中)、靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內和皮下途徑)的調配物包含水性和非水性等張無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑和使調配物與預期接受者的血液等張的溶質；以及水性和非水性無菌懸浮液，其可包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑和防腐劑。經包裝核酸的調配物可於單位劑量或多劑量密封容器(諸如安瓿和小瓶)中提供。非經腸投藥和靜脈內投藥為優選投藥方法。具體來說，己用於天然胺基酸同源物治療劑的投藥途徑(包含(但不限於)通常用於EPO、IFN、GM-CSF、IFN、白細胞介素、抗體和/或任何其它醫藥遞送蛋白質的那些投藥途徑)以及目前使用的調配物一起提供優選投藥途徑和如本文中所述的經修飾或未經修飾非天然胺基酸多肽的調配物。在本文中所述的組合物和方法的情況下，投與患者的劑量足以隨時間在患者中產生有益治療反應。劑量是由以下因素決定特定調配物的功效和所使用的經修飾或未經修飾非天然胺基酸多肽的活性、穩定性或血清半衰期以及患者的狀況，以及欲治療的患者的體重或表面積。劑量大小也由特定患者中伴隨特定調配物或其類似物的投藥產生的任何有害副作用的存在、性質以及程度決定。在確定在治療或預防疾病(包含(但不限於)癌症、遺傳性疾病、糖尿病、AIDS以及其類似疾病)中欲投與的調配物的有效量時，醫師評估循環血漿含量、調配物毒性、疾病進程和/或(相關時)抗非天然胺基酸多肽抗體的產生。(例如)向70千克患者投與的劑量通常在相當於目前使用的治療性蛋白質的劑量的範圍內，其是根據相關組合物的改變的活性或血清半衰期加以調節。本文中所述的醫藥調配物可通過任何已知的常規療法來補充治療條件，所述常規療法包含抗體投藥、疫苗投藥、投與細胞毒性劑、天然胺基酸多肽、核酸、核苷酸類似物、生物反應調節劑以及其類似物質。對於投藥來說，本文中所述的醫藥調配物是以由相關調配物的LD-50或ED-50和/或各種濃度下經修飾或未經修飾非天然胺基酸多肽的任何副反應(包含(但不限於)當關係到患者的體重和整體健康時)的觀測結果所確定的速率投與。可通過單一劑量或分次劑量實現投藥。如果經歷調配物輸液的患者出現發熱、發冷或肌痛，那麼他/她接受適當劑量的阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、醋氨酚(acetami加phen)或其它疼痛/發熱控制藥物。在即將輸液前30分鐘，用阿司匹林、醋氨酚或(包含(但不限於))苯海拉明(diphenhydramine)對經歷輸液反應(諸如發熱、肌痛和發冷)的患者進行前驅用藥。度冷丁(meperidine)用於不能對退熱劑和抗組胺劑迅速作出反應的更嚴重的發冷和肌痛。視反應的嚴重性而定減緩或中斷細胞輸液。如本文中所述的經修飾或未經修飾非天然胺基酸多肽可直接投與哺乳動物個體。通過通常用於向個體引入多肽的任何途徑進行投藥。如本文中所述的經修飾或未經修飾非天然胺基酸多肽包含適於口服、經直腸、局部、吸入(包含(但不限於)通過氣溶膠)、經頰(包含(但不限於)舌下)、經陰道、非經腸(包含(但不限於)皮下、肌肉內、皮內、關節內、胸膜內、腹膜內、腦內、動脈內或靜脈內)、局部(即，皮膚與黏膜表面，包含氣管表面)以及經皮投藥者，但在任何給定情況下最合適途徑將視所治療的病狀的性質和嚴重性而定。投藥可為局部或全身性投藥。調配物可於單位劑量或多劑量密封容器(諸如安瓿和小瓶)中提供。如本文中所述的經修飾或未經修飾非天然胺基酸多肽可製備為單位劑量可注射形式(包含(但不限於)溶液、懸浮液或乳液)與醫藥學上可接受的載劑的混合物。也可通過連續輸液(使用(包含(但不限於))微型泵，諸如滲透泵)、單次快速注射或緩釋儲槽調配物來投與如本文中所述的經修飾或未經修飾非天然胺基酸多肽。適於投藥的調配物包含水性和非水性溶液(等張無菌溶液)，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑和使調配物等張的溶質；以及水性和非水性無菌懸浮液，其可包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑和防腐劑。可由先前所述類型的無菌粉末、顆粒和片劑來製備溶液和懸浮液。冷凍乾燥為用於自所關注蛋白質製劑移除水的用於提供蛋白質的常用技術。冷凍乾燥或凍幹為使欲乾燥材料首先冷凍且隨後通過在真空環境中升華來移除冰或冷凍溶劑的方法。在預凍幹調配物中可包含賦形劑以增強在冷凍乾燥過程中的穩定性和/或改良凍乾產品在儲存時的穩定性。Pikal,M.Biopharm.3(9)26-30(1990)和Arakawa等人，Pharm.Res.8(3):285-291(1991)。所屬領域的一般技術人員也己知藥物的噴霧乾燥。舉例來說，參看Broadhead,J.等人，"TheSprayDryingofPharmaceuticals,"DrugDev.Ind.Pharm,18(11和12),1169-1206(1992)。除小分子藥物之外，多種生物材料也已經噴霧乾燥且所述生物材料包含酶、血清、血漿、微生物和酵母。噴霧乾燥為適用技術，因為其可將液體藥物製劑在一步工藝中轉化為精細、無塵或聚集的粉末。基本技術包括以下四個步驟a)將進料溶液霧化成噴霧；b)噴霧-空氣接觸；c)使噴霧乾燥；和d)自乾燥空氣分離經乾燥的產物。美國專利第6,235,710號和第6,001,800號(其是以引用的方式併入本文中)描述通過噴霧乾燥來製備重組促紅細胞生成素。本文中所述的醫藥組合物可包括醫藥學上可接受的載劑。醫藥學上可接受的載劑部分是由所投與的特定組合物以及由用於投與組合物的特定方法決定。因此，存在多種如本文中所述的經修飾或未經修飾非天然胺基酸多肽的醫藥組合物(包含可選的醫藥學上可接受的載劑、賦形劑或穩定劑)的合適調配物。(例如參看ie脂'"gto"k屍/2anKace^'ca/Sc/e"cM,第17版，1985))。合適載劑包含緩衝劑，含有琥珀酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽、HEPES、檸檬酸鹽、咪唑、乙酸鹽、碳酸氫鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包含(但不限於)抗壞血酸；低分子量多肽，包含(但不限於)少於約10個殘基的那些多肽；蛋白質，包含(但不限於)血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，包含(但不限於)聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，包含(但不限於)甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、精氨酸、組氨酸或組氨酸衍生物、甲硫氨酸、穀氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包含(但不限於)海藻糖、庶糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，包含(但不限於)EDTA;二價金屬離子，包含(但不限於)鋅、鈷或銅；糖醇，包含(但不限於)甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，包含(但不限於)鈉；和/或非離子型表面活性劑，包含(但不限於)Tween(包含(但不限於)Tween80(聚山梨醇酯80)和Tween20(聚山梨醇酯20))、Pluronics和其它泊洛尼克酸(pluronicacid)(包含(但不限於)泊洛尼克酸F68(poloxamer188))或PEG。合適表面活性劑(例如)包含(但不限於)以聚(氧化乙烯)-聚(氧化丙烯)-聚(氧化乙烯)(即，(PEO-PPO-PEO))或聚(氧化丙烯)-聚(氧化乙烯)-聚(氧化丙烯)(即，(PPO-PEO-PPO))或其組合為基礎的聚醚。PEO-PPO-PEO和PPO-PEO-PPO以商品名Pluronics、R-Pluronics、Tetronics和R-Tetronics(BASFWyandotteCorp.,Wyandotte,Mich.)在市面上有售且進一步描述於美國專利第4，820，352號中，其是以引用的方式全部併入本文中。其它乙烯/聚丙烯嵌段聚合物可為合適的表面活性劑。表面活性劑或表面活性劑的組合可用於使(經修飾)非天然胺基酸多肽穩定以抵抗一種或一種以上應力(包含(但不限於)由攪拌產生的應力)。一些上述物質可被稱作"膨脹劑"。一些也可被稱作"張力調節劑"。如本文中所述的經修飾或未經修飾非天然胺基酸多肽(包含與諸如PEG的水溶性聚合物鍵聯的所述多肽)也可通過持續釋放系統或作為其部分來投與。持續釋放組合物包含(包含(但不限於))呈定形物品(包含(但不限於)薄膜或微膠囊)形式的半滲透性聚合物基質。持續釋放基質包含生物相容性材料，諸如聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)(Langer等人，m她r.to,15:167-277(1981);Langer,C/j謡.Tfec/z.,12:98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上文)或聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP133,988)、聚乳酸(polylactide;polylacticacid)(美國專利第3,773,919號;EP58,481)、聚乙醇酸(乙醇酸的聚合物)、聚乳酸-共-乙醇酸(乳酸與乙醇酸的共聚物)、聚酐、L-穀氨酸與y-乙基-L-穀氨酸酯的共聚物(Sidman等人，祝o/7o/;weAs,22,547-556(1983))、聚(原酸)酯、多肽、透明質酸、膠原蛋白、硫酸軟骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚胺基酸、胺基酸(諸如苯丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸)、聚核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯垸酮以及矽酮。持續釋放組合物也包含脂質體截留的化合物。含有化合物的脂質體是由本身已知的方法來製備DE3,218,121;Epstein等人，Prac.A^/.爿ca《Scz'US.A，82:3688-3692(1985);Hwang等人，Prac.Ato/爿cadSc/t/.S.A，77:4030-4034(1980);EP52,322;EP36,676;美國專利第4,619,794號；EP143,949;美國專利第5,021,234號；日本專利申請案83-118008;美國專利第4,485,045號和第4,544,545號；以及EP102,324。所引用的所有參考文獻和專利都是以引用的方式併入本文中。脂質體截留的多肽可由描述於以下文獻中的來製備，(例如)DE3,218,121;Epstein等人，屍rac.iVa"^c^.Sc/.C/.S.A,82:3688-3692(1985);Hwang等人，Proc.A^/.C/.S.A,77:4030-4034(1980);EP52,322;EP36,676;美國專利第4,619,794號；EP143,949;美國專利第5,021,234號；日本專利申請案83-118008;美國專利第4,485,045號和第4,544,545號；以及EP102,324中。脂質體的組成和大小為眾所周知的或能夠由所屬領域的一般技術人員根據經驗容易地確定。脂質體的一些實例描述於(例如)ParkJW等人，/Voc.爿cadScz'.92:1327-1331(1995);LasicD和PapahadjopoulosD(編)MedicalApplicationsofLiposomes(1998);DrummondDC等人，LiposomaldrugdeliverySystemsforcancertherapy,在TeicherB(編)CANCERDRUGDiscoveryandDevelopment(2002)中;ParkJW等人，C/z'".Omceri仏8:1172-1181(2002);NielsenUB等人，所ocW附.5/o;^:^.1591(1-3):109-118(2002);MamotC等人，Owe"i仏63:3154-3161(2003)中。所引用的所有參考文獻和專利都是以引用的方式併入本文中。在如本文中所述的組合物、調配物和方法的情況下，向患者投與的劑量應足以隨時間在個體中產生有益反應。通常，每劑量非經腸投與的如本文中所述的經修飾或未經修飾非天然胺基酸多肽的總醫藥學有效量在每天每千克患者體重約0.01pg至約100嗎或約0.05mg至約lmg的範圍內，但此服從於治療判斷。給藥頻率也服從於治療判斷，且可比獲準用於人類的市售產品的頻率大或小。通常，聚合物:多肽接合物(包含(僅舉例來說)如本文中所述的聚乙二醇化多肽)可通過上述任何投藥途徑投與。XI.分離和純化A.色譜法在本文中的任何實施例中，肽、(經修飾)非天然胺基酸多肽、多肽的結合搭配物或受體的分離可通過色譜法進行。色譜法是以多肽的差異吸附和洗脫為基礎。將樣品溶解於可為氣體、液體或超臨界流體的流動相中。然後迫使這一流動相通過固定於管柱中或固體表面上的不混溶固定相。固定相的實例包含吸附於固體上的液體、鍵結於固體表面的有機物質、固體、離子交換樹脂以及聚合固體間隙中的液體。多肽由不同色譜法或其它分離/純化法純化的能力可通過添加非天然胺基酸或用非天然胺基酸取代一個或一個以上非天然胺基酸視情況以及一個或一個以上天然胺基酸取代來調節。因此，多肽的性質可通過改變胺基酸組成來改變，從而使得能夠增加或減小其與已知基質的相互作用。胺基酸組成的改變包含(但不限於)疏水性胺基酸含量、親水性胺基酸含量以及多肽的電荷、pl或其它特徵的改變。所述修飾可適用於分離難以分離的膜蛋白質，因為其在性質上是疏水性的且保持其天然構象。氣相色譜法在一實施例中，多肽的分離可通過氣相色譜法(GC)進行。將樣品氣化且注入到色譜柱的頭部上。流動氣相的實例包含(但不限於)氦氣、氬氣、氮氣、二氧化碳以及氫氣。在一實施例中，樣品是通過氣固色譜法分離，其中固定相是固體。固體固定相的實例為分子篩和多孔聚合物。在另一實施例中，多肽是通過氣液色譜法分離，其中固定相是固定於惰性固體表面上的液體。液體固定相的實例包含聚二甲基矽氧烷、聚(苯基甲基二甲基)矽氧垸(10%苯基)、聚(苯基甲基)矽氧烷(50%苯基)、聚(三氟丙基二甲基)矽氧烷、聚乙二醇以及聚(二氰基烯丙基二甲基)矽氧垸。常規GC管柱是呈填塞且開口的管狀或毛細管狀。GC色譜柱的長度為小於2米到50米或50米以上不等。用於其構造的物質的實例包含不鏽鋼、金屬、玻璃、熔融矽石以及特氟綸(Teflon)。GC管柱通常具有約2毫米至4毫米的內徑。微GC具有約1毫米的內徑。毛細管GC利用內徑約100微米至750微米的毛細管。納米GC可以50微米-l亳米的內徑使用。液相色譜法在一實施例中，多肽的分離可通過液相色譜法(LC)進行。LC涉及使用於固定相管柱的長度在IO釐米至30釐米範圍內。LC管柱通常由滑腔不鏽鋼管構造，但偶爾會遇到重玻璃管。常規LC管柱具有約4.6毫米的內徑和約1毫升/分鐘的流速。微LC具有約1.0毫米的內徑和約40微升/分鐘的流速。毛細管LC利用內徑約300微米且流速約5微升/分鐘的毛細管。納米LC可以50微米-1毫米的內徑和200納升/分鐘的流速使用。納米LC的長度可不同，例如，5釐米、15釐米或25釐米。納米LC固定相也可為整塊材料，諸如聚合整料或溶膠-凝膠整料。液相色譜法中已使用兩種基本類型的填充材料，無孔粒子和多孔粒子。珠粒或粒子的特徵通常在於粒徑和孔徑。粒徑通常在3微米與50微米之間的範圍內。較大粒子將產生較小系統壓力，且較小粒子將產生較大壓力。較小粒子通常產生較高分離效率。粒子孔徑以埃(angstrom)量度且通常在100埃-1000埃範圍內。其可覆蓋有二氧化矽、氧化鋁、離子交換樹脂、有機表面層、聚合物、配位體、碳水化合物或特定輔助物質的多孔層。在本發明的一實施例中，多肽可使用HPLC技術分離。在本發明的另一實施例中，多肽可使用管柱色譜法分離。在管柱色譜法中，將固體介質填塞至色譜管柱上，且使含有多肽的初始混合物穿過管柱以允許結合。然後使洗滌緩衝液穿過管柱，且接著向管柱施加洗脫緩衝液以收集樣品。所述步驟可在周圍壓力下進行。在另一實施例中，多肽與固相的結合可使用以下步驟實現批處理，通過將初始混合物添加到容器中的固相中，將兩者混合在一起，分離固相(即，通過離心)，移除液相，洗滌，再離心，添加洗脫緩衝液，再離心以及移除洗脫液。在本發明的另一實施例中，使用混合方法，其中通過批處理法進行結合，然後將結合有標靶分子的固相填塞至管柱上，且在管柱上進行洗滌和洗脫。在本發明的又一實施例中，肽的分離在微流體裝置中進行。在本發明的另一實施例中，肽的分離在納米流體裝置中進行。分配色譜法在一實施例中，多肽的分離是通過分配色譜法進行。在一實施例中，多肽的分離是通過液-液分配色譜法進行。對液-液分配色譜法來說，液體固定相通過物理吸附保留在填料的表面上。在另一實施例中，多肽的分離可通過鍵結相分配色譜法進行。對鍵結相分配色譜法來說，固定相化學鍵結於支撐表面上。在另一實施例中，使用正相色譜法分離多肽。在正相色譜法中，使用極性固定相以及非極性溶劑。正相色譜法的固定相的實例包含(但不限於)水、醇以及三乙二醇。正相色譜法的非極性溶劑的實例包含(但不限於)乙基、醚、氯仿、四氫呋喃、氟烷、環己垸、l-氯丁垸、四氯化碳、甲苯、乙醚、己垸以及異丙醚。在一實施例中，分配色譜法使用反相填料；此稱為反相分配色譜法。在反相色譜法中，使用非極性固定相以及極70性流動相。反相分配色譜法的固定相的實例包含(但不限於)烴、醚、酯、酮、醛、醯胺以及胺。反相分配色譜法的流動固定相的實例包含水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二噁垸、硝基甲烷、乙二醇、四氫呋喃以及乙腈。在一實施例中，可用於分離多肽的反向色譜法的類型為離子對色譜法。離子對色譜法中的流動相由含有有機溶劑(諸如甲醇或乙腈)的水性緩衝液和含有具有多肽的相反電荷的抗衡離子的離子型化合物組成。抗衡離子與多肽結合形成離子對，所述離子對為由反相填料保留的中性物質。然後用甲醇或另一水溶性有機溶劑(如以上所述的溶劑)的水溶液實現離子對的洗脫。抗衡離子的實例為C1(V、C12H25S03—、(C4H9)4N+、(C16H33)(CH3)3N+、(C4H9)4N+、雙-(2-乙基已基)磷酸根以及(C4H9)4N+。在一實施例中，多肽可使用具有手性固定相的分配色譜法分離。手性固定相的類型的實例包含(但不限於)基於蛋白質的固定相、纖維素與直鏈澱粉的小分子量手性聚合物、大環糖肽以及基於環糊精的物質。吸附色譜法在一實施例中，多肽的分離可通過吸附色譜法進行。一吸附是物質(流動相中所含的物質)通過物理力(分散、極性或離子)與固定相相互作用的過程，從而使得物質層(或各層)粘附於固定相上。在大多數情況下，固定相將為固體(例如矽膠、氧化鋁、炭等)或有時為液體(例如，水表面上的表面活性劑)。表面層可為單層、雙層或多層。可用於吸附色譜法中的溶劑的實例包含水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二噁垸、硝基甲垸、乙二醇、四氫呋喃、乙腈、乙基、醚、氯仿、四氫呋喃、氟垸、環己烷、l-氯丁烷、四氯化碳、甲苯、乙醚、己垸以及異丙醚。離子交換色譜法在一實施例中，多肽的分離可通過離子交換色譜法進行。在離子交換色譜法中，多肽的分離是以離子交換樹脂為基礎。離子交換樹脂可為陰離子交換樹脂或陽離子交換樹脂。離子交換樹脂可由天然離子交換劑(諸如粘土和沸石)或合成離子交換劑製成。陽離子交換樹脂的常見活性位點的實例為磺酸基-S(VH+、羧酸基-COO—H+以及磷酸-P032+H2。陰離子交換樹脂的常見活性位點的實例為季胺基-N(CH3)+OH—或伯胺基-NH3+OH—。離子交換色譜法中的流動相通常為可含有中等量甲醇或其它水混溶性有機溶劑的水溶液；所述流動相也含有呈緩衝劑形式的離子物質。在一實施例中，離子交換柱是用鹽濃度梯度洗脫。在一實例中，在緩衝液流經管柱時泵將遞增量的鹽添加到緩衝液中，以便流經管柱的離子濃度存在連續穩定的增加。當緩衝液的離子強度中和蛋白質電荷時，蛋白質"洗脫"或離開管柱固定相。帶電最小的分子首先離開，而帶電最高的最後離開。