針對人類巨細胞病毒的結合成員的製作方法

2023-09-21 18:28:40

專利名稱：針對人類巨細胞病毒的結合成員的製作方法
技術領域：
本發明涉及結合成員，特別是抗體分子，其中和人類巨細胞病毒(hCMV)的生物學效應。結合成員對於hCMV感染的治療和預防是有用的。
背景技術：
人類巨細胞病毒(hCMV)是一種廣泛分布的病原體，取決於地理和社會經濟的起源，其通常對40-80%的人口建立無症狀的和終生持續性。然而，在免疫受損(免疫減弱)的病人中，如移植接受者和受愛滋病病毒(HIV)感染的個體，和在新生兒中，hCMV感染是發病率和死亡率的主要原因，並且對衛生保健系統造成重大的經濟負擔。hCMV是影響實體器官移植(solid organ transplantation) (SOT)和造血幹細胞移植(SCT) (Razonable和Paya，2003)的結果的最顯著的感染。在移植之後，在約60-70% 的hCMV-血清反應陽性的病人或接受來自血清反應陽性供體的器官移植的病人中產生活性hCMV感染(Razonable和Paya，同前)。如果沒有採取預防措施，患進展性hCMV疾病的風險是20-30%。考慮到以下事實，即2008年在世界範圍內進行了大約26，000例異體SCT(www. cibmtr. org),這種療法的成功和移棺後的發病率和死亡率的降低具有可觀的財政意義。hCMV相關的併發症可以導致每個病人25，000至50，000歐元的額外費用。此外，移植病人中的HCMV感染與移植相關的動脈硬化和加速的移植失敗有關(Streblow 等，2007)。如上所述，hCMV作為圍產期病原體是相關的。每年，大約1%的易患病婦女在妊娠期血清轉化。這些人中大約40%將hCMV遺傳給她們的孩子，導致在美國每年有40，000受感染的新生兒(Kenneson和Cannon，2007)。10-20%受感染的兒童在出生時患有急性症狀。其中高達20%死亡，並且剩餘的兒童典型地患有中度至重度的併發症，包括CNS相關病症，如失明、失聰和智力障礙。除了對受感染的病人和他們的家庭的毀滅性後果之外，那些病人的醫療保健成本也是顯著的，尤其是，如果圍產期感染導致嚴重和永久性的傷殘。目前，五種抗病毒藥劑被批准用於hCMV感染更昔洛韋(Ganciclovir) /繳更昔洛韋(Valganciclovir)、西多福韋(Cidofovir)、勝甲酸(Foscarnet)和福米韋生(Fomivirsen)0所有化合物都涉及劑量依賴性副作用和耐病毒株的進展(Schreiber等，2009)。沒有一種藥物獲得用於兒童或孕婦的許可。此外，靜脈內注射免疫球蛋白製劑(IVIG),例如CytoGam (CSL Behring)和Cytotecf (BiOtest)用於有 hCMV 感染風險
的病人的預防和治療。然而，在移植情況下關於這種治療的好處的不確定性是明顯的(Sokos等，2002 ；Raanani等，2009)。hCMV-特異性細胞毒素T細胞的過繼轉移(adoptivetransfer)已經成功用於造血幹細胞移植病人(Moss和Rickinson, 2005),但是這種治療是極其昂貴的，並將局限於有必要的專業技術的少數移植中心。此外，這種類型的治療只限於對於hCMV呈血清反應陽性的移植接受者。相比之下，已經報導了 IVIG對先天性CMV感染的治療和預防是有效的(Nigro等，2005)。然而，針對hCMV治療的IVIG是從hCMV血清反應陽性的供體分離和純化的，導致效價變化並從而導致在這些製劑中hCMV特異性抗體的批次與批次(batch-to-batch)之間的變化。此外，源於人血液的藥物產品總是帶有人類病原體傳播的風險。結果，期望重組抗體產品，其用於由hCMV感染所引起的疾病的預防和治療，使得hCMV能夠有效中和。hCMV感染的抗體療法的靶標是在hCMV病毒粒的表面表達的蛋白質。hCMV病毒粒包膜的組成非常複雜，雖然已經鑑定了構成包膜的許多結構蛋白，但是仍然不能充分確定。在開發用於治療hCMV的抗體期間，已經鑑定了在表面糖蛋白複合物gp58/l 16( gB或gC_l )、gp 47-52 (gC-II ;gM 和 gN) (Shimamura 等，2006)、gp 86 (gH 或 gC-III) (Urban 等，1996)中的抗原決定簇(antigenic determinants)。迄今為止大多數經鑑定的中和抗體結合到gB蛋白上，已經顯示gB蛋白包括大多數中和表位(Britt等，1990)。gB複合物被合成為130kD的前體，其斷裂成兩個共價連接的分子，名為gp58和gpll6。N端片段(gpll6)包括一個直鏈中和表位，稱為20個胺基酸(胺基酸67-86)的抗原區-2 (AD-2)，其不需要針對抗體調節的生物活性的補體(Meyer等，1990)。gB的gp58部分(moiety)帶有中和區AD-1,其包括74個胺基酸(胺基酸557-630)並且很可能代表構象表位(Ohlin等，1993 ；ffagner等，1992)。 單克隆抗體的出現最初引起多種抗hCMV的中和小鼠單克隆抗體的鑑定。然而，小鼠單克隆抗體不適合用於人類治療，由於人免疫系統將這些蛋白質識別為外來物，結果在非常短的時間段後清除，導致低的或無臨床效果。已經開發了抗hCMV蛋白的嵌合抗體，並且EP664834B (Harris等)描述了稱為gH的嵌合抗體，其靶向hCMV的86kD的糖蛋白；然而，這樣的抗體在臨床使用情況(clinical setting)下沒有成功。將異源骨髓瘤(heteromyelomas)用於產生雜交瘤的技術，已經用於產生識別各種在病毒包膜中發現的hCMV糖蛋白的各種人單克隆抗體。US5，043，281 (Masuho等)描述了中和人單克隆抗體，其識別分子量在130，000至55，000之間的CMV抗原蛋白。US5, 750, 106(Ostberg)描述了識別gH糖蛋白的被稱為SDZ MSL 109的抗CMV的人單克隆抗體、以及用於生產這種抗體的雜交瘤細胞系。已經在第I/II階段臨床試驗中評價了中和病毒的人單克隆抗體之一，SDZ MSL-109對於在免疫受損的病人中由hCMV誘發的視網膜炎，但是由於缺乏效能，沒有繼續進行臨床試驗(Borucki等,2004 !Hamilton等，1997 ;Boeckh等，2001 )。這些試驗失敗的一個可能解釋是hCMV的抗原變異性，hCMV在人類皰疹病毒中是獨特的，因為其抗原可變，並且大多數與包膜抗原反應的人單克隆抗體顯示區域特異性的中和能力。對於gH_特異性人單克隆抗體類來說，尤其如此，如SDZ MSL-109。這種障礙僅能通過使用定向抗hCMV上的表位的單克隆抗體來克服,該表位存在於不同的分離株之間。過去，由於以下事實，即不能獲得用於中和能力的抗體的高通量篩選，因而分離hCMV中和單克隆抗體的進程緩慢。此外,非洲淋巴細胞瘤病毒(Epstein Barr VirusXEBV)永生化(immortalisation)的方法已經多年來頻繁地用於產生永生化的(immortalised)B細胞，其生產關注的抗體。利用抗原特異性選擇(Casali等，1986)來自病人的淋巴結、脾或外周血(Yamaguchi 等，1987 ；Posner 等，1991 ；Raf 等，1988 ；Steenbakkers 等，1993 和1994)，這種技術已經成功用於由不同來源的人類B細胞(如健康對象的外周血)產生分泌抗體的細胞。這項技術用於從CMV血清反應陽性的血液供體中分離的外周血單核細胞的永生化和隨後三種抗體的分離ITC52、ITC63b 和 ITC88 (W0 93/021952A1 )。ITC52 和 ITC63b與由CMV gp58的胺基酸序列557-630構成的CMV的構象AD-I表位是反應性的，並且ITC88對於包括CMV gpl 16的胺基酸序列67-86 (AD-2)的AD-2是反應性的(W0 93/021952A1 )。
Lanzavecchia (WO 04/076677A2)和 Funaro 等(TO 07/068758A I)已經公開了 EBV轉化方法的改進，並且這些方法已經用於產生針對hCMV的抗體。WO 08/084410A2(Lanzavecchia和Macagno)描述了由EBV細胞系1F11、2F4、5A2以及9A11生產的抗體，其中和內皮細胞、上皮細胞、視網膜細胞和樹突細胞的hCMV感染，並定向針對由gpUL130和gpUL131A形成的構象表位。然而，如果成纖維細胞用作感染的靶細胞，來自這些EBV細胞系的抗體不具有任何可檢測的hCMV中和能力。W008/084410A2還提到了 EBV細胞系10C6、5FU6B4和7H3，產生中和成纖維細胞和內皮細胞的hCMV感染的抗體，這些細胞的半最大抑制濃度(IC5tl)範圍在O. 3和2. Oy g/ml之間。描述了由這些EBV系產生的抗體結合到gB的功能表位上。然而，雖然已經從一些上述的EBV細胞系推斷出抗體的重鏈和輕鏈序列，但是對於由公開的序列編碼的重組表達和純化的抗體，這些數據還沒有被確認。來自Lanzavecchia和Macagno的更新的專利申請(WO 10/007463A1)描述了抗體6G4,其結合到由UL128、UL130和UL131A蛋白的組合確定的表位上，並且其中和內皮、視網膜和樹突細胞的hCMV感染。此外,WO 10/007533A1 (Lanzavecchia和Macagno)描述了結合到以下表位上的hCMV中和抗體hCMV UL128蛋白中的表位，由gH、gL、UL128和UL130蛋白形成的表 位，由UL128、UL130和UL131A蛋白形成的表位或由UL130和UL131A蛋白形成的表位。WO 08/071806A1 (Funaro等)描述了抗體26A1，其結合併中和hCMV，但是當用ELISA測試時對於抗原gB或gH都不顯示顯著結合。據報導針對初始(初代)成纖維細胞和內皮細胞兩者的抗體26A1的半最大抑制濃度(IC5tl)在lyg/ml範圍內，並且因此在現有技術中描述的抗體已到達的範圍內。Funaro和同事的進一步的專利申請描述了抗體1F7,其識別gH (WO 09/003975A1)。類似於抗體26A1，正如在WO 08/071806A1中所描述的，據報導初始成纖維細胞和內皮細胞的抗體1F7的半最大抑制濃度(IC5tl)在I μ g/ml的範圍內，因此在現有技術中描述的抗體已到達的範圍內。Funaro和同事的另一個專利申請(WO09/024445A1)描述了抗體 8C10、37B7、8A11 和 10B7，其識別 gB (克隆 8C10、8A11、10B7)的AD-2區域，或與gB或gH不相關的蛋白質(克隆37B7)。如在Funaro和同事的專利申請(WO08/071806A1和WO 09/003975A1)中那樣，W009/024445A1中描述的針對初始成纖維細胞以及內皮細胞兩者的抗體(1( 7、8411、3787)的半最大抑制濃度(1(5(|)也顯示在約1118/1111的範圍內或在約10 μ g/ml或更高的範圍內(8C10)，因此在先前公開的中和hCMV抗體的範圍內。另外的最新專利申請描述了具有類似特點的中和hCMV抗體。例如，WO09/114560A2(01sen)描述了抗體克隆 2F10、2M16、2N9、3C21、3G7、4P12、5P9、9C16，其全部結合至gB的AD-2表位，並且成纖維細胞的hCMV感染的半最大抑制濃度(IC5tl)顯示在I μ g/ml的範圍內。US20090004198 (Nakajima等)披露了對於gB AD-I區域高親合抗體，如果使用I μ g/ml和更高(10 μ g/ml和100 μ g/ml)的濃度，則其具有明顯的pM結合親和力，和成纖維細胞上80%的hCMV中和活性。來自Evec Inc.的最新申請WO 10/114105A1和WO10/114106A1，兩者分別描述了結合至AD-2和AD-I中的不連續表位的抗體。正如在本發明中披露的，我們已經開發了中和hCMV的人類抗體，其對結合到hCMV的gB蛋白具有高親和力。此外，這些抗體在使用廣泛的易受hCMV感染的細胞型(成纖維細胞、內皮、上皮和樹突細胞)的hCMV中和中顯示類似的高效能(IC50在O. 5 μ g/ml以下)，並且不僅在實驗室菌株AD-169中而且在所有迄今為止已測試的臨床分離株中顯示高效能。此外，本文中披露的抗體識別和確定gB蛋白的新的中和表位，其沒有在之前描述過。由於它們高的親和力和效能、和通過如在本文描述的功能性研究中所確定的其新表位結合的特性，本發明的結合成員尤其適合用於人類病人的hCMV感染的醫學治療、預防和/或診斷中。正如在本文中其他部分詳細描述的，結合成員可用於治療各種與CMV感染相關的紊亂。

發明內容
在本文中描述了幾種高效力的gB特異性的中和hCMV的人類抗體，其還識別完全新的hCMV中和表位，並從而與所有其他公知的對於hCMV特異性的抗體相比，通過不同的治療原理起作用。在下文中進一步披露了他們的發現和功能特性。正如在實施例中更詳細描述的，已鑑定了 50種完全人源性hCMV中和抗體。從EBV轉化的源於B細胞(其來自於感染hCMV的供體)的人類外周血中分離它們。如在表19和20中，詳細描述了抗體I至50的⑶R序列。如在表7中，詳細描述了一組抗體I至46的Vh區和\區的組合。在表7和19中涉及的所有的序列也顯示在隨附的序列表中，其形成本公開的一部分。
正如在下文中更詳細描述的，在治療的相應濃度(即IC5tl在1μ g/ml以下)下，根據本發明的結合成員已顯示中和靶細胞的hCMV感染。最有活性的結合成員甚至IC5tl在O. 5 μ g/ml以下,也能中和hCMV。用代表不同gB遺傳型的不同臨床分離株(例如Towne和Altu ;表16)也檢測到了中和能力。本發明的結合成員可以中和hCMV的一種或多種活性。例如，抑制的生物活性可以是預防成纖維細胞、內皮細胞、上皮細胞、視網膜細胞和/或樹突細胞的感染。在體外中和試驗中，利用hCMV的重組菌株AD169 (其表達報告基因螢光素酶)已經證明預防成纖維細胞的感染。一旦感染這種基因修飾的hCMV株，靶細胞對螢光素酶的表達轉為陽性，其能通過在標準發光計中適當的底物轉化來檢測。當首先與重組的螢光素酶陽性病毒株一起孵育，然後接種到初始的人類包皮成纖維細胞(HFF)的單層上時，本發明中描述的結合成員顯示中和hCMV株AD169的感染。隨後進一步孵育，使用發光計檢測到了發光並且測定了相對光單位(RLU)。然後計算中和百分比，其中中和滴定度表示為結合成員的濃度(μ g/ml )，其使得靶細胞的hCMV感染減少50%或100%。結合成員在O. I至