在另一實例中，用具有遞增離子強度的緩衝液充分清洗管柱直到所需蛋白質洗脫；每次用相同量的緩衝液重複這一完全相同的順序以得到蛋白質的可重現的產率和純化。在一實施例中，通過離子交換色譜法分離所關注的多肽後，將使樣品經受高鹽濃度移除。在一實施例中，高鹽濃度的移除將通過透析進行。透析利用半透性膜。透析膜的主要特徵在於其是多孔的。然而，孔徑使得當小鹽離子可自由通過膜時，較大蛋白質分子不能通過(即，其被保留)。因此，透析膜由將其保留的最小的典型球狀蛋白質的分子質量表徵。高鹽濃度的移除可以單個或多個透析步驟實現。在另一實施例中，高鹽濃度的移除通過電透析進行。電透析是在電勢梯度的影響下離子穿過離子可透膜從一種溶液運輸到另一溶液中的電隔膜過程。因為用於電透析中的膜具有選擇性運輸具有正電荷或負電荷的離子且排除具有相反電荷的離子的能力，所以電透析適用於電解質的濃縮、移除或分離。在另一實施例中，高濃度鹽的移除是通過使用脫鹽管柱在重力流動凝膠過濾中實現。重力流動凝膠過濾涉及具有不同尺寸的分子基於其透入合適固定相中的相對能力的色譜分離。向脫鹽管柱中填塞小的多孔纖維素珠粒。所述管柱含有具有特定直徑的溼珠粒。所使用的珠粒的直徑將視所關注的肽的分子量而定。分離的不同程度可基於填塞至管柱中的介質的孔徑實現。可選擇介質以完全排除蛋白質或大分子，同時仍包含小溶質。大分子被從凝膠的內孔中排除出且首先從管柱中排出。較小分子能夠透過微孔，且然後以較低速率通過管柱前進。所述較小分子接著用另外的緩衝體積衝洗通過管柱。尺寸排除色譜法在一實施例中，多肽的分離可通過尺寸排阻色譜法(也稱為凝膠滲透或凝膠過濾色譜法)進行。大於填料的平均孔徑的分子被排除且因此不經受保留。尺寸排阻色譜法的填料的實例包含矽石、纖維素珠粒以及聚合物粒子。多孔玻璃和矽石粒子通常具有40埃至2500埃範圍內的平均孔徑。在一些實施例中，具有102埃的平均孔徑的聚合物填料的分子量排阻極限是700。在另一實施例中，具有103埃的平均孔徑的聚合物填料的分子量排阻極限是(O.l至20)X104。在另一實施例中，具有104埃的平均孔徑的聚合物填料的分子量排阻極限是(l至20)X104。在另一實施例中，具有105埃的平均孔徑的聚合物填料的分子量排阻極限是(l至20)X105。在又一實施例中，具有106埃的平均孔徑的聚合物填料的分子量排阻極限是(5至10)X106。在一些實施例中，具有125埃的平均孔徑的聚合物填料的分子量排阻極限是(0.2至5)X104。在另一實施例中，具有300埃的平均孔徑的聚合物填料的分子量排阻極限是(0.03至1)X1S。在另一實施例中，具有500埃的平均孔徑的聚合物填料的分子量排阻極限是(0.05至5)X105。在又一實施例中，具有1000埃的平均孔徑的聚合物填料的分子量排阻極限是(5至20)X105。薄層色譜法在一實施例中，多肽的分離可通過薄層色譜法進行。薄層色層法包含紙色譜法、薄層色譜法以及電色譜法。各利用自撐式或塗布於玻璃、塑料或金屬表面上的平坦的薄層材料。流動相通過毛細管作用、有時藉助於重力或電勢輔助移動通過固定相。在一實施例中，平面分離是在塗布有薄且粘附的細粒層的平坦玻璃或塑料板上進行；這一層構成固定相。固定相和流動相類似於吸附色譜法、正相和反相分配色譜法、離子交換色譜法以及尺寸排阻色譜法中所討論的那些。在一實施例中，通過噴灑與有機化合物反應以產生深色產物的溶液將多肽置於板中。這類溶液的實例包含茚三酮、碘溶液以及硫酸溶液。在另一實施例中，通過將螢光物質併入固定相中來放置多肽。在紫外光下檢測板。樣品組分猝滅螢光物質，從而除放置非發螢光樣品組分以外的所有板均發螢光。親和力色譜法在一實施例中，多肽的分離可通過親和力色譜法進行。親和力色譜法依賴於設計與分子已知子集可逆結合的固定相的能力。親和力純化通常包括以下步驟1)將粗樣品與經固定的配位體支撐物質一起培育以使樣品中的標靶分子與經固定的配位體結合，2)從固體支撐物洗除未結合的樣品組分，以及3)通過改變緩衝條件以使結合相互作用不再發生，從固定配位體洗脫(解離且回收)標耙分子。用於親和力色譜法的洗脫緩衝液的實例包含(但不限於)100mM鹽酸甘氨酸、100mM擰檬酸、50-100mM三乙胺或三乙醇胺、150mM氫氧化銨、於10mMTris中的3.5-4.0M氯化鎂、於10mM磷酸鹽緩衝液中的5M氯化鋰、2.5M碘化鈉、0.2-3.0硫氰酸鈉、2-6M鹽酸胍、2-8M脲、1%脫氧膽酸鹽、1%SDS、10%二噁烷、50%乙二醇、0.1M甘氨酸-NaOH、具有50%乙二醇的0.1M甘氨酸-NaOH、3.0M氯化鉀、具有2.0MNaCl的0.1MTris-乙酸鹽、5.0M碘化鉀、1%SDS、1%脫氧膽酸鈉、2.0M脲、6.0M脲、2.0M鹽酸胍、l.OM硫氰酸銨以及>0.1M抗衡配位體或類似物。在一實施例中，固定相包含配位體，所述配位體包含(但不限於)特定碳水化合物或輔助物質。在一實施例中，可隨後用高濃度碳水化合物或特定輔助物質洗脫多肽。有時可使用結合位點的模擬物作為親和性固定相。用於固定相中的特定糖、抑制劑或輔助物質將根據多肽的性質而變化。本發明的實施例包含所屬領域中已知的任何配位體、碳水化合物或輔助物質。在另一實施例中，所固定的固定相包含染料。常用於染料-配位體色譜法的染料的實例包含活性藍2(CibacronBlue3GA)、活性紅120(ProcionRedHE3B)、活性藍4(ReactiveBlueMRB)TC、活性綠5(ReactiveGreenH4G)TC、活性綠19(ReactiveGreenHE4BD)TC、綠色19A(ReactiveGreenHE4BD)TC、活性黃86(ReactiveYellowM8G)tc以及活性棕IO(ReactiveBrownM4R)TC。在另一實施例中，固定相包含金屬螯合樹脂。在金屬螯合物色譜法中，金屬離子(諸如Zn"、C^+以及NP+)通過螯合物鍵結參與與位於多肽表面中的電子供體基團可逆地相互作用固定於色譜固定相上。在電子基團供體至少部分以非質子化形式存在的pH值下，多肽鍵結於固定相且接著可藉助於具有使電子基團質子化的較低pH值的緩衝液洗脫。螯合樹脂的實例包含8-羥基喹啉、水楊酸、二亞乙基三胺、二亞乙基三胺四乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、亞氨基二乙酸以及次氮基三乙酸。在另一實施例中，多肽的分離可通過免疫親和力色譜法進行。免疫親和力或免疫吸附色譜法的原理是以抗原與其抗體的高度特異性相互作用為基礎。免疫親和力色譜法利用抗體或抗體片段作為配位體，所述配位體以保留其結合能力的方式固定於固定相上。通過改變削弱抗體-抗原相互作用的流動相的條件實現所保留多肽的洗脫。洗脫條件意欲破壞將抗原與抗體保持在一起的離子鍵、疏水鍵以及氫鍵。成功的洗脫條件將視所發生的特異性抗原-抗體相互作用而定。可產生識別多肽中所存在的非天然胺基酸的抗體。所述抗體可用於親和力色譜法中以在檢測非天然胺基酸多肽的存在的免疫檢定中和使用抗體的其它檢定中從複雜混合物中純化非天然胺基酸多肽或能夠使多肽與支撐物(諸如樹脂)上的其它分子接合。可產生識別多肽N末端或C末端或多肽的其它部分中所存在的一個或一個以上非天然胺基酸的抗體。非天然胺基酸多肽可為抗體、抗體片段或抗原結合多肽或其片段，且通過親和力色譜法用於分離抗原。在一實施例中，多肽的分離可通過疏水性相互作用色譜法進行。多肽可含有親水性與疏水性天然胺基酸和親水性與疏水性非天然胺基酸。根據多肽的相對疏水性通過其與疏水性化合物可逆性結合的能力分離多肽。用於緩衝液中的遞減濃度的鹽從管柱洗脫多肽。疏水性化合物的實例包含(但不限於)疏水性脂肪酸鏈、具有正丁基官能團的化合物、具有正辛基官能團的化合物以及具有苯基官能團的化合物。超臨界流體色譜法在一實施例中，多肽的分離可通過超臨界色譜法(SFC)進行。在SFC中，通過超臨界流體使樣品流經分離柱，其中基於個別分析物與管柱中的固定相之間的相互作用的量將混合物分成獨特帶。常規SFC管柱呈填塞且開口的管狀或毛細管狀。開口管柱的長度為10米到20米或20米以上不等。開口管柱通常具有約0.05毫米至4毫米的內徑。填塞管柱的直徑從0.5毫米或0.5毫米以下到4.6毫米不等，其中粒徑在3微米至10微米範圍內。填塞管柱含有固定相粘附於其上的小的去活化粒子。管柱通常為不鏽鋼。毛細管柱是由熔融矽石製成的具有狹窄內徑的開口管柱，其中固定相鍵結於管柱壁。塗層類似於分配色譜法中所使用的塗層。用於SFC中的超臨界流體的實例包含(但不限於)二氧化碳、乙垸、戊垸、氧化亞氮、二氯二氟甲垸、乙醚、氨以及四氫呋喃。在一些應用中，以低濃度(1-5%)引入極性有機調節劑(諸如甲醇)。B.沉澱法在一實施例中，肽、(經修飾)非天然胺基酸多肽、多肽的結合搭配物或受體的分離可通過沉澱法進行。多肽的溶解性與溶液的離子強度和pH值相關。多肽具有等電點，在該點時其胺基酸側基的電荷彼此平衡。如果溶液的離子強度極高或極低，那麼蛋白質將傾向於在其等電點下沉澱。在一實施例中，溶液的離子強度將通過添加鹽而得以增加。沉澱法中所使用的鹽的實例包含(但不限於)硫酸銨和硫酸鈉。在本發明的任何實施例中，可使用蛋白質沉澱的所屬領域中己知的任何鹽。在另一實施例中，將用聚合物迫使多肽離開溶液。通常用於沉澱多肽的聚合物的一個實例為聚乙二醇。在本發明的任何實施例中，可使用蛋白質沉澱的所屬領域中已知的任何聚合物。在一實施例中，通過離心或過濾移除所沉澱的多肽。在一實施例中，通過向溶液中添加鹽使所關注的肽沉澱後，將使樣品經受高鹽濃度的移除。脫鹽方法討論於離子交換色譜法部分中。免疫沉澱在本發明的一實施例中，多肽的分離可通過免疫沉澱法(immunoprecipitation，IP)進行。IP指的是使用特異性抗體的抗原的小規模親和力純化。經典的免疫沉澱法包括以下步驟1)將特異性抗體與含有抗原的樣品一起培育，2)用固定的蛋白質A或G瓊脂糖凝膠(蛋白質A或G結合與其抗原結合的抗體)捕獲抗體-抗原複合物，3)用緩衝液洗滌凝膠以移除未結合樣品組分，4)洗脫抗原(和抗體)。在本發明的一實施例中，使用固定的蛋白質A或G凝膠在微離心管中進行含多肽樣品的經典IP。各步驟(洗滌和洗脫)後，通過離心使凝膠成團，且移除上清液。所洗脫的樣品通常總會含有抗原與抗體兩者，且所洗脫樣品的還原凝膠電泳會產生抗原帶與重鏈和輕鏈抗體片段帶。從分離的電泳凝膠獲得多肽的方法為所屬領域的一般技術人員所知。75在本發明的另一實施例中，為避免洗脫抗原被抗體汙染，可對經典IP方法進行修改，以便使抗體永久地固定且不會與抗原一起洗脫。在一實例中，首先使抗體結合於蛋白質A或G凝膠，且然後使抗體共價交聯於蛋白質A或G。在另一實例中，使抗體與經活化親和性支撐物直接偶合。非天然胺基酸多肽可為抗原結合多肽且可用於免疫沉澱法中。在一實施例中，支撐物質為多孔凝膠，諸如交聯珠粒瓊脂糖或交聯雙丙烯醯胺與吖內酯的共聚物。在本發明的一實施例中，多肽可通過磁性親和力分離來分離。將含有所關注分子的樣品與用抗體或其它結合搭配物衍生化的磁性珠粒一起培育。使用磁場將磁性珠粒牽引出溶液且位於表面上。可小心地移除含有任何未結合分子的緩衝液。在此項技術中熟知使用用於分離所關注分子的磁性珠粒的方案。磁性珠粒可經衍生化以含有活性基團，所述活性基團包含(但不限於)羧酸或伯胺或特異性親和性分子，諸如抗生蛋白鏈菌素或山羊抗小鼠、抗兔或抗大鼠IgG或蛋白質A或G。在另一實施例中，支撐物為微板。C.電泳在本文中的任何實施例中，多肽的分離可通過電泳進行。電泳是在電場中基於分子的大小和離子電荷通過經由凝膠的差異遷移模式的離子型分子(諸如多肽)的分離。電泳可在凝膠、毛細管中或晶片上進行。用於電泳的凝膠的實例包含澱粉、丙烯醯胺、瓊脂糖或其組合。凝膠可通過其交聯、添加洗滌劑、固定酶或抗體(親和力電泳)或底物(酶譜法(zymography))以及pH梯度來修飾。從電泳凝膠獲得多肽的方法為所屬領域的一般技術人員所已知。毛細管電泳在一實施例中，肽、(經修飾)非天然胺基酸多肽、多肽的結合搭配物或受體的分離可通過毛細管電泳法(CE)進行。CE可用於分離複雜親水性分子和高度帶電溶質。CE的優點包含其使用小樣品(規模在0.001微升到IO微升範圍內)、快速分離、易於重現、效率極高，此意謂可同時分離數百個組分，容易自動化，可定量使用且消耗有限量的試劑。CE技術通常涉及使用窄膛融合矽石毛細管來分離大分子和小分子的複雜陣列的分離技術。使用高電壓來基於電荷、大小以及疏水性的差異分離分子。視所使用的毛細管的類型和緩衝液而定，CE可進一步分成以下分離技術諸如毛細管區帶電泳(capillaryzoneelectrophoresis,CZE)、毛細管等電點聚焦(capillaryisoelectricfocusing,CIEF)和毛細管電色譜法(capillaryelectrochromatography，CEC)。毛細管區帶電泳(CZE)(也稱為無溶液CE(FSCE))為CE的最簡單形式。CZE的分離機理是基於分析物荷質比的差異。CZE的基本要求為毛細管整個長度上緩衝溶液的均一性和恆定的磁場強度。分離主要依賴於溶質上酸性基團的pH控制解離或溶質上鹼性官能團的質子化。毛細管等電點聚焦(CIEF)允許兩性分子(諸如，多肽)通過電泳在陰極與陽極之間產生的pH梯度下分離。溶質會遷移到溶質淨電荷為零的點。在此等電點(溶質的pl)下，遷移停止且樣品聚焦於緻密區帶中。在CIEF中，一旦溶質在其pl下聚焦，則通過壓力或化學措施使區帶移動穿過檢測器。CEC為傳統液相色譜法(HPLC)與CE之間的混合技術。本質上，向CE毛細管中填塞HPLC填料且在整個填塞毛細管上施加電壓，其產生電滲流(electro-osmoticflow,EOF)。EOF將溶質沿毛細管朝向檢測器運輸。在溶質朝向檢測器運輸期間，發生溶質的差異分配與電泳遷移，此產生CEC分離。因此，與HPLC與CE相比，使用CEC有可能獲得獨特的分離選擇性。EOF的有利流動分布減小與流動相關的帶增寬且CEC中通常獲得每米數十萬塊板的分離效率。CEC也使得有可能使用小直徑填料和實現極高效率。膠束電動毛細管色譜法(Micellarelectrokineticcapillarychromatography,MECC)為允許分離不帶電溶質的毛細管電泳法。在這一技術中，以超過形成膠束的臨界膠束濃度的量將表面活性劑(諸如，十二垸基硫酸鈉)添加至操作緩衝液中。這一類型的陰離子膠束的表面具有大的負電荷，此賦予其大的朝向陽電極的電泳遷移率。然而，大多數緩衝液展現朝向陰電極的高電滲速率，致使陰離子膠束被帶向陰電極，但以小得多的速率。此形成快速移動的水相和較慢移動的膠束相。當將樣品引入到系統中時，組分自身在膠束的內部於水相與烴相之間分布。或者，等速電泳(isotachophoresis，FTP)為通過使用不連續緩衝液的電泳分離來濃縮樣品的方法。在等速電泳中，使用兩種不同的緩衝液系統以產生分析物分離至其中的區帶。等速電泳實驗期間，有可能分離陽離子或陰離子，而不是兩者。在ITP中，將大體積的樣品放置在前導電解質與末端電解質之間。樣品中的分析物根據其移動性依次堆積於窄的帶中。所述技術可與毛細管電泳組合使用，其中在樣品注射到毛細管中的位點處使用不連續電解質系統。此外，瞬時等速電泳(transientisotachophoresis，tITP)為通常與毛細管電泳(CE)組合使用的這一技術的變體。Foret，F.等人在"TraceAnalysisofProteinsbyCapillaryZoneElectrophoresiswithOn-ColumnTransientIsotachophoreticPreconcentration".五/e"ra//zo^^1993，14,417-428(1993)中描述兩種用於執行tITP的電解質配置。一種配置使用通過毛細管連接的兩個貯液器。向毛細管和一個貯液器中填充前導電解質(leadingelectrolyte,LE)，而向另一存儲器中填充終端電解質(terminatingelectrolyte,TE)。首先將用於分析的樣品注入至填充有LE的毛細管中，且將毛細管的注入端插入含有TE的貯液器中。施加電壓且具有介於LE與TE的移動性中間的移動性的那些樣品組分堆積於尖銳的ITP區帶中且獲得穩定態濃度。所述區帶的濃度與LE共離子的濃度相關，但不與TE的濃度相關。一旦達到穩定狀態，就用含有LE的忙液器代替含有TE的存儲器。這使得尖銳ITP區帶去堆積，此允許個別物質以區帶電泳模式移動。Foret，F.等人所討論的另一配置使用類似方法，但在各貯液器中使用單一本底電解液(backgro皿delectrolyte,BGE)。BGE共離子的移動性較低，使得其可充當終端離子。用於分析的樣品含有另外的具有高電泳遷移率的共離子，使得其在tITP遷移期間可充當前導區帶。將樣品注入至毛細管中且施加電壓後，樣品中具有較高移動性的前導離子形成不對稱的前導且尖銳的後置邊界。正好在後置邊界後方，形成傳導不連續性，且此產生不均勻電場，且因此樣品離子堆積。當遷移前進時，前導區帶將因電遷移分散而增寬，且較高移動性鹽的濃度將降低。結果是沿遷移區帶的電場遞減不同。在前導區帶的某一濃度下，樣品帶將去堆積且在獨立的速度下以區帶電泳模式移動。肽的分離可涉及所屬領域中已知的任何程序，諸如毛細管電泳(例如，在毛細管中或晶片上)或色譜法(例如，在毛細管、管柱中或在晶片上)。D.移除汙染物的程序在本發明的一些實施例中，在獲得所關注的多肽的一級純化程序後，可能需要二級純化步驟來移除汙染物。汙染物可為抑制劑、幹擾物質或不適當緩衝劑。在本發明的一實施例中，汙染物的移除將通過從生物分子的複雜混合物中特定純化出其所關注的蛋白質來實現。在本發明的另一實施例中，汙染物的移除將通過從含有所關注的蛋白質的樣品中特定移除汙染物來實現。舉例來說，可使用固定的蛋白質A從樣品中選擇性移除免疫球蛋白，在所述樣品中免疫球蛋白視為汙染物。在又一實施例中，可使用過濾器從樣品中移除不想要的組分。實例包含(但不限於)尺寸排阻色譜法和超濾膜，其基於大小和分子量分離分子。在又一實施例中，可使用超離心法從樣品中移除不想要的組分。超離心法可涉及離心樣品，同時用光學系統監測粒子的沉積(或無沉積)。在本發明的另一實施例中，使用電透析從樣品中移除不想要的組分。電透析為在電勢梯度的影響下將離子從一種溶液運輸穿過離子可透膜到另一溶液中的電隔膜過程。因為用於電透析中的膜具有選擇性運輸具有正電荷或負電荷的離子且排斥具有相反電荷的離子的能力，所以電透析適用於電解質的濃縮、移除或分離。移除內毒素在本發明的一些實施例中，可能有必要從樣品中移除內毒素。內毒素為革蘭氏陰性菌(Gram-negativebacteria)的致熱脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)組分。因為所述細菌是普遍存在的，所以內毒素為生物化學製劑的常見汙染物並不驚奇。內毒素汙染通常以內毒素單位(endotoxinunit,EU)量度，其中1EU對應於足以產生致熱反應的內毒素的濃度(通常每千克體重約0.1納克)。在一實施例中，內毒素的移除通過超離心法進行。在另一實施例中，內毒素的移除通過使用經固定的多粘菌素B(polymixinB)進行。降低內毒素含量的方法為所屬領域的一般技術人員所己知且包含(但不限於)使用矽石支撐物、玻璃粉或羥基磷灰石的純化技術、反相色譜法、親和力色譜法、尺寸排阻色譜法、陰離子交換色譜、疏水性相互作用色譜法，所述方法的組合，以及其類似方法。測量內毒素含量的方法為所屬領域的一般技術人員所已知且包含(但不限於)鱟阿米巴細胞溶胞物(LimulusAmebocyteLysate，LAL)檢定。移除清潔劑在本發明的一些實施例中，可能有必要移除樣品中的一些或所有洗滌劑。舉例來說，雖然許多水溶性多肽在洗滌劑增溶形式下起作用，但其它多肽可能被洗滌劑增溶作用改性和失活。在一實施例中，洗滌劑移除可通過透析進行。透析有效移除具有高臨界膠束濃度(criticalmicelleconcentrations,CMC)和/或小聚集數的洗滌劑，諸如N-辛基糖苷。在另一實施例中，從樣品中移除洗滌劑可通過蔗糖密度梯度分離進行。在又一實施例中，洗滌劑可通過尺寸排阻色譜法從樣品中移除。E.重組多肽在本發明的一實施例中，多肽的分離可使用遺傳工程化技術來合成雜交蛋白質。通過融合所關注的多肽的編碼序列與對配位體具有高親和性的多肽的編碼序列，可由微生物直接產生具有親和性標籤的雜交蛋白質。表達系統的實例為大腸桿菌(&c/zer/c/n'"co//)、枯草桿菌(5ac/腸s由他)、.螢光假單胞菌(i^e油膨wflw,omsc冊)、銅綠假單胞菌(Psewdowowasaen/g/"osa)、惡臭假單胞菌(i^ez^fo膨woy;7w"^f)、酵母、哺乳動物細胞以及昆蟲細胞中的杆狀病毒系統。然後可使用親和性標籤通過親和力色譜法從培養基、細胞溶胞物、提取物、包涵體、宿主細胞的周質間隙、宿主細胞的細胞質或其它材料回收產物。在本發明的一實施例中，可通過離心或過濾獲得分泌至介質中的非天然胺基酸多肽。所述溶液可適於直接施加至色譜管柱。在本發明的另一實施例中，提取細胞內累積的多肽，之後通過色譜純化。在一實施例中，通過細胞破壞提取多肽。細胞破壞技術的實例包含機械粉碎機，諸如玻璃珠粒研磨機和高壓均質機。在本發明的另一實施例中，通過細胞滲透提取多肽。滲透劑的實例包含(但不限於)鹽酸胍和曲拉通X-100(TritonX-IOO)。除化學滲透外，可通過酶促溶解滲透細胞。細胞滲透後所獲得的細胞均勻混合物或粗提取物的澄清可通過離心或不同過濾法(諸如微過濾或超濾)進行。已開發出適用於離子交換色譜法、疏水性相互作用色譜法、親和力色譜法、免疫親和力色譜法以及金屬-螯合物色譜法的純化標籤。舉例來說，具有聚精氨酸標籤的雜交多肽可通過離子交換色譜法純化，具有聚苯丙氨酸標籤的雜交多肽可通過疏水性色譜法分離，具有e-半乳糖苷酶標籤的雜交多肽可通過親和力色譜法分離，具有蛋白質A標籤的雜交多肽可通過IgG親和力色譜法分離，具有抗原標籤的雜交多肽可通過免疫親和力色譜法分離且具有聚組氨酸的雜交多肽可通過金屬螯合物色譜法分離。標籤可通過化學或酶促手段移除。在一些實施例中，通過分子內反應移除標籤。連接子分子可被釋放或可不被釋放。類似地，可使用非天然胺基酸產生純化標籤，且可使用色譜法或其它技術純化具有所述標籤的雜交多肽。在一實施例中，多肽的末端處包含多個非天然胺基酸。這種具有多個非天然胺基酸的多肽的純化可根據非天然胺基酸的性質通過親和力色譜法或其它方式純化。為使具有多個非天然胺基酸標籤的多肽與另一分子接合，可進行以下程序。使多肽與與非天然胺基酸標籤結合的樹脂結合後，進行反應以使多肽與另一分子(諸如PEG)接合。作為接合的結果或在接合完成後，可從樹脂釋放接合產物。可在變性條件下進行接合且可在樹脂上進行多肽的再摺疊。可使第二分子與多肽在多肽中所存在的天然或非天然胺基酸處接合。可使第二分子與多肽在非天然胺基酸標籤中所存在的天然或非天然胺基酸處接合。在另一實施例中，多肽末端所包含的多個非天然胺基酸為金屬結合胺基酸。這種多肽的純化可使用類似於用於以His標籤標記的蛋白質的方法進行。在另一實施例中，多肽包括兩個或兩個以上非天然胺基酸，其中一個或一個以上非天然胺基酸用於使多肽與樹脂結合且第二個非天然胺基酸用於使多肽與另一分子(包含(但不限於)PEG)接合。可使用適用於純化技術的其它物質代替樹脂。標籤可通過化學或酶促手段移除。在一些實施例中，通過分子內反應移除標籤。連接子可被釋放或可不被釋放。在另一實施例中，雜交多肽可在多肽與標籤接合處具有非天然胺基酸。可使用這一非天然胺基酸通過化學裂解使多肽與標籤分離，例如在使標籤與管柱結合期間或之後。可使用這一非天然胺基酸通過酶促裂解或通過分子內化學反應使多肽與標籤分離。在另一實施例中，使用"前藥"型方法。使非天然胺基酸多肽結合於純化基質，且在包含(但不限於)分子內反應、曝露於紫外光(對釋放來說為光活化分子)、化學裂解或酶促裂解的事件後部分或整個多肽得以釋放。在另一實施例中，可在多肽部分之間的接合處引入特異性裂解位點。這使得能夠(例如)裂解雜交分子以產生不含親和性標籤的所關注蛋白質。融合序列的移除可通過酶促裂解或化學裂解實現。為使親和性標籤從所關注的多肽分裂，可將特異性化學裂解或酶促裂解位點工程化於融合蛋白質中。融合序列的酶促移除可使用所屬領域的一般技術人員所己知的方法實現。如對於所屬領域的一般技術人員將顯而易見，用於移除融合序列的酶的選擇將由融合體的特性決定，而反應條件將由酶的選擇指定。化學裂解可使用所屬領域的一般技術人員已知的試劑(包含(但不限於)溴化氰、TEV蛋白酶以及其它試劑)實現。裂解試劑的實例包含(但不限於)甲酸、羥胺、膠原酶、因子Xa、腸激酶、腎素、羧基肽酶A以及羧基肽酶B。經裂解的hGH多肽可通過所屬領域的一般技術人員已知的方法從經裂解的融合序列和裂解試劑中純化。如對於所屬領域的一般技術人員將顯而易見，所述方法將由融合序列和多肽的特性和性質決定。用於純化的方法可包含(但不限於)尺寸排阻色譜法、疏水性相互作用色譜法、離子交換色譜法或透析或其任何組合。隨著發展中蛋白質和肽治療劑的數目的增加，對成本不高且不難擴大規模的高效、經濟且大規模的蛋白質純化法存在需求。可使用樹脂或所屬領域的技術人員已知的其它物質分離多肽。圖10展示利用與非天然胺基酸反應的樹脂的非天然胺基酸多肽的純化方法的實例。在樹脂上的化學特異性親和性標籤與蛋白質中存在的非天然胺基酸之間形成共價鍵。所述鍵在寬範圍的pH值和純化條件下為穩定的。分離步驟可以交替模式進行，所述交替模式包含(但不限於)能夠進行大規模純化的浴模式。樹脂與親和性標籤在物理上和化學上都為穩定的，且因此可再使用以降低規模擴大後的蛋白質純化的成本。分離可與多肽與分子(包含(但不限於)PEG)的接合組合進行。這種"一鍋式"方法進一步簡化接合過程且降低蛋白質(包含(但不限於)標靶治療蛋白質)的製造成本(圖11)。可根據多肽中所存在的非天然胺基酸選擇且使樹脂官能化。圖12展示樹脂選擇和官能化的實例。視多肽中的非天然胺基酸而定，用於純化的樹脂或其它基質可用不同官能團官能化。舉例來說，圖13展示使用羥胺樹脂的非天然胺基酸多肽的親和力純化的實例。圖14展示使用醛樹脂的非天然胺基酸多肽的純化的實例。再生純化方法中所使用的基質的能力也提供大規模生產的優點。在一些實施例中，純化過程將多肽中所存在的一個或一個以上非天然胺基酸改為一個或一個以上天然胺基酸。圖15展示從非天然胺基酸前驅體純化天然蛋白質的實例。在非天然胺基酸從純化過程中所使用的樹脂中釋放後，其轉化為酪胺酸。圖16展示非天然胺基酸的非限定性實例。可使用兩種或兩種以上蛋白質的組中所存在的非天然胺基酸純化多肽複合物。非天然胺基酸可彼此鍵結或通過連接子、聚合物或使得能夠純化多肽複合物的另一分子接合。可以這種方式分離的多肽包含(但不限於)多亞單元受體或酶。用於分離複合物的技術可使用一種或一種以上多肽中所存在的一個或一個以上另外的非天然胺基酸。用於分離大蛋白質的技術為所屬領域的一般技術人員所已知。多肽複合物的解離可使用一種或一種以上多肽中所存在的一個或一個以上非天然胺基酸進行。可使一個或一個以上非天然胺基酸與另一具有使得複合物中的多肽分離的官能團的分子反應。在一些實施例中，多肽可因涉及多肽中所存在的一個或一個以上非天然胺基酸的非共價相互作用而形成複合物。在一些實施例中，歸因於多肽中所存在的一個或一個以上非天然胺基酸，可使用電/化學相互作用(諸如電場或磁場)純化多肽。在其它實施例中，可使用非天然胺基酸多肽實現單細胞純化或分離。XII.文庫篩檢1.高通量篩檢用於本文中所揭露的非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段的篩檢過程的技術方法包含(但不限於)基於多孔板的篩檢系統、基於細胞的篩檢系統、基於微流體的篩檢系統以及以固相合成藥物組分篩檢可溶性標靶。自動多孔格式為成熟的高通量篩檢系統。廣泛使用自動96孔板基篩檢系統。可製備基於板的篩檢系統以進一步減小反應孔的體積，從而增加每板的孔密度。本發明中也可使用其它類型的高通量檢定，諸如微型化細胞基檢定。微型化細胞基檢定歸因於其活體內性質具有產生高質量和準確性的篩檢數據的潛能。在活體外反應中在溶液中測量的微流體基篩檢系統使用十微米到數百微米寬的通道。微泵、電滲流、整合式閥門以及混合裝置控制液體通過通道網絡的運動。用於篩檢的文庫可分為(僅舉例來說)基於通用篩檢或模板的文庫，諸如具有常見雜環晶格的組；目標選擇，諸如基於機制的選擇，例如激酶調節劑、GPCR配位體、抗感染劑、鉀通道調節劑以及蛋白酶抑制劑；優先結構，諸如含有化學基元的化合物，與其它結構相比，其更通常與較高生物活性相關；多樣性，諸如預先選自具有最大化學82多樣性的可用庫存的化合物；植物提取物；天然產物/天然產物來源的產物等。A.化學文庫組合化學文庫為參與新化合物先導物的產生的方式。組合化學文庫為由化學合成或生物合成通過組合大量化學"基本組分(buildingblock)"(諸如試劑)產生的多樣性化合物的集合。通過化學基本組分的所述組合混合可合成數百萬種化合物。如Lipinski"5規則(ruleoffive)"需求中所述，H鍵供體和接受體的LogP、分子量、數目有助於確定類藥特徵的強有力候選物。Lipinski"5規則"要求化合物具有以下性質氫鍵供體為5個或5個以下；分子量小於或等於500Da;所計算出的LogP小於或等於5;以及氫鍵接受體為10個或10個以下。與通過組合化學和/或高通量合成法獲得的化合物文庫聯合的高通量篩檢技術可用於快速鑑別且優化如本文中所揭露的非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段的配位體。有機化合物的化學多樣性文庫包含(但不限於)苯並二氮呼；多變體(diversomer),諸如乙內醯脲、苯並二氮呼以及小化合物文庫的類似有機合成；寡聚文庫，諸如肽、N-垸基甘氨酸、聚氨基甲酸酯以及聚脲；寡聚氨基甲酸酯和/或膦酸二肽酯；碳水化合物文庫；手性化合物文庫以及小有機分子文庫。已通過固相法合成多種雜環化合物文庫。所述化合物包含(僅舉例來說)苯並二氮呼、吡咯烷、乙內醯脲、1,4-二氫吡啶、異喹啉酮、二酮哌嗪、苯甲基哌嗪、喹諾酮、二氫和四氫異喹啉酮、4-噻唑烷酮、e-內醯胺、苯並異噻唑酮、吡咯以及咪唑。無機化合物的組合文庫包含(但不限於)(a)金屬和主族元素的氧化物，包含過渡金屬氧化物，諸如氧化鋯、二氧化鈦、氧化錳，稀土氧化物，諸如二氧化鈰和氧化鑭；二元、三元和三元以上複合固態氧化物以及陶瓷相；氧化鋁、二氧化矽、鋁矽酸鹽以及鋁磷酸鹽的各種形式；(b)鋁矽酸鹽和矽酸鹽沸石的天然和合成形式，諸如ZSM-5、e、沸石Y以及鎂鹼沸石，分子篩的各種形式，諸如鋁磷酸鹽和鈦矽酸鹽；天然或合成粘土以及相關礦物質，諸如高嶺土、矽鎂土、滑石、蒙脫石以及Laponite;(c)非氧化物陶瓷，諸如金屬碳化物和氮化物；(d)碳的各種形式，諸如活性碳、碳分子篩、石墨、富勒烯(fullerene)、納米碳管以及碳黑；(e)各種有機聚合物、寡聚物或樹脂，諸如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚醯胺、滷代烴聚合物、聚酯等；(f)金屬，諸如沉積、混合或交換於任何支撐物(諸如以上(a)-(e)中所述的任何物質)中的貴金屬和/或過渡金屬。所述相的實例包含Pt/氧化鋁、Pd/氧化鋁以及Cu-ZSM-5。B.生物文庫使用微生物的肽文庫免疫系統的抗體和免疫細胞受體為代表性生物文庫。在免疫系統中，所有文庫設計、合成以及優化的過程都是由有機體自身控制的。僅抗原和形成胚胎因子的遺傳信息的結構為外部條件，但其餘由內在因素自發控制。因為免疫系統使用蛋白質結構文庫，所以其是使用胺基酸作為基本因子的文庫。因為由胺基酸形成的肽或蛋白質是通過翻譯遺傳信息所合成的第一產物，通過遺傳工程技術，可通過將經修飾遺傳信息插入如細菌或病毒的微生物中容易地獲得所需序列的蛋白質。微生物文庫合成具有數個優點。有可能克隆微生物以每種微生物僅產生一種蛋白質，且即使僅獲得一個細胞，但克隆的數目可通過細胞增殖容易地增加。使用微生物的另一優點在於當存在足夠供應時，其可自我繁殖。合成產生所需蛋白質序列的DNA鏈後，需要時通過酶來合成其互補鏈。對用於在微生物中適當複製且翻譯的所合成的DNA來說，需要用載體包裝且插入微生物中。下一步是使蛋白質表達於微生物表面上且尋找所需蛋白質。為製造文庫，需要各種遺傳信息。可使用特定有機體的隨機DNA合成或切割cDNA或整個基因組DNA。可修飾產生特定蛋白質的DNA序列的部分以製造突變型蛋白質文庫。考慮到微生物培育的體積限制和表達速率，可製造109(十億)種文庫。與106至107種合成文庫相比，此為一個巨大的數目。5單元肽的數目是205(320萬)，6單元肽的數目是6400萬，且7單元肽的數目超過十億。因此，如果改變超過7個胺基酸，那麼製造出並非含有所有可能的組合的不完整文庫。對長蛋白質來說，可獨立選擇7個不同胺基酸並替換。當隨機合成DNA時，DNA代碼可重複且指定同一胺基酸，且產生頻率改變。因此，為產生所有可能的組合，需要更多數量的克隆。線性組合生物文庫(諸如多肽文庫)是通過以任何可能的方式組合一組化學基本組分(稱為胺基酸)達給定的化合物長度(即，多肽化合物中的胺基酸的數目)來形成。蛋白質可為蛋白質家族的成員，所述蛋白質家族諸如受體家族(實例生長因子受體、兒茶酚胺受體、胺基酸衍生物受體、細胞激素受體、凝集素)、配位體家族(實例細胞激素、絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin))、酶家族(實例蛋白酶、激酶、磷酸酶、類rasGTP酶、水解酶)、轉錄因子(實例類固醇激素受體、熱休克轉錄因子、鋅指、白胺酸拉鏈、同源異型結構域)、HIV蛋白酶或C型肝炎病毒(HCV)蛋白酶以及抗體或抗體片段(例如，Fab)。其它實例諸如類肽、所編碼的肽、隨機生物寡聚物、二肽、插烯多肽、具有0D葡萄糖支架的非肽擬肽、抗體文庫以及肽核酸文庫。噬菌體文庫其為許多蛋白質文庫法中的一種。噬菌體生活在細菌宿主中且為一種具有遺傳物質和衣殼的病毒。M13和入病毒最著名。M13為細長病毒，且因其具有小的基因組大小而可容易地製造出眾多文庫。與其它病毒不同，其可來到宿主細胞外部而不對宿主細胞產生損傷或抑制宿主細胞生長。己知M13在宿主細胞中擴增其遺傳信息且當排出時穿戴上衣殼。其產生IO種蛋白質且其中pvin和piii衣殼常用於文庫合成。pvm蛋白質包裹周身且具有約50個胺基酸。通常每個病毒表達2700個。因為其氨基端伸出衣殼外部，所以其可經修飾以在其上表達不同肽。雖然通常不能表達長肽，但有可能表達6單元肽。因為同時表達大量相同文庫分子，所以儘管其尺寸相對較短，但其適於與各種配位體的反應。pm蛋白質表達於病毒末端，且通常表達3至5個具有406個胺基酸的蛋白質。其可表達非常大的蛋白質，從而其用於整個蛋白質或抗體分子文庫。正常抗體使用Fab、抗原識別區或Fvs鏈。噬菌體文庫和融合瘤為製造抗體的最著名的方法。M13對於製造隨機肽文庫為理想的，且所述病毒足夠穩定來沉澱且濃縮，從而可能以l-10微升的體積篩檢109個文庫。與M13不同，A病毒在細胞質中使其自身包覆衣殼且當存在足夠數目時從其宿主細胞釋放出來，而不是在排出時穿戴衣殼。換句話說，如果表達不同蛋白質，那麼其將很可能以具有適當功能的摺疊形狀排出。pV和D蛋白質常用於文庫合成。對可表達於噬菌體表面上的蛋白質來說，存在隨機肽、天然蛋白質片段、突變型特定蛋白質文庫以及部分抗體片段，且其用於色譜物質、蛋白質-蛋白質相互反應、受體結合位點搜尋以及藥物發現。噬菌體呈現為廣泛使用的製造肽文庫的技術。所述肽文庫適用於篩檢以鑑別具有特定所需活性(諸如與另一多肽或其它分子結合)的肽。在噬菌體呈現中，使肽文庫與噬菌體蛋白質(通常呈現於噬菌體表面上的鞘蛋白)融合。使帶有肽的噬菌體的文庫與經固定結合搭配物(諸如細胞表面或純化蛋白質)接觸，且隨後分離特定結合物。噬菌體呈現技術和文庫描述於美國專利第5580717號、第5702892號、第5750344號、第5821047號、第5962255號、第6140471號、第6475806號、第5427908號、第5667988號、第5733743號、第5750373號、第5824520號、第6096551號、第6225447號、第6492160號中，其是以引用的方式全部併入本文中。美國專利第5,750,373號(其是以引用的方式全部併入本文中)描述選擇新穎蛋白質(諸如生長激素)和對各自受體分子具有改變的結合性質的抗體片段變異體的方法。所述方法包括使編碼所關注蛋白質的基因與絲狀噬菌體M13的基因m鞘蛋白的羧基未端域融合。細菌和酵母文庫不僅具有衣殼的病毒，而且具有細胞壁和細胞膜的細菌也可用於文庫表達。可使用革蘭氏陽性菌(gram-positivebacteria)與革蘭氏陰性菌將蛋白質表達於細胞表面上，且通常使用革蘭氏陰性菌大腸桿菌。細菌文庫可尋找與某種抗體強有力結合的抗原且將其用作疫苗，或其可表達用於分析特定物質的診斷抗體或受體文庫。此稱為翻譯修飾，其是在蛋白質合成後，通過磷酸化或糖添加來修飾高等動物的蛋白質。但原核生物細菌不具有這種功能，且即使合成蛋白質時，在大多數情況下，其因其不良溶解性而沉澱，或失活。因此，使用真核生物釀酒酵母(S.cerevisiae)。儘管釀酒酵母像細菌一樣為單細胞，但其具有翻譯修飾功能，且可製造極類似於原始物質的蛋白質。與病毒不同，其具有微米尺寸細胞，從而可使用螢光活化細胞分選術(fluorescence-activatedcellsorting,FACS)。可將經螢光標記的標耙分子添加到表達於細胞表面上的蛋白質的文庫中且流經FACS機器的薄壁管。FACS通過螢光色和強度分選處於生活狀態下的各細胞。有可能篩檢具有不同顏色的不同靶分子，且也有可能分選具有不同強度和選擇性的細胞。另一優點為液相篩檢。沒必要分離強烈粘附的分子。使所分選的細胞再次增殖且對其進行再篩檢。酵母表面呈現技術也廣泛用於產生和呈現肽文庫。酵母表面呈現可與螢光活化細胞分選組合用於選擇呈現所需肽的細胞。酵母表面呈現技術和文庫描述於美國專利第6083693號、第6406863號、第6410271號、第6232074號、第6410246號、第6610472號中，其是以引用的方式全部併入本文中。細菌表面呈現已以多種形式用於將肽呈現於細胞表面上或周質中。多種細菌宿主可用於這一系統中，如多種將所呈現的肽錨定於細胞表面上的多肽錨定域。細菌表面呈現技術和文庫描述於美國專利第5348867號、第5866344號、第6277588號、第5635182號、第6180341號中，其是以引用的方式全部併入本文中。使用其它活體內系統製造多肽文庫且鑑別由胺基酸序列的變化產生的活性的變化，諸如標靶蛋白質結合調節。活體內系統的實例包含(但不限於)酵母雙雜交系統(Schneider,S等人，Nat.Biotechnol.,17,170-175(19卯))和二氫葉酸還原酶蛋白質片段互補檢定(Pellitier,N丄等人，Nat.Biotechnol.,17,683-6卯，(19卯))，其是以引用的方式併入本文中。生物淘選可使用所合成的微生物文庫尋找以高親和力與特定分子結合的肽。可將標靶分子(諸如如本文中所揭露的非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段)均勻地放置在測試板上。可將所製備的微生物文庫添加到板上。僅與標耙分子強有力結合的微生物將保留且其餘將留在溶液中。不久，可捨棄未結合的微生物，且隨後可用適當溶液洗滌弱或偶然結合的微生物。標靶分子的結合親和力決定洗滌方法。仍保留的微生物可通過添加低pH值或高濃縮標靶分子分開，且通過再培育擴增數量。有時，當親和力太強時，可能難以在不殺死細菌的情況下將其分離。如果其為噬菌體，則可直接感染其宿主細胞，而不是分離。因為仍會存在一些偶然結合的不想要的微生物，所以第一擴增微生物可經歷重複篩檢和擴增過程以增加含有活性蛋白質的克隆的數目。最後，在其以低濃度培育後，可分離各克隆，且通常可選擇數十個克隆且將其用於DNA序列分析。如果來自DNA信息的肽結構可識別且大部分克隆展示一致肽序列，那麼此為成功的。然而，因為蛋白質的數種克隆可具有毒性且DNA表達速率可變化，所以可能存在選擇比所需篩檢結果更快的增殖和充分表達的克隆的可能性。因此，通過測量肽合成和結合親和力的證實步驟是必要的。微生物蛋白質文庫技術根本上使用生活有機體的自我繁殖能力。g卩，通過擴增(饋給)少量所獲得的候選分子，可增加純度和數量。核糖體呈現核糖體呈現和mRNA呈現技術也廣泛用於製造肽文庫。核糖體呈現和mRNA呈現為在核糖體上或通過使用嘌呤黴素(puromycin)使編碼肽的mRNA與所編碼的肽偶合的活體外技術。核糖體呈現和mRNA呈現技術和文庫描述於美國專利第6416950號、第6436665號、第6602685號、第6660473號、第6429300號、第6489116號、第6623926號、第6589741號、第6348315號、第6207446號、第6258558號、第6416950號、第6440695號、第6228994號、第6281344號、第6429300號、第6660473號、第5580717號、第5688670號、第6238865號、第6261804號、第6518018號、第6281344號、第6258558號、第6214553號中，其是以引用的方式全部併入本文中。DNA、RNA-文庫DNA擴增技術PCR的發展已使得能夠使用核酸作為文庫。因為DNA和RNA由4種單元構成，所以10寡聚物具有410(約106-—百萬)種，且20寡聚物文庫可具有約1012種。通過使用自動固相DNA合成器，固定序列中的5'端和3'端且隨機放置A、T、C以及G，各佔序列的約25%。當已製成一條鏈時，可將其通過使用酶複製或通過PCR擴增。雖然通常製造且使用約1014-15個分子，但偶爾存在約40個位置(1024種)以供隨機引入，有時其以不完整組的文庫開始。對DNA文庫來說，簡單地使用DNA自身，但對RNA文庫來說，需要T7RNA聚合酶來轉錄。所製備的文庫通過標靶分子結合篩檢加以分選；對DNA來說，通過PCR擴增，且對RNA來說，通過RT-PCR擴增。可使用如本文中所揭露的非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段作為標靶分子。重複所擴增文庫的篩檢和擴增直到開始數目1014—15範圍變窄到數百個，且隨後分析所獲得的候選分子的序列，且測量各自的結合親和力。所述所獲得的DNA和RNA稱為適體(aptamer)，且其對蛋白質標靶分子展示強親和力。適體在活體內抑制標靶分子的功能，但其被活體內核酸酶快速破壞。為解決這一問題，文庫的一些部分經人工核酸取代以增加對核酸酶的抗性。生物文庫的數個實例包含(但不限於)生物活性脂質文庫；內源性大麻素文庫在大麻素(cannabinoid，CB)和辣椒素(vanniloid，VR)受體處具有活性的化合物，其包含各類配位體，例如醯胺、乙醇醯胺、脂胺基酸、醯基-Y-氨基丁酸(Acyl-GABA)以及醯基多巴胺(Acyl-d(jpamine)等；已知生物活性文庫，諸如GPCR配位體、第二信使調節劑、細胞核受體配位體、肌動蛋白和微管蛋白調節劑、激酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、離子通道阻斷劑、基因調控劑、脂質生物合成抑制劑等；離子通道配位體文庫；激酶/磷酸酶抑制劑文庫；天然產物文庫天然產物為化學多樣性的非常卓越的來源且為藥理學活性小分子的任何篩檢程序的理想起點；神經傳遞素文庫CNS受體配位體，諸如腎上腺素能藥、多巴胺能藥、血清素能藥(Serotonergics)、鴉片樣物質(和o配位體)、膽鹼能藥、組織胺能藥(和抑黑素配位體)、離子移變穀氨酸能藥(IonotropicGlutamatergics)、代謝移變穀氨酸能藥(MetabotropicGlutamatergics)、Y-氨基丁酸能藥(GABAergics)以及嘌呤能藥(Purinergics)(和腺苷)等；細胞核受體配位體文庫細胞核受體配位體文庫含有在細胞核受體處結合的化合物。可包含受體激動劑和拮抗劑；孤配位體文庫孤配位體文庫含有具有生物活性的化合物，但其蛋白質結合搭配物尚未鑑別出。舉例來說，痕量胺、神經傳遞素代謝物、內源性e-咔啉、尿中代謝物、菸鹼同源物以及D-胺基酸等。2.篩檢方法