5.O μ g/ml,優選O. I至2. O μ g/ml,更優選從O. 3至I. 3 μ g/ml或更優選從O. I至O. 6 μ g/ml 的濃度下可以使 hCMV 感染減少 50%。在 O. 1、0·5、1·0、1· I、I. 2、I. 3、I. 5 或 2. O μ g/ml的治療相應濃度下，結合成員已經顯示使得hCMV感染減少50%。可以使用其他方法測定hCMV感染性的中和，包括ELISA、FACS、蛋白質印跡法、免疫沉澱反應、和基於蝕斑形成和計數的肉眼觀察。在本文中描述的結合成員顯示不僅在成纖維細胞中中和人類hCMV，而且在內皮、上皮和樹突細胞中也具有相似效能(如在使用初始的包皮成纖維細胞的試驗中、實施例4和在使用人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的試驗中、人ARPE-19視黃醛色素(視網膜色素，retinal pigment)上皮細胞和一次樹突細胞的實驗中所示的,如實施例7所示)。本發明披露了針對hCMV的高親和力結合成員和特異性針對hCMVgB蛋白的高親和力結合成員。本發明的結合成員可以結合具有不超過50nm的Kd,例如不超過25nm、15nm、10nm、5nm、3nm、I. 5nm、lnm、0. 5nm、0. lnm、75pm 或 57pm 的 Kd 的 hCMV gB 蛋白。優選地，結合成員的KD為Inm以下,優選小於O. 5nm,優選小於O. Inm,並且更優選小於75pm。Kd可以由表面細胞質基因組共振測定，例如JBiaeore'*^在本文的實施例5中描述了未和力的Biaeore"8測定。正如在本文中其他部分描述的，表面細胞質基因組共振涉及在流體相中使分析物流過附著在固體載體上的配體,並測定分析物與配體之間的結合速率(ka)和解離速率(kd)。例如可以進行表面細胞質基因組共振，從而使結合成員以流體相流過附著在載體上的gB蛋白。表面細胞質基因組共振數據可以擬合成單價分析物數據模型(monovalentanalyte data model)。親和力可以表示為離解常數(KD)，其由解離速率常數和結合速率常數之比kd/ka計算出，正如使用單價分析物數據模型通過表面細胞質基因組共振測定的。在本文中描述的結合成員顯示結合至hCMV gB蛋白的特異性區域。hCMV gB蛋白的已知表位位於gB菌株AD169 (SEQ ID No:239)的抗原區I (AD-1 ;在胺基酸552-635之間)內和/或抗原區2 (AD-2;在胺基酸67-86之間)內。在本發明中，我們描述了結合到hCMV gB蛋白的兩種新抗原區上的結合成員，即抗原區4 (AD-4 ;在gB株AD169的胺基酸.121-132和344-438之間的不連續區域；SEQ ID No :239)抗原區5CAD-5 ;在gB株AD169的胺基酸133至343之間；SEQ ID No:239)。在初始實驗中，研究了在本文中描述了以下六種結合成員結合至hCMV gB蛋白的特異性區域的能力單克隆重組抗體Ab-04、Ab-ll、Ab-14、Ab-19、Ab-28和Ab-42。尤其是，首先在山;.1(01^競爭實驗(選擇在本領域已知的結合到gB蛋白的AD-I或AD-2表位上的抗hCMV抗體)中研究了這六種結合成員的表位結合特異性。由於本發明的結合成員以高親和力特異性地結合到gB蛋白上，但是不能與AD-I和AD-2特異性抗體競爭與gB的結合，顯然，本發明的結合成員識別gB蛋白的中和表位。通過表達包含胺基酸殘基100至447的gB蛋白的截短型(truncated version) (gB株AD169 ;SEQ IDN0:239)，其一旦在COS細胞中表達就會被本發明的結合成員識別，獲得了對這個研究結果的進一步支持。在HCMV gB的分子模型產生之後(菌株AD169 ;SEQ ID No: 239)，識別了表面暴露的蛋白質區域，並且預測胺基酸殘基121-132和344-438之間的不連續胺基酸序列為能夠結合本發明的結合成員的可能表位。當該預測的表位表達為胺基酸116至132和344至440(gB株AD169 ;SEQ ID NO: 239)時，其與合成的胺基酸連接子(接頭)偶聯，人們發現，這種重組蛋白由本發明的結合成員Ab-ll、Ab-14或Ab-28特異性識別。這個新表位稱為AD-4。因此，本發明的結合成員並不結合到hCMV gB蛋白的AD-I區。此外，本發明的結合成員並不結合到hCMV gB蛋白的AD-2區。相比之下，本發明的結合成員Ab-Ol至Ab_46結合到稱為AD-4 (也稱為區域II (Dom II))的新構象表位，其在胺基酸殘基100至447之間，優選在胺基酸殘基121至438之間。更優選，本發明的結合成員結合至gB株AD169的不連續胺基酸伸長序列(stretches) 116-132 和 344-440 (SEQ ID NO:239)，最優選 gB 株 AD169 中的伸長序列121-132和344-438 (SEQ ID N0:239)。在這點上，依照本發明應當理解由gB株AD169的胺基酸伸長序列121-132和344-438 (SEQ ID NO:239)生成的不連續表位構成了與gB株AD169的胺基酸伸長序列116-132和344-440 (SEQ ID N0:239)相同的表位。由於抗體Ab-Ol至Ab-46都具有結構上相關的⑶R (尤其是相同長度和相關序列的HCDR3)，並且來自於單一供體，這些抗體分子是原始gB反應性克隆最可能的體細胞突變型，並因此預期結合hCMV gB蛋白上相同或非常相似的重疊表位。因此，用重組抗體Ab-11、Ab-14或Ab-28獲得的表位的表徵結果，也預期為本文中披露的所有抗體Ab-Ol至Ab_46的代表。因此本發明涉及結合成員，優選抗體，其結合到由抗體Ab-I I ,Ab-14或Ab-28識別的gB蛋白的構象表位上，並且還涉及與任何抗體Ab-ll、Ab-14或Ab-28競爭結合到由這些抗體識別的gB蛋白的構象表位上的結合成員。因此在第一個實施方式中，本發明的結合成員可以在包含胺基酸116至132或胺基酸121至132的區域結合hCMV gB蛋白，正如由結構模型(實施例9)預測的。本發明的結合成員也可以在包含胺基酸344至440或胺基酸344至438的區域結合hCMV gB蛋白，正如由結構模型(實施例9)預測的。可選地，除了結合胺基酸116至132和/或胺基酸344至440之外，結合成員可以結合hCMV gB胺基酸序列中的側接殘基(flanking residue)或結構上臨近的殘基。按照慣例，殘基編號對應於hCMV gB株AD169 (SEQ ID N0:239)。在進一步的實驗中，還研究了在本文中描述的以下四種結合成員結合到hCMV gB蛋白的特定區域的能力單克隆的重組抗體Ab-47、Ab-48、Ab-49、Ab-50。尤其是，首先在ELISA競爭實驗(實施例8. 3)中然後利用捕獲法ELISA (capture ELISA)(實施例10. 2)研究了這四種結合成員的表位結合特異性。顯然，這四種結合成員識別gB蛋白的進一步的新 中和表位。 在HCMV gB的分子模型(菌株AD169 ;SEQ ID No: 239)產生之後，鑑定了表面暴露的蛋白區域(蛋白結構域)，並且預測胺基酸殘基133至343之間的胺基酸序列為能夠結合本發明的結合成員的可能表位。將這個預測的表位細分並表達為兩個子區域(subdomain):子區域I (胺基酸133-144和251-343)和子區域2 (胺基酸140至255) (gB株AD169 ；SEQID No: 239)。當在捕獲法ELISA中測試時，本發明的結合成員Ab-47、Ab-49或Ab-50識別子區域I。胺基酸134至344的新表位區域(gB株AD169 ;SEQ ID No:239)已被命名為AD-5。因此，本發明的結合成員Ab-47、Ab-48、Ab-49或Ab-50不結合hCMV gB蛋白的AD-I區域。此外，本發明的結合成員不結合hCMV gB蛋白質的AD-2區域。相比之下，本發明的結合成員Ab-47至Ab-50結合至被稱為AD-5 (也稱為區域I (Dom I))的新構象表位，其在gB株AD169的胺基酸殘基133至343之間(SEQ ID NO: 239)。因此本發明涉及結合成員，優選抗體，其結合至由抗體Ab-47、Ab-48 > Ab-49或Ab-50識別的gB蛋白的構象表位，並且還涉及與這四種抗體任一種競爭結合到由這些抗體識別的gB蛋白的構象表位上的結合成員。因此在第二個實施方式中，本發明的結合成員可以在包含胺基酸133至343的區域結合hCMV gB蛋白，正如從結構模型(實施例9)預測的。可選地,除了結合胺基酸133至343之外，結合成員可以結合hCMV gB胺基酸序列中的側接殘基或結構上臨近的殘基。按照慣例，殘基編號對應於hCMV gB株AD169 (SEQ ID NO: 239)。本發明的結合成員可以包括抗體分子，例如具有完全人源的胺基酸序列的抗體分子。結合成員通常包括抗體％和/或八區。作為本發明的一部分，還披露了結合成員的Vh和'區。每一個'區包括互補決定區域(⑶R)和框架區(FR)。抗體的VHg包括三個HCDR區，指定為HCDR1、HCDR2和HCDR3。抗體的\區包括三個LCDR區，指定為LCDR1、LCDR2和LCDR3。Vh或\區的框架包括四個框架區，FWR1、FWR2、FWR3和FWR4，與CDR以下列結構散布FWRl-CDRl-FWR2-CDR2-FWR3-CDR3-FWR4。根據本發明的抗體Vh和\區以及CDR的實施例，列在形成本公開一部分的隨附的序列表中。在下文中和表19中披露了進一步的CDR。在本文中披露的所有的V1^P'序列、⑶R序列XDR組和HCDR組和IXDR組代表本發明的多個方面和實施方式。正如在本文描述的一組CDR (CDR組)」包括CDR1、CDR2和CDR3。因此，一組重鏈CDR指的是HCDR1、HCDR2和HCDR3，一組輕鏈⑶R指的是IXDR1、IXDR2和IXDR3。除非另有說明，「一組⑶R(⑶R組)」包括HCDR和LCDR。典型地，本發明的結合成員是單克隆抗體。本發明的結合成員可以包括非抗體分子中的抗原結合位點，通常由一種或多種⑶R提供，例如在非抗體蛋白質支架(骨架，scaffold)中的一組⑶R，正如在下文中進一步討論的。最初從感染hCMV的供體中分離，並從EBV永生化的B細胞系(稱為SM1、SM3、SM4、SM5、SM6、SM7、SM9、SMlO或SM11)中分離根據本發明的結合成員Ab-Ol至Ab_46。從這九種細胞系能夠鑑定人類抗體的37種不同Vh和62種不同\的編碼序列(表6)。來自每一種細胞系的所有經鑑定的Vh和\編碼序列的組合作為IgH和IgL鏈理論上能夠產生295種不同的抗體。其中，已鑑定了 46種不同的重組抗體，其在使用螢光素酶表達、hCMV實驗室菌株AD-169和初始(初代)人類包皮成纖維細胞的一線生物篩選試驗中(first-line biological screening assay)中和hCMV。發現這些重組抗體中的六種以高效能(IC5tl在
Iμ g/ml以下)中和hCMV，並以15nm以下的Kd (下表13和15)以高的親和力結合gB蛋白。結合成員的可變區的結構和位置可以參考Kabat等和其更新資料來確定。在本文中描述的是一組結合成員，每一種都包括在表19和20中所列舉的⑶R組，其中HCDRl具有 Kabat 殘基 31-35 ；HCDR2 具有 Kabat 殘基 50-65 ；HCDR3 具有 Kabat 殘基 95-102。LCDRl具有 Kabat 殘基 24-34 ;LCDR2 具有 Kabat 殘基 50-56，並且 LCDR3 具有 Kabat 殘基 89-97。Kabat 編號利用網站 http://www. bioinf. orR. uk/abs/abnum/ 來石角定。本發明的第一實施方式的結合成員可以包括如在本文中描述的一種或多種CDR，例如⑶R3，也與可選的⑶Rl和⑶R2以形成一組⑶R。⑶R或⑶R組可以是如本文中描述的抗體Ab-Ol至Ab-46中的任何一種的⑶R或⑶R組，或者也可以是其變異體。結合成員可以包括抗體Ab-Ol至Ab-46任意一種的一組H和/或IXDR，這些抗體在公開的H和/或L CDR組中具有一個或多個胺基酸突變。胺基酸突變是一個胺基酸的替換、缺失(刪除)或插入。基於提供的實施例和披露的序列，可以有，例如多達22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 I 個突變，例如在 H 和 / 或 L CDR 組內的替換。此外，在HCDR3中可以有多達9、8、7、6、5、4、3、2或I個突變，和/或在HCDR2中可以有多達6、5、4、3、2或I個突變，和/或在HCDRl中可以多達3、2或I個突變，和/或在IXDR3中可以有多達6、5、4、3、2或I個突變，和/或在IXDR2和/或LCRDl中可以有I個突變。突變可以是替換，或者與所披露的H和/或L⑶R組相比，H和/或L⑶R可以可選地包括一個胺基酸的插入或缺失。可以在⑶R的任一點進行替換(替代)、插入或缺失。例如，在HCDRl中，替換可以是Kabat殘基31-35任何一個，例如Kabat殘基31、32、34和/或35的任何一個，在HCDR2中替換可以是Kabat殘基50-65的任何一個，例如Kabat殘基50、53、54、58、60、和/或64的任何一個，並且在HCDR3中替換可以是Kabat殘基99-102的任何一個，例如Kabat殘基99-100C、100E、100F和/或100K-102的任何一個。例如，在LCDRl中，替換可以是Kabat殘基24-34的任何一個，例如Kabat殘基26或27，在LCDR2中替換可以是Kabat殘基50-56的任何一個，例如Kabat殘基56，並且在IXDR3中替換可以是Kabat殘基89至97的任何一個，例如任何Kabat殘基89並且在位置95B可以有插入。在分別關於HCDR和IXDR的表20a和20b中可以發現，特定胺基酸突變與抗體Ab-28的序列的詳細信息的對比，例如胺基酸替換或插入。例如，本發明提供針對hCMV的經分離的結合成員，其包括一組⑶R :HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDRl、IXDR2和IXDR3，其中來自以下一組⑶R的⑶R組具有22個以下的胺基酸改
變，其中HCDRl具有胺基酸序列SEQ ID NO:3 ；HCDR2具有胺基酸序列SEQ ID NO:4 ；HCDR3具有胺基酸序列SEQ ID NO:5 ；LCDRl 具有胺基酸序列 SEQ ID NO:93 ； LCDR2具有胺基酸序列SEQ ID NO:94 ;以及LCDR3 具有胺基酸序列 SEQ ID NO:95。例如，根據本發明的結合成員或Vh區，可以包括具有一個或多個下列突變的抗體Ab-28 的 HCDRl 由Gly 替換 Kabat 殘基的 Asp 31 ；由Phe 或 Tyr 替換 Kabat 殘基的 His 32 ；由Ile或Leu替換Kabat殘基的Met 34 ；以及由Asn 替換 Kabat 殘基的 Val 350根據本發明的結合成員或VHg，可以包括具有一個或多個下列突變的抗體Ab-28的 HCDR2 由Ser 或 Cys 替換 Kabat 殘基的 Trp 50 ；由Asn 或 His 替換 Kabat 殘基的 Gln 53 ；由Thr 替換 Kabat 殘基的 Ser 54 ；由Lys、Asn 或 His 替換 Kabat 殘基的 Gly 58 ；由Ala替換Kabat殘基的Gly 60 ；以及由Arg 替換 Kabat 殘基的 Gln 64。根據本發明的結合成員或VHg，可以包括具有一個或多個下列突變的抗體Ab-28的 HCDR3 由Ala 替換 Kabat 殘基的 Thr 99 ；由Met 替換 Kabat 殘基的 Val 100 ；由Thr 替換 Kabat 殘基的 Ser 100A ；由Thr 替換 Kabat 殘基的 Asn 100B ；由Phe 替換 Kabat 殘基的 Ser 100C ；由Met 或 Ala 替換 Kabat 殘基的 Leu 100E ；由Gly 替換 Kabat 殘基的 Ser 100F ；由Tyr 替換 Kabat 殘基的 His 100K ；由Ser 或 Asp 替換 Kabat 殘基的 Asn 100L ；由Val 或 Ile 替換 Kabat 殘基的 Arg 100M ；由Met 替換 Kabat 殘基的 Leu 100N ；
由Gly替換Kabat殘基的Asp 101 ;以及由Val 或 Ile 替換 Kabat 殘基的 Ala 102。 根據本發明的結合成員或\區可以包括抗體Ab-28的LCDRl，其中，Asn替換Kabat殘基的Ser 26，或者Arg替換Kabat殘基的Ser 27。根據本發明的結合成員或Vl區，可以包括其中由Pro替換Kabat殘基的Ser 56的抗體 Ab-28 的 LCDR2。根據本發明的結合成員或'區，可以包括具有一個或多個下列突變的抗體Ab-28的 LCDR3 由Ala 替換 Kabat 殘基的 Gly 89 ；由Trp 替換 Kabat 殘基的 Pro 91 ； 由Ser 替換 Kabat 殘基的 Arg 93 ；由Asp 替換 Kabat 殘基的 Ser 94 ；由Gly 或 Ala 替換 Kabat 殘基的 Ser 95a ；由Ala 插入 Kabat 殘基 95b ；由Tyr替換Kabat殘基的Val 96 ；以及由Val 替換 Kabat 殘基的 Ile 97。因此，本發明的結合成員可以包括IXDR3，其中Kabat殘基95b是Ala或其中Kabat殘基95b缺失。本發明提供包括任何一個抗體Ab-Ol至Ab-46的HCDRl、HCDR2和/或HCDR3的結合成員，和/或任何一個抗體I至46的IXDRl、IXDR2和/或IXDR3，例如在表19或20中顯示的任何抗體Ab-Ol至Ab-46的一組Q)R。例如，本發明的結合成員可以包括一組⑶R :HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDRl、IXDR2和LCDR3，其中:HCDR1 是 SEQ ID NO:8 ;HCDR2 是 SEQ ID NO:9 ;HCDR3 是 SEQ ID NO: 10 ；LCDRl是SEQ ID N0:98 ;LCDR2是SEQ ID N0:99 ;LCDR3是SEQ ID NO: 100，代表抗體Ab_02 的CDR。例如，本發明的結合成員可以包括一組⑶R :HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDRl、IXDR2和LCDR3，其中HCDR1 是SEQ ID NO: 13 ;HCDR2是SEQ ID NO: 14 ;HCDR3是SEQ ID NO: 15 ；LCDRl是 SEQ ID N0:103 ;LCDR2 是 SEQ ID NO: 104 ;LCDR3 是 SEQ ID NO: 105，代表抗體 Ab_04 的CDR。例如，本發明的結合成員可以包括一組⑶R :HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDRl、IXDR2和LCDR3，其中HCDR1 是SEQ ID NO: 18 ;HCDR2是SEQ ID NO: 19 ;HCDR3是SEQ ID NO:20 ；LCDRl是 SEQ ID N0:108 ;LCDR2 是 SEQ ID NO: 109 ;LCDR3 是 SEQ ID NO: 110，代表抗體 Ab-Il 的CDR。例如，本發明的結合成員可以包括一組⑶R :HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDRl、IXDR2和LCDR3，其中HCDR1 是SEQ ID NO:23 ;HCDR2是SEQ ID N0:24 ;HCDR3是SEQ ID NO:25 ；LCDRl是 SEQ ID N0:113 ;LCDR2 是 SEQ ID NO: 114 ;LCDR3 是 SEQ ID NO: 115，代表抗體 Ab_14 的CDR。例如，本發明的結合成員可以包括一組⑶R :HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDRl、IXDR2和LCDR3，其中=HCDRl 是 SEQ ID NO:3 ；HCDR2 是 SEQ ID NO:4 ；HCDR3 是 SEQ ID NO:5 ；LCDRl是 SEQ ID NO: 93 ;LCDR2 是 SEQ ID NO: 94 ;LCDR3 是 SEQ ID 勵:95，代表抗體六13-28的0)1 。