技術領域：
：本發明提供鑑別與蛋白質結合或充當蛋白質的結合特徵或生物活性的調節劑的候選藥劑的方法。檢定可以多種方式進行，所述方式包含用已知分子篩檢非天然胺基酸多肽文庫，或反之亦然。在一實施例中，在單個試管中或以小規模進行所述方法。在另一實施例中，同時多重執行所述方法。舉例來說，可在多孔篩檢板中同時對多個檢定混合物執行所述方法。因此，在一方面中，本發明提供高通量篩檢系統。在一實施例中，在檢定相互作用方面，利用螢光或吸光度讀數來確定活性。僅舉例來說，檢定的其它生物活性為乙醯化、羧化、醯化、磷酸化、脫磷酸化、泛素化、糖基化、脂質修飾、ADP核糖基化、生物可用性以及半衰期。存在許多所屬領域的技術人員已知的也可用於在篩檢檢定中檢測非天然胺基酸多肽與另一分子之間的相互作用的方法。所述方法可包含(僅舉例來說)螢光結合-結合檢定、熱轉移檢定、電泳遷移率轉移檢定、蛋白質-蛋白質結合檢定、生物化學篩檢檢定、免疫檢定(即，免疫沉澱法)和基於細胞的檢定(即雙或三雜交篩檢、GST釣餌(GSTpulldown)、TAP-TAG系統)、表達檢定、蛋白質-DNA結合檢定、功能檢定(磷酸化檢定等)以及其類似方法。例如參看美國專利第6,495,337號，其是以引用的方式併入本文中。其它方法也可包含蛋白質晶片系統，所述系統可篩檢有助於進行蛋白質-蛋白質相免疫檢定的酶、受體蛋白質或抗體(MacBeath和Schreiber,Sc/e"ce2000289:1760-1763)。另一實施例可涉及通過對DNA和已知與非天然胺基酸多肽相互作用的其它蛋白質使用螢光染色且使用螢光顯微術產生的圖片來測量細胞特性的變化探測細胞生理學來繪示可在引入功能性非天然胺基酸多肽的完整細胞中起作用的藥物(Mayer,T.U.，Kapoor,T.M.,Haggarty,S.J.，King,R.W"Schreiber，S丄.，Mitchison，T丄(1999).Scze"ce.篇，971-4)。具體來說，存在眾多可進行測試配位體與非天然胺基酸多肽結合的檢測(且因此進行非天然胺基酸多肽的配位體的鑑別)的方法。適用的方法為可區別摺疊非天然胺基酸多肽與展開的非天然胺基酸多肽的那些方法。僅舉例來說，如下所述的方法為一些可進行此操作的方法。在各種情況下，在已度過足以使非天然胺基酸多肽與其配位體結合的時間後，對測試組合(測試配位體-非天然胺基酸多肽組合)執行所述檢測方法，且對對照組合(其與測試組合相同，其中例外為不存在測試配位體)執行所述檢測方法。A.確定摺疊非天然胺基酸多肽的存在的方法在本發明方法中，可將測試配位體與非天然胺基酸多肽組合，其中所述多肽的配位體(即，結合非天然胺基酸多肽的因子)正待鑑別。所得組合為測試配位體-非天然胺基酸多肽組合或測試組合。測試配位體通常以相對於非天然胺基酸多肽過量的摩爾量存在。本發明方法可以溶液形式進行，或在所述方法的一些實施例中，非天然胺基酸多肽可存在於固相上(例如，通過連接子共價鍵聯或以其他方式共價鍵聯於珠粒)。在適於使非天然胺基酸多肽與配位體結合的條件(例如，溫度、pH值、鹽濃度、時間)下，使測試配位體與非天然胺基酸多肽組合。另外，對可逆展開的非天然胺基酸多肽來說，測試配位體與非天然胺基酸多肽組合的條件通常為使得在不存在測試配位體的情況下，實質比例的非天然胺基酸多肽以展開形式存在的條件，但所述比例可根據所使用的檢測方法而變化。在不可逆展開的非天然胺基酸多肽的情況下，條件通常為使得在不存在配位體的情況下，非天然胺基酸多肽以實質速率展開的條件。所述條件經選擇以確保非天然胺基酸多肽展開到適當程度；因此可方便地測量所觀察到的信號(例如，通過蛋白酶消化；與抗體、伴侶蛋白(chaperonin)或表面的結合)。如果太少的非天然胺基酸多肽展開，那麼所觀察到的信號將以太低而不能方便地測量的程度或速率出現。對所評估的各測試配位體-非天然胺基酸多肽組合來說，將使用已知方法憑經驗確定執行本發明方法的條件。所述條件包含反應溫度和所使用的離液劑或變性劑。執行所述方法的溫度由正使用的非天然胺基酸多肽確定且可使用已知方法憑經驗確定。為調節或優化展開非天然胺基酸多肽的比例，對一些非天然胺基酸多肽來說，可能需要變性條件。所述變性條件89可包含使用高溫、向培育混合物中添加蛋白質變性劑(例如，脲、胍)或使用兩者。另外，可通過工程化非天然胺基酸多肽中的不穩定或穩定胺基酸取代來調節一些非天然胺基酸多肽的穩定性。將測試配位體與非天然胺基酸多肽組合，維持在適當條件下且歷時足以使非天然胺基酸多肽與配位體結合的時間。非天然胺基酸多肽與配位體結合所需的時間將視測試配位體、非天然胺基酸多肽以及所使用的其它條件而變化。在一些情況下，結合會即刻發生(例如，大體上與測試配位體與非天然胺基酸多肽的組合同時發生)，而在其他情況下，將所得測試配位體-非天然胺基酸多肽組合在檢測結合之前維持較長時間。在不可逆展開的非天然胺基酸多肽的情況下，展開速率也須考慮確定結合測試配位體的適當時間。以以下數種方式中的一種評估測試配位體與非天然胺基酸多肽的結合通過確定摺疊非天然胺基酸多肽存在於測試配位體-非天然胺基酸多肽組合中的程度；通過確定展開非天然胺基酸多肽存在於測試配位體-非天然胺基酸多肽組合中的程度或通過確定組合中摺疊非天然胺基酸多肽與展開非天然胺基酸多肽的比率。即，在存在測試配位體的情況下和不存在測試配位體的情況下，測定摺疊非天然胺基酸多肽的量、展開非天然胺基酸多肽的量之間的差異或摺疊非天然胺基酸多肽與展開非天然胺基酸多肽的比率。如果測試配位體結合非天然胺基酸多肽(即，如果測試配位體為非天然胺基酸多肽的配位體)，那麼與不存在結合非天然胺基酸多肽的測試配位體的情況相比，會存在較多摺疊非天然胺基酸多肽和較少展開非天然胺基酸多肽(且因此，較高的摺疊與展開非天然胺基酸多肽的比率和較低的展開與摺疊非天然胺基酸多肽的比率)。不必測定摺疊和展開非天然胺基酸多肽的數量或比例。僅需知道，在存在和不存在配位體的情況下，摺疊或展開蛋白質的量存在差異(兩種形式平衡時的變化)或展開速率的變化。這一差異可通過比較摺疊和/或展開非天然胺基酸多肽存在於測試組合(測試配位體-非天然胺基酸多肽組合)中的程度與其存在於對照組合中(不存在測試配位體情況下的非天然胺基酸多肽)的程度來確定。或者，對可逆展開來說，在不存在測試配位體的情況下，可通過測定其最初(例如，在向非天然胺基酸多肽溶液或固體支撐物結合測試蛋白質中添加測試配位體之前)和隨後在適於發生非天然胺基酸多肽-配位體結合的條件下測試配位體與非天然胺基酸多肽組合後的出現率來評估兩種形式出現的程度的差異。在任一種情況下，可使用多種如下所述的已知方法進行非天然胺基酸多肽的兩種形式的測定。通過本發明方法展示結合非天然胺基酸多肽的測試配位體稱為非天然胺基酸多肽的配位體。1.使用蛋白質水解確定配位體結合在本發明方法的一實施例中，通過使用蛋白質水解檢測測試配位體與非天然胺基酸多肽的結合。在這一實施例中，使優先作用於展開非天然胺基酸多肽的蛋白酶與測試配位體-非天然胺基酸多肽組合(測試組合)加以組合，且在適當培育期後，使用下文詳細描述的方法中的一種檢定所得測試組合-蛋白酶混合物以測定在存在和不存在測試配位體的情況下，完整或降解非天然胺基酸多肽之間的差異。對測試配位體-非天然胺基酸多肽組合和對照組合執行相同檢定且比較兩個檢定的結果。與對照組合相比，測試組合中的較多完整蛋白質或較少降解蛋白質表明測試配位體已結合非天然胺基酸多肽，且因此表明測試配位體為非天然胺基酸多肽的配位體。類似地，與對照相比，測試組合中較高的完整非天然胺基酸多肽與降解蛋白質的比率表明測試配位體為非天然胺基酸多肽的配位體。在這一實施例中可使用多種蛋白酶，諸如胰蛋白酶、糜蛋白酶、V8蛋白酶、彈性蛋白酶、羧基肽酶、蛋白酶K、嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)以及枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)。僅需在所選擇的培育條件下，所使用的蛋白酶能夠作用於所使用的非天然胺基酸多肽(水解其肽鍵)且這一作用優先針對蛋白質的展開形式。為避免被直接抑制蛋白酶的標靶配位體幹擾，可同時或在並行檢定中使用一種以上蛋白酶。為有效消化肽鍵，肽底物(非天然胺基酸多肽)須到達所選蛋白酶的酶活性位點。因為摺疊蛋白質分子中的原子緊密壓實，所以當蛋白質處於摺疊狀態時，大部分易受影響的肽鍵在空間上被阻斷進入蛋白酶活性位點。在展開狀態時，肽鍵暴露較多且因此相對較易受蛋白酶作用。因此，添加結合摺疊非天然胺基酸多肽的測試配位體，從而使其穩定為蛋白酶抗性形式，這改變蛋白質水解的速率。因此，通過將測試配位體與非天然胺基酸多肽一起培育，添加蛋白酶以優先降解展開蛋白質，且隨後使用檢定以定量完整或降解非天然胺基酸多肽，有可能探知測試配位體是否結合非天然胺基酸多肽，且因此探知其是否為非天然胺基酸多肽的配位體，從而指示其在治療上潛在適用。或者，蛋白酶可為未純化或部分純化的非天然胺基酸多肽樣品所內在的。2.通過檢測表面結合確定配位體結合在本發明方法的另一實施例中，利用展開蛋白質粘附於表面的傾向。這一實施例依賴於摺疊蛋白質以特定三維排列保持且因此不同於其展開對應物而結合表面的事實。如果測試配位體結合非天然胺基酸多肽(即，其為非天然胺基酸多肽的配位體)，那麼其將使非天然胺基酸多肽的摺疊形式穩定。因此，測試配位體結合非天然胺基酸多肽的能力可通過評估在存在和不存在測試配位體的情況下非天然胺基酸多肽結合於適當固體表面的程度來測定。出於此目的，可使用下文詳細描述的方法。在這一實施例中，將非天然胺基酸多肽、測試配位體以及優先結合展開蛋白質的表面組合且維持在適於使非天然胺基酸多肽與配位體結合和使展開非天然胺基酸多肽與表面結合的條件下。出於此目的，存在眾多合適的表面，包含由多種經處理或未經處理的塑料構造的微量滴定板、經處理用於組織培養或高蛋白質結合的板、硝化纖維素過濾器以及PVDF過濾器。如果測試配位體結合非天然胺基酸多肽，那麼與可比對照組合相比，測試配位體-非天然胺基酸多肽組合中存在較多摺疊非天然胺基酸多肽和較少展開非天然胺基酸多肽。目卩，在存在為非天然胺基酸多肽的配位體的測試配位體的情況下，與不存在非天然胺基酸多肽的配位體的情況相比，較少展開蛋白質可用於結合優先結合展開蛋白質的表面。可使用如下所述的方法中的一種進行表面結合的非天然胺基酸多肽的量或保留在溶液中的非天然胺基酸多肽的量的測定。如果與不存在測試配位體的情況相比，在存在測試配位體的情況下，較多非天然胺基酸多肽未結合表面(即，如果較多非天然胺基酸多肽存在於溶液中)，那麼測試配位體為非天然胺基酸多肽的配位體。與測試配位體不為非天然胺基酸多肽的配位體的情況相比，在測試配位體為非天然胺基酸多肽的配位體的情況下，溶液中的非天然胺基酸多肽相比表面結合的非天然胺基酸多肽的比率較高。相反地，與測試配位體不為非天然胺基酸多肽的配位體的情況相比，在測試配位體為非天然胺基酸多肽的配位體的情況下，表面結合的非天然胺基酸多肽相比溶液中的非天然胺基酸多肽的比率較低。3.使用抗體結合確定配位體結合在第三實施例中，通過使用僅針對展開狀態("變性特異性抗體"或"DS抗體")或僅摺疊狀態("性質特異性抗體"或"NS抗體")的特定抗體評估存在摺疊與展開非天然胺基酸多肽的程度且因此評估測試配位體與非天然胺基酸多肽的結合。當非天然胺基酸多肽處於摺疊狀態且通過為非天然胺基酸多肽的配位體的測試配位體穩定於這一狀態時，DS抗體的表觀結合親和力將降低(Breyer,(1989)"ProductionandCharacterizationofMono-clonalAntibodiestotheN-terminalDomainoftheLambdaRepressor",/扁.C&附.,264(5):13348-13354)且NS抗體的表觀結合親和力將增強。如果與不存在測試配位體的情況相比，在存在測試配位體的情況下，與非天然胺基酸多肽結合的DS抗體較少或如果NS抗體結合較多，那麼測試配位體為非天然胺基酸多肽的配位體o存在眾多所屬領域中已知的製造與特定蛋白質結合的抗體的方法(Harlow,E.和D.Lane,ANTIBODIES:ALABORATORYMANUAL,ColdSpringHarborLaboratory,1988，其是以引用的方式併入本文中)。為製備對變性狀態具有特異性的抗體，可用來自在天然狀態下受到掩蔽的蛋白質的區域的肽使動物免疫。如果蛋白質的結構未知，那麼可製備針對數種肽的抗體，且隨後可就與變性狀態的優先結合篩檢抗體。抗體產生是通過標準技術進行，諸如用於產生單克隆抗體的技術，其詳細描述於Zola,MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques,CRCPress,Inc.,BocaRaton，Fla.(1987)中，其是以引用的方式併入本文中。存在至少三種可利用DS或NS抗體檢測配位體誘導的摺疊非天然胺基酸多肽的出現率、展開蛋白質的出現率或彼此間的比率的變化的基本方法。在一方法中，諸如在塗布有變性非天然胺基酸多肽或其肽片段的微量滴定板中，在適於使非天然胺基酸多肽與其配位體結合和使DS抗體與展開非天然胺基酸多肽結合的條件下培育含有針對展開非天然胺基酸多肽的DS抗體、非天然胺基酸多肽以及測試配位體的測試溶液。以與測試溶液相同的方式處理與測試溶液相同但例外為不含測試配位體的對照溶液。通過比較測試溶液與對照溶液中的結合於板的抗體的量或保留在溶液中的量，檢測非天然胺基酸多肽摺疊的差異。可如下所述測量結合於板或保留在溶液中的抗體的量。在第二種方法中，在塗布有稱為固相抗體的第二抗體的板中培育含有DS抗體、測試配位體以及非天然胺基酸多肽的測試溶液，所述第二抗體不能與DS抗體同時與非天然胺基酸多肽結合且其對非天然胺基酸多肽具有特異性，但對摺疊狀態("天然特異性"或"NS抗體")具有特異性或不能區分天然狀態與變性狀態("非區分"或"ND抗體")。將所得測試組合或溶液維持在適於使非天然胺基酸多肽與非天然胺基酸多肽的配位體結合和使抗體與其識別(對其具有特異性)的蛋白質結合的條件下。以與測試溶液相同的方式處理與測試溶液相同但例外為不含測試配位體的對照溶液。在兩種溶液中，變性(展開)非天然胺基酸多肽結合DS抗體且關於結合固相抗體受到抑制。可通過測定測試溶液中與固相抗體結合的非天然胺基酸多肽的量且將其與在不存在測試配位體的情況下非天然胺基酸多肽與固相抗體結合的程度(其轉而反映呈摺疊狀態的非天然胺基酸多肽的量)比較來計量測試配位體結合非天然胺基酸多肽的能力。可通過如下所述的方法檢測通過第二抗體結合於板或保留在溶液中的非天然胺基酸多肽的量。對溶液中的抗體和於固相上的DS或ND抗體來說，可以可比於NS抗體的方式使用這種方法。在第三種方法中，在容器(諸如已塗布有DS或NS抗體的微量滴定孔)中培育含有非天然胺基酸多肽和測試配位體的測試溶液，且維持在適於使非天然胺基酸多肽與其配位體結合和使抗體與非天然胺基酸多肽結合的條件下。或者，抗體可存在於珠粒表面上。通過測定在存在和不存在測試配位體的情況下非天然胺基酸多肽保留在溶液(未結合於抗體)中或固體表面(結合於抗體)上的程度或兩者的比率來計量測試配位體結合非天然胺基酸多肽的能力。如果測試配位體結合非天然胺基酸多肽(其為非天然胺基酸多肽的配位體)，那麼與對照溶液中結合於抗體的情況相比，會存在較少結合於DS抗體的非天然胺基酸多肽或較多結合於NS抗體的非天然胺基酸多肽(即，在DS抗體的情況下，溶液中會有較多非天然胺基酸多肽，而對NS抗體來說，溶液中會較少)。在另一實施例中，抗體可存在於溶液中，且可將非天然胺基酸多肽連接至固相，諸如板表面或珠粒表面。4.使用分子伴侶確定配位體結合在第四實施例中，使用分子伴侶確定測試配位體與非天然胺基酸多肽的結合。伴侶為多種結合展開蛋白質作為其正常生理功能的部分的蛋白質。其通常涉及裝配寡聚蛋白質，確保某些蛋白質恰當摺疊，促進蛋白質定位以及生理應力期間阻止蛋白質聚集體形成。Hardy,(1991"AKineticPartitioningModelofSelectiveBindingofNormativeProteinsbytheBacterialChaperoneSecB",ScZe"ce251:439-443。所述蛋白質具有在不特異性識別確定序列基元的情況下與許多展開或部分變性蛋白質相互作用的能力。大腸桿菌中可見的一種分子伴侶為SecB。已證明SecB參與其它無關蛋白質的子集的輸出。競爭實驗已展示SecB與所有所測試的展開蛋白質(包含其特定輸出子集外部的蛋白質)緊密結合，但似乎不與摺疊蛋白質相互作用。在這一實施例中，在塗布有分子伴侶的微量滴定板或其它合適表面上在適於使非天然胺基酸多肽與其配位體結合和使所使用的分子伴侶與展開非天然胺基酸多肽結合的條件下培育含有測試配位體和標靶的測試溶液。溶液中的展開非天然胺基酸多肽相對於經配位體穩定的摺疊非天然胺基酸多肽將具有較大的結合分子伴侶覆蓋表面的傾向。因此，可通過使用下文詳述的方法測定保持未結合的非天然胺基酸多肽的量或結合於伴侶塗布表面的量確定測試配位體結合非天然胺基酸多肽的能力。或者，可利用與分子伴侶結合的競爭檢定。可在容器(諸如塗布有變性(展開)非天然胺基酸多肽的微量滴定孔)中在適於使非天然胺基酸多肽與其配位體結合和使分子伴侶與展開非天然胺基酸多肽結合的條件下培育含有經純化非天然胺基酸多肽、測試配位體以及分子伴侶的測試溶液。以相同方式處理與測試溶液相同但例外為不含測試配位體的對照溶液。溶液中的變性非天然胺基酸多肽將與伴侶蛋白結合，且因此，抑制其與結合於容器表面(微量滴定孔表面)的變性非天然胺基酸多肽的結合。測試配位體與非天然胺基酸多肽的結合將產生較小量的展開非天然胺基酸多肽，且因此，與不存在測試94配位體的結合的情況相比，較多伴侶將可用於與固相變性非天然胺基酸多肽結合。因此，測試配位體的結合可通過評估測試溶液和對照溶液中的結合於表面和在溶液中的伴侶且比較所述結果來確定。與對照溶液中相比，測試溶液中伴侶與固相變性非天然胺基酸多肽的結合的程度較大表明測試配位體與非天然胺基酸多肽結合(即，表明鑑別出非天然胺基酸多肽的配位體)。在這一檢定中，通常不以過量提供分子伴侶，從而可測量其結合的競爭。或者，可在容器(諸如，微量滴定孔)中培育含有非天然胺基酸多肽、測試配位體以及分子伴侶的測試溶液，所述容器表面塗布有抗血清或對摺疊非天然胺基酸多肽具有特異性(NS抗體)且不能結合結合於伴侶的非天然胺基酸多肽的單株抗體。展開非天然胺基酸多肽將結合溶液中的伴侶且因此抑制結合固相抗體。通過檢測溶液中或結合於孔壁的非天然胺基酸多肽且比較適當對照(無測試配位體的相同組合)中的所述任一者-或兩者的程度，可確定測試配位體結合非天然胺基酸多肽的能力。如果測試配位體為非天然胺基酸多肽的配位體，那麼與對照溶液中相比，在測試溶液中將有較多非天然胺基酸多肽與結合於容器表面的抗血清或單株抗體結合。相反地，與對照溶液中相比，測試溶液中將存在較少未結合(溶液中)的非天然胺基酸多肽。測試溶液和對照溶液中的結合非天然胺基酸多肽、未結合非天然胺基酸多肽或兩者的比率的檢測和比較表明測試配位體是否為非天然胺基酸多肽的配位體。5.通過測量蛋白質聚集確定配位體結合呈摺疊形式的蛋白質的比例越高，可用於與僅與摺疊狀態結合的配位體結合的蛋白質的量越大。因此，如果蛋白質具有已知配位體，那麼有可能通過添加結合蛋白質上的另一位點的配位體來增加蛋白質與已知配位體的結合。在這一方法中，將已知與非天然胺基酸多肽結合的配位體固定於固體基板上。然後添加含有非天然胺基酸多肽的溶液以及測試配位體或配位體。在不存在測試配位體的情況下，相對於相同檢定，與固定配位體結合的非天然胺基酸多肽的量的增加表明測試配位體結合非天然胺基酸多肽。可通過使用下文概述的檢測方法對固體基板取樣或對溶液取樣來評估結合於固體基板的非天然胺基酸多肽的量。6.通過測量蛋白質聚集確定配位體結合對不可逆展開的蛋白質來說，展開蛋白質通常形成不可溶聚集體。蛋白質聚集的程度可通過下文概述的諸如光散射、離心以及過濾的技術測量。在這一方法中，培育非天然胺基酸多肽和測試配位體，且隨時間或在固定培育時間後，測量蛋白質聚集的量。比較測試混合物中的蛋白質聚集的程度與不存在測試配位體的情況下對照檢定的相同測量。如果測試配位體結合非天然胺基酸多肽，那麼與不存在測試配位體的情況相比，非天然胺基酸多肽展開的速率將較低。對隨時間的測量來說，與測試配位體不為非天然胺基酸多肽的配位體的情況相比，在測試配位體為非天然胺基酸多肽的配位體的情況下，展開蛋白質且因此聚集蛋白質的增長速率將較低。對固定時間的測量來說，與測試配位體不為非天然胺基酸多肽的配位體的情況相比，在測試配位體為非天然胺基酸多肽的配位體的情況下，會存在較少的展開蛋白質且因此存在較少聚集蛋白質。因此，測試配位體結合非天然胺基酸多肽的能力可通過評估在存在和不存在測試配位體的情況下蛋白質聚集的程度來確定。XIV.蛋白質檢測技術在檢測非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段的本發明方法中可使用所屬領域中已知的檢測蛋白質、小肽或游離胺基酸存在與否的方法。所使用的方法可由待檢測的產物(蛋白質、肽、游離胺基酸)決定。舉例來說，可使用檢測蛋白質大小的技術測定非天然胺基酸多肽的蛋白質水解降解的程度。放射性標記、螢光標記以及酶鍵聯標記可通過測量放射性、螢光或酶活性來檢測在溶液中或基板上的存在與否。免疫學方法可檢測已知非天然胺基酸多肽在溶液中或底物上的存在與否，諸如通過對所述蛋白質具有特異性的抗體的結合。圖la呈示多種可用於檢測非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段的蛋白質檢測技術。A.螢光顯微術本文中揭露的用於蛋白質檢測的方法包含檢測非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段的螢光顯微術。螢光顯微術為使得所觀察的結構的分子組成能夠通過使用具有高化學特異性的螢光標記探針得以鑑別的廣泛使用的顯微技術。所述探針可為包括非天然胺基酸的抗體、抗體片段或抗原結合多肽。螢光顯微術可用於研究固定試樣。對可以合理豐度提取和純化的蛋白質來說，可使螢光團接合於蛋白質且將接合物引入細胞中。可使螢光團接合於多肽中的非天然胺基酸。假定螢光類似物具有類似天然蛋白質的特性且因此可用於揭露這一蛋白質在細胞中的分布和特性。蛋白質固有螢光衰減和其螢光各向異性、碰撞猝滅以及共振能量傳遞的相關觀察結果連同NMR、紅外光譜學、圓二色譜以及其它技術為蛋白質檢測的重要技術。測量螢光衰減使得能夠直接觀察蛋白質中的結構變化的動力學。此外，當使用外在螢光探針時，從胺基酸酪氨酸和色氨酸發射的蛋白質的天然螢光的激發消除局部環境擾動的可能性。在使用螢光探針用於生物研究中的一個發展為使用天然螢光蛋白質作為螢光探針。二十世紀九十年代後期發現天然存在的染料，所謂的螢光蛋白質(GFP、YFP、CFP、TOPAS、GFT、RFP)(Clonetech,USA)。所述染料以其對試樣的影響較低而著名。因此，其尤其適於在活製備物中標記細胞區域。維多利亞多管水母(jellyfishAequoreavictoria)產生天然螢光蛋白質，稱為綠色螢光蛋白質(greenfluorescentprotein,GFP)。所述螢光探針與標靶蛋白質的融合使得能夠通過螢光顯微術觀測和通過流式細胞術定量。因為GFP標籤為遺傳編碼的且不需要輔助因子，所以其可用於分析活細胞和完整有機體中的蛋白質表達和定位。這一蛋白質的基因已經克隆且可轉染至其它有機體中。GFP標籤可用於定位有機體中特定基因所表達的區域或用於鑑別特定蛋白質的位置。在許多情況下，所述嵌合蛋白質保持其原始功能。因此，通常有可能(例如)使用這一技術觀測蛋白質(包含(但不限於)細胞骨架蛋白質)的細胞內分布。用GFP可觀察到未染色或未固定的樣品。目前存在數種GFP變異體，其提供光譜上可分離的發射顏色。使GFP突變已產生藍色、青色和黃色螢光發射形式。可用於標記本發明非天然胺基酸肽、多肽、抗體以及抗體片段的螢光蛋白質包含(但不限於)綠色螢光蛋白質(GFP)、青色螢光蛋白質(cyanfluorescentprotein,CFP)、紅色螢光蛋白質(redfluorescentprotein,RFP)、黃色螢光蛋白質(yellowfluorescentprotein,YFF)、增強型GFP(EGFP)、增強型YFP(EYFP)以及其類似物。已通過突變開發GFP的新穎形式，包含"人類化"GFPDNA，其蛋白質產物已增加在哺乳動物細胞中的合成。(參看Cormack等人，(1996)Gene173，33-38;Haas等人，(1996)CurrentBiology6,315-324;以及Yang等人，(1996)NucleicAcidsResearch24,4592-4593)。一種所述人類化蛋白質為"增強型綠色螢光蛋白質(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)"。可使GFP、GFP的變異體或其它天然存在的染料與非天然胺基酸多肽偶合。GFP可用作生物傳感器，通過以特徵方式發螢光報導離子含量或pH值的結果。一種可用於自動檢測鋅離子含量的分子為展示為蛋白質資料庫(ProteinDataBank,PDB)登錄號lkys的藍色螢光蛋白質。一旦鋅與經修飾發色團結合，則蛋白質就發射產生可容易檢測的可見信號兩倍亮的螢光。包括非天然胺基酸的其它肽和蛋白質生物傳感器的構造可展現對其環境、寡聚狀態、配位體結合後的構象、結構或直接配位體結合的變化響應的螢光性質改變。經適當標記的螢光生物分子允許空間上和時間上檢測活細胞內部的生化反應。例如參看Giuliano,K.A.等人，iev.5/o//2".Aowo/.1995，24:405-434;Day,R.N.Mo/.五m/ocn"o/.1998,12:1410-9;Adams,S.R.等人，iVa^re1991,349:694;Miyawaski,A.等人，A^wre1997，388:882-7;Hahn,K.等人，Atowre1992,359:736;Hahn,K.M.等人，5/o/.19卯，265:20335;以及Richieri,GV.等人，Mo/.Ce〃.to.1999,192:87-94。美國專利第6,951,947號(其是以引用的方式併入本文中)討論檢測環境變化的生物傳感器和螢光團。目前，所述技術是由現有探針的新應用和新的且具有創新性的探針的設計和合成驅動。在不限制本發明的範疇的情況下，一些探針如下標記螢光的靈敏性和安全性(與放射方法相比)已越來越多地用於特異性標記核酸、蛋白質以及其它生物分子。除螢光素外，存在覆蓋整個400納米至820納米範圍的其它螢光標記。僅舉例來說，一些標記包含(但不限於)螢光素和其衍生物、羧基螢光素、羅丹明(Rhodamine)和其衍生物、Atto標記、螢光紅和螢光橙Cy3/Cy5替代物、具有長壽命的鑭系金屬配合物、長波長標記(高達800納米)、DY菁標記、藻膽素蛋白質。能夠在一波長下吸收輻射而在較長波長下發射輻射的螢光分子包含(但不限於)Alexa-532、羥基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、香豆素、級聯藍(CascadeBlue)、羅氏黃(LuciferYellow)、P-藻紅素、R-藻紅素、(PE)、PE-Cy5接合物、PE-Cy7接合物、紅613、螢光素、BODIPY-FL、BODIPYTR、BODIPYTMR、Cy3、TRITC、X-羅丹明、麗絲胺羅丹明B(LissamineRhodamineB)、PerCP、德克薩斯紅(TexasRed)、Cy5、Cy7、別藻藍蛋白(APC)、TruRed、APC-Cy7接合物、俄勒閃綠(OregonGreen)、四甲基羅丹明、丹磺醯(Dansyl)、丹磺醯氮丙啶、Indo-l、Fura-2、FM1-43、DilC18(3)、羧基-SNARF-l、NBD、Indo-l、Fluo-3、DCFH、DHR、SNARP、Monochlorobimane、鈣黃綠素、N-(7-硝基苯並-2-氧雜-l,3-二唑-4-基)胺(NBD)、苯胺基萘、deproxyl、鄰苯二甲醯胺、氨基pH鄰苯二甲醯胺、二甲基氨基-萘磺醯胺、可比於氟矽酸鈉(prodan)、洛丹(Lordan)或丙烯丹基(Acrylodan)以及其衍生物的探針。香豆素螢光染料包括(例如)氨基甲基香豆素、7-二乙基氨基-3-(4'-(l-馬來醯亞胺基)苯基)-4-甲基香豆素(CPM)以及N-(2-(l-馬來醯亞胺基)乙基)7-二乙基氨基香豆素-3-甲醯胺(MDCC)。其它適用的分子包含那些呈現螢光共振能量傳遞(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)的分子。己知許多所述供體-接受體對且其包含螢光素-羅丹明、香豆素-螢光素或羅丹明等。另一類適用的標記對包含螢光團-猝滅劑對，其中第二基團為減小螢光基團的螢光強度的猝滅劑。一些已知猝滅劑包含丙烯醯胺基團、重原子(諸如碘離子和溴酸根)、氮氧化物自旋標記(諸如TEMPO)等。可使諸如所述標記的標記與非天然胺基酸多肽接合。接合於非天然胺基酸多肽的螢光團可在所有時間發螢光或僅當多肽結合於標耙時才發螢光。其它類型的螢光團包含接合物僅舉例來說，一些接合物包含(但不限於)異硫氰酸鹽接合物、抗生蛋白鏈菌素接合物以及生物素接合物。抗體接合物已廣泛用於追蹤活細胞和整個有機體中的生物分子。其可經產生以對幾乎任何抗原決定基具有特異性且因此原則上適用於使許多生物分子成像。包含(但不限於)抗體接合物的接合物可包括非天然胺基酸。酶底物酶底物包含(但不限於)發螢光底物和發色底物。微米粒子和納米粒子多種技術允許製備在大小、基質化學、螢光染料類型、螢光強度以及表面官能團方面不同的多種螢光微球。僅舉例來說，一些所使用的螢光染料為-FITC(綠色螢光，激發/發射=506/529納米)、羅丹明B(橙色螢光，激發/發射=560/584納米)、尼羅藍A(NileBlueA)(紅色螢光，激發/發射=636/686納米)。在(例如)生物化學、生物分析以及醫學領域中，螢光納米粒子為光數據存儲與其它技術應用的有前景的手段。現行醫學和生物螢光成像方法主要以染料標記物為基礎，所述標記物在每分子光發射以及光學穩定性方面受到限制。納米粒子克服那些問題，提供強且穩定的螢光。螢光納米粒子已成功用於各種類型的免疫檢定。螢光納米粒子以諸如聚丙烯腈和聚苯乙烯等的不同材料為基礎。分子轉子螢光分子轉子是只要轉動受到限制即變得發螢光的微環境限制傳感器。螢光強度的變化通過限制繞螢光團的供體-接受體鍵的分子內旋轉弛豫引起。分子限制的實例包含(但不限於)染料增加(聚集)、與抗體結合或捕獲於肌動蛋白聚合中。IEF標記物等電點聚焦(IsoelectricFocusing,IEF)為分離兩性電解質(主要為蛋白質)的強有力分析手段。為確保分析的高效能，需要pl標準物(pl標記物)。利用螢光IEF-標記物的IEF-凝膠電泳的優點是直接觀察梯度形成的可能性。螢光IEF-標記物也可在280納米(20'C)下通過紫外線吸收檢測。任何或所有所述螢光探針可用於檢測非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段。圖9呈示通過在併入多肽中的非天然胺基酸的羰基與分子的羥胺之間形成肟來位點特異性地連接至蛋白質的分子的非限定性實例。所展示的分子為螢光團、生物素以及螯合劑。生物正交化學報導體小分子具有通向細胞內和血管外區隔的較佳通過性。其作為成像劑的用途需要使小探針選擇性靶向所需生物分子的方法。親核官能團存在於大部分類型的生物聚合物中，此準許用生物素、螢光團以及眾多其它小分子報導體輕易衍生化。已確立的生物接合方案已使所述操作對活體外經純化生物聚合物來說價值不高。用標籤標記生物分子的替代策略為摻合遺傳編碼標籤的簡單性與抗體標記的特異性和小分子探針的多功能性。這種方法涉及使用細胞自身的生物合成機構將獨特的化學官能團(生物正交化學報導體)併入標靶生物分子中。生物正交化學報導體為可通過與外源傳送探針的高選擇性反應在活系統中經修飾的非天然的非擾動化學手柄。這種兩步標記法根據探針的性質可用於裝備用於檢測或分離的標靶生物分子。生物正交偶合反應的實例包含(但不限於)疊氮化合物與三芳基膦的施陶丁格連接(Staudingerligation)、酮/醛-肼反應以及休斯根氏1,3-偶極疊氮化合物-炔烴環加成(Huisgen's1，3-dipolarazide-alkynecycloaddition)。用空間上不顯著的疊氮基代替大體積螢光標籤可提供更能以不偏方式分布在活細胞、組織或有機體中的探針。同樣，也消除螢光標籤對針對特異性蛋白質的探針結合親和力的可變且通常對抗的效應。最後，使用疊氮化合物-炔烴環加成化學可通過移除對產生和純化大量在結構上多樣的螢光團標記試劑的需要使探針合成簡單化。利用非天然胺基酸多肽的偶合反應可提供為螢光標記多肽的替代物的探針。可使用休斯根氏1,3-偶極疊氮化合物-炔烴環加成來連接其它分子或提供多肽純化或檢測的其它方法。可在固體支撐物上合成肽文庫，且通過使用著色受體，可逐個選擇染色固體支撐物。如果受體不能指示任何顏色，那麼可將其結合抗體染色。因為有可能在顯微鏡或甚至放大鏡下通過鑷子分離固體支撐物，所以所述方法不僅可用於蛋白質受體，而且也可用於篩檢合成人工受體的結合配位體以及篩檢新金屬結合配位體。這一方法適用於搜尋新前導化合物，因為其使得能夠篩檢大量化合物。然而，根據染料強度來測定活性可能不精確，且大量固體支撐物可能不能總是逐個處理。因此，需要高通量篩檢(HTS)的自動方法且可使用螢光活化細胞分選器(FluorescenceActivatedCellSorter,FACS)方法。這一機器最初使細胞穿過毛細管且通過檢測其螢光強度分離細胞。可對固體支撐物而不是細胞使用相同方法。因為其為細胞而設計，所以可操作具有細胞大小的小樹脂，但具有正常大小(50至200皮摩爾)的固體支撐物需要經特別改進的機器。也可進行化合物的部分或完全分離。對化合物的部分分離來說，使用時間控制感光分解或在不同條件下裂解數種官能團。同時，可將固體支撐物分散到軟瓊脂上且通過感光分解分離一些化合物。然後將經分離化合物散開在固體支撐物周圍，從而可同時進行篩檢和固體支撐物分離。B.免疫檢定本文中揭露的用於蛋白質檢測的方法包含檢測非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段的免疫檢定。免疫檢定組合化學和免疫學原理以使得能夠進行科學測試，例如特異性且靈敏檢測所關注的分析物(非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段)的酶免疫檢定和免疫印跡法。所述檢定的基本原理為抗體-抗原反應的特異性。類似於西方印跡法(Westernblot)，對免疫印跡法來說，單一蛋白質可由其抗體鑑別。可進行競爭結合免疫檢定，其中分析物與經標記抗原競爭抗體分子的有限池(例如，放射性免疫檢定(radioimmunoassay,EMIT))。免疫檢定可不具競爭性，以使得抗體以過量存在且經標記。當分析物抗原增加時，經標記抗體-抗原複合物的量也增加(例如，ELISA)。如果抗體通過將抗原注射到實驗動物中產生,則其可為多克隆抗體，或如果抗體通過細胞融合和細胞培養技術產生，則其可為單克隆抗體。在免疫檢定中，抗體充當分析物抗原的特異性試劑。抗原可為非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段。另一方面，免疫檢定中所使用的抗體或其片段可為非天然胺基酸多肽，且可用於檢測可或可不包括非天然胺基酸的抗原。在不限制本發明的範疇和內容的情況下，免疫檢定的一些類型為(僅舉例來說)放射性免疫檢定(Radioimmunoassay,RIA)和酶免疫檢定，如酶聯免疫吸附檢定(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)、酶倍增免疫檢定(EnzymeMultipliedImmunoassay,EMIT)、微粒酶免疫檢定(MicroparticleEnzymeImmunoassay,MEIA)、發光免疫檢定(luminescentimmunoassay，LIA)以及螢光免疫檢定(fluorescentimmunoassay,FIA)。所述技術可用於檢測非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段。用作一次或二次抗體的抗體可經放射性同位素(例如，125I)、螢光染料(例如，FITC)或催化發螢光或發光反應的酶(例如，HRP或AP)標記。1.酶倍增免疫檢定技術(EnzymeMultipliedImmunoassayTechnique,EMIT)EMIT為無需分離步驟的競爭結合免疫檢定。其為一種允許定量未標記蛋白質的免疫檢定類型，其中蛋白質經酶標記且酶-蛋白質-抗體複合物經酶促失活。2.酶聯免疫吸附檢定(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)本文中揭露的用於蛋白質檢測的方法包含檢測非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段的ELISA。酶聯免疫吸附檢定是以連接於固體支撐物的選擇性抗體以及產生能夠檢測低含量的蛋白質的系統的酶反應為基礎。其也稱為酶免疫檢定或EIA。抗原(包含(但不限於)蛋白質)由針對其(即，對抗體來說，其為抗原)產生的抗體檢測。通常使用單克隆抗體。測試可要求抗體固定於固體表面，諸如試管的內表面；且製備與酶偶合的相同抗體。酶為由無色底物產生有色產物的酶(例如，e-半乳糖苷酶)。測試(例如)是通過用待檢定的抗原溶液(例如，蛋白質)填充試管來進行。任何存在的抗原分子都可與固定抗體分子結合。將抗體-酶接合物添加至反應混合物中。接合物的抗體部分與先前結合的任何抗原分子結合，產生抗體-抗原-抗體"夾心"。洗除任何未結合接合物後，添加底物溶液。一組時間間隔後，使反應停止(例如，通過添加1NNaOH)且在分光光度計中測量由底物與接合於二次抗體的分子的反應形成的有色產物的濃度。顏色強度與所結合抗原的濃度成比例。ELISA也可經改適以測量抗體的濃度，在此情況下，將孔塗布適當抗原。添加含有抗體的溶液(例如，血清)。歷時與固定抗原結合的時間後，添加由針對正測試的抗體的抗體組成的酶接合抗免疫球蛋白。洗除未反應試劑後，添加底物。所產生的顏色的強度與所結合的經酶標記抗體的量成比例(且因此與正檢定的抗體的濃度成比例)。3.放射性檢定本文中揭露的用於蛋白質檢測的方法包含檢測非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段的放射性免疫檢定。放射性免疫檢定具有高靈敏度。使用具有高親和力(例如，K(^10S-10"M—1)的抗體，有可能檢測試管中的幾皮克(10—12克)的抗原。可使用放射性同位素來研究少量化合物的活體內代謝、分布以及結合。使用^、12(3、31P、32S、1271的放射性同位素，諸如3H、"C、32P、35S、125I。放射性同位素與非放射性同位素具有幾乎相同的化學性質，從而其可容易地轉化。同時，因為其輻射能相對較大，所以僅需要極少的量。