例如，本發明的結合成員可以包括一組CDR HCDR1, HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和 LCDR3，其中=HCDRl 是 SEQ ID NO:28 ；HCDR2 是 SEQ ID NO:29 ；HCDR3 是 SEQ ID NO:30 ；LCDRl 是SEQ IDN0:108 ;LCDR2 是SEQ ID NO: 109 ;LCDR3 是SEQ ID NO: 110，代表抗體Ab_42的 CDR。結合成員可以包括這些抗體之一的一組Vh⑶R。可選地，也可以包括這些抗體之一的一組Vf DR，並且'CDR可以來自與Vh⑶Rs相同的或不同的抗體。本發明也提供了包括任何一種抗體Ab-OI至Ab-46的一組HCDR的Vh區域，和/或包括任何一種抗體Ab-Ol至Ab-46的一組HCDR的 '區。代表性地，雖然下文中進一步討論了 Vh或\區可以單獨用於結合抗原，但是Vh區與\區配對以提供抗體的抗原結合位點。抗體Ab-28的Vh區可以與抗體Ab-28的\區配對，以便形成包含抗體Ab-28VH和\區兩者的抗體抗原結合位點。提供了在本文中披露的其他Vh和\區的類似實施方式。在其他實施方式中，抗體Ab-28VH與除抗體\之外的\ 區配對。本領域充分建立了輕鏈混雜(promiscuity) (Kang等，1991 )。此外,本發明提供了在本文中披露的其他Vh和\區的類似實施方式。因此，包括任何一種抗體I至46的Vh的IgH鏈可以與包括任何一種抗體Ab-Ol至Ab-46的\的IgL鏈配對，以便生成gB特異性結合成員。結合成員可以包括具有一個或多個⑶R的抗體分子，例如在抗體框架內的一組CDR0框架區可以是人胚系基因節段序列。人胚系基因節段序列對於本領域技術人員是已知，並且能夠從例如VBase編譯或IMGT在線資料庫(http: //imgt. cines. fr)中獲得。本發明的結合成員可以是經分離的人抗體分子，其具有包括人胚系框架中的一組HCDR的Vh區，例如IGHV1-2。因此，Vh區框架區FWR1、FWR2和/或FWR3可以包括人胚系基因節段IGHV1-2的框架區。FWR4可以包括選自例如SEQ ID No: 188至191的人胚系J節段的框架區。Vh FffRl的胺基酸序列可以是SEQ ID No: 181。Vh FWR2的胺基酸序列可以是SEQ ID NO: 182。Vh FWR3 的胺基酸序列可以是 SEQ ID NO: 183 或 184。本發明的抗體分子或Vh區可以包括以下組的重鏈框架區FWRl SEQ ID No: 181 ；FWR2SEQ ID No: 182 ；FWR3SEQ ID No: 183 或 184 ;或可以包括具有 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸改變(如替換、插入或缺失)的所述重鏈框架區。而且，本發明的抗體可以包括由至少80%同一於IGHV1-2胚系基因序列的核酸序列編碼的Vh區，優選核酸序列至少90%、95%、96%、97%同一於IGHV1-2胚系基因序列，並且更優選至少98%、99%同一於IGHV1-2胚系基因序列。本發明的抗體的Vh區可以是至少80%同一於由IGHV1-2胚系基因序列編碼的Vh區的胺基酸序列。優選Vh區的胺基酸序列至少90%、95%、96%、97%同一於由IGHV1-2胚系基因序列編碼的胺基酸序列，並且更優選，至少98%,99%同一於由IGHV1-2胚系基因序列編碼的胺基酸序列。通常，結合成員還具有'區，其包括一組IXDR，例如在人胚系框架中，例如IGLV1-51。因此，Vl區框架區可以包括人胚系基因節段IGLV1-51的框架區FWR1、FWR2和/或FWR3。FWR4可以包括人胚系J節段IGLJ2的框架區(SEQ ID NO: 193)。'FWRl的胺基酸序列可以是SEQ ID No: 185。Vl FWR2的胺基酸序列可以是SEQ ID No: 186。'FWR3的胺基酸序列可以是SEQ ID No: 187。
本發明的抗體分子或八區可以包括以下組的輕鏈框架區FWR1 SEQ ID No:185 ；FWR2SEQ ID No:186 ；FWR3SEQ ID No: 187 ;或可以包括具有 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個胺基酸改變(如替換、插入或缺失)的所述組的輕鏈框架區。此外，本發明的抗體可以包括' 區,其由至少80%同一於IGLV1-51胚系基因序列的核酸序列編碼。優選核酸序列至少90%、95%、96%、97%同一於IGLV1-51胚系基因序列，並且更優選至少98%、99%同一於IGLV1-51胚系基因序列。本發明的抗體\區域可以至少80%同一於由IGLV1-51胚系基因序列編碼的\區的胺基酸序列。優選\區的胺基酸序列至少90%、95%、96%、97%同一於由IGLV1-51胚系基因序列編碼的胺基酸序列，並且更優選，至少98%、99%同一於IGLV1-51胚系基因序列編碼的胺基酸序列。例如，本發明的抗體分子可以包括一組重鏈和輕鏈框架區，其中重鏈FWRl是SEQID No:181 ;重鏈 FWR2 是 SEQ ID No: 182 ;重鏈 FWR3 是 SEQ ID No: 183 ;輕鏈 FWRl 是 SEQID No:185 ;輕鏈 FWR2 是 SEQ ID No: 186 ;輕鏈 FWR3 是 SEQ ID No: 187 ;或可以包括具有 10 個以下(例如5個以下的胺基酸改變，例如替換)的所述組的重鏈和輕鏈框架區。根據本發明，最初從三位感染hCMV的供體中分離並從EBV永生化的B細胞系(稱為SM10、SM12、2C2或1G2)中分離結合成員Ab_47至Ab_50。從這四種細胞系中，可以鑑定人類抗體的四種不同的Vh和五種不同的'編碼序列(表12)。來自每種細胞系的所有經鑑定的Vh和\編碼序列的組合作為IgH和IgL鏈理論上能夠產生20種不同的抗體。其中，已鑑定了四種不同的重組抗體，其在使用螢光素酶表達、hCMV實驗室菌株AD-169和初始人類包皮成纖維細胞的一線生物篩選試驗中中和hCMV。發現所有這些重組抗體以高效能中和hCMV (IC5tl 在 O. 6 μ g/ml 以下，下表 14)。結合成員可變區的結構和位置可以參考Kabat等(1991)和其更新資料確定。在本文中描述的是結合成員Ab-46、Ab-47、Ab-48和Ab_50，其每一種包括在表19中列舉的CDR組，其中的⑶R通過Kabat編號系統(Kabat和Wu, 1991)識別並且使用網站http://www.bioinf. orR. uk/abs/abnum/ 確定。本發明的第二實施方式的結合成員可以包括如在本文中描述的一種或多種CDR，例如⑶R3，以及也可選的⑶Rl和⑶R2以形成一組⑶R。⑶R或⑶R組可以是任何一種抗體Ab-47至Ab-50的⑶R或⑶R組，或者可以是在本文中描述的其變異體。結合成員可以包括在公開的H和/或L CDR組中具有一個或多個胺基酸突變的任何一種抗體Ab-47至Ab-50的一組H和/或L⑶R。胺基酸突變是一個胺基酸的替換、缺失或插入。基於提供的實施例和公開的序列，在H和/或L⑶R組內可以有例如多達10、9、8、7、6、5、4、3、2或I個突變。突變可以是替換，或者與公開的H和/或L⑶R組相比，H和/或L⑶R可以可選地包括一個胺基酸的插入或缺失。可以在⑶R中的任一點進行替換、插入或缺失。本發明提供包括任何一種抗體Ab-47至Ab-50的HCDRl、HCDR2和/或HCDR3的結合成員，和/或任何一種抗體Ab-47至Ab-50的IXDRl、IXDR2和/或IXDR3，例如在表19中顯示的任何抗體Ab-47至Ab-50的一組CDR。例如，本發明的結合成員可以包括一組⑶R :HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDRl、IXDR2和LCDR3，其中=HCDRl 是 SEQ ID No:243 ;HCDR2 是 SEQ ID No:244 ;HCDR3 是 SEQ ID No:245 ；LCDRl 是 SEQ ID No:263 ;LCDR2 是 SEQ ID No: 264 ;LCDR3 是 SEQ ID No: 265，代表抗體Ab_47的 CDR。例如，本發明的結合成員可以包括一組⑶R :HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDRl、IXDR2和LCDR3，其中=HCDRl 是 SEQ ID No:248 ;HCDR2 是 SEQ ID No:249 ;HCDR3 是 SEQ ID No:250 ；LCDRl 是 SEQ ID No:268 ;LCDR2 是 SEQ ID No: 269 ;LCDR3 是 SEQ ID No: 270，代表抗體Ab_48的 CDR。例如，本發明的結合成員可以包括一組⑶R :HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDRl、IXDR2和LCDR3，其中=HCDRl 是 SEQ ID NO: 253 ;HCDR2 是 SEQ ID NO: 254 ;HCDR3 是 SEQ ID NO: 255 ；LCDRl 是SEQ ID N0:273 ;LCDR2 是SEQ ID NO: 274 ;LCDR3 是SEQ ID NO: 275，代表抗體Ab_49的 CDR。例如，本發明的結合成員可以包括一組⑶R :HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDRl、IXDR2和LCDR3，其中=HCDRl 是 SEQ ID NO: 258 ;HCDR2 是 SEQ ID NO: 259 ;HCDR3 是 SEQ ID NO: 260 ；LCDRl 是SEQ ID N0:278 ;LCDR2 是SEQ ID NO: 279 ;LCDR3 是SEQ ID NO: 280，代表抗體Ab_50的 CDR。 本發明的結合成員可以是經分離的人抗體分子，其具有包括人胚系框架中的一組HCDR的Vh區，例如IGHV4-39或IGHV4-59。因此，VH區框架區FWR1、FWR2和/或FWR3可以包括人胚系基因節段IGHV4-39或IGHV4-59的框架區。FWR4可以包括選自任意六種重鏈J節段的人胚系J節段的框架區(見Ravetch等，1981 )。Ab-47或Ab-50的Vh區的胺基酸序列，可以包括以下組中的IGHV4-39的重鏈框架g =FffRlSEQ ID No:281,FWR2SEQ ID No: 282, FWR3SEQ ID No: 283，或可以包括具有 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個胺基酸改變(如替換、插入或缺失)的所述組的重鏈框架區。Ab-48或Ab-48VHg的胺基酸序列，可以包括以下組中的IGHV4-59的重鏈框架區FffRlSEQ ID No:284,FWR2SEQ ID No: 285，FWR3SEQID No: 286，或可以包括具有 1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12或13個胺基酸改變(如替換、插入或缺失)的所述組的重鏈框架區。而且，本發明的抗體可以包括由至少75%同一於IGHV4-39或IGHV4-59胚系基因序列的核酸序列編碼的Vh區，優選核酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%同一於IGHV4-39或IGHV4-59胚系基因序列，並且更優選至少98%、99%同一於IGHV4-39或IGHV4-59胚系基因序列。本發明的抗體Vh區可以至少75%同一於由IGHV4-39或IGHV4-59胚系基因序列編碼的Vh區的胺基酸序列。優選，Vh區的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%,97%同一於由IGHV4-39或IGHV4-59胚系基因序列編碼的胺基酸序列，並且更優選至少98%,99%同一於IGHV1-2胚系基因序列編碼的胺基酸序列。本發明的結合成員也可以包括Vl區，其包括人胚系框架中K輕鏈⑶R (kappa輕鏈CDR)，例如IGKV2D-28或IGKV1D-33。因此，\區框架區FWR1、FWR2和/或FWR3可以包括人胚系基因節段IGKV2D-28或IGKV1D-33的框架區。FWR4可以包括選自任何五種Kjf段(kappa J節段)中的人胚系J節段的框架區(參見Hieter等，1982)。Ab-47或Ab_48VL區的胺基酸序列可以包括以下組中的IGKV2D-28的κ輕鏈框架區=FffRlSEQ ID No: 287，FWR2SEQ ID No: 288，FWR3SEQ ID No: 289，或可以包括具有 I 或 2個胺基酸改變(如替換、插入或缺失)的所述組的輕鏈框架區。Ab-49\g的胺基酸序列，可以包括以下組中的IGKV1D-33的輕鏈框架區FWR1SEQID No :290, FWR2SEQ ID No :291, FWR3SEQ ID No: 292，或可以包括具有 1、2、3、4、5、6、7、或8個胺基酸改變(如替換、插入或缺失)的所述組的輕鏈框架區。本發明的結合成員也可以包括'區，其包括人胚系框架中的一組λ輕鏈(lambdalight chain)CDR，例如IGLV1-47。因此，Vl區框架區FWR1、FWR2和/或FWR3可以包括人胚系基因片段IGLV1-47的框架區。FWR4可以包括選自任意四種λ J節段(lambda J segment)的人胚系J節段的框架區(參見Udey和Blomberg 1987 ；Vasicek和Leder, 1990)。Ab_50VL區的胺基酸序列可以包括以下組中的IGLV1-47的λ輕鏈框架區FffRlSEQ ID N0:293，FWR2SEQ ID NO: 294,FWR3SEQ ID NO: 295，或可以包括具有 I 或 2 個胺基酸改變(如替換、插入或缺失)的所述組的輕鏈框架區。
而且，本發明的抗體可以包括由至少90%同一於IGKV2D-28、IGKV1D-33或IGLV1-47胚系基因序列的核酸序列編碼的\區。優選核酸序列至少95%、96%、97%同一於IGKV2D-28、IGKV1D-33或IGLV1-47胚系基因序列，並且更優選至少98%、99%同一於IGKV2D-28、IGKV1D-33或IGLV1-47胚系基因序列。本發明的抗體Vl區，可以至少90%同一於由IGKV2D-28、IGKV1D-33或IGLV1-47胚系基因序列編碼的\區的胺基酸序列。優選Vl區的胺基酸序列至少95%、96%、97%同一於由IGKV2D-28、IGKV1D-33或IGLV1-47胚系基因序列編碼的胺基酸序列，並且更優選至少98%、99%同一於由IGKV2D-28、IGKV1D-33或IGLV1-47胚系基因序列編碼的胺基酸序列。本發明的結合成員可以是一種與以下任何一種結合成員競爭結合hCMV(的結合成員)，其(i)結合hCMV並且(ii)包括結合成員、V1^P/或'區、⑶R，例如在本文中披露的HCDR3 和 / 或 CDR 組。可以在體外測定結合成員之間的競爭，例如，利用結合實驗，如ELISA、表面細胞質基因組共振、和/或通過在一種結合成員上標記特定的報告分子，其能夠在一種或多種其他未標記的結合成員存在下被檢測到，以使之能夠識別結合相同表位或重疊表位的結合成員。本領域技術人員容易獲知這樣的方法，並且在本文中更詳細地描述了這樣的方法(參見實施例)。因此，本發明進一步的方面提供了結合成員，其包括與抗體分子競爭的抗體抗原結合位點，例如包括Vh和/或 '區、⑶R，例如任意一種抗體Ab-Ol至Ab-50的HCDR3或⑶R組的抗體分子，用於結合至hCMV。在進一步的方面中，本發明提供包括編碼結合成員的序列的經分離的核酸，這些結合成員包括根據本發明的Vh區和/或 '區，以及製備包括本發明的Vh區和/或\區的結合成員的方法，及回收它的方法，這些Vh區和/或\區是由所述核酸在致使包括Vh區和/或\區的結合成員產生的條件下編碼的。本發明另外的方面提供編碼任何在本文中披露的Vh CDR或'CDR序列的經分離的核酸。進一步的方面提供一種宿主細胞，其包括本發明的核酸或用本發明的核酸轉染。本發明進一步的方面描述了包括本發明的結合成員的組合物，和在結合、抑制和/或中和hCMV感染的方法中的應用，包括通過療法治療人或動物體的方法。根據本發明的結合成員可以用於治療或診斷的方法中，如治療(其可以包括預防性治療)人或動物體(例如人類病人)的疾病或紊亂的方法中，其包括給予所述人或動物體有效量的本發明的結合成員或本發明的幾種結合成員的組合。根據本發明的可治療的病症包括其中hCMV起作用的任何一種，正如在本文中的其他部分詳細描述的。