受體固定法對96孔板格式來說，通過使用抗體或化學方法將受體固定於各孔中，且將放射性標記配位體添加到各孔中以誘導結合。洗除未結合配位體，且隨後通過結合配位體或洗除配位體的放射性的定量分析測定標準物。添加用於篩檢的標靶化合物誘導與受體的競爭結合反應。如果與標準放射性配位體相比，標靶化合物對受體展示較高親和力，那麼大部分放射性配位體不與受體結合且留在溶液中。因此，通過分析結合放射性配位體(或洗除配位體)的數量，可容易地指示標靶化合物與受體的親和力。當受體不能固定於96孔板或配位體結合須在溶液相中進行時，可使用濾膜法。對這種方法來說，在溶液中進行配位體-受體結合反應後，經硝化纖維素濾紙過濾反應溶液。包含配位體的小分子將穿過濾紙，且僅蛋白質受體將留在濾紙上。僅與受體強有力結合的配位體將留在濾紙上，且所添加化合物的相對親和力可通過標準放射性配位體的定量分析鑑別。這種方法也可用於篩檢蛋白激酶抑制劑。在此情況下，可使用Y-"P-ATP作為磷酸基團供應者，且可通過檢査放射性標記蛋白質底物來分析酶活性。不反應的放射性ATP將被過濾且移除。僅舉例來說，可通過製備放射性抗原與針對所述抗原的抗體的混合物來進行放射性免疫檢定。可將碘原子引入到蛋白質中的酪氨酸殘基中，通常使用放射性同位素1251或1311。可將已知量的未標記("冷")抗原添加到混合物的樣品中。所述抗原競爭抗體的結合位點。在遞增濃度的未標記抗原下，遞增量的放射性抗原被從抗體分子上置換下來。將抗體結合抗原與上清液中的游離抗原分離，且測量各自的放射性。從所述數據可繪製標準結合曲線。平行操作待檢定的樣品("未知物")。確定各未知物中的結合抗原與游離抗原的比率後，可從標準曲線直接讀取抗原濃度。可用於檢測非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段的放射性免疫檢定的其它方法為(僅舉例來說)通過添加針對第一抗體的"第二"抗體使抗原-抗體複合物沉澱。舉例來說，如果使用兔IgG來結合抗原，那麼可通過添加抗兔IgG抗血清(例如，通過用兔子IgG使山羊免疫來產生)使複合物沉澱。或者，可使抗原特異性抗體與試管內壁偶合。培育後，移除未結合內含物；洗滌試管，且測量未結合與結合物質的放射性。可使抗原特異性抗體與如葡聚糖凝膠(Sephadex)的顆粒偶合。離心反應混合物使結合計數(在球粒中)與上清液中的游離計數分離。4.螢光免疫檢定本文中揭露的用於蛋白質檢測的方法包含檢測非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段的螢光免疫檢定。基於螢光的免疫法是以標記配位體對未標記配位體對高特異性受體部位的競爭性結合為基礎。其為蛋白質分析中非常重要的臨床和分析生物化學手段。這種技術可用於以螢光壽命隨分析物濃度變化的變化為基礎的免疫檢定。這種技術利用具有短壽命的染料，所述染料如異硫氰酸螢光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC))(供體)，其螢光通過能量轉移到曙紅(Eosin)(接受體)而猝滅。許多分子物質已用於使能量從供體分子轉移到接受體分子。具體來說，夾心型免疫複合物形成可用於這一技術。在本發明的方法中可使用許多光致發光化合物，且其包含以上螢光顯微術中所列的化合物以及以下基團，諸如菁、噁嗪、噻嗪、卟啉、酞菁、螢光紅外發射多核芳烴、藻膽蛋白、方酸(squamine)和有機金屬配合物、烴以及偶氮染料。基於螢光的免疫學法可為(舉例來說)異源或同源方法。異源免疫檢定包括使所結合的分析物與游離標記分析物物理分離。可使分析物或抗體連接於固體表面。這一技術可為競爭性(較高選擇性)或非競爭性技術(較高靈敏度)。檢測可為直接檢測(僅使用一種類型的抗體)或間接檢測(使用第二類型的抗體)。同源免疫檢定不包括物理分離。雙抗體螢光團標記抗原參與與針對抗原與螢光團兩者的抗體的平衡反應。標記和未標記抗原競爭有限數目的抗抗原抗體。103簡單螢光標記法通過使用相關螢光其可用於受體-配位體結合、酶活性，且其可用作多種活體內生理變化(諸如pH值、離子濃度以及電壓)的螢光指示劑。胺基酸(諸如酪氨酸和色氨酸)的自發螢光產生背景輻射，且為克服所述弱點，通常使用吸收波長大於520納米的紫外線的螢光化合物，諸如菁。FRET:螢光共振能量傳遞FRET可用於測量活體內兩種蛋白質的相互作用且可測量納米尺度的距離和距離(構象)變化。因此，其用於測量簡單蛋白質-蛋白質相互作用和蛋白質摺疊、構象以及穩定性的變化(參看Philipps，B.;Hennecke,J.;GlockshuberR.MolBiol.2003,327，239-249;Riven，I.;Kalmanzon,E.;Segev,L.;ReuvenyE.Neuron.2003,38,225-235)。使兩種不同螢光分子(螢光團)接合於兩種所關注的蛋白質。在FRET中可使用與螢光團接合的非天然胺基酸多肽。當使用兩種螢光化合物而不是單一螢光化合物時，存在非螢光能量轉移。當螢光供體的發射波長類似於接受體的吸收波長時，處於激發態的供體會將其能量轉移到接受體而不是發射螢光，且因此發射在接受體的發射波長下發生。FRET分析已使用許多不同螢光團對，包含與所關注蛋白質融合的綠色螢光蛋白質(greenfluorescentprotein,GFP)變異體CFP(青色)和YFP(黃色)。50。/。FRET效應的距離R0視供體發射範圍與接受體吸收範圍的重疊和接受體的量子產率和溶劑而定。如果兩種螢光分子彼此相距短於R0的距離，那麼當發射供體的吸收光時，理論上接受體的螢光將較強。如果距離變得比R0長，那麼當發射相同光時，供體的螢光將檢測為較強。因此，如果螢光分子鍵聯於可用作激酶(諸如蛋白酶)的小肽的末端時，那麼酶活性可容易地測量。Xu等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1999，96,151-156)開發出生物發光共振會g量傳遞(Bioluminesceneresonanceenergytransfer,BRET)。其以類似於FRET的原理作用且以海腎(Renilla)螢光素酶的發射光譜類似於CFP的發射光譜的發現結果為基礎。當利用細胞器靶向螢光蛋白質變異體時，所述技術允許研究特定亞細胞區隔內的相互作用，包含膜蛋白質-蛋白質相互作用。也可在哺乳動物細胞中研究翻譯後修飾事件。時間分辨螢光(TimeResolvedFluorescence,TRF):為減小螢光背景，開發出時間分辨螢光。常見螢光分子的激發態壽命通常僅幾微秒，但鑭系元素具有數毫秒的壽命。TRF為在其它螢光分子的發射完成後，選擇性測量鑭系螢光的方法。TRF也可與FRET一起使用，且鑭系變成供體或接受體。5.多種檢定格式多種檢定格式可用於檢測本文中所揭露的非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段，包含"夾心"免疫檢定和探針檢定。舉例來說，在第一檢定格式中，使已塗布於固相上的多克隆或單克隆抗體或其片段或所述抗體的組合與測試樣品接觸以形成第一混合物。將此第一混合物在足以形成抗原/抗體複合物的條件下培育足以形成所述複合物的時間。然後，使包括其上已連接信號產生化合物的單克隆或多克隆抗體或片段或所述抗體的組合的指示劑試劑與抗原/抗體複合物接觸以形成第二混合物。然後將所述第二混合物在足以形成抗體/抗原/抗體複合物的條件下培育足以形成所述複合物的時間。通過檢測信號產生化合物所產生的可測量的信號確定測試樣品中和捕獲於固相上的抗原(如果有)的存在。測試樣品中所存在的抗原的量與所產生的信號成比例。在替代檢定格式中，通過使以下物質接觸形成混合物(1)結合於固體支撐物的與抗原特異性結合的多克隆抗體、單克隆抗體或其片段或所述抗體的組合；(2)測試樣品；以及(3)包括其上連接信號產生化合物的與不同抗原決定基特異性結合的單克隆抗體、多克隆抗體或其片段(或所述抗體的組合)的指示劑試劑。然後將這一混合物在足以形成抗體/抗原/抗體複合物的條件下培育足以形成所述複合物的時間。通過檢測信號產生化合物所產生的可測量的信號確定存在於測試樣品中和捕獲於固相上的抗原(如果有)的存在。測試樣品中所存在的抗原的量與所產生的信號成比例。在另一檢定格式中，本發明的單克隆抗體中的一種或至少兩種的組合可用作用於檢測抗原的抗體的競爭探針。舉例來說，將本文中所揭露的非天然胺基酸多肽單獨或組合塗布於固相上。然後將懷疑含有抗原的抗體的測試樣品與包括信號產生化合物和至少一種單克隆抗體的指示劑試劑在足以形成測試樣品與指示劑試劑的結合於固相的抗原/抗體複合物或結合於固相的指示劑試劑的條件下一起培育足以形成所述複合物的時間。可定量測量單克隆抗體與固相的結合的減少。在另一檢測方法中，單克隆或多克隆抗體可通過免疫組織化學分析用於組織切片以及細胞中的抗原的檢測中。組織切片可從冷凍或化學固定的組織樣品切割。如果將在細胞中檢測抗原，那麼可從血液、尿、乳房抽吸液或其它體液中分離細胞。可通過手術活檢或穿刺針活檢獲得細胞。細胞可在經磁性粒子或鐵磁流體標記後通過離心或磁力吸引分離以富集細胞的特定部分以用於經抗體染色。所述抗體直接經標記(經(例如)螢光素、膠體金、辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶等標記)或通過使用二次標記抗物質抗體標記(經多種本文中例示的標記標記)以追蹤疾病的組織病理學的細胞化學分析也在本發明的範疇內。單克隆抗體(和其片段)的組合也可一起用作連同與本文中所揭露的非天然胺基酸多肽的其它區域特異性結合的抗體的混合物中的組分，各抗體具有不同的結合特異性。檢定中所使用的多克隆抗體可單獨使用或以多克隆抗體的混合物形式使用。因為檢定格式中所使用的混合物包括對本文中所揭露的非天然胺基酸多肽具有不同結合特異性的單克隆抗體或多克隆抗體，所以其適用於檢測、診斷、分級、監測、預後、活體內成像、預防或治療或確定多種疾病和病狀的誘因。本發明涵蓋且在本發明的範疇內的是通過使用重組抗原以及通過使用合成多肽或純化多肽(所述多肽包括本文中所揭露的非天然胺基酸多肽的胺基酸序列)可在檢定中檢測本文中所揭露的非天然胺基酸胺基酸。也在本發明的範疇內的是鑑別本文中所揭露的非天然胺基酸多肽的不同抗原決定基的不同的合成、重組或純化多肽可組合用於檢測、診斷、分級、監測、預後、活體內成像等的檢定中。在此情況下，可將所有所述多肽塗布於一個固相上；或可將各獨立的多肽塗布於獨立的固相上，諸如微粒，且隨後組合以形成隨後可用於檢定中的多肽混合物。隨後使塗布於固相上或經可檢測標記標記的多肽與樣品中所存在的多肽競爭有限量的抗體。合成、重組或純化肽與抗體的結合的減少為存在本文中所揭露的非天然胺基酸多肽的指示。所屬領域的一般技術人員已知檢定格式的變體。6.用於免疫檢定的掃描探針顯微術(SPM)本文中揭露的用於蛋白質檢測的方法包含檢測非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段的SPM。在掃描探針顯微術中，在捕獲相中，(例如)將至少一種單克隆抗體粘附於固相且利用掃描探針顯微術檢測可能存在於固相表面上的抗原/抗體複合物。使用掃描隧道顯微術消除對許多免疫檢定系統中通常須利用以檢測抗原/抗體複合物的標記的需要。可以許多方式進行使用SPM來監測特異性結合反應。在一實施例中，使特異性結合搭配物的一個成員(為單克隆抗體的分析物特異性物質)連接於適於掃描的表面。分析物特異性物質的連接可通過吸附於包括塑料或金屬表面的固相的測試件實現。可利用特異性結合搭配物(分析物特異性物質)與測試件的共價連接，其中所述測試件包括經衍生化的塑料、金屬、矽或玻璃的固相。共價連接方法為所屬領域的技術人員所巳知且包含多種使特異性結合搭配物與測試件不可逆鍵聯的方法。如果測試件為矽或玻璃，那麼在連接特異性結合搭配物之前，表面須活化。同時，可使用聚電解質相互作用將特異性結合搭配物通過使用技術和化學固定於測試件的表面上。優選連接方法是通過共價方式進行。特異性結合成員連接後，可將表面用諸如血清、蛋白質或其它阻斷劑的物質進一步處理以使非特異性結合最小化。出於檢定目的，也可在製造場所或使用時掃描表面以驗證其適用性。不期望掃描過程改變測試件的特異性結合性質。C.光譜學1.核磁共振(NMR)本文中揭露的用於蛋白質檢測的方法包含檢測非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段的NMR。核磁共振光譜學能夠在原子分辨水平上確定如蛋白質和核酸的生物巨分子的結構。另外，有可能用NMR研究時間依賴性現象，諸如巨分子中的分子內動力學、反應動力學、分子識別或蛋白質摺疊。本文中揭露的用於蛋白質檢測的方法包含檢測非天然胺基酸多肽和經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段的NMR。NMR的理論和實施能力的進步使得NMR光譜的信息內容得到越來越有效地利用。生物化學方法(重組蛋白質表達)的平行發展允許可簡單且快速地製備蛋白質樣品。可通過均一或選擇性同位素標記將如15N、13C以及211的異核併入蛋白質中。可有力簡化所述樣品的光譜。另外，用所述方法可確定一些關於巨分子的結構和動力學的新信息。所有所述發展目前允許結構測定具有高達30千道爾頓或30千道爾頓以上的質量的蛋白質。2.X-射線結晶學本文中揭露的用於蛋白質檢測的方法包含檢測非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段的X-射線結晶學。X射線結晶學為結晶學中的技術，其中記錄通過X射線衍射穿過晶體中原子的緊密晶格產生的圖案，且隨後分析以揭露所述晶格的性質。這通常產生對物質的材料和分子結構的了解。可使用布拉格定律(Bragg'slaw)確定晶體晶格中的間隔。環繞原子的電子而不是原子核本身為與進入的X射線光子物理相互作用的實體。這一技術在化學和生物化學中廣泛用於確定多種分子(包含無機化合物、DNA以及蛋白質)的結構。通常使用材料的單晶進行X射線衍射，但如果所述單晶不可得，那麼也可使用微晶粉末樣品，但這需要不同設備且很不直接。對X射線結晶學來說，分子須經結晶。不能可靠地檢測通過一個電子衍射的一個光子，然而，由於規則的結晶結構，在許多對稱排列的分子中通過相應電子使光子衍射。因為峰匹配的具有相同頻率的波相互增強，所以信號變得可檢測。為確定結構，使用一些結晶方法使所關注的分子的晶體生長。收集晶體且通常將其用液氮冷凍。冷凍晶體降低數據收集期間發生的輻射損傷且減少晶體的熱運動。將晶體放置在發射X射線束的機器衍射計上。X射線衍射出晶體中的電子，將衍射圖案記錄在膜上且掃描到計算機中。將所述衍射圖像組合且最終用於構造結晶分子的電子密度的圖，然後使原子配合電子密度圖且改進各種參數(諸如位置)以最佳配合所觀察到的衍射數據。3.螢光光譜學本文中揭露的用於蛋白質檢測的方法包含檢測非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段的螢光光譜學。除標準螢光測量外，已開發出多種其它方法。常規螢光分析法涉及在確定波長下測量螢光團某一發射最大值的發射光強度。總螢光分析法涉及收集吸收連續區以及發射波長的數據。在螢光偏振中，使用偏振光激發且螢光染料標記抗原與特異性抗體的結合影響偏振程度。窄線光譜學(LineNarrowingSpectroscopy)涉及低溫固體光譜學，其從其提供的窄線發射光譜中獲得其選擇性。時間依賴性螢光光譜學包括與穩態測量相比含有較多信息的時間分辨測量，因為穩態值代表時間分辨測定的時間平均值。其為單光子計時技術，其中測量激發光脈衝與樣品所發射的第一光子之間的時間。頻域螢光光譜學是時間分辨方法的替代方法。螢光的時間衰減通常在給定頻率下使用具有正弦調製的強度的光源通過測定螢光信號相對於激發光的相位延遲和相對調製來測量。4.基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜(MatrixAssistedLaserDesorptionionizationtime-of-flightmassspectrometry，MALDITOF-MS)本文中揭露的用於蛋白質檢測的方法包含檢測非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段的MALDITOF-MS。線性TOF-MS:質譜已顯現為分析和表徵具有不同複雜性的大生物分子的重要手段。於1987年開發的基質輔助雷射解吸/電離(MALDI)技術已將生物分子的質譜分析的質量上限增加到超過300,000Da且已使得通過質譜來分析大生物分子能夠變得更容易且更靈敏。TOF質譜計基於以下原理操作在使時間上和空間上明確的一組具有不同質量/電荷(m/z)比的離子經受同一施加電場(K.E.=[mv2]/2=zeEs，其中K.E.=動能；m=離子的質量；V=離子的速度；z=電荷數；e=電子電荷(庫侖)；E=電場梯度；以及3=離子源區的距離)且使其遷移恆定電場區中時，其將在視其m/z比而定的時間內橫穿這一區。反射TOF-MS:已通過利用單級或二級反射(RETOF-MS)獲得MALDITOF-MS中的改進的質量解析度。使用位於飛行管末端的反射器利用離子反射器補償具有略微不同的動能的相同m/z離子的飛行時間的差。這使得在空間和時間上將離子包聚焦於檢測器。在反射質譜中，充分分辨同位素多重峰產生約3400的半最大寬度(fullwidthhalf108maximum,FWHM)質量解析度。關於高達約3000Da的肽用RETOF-MS已獲得高達6000的質量解析度(FWHM)。當測定離子質量時，增強質量解析度也可增加質量精確性。歷史上主要利用線性與反射MALDI-TOF-MS進行分子離子和酶促消化物的分子量測定，從而獲得蛋白質的結構信息。通常在經純化或不經純化的情況下對所述消化物進行質量分析，之後測定分子量。已開發出多種方法以利用MALDITOF-MS獲得蛋白質和肽的主要序列信息。可採用兩種不同方法。第一種方法稱為蛋白質梯狀測序且用於在插入TOF質譜計之前產生分析物的結構信息片段且接著分析。第二種方法利用TOF質譜計內部發生的亞穩離子衰減現象產生序列信息。利用TOF-MS的梯狀測序可使用MALDI-TOF-MS以梯狀測序技術對蛋白質或肽進行測序，所述技術由將蛋白質或肽的N-末端或C-末端時間依賴性或濃度依賴性化學降解為片段(各相差一個胺基酸殘基)組成。在單一MALDI-TOF-MS實驗中對混合物進行質量分析，其中相鄰質譜峰之間的質量差對應於特定胺基酸殘基。可認為這一類型的分析是簡單地測定單一MALDI樣品中所存在的一系列肽/蛋白質的質量。質譜中的出現順序確定原始蛋白質或肽中的胺基酸序列。利用RETOF-MSMALDI的源後衰減歷史上認為其為幾乎僅產生完整質子化假分子離子物質的"軟"電離技術。顯著程度的亞穩離子衰減在離子加速後和檢測之前發生。由肽和蛋白質的亞穩離子衰減產生的離子片段通常包含中性分子丟失(諸如水、氨以及胺基酸側鏈的部分)與肽鍵處的隨機裂解。MALDI質譜中的所述亞穩離子衰變產物的觀察結果視TOF儀器配置而定。MALDITOF-MS在生物科學中已發展為用於獲得精確質量測定與主要序列信息的重要手段。本文中揭露的用於蛋白質檢測的方法包含檢測非天然胺基酸多肽和經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段的MALDITOF-MS。從序列已推導獲知的質譜獲得的序列信息決不是暗指從亞穩離子衰減質譜推導出未知肽或蛋白質序列的直接流程。預想所述MALDI技術最適用於與常規生物化學技術(諸如，蛋白質消化)組合。其可適用於以此方式鑑別已知蛋白質中的經阻斷氨基末端、翻譯後修飾和突變位點。同時，對完全未知物來說，應可能對極小量(小於10pmol)的分析物進行大量初步結構測定。對梯狀測序和源內破碎研究來說，重要的是使潛在肽雜質減到最少。利用線性TOF-MS的源內衰減用於研究產生離子的MALDI的亞穩離子衰減的RETOF-MS的替代方法是利用具有線性TOF-MS的DE。通過使用DE技術，也可獲得肽和蛋白質的主要結構信息。對產生肽或蛋白質離子的MALDI來說，通常不存在解吸事件(即，離子形成)時所產生的迅速的離子破碎。通過在離子形成與離子提取之間併入時間延遲，允許源內離子在提取之前在相對較短的時間(90%)產生容易解釋的數據，但不夠純的蛋白質混合物也可提供適用的數據，以供精確數據解釋。N-末端修飾(尤其乙醯化)蛋白質不能直接測序，因為自由伯氨基的缺乏而不能發生Edman化學。然而，經阻斷蛋白質的有限蛋白質水解(例如，使用溴化氰)可允許在儀器的各循環中產生胺基酸混合物，可使所述混合物經受資料庫分析以解釋有意義的序列信息。認為C-末端測序是重要的翻譯後修飾，有時關鍵性地影響蛋白質的結構和活性。多種疾病情形與蛋白質加工受損相關，且C-末端測序提供研究蛋白質結構和加工機制的另一手段。蛋白質組分析對蛋白質組來說，蛋白質可主要通過計算機檢索算法鑑別，所述算法將序列指定到從對所關注的蛋白質進行電噴霧電離(electrosprayionization,ESI)、基質輔助雷射解吸/電離(MALDI)、飛行時間(TOF)儀器或三維四極離子阱所產生的一組憑經驗獲得的質量/強度數據。其它檢測方法其他檢測方法涉及聯吡啶；金屬配位；納米技術(金)；生物素-抗生蛋白鏈菌素/抗生物素蛋白；UV/Vis;涉及結合事件和偶合事件的兩步系統，歸因於非天然胺基酸與標靶的接近，產生從螢光團、結合於多肽、脂質運載蛋白(e桶狀)、脂肪酸結合蛋白中所存在的非天然胺基酸的小分子基螢光/發螢光分子以及由深到淺或由淺到深的螢光團的發射。XV.成像和診斷本文中揭露利用非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段的用於成像和診斷的方法。分子成像為涉及鑑別分子成像標靶的分子和細胞生物學、開發合適成像探針的放射化學和生物接合化學、優化獲得最佳耙向功效和有利活體內動力學的探針的藥理學以及活體內非侵襲性監測分子成像探針歷程的成像捕獲技術的成果的多學科領域。除基本診斷應用外，分子成像也在治療功效評估、藥物發現以及活系統中的分子機制的理解中發揮作用。分子成像探針(單克隆抗體、微型抗體、蛋白質、肽以及擬肽)可用於觀測和定量分子標靶。解剖學(微MRI和微CT)和分子成像技術(微PET、微SPECT以及NIR螢光成像)的組合可允許獲得分子和功能信息且監測特異性分子治療功效。生物成像方法可使用光透射、反射、散射以及螢光發射策略以高空間和光譜解析度用於檢測空間定向(即，分布)且定量細胞和組織天然成分、結構、細胞器以及所投與的組分，諸如經標籤標記的探針(例如，螢光探針)和藥物。未經標記化合物與經標記探針對具有已知藥理學特徵和功效的藥劑的活體內競爭檢定可用於藥物評估程序。藥物靶向的非侵襲性特徵、受體佔位性、有效受體或酶抑制所需的濃度等可加速前導化合物的評估。當新穎藥物候選物進行至藥效和藥物動力學研究時，成像分析可定量且重複地監測標靶可接近性、標靶位點處的保留持續時間和其與藥物功效的相關性，以及從不相干組織的清除率。在臨床試驗中，成像檢定可有利於評估患者中的非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段的藥理學性質與治療功效。通過用合併結構和功能數據的多模態成像儀器組合成像探針，醫師可同時進行多功能成像檢定和解剖學分析。隨後可使來源於結構研究和藥物分布和濃度的非侵襲性重複監測的信息與關於信號轉導路徑、標靶酶活性、抗原含量、受體活化、細胞增殖、蛋白酶體活性等的生物效應相關聯。所述非侵襲性檢定可準許實時監測和修改靶向介入和治療策略。分子成像技術可用於在臨床前研究中研究小鼠模型。舉例來說，用於癌症和其它病症的許多藥物通過誘導細胞凋亡發揮其治療效應。重複地使活動物中的細胞凋亡反應成像的能力可有利於所述藥物的臨床前評估。對研究轉殖基因小鼠來說，通過非侵襲性成像鑑別可以適當空間和時間模式表達轉殖基因的建立者小鼠可準許鑑別未經配種的建立者。分子成像可提供治療基因的表達的位置、量值以及持續時間以優化基因治療方案。光學成像可與靶向基因轉移聯合。報導體基因的分子成像也可用於監測細胞基療法的生物分布和功效。成像探針成像探針可為經放射性同位素標記的分子或光發射或近紅外(nearinfrared，NIR)發射分子。在研究中，分子成像探針的濃度和/或光譜性質通過特定生物過程而改變。可用於功能成像研究的探針的兩種類型為(僅舉例來說)直接結合探針和間接探針。直接結合探針和間接探針可為非天然胺基酸多肽。直接結合探針的實例包含(但不限於)抗體、抗體片段、抗原結合多肽以及其片段和受體配位體。直接探針可用於檢測其標靶的濃度，因為其結合為化學計量的。因此，直接探針適用於研究在病理學病狀中(例如)在治療之前和之後過表現的標靶。間接探針用於監測其大分子標靶的活性，包含催化活性。所述探針的實例由Herschman描述於Science2003302:605-608中。探針可開發用於監測內源靶向分子和生物過程。所述探針可為(經修飾)非天然胺基酸多肽。可使用成像探針研究內源過程的重要調節劑和/或指示劑。酶(諸如激酶或蛋白酶)的底物可通過放射性核素或螢光分子標記，以使得通過分子成像檢定檢測諸如磷酸化或蛋白酶裂解的事件。所述在蛋白酶裂解後發射NIR螢光的螢光探針可稱為"可活化"光學成像探針。直接和間接探針可通過高產量篩檢化學文庫發現。直接探針也可通過篩檢大重組抗體和噬菌體文庫發現。所述文庫可包括(經修飾)非天然胺基酸多肽。量子點利用本文中所揭露的非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段的用於成像和診斷的方法包含螢光半導體納米晶體(也稱為量子點(quantumdot或qdot))。量子點可用於研究單個分子水平上的細胞內過程、高解析度細胞成像、細胞通行的長期活體內觀察、腫瘤靶向以及診斷。膠體半導體量子點是直徑為數納米的單晶，其尺寸和形狀可通過合成中所使用的持續時間、溫度以及配位體分子精確控制。這種方法可產生具有組成和尺寸依賴性吸收和發射的量子點。吸收具有大於半導體帶隙能的能量的光子可使得產生電子-空穴對(或激發子)。與標準螢光團鮮明對照，吸收在較高能量(即，較短波長)下可具有增加的概率且產生寬帶吸收譜。對小於所謂的玻爾激發子半徑(Bohrexcitonradius)(數納米)的納米晶體來說，能級可能是量子化的，其值直接與量子點的尺寸相關(稱為量子限制的效應，由此得名"量子點")。激發子(特徵在於壽命長，>10納秒)的輻射複合可使得發射窄的對稱能帶的光子。量子點的長螢光壽命可使得能夠使用時間選通檢測來從具有較短壽命的物質的信號(諸如細胞中遇到的背景自發螢光)中分離其信號。可經延長時間用(例如)共焦顯微術、全內反射顯微術或基本視野表螢光顯微術觀察和追蹤單個量子點。螢光相關光譜可允許測定每粒子的亮度以及提供平均量子點尺寸的測量。量子點也可用作雙光子共焦顯微術的探針，因為其特徵在於非常大的吸收截面。其可與標準染料同時使用。量子點具有作為螢光共振能量傳遞(FRET)對的可定製供體的潛能。對諸如量子點標記靶分子(諸如非天然胺基酸多肽)的應用來說，可將單個識別部分移植到量子點中(例如，DNA寡核苷酸或適體、抗體、抗體片段、抗原結合多肽等)或用作量子點增溶配位體。含有(例如)胺或羧基的量子點配位體可利用標準生物接合反應提供含有硫醇基或N-羥基琥珀醯亞胺酯部分的交聯分子的可能性。另一種方法可為使用量子點與帶電接頭分子之間或量子點與經修飾而併入帶電域的蛋白質之間的靜電作用。可重複所述官能化步驟以添加或改變官能團。舉例來說，經抗生蛋白鏈菌素塗布的量子點可與經生物素標記蛋白質或抗體組合使用。諸如使用(i)針對特異性靶的抗體，(ii)針對第一抗體的經生物素標記的二次抗體，以及(iii)經抗生蛋白鏈菌素塗布的量子點的三層法可允許量子點標記如本文中所揭露的非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段。許多潛在表面連接基團可用於將不同官能團"移植"到個別量子點中，從而產生多能探針。舉例來說，除識別部分外，可使量子點具備膜交連或細胞內化能力和/或酶促功能。肽可經定製，且通過選擇序列，單步表面活性劑交換可產生必要的功能(i)保護核心/殼層結構且維持原始量子點光物理學，(ii)溶解量子點，(iii)提供生物界面，以及(iv)允許併入多種功能。所得粒子可具有膠體性質、光物理學以及生物適應性，且所述"肽工具包"可適合於提供其他官能團。所述官能團可通過分子演化來改進。可使用活細胞實驗(諸如全細胞標記、標記膜結合蛋白質以及細胞質或細胞核標靶標記)進行細胞或病原體檢測、細胞追蹤以及細胞譜系研究。此可通過量子點的微量注射、電穿孔或吞噬在不經任何官能化的情況下實現。可以使量子點耙向細胞表面蛋白質的方式探究不同類型的官能化。一些實例包含抗生蛋白鏈菌素、二次抗體或一次抗體、受體配位體(諸如表皮生長因子(epidermalgrowthfactor,EGF)或血清素)、識別肽以118及親和性對，諸如使標靶蛋白質工程化後的生物素-抗生物素蛋白。另一策略可由使一次抗體與量子點交聯組成。一些蛋白質可由肽識別，所以可使用肽以供量子點官能化。微量注射可允許將經適當靶向肽序列官能化的量子點傳送到線粒體或細胞核中。量子點的長期穩定性和亮度使其成為活動物耙向和成像的候選者。在合成中，新組成可使量子點必然具有以下性質，諸如(i)對電場或磁場的靈敏性；(ii)較窄的螢光發射和較長的壽命(使用鑭系金屬摻雜量子點)；(iii)較小的尺寸和如三元混合物所證明的NIR光譜的擴展；(iv)納米杆量子點的末端特異性官能化；(V)抑止閃爍和量子產率增加；以及(Vi)內建式啟閉開關或光電生物轉換器。生物轉換器光激發量子點可將其電荷轉移到充當電子或空穴接受體的結合酶，從而使得其控制能夠通過光活化進行。相反地，量子點可通過電子或空穴供體酶經化學發光發亮。納米材料的肽塗層可為賦予有機-無機界面新穎功能的手段。可使用半導體的能帶隙(通過合理設計)與肽的氧化還原電勢(通過分子演化)的同時工程化設計優化量子點組成和用於結合的肽序列以及所需光學、電子、磁性以及化學性質。總之，不同的形狀、末端特異性以及組成可產生更複雜的生物無機結構，所述結構可用作細胞機構的光電子界面。量子點可用作對比試劑與MRI、PET、計算機斷層成像以及IR螢光成像(後者通過表皮直接成像或通過導管基共焦纖維顯微鏡)組合用於功能成像。活體內光學活檢可證實病理學，且隨後可通過將能量(用於k-殼層吸收的單色X射線或雷射IR輻射)沉積於靶向量子點中來選擇性、局部以及臨時性地進行治療。或者，有可能將治療性酶移植到量子點表面且通過光將其活化或通過光學循環量子點產生自由基(諸如單重態氧)。成像儀器多種儀器可用於成像和診斷如本文中所揭露的非天然胺基酸、非天然胺基酸多肽、經修飾非天然胺基酸多肽以及其片段。對探針的監測可由(1)測量系統和(2)分析軟體組成。測量系統可包含所有光學器件、電子器件以及照明樣品的方式(例如，光源選擇)、測量模式(例如，螢光或透射)以及最適於由測量提取所需結果的校正。分析軟體可包含以有意義的方式分析和呈現重要結果所必需的所有軟體和數學算法。測量可使用與以下系統連接的幾乎任何光學系統進行例如垂直或倒置顯微鏡、螢光顯微鏡、微距透鏡、內窺鏡以及底部照相機。此外，可使用任何標準實驗方法，包含光透射(明視場和暗視場)、所投與的探針的自發螢光和螢光等。螢光測量可用任何標準濾光片組(由屏障濾光片、激發濾光片以及二色鏡組成)或用於專門應用的任何定製濾光片組進行，只要發射光譜屬於系統靈敏度的光譜範圍內。光譜生物成像也可與任何標準空間濾光法(諸如暗視場和相差)且甚至與偏振光顯微術組合使用。放射性核素標記探針可通過PET或單光子發射斷層成像(single-photonemissiontomography,SPECT)檢測，探針發射光(螢光、生物發光或MR發射)可通過光學成像檢測，且無線電波發射可通過MRI檢測。小動物裝置可用於放射性核素基成像(例如，微SPECT和微PET)、可見光光學成像(使用靈敏的冷卻電荷耦合裝置(charged-coupleddevice,CCD)照相機)和NIR發射。解剖學(微MRI和微CT)和分子成像技術(微PET、微SPECT以及NIR螢光成像)的組合可有助於獲得分子和功能信息且監測特定分子治療功效。非侵襲性報導體基因檢定可用於活動物的分子成像研究。使用直接結合FESP探針或單純皰疹病毒1型胸苷激酶(herpessimplexvirustype1-thymidinekinase,HSVl-TK)，經放射性核素標記的探針可用於監測活小鼠中報導體基因的表達。HSV1-TK可用經正電子標記的胸苷類似物監測。如同FDG，作為酶依賴性磷酸化的結果，己糖激酶的間接底物探針HSV1-TK的正電子標記底物可保留在細胞中。對光學成像檢定來說，酶從其底物產生的光可用靈敏的CCD照相機監測。可用螢光、生物發光或放射性核素探針成像的編碼融合蛋白質的新穎報導體基因可允許用許多不同成像探針和適於不同應用的儀器研究單個動物。微PET儀器可提供對功能檢定的較佳解剖學區分例如精確定位器官中腫瘤的位置、更精確地確定細胞遷移的位置等。螢光介導的斷層成像可改進光學成像程序的解析度和定量。光譜成像技術可區分多個螢光探針的發射，從而準許同時分析不同光學探針且顯著降低背景自發螢光。多肽和文庫的非天然胺基酸掃描待經取代以調節多肽的活性或性質的胺基酸的鑑別可通過定點突變誘發來進行。調節功能的本發明的多肽和多肽文庫中的胺基酸可通過在多肽的任何或所有位置用非天然編碼胺基酸代替天然胺基酸來鑑別或調節。可通過所屬領域中已知的方法將天然編碼胺基酸取代到多肽的選定位置中，所述方法諸如定點突變誘發或丙胺酸掃描突變誘發(例如參看Cunningham等人，1989)，所述揭露案是以引用的方式全部併入本文中。丙胺酸掃描突變誘發程序在分子中的選定或每個殘基處引入單個丙胺酸突變。代替取代天然編碼胺基酸丙胺酸，用非天然編碼胺基酸取代多肽鏈中的天然編碼胺基酸。隨後就生物活性使用適於測量特定多肽或蛋白質的功能的檢定測試所得包括非天然編碼胺基酸的突變型多肽分子。尤其受關注的可為用非天然編碼帶電胺基酸或非天然編碼中性胺基酸取代天然編碼帶電和/或中性胺基酸。所述取代可產生具有高度希望的經改進或調節特徵的蛋白質，所述特徵諸如經調節的受體結合、經調節的酶活性、經調節的抗原結合或經調節的聚集或溶解性。實例提供以下實例以說明而不是限制本發明。實例1本實例描述可與非天然胺基酸多肽一起形成的接合物。分子可直接鍵結至多肽中的一個或一個以上非天然胺基酸或可通過連接子、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子連接。圖9呈現通過在併入多肽中的非天然胺基酸的羰基與分子的羥胺之間形成肟鍵的反應來位點特異性地連接至多肽的分子的非限制性實例。可將包含(但不限於)螢光團、生物素以及螯合劑的分子連接至非天然胺基酸多肽。實例2可使用樹脂或所屬領域的技術人員己知的其它物質分離多肽。圖10展示利用與非天然胺基酸反應的樹脂的非天然胺基酸的純化方法的實例。共價鍵形成於樹脂上的化學特異性親和性標籤與蛋白質中存在的非天然胺基酸之間。所述鍵聯在寬範圍的pH值和純化條件下穩定。分離步驟可以交替模式進行，所交替模式包含(但不限於)能夠進行大規模純化的浴模式。樹脂與親和性標籤在物理上和化學上都是穩定的，且因此可重複使用以降低規模擴大後的蛋白質純化的成本。分離可與多肽與分子(包含(但不限於)PEG)的接合組合進行。所述"一鍋式"方法進一步簡化接合過程且降低蛋白質(包含(但不限於)標靶治療蛋白質)的製造成本(圖11)。可接合的其它分子包含(但不限於)螢光團。可根據多肽中所存在的非天然胺基酸選擇且官能化用於純化的樹脂或其它物質。圖12展示樹脂選擇和官能化的實例。視多肽中所存在的非天然胺基酸而定，可不同地官能化用於純化的樹脂或其它物質。舉例來說，圖13展示使用羥胺樹脂親和力純化非天然胺基酸多肽的實例。圖14展示使用醛樹脂純化非天然胺基酸多肽的實例。展示羥胺樹脂及醛樹脂的非限定性實例。在一些實施例中，純化過程的一個或一個以上步驟將多肽中所存在的一個或一個以上非天然胺基酸修飾為一個或一個以上天然胺基酸。圖15展示從非天然胺基酸前驅體純化天然蛋白質的實例。在從純化過程中所使用的樹脂釋放後，使非天然胺基酸轉化為酪氨酸。圖16展示非天然胺基酸的非限定性實例。121實例3非天然胺基酸掃描突變誘發這一實例詳述包含非天然編碼胺基酸的hGH多肽在大腸桿菌中的克隆和表達。這一實例也描述一種評估經修飾hGH多肽的生物活性的方法。克隆hGH和其片段的方法詳述於美國專利第4,601,980號、第4,604,359號、第4,634,677號、第4,658,021號、第4,898,830號、第5,424,199號以及第5,795,745號中，其是以引用的方式併入本文中。編碼全長hGH和成熟形式的缺乏N末端信號序列的hGH的cDNA分別展示於SEQIDNO:21和SEQIDNO:22中。關於完整全全長天然存在GH胺基酸序列以及成熟天然存在GH胺基酸序列和天然存在突變體，參看SEQIDNO:1、SEQIDNO:2以及SEQIDNO:3。使用包括正交tRNA(O-tRNA)和正交氨醯基tRNA合成酶(O-RS)的所引入翻譯系統來表達含有非天然編碼胺基酸的hGH。O-RS優先用非天然編碼胺基酸氨醯基化O-tRNA。轉而翻譯系統回應所編碼的選擇密碼子將非天然編碼胺基酸插入hGH中。表1:O-RS和O-tRNA序列tableseeoriginaldocumentpage122用含有經修飾hGH基因和正交氨醯基tRNA合成酶/tRNA對(對所需非天然編碼胺基酸具特異性)的質粒轉化大腸桿菌允許將非天然編碼胺基酸位點特異性地併入hGH多肽中。在37'C下在含有介於0.01-100mM之間的特定非天然編碼胺基酸的培養基中生長的經轉化大腸桿菌以高保真度和高效率表達經修飾hGH。含有非天然編碼胺基酸的經His標籤標記的hGH是由大腸桿菌宿主細胞以包涵體或聚集體形式產生。在6M鹽酸胍中在變性條件下將聚集體溶解且進行親和力純化。在4'C下在50mMTRIS-HCl(pH8.0)、40CuS04和2%(w/v)Sarkosyl中通過透析進行再摺疊過夜。隨後將物質以20mMTRIS-HC1(pH8.0)、100mMNaCl、2mMCaCl2透析，接著移除His標籤。參看Boissel等人，(1993)268:15983-93。用於純化hGH的方法在所屬
技術領域：
中眾所周知且由SDS-PAGE、西方印跡分析(WesternBlotanalysis)或電噴霧-電離離子阱質譜以及其類似方法證實。使用ProBond鎳螯合樹月旨(ProBondNickel-ChelatingResin;Invitrogen，Carlsbad,CA)通過由製造商提供的標準經His標籤標記的蛋白質純化程序，接著通過陰離子交換管柱，之後負載於凝膠上來純化經His標籤標記的突變型hGH蛋白質。為進一步評估經修飾hGH多肽的生物活性，使用測量hGH與其受體的相互作用的下遊標記物的檢定。hGH與其內源產生的受體的相互作用使得人類IM-9淋巴細胞系中的信號轉導因子和轉錄活化因子家族成員STAT5的酪氨酸磷酸化。從IM-9cDNA文庫中鑑別出STAT5的兩種形式STAT5A和STAT5B。例如參看Silva等人，Mol.Endocrinol.(1996)10(5):508-518。IM-9細胞上人類生長激素受體對人類生長激素具有選擇性，而不對大鼠生長激素和人類催乳激素具選擇性產生可檢測的STAT5磷酸化。重要的是，大鼠GHR(L43R)胞外域與帶有hGH的G120R高效競爭hGH剌激的pSTAT5磷酸化。用本發明的hGH多肽刺激IM-9細胞。人類IM-9淋巴細胞是購自ATCC(Manassas,VA)且在補充有丙酮酸鈉、青黴素、鏈黴素(Invitrogen,Carlsbad,SanDiego)以及10%熱滅活胎牛血清(Hyclone,Logan，UT)的RPMI1640中培養。將MI-9細胞在檢定培養基(無苯酚紅的RPMI、10mMHepes、1%熱滅活木炭/葡聚糖處理的FBS、丙酮酸鈉、青黴素以及鏈黴素)中飢餓過夜，之後在37'C下用12點劑量範圍的hGH多肽刺激10分鐘。將經刺激的細胞用1%甲醛固定，之後在冰上用90%冰冷甲醇滲透1小時。通過用初級磷酸基STAT5抗體(CellSignalingTechnology,Beverly,MA)在室溫下細胞內染色30分鐘，接著用PE接合二次抗體染色來檢測STAT5磷酸化程度。在FACS陣列上進行樣品獲取，其中所獲取的數據是用Flowjo軟體(TreeStarInc.,Ashland,OR)分析。自利用SigmaPlot以平均螢光強度(MFI)對蛋白質濃度繪製的劑量反應曲線得到EC50值。下表2概述由突變型hGH多肽產生的IM-9數據。如所述用人類IM-9細胞測試各種在不同位置處具有非天然胺基酸取代的hGH多肽。在所指示位置處用對乙醯基苯基丙氨酸進行所示取代。使用相同檢定評估經聚乙二醇化的包括非天然胺基酸的hGH多肽的生物活性。由表中所示的數據，顯然受體結合活性根據用非天然編碼胺基酸取代天然編碼胺基酸的位置而存在差異。表2tableseeoriginaldocumentpage124實例4這一實例詳述經修飾hIFN多肽在大腸桿菌中的克隆和表達。這一實例演示包含非天然編碼胺基酸的hIFN多肽可如何表達於大腸桿菌中。參看Nagata等人，Nature,第284巻，316-320(1980)和美國專利第4,364,863號。編碼全長hIFN和成熟形式的缺乏N末端信號序列的hIFN的cDNA分別展示於SEQIDNO:23和SEQIDNO:24中。在不改變胺基酸序列的情況下優化用於克隆和表達的序列之後，將全長和成熟hlFN編碼cDNA插入pBADHISc、pET20b以及pET19b表達載體中。使用包括正交tRNA(O-tRNA)和正交氨醯基tRNA合成酶(O-RS)的所引入的翻譯系統來表達含有非天然編碼胺基酸的hGH。O-RS優先用非天然編碼胺基酸氨醯基化O-tRNA。轉而翻譯系統回應所編碼的選擇密碼子將非天然編碼胺基酸插入hGH中。適用於幹擾素表達的O-RS和O-tRNA序列包含實例3中的展示的那些序列。用含有經修飾hIFH基因和正交氨醯基tRNA合成酶/tRNA對(對所需非天然編碼胺基酸具特異性)的質粒轉化大腸桿菌允許將非天然編碼胺基酸位點特異性地併入hlFN多肽中。在37'C下在含有介於0.01-100mM之間的特定非天然編碼胺基酸的培養基中生長的經轉化大腸桿菌以高保真度和高效率表達經修飾hIFN。含有非天然編碼胺基酸的經His標籤標記的hlFN是由大腸桿菌宿主細胞產生且經親和力純化。用於純化hlFN的方法在所屬領域中眾所周知且由SDS-PAGE、西方印跡分析或電噴霧-電離離子阱質譜以及其類似方法證實。結合檢定如美國專利第6,566,132號、第5,889,151號、第5,861,258號、第5,731,169號、第5,578,707號(其是以引用的方式併入本文中)中所述來製備hIFN受體。對於包括非天然胺基酸的非聚乙二醇化多肽來說，可通過使用所屬