在下文中進一步詳細描述了本發明的這些和其他方面。術語為方便在此處指出，在本文中使用的「和/或」視為兩個特定特性或組分(部分)中的每一個與或不與另一個而具體公開。例如，「A和/或B」視為(i)A，(ii)B和(iii)A和B中的每一個的具體公開，就像本文中單獨地給出了每一種(情況)。hCMV人類巨細胞病毒(hCMV)的全長胺基酸序列具有GenBank Acc No. X17403 (人類巨細胞病毒菌株AD169的全部基因組)，並且包括229354個鹼基對序列(Chee等，1990 ；Bankier 等，1991 )。gB gB複合物是CMV病毒粒包膜的一種表面糖蛋白複合物。有大量不同的gB蛋白株gB 株 AD169-SwissProt Acc. No. P06473 (SEQ ID NO:239)。gB 株 Towne-SwissProt Acc. No. P13201 (SEQ ID NO:240)。已知的gB中和區域包括抗原區域-I (AD-1 ;SEQ ID No:239[AD169]的胺基酸552-635)和抗原區域-2 (AD-2 ；SEQ ID No. 239[AD169]的胺基酸67-86)。還存在進一步的抗原區域AD-3 (SEQ ID No. 239 [AD169]的胺基酸783-906)。這個區域位於病毒內部並且不是中和抗體的靶標。結合成員這描述了結合彼此的分子對的一個成員。結合對的成員可以是自然得到的或完全或部分合成製備的。結合對的一個成員可以是，多肽、核酸、碳水化合物、脂類、小分子量化合物、寡核苷酸、寡肽、RNA幹擾(素)(RNAi ;參見Milhavet等，2003)、反義(分子)(參見Opal inska和Mihavet, 2003 )、重組蛋白、抗體或其片段或結合物(軛合物，綴合物)或其融合蛋白。本發明使用的反義(分子)抑制劑或RNAi抑制劑可以包括能夠調控基因表達(例如，能夠向下調節(下調)編碼hCMV gB蛋白的序列的表達)的核酸分子。這樣的核酸分子可以包括，但是不局限於反義分子(antisense molecules)、短幹擾核酸(siNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、微RNA (小RNA，micro RNA)、短髮夾RNA (shRNA)、核酸傳感器分子、異型酶、酶促核酸分子和三聯寡核苷酸以及任何其它核酸分子，其可以用於介導RNA幹擾「RNAi」或以序列特異性方式的基因沉默。分子對的一個成員可以在表面上具有區域或空洞，其結合併因此與特定空間或極性排列的分子對的其他成員互補。結合對類型的實例是抗原-抗體、受體-配體和酶-底物。結合成員通常包含具有結合位點的分子。例如，結合成員可以是抗體分子或包括結合位點的非抗體蛋白質。結合位點可以通過以下手段提供在抗體框架區和/或非抗體蛋白質支架(骨架，scaffolds)(如纖連蛋白或細胞色素B等)上配置⑶R (Haan和Maggos2004 ；Koide等，1998 ；Nygren等，1997),或在蛋白質支架內隨機化或變異環(loop)上的胺基酸殘基，以便賦予對於期望靶標的結合特異性。Nygren等已詳細綜述了用於在蛋白質中工程化設計新結合位點的支架。WO 00/034784A1 (Lipovsek)披露了用於抗體模擬物的蛋白質支架，其中描述了蛋白質(抗體模擬物)包括具有至少一個隨機化的環的纖連蛋白III型區域(結構域)。可以由免疫球蛋白基因總科的任何區域(結構域)成員提供將適宜的支架接枝到一種或多種CDR，例如一組HCDR中。支架可以是人類蛋白質或非人類蛋白質。非抗體蛋白質支架的優勢是，它可以在支架分子中提供抗原結合位點，這些支架分子比至少一些抗體分子小和/或更易於生產。可以賦予小尺寸的結合成員有用的生理特性，如進入細胞，深入組織或在其他結構內到達靶標，或在目標(祀標)抗原的蛋白質空洞內結合的能力。Wess (2004)綜述了使用非抗體蛋白質支架中的抗原結合位點。典型是具有穩定主鏈和一個或多個可變環的蛋白質，其中特定地或隨機地變異一個環或多個環的胺基酸序列以創建結合祀標的抗原結合位點。這樣的蛋白質包括來自金黃色釀膿葡萄球菌(S aureus)、轉鐵蛋白、四連接素、纖連蛋白、脂質運載蛋白(Iipocalin)以及結晶的和其他Affilin 支架(Scil蛋白質)的蛋白A的IgG結合區域。其他方案的實例包括合成的「微體」，其基於具有分子內二硫鍵的環肽-小蛋白、微蛋白(Versabodies , Amunix)和錨蛋白重複蛋白質(DARPins,分子伴侶)。除抗體序列和/或抗原結合位點之外，根據本發明的結合成員可以包括其他氨基 酸，例如形成肽或多肽(如摺疊區)，或賦予分子除結合抗原的能力之外的另外的功能特性。本發明的結合成員可以攜帶可檢測的標記物，或者可以結合(綴合，共軛)於毒素或靶向部分或酶(例如經由肽鍵或連接子(接頭))。例如，結合成員可以包括催化部位(例如在酶區域)以及抗原結合位點，其中抗原結合位點結合到抗原上並因此靶向對抗原的催化部位。催化部位可以抑制抗原的生物功能，例如通過裂解。正如所指出的，雖然可以通過非抗體支架攜帶⑶R，但是用於攜帶本發明的⑶R或一組CDR的結構通常會是抗體的重鏈或輕鏈序列或其實質性部分，其中CDR或CDR組位於對應於自然發生由重排的免疫球蛋白基因編碼的Vh和\抗體可變區的CDR或CDR組的位置。免疫球蛋白可變區的結構和位置可以參考Kabat和Wu (1991)和其更新資料確定。大量學術和商業在線資源可用來查詢這個資料庫。例如，參見Martin (1996)和相關的在線資源，目前在 http: //www. bioinf. orR. uk/abs/simkab. html 的網址上。通過⑶R區域或⑶R，用來表示由Kabat等(同上)定義的免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的高可變區。抗體典型地包括3個重鏈⑶R，稱為HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及3個輕鏈⑶R,稱為IXDR1、IXDR2和IXDR3。在此處使用術語⑶R或多個⑶R是為了表示這些區域中的一個或幾個、乃至全部，這些區域包括負責通過抗體針對抗原或其識別的表位的親和力結合的大多數胺基酸殘基。在六個⑶R序列中，重鏈的第三個⑶R (HCDR3)具有最大的變異性，即更大的多樣性，本質上由於本領域公知的機制，如胚系免疫球蛋白重鏈基因座的V、D和J基因節段的V(D)J重排。HCDR3可以短至兩個胺基酸或長至26個胺基酸，或可以具有這兩個極端值之間的任意長度。⑶R長度也可以隨由特定的基礎框架(underlying framework)能夠容納的長度而變化。功能上，HCDR3能夠在抗體特異性的測定中發揮重要作用(Segal等，1974 ；Amit等，1986 ；Chothia 等，1987,1989 ；Caton 等，1990 ；Sharon, 1990a ；Sharon, 1990b ；Kabat 等，1991)。在本發明的結合成員Ab-Ol至Ab-46中，正如在表20a和20b中表明的，HCDRl可以是5個胺基酸長，包括Kabat殘基31-35。HCDR2可以是17個胺基酸長，包括Kabat殘基50-65。HCDR3可以是22個胺基酸長，包括Kabat殘基95-102。LCDRl可以是13個胺基酸長,包括Kabat殘基24-34。LCDR2可以是7個胺基酸長，包括Kabat殘基50-56。LCDR3可以是10個胺基酸長，包括Kabat殘基89-97。在本發明的結合成員Ab-47至Ab-50中，HCDRl可以是7或5個胺基酸長，分別包括Kabat殘基31-37或31-35。HCDR2可以是16個胺基酸長，而HCDR3可以是10、15、17或22個胺基酸長。IXDRl可以是11個胺基酸長，包括Kabat殘基24-34 ;或13個胺基酸長，包括Kabat殘基23-35 ;或16個胺基酸長，包括Kabat殘基24_39。LCDR2可以是7個胺基酸長，而LCDR3可以是9個胺基酸長。抗體分子這描述了不論是自然地還是部分地或完全合成製備的免疫球蛋白。該術語也覆蓋了包括抗體抗原結合位點的任意多肽或蛋白質。在此必須理解，本發明不涉及天然形態的抗體，也就是說，它們不在其自然環境中，但是它們已能通過從自然資源中的純化而分 離或獲得，否則通過遺傳重組獲得，或通過化學合成獲得，然後它們能夠包括非天然的胺基酸。包括抗體抗原結合位點的抗體片段包括，但是不局限於，諸如Fab、Fab』、F(ab』)2、Fab ' -SH、scFv、Fv、dAb和Fd的分子。已工程化設計出了包括一個或多個抗體抗原結合位點的各種其他抗體分子，包括例如Fab2、Fab3、二聚抗體(雙抗體，diabodies)、三聚抗體(triabodies)、四聚抗體(tetrabodies)和微型抗體(minibodies),以及雙特異性(bispecific)抗體和三特異性(trispecific)抗體。在 Hollilnger 和 Hudson (2005)中描述了抗體分子和用於構建它們的方法以及它們的應用。採用單克隆抗體和其他抗體以及使用重組DNA技術以產生結合目標抗原的其他抗體或嵌合分子是可能的。這樣的技術可能涉及向不同的免疫球蛋白的恆定區或恆定區加框架區引入編碼免疫球蛋白可變區或抗體的⑶R的DNA。例如，參見EP0184187A(Kudo等)或EP0239400A(Winter)。生產抗體的雜交瘤或其他細胞可以經受基因突變或其他改變，其可以改變或可以不改變產生的抗體的結合特異性。由於抗體能夠以大量方法修飾，術語「抗體分子」應當解釋為覆蓋任意結合成員或帶有抗體抗原結合位點(對抗原具有期望的特異性和/或結合)的物質。因此，該術語覆蓋雙特異性或三特異性抗體以及抗體片段和衍生物，包括任何多肽，其包含抗體抗原結合位點，無論是天然的還是完全或部分合成的。因此包括融合到另外的多肽(例如來源於另外的物種或屬於另外的抗體類或子類)上的包含抗體抗原結合位點或等價物的嵌合分子。例如EP0120694A (Boss等)和EP0125023A (Cabilly等)描述了嵌合抗體的克隆和表達。在抗體工程化領域中可用的進一步的技術使分離人類和人化抗體成為可能。例如，正如Kontermann和Dubel (2001)描述的，能夠製備人類雜交瘤。在許多出版物，如Kontermann和Dubel (同上)和WO 92/01047A1 (McCafferty等)中已經詳細描述了用於產生結合成員的另一種已創建的技術，噬菌體顯示。可以使用以下轉基因小鼠分離人類抗體(其中使轉基因小鼠的小鼠抗體基因失活，並且用人類抗體基因功能性取代，同時保持小鼠免疫系統的其他組分完整XMendez等，
1997)。可替代地，由Grawunder和Melchers (W0 03/068819A1)所描述的方法可以用於產生基因修飾的脊椎動物前體淋巴細胞以產生異源抗體或結合蛋白質。使用本領域公知的技術可以產生人化抗體，如在例如WO 91/09967A1 (Adair等)中披露的那些。而且，WO04/006955A1 (Foote)描述了用於人化抗體的方法，基於通過以下(操作)從人抗體基因中選擇可變區框架序列，即這些人抗體基因通過將針對非人類抗體的可變區的CDR序列的規範(canonical)CDR結構類型,例如胚系抗體基因節段與來自人抗體序列文庫的相應CDR的規範CDR結構類型進行比較。具有與非人類CDR相似的規範CDR結構類型的人抗體可變區形成從其中選擇人類框架序列的人抗體序列成員的子組(subset)。子組成員可以通過人和非人類⑶R序列之間的胺基酸相似性進一步排列。在WO 04/006955A1 (同上)的方法中，選擇排名最前的人類序列以提供框架序列，用於構建嵌合抗體，其使用選定的人類框架子組成員，用非人類CDR對應物功能性替代CDR序列，從而在不需要比較非人類和人類抗體的框架序列的情況下，提供高親和力和低免疫性的人化抗體。還披露了根據該方法製備的嵌合抗體。已顯示全抗體的片段能夠進行結合抗原的功能。結合片段的實例是(i)包括'、VH、Cl和ChI區的Fab片段；(ii )包括Vh和ChI區的Fd片段；(iii )包括單個抗體的Vl和Vh 區的 Fv 片段；(iv) dAb 片段(Ward 等 1989 ；McCafferty 等，1990 ；Holt 等，2003),其包括Vh或 ' 區；(V)經分離的⑶R區域；(vi)F(ab' )2片段，包括二個連接的Fab片段的二價片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv),其中Vh區和\區通過肽連接子(連接肽，linker)連 接，該肽連接子允許兩個區域締合以形成抗原結合位點(Bird等，1998 ；Huston等，1988)；(viii)雙特異性單鏈Fv 二聚體(W093/011161A1 (Whitlow等))和(ix) 「二聚抗體(雙抗體，雙體)」，由基因融合構建的多價或多特異性片段(Holliger等1993和WO 94/13804A1)。可以通過二硫橋的合併連接Vh和\區穩定Fv、scFv或二聚抗體(雙抗體)分子(Reiter等，1996)。也可以製備包括scFv與Ch3區連接的微型抗體(Hu等，1996)。結合片段的其他實例是Fab』，其通過在重鏈ChI區(包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸)的羧基末端添加幾個殘基而不同於Fab片段，以及Fab』 _SH，其為一種Fab』片段，其中恆定區的半胱氨酸殘基(多個半胱氨酸殘基)含有游離巰基。也已描述了抗體分子，其包括僅二個由框架區連接的⑶R (Qui等，2007)。利用通過選定的⑶Rl或⑶R2的C末端經由框架區與⑶R3的N末端連接的鍵接將來自Vh或 '區的⑶R3連接到其他區域的⑶Rl或⑶R2環上。區域抗體(結構域抗體，domain antibody) (dAb)是抗體的一種小型單體抗原結合片段，即抗體重鏈可變區或輕鏈可變區(Holt等，2003)。Vh dAb自然發生(出現)在駱駝科動物(camelid)(例如駱駝、美洲駝羊(llama))中，並且可以通過用目標抗原使駱駝科動物免疫、分離抗原特異性B細胞並直接從個別B細胞中克隆dAb基因而產生；然而，也能夠在細胞培養物中產生dAb。本發明的結合成員可以是dAb，其包括基本上如在本文中給出的Vh或V區或包括基本上如本文中給出的一組⑶R的Vh或 '區。以任意一種抗體Ab-Ol至Ab-50起始,通過如酶消化(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通過化學還原裂解二硫橋的方法能夠獲得本發明的抗體片段。在另外的方式中，通過本領域技術人員公知的基因重組技術或者通過肽合成或通過核酸合成和表達能夠獲得包括在本發明中的抗體片段。根據本發明的功能抗體片段包括其半衰期通過化學修飾，尤其是PEG化，或例如通過在脂質體中合併，而增加的任意功能片段。雙特異性或雙功能的抗體形成兩種不同的可變區合併在同一種分子(Hoi Iiger和Bohlen，1999)中的第二代單克隆抗體。因此，雙特異性抗體可以具有由可變區編碼的兩種不同的結合特異性，從而結合到單一或多種目標抗原的兩個不同表位上。從它們對於募集(recruit)新效應器的功能或對於靶向腫瘤細胞表面上的幾種分子的能力已證明其在診斷領域和在治療領域的應用。例如，可以用另外的細胞毒機制裝配(arm)抗體，如放射性同位素、細菌毒素、炎症細胞因子、化療藥(chemotherapuetics)或前藥。在使用雙特異性抗體的情況下，這些可以是常規的雙特異性抗體，其可以用各種方法(Holliger和Winter，1993)製備。雙特異性抗體的實例包括:BiTF/技術(Micromet, Inc)中的那些，其中可以使用具有不同特異性的兩種抗體的結合區域，並直接經由短的柔性肽鍵連接。這在短的單個多肽鏈上組合兩個抗體。在沒有Fe區域而僅使用可變區的情況下能夠構建二聚抗體(雙抗體)和scFv，潛在地降低抗個體遺傳型反應的效應。能夠使雙特異性抗體構建成為整個IgG、成為細胞雜交瘤(quadroma)(雙重特異性抗原結合片段(Fab)加Fe Y )、成為雙特異性F(ab』)2、成為Fab』 PEG、成為異源二聚Fab、成為二聚抗體(雙抗體)或成為雙特異性或異源二聚體scFv (在Kufer等的綜述中，2004)。而且，可以使用本領域公知的常規方法連接兩種雙特異性抗體以形成四價抗體。與雙特異性全抗體相反，雙特異性二聚抗體也可以是特別有用的，因為能夠在大腸桿菌中容易地構建和表達它們。 最新關於多特異性抗體的研究已經指向開發混合抗體，其中由單一克隆細胞產生三到五種重組人單克隆抗體。組分抗體共享同一個免疫球蛋白輕鏈可變區，以便確保與混合物中的抗體種類有關的所有結合位點是功能性的(Oligoclonics ；MerusBiopharmaceuticals BV ；W0 04/106375A I)。組分抗體可以包括不同的形式，如全IgG或Fab片段或抗體的全長免疫球蛋白和片段的混合物。選擇針對超級生物活性(如在病毒中和中提高的潛能、對細胞因子和趨化因子的改進的中和和去除、增強的殺死腫瘤細胞和預防逃逸以及改進的防護病毒的呼吸)的組分抗體。可利用本領域的各種方法以獲得抗hCMV的抗體。抗體可以是單克隆抗體，尤其是人源的，其能根據本領域技術人員公知的標準方法獲得。通常，對於單克隆抗體或它們的功能片段的製備，特別是源於小鼠的，可能涉及在手冊「Antibodies」 (Harlow和Lane, 1988)中特別描述的技術或涉及由Kohler和Milstein (1975)描述的由雜交瘤的製備技術。可以從以下來源獲得單克隆抗體，例如，動物或人類免疫的抗hCMV的B細胞中或一種例如包括由所述單克隆抗體識別的表位的gB的片段。在本文中描述了適宜的片段和肽或包括它們的多肽，並且它們可以用於使動物免疫以產生抗hCMV的抗體。根據通常的操作方法可以產生hCMV抗體或它的一種片段，這些方法通過以包含在cDNA序列中用於編碼hCMV或其片段的核酸序列為起始的基因重組、和/或以包含在hCMV的肽序列和/或其片段中的胺基酸序列為起始的肽合成來產生。例如，可以在親和柱上純化單克隆抗體，在該親和柱上已經預先固定了 hCMV蛋白或包含由所述單克隆抗體識別的表位的其組分蛋白中的一種。更特別的是，可以通過以下方法純化單克隆抗體，即蛋白A和/或蛋白G的色譜法，接著進行或不進行旨在消除自身的殘餘蛋白汙染物以及DNA和LPS的離子交換色譜法，接著進行或不進行瓊脂糖凝膠上的排阻色譜法以便消除由於二聚體或其他多聚體存在的潛在聚集。可以同時或順次地使用任何的這些技術。抗原結合位點這描述了結合到並且互補於目標抗原的全部或部分的分子的一部分。在抗體分子中，其稱為抗體抗原結合位點，並且包括結合到並且互補於目標抗原的全部或部分的抗體的一部分。當抗原較大的情況下，抗體可以僅結合到抗原的特定部分，該部分稱為表位。抗體抗原結合位點可以由一種或多種抗體的可變區提供。抗體抗原結合位點可以包括抗體輕鏈可變區(\)和抗體重鏈可變區(VH)。抗原結合位點可以在從CDR的自然部位分離的抗體分子的區域被工程化，例如在Vh或\區的框架區，或者例如，在抗體恆定區中，但不局限於ChI和/或Ch3。在結構區被工程化的抗原結合位點可以增加或代替由V1^P'區的CDR組形成的抗原結合位點。當在抗體分子中存在多個抗原結合位點的情況下，它們可以結合hCMV上的相同抗原區域，例如，從而提高結合成員的化合價進而提高其親和力。可替換地，多個抗原結合位點可以結合hCMV上不同的抗原和/或一個或多個其他抗原，這可以用於增加效應器功能，延長半衰期或改善抗體分子的體內遞送。分離這是指一種狀態，在該狀態下本發明的結合成員或編碼這些結合成員的核酸通常 會符合本發明。因此，結合成員、V1^P /或' 區和編碼核酸分子，以及根據本發明的載體(vector)可以通過分離和/或純化提供，例如從它們的自然環境中，以基本純的或均質形式，或在核酸的情況下，游離的或基本上游離的核酸或源基因，而不是編碼具有所需功能的多肽的序列。分離的成員和分離的核酸對於它們自然相關的物質將是游離的或基本游離的，如其他多肽或核酸對於發現它們的自然環境，或當在體外或在體內通過重組DNA技術進行這種製備時，對於製備它們的環境。可以與稀釋劑或佐劑一起配製成員和核酸，並且還為了實際的分離目的，例如成員會通常與明膠或其他載體一起混合，如果用於在免疫測定中塗覆微滴定板，或者在用於診斷或治療時與藥用載體或稀釋劑一起混合。結合成員可以自然地或通過異源真核細胞的系統(例如CHO或NSO細胞)糖基化，或它們可以是非糖基化的，例如，如果它們在原核細胞中通過表達而產生。包括抗hCMV抗體分子的異種製劑(異源製劑)也成為本發明的一部分。例如，這樣的製劑可以是具有全長重鏈和缺少C末端賴氨酸的重鏈的抗體的混合物，這些抗體帶有不同程度的糖基化和/或帶有衍生的胺基酸，如N末端穀氨酸的環化以形成焦穀氨酸殘基。如在本文使用的，短語「基本上如給出的」指的是在本文中描述的結合成員的Vh或Vl區的相關CDR的特性將與在本文中給出的序列的特定區域相同或高度類似。正如在本文中描述的，短語「高度類似」於一種或多種可變區的特定區域，預期在CDR和/或VH或VL區可以發生從I至約5個，例如從I至4個，包括I至3個，或1、2、3或4個胺基酸替換。


圖I.該圖顯示gB蛋白的示意圖(菌株AD169 ;SEQ ID No:239)，表明已知的抗原區域AD-l、AD-2和AD-3的位置(Ohlin等1993 ;Wagner等，1992)。在胺基酸460處有斷裂位點，和將這兩部分連接在一起的二硫鍵，如用括號所示的。Signal (信號)信號序列(胺基酸1-22)，TM :跨膜區(胺基酸751-771)。圖2.該圖顯示通過製備性螢光激活細胞分選(FACS)富集的gB特異性的記憶B細胞。為了分離gB特異性、IgG陽性的記憶B細胞，抗⑶20MACS富集的(MACS=磁激活細胞分選)B細胞由下列抗體染色a、抗人類⑶19 (B細胞標記物)；b、抗人類⑶27 (記憶B細胞標記物)；c、抗人類IgG。另外，與用螢光色素標記的重組糖蛋白B—起孵育B細胞。將⑶19+/⑶27+/IgG+/gB+反應性B細胞分選到經照射的飼養細胞上，並且如在實施例I中描述的建立產生抗體的細胞系。圖3. HCMV gB的區域構造(domain architecture)。代表各單獨區域的各個區域以不同的顏色深淺顯示，並且給出了起始殘基的編號。括號表明二硫鍵。Signal (信號)信號序列，TM:跨膜區域。·圖4.抗hCMV抗體和Ab-50之間的ELISA競爭。圖4a顯示與抗體Ab_47、Ab_48、Ab-49和C23 (gB特異性對照抗體)競爭的Ab-50。檢測到了針對Ab_50相對於Ab_47和Ab-49結合到gB蛋白上的競爭，但對於Ab-48 (或C23對照抗體)沒有(檢測到)。圖4b顯示了 Ab-50與抗體ITC52、ITC88、89-104和89-109的競爭。在Ab_50和任何的這些測試的抗體之間沒有檢測到結合競爭。橫跨在圖4a和4b上部的虛線表示Ab-50的濃度為O. 5ng/孔。圖5.人血清中抗gB和gB片段的抗體效價。從HCMV血清反應陽性的個體中隨機選取八十種血清，用ELISA分析抗重組gB和抗原區域I (AD-1)、2 (AD-2),4 (AD-4/DomII)和5 (AD-5/Dom I)的反應性。水平線代表切斷個體抗原。圖6.該圖顯示抗不同的抗原區域的抗體效價(由ELISA測定)和50%中和效價之間的關係° r :Spearman 等級相關係數(Spearman rank correlation coefficient)。圖7.親和純化的抗AD-4多克隆抗體的特異性和中和能力。a)分別用gB、AD-U AD-2和AD_4塗覆ELISA板，並用各種抗體測試。E3 :親和純化的G免疫球蛋白片段；Pre (純化前)親和純化之前的血清池；Post (純化後)親和純化之後的血清池；C23 :人類AD-2特異性單克隆抗體；89-104 :人類抗AD-I特異性單克隆抗體；抗GST :針對GST特異性的小鼠單克隆抗體。b)使用血清池、人單克隆抗體C23和親和純化的AD-4特異性IgG片段(E3)的中和試驗。圖8.該圖顯示AD-4和突變蛋白的胺基酸序列。在最上面的橫排(lane)顯示了用於哺乳動物細胞表達的AD-4的胺基酸序列。橫排A-Q中表示交換丙氨酸的殘基。虛線表示與野生型序列相同。圖9.由人單克隆抗體(Ab-28、Ab-IU Ab-14)識別的AD-4和AD-4突變蛋白和來自hCMV血清反應陽性的供體的親和純化IgG。ELISA板塗覆以表明的AD-4融合蛋白，並用於分析人單克隆抗體的結合(Ab-28、Ab-11、Ab-14 ;圖9a)或親和純化的IgG片段(E3 ;圖%)。抗GST抗體用於控制抗原的塗覆效率。圖10.人血清對AD-4突變體的識別。在ELISA中測試血清板(80個樣品)抗GST 融合蛋白，分別包括 AD-4 或突變型肽 AD-4G (K378K379)、AD-4H (Q380E381)、AD-4E(E359D362)、AD-41 (N383S385)和 AD-4L (N405T406)。對於每一種血清，計算最高和最低的OD值之間的比率並繪製成倍數差。虛線代表所有血清樣品的平均差。圖11.該圖顯示gB蛋白抗原區域和子區域識別抗體的捕獲法ELISA測定結果。與對照組(pcUL132SigHA)、AD-4+AD-5、AD-5 的子區域 I (AD-5-S1)或 AD-5 的子區域 2(AD-5-S2)—起轉染293T細胞。抗體Ab_47至Ab_50用於檢測。通過間接免疫螢光檢測結果O
圖12.使用中和抗體Ab-28和不同的人血清的競爭中和試驗。圖左側的數據代表三份應用恆定濃度為約其50%的中和活性的不同hCMV陽性血清和hCMV陰性血清(在X軸上)。圖右側的曲線代表用hCMV陽性或hMCV陰性血清滴定的Ab-28的組合，該血清加入的恆定濃度與由圖左側的數據代表的濃度相同。所有曲線反映了僅Ab-28的IgG濃度，而不加血清的恆定IgG濃度。以一式三份分析所有樣品。圖例· hCMV陰性血清的恆定濃度；▲ hCMV陽性血清的恆定濃度^hitrateek (標準人免疫球蛋白)的恆定濃度；〇用恆定濃度的hCMV陰性血清滴定Ab-28 ;▽用恆定濃度的hCMV陽性血清滴定Ab_28 ; □用恆定濃度的Intratect (標準人免疫球蛋白)滴定Ab_28 ; 單獨滴定Ab_28。圖13.使用Ab-02、Ab-04和Ab_28的吸附後試驗。允許hCMV病毒在4°C下吸附但不穿入人包皮成纖維細胞內，持續I小時，然後加入抗體Ab-02、Ab-04或Ab-28並使其在4°C下孵育30、80或120分鐘的期間。一式三份對每種抗體配製1:2的系列稀釋液，從150至5 μ g/ml。C23 (AD-2特異性抗體)用作抑制病毒穿入細胞的對照抗體。x軸顯示IgG濃度(μ g/ml)而y軸顯示％中和。圖例· 30分鐘的孵育期；■ 80分鐘的孵育期；▲ 120分 鐘的孵育期。圖14. AD-I和AD-2特異性抗體與Ab_28之間的代表性競爭中和試驗。如圖12a和12b所示，分別在Ab-28不存在(·)或存在(■)下滴定ITC52 (AD-1特異性抗體)或ITC88(AD-2特異性抗體)。向恆定濃度為O. 5 μ g/ml (▲)的滴定抗體中加入Ab_28。圖12c顯示，在ITC88不存在(·)或存在(■)下滴定ITC52，向恆定濃度為3 μ g/ml (▲)的滴定抗體中加入ITC88。所有結果代表三次分析。圖15. AD-4特異性抗體與AD-5特異性抗體之間的競爭中和試驗。對於此試驗，使用一種代表性AD-4- (Dom II)特異性抗體(Ab_28)和兩種代表性AD-5- (Dom I)特異性抗體(Ab-49和Ab-50)。x軸顯示IgG濃度(μ g/ml)而y軸顯示％_中和。圖例·單獨的AD-5抗體(Ab-49或Ab-50) ;▲單獨的AD-4抗體；■ AD-5和AD-4的混合抗體。當在第一孔中施加的每一種抗體為I. 5 μ g/ml時,混合物的起始濃度為3 μ g/ml。
具體實施例方式正如上文所提到的，根據本發明的結合成員調控並且可以中和hCMV的生物活性。高效能結合成員可以從初始篩選，例如生物hCMV中和試驗中直接獲得。本文中的其他部分更詳細地描述了試驗和效能。非洲淋巴細胞瘤病毒(eb病毒，Epstein-Barr virus) (EBV)轉化是永生化哺乳動物細胞的一種可靠方法，並且已經開發了多種EBV轉化方案(Rosen等，1997 ；Steinitz等，1997 ；Steinitz 等，1980 ；Kozbor 和 Roder, 1981 ；Lundgren 等，1983 ；Rosen 等，1983 ；Steinitz 等，1984 ；Lanzavecchia, 1985 ；Bernasconi 等，2001 ; Jung 等，2002 ；Traggiai 等，2004)。該技術最常用於從充當DNA和蛋白質分離的永久性來源的人類淋巴細胞中獲得細胞系，並且已經發現在臨床試驗中作為產生用於遺傳型的病人DNA的永久來源的主要方法而廣泛應用。EBV是一種皰疹病毒，並且其基因組由已經完全測序的172kb的線性雙鏈DNA構成。廣泛研究了 EBV分子生物學和發病機理，並且已知了許多關鍵EBV和宿主細胞基因在致病機理中的作用。EBV僅感染特定的哺乳動物上皮細胞和B淋巴細胞。通過激活大量細胞周期調節基因以及包括免疫球蛋白基因的B細胞特異性基因，在體外EBV永生化B細胞。然後能夠選擇生長的克隆分泌特異性抗體用於分析。然後，關注的抗體能夠通過傳統方法克隆和測定它們的序列。可以以分離的形式提供帶有所述選定的結合成員的胺基酸序列的抗體Vh可變區，也可以(提供)包括這樣的Vh區的結合成員。可以進一步測試結合hCMV的能力，以及與例如本發明任何一種抗體分子Ab-Ol至Ab-50競爭結合hCMV的能力(例如以scFv形式和/或IgG形式，例如IgG1X可以測試中和hCMV的能力，正如在本文中其他部分進一步討論的。能在適當的條件下比較不同的結合成員的結合親和力和中和效能。本發明的Vh和\區以及⑶R的變異體，包括那些在本文中給出的和在本發明的結合成員中能夠採用的胺基酸序列，可以通過序列改變或突變和篩選具有期望特性的抗原結合成員的方法獲得。期望特性的實施例包括但不限於·相對於針對抗原是特異性的已知抗體對抗原提高的結合親和力·如果活性已知，則相對於針對抗原是特異性的已知抗體提高的中和抗原的活性·以特定摩爾比，具有已知抗體或配體對抗原的特定競爭活性·
·對於免疫沉澱複合物的能力·結合到特定表位(如鏈狀表位，例如使用篩選的鏈狀肽和/或由不連續的殘基形成的限定構象(constrained conformation)或構象表位的肽)的能力·介導hCMV的新生物活性或下遊分子的能力。在本文中也提供了這樣的方法。由Vh區和'區組成的抗體抗原結合位點典型地由六個多肽環形成三個來自輕鏈可變區(')，三個來自重鏈可變區(VH)。對已知原子結構的抗體分析已經闡明了序列和抗體組合位點的三維結構之間的關係。這些關係意味著，除了在Vh區的第三區域(環)之外，結合位點環具有少量的主鏈構象或規範結構(極限結構，canonical structure)之一。已經證明在特定的環中形成的規範結構是由其大小和在環和框架區兩者的關鍵位點處的某些殘基的存在決定的(Chothia等，1992 ;Al_Lazikani等，1997)。序列-結構關係的這種研究可以用於已知序列的抗體中那些殘基的預測，但不是未知的三維結構，其在保持其CDR環的三維結構並因此保持結合特異性中是重要的。在結構方法中，可以使用任意可自由得到的或商業程序包(如WAM) (Whitelegg和Rees, 2000)創建抗體分子的模型(Chothia等，1986)。蛋白質可視化和分析軟體包，如Insight II(Accelrys, Inc.),或 Deep View (Guex 和 Peitsch, 1997)可以然後用於在 CDR 的每個位置評估可能的替代。該信息可以然後用於使可能對活性有最小的或有益的影響的替代發生。在CDR的胺基酸序列、抗體Vh或\區和結合成員中發生替代的所需技術通常在本領域是可得到的。可以利用替換產生變異序列，這些替換能夠預測或不能夠預測對活性具有最小或有益的影響，或測試結合和/或中和hCMV的能力和/或任何其他期望的性質。正如討論的，根據本發明可以採用任何Vh和\區(其序列在本文中明確披露)的可變區胺基酸序列變異體。本發明進一步的方面是一種抗體分子，其包括與在隨附的序列表中顯示的任意一種抗體Ab-Ol至Ab-50的Vh區具有至少60、70、80、85、90、95、98或99%胺基酸序列同一性的Vh區，和/或包括與在隨附的序列表中顯示的任意一種抗體Ab-Ol至Ab-50的\區具有至少60、70、80、85、90、95、98或99%胺基酸序列同一性的\區。可以用於計算兩種胺基酸序列的 ％ 同一性的算法包括，例如 BLAST (Altschul 等，1990),FASTA (Pearson 和 Lipman,