技術領域：
中已知的BIAcore生物傳感器(Pharmacia)技術測量激素對其受體的親和性。BIAcore生物傳感器檢定用於測量包括在表3中所示的位置處取代的非天然編碼胺基酸的hIFN分子的結合特徵以及受體結合數據。由表中所示的數據，顯然受體結合活性根據用非天然編碼胺基酸取代天然編碼胺基酸的位置而存在差異。表3IFNa2A變體Kd(nM)IFNa2A變體KdCnM)SigmaIFNaA116His-Q61pAF216His-IFNa2A66His-N65pAF7ClSIFNa2A116His曙E78pAF7ClSE107pAF96His-Y89pAF96His-F36S13006His-E96pAF126His陽F38L186His-I100pAF106His-F38S426His-G102pAF276His-L9pAF146His-V103pAF146His-R12pAF86ffis國T106pAF8.6His-R13pAF146His-E107pAF56His-M16pAF186His-P109pAF176His-I24pAF56His-L110pAF136His-F27pAF86His-E113pAF196His-K31pAF526His-L117pAF86His-H34pAF46His-R120pAF46His-G37pAF126HisY122S3006His-P39pAF176His-R125pAF196His-E41pAF166ffis-K134pAF106His-N45pAF76His-R149pAF756His-Q48pAF176His-E159pAF3.56ffis-K49pAF10實例5蛋白質與寡核苷酸之間的接合物和複合物在診斷和治療(諸如免疫PCR、基因治療以及最近RNAi的靶向傳送)中具有廣泛應用。位點特異性接合使得能夠產生特異性設計的分子和具有新穎功能的納米結構。目前位點特異性接合已主要通過馬來醯亞胺化學實現，其中工程化蛋白質表面半胱氨酸選擇性地與馬來醯亞胺反應以形成硫醚。非天然胺基酸位點特異性地併入多肽中的發展已使得大量化學能夠用於分子與蛋白質的接合。已將超過30個非天然編碼胺基酸位點特異性地併入蛋白質中。在此實例中，使用如下所述的非天然胺基酸作為手柄，使寡核苷酸與蛋白質位點特異性地接合。此外，使用單鏈DNA作為模板，以確定方式在一維程度上裝配接合蛋白質。這一實驗中所使用的蛋白質為人類生長激素Y35突變體，其中酪氨酸35由非天然編碼胺基酸9.2代替(流程1)。在-8(TC下，將單鏈DNA以25mM溶液形式存儲於水中。ssDNAFTam27的序列為5'-CAGCCAGCGTGCACG(SEQIDNO:21)。用醯肼修飾FTam27的5'。模板序列為FTam28-dh5'-CGTGCACGCTGGCTGCGTGCACGCTGGCTG(SEQIDNO:21);FTam-d2:5'-CGTGCACGCTGGCTGTCGTGCACGCTGGCTG(SEQIDNO:22);FTam28-d3:5'-CGTGCACGCTGGCTGTTCGTGCACGCTGGCTG:FTam28-tl(SEOIDNO:23):5'-CGTGCACGCTGGCTGCGTGCACGCTGGCTGCGTGCACGCTGGCTG(SEOIDNO:24):FTam28-t2:5'-CGTGCACGCTGGCTGTCGTGCACGCTGGTCTGCGTGCACGCTGGCTG(SEQIDNO:25);FTam28-t3:5'-CGTGCACGCTGGCTGTTCGTGCACGCTGGTTCTGCGTGCACGCTGGCTG(SEQIDNO:26)。蛋白質單鏈DNA接合使用PDIO凝膠過濾管柱將蛋白質(Img)緩衝液交換至反應緩衝液(150mMNaCl，20mMNaOAc，400mMArg，5mMEDTA，pH4.0)中。使用10kDMWCOCENTROCON(Vivascience)將蛋白質溶液濃縮為90微升。將5微升25mM具有醯肼5'修飾的ssDNAFTam27的水溶液分配到40微升反應緩衝液中。將ssDNA溶液緩慢添加到蛋白質溶液中。最初出現沉澱，但又溶解。在28'C下培育20小時後，添加5mM氰基硼氫化鈉。將反應混合物再培育20小時且使其經受分析和純化。接合物的純化使用1毫升苯基HIC管柱進行接合物的FPLC純化。緩衝液A:2MNaCl，10mMTrisHC1，pH7.0;緩衝液B:10mMTrisHC1，pH7.0。純化中所使用的梯度為10管柱體積(columnvolume,CV)0%B，5CV到50%B，在50。/。B下保持5CV，然後30CV到100%B。濃縮經純化接合物，與存儲緩衝液(200mMNaCl，50mMTris*HC1，1mMEDTA，pH8.0)進行緩衝液交換且在MES緩衝液中以200V使用4-12%SDS凝膠使其經受PAGE分析。雜交將5微升蛋白質-ssDNA接合物添加到於存儲緩衝液(200mMNaCl，50mMTris.HCl，lmMEDTA，pH8.0)中的互補ssDNA中。向混合物中補充存儲緩衝液以產生20微升的最終體積且在42'C下加熱30秒，隨後冷卻到室溫。通過在125V，4'C下天然TRIS甘氨酸凝膠電泳3至5小時分析最終產物。NaCNBHs■5'ssDNAhGH流程1:hGH突變體(Y35/非天然胺基酸9.2)與在5'末端處經醯肼修飾的單鏈DNA的接合流程將具有1,3二酮部分的非天然編碼胺基酸9.2併入人類生長激素(hGH)中的胺基酸位置35處，且用作與在5'處經醯肼官能團修飾的15mer單鏈DNAFTam27接合(流程1)的手柄。這一接合最初產生腙，所述腙進一步被氰基硼氫化鈉還原以產生不可逆的共價鍵。在5倍過量的ssDNA的情況下，獲得70%的產率(圖17)。使用HIC管柱將接合物純化到約90%純且使其經受雜交。接合物經設計以與具有兩個(d)或三個(t)其間具有零個(1)、一個(2)以及兩個(3)鹼基T作為間隔基的串聯互補序列(FTam28)重複的ssDNA雜交(圖18)。為確定hGH-DNA接合物的相對濃度，將5微升hGH-ssDNA接合物與一系列濃度的FTam28-d3(具有兩個與FTam27互補的重複序列和兩個在其間作為間隔基的T鹼基的單鏈DNA)混合。將結果用4'C下，125V3小時的14。/。天然甘氨酸凝膠電泳分析(圖19)。最完全的雜交是與4微升10nMFTam28-d3混合的5微升hGH-ssDNA，其產生約16nM的接合物濃度。根據凝膠，具有FTam28-d3的hGH-ssDNA和hGH-ssDNA雜交單體比hGH自身更易移動，可能歸因於DNA主鏈上的大量負電荷。所述現象也在對照實驗中得到證明(圖20)。當將hGH與1微升100FTam28-d3混合時，未觀察到雜交(泳道4)。另一方面，當將1微升100FTam28-d3與hGH-ssDNA接合物混合時，通過雜交形成hGH二聚體。hGH與DNA之間不存在非特異性相互作用。所接合hGH的二聚作用為特異性DNA雜交的結果。當添加大大過量的FTam28-d3時，形成較多雜交單體和較少雜交二聚體。當將80皮摩爾hGH-ssDNA接合物與10當量FTam28-d3混合時(泳道3)，出現實質量的雜交二聚體。此指示雜交二聚體在熱力學上比雜交單體更穩定。為證明蛋白質-ssDNA以充分確定的方式裝配(圖21)，使用單鏈DNA作為模板裝配六個一維結構的hGH。所述結構因各hGH分子之間不同的價數和間隔基而不同。將hGH-ssDNA與1當量各DNA模板混合。將混合物在5(TC下培育5分鐘，冷卻到室溫且在天然甘氨酸凝膠上分析。所述一維結構被高度有效地裝配。泳道1至泳道3展示DNA序列重複之間分別具有零、一和二個T鹼基的間隔基的二聚體形成的結果。泳道4至泳道6展示具有零、一以及三個T鹼基作為間隔基的間隔基的三聚體形成的裝配結果。使用非天然編碼胺基酸作為化學手柄，使單鏈DNA位點特異性地與蛋白質表面接合。這一單鏈DNA-蛋白質接合物可用於使用DNA作為模板高度有效地裝配蛋白質一維結構。位點特異性寡核苷酸接合也可用於裝配產生具有新穎功能的新穎納米結構的充分確定的三維結構。此外，蛋白質-寡核苷酸接合技術可適用於產生蛋白質藥物"即插即用(plugandplay)"文庫。在此情況下，寡核苷酸可用作編碼個別小分子和/或蛋白質的鍵聯與"名稱標籤"。蛋白質-寡核苷酸接合物可用於免疫PCR以供診斷應用。這一技術也可用於產生可用於靶向RNAi療法中的蛋白質RNA或PNA接合物。應了解本文中所述的實例和實施例僅出於說明性目的且所屬領域的一般技術人員將提出根據其的各種修飾或更改且其包含在本申請案的精神和範圍和隨附權利要求書的範疇內。雖然本文中已展示和描述本發明的優選實施例，但對於所屬領域的技術人員將顯而易見所述實施例僅以舉例的方式提供。在不悖離本發明的情況下，現在所屬領域的技術人員將想到許多變化、更改和取代。應了解，本文中所述的本發明的實施例的各種替代形式可用於實施本發明。希望隨附權利要求書界定本發明的範疇且從而涵蓋權利要求書範疇內的方法和結構以及其等效物。權利要求1.一種檢測多肽的方法，其包括檢測所述多肽中的非天然編碼胺基酸側鏈。2.根據權利要求1所述的方法，其中所述多肽是使用選自由以下方法組成的群組的技術檢測免疫檢定、微陣列、顯微術、螢光顯微術、電子顯微術、電泳、光譜學、顯色反應、放射性檢測、無線電發射、亞原子粒子檢測、金屬結合、螯合、結構或構象變化、酶活性、特異性結合、攝影術、磁場測量、傳感器、電磁能檢測、基因表達、可見或不可見光檢測、溫度檢測以及化學檢測。3.根據權利要求2所述的方法，其中所述免疫檢定選自由以下檢定組成的群組放射性免疫檢定、酶聯免疫吸附檢定、酶倍增免疫檢定、微粒酶免疫檢定、發光免疫檢定以及螢光免疫檢定。4.根據權利要求2所述的方法，其中所述光譜學選自由以下方法組成的群組SELDI、MALDI、螢光光譜學、NMR、UV-Vis以及X射線結晶學。5.根據權利要求2所述的方法，其中所述電泳選自由以下方法組成的群組凝膠電泳、區帶電泳、等電點聚焦電泳、毛細管電泳、毛細管區帶電泳、毛細管凝膠電泳、毛細管等速電泳、毛細管等電點聚焦電泳以及毛細管電色譜法。6.根據權利要求1所述的方法，其中所述多肽是由核糖體合成。7.根據權利要求1所述的方法，其中所述非天然胺基酸多肽經翻譯後修飾。8.—種檢測多肽的方法，其包括檢測所述己經翻譯後修飾的多肽中的非天然編碼胺基酸側鏈。9.根據權利要求8所述的方法，其中所述多肽使用選自由以下方法組成的群組的技術檢測免疫檢定、微陣列、顯微術、螢光顯微術、電子顯微術、電泳、光譜學、顯色反應、放射性檢測、無線電發射、亞原子粒子檢測、金屬結合、螯合、結構或構象變化、酶活性、特異性結合、攝影術、磁場測量、傳感器、電磁能檢測、基因表達、可見或不可見光檢測、溫度檢測以及化學檢測。10.根據權利要求9所述的方法，其中所述免疫檢定選自由以下方法組成的群組放射性免疫檢定、酶聯免疫吸附檢定、酶倍增免疫檢定、微粒酶免疫檢定、發光免疫檢定以及螢光免疫檢定。11.根據權利要求9所述的方法，其中所述光譜學選自由以下方法組成的群組SELDI、MALDI、螢光光譜學、NMR、UV-Vis以及X射線結晶學。12.根據權利要求9所述的方法，其中所述電泳選自由以下方法組成的群組凝膠電泳、區帶電泳、等電點聚焦電泳、毛細管電泳、毛細管區帶電泳、毛細管凝膠電泳、毛細管等速電泳、毛細管等電點聚焦電泳以及毛細管電色譜法。13.根據權利要求8所述的方法，其中所述多肽是由核糖體合成。14.一種檢測所述多肽中非天然編碼胺基酸側鏈的方法，其包括使所述非天然編碼胺基酸側鏈與包括與所述非天然編碼胺基酸側鏈特異性相互作用的官能團的分子接觸。15.—種篩檢分子文庫的方法，其包括a)使包括非天然編碼胺基酸的多肽與所述文庫分子在允許所述文庫分子與所述包括非天然編碼胺基酸的多肽相互作用的條件下組合，b)鑑別所述與所述包括非天然編碼胺基酸的多肽相互作用的文庫分子。16.根據權利要求15所述的方法，其中所述非天然胺基酸多肽是由核糖體合成。17.根據權利要求15所述的方法，其中所述非天然編碼胺基酸的側鏈經翻譯後修飾。18.根據權利要求17所述的方法，其中所述非天然胺基酸多肽是由核糖體合成。19.根據權利要求15所述的方法，其中所述文庫為化學文庫或生物文庫。20.根據權利要求19所述的方法，其中所述化學文庫為有機文庫或無機文庫。21.根據權利要求19所述的方法，其中所述生物文庫分子選自由以下各物組成的群組蛋白質、肽、多肽、DNA、RNA、病毒、核糖體、翻譯複合物、噬菌體、細菌以及酵母。22.根據權利要求15所述的方法，其中所述文庫分子與所述多肽的所述相互作用為所述文庫分子與所述多肽的特異性結合。23.根據權利要求15所述的方法，其中所述文庫分子與所述多肽的所述相互作用為所述文庫分子與所述多肽的共價鍵形成或複合物形成。24.根據權利要求15所述的方法，其進一步包括以下步驟c)回收與所述非天然胺基酸多肽相互作用的文庫分子；以及d)從所述文庫分子分離所述非天然胺基酸多肽，從而獲得經分離文庫分子。25.—種核糖體製造的多肽的文庫，其包括多個具有不同胺基酸序列的多肽，其中各多肽包括非天然胺基酸。26.根據權利要求25所述的文庫，其中各多肽包括相同非天然胺基酸。27.根據權利要求25所述的文庫，其中各多肽包括不同非天然胺基酸。28.根據權利要求25所述的文庫，其中至少一種多肽經翻譯後修飾。29.根據權利要求27所述的文庫，其中所述多肽除所述非天然編碼胺基酸外為一致的。30.根據權利要求25所述的文庫，其中各多肽與包括天然胺基酸的多肽同源。31.根據權利要求26所述的文庫，其中各多肽除所述非天然胺基酸的位置外為一致的。32.—種純化多肽鏈中具有非天然編碼胺基酸的多肽的方法，其包括使所述多肽和與所述多肽中的非天然編碼胺基酸相互作用的物質接觸。33.根據權利要求32所述的方法，其中所述物質為選自由液相色譜法、氣相色譜法以及超臨界流體色譜法組成的群組的色譜基質。34.根據權利要求33所述的方法，其中所述液相色譜法選自由分配色譜法、吸附色譜法、離子交換色譜法、尺寸排阻色譜法、薄層色譜法以及親和力色譜法組成的群組。35.根據權利要求33所述的方法，其中所述液相色譜法選自由HPLC、管柱色譜法以及批處理法組成的群組。36.根據權利要求32所述的方法，其中所述多肽與所述物質的所述接觸在微流體裝置中發生。37.根據權利要求32所述的方法，其中所述多肽與所述物質的所述接觸在納米流體裝置中發生。38.根據權利要求34所述的方法，其中所述分配色譜法選自由正相色譜法、反相色譜法以及離子對色譜法組成的群組。39.根據權利要求34所述的方法，其中所述薄層色譜法選自由紙色譜法、薄層色譜法以及電色譜法組成的群組。40.根據權利要求34所述的方法，其中所述親和力色譜法選自由配位體色譜法、染料色譜法、金屬螯合物色譜法、免疫親和力色譜法以及疏水性相互作用色譜法組成的群組。41.一種純化多肽鏈中具有非天然編碼胺基酸的多肽的方法，其包括使所述多肽沉澱，其中當與多肽鏈中無非天然編碼胺基酸的所述多肽的溶解性相比時，所述非天然編碼胺基酸改變所述多肽的溶解性。42.根據權利要求41所述的方法，其中所述沉澱通過選自由鹽、酸、鹼以及聚合物組成的群組的化合物進行。43.根據權利要求41所述的方法，其中所述純化是通過免疫沉澱法達成。44.根據權利要求32所述的方法，其中所述物質是磁性物質。45.—種純化多肽側鏈中具有非天然編碼胺基酸的核糖體製造的多肽的方法，其包括使所述多肽電泳，其中當與多肽側鏈中無非天然編碼胺基酸的所述多肽的電泳遷移率相比時，所述非天然編碼胺基酸改變所述多肽的電泳遷移率。46.根據權利要求45所述的方法，其中所述電泳選自由凝膠電泳和毛細管電泳組成的群組。47.根據權利要求46所述的方法，其中所述凝膠電泳選自由區帶電泳和等電點聚焦電泳組成的群組。48.根據權利要求46所述的方法，其中所述毛細管電泳選自由以下方法組成的群組毛細管區帶電泳、毛細管凝膠電泳、毛細管等速電泳、毛細管等電點聚焦電泳、毛細管電色譜法、膠束電動毛細管色譜法、等速電泳以及瞬時等速電泳。49.一種純化多肽側鏈中具有非天然編碼胺基酸的核糖體製造的多肽的方法，其包括使所述多肽透析，其中當與多肽側鏈中無非天然編碼胺基酸的所述多肽的擴散速率相比時，所述非天然編碼胺基酸改變所述多肽的擴散速率。50.根據權利要求49所述的方法，其中所述透析是電透析。51.—種純化非天然胺基酸多肽的方法，其包括通過超濾純化所述多肽。52.根據權利要求32、41、45或49所述的方法，其中所述多肽是在微生物中表達。53.根據權利要求32、41、45或49所述的方法，其中所述多肽是在選自由大腸桿菌(Esc/je〃.c&'aco//)、螢光假單胞菌(i^eMctowowcw^/7MoreyceAW)、枯草桿菌(5acz7/iwsw6/z7/51)、酵母、哺乳動物細胞以及昆蟲細胞組成的群組的微生物中產生。54.根據權利要求53所述的方法，其中所述非天然胺基酸多肽為含有親和性標籤的雜交肽。55.根據權利要求32、41、45或49所述的方法，其中所述非天然胺基酸多肽經翻譯後修飾。56.根據權利要求55所述的方法，其中所述翻譯後修飾是通過肟交換反應達成。57.根據權利要求32、41、45或49所述的方法，其中所述非天然胺基酸經翻譯後修飾以包括肟基團。58.—種方法，其包括a)在具有至少一種已知生物活性的預選定多肽中的單個預選定位點處用非天然編碼胺基酸取代天然編碼胺基酸；和b)測量所述包括所述非天然編碼胺基酸的預選定多肽的生物活性；以及c)比較步驟b)的所述預選定多肽與已在所述預選定多肽鏈的不同位置處用非天然編碼胺基酸取代天然編碼胺基酸的預選定多肽或多肽鏈中無取代非天然編碼胺基酸的預選定多肽的生物活性。59.根據權利要求58所述的方法，其中所述多肽鏈中的用於以非天然編碼胺基酸取代的所述預選定位置為連續的。60.根據權利要求58所述的方法，其中對於所述多肽鏈中的每一個別位置重複在所述預選定多肽鏈的單個位點處用所述非天然編碼胺基酸取代天然編碼胺基酸。61.根據權利要求58所述的方法，其中用相同非天然編碼胺基酸取代。62.根據權利要求58所述的方法，其中用不同非天然編碼胺基酸取代。63.根據權利要求58所述的方法，其中所述預選定多肽鏈中一個以上的位置經非天然編碼胺基酸取代。64.—種選擇用於翻譯後修飾預選定多肽的位置的方法，其包括a)在具有至少一種已知生物活性的預選定多肽中的單個預選定位點處用非天然編碼胺基酸取代天然編碼胺基酸；和b)測量所述包括所述非天然編碼胺基酸的預選定多肽的生物活性；以及c)比較步驟b)的所述預選定多肽與已在所述預選定多肽鏈的不同位置處用非天然編碼胺基酸取代天然編碼胺基酸的預選定多肽或多肽鏈中無取代非天然編碼胺基酸的預選定多肽的生物活性。.65.根據權利要求64所述的方法，其中所述翻譯後修飾為與水溶性聚合物偶合。66.—種包括一種多肽的組合物，所述多肽在所述多肽的一個或一個以上特定胺基酸位置處與核酸分子共價連接，其中所述多肽和核酸分子共價連接至所述多肽的一個或一個以上非天然編碼胺基酸的胺基酸側鏈。全文摘要本發明公開了檢測非天然胺基酸和包含至少一個非天然胺基酸的多肽的方法。自身或作為多肽的一部分的非天然胺基酸可包含多種官能團，包含(但不限於)肟基、羰基和/或羥胺基。本發明還公開了經進一步翻譯後修飾的非天然胺基酸多肽和檢測所述多肽的方法。文檔編號C12P21/06GK101454461SQ200680043001公開日2009年6月10日申請日期2006年11月16日優先權日2005年11月16日發明者安娜-瑪麗亞·A·海斯·普特南,鋒田,苗振偉,英·布徹勒申請人:Ambrx公司