1998),或Smith-Waterman算法(Smith和Waterman, 1981),例如採用默認參數。特定變異體可以包括一個或多個胺基酸序列改變(胺基酸殘基的添加(增加)、缺失(刪除)、替換和/或插入)。改變可以發生在一個或多個框架區和/或一種或多種CDR中。改變通常不導致功能的喪失，因此包括如此改變的胺基酸序列的結合成員可以保持結合和/或中和hCMV的能力。它可以保持與沒有發生改變的結合成員(例如在本文中描述的試驗中測定的)等量的結合和/或中和能力。包括如此改變的胺基酸序列的結合成員可以具有改善的結合和/或中和hCMV感染性的能力。改變可以包括用非自然產生的或非標準胺基酸替換一個或多個胺基酸殘基，將一個或多個胺基酸殘基修飾成非自然產生的或非標準形式，或將一個或多個非自然產生的或非標準胺基酸插入序列裡。在本文中的其他部分描述了本發明的序列中改變的編號和位置的實施例。自然產生的胺基酸包括20種「標準」 L-胺基酸，由它們的標準單個字母代碼標 識為G、A、V、L、I、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、E。非標準胺基酸包括任何其它殘基，該殘基可以合併到多肽主鏈上或由現有的胺基酸殘基修飾產生。非標準胺基酸可以是自然產生的或非自然產生的。幾種自然產生的非標準胺基酸在本領域是公知的，如4-羥脯氨酸、5-輕賴氨酸、3-甲基組氨酸、N-乙醯絲氨酸)(Voet和Voet, 2004)。在它們的N-α位衍生的胺基酸殘基將僅位於胺基酸序列的N末端。通常在本發明中，胺基酸是L-胺基酸，但它可以是D-胺基酸。因而改變可以包括將L-胺基酸改變成D-胺基酸，或用D-胺基酸替換。還已知胺基酸的甲基化、乙醯化和/或磷酸化形式，本發明的胺基酸可以經受這樣修飾。在本發明的抗體區域和結合成員的胺基酸序列中，可以包括上述非自然的或非標準胺基酸。在合成期間非標準胺基酸(例如D-胺基酸)可以合併到胺基酸序列中，或在合成胺基酸序列之後修飾或替換「原始的」標準胺基酸。非標準的和/或非自然產生的胺基酸的應用增加了結構和功能的多樣性，並且因而能增加潛能以使本發明的結合成員達到期望的結合和中和hCMV的性質。另外，由於在給予動物(例如人)之後含有L-胺基酸的多肽的體內降解，與標準L-胺基酸相比，D-胺基酸和類似物已經顯示具有不同的藥代動力學曲線，意味著D-胺基酸有利於一些體內應用。本發明的新型攜帶CDR衍生序列的Vh或\區可以利用一種或多種選定的Vh和/或'基因的隨機誘變生成，以便在整個可變區內產生突變。Gram等(1992)描述了這樣的技術，其使用易錯PCR (錯配PCR，error-prone PCR) 在一些實施方式中，在整個可變區或CDR組內發生一或兩個胺基酸替換。另一種可以使用的方法是引發Vh或'基因的CDR區域誘變(Barbas 等，1994 ；Schier 等，1996)。所有上述的技術是本領域已知的那些，並且技術人員將能夠利用本領域的常規方法使用這些技術以提供本發明的結合成員。本發明進一步的方面提供一種用於獲得針對hCMV的抗體抗原結合位點的方法，該方法包括在Vh區(在本文中給出的Vh區的胺基酸序列是該Vh區的變異體的胺基酸序列)的胺基酸序列中通過添加、缺失、替換或插入一個或多個胺基酸，可選地結合如此提供的Vh區與一個或多個\區，並測試Vh區或VH/VL 一個組合或多個組合以確定結合成員或針對hCMV的抗體抗原結合位點，以及可選地具有一種或多種期望的性質，例如中和hCMV活性的能力。所述'區可以具有基本上如在本文中給出的胺基酸序列。可以採用模擬方法，其中在本文中披露的一種或多種\區的序列變異體與一種或多種Vh區相結合。正如上面所指出的，如在人類抗體可變區或其實質性部分中的CDR，可以攜帶有如本文中給出的CDR胺基酸序列。基本上如在本文中給出的HCDR3序列代表本發明的實施方式，如在人重鏈可變區或其實質性部分中的HCDR3，可以攜帶有這些中的每一種。在本發明中採用的可變區可以獲自或來源於任何胚系或重排人類可變區，或者可以是基於已知人類可變區的共有序列或實際序列的合成可變區。可變區可以源於非人抗體。可以使用重組DNA技術將本發明的⑶R序列(例如⑶R3)引入一系列(a repertoireof)缺少⑶R (例如⑶R3)的可變區內(引入缺少⑶R (例如⑶R3)的可變區譜內)。例如，Marks等(1992)描述了產生一系列抗體可變區(產生抗體可變區譜)的方法，在這些可變區中，與指向人類Vh基因的第三框架區的共有引物一起使用靶向或靠近可變區的5』端的共有引物，以提供一系列缺少⑶R3的Vh可變區(以提供缺少⑶R3的Vh可變區譜)。Marks等進 一步描述了這種系列可以如何與特定抗體的CDR3相結合。使用類似的技術，本發明的源於⑶R3的序列可以與缺少⑶R3的Vh或\區系列(譜)混雜(shuffled)，並且可以與和同源的Vl或Vh區合併的全Vh或\區混雜以提供本發明的結合成員。該系列可以然後展示在適宜的宿主系統中，如噬菌體展示系統、酵母展示系統、細菌展示系統、T7展示系統、病毒展示系統、細胞展示系統、核糖體展示系統或共價展示系統。同樣，一個或多個或所有的三個⑶R可以接枝到一系列Vh或八區(Vh或八區譜)，然後篩選這些Vh或 '區以得到針對hCMV的一種結合成員或多種結合成員。例如，可以採用一個或多個抗體Ab-Ol至Ab-50的HCDR1、HCDR2和HCDR3或HCDR組，和/或可以採用一個或多個抗體Ab-Ol至Ab-50的IXDRl、IXDR2和IXDR3或IXDR組。同樣，可以採用在本文中披露的其他Vh和\區、CDR組以及HCDR組和/或LCDR組。免疫球蛋白可變區的實質性部分與它們其間的框架區一起，可以至少包括三個⑶R區。該部分也可以包括至少約50%的第一和第四框架區的任意一者或兩者，該50%為第一框架區的C末端的50%和第四框架區的N末端的50%。在可變區的實質性部分的N末端或C末端處的另外的殘基可以是通常不與自然產生的可變區相關的那些。例如，由重組DNA技術製備的本發明的結合成員的構建，可以導致由引入的連接子編碼的N-或C-末端殘基的引入，從而促進克隆或其他操作步驟。其他操作步驟包括結合本發明的可變區的連接子引入至包括抗體恆定區、其他可變區或可檢測的/功能性標記物的進一步蛋白質序列中，如在本文中的其他部分更詳細討論的。雖然在本發明的一些方面中，結合成員包括一對Vh和 '區，基於Vh或\區序列的單個結合區域形成本發明進一步的方面。眾所周知，單個免疫球蛋白區域，特別是％區以特定方式結合目標抗原。在任何的單個結合區域的情況下，這些區域可以用於篩選能夠形成能結合hVMV的雙區域結合成員的互補區域。這可以使用在W092/01047 (McCafferty等)和在Marks等(同上)中披露的所謂分級雙組合方法(hierarchical dual combinatorialapproach)通過曬菌體展示篩選來實現。本發明的結合成員可以進一步包括抗體恆定區或其部分，例如人類抗體恆定區或其部分。例如，'區可以在其C末端附著包括人類CK或CA鏈的抗體輕鏈恆定區。同樣，基於Vh區的結合成員，可以在C末端附著源於任何抗體同種型的免疫球蛋白重鏈的所有或部分(例如ChI區)，該抗體同種型例如IgG、IgA、IgE和IgM，和任何子類同種型，特別IgGi和IgG4是有利的，由於其效應器功能和易於製備。具有這些性質並穩定可變區的任何合成的或其他恆定區變異體在本發明中也是有用的。 本發明的結合成員也可以包括多於一對Vh和\區(如雙特異性或多特異性抗體)，這形成本發明進一步的方面。在雙特異性抗體的情況下，其有兩對Vh和\區，一對Vh和\區可以來自於如在本發明中所描述的任何一種抗體Ab-Ol至Ab-5。V1^P \區中的第二對可以與第一對相同或不同。例如，Vh和Vlj區域對可以是選自任意一種抗體Ab-Ol至Ab-50或選自不同的抗體。在優選實施方式中，第一 ％和'區域對選自任意一種抗體Ab-Ol至Ab-50,並且第二 Vh和\區域對也選自任意一種抗體Ab-Ol至Ab-50，但是與第一區域對不同，以便雙特異性抗體結合到hMCV。此外，第一 Vh和\區域對選自任意一種抗體Ab-Ol至Ab-50,並且第二 Vh和\區域對選自不同的抗體。該雙特異性抗體可以因此結合到hCMV和不同的抗原或hCMV上不同的表位上。優選地，雙特異性抗體包括結合到hCMV的AD-4或 AD-5上的第一 Vl區域對(例如來自於任意一種抗體Ab-Ol至Ab-50的第一 \區域對)，和選自以下描述的hCMV結合抗體中的第二 Vl區域對US5，043, 281(Mashuho等)、US5, 750，106 (Ostberg),W093/021952A1 (Borrebaeck 等)、W008/084410A2、W010/007463A1和 W010/007533A2 (Lanzavecchia 和 Macagno)、W008/071806A1、W009/003975A1 和W009/024445A1 (Funaro 等)、W009/114560A2 (Olsen)、W010/114105A1 和 W010/114106A1(Takada 等)。可以產生抗體的混合物，如作為Oligoclonics 被本領域公知的重組人單克隆抗體的混合物(Merus Biopharmaceutical BV ；W0 04/106375),以供中和 hMCV 使用。這些混合物可以包括源於任意一種抗體Ab-Ol至Ab-50的結合成員。該抗體混合物也可以包括來自於任意一種抗體Ab-Ol至Ab-50的結合成員，其與識別gB蛋白上的不同抗原區域(如AD-I或AD-2)或識別gH或識別hCMV蛋白gpUL130、gpUL131A、gpl28等的抗hCMV結合成員組合。例如該抗體混合物可以包括來自於任意一種抗體Ab-Ol至Ab-50的\區，和選自任何以下描述的 hCMV 結合抗體的 Vh 區US5, 043, 281 (Mashuho 等)、US5, 750, 106(0stberg)、W093/021952A1 (Borrebaeck 等)、W008/084410A2、W010/007463A1 和 W010/007533A2(Lanzavecchia 和 Macagno)、W008/071806AU W009/003975A1 和 W009/024445A1 (Funaro等)、W009/114560A2 (Olsen)、W010/114105A1 和 W010/114106A1 (Takada 等)。可替換地，與選自任何前述列表中描述的任何hCMV結合抗體的Vh區和/或選自任意一種抗體Ab-Ol至Ab-50的Vh區一起，抗體混合物可以包括選自任何以下描述的hCMV結合抗體的Vl 區US5, 043，281 (Mashuho 等)、US5, 750，106 (Ostberg), W093/021952A1 (Borrebaeck等)、W008/084410A2、W010/007463A1 和 W010/007533A2 (Lanzavecchia 和 Macagno)、W008/071806AUW009/003975A1 和 W009/024445A1 (Funaro 等)、W009/114560A2 (Olsen)、W010/114105A1和 W010/114106A1 (Takada 等)。本發明的結合成員也可以包括抗體或片段，其包括修飾的Fe區，其中該修飾的Fe區相對於野生型Fe區包括至少一個胺基酸修飾。可以設計變異體Fe區，相對於包括野生型Fe區的類似分子，以便以更大的或較小的親和力結合Fe受體。Fe區指的是天然產生或合成的多肽，其同源於依靠IgG的木瓜蛋白酶消化產生的IgG C末端區域。IgG Fe具有大約50kD的分子量。對於本發明的抗體和/或片段，能夠使用整個Fe區，或僅使用半衰期增加的部分。如果需要，能夠變異Fe區，以抑制其修復補體和以高親和力結合Fe受體的能力。本發明中，在修飾自然產生的Fe區以提高在生物環境中的抗體或片段的半衰期(例如，血清半衰期或由體外試驗測量的半衰期)的情況下，可以提供帶有修飾的Fe區的抗體或片段。改變IgG的Fe區的原始形式的方法也在US6, 998, 253中描述(Presta和Snedecor)。可以通過對Fe區進行修飾、通過改變糖基化方式、或通過對Fe區的胺基酸序列進行修飾而改變的效應器功能(例如增強)，包括但僅不限於提高的Fe介導細胞的細胞毒性，包括提高的抗體依賴細胞的細胞毒性和提高的補體介導的溶解(例如受hCMV感染的細胞)，提高的抗體對Fe受體、天然殺傷細胞(NK)、巨噬細胞、單核細胞、和/或多形核細胞的結合，提高的樹突細胞成熟和提高的T細胞的啟動。潛在的修飾包括一個或多個胺基酸殘基的插入、缺失或替換，包括用丙氨酸替換、保守替換、非保守替換或用相應的胺基酸殘基對來自不同的IgG子類的相同位置的取代(例如在那個位置用相應的IgG2殘基取代IgG1殘基)。
在其他實施方式中，本發明的Fe多肽變異體可以包括一種或多種工程化的糖型(糖形，glycoforms),即一種共價附著在包括Fe區的分子上的碳水化合物組合物。IgG型抗體的Fe區在CH2區的殘基Asn297包含保守的N-連接的糖基化位點。已顯示，與這個殘基連接的低聚糖(寡糖)的糖基化形式的修飾可以提高由Fe區與Fe受體相互作用介導的效應器功能。經工程化的糖型可用於各種目的，包括但不限於增強或降低效應器功能。經工程化的糖型可以由本領域技術人員已知的任何方法產生，例如，通過使用工程化的或變異體表達菌株，通過用一種或多種酶，例如β (1，4)-N-乙醯氨基葡萄糖轉移酶III共表達，通過在來自於各種生物體的各種有機體或細胞系中表達包括Fe區的分子，或通過在已經表達了包括Fe區的分子之後修飾碳水化合物。用於產生工程化糖型的方法是本領域已知的，並且該方法包括但僅不限於，在下列中描述的那些US6，602，684 (I丨mana 等)、US20030157108 (Presta 等)、Umafla 等(1999)、Davies 等(2001 )、Shields 等(2002)、Shinkawa 等(2003)、和與 Potelligent 技術相關的專利和申請(Biowa，Inc. ,Princeton,NJ,U. S.)、和GlycoMAb 糖基化工程化技術(GLYCART Biotechnology AG, Schlieren, CH) 因此，在進一步的方面中，本發明包括如在本文的其他部分描述的hCMV結合成員，其中所述結合成員包括至少包括Fe區或等效區(該等效區包括至少一個IgG CH2區，其已被修飾從而提高一種或多種效應器功能)。在一個實施方式中，修飾結合成員以改變在Asn 297的N-連接低聚糖的糖基化形式，以便提高一種或多種效應器功能的活性。在另外的實施方式中，結合成員被修飾以改變Fe區的胺基酸序列，以便提高一種或多種效應器功能的活性。測定效應器功能活性和確定它們是否提高的方法是本領域公知的。本發明的結合成員可以用可檢測的或功能性標記物標記。因此，結合成員或抗體分子可以以免疫軛合物(免疫結合物，immunoconjugate)的形式存在，以便獲得可檢測的和/或可計量的信號。免疫軛合物可以包括本發明的抗體分子，例如任意一種抗體Ab-Ol至Ab-50與可檢測的或功能性標記物軛合(結合)。標記物可以是產生或能夠誘導以產生信號的任意分子，包含但不限於突光色素、放射性標記物、酶、化學發光劑(chemiIuminescers)或光敏劑。因此，可以通過檢測螢光或發光、放射性、酶活性或吸光度檢測和/或測定結合。適宜的標記物，以示例而不是限制的方式，包括酶，如鹼性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(「G6TOH」)、a-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖澱粉酶、碳酸酐酶、乙醯膽鹼酯酶、溶菌酶、蘋果酸脫氫酶和過氧化物酶，例如辣根過氧化物酶；染料；螢光標記物或螢光色素(如螢光素及其衍生物、羅丹明複合物和衍生物、綠色/黃色螢光蛋白(G/YFP)、紅色螢光蛋白(RFP)、藍色螢光蛋白(BFP)、丹醯、傘形酮(umbelliferone)、藻紅蛋白、藻藍蛋白、別藻藍素、鄰苯二甲醛(o-phthaldehyde)和螢光胺；鑭系元素穴狀化合物和螯合物的突光團，例如銪等(Perkin Elmer和Cis Biointernational);化學發光標記物或化學發光齊U，如異魯米諾(異氨基苯二醯肼，isoluminol)、魯米諾和二氧雜環丁燒(dioxetane);生物發光標記物，如螢光素酶和螢光素；敏化劑；輔酶；酶底物；放射性標記物包含但不限於溴 77、碳 14、鈷 57、氟 8、鎵 67、鎵 68、氫 3 (氚)、銦 111、銦 113m、碘 123m、碘 125、碘 126、碘131、碘 133、汞 107、汞 203、磷 32、錸 99m、錸 101、錸 105、釕 95、釕 97、釕 103、釕 105、鈧 47、硒 75、硫 35、鎝 99、鎝 99m、締 121m (telIuriuml2Im)>5$ 122m (telluriuml22m)>5$ 125m、銩165、銩167、銩168、釔199以及其它在本文中提到的放射性標記物；粒子，如膠乳或碳粒子；金屬溶膠；微晶(crystallite);脂質體；細胞等，其可以用染料、催化劑或其它可檢 測基團進一步標記；分子，例如生物素、地高辛(digoxygenin)或5-溴脫氧尿苷；毒素部分(moieties)，如例如選自由以下構成的組中的毒素部分假單胞菌外毒素(PE或細胞毒片段或其突變型)，白喉毒素或細胞毒片段或其突變型，肉毒桿菌毒素A、B、C、D、E或F，蓖麻毒素或其細胞毒片段，例如蓖麻毒素A，相思豆毒素(abrin)或其細胞毒片段，肥皂草素或其細胞毒片段，商陸抗病毒毒素(pokeweed antiviral toxin)或其細胞毒片段，和異株腹瀉毒蛋白I (bryodin I)或其細胞毒片段。適宜的酶和輔酶在US4, 275，149 (Litman 等)和 US4, 318，98 (Boguslaski 等)中披露，並且適宜的螢光劑和化學發光劑在US4，275，149中披露，其通過引用整體合併入本文中。標記物進一步包括化學部分，如通過結合在特異性同源可檢測部分可以檢測的生物素，例如標記的抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素，或通常經工程化的抗生蛋白鏈菌素，如streptactin (IBA GmbH,G ttingen,DE)。使用本領域已知的常規化學,可檢測標記物可以附著於本發明的抗體上。可以通過本領域技術人員已知的方法製備免疫軛合物或它們的功能片段。它們可以直接與酶或突光標記物偶聯或通過間隔基團或連接基團的中間體(intermediary),如聚醛(polyaldehyde)，像戊二醛，乙二胺四乙酸(EDTA)，二亞乙基三胺五乙酸(DPTA)，或在偶聯劑(如以上提及的用於治療性軛合物的那些)存在下。包括螢光素型的標記物的軛合物可以通過與異硫氰酸鹽/酯反應製備。本領域技術人員已知的用於將治療性放射性同位素直接或通過螯合劑(如上面提及的EDTA、DTPA)偶聯到抗體上的方法可以用於能夠用於診斷的放射元素。同樣可以通過氯胺T方法(Hunter和Greenwood, 1962)用鈉125進行標記，或通過在US4, 424, 200(Crockford和Rhodes)中描述的技術或如在US4, 479, 930 (Hnatowich)中描述的經由DTPA附著用鎝99m標記，這兩者都通過引用整體合併入本文中。標記物可以通過多種方法產生用外部手段可檢測的信號，這些外部手段例如，通過肉眼觀測、電磁輻射、熱和化學試劑。標記物也可以結合到與本發明的結合成員或載體相結合的另一種結合成員上。標記物可以直接產生信號，從而不需要另外的組分產生信號。多種有機分子，例如螢光劑，能吸收紫外線和可見光，其中光吸收將能量轉移到這些分子中並且使它們抬升至激發能態。然後這種吸收的能量通過第二波長的光線發射而消散。這種第二波長發射也可以將能量轉移到標記的受體分子中，而得到的能量通過光發射(例如螢光共振能量轉移(FRET))從受體分子中消散。直接產生信號的其它標記物包括放射性同位素和染料。可替換地，標記物可以需要其他組分以產生信號，然後信號產生系統會包括需要產生可測定信號的所有組分，其可以包括底物、輔酶、增強子、另外的 酶、與酶促產物反應的物質、催化劑、激活劑(活化劑)、輔因子、抑制劑、淨化劑(清除劑，scavengers)、金屬離子和需要結合信號產生物質的特定結合物質。在US5，185，243 (Ullman等)中可以找到適宜的信號產生系統的詳細討論。本發明提供了引發或允許如本文中提供的特異性抗hCMV結合成員的結合的方法。正如所指出的，這樣的結合可以發生在體內，例如在給予結合成員、或編碼結合成員的核酸之後，或者它可以發生在體外，例如，在ELISA、蛋白質印跡法、親和色譜法、免疫細胞化學、免疫沉澱反應、中和和生物化學的或基於細胞的試驗中。本發明還提供用於直接測定抗原水平的方法，通過採用根據本發明的結合成員，例如在生物傳感器系統中。例如,本發明包括檢測和/或測定結合至hCMV的方法，包括，
(i)將所述結合成員暴露於hCMV，以及(ii)檢測所述結合成員對hCMV的結合，其中使用在本文中描述的任何方法或可檢測的標記物檢測。這和在本文中描述的任何其它結合檢測方法，可以直接由進行該方法的人員詮釋，例如，通過在視覺上觀察可檢測的標記物。可替換地，這種方法或在本文中描述的任何其它結合檢測方法，可以以放射自顯影照片(autoradiograph )、照片、計算機列印輸出、流式細胞術報告、圖、圖表、包含結果的試管或容器或孔、或任何其他該方法的結果的可視的或物理表徵的形式產生報告。可以確定結合成員結合到hCMV上的量。定量可以涉及試樣中抗原的數量，其可以是診斷所關注的。對於hCMV結合的篩選和/或其定量可以是有用的，例如，在本文中涉及的篩選疾病或紊亂和/或任何其它疾病或紊亂的病人中，涉及異常的hCMV表達和/或活性。本發明的診斷方法可以包括(i )從對象(被試者)中獲得組織或流體樣品，(i i )將所述組織或流體樣品暴露於本發明的一種或多種結合成員；以及(iii)與對照樣品相比，檢測結合的hCMV，其中與對照相比hCMV結合量的增加可以表明hCMV表達和/或活性。要測試的組織或流體樣品包括血液、血清、唾液、尿液、痰、活檢材料或疑似包括h CMV的任何組織。對hCMV檢測呈陽性的對象(被試者)也可以得益於在本文中稍後披露的治療方法。根據在本文中披露的方法，本領域技術人員能夠根據他們優先的和一般知識，選擇測定結合成員與抗原的結合的適宜模式。可以通過任何適當的手段測定樣品中結合成員的反應性。競爭性結合試驗可以與放射性抗原(例如同位素標記物，如"Tc、14C、131I、125I、3H、32P或35S)或使用連接到報告分子上的抗原或類似物的非放射性抗原一起使用。報告分子可以是具有光譜分離吸收(spectrally isolated absorption)或發射特性的突光色素、磷光體或雷射染料。適宜的螢光色素包括螢光素、羅丹明、藻紅蛋白和德州紅和鑭系元素螯合物或穴狀化合物。適宜的生色染料包括二氨基聯苯胺。其他報告分子(reporters)包括大分子膠體顆粒或微粒材料(如彩色的磁性或順磁性膠乳珠)和生物或化學活性劑，其可以直接或間接地導致可檢測的信號可以視覺觀測、電子檢測或記錄。這些分子可以是催化反應進行的酶，例如，或變色或引起電性質的改變。它們可以是分子易激發的，以便能態之間的電子躍遷引起特徵譜的吸收或發射。它們可以包括用於與生物傳感器連接的化學實體。可以採用生物素/抗生物素蛋白或生物素/抗生蛋白鏈菌素和鹼性磷酸酶或辣根過氧化物酶檢測系統。由單獨的結合成員-報告分子結合物(軛合物)產生的信號可以用於導出樣品(正常和測試)中相關結合成員結合的可計量的絕對或相對數據。還提供了包括根據本發明的任何方面或實施方式的結合成員的試劑盒。在該試劑盒中，可以標記結合成員以使其在樣品中的反應性能夠檢測，例如正如在下文中進一步描述的。進一步的結合成員可以附著或可以不附著在固體載體上。試劑盒的組分通常是滅菌的並且密封在小瓶或其他容器中。診斷分析或其他對於結合成員有用的方法中可以採用試劑盒。試劑盒可以包括在方法，例如根據本發明的方法中對於各組分使用的說明書。輔助或使這樣的方法進行的輔助材料可以包含在本發明的試劑盒中。輔助材料包括第二種不同的結合成員，其結合到第一結合成員上，並與可檢測的標記物(例如螢光標記物、放射性同 位素或酶)結合。基於抗體的試劑盒也可以包括用於進行免疫沉澱反應的珠粒。試劑盒的每一種組分通常是在其自身適宜的容器中。因此，這些試劑盒通常包括適合於每一種結合成員的不同容器。而且，試劑盒可以包括用於進行試驗和方法的說明書，用於詮釋和分析由試驗進行而產生的數據。本發明還提供了如上的結合成員用於測定競爭試驗中的抗原水平中的應用，也就是說通過在競爭試驗中採用如本發明提供的結合成員測定樣品中的抗原水平的方法中的應用。這可以是在從不需要的未結合的抗原中物理分離結合的抗原的情況下。將報告分子連接到結合成員上，以便在結合時發生物理或光學改變是一種可能性。報告分子可以直接或間接產生可檢測的信號，其可以是可計量的。報告分子的連接(鍵接)可以是直接或間接地、共價地(例如經由肽鍵)或非共價地。經由肽鍵的連接(鍵接)可以作為編碼抗體和報告分子的基因融合的重組表達的結果。在各個方面和實施方式中，本發明擴展到與在本文中定義的任何結合成員(例如任意一種抗體Ab-Ol至Ab-50)競爭結合到hCMV上的結合成員，例如以IgG形式。結合成員之間的競爭可以在體外試驗，例如通過將特異性報告分子標記到一種結合成員上，可以在其他未標記的(未示蹤的，untagged)結合成員存在下檢測該結合成員，以使結合相同表位或重疊表位的結合成員能夠識別。可以測定競爭，例如，使用ELISA或通過表面細胞質基因組共振，其中hCMV固定在固相中，並且與一種或多種未示蹤的或未標記的結合成員一起，向該固相中加入第一種示蹤的或標記的結合成員。與示蹤的結合成員競爭的未示蹤的結合成員的存在通過由示蹤的結合成員發射的信號的降低檢測。例如，本發明包括識別hCMV結合化合物的方法，包括(i )將gB蛋白固定到載體上，
(ii)以同時地或分步的方式，使所述固定的gB與至少一種示蹤的或標記的根據本發明的結合成員與一種或多種未示蹤的或未標記的測試結合化合物相接觸，以及(iii)通過檢測示蹤的結合成員中結合的標記量的降低鑑定(識別)新的hCMV結合化合物。利用多孔或陣列形式(array format)以高通量的方式進行這樣的方法。這樣的試驗也可以在溶液中進行。參見，例如，US5, 814，468 (Sliman等)，其通過引用整體合併入本文中。如上所述，結合的檢測可以由進行該方法的人員直接說明，例如，通過視覺觀察可檢測的標記物，或其存在的減少。可替換地，本發明的結合方法可以以放射自顯影、照片、計算機列印輸出、流式細胞術報告或該方法的結果的任何其它可視的或物理的表徵產生報告。競爭試驗也可以用於表位的表徵。在一種情形下，表位的表徵可以用於識別由hCMV結合成員結合的表位，該表位可選地已經可以優化中和和/或調節特性。這樣的表位可以是鏈狀的或構象的。構象表位可以包括至少兩種不同的hCMV區域(結構域)，其中當hCMV蛋白摺疊成它的三級或四級結構以形成構象表位時，所述區域(結構域)的位置相互臨近，這些構象表位由hCMV的抑制劑識別，如在本說明書中提供的hCMV結合成員。在競爭測試中，可以採用抗原的肽片段，特別是包括或由關注的表位構成的肽。可以使用在任意末端加有一個或多個胺基酸的表位序列。根據本發明的結合成員可以是它們針對抗原的結合被帶有或包括給定序列的肽抑制的那些。本發明進一步提供了編碼本發明的結合成員的經分離的核酸。核酸可以包括DNA和/或RNA。在一個(實施例)中，本發明提供用於編碼CDR或CDR組或Vh區或\區或抗體 抗原結合位點或抗體分子的核酸，例如本發明在上文中定義的scFv或IgG115本發明也以質粒、載體(vectors)、轉錄或表達盒(cassettes)的形式提供包括如上的至少一種多核苷酸的構建體。本發明還提供重組宿主細胞，其包括一種或多種如上的構建體。編碼任何⑶R或CDR組或Vh區或\區或抗體抗原結合成員或抗體分子的核酸，例如提供的scFv或IgGl，本身形成本發明的一個方面，如同編碼產物的生產方法，該方法包括由編碼的核酸表達。通過在適當的條件下培養包含該核酸的重組宿主細胞可以方便地實現表達。在通過表達產生包括在本文中披露的Vh*'區的結合成員之後，可以使用在本領域已知的和視為適當的任何適宜的技術分離和/或純化結合成員。根據本發明的核酸可以包括DNA或RNA，並且可以是完全或部分合成的。除非上下文中另外需要，參照在本文中給出的核苷酸序列涵蓋具有特定序列的DNA分子，並且涵蓋具有特定序列的RNA分子，其中U代替了 T。還進一步的方面提供了生產包括本發明的V1^P/或'可變區的結合成員的方法，該方法包括由編碼核酸引發表達。這樣的方法可以包括在產生所述抗體Vh和/或\可變區的條件下培養重組宿主細胞。生產方法可以包括產物的分離和/或純化步驟。生產方法可以包括將該產物配製成包括至少一種另外的組分(如藥物活性賦形劑)的組合物。已知在各種不同的宿主細胞中多肽的克隆和表達系統。適宜的宿主細胞包括細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、絲狀真菌、酵母和昆蟲細胞以及轉基因植物和動物。本領域充分建立了在原核細胞中抗體和抗體片段的表達。對於綜述，請參見例如Pluckthun( 1991)。普通的細菌宿主是大腸桿菌。作為用於產生結合成員的選擇方案，培養基中的真核細胞的表達對於本領域技術人員也是可得到的，(Chadd 和 Chamow, 2001 ；Andersen 和 Krummen, 2002 ；Larrick 和Thomas, 2001)ο本領域可用的用於表達異源多肽的哺乳動物細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞(人子宮頸癌傳代細胞)、幼倉鼠腎(BHK)細胞、NSO小鼠黑色素瘤細胞、YB2/0大鼠骨髓瘤細胞、人胚胎腎細胞(HEK)、人胚胎視網膜細胞和許多其它的細胞系。
可以選擇或構建適宜的載體，包括適當的調控序列，包括在適當的情況下的啟動子序列、終止子序列、聚腺苷酸化序列、增強子序列、標記基因和其他序列。載體可以是質粒、曬菌體或病毒載體,例如在適當的情況下的逆轉錄病毒載體(Sambrook和Russell,2001)。Ausubel等(1991)詳細描述了用於操作核酸的許多已知的技術和方案，例如核酸構建體的製備、誘變、測序、向細胞中引入DNA和基因表達、以及蛋白質分析。本發明進一步的方面提供了包括在本文中披露的核酸的宿主細胞。這樣的宿主細胞可以在體外培養(供養)並且可以在組織培養基中繁殖。這樣的宿主細胞也可以在體內培養(供養)，例如以便在腹水中產生結合成員。宿主細胞存在於體內可以允許本發明的結合成員細胞內表達為「胞內抗體(intrabodies)」或細胞內抗體(intra-cellularantibodies)。胞內抗體可以用於基因治療。進一步的方面還提供了包括將本發明的核酸引入到宿主細胞中的方法。可以採用任何可用的技術引入。對於真核細胞，適宜的技術可以包括使用反轉錄病毒或其他病毒(例如牛痘，或對於昆蟲細胞、杆狀病毒、或其任意組合)的磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖、電穿孔、 脂質體介導的轉染和轉導。向宿主細胞中引入核酸，尤其是真核細胞酸可以使用病毒的或基於質粒的系統。可以附加型地(印isomally)培養(供養)質粒系統，或者可以合併到宿主細胞基因組或人工染色體內。合併可以通過一個或多個副本在單一或多個基因座(位點)的隨機或靶向整合。對於細菌細胞，適宜的技術可以包括使用噬菌體的氯化鈣轉化、電穿孔和轉染。引入之後可以緊接著引發或允許核酸表達，例如通過在表達結合成員的條件下培養宿主細胞。通過本領域技術人員已知的方法可以實現表達的產物的純化。本發明的核酸可以整合入宿主細胞的基因組(例如染色體)中。根據標準技術，可以通過促進基因組重組的序列包體(inclusion)促進整合。本發明還提供了包括在表達系統中使用如上所述的構建體的方法，以便表達上述的結合成員或多肽。正如在本文中其他部分所討論的，有證據表明在各種紊亂中涉及hCMV感染。本發明的結合成員可以因此用於與hCMV感染有關的紊亂的診斷或治療方法中。這樣的紊亂可以影響免疫受損的病人，如同種異體移植接受者和愛滋病病毒感染的個體，並且可以包括例如發燒、肝炎、視網膜炎、肺炎、骨髓抑制(myelosuppression)、腦病、多發性神經根病、免疫抑制、排斥/移植物抗宿主病或動脈硬化。本發明的結合成員也可以用於治療新生兒中的子宮內感染。經常地，新生兒出生時沒有以上列舉的紊亂的徵兆或症狀，但是不加治療可以發展CNS機能障礙和損傷的進程中的症狀，例如，但不局限於失聰，失明，和/或智力低下(mental retardation)。因此，本發明提供了治療hCMV感染相關的紊亂的方法，包括對需要其的病人單獨的或在與另一種本領域公知的或本文中描述的適當的藥物的組合治療方案中給予有效量的本發明的一種或多種結合成員。在本文的其他部分總結了特定紊亂中涉及hCMV感染的證據。此外，在本文中呈現的數據進一步表明，本發明的結合成員可以用於治療這樣的紊亂，包括紊亂的預防性治療和嚴重性的降低。因此，本發明提供了在本文中提到的任一種紊亂的治療或降低至少一種症狀的嚴重性的方法，包括對需要其的病人單獨的或在與另一種本領域公知的或本文中描述的適當的藥物的組合治療方案中給予有效量的本發明的一種或多種結合成員，以便降低任何上述紊亂的至少一種症狀的嚴重性。因此，在涉及hCMV感染和/或活性的，特別是由病人體內高病毒載量所導致的疾病或紊亂的治療中，本發明的結合成員作為治療劑是有用的。治療方法可以包括給予需要其的病人有效量的本發明的結合成員，其中降低了異常感染和/或hCMV的活性。治療方法可以包括(i)確定證實的病人感染hCMV的水平或活性，例如使用上文描述的診斷方法，並且(ii)給予病人有效量的本發明的結合成員，其中降低了 hCMV的表達和/或活性。根據本發明的有效量是降低hCMV的表達和/或活性的量，以便降低或減輕hCMV感染或待治療的特定疾病或紊亂的至少一種症狀的嚴重性，但是不必要治癒疾病或紊亂。本發明也提供對抗(拮抗)hCMV感染的至少一種效應的方法，包括接觸或給予有效量的本發明的一種或多種結合成員以便對抗(拮抗)所述hCMV感染的至少一種效應。因此，本發明進一步的方面提供了包括如提供的結合成員、包括這樣的結合成員的藥物組合物的給藥的治療方法，和這樣的結合成員在生產用於給藥的藥劑中的應用，例如，在製備包括將該結合成員與藥物活性賦形劑一起配製的藥劑或藥物組合物的方法中。藥物活性賦形劑可 以是一種化合物或者化合物的組合，其引入藥物組合物而不引起二次反應，並且其允許，例如，促進一種活性化合物或多種活性化合物的給藥，增加其在體內的壽命和/或效能，增加在溶液中的溶解度或改善其保存。本領域技術人員已知並且將適當應用這些藥用載體，作為選定的一種活性化合物(或多種活性化合物)的給藥的性質和模式的功能(函數)。本發明的結合成員通常將以藥物組合物的形式給藥，除結合成員之外其可以包括至少一種組分。因此，除活性組分之外，根據本發明的藥物組合物和根據本發明的應用可以包括藥物活性賦形劑、載體、緩衝劑、穩定劑或對本領域技術人員已知的其他材料。這樣的材料應當無毒，並且不應當幹擾活性成分的效能。載體或其他材料的確切性質將取決於給藥途徑，其可以是口服的、吸入的、氣管內的、局部的、囊內的(泡內的，intra-vesicular)或通過注射，正如在下文討論的。用於口服給藥的藥物組合物可以以片劑、膠囊、粉劑、液體或半固態形式的。片劑可以包括固體載體，如明膠或佐劑。液體藥物組合物通常包括液體載體，如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成油。生理鹽水溶液可以包括葡萄糖或其他糖類溶液或二醇類，如乙二
醇、丙二醇或聚乙二醇。對於靜脈內注射，或在痛苦部位的注射，活性組分將是以腸道外可接受的水溶液的形式，這些水溶液是無熱原的並且具有適當的PH值、等滲性和穩定性。本領域相關技術人員能夠很好地製備適用的適宜溶劑，例如等滲的載體，如氯化鈉注射液、林格(Ringer’s)注射液、乳酸化的林格注射液。可以按需要採用防腐劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑和/或其他添加物，包括緩衝齊 ，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸等；抗氧化劑，如抗壞血酸(維生素c)和甲硫氨酸；防腐劑(如十八燒基二甲節基氯化銨；氯化六甲雙銨(hexamethonium chloride);苯扎氯銨；苄索氯銨；苯酚、丁基醇或苯甲醇；對羥苯甲酸烷基酯類(對羥苯甲酸類，parabens)，如甲基或丙基對羥基苯甲酸烷基酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3』_戊醇；及間-甲酚)；低分子量多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸、或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA ;糖類，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽反離子，如鈉；金屬絡合物(例如鋅-蛋白絡合物);和/或非離子表面活性劑，如吐溫 、PLURONICS 或聚乙二醇(PEG)。本發明的結合成員可以以液體、半固態或固體形式配製，取決於分子的理化性質和遞送途徑。配製品可以包括賦形劑或賦形劑的組合，例如，糖類、胺基酸和表面活性劑。液體配製品可以包括寬範圍的抗體濃度和PH值。例如，固體配製品可以通過例如由冷凍乾燥、噴霧乾燥或超臨界流體技術乾燥而產生。結合成員的配製品將取決於預期的遞送途徑。結合成員可以與載體一起製備，該載體將保護結合成員免於快速釋放，如控制釋放的配製品，包括包埋體、透皮貼片和微囊化的遞送系統。可以使用可生物降解的、生物相容性聚合物，如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。許多製備這樣的配製品的方法對於本領域技術人員是已知的(Robinson, 1978)。可以給予以下方式治療口服，或通過注射(即皮下、關節內、靜脈內、腹膜內、動脈內或肌肉內)途徑，通過吸入、氣管內途徑，通過囊內途徑(灌輸到膀胱中)、或局部(例如眼內、鼻內、直腸、傷口內、皮膚上)。治療可以通過脈衝輸注用藥，特別是以結合成員降低的劑·量。給藥途徑可以由治療的物理化學特性決定，通過對疾病的特定考慮或通過優化效能的需求或使副作用最小化。一種特定的給藥途徑是靜脈內途徑。本發明的藥物組合物的另一種給藥途徑是皮下途徑。應當認為治療將不僅限於臨床應用。因此，使用無針設備的皮下注射也是有利的。組合物可以單獨的或與其他治療聯合給予，取決於要治療的條件同時地或順次地(給予)。本發明的結合成員可以用作與另外的藥物組分相配合的聯合治療的一部分。聯合治療可以用於提供顯著的協同效應，特別是本發明的結合成員和一種或多種其他抗體(如在本文中披露的抗體Ab-Ol至Ab-50)或在以下出版物中描述的任何hCMV抗體的組合US5, 043，281 (Mashuho 等)、US5, 750，106 (Ostberg)、W093/021952A1 (Borrebaeck等)、W008/084410A2、W010/007463A1 和 W010/007533A2 (Lanzavecchia 和 Macagno)、W008/071806A1,W009/003975A1 和 W009/024445A1 (Funaro 等)、W009/114560A2 (Olsen)、W010/114105A I和W010/114106A1 (Takada等)或任何其它藥物。本發明的結合成員可以同時或順次地或作為與另外的治療劑或藥劑的組合製劑給藥，用於治療在本文中列舉的一種或多種病狀。本發明的結合成員可以用作化學敏化劑((1161]1086118；[1^861·),藉此其可以提高抗病毒藥劑的治療效能，並且因而可以與一種或多種抗病毒藥劑聯合提供給藥，同時地或順次地。根據本發明的結合成員可以組合或加入一種或多種以下抗病毒藥劑來提供，例如阿昔洛韋、泛昔洛韋、糹顏更昔洛韋、更昔洛韋、西多福韋、金剛燒胺、金剛乙胺、利巴韋林、扎那米韋和/或奧司他韋。本發明的結合成員以及一種或多種上述另外的藥物組分可以用於藥劑的生產。藥劑可以用於向個體單獨或聯合給藥，因此可以包括結合成員和另外的組分，作為組合製劑或作為單獨製劑。單獨製劑可以用於促進單獨和連續或同時給藥，並且允許通過不同途徑的組分的給藥，例如口服和腸道外給藥。
根據本發明，提供的組合物可以對哺乳動物給藥。給藥通常是以「治療有效量」的，這足以顯示對病人有益。這樣的益處可以是至少改善至少一種症狀。給藥的實際量和速率以及給藥的持續時間，將取決於待治療的性質和嚴重性、待治療的特定哺乳動物、個體病人的臨床病症、紊亂的原因、組合物的遞送部位、結合成員的類型、給藥的方法、給藥的時刻表以及醫學從業者已知的其他因素。治療的處方是在普通從業者和其他醫生的責任內，例如對劑量等的確定，並且可以取決於症狀的嚴重性和/或待治療的疾病的進展。本領域已知抗體的適當劑量(Ledermann等，1991 ;Bagshawe等，1991 )。可以使用在本文或在Physician’s Desk Reference (2009)中指明的特定劑量,作為適合於給藥的藥劑類型。本發明的結合成員的治療有效量或適宜的劑量，可以通過比較其體外活性和在動物模型中的體內活性確定。已知小鼠和其他試驗用動物到人的有效量的外推方法。精確的劑量將取決於大量因素，包括抗體是用於診斷、預防還是治療，治療區域的大小和位置，抗體的確切性質(例如全抗體還是片段)以及任何可檢測的標記物的性質或附連在抗體上的其他分子。對於系統應用(全身應用)的典型抗體劑量將在100μ g至Ig的範圍內，而對於局部應用在Iug至Img的範圍內。可以給予最初較高的載藥劑量，接著一個或多個較低的劑量。代表性地，抗體將是全抗體，例如IgG1同種型。這是用於成年病人的單次治療的劑量，其可以適當地調整用於兒童、嬰兒和新生兒，並且也調整其它抗體形式與分子量的比例。可以以每 天、每周兩次、每周或每月的間隔重複治療，由醫生自行處理。治療可以是每二到四周皮下給藥，和每四到八周靜脈注射。治療可以是定期性的，並且給藥的周期約為兩周或更長，例如約三周或更長、約四周或更長、或約每月一次。治療可以在移植手術之前和/或之後給予，和/或可以直接在外科治療的解剖部位給藥或施藥(塗敷)。就劑量和給藥需求而言，與本領域之前披露的抗hCMV的抗體相比，本發明的hCMV結合成員可以提供優勢。例如，如果抗hCMV的治療劑量較低，其可以具有顯著優勢，因為低劑量有利於皮下注射以及靜脈內注射。本領域技術人員已知皮下用藥可能受到結合成員的量的限制，例如每劑量所需的抗體分子。這是由於皮下注射受到能夠在皮膚的一個部位注射的體積的限制。通常使用1.2ml以下的皮下注射體積。由於以大於50mg/ml的濃度配製用於皮下注射的結合成員可能更加困難，通過這種途徑的大於IOOmg的劑量通常需要多次注射並且使病人更加不適。因此，例如更高效能的hCMV結合成員的較低劑量是有利的，因為其擴展了給藥途徑。實施例實施例I :hCMV特異件記憶B細胞的FACS分詵和IgG陽件記憶B細胞的EBV轉化在獲得知情供體的同意之後，從健康的hCMV血清反應陽性的供體中採集外周血(300ml),已經預先篩選了高gB結合效價和有效中和hCMV活性的這些供體的血清。外周血單核細胞(PBMC)通過Ficoll密度梯度離心(Lymphof lot, Biotest, Dreieich,德國)純化。在使用抗人⑶22微珠(Mitenyi Biotech, Bergisch Gladbach,德國)富集B細胞之後,用下列試劑標記 B 細胞a、抗人 CD19-FITC (Miltenyi Biotec，德國)；b、抗人 CD27-PE (BDBioscience Pharmigen, Basel,瑞士)；c、抗人 IgG-bio (Jackson Immuno-Research, WestGrove, PA,美國)；d、抗生蛋白鏈菌素,Alexa i;Uu)r" 350 結合物(Molecular Probes Inc,Eugene，0R，USA)和e、Cy5-標記的糖蛋白B (IOOng每IxlO6個B細胞)。通過分選滿足以下四個標準的細胞分離了 gB-特異性的、IgG-陽性記憶B細胞FITC+/PE+/Alexa Muor'350+和Cy5+ (見圖2)。可替換地，用以下試劑標記B細胞a、抗人CD19_PerCP (Dianova,Hamburg,德國);b、抗人CD27_PE(BD Bioscience Pharmigen,Basel,瑞士);c、抗人IgG-FITC(Dianova, Hamburg,德國)；d、Cy5_標記的糖蛋白B (IOOng每IxlO6個B細胞)。使用l.'ACSCalibl!rKl(Becton Dickinson,Heidelberg,德國)分析或通過分選滿足 PerCP+/PE+/FITC+和Cy5+標準的細胞分離這些gB-特異性的、IgG-陽性的記憶B細胞。在包含經照射的飼養細胞(人包皮成纖維細胞,HFF)的匯合層(confluent layer)的96-孔平底微量培養板中，使用MoFlo 細胞分選儀(Cytomation, Freiburg,德國)分選濃度為5或10個細胞/孔的細胞。在包括如先前描述(Ros6n等，1997 ；Bernasconi等，2002 Jung等，2002 ;Traggiai等2004)的細胞培養上清液(生產EBV的細胞系B95-8的30%上清液)和CpG ODN 2006 (2. 5 μ g/ml)的EBV存在下，經分選的細胞在以2mM的穀氨醯胺、100IU/ml的青黴素、100 μ g/ml的鏈黴素、50μΜ的2-巰基乙醇和10%胎牛血清(力口熱失活的)(PAN-Biotech，Aidenbach，德國)補充的RPMI-1640完全培養基中生長。在三周之後，使用酶聯免疫吸附測定(ELISA)，對來自產生的細胞系的培養上清液篩選gB-特異性。簡單地說，用碳酸鹽緩衝液(pH 9.6)中的0.5 μ g/ml的糖蛋白B在4°C下塗布ELISA板(Nunc)，持續16h。塗有gB的板用以0. 05%的吐溫(ELISA洗滌緩衝液)補充的磷酸鹽緩 衝鹽水(PBS)洗滌6次，並用以0. 05%的吐溫和2%的胎牛血清(ELISA緩衝液)補充的PBS封閉2h。在室溫下孵育每個孔中的50μ I培養上清液lh，在另外的洗滌步驟之後，使用與過氧化物酶(Jackson Immuno-Research,美國)結合的Fe Y片段-特異性二次抗體(二抗)顯示了結合的抗體。在Ih孵育期之後，通過洗滌去除未結合的二次抗體，並且使用在0. 05M磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液(pH 5. 0),0. 05%H202中的50 μ I/孔的濃度為0. 04mg/ml的鄰-苯基二胺測定酶活性。在室溫下孵育10分鐘之後，通過加入50 μ I/孔的2M H2SO4中止反應並使用 Spectramax 190ELISA 光度計(Molecular Devices, Sunnyvale, CA,美國)測定在492nm 下的光密度(0D)。Softmax Pro 3. O (Molecular Devices, USA)軟體用於分析。實施例2 :體外hCMV中和實驗使用在hCMV基因組中包括螢光素酶報告基因表達盒的hCMV重組株AD169(HB15-UL84prluc)，篩選gB-特異性的培養上清液的中和活性，當感染目標細胞(由ThomasStamminger 醫生和教授善意提供的，Institute of Clinical and Molecular Virology,University Hospital Erlangen,德國)後該hCMV基因組導致螢光素酶的表達。在96孔板上，通過TCID50試驗在初始的(初代)成纖維細胞(HFF或MRC-5細胞)中測定病毒上清液的傳染效價，正如在Mahy和Kangro( 1996)中所描述的。對於基於螢光素酶的中和試驗，在96孔U形底微量培養板中，在37°C下孵育等體積的gB-特異性上清液和經滴定的AD169 Δ Luc上清液(300pfu) lh。將抗體-病毒混合物轉移到預先接種的HFF單層上。在37°C下另外孵育4h之後，用完全培養基替換抗體-病毒混合物。緊接著在37°C下孵育另外42h，用每孔100 μ I Glo溶解緩衝液(Promega，Madison, WI)溶解細胞。將30 μ I溶解的孔各自置於白色的96孔的LIA板(Greiner Bio-one, Frickenhausen,德國)中。向每個孔中加入50μ L 試驗緩衝液(15mM KH2PO4, 25mM 雙甘氨肽、IM MgSO4、0. 5M EGTA、5mMATP、ImM DTT)。每孔(以25mM雙甘氨肽、IM MgS04、0. 5M EGTA、2mM DTT和0. 05mM D-螢光素)中注射50 μ LD-螢光素(P. J. K. Kleinbittersdorf,德國)溶液並通過 Centro LB 960 發光計(BertholdTechnologies, Bad Wildbad,德國)進行化學發光的檢測。MicroWin2000 軟體(MikrotekLaborsysteme, Overath,德國)用於分析。使用下列的計算以百分中和表示用發光計測定的相對光單位(RLU)%中和=IOOx (V0-Vn) /Vtl，其中Vn代表包括病毒和抗體的孔中的RLU，V0代表僅包括病毒的孔中的RLU。第一次篩選顯示9種(其中和hCMV感染性)gB-特異性培養上清液，而第二次篩選顯示另外3種(其中和hCMV感染性)gB-特異性培養上清液。將9種EBV永生化的記憶B細胞系和由它們產生的中和抗體命名為SMI、SM3、SM4、SM5、SM6、SM7、SM9、SMlO和SMll (見下表I)。將另外的3種EBV永生化的記憶B細胞系和由它們產生的中和抗體命名為SM12、2C2和1G2 (見下表I)。50%中和滴定度(滴度)(IC5tl)表示為導致hCMV感染降低50%的抗體濃度。同樣，90%中和滴定度(IC9tl)表示為導致hCMV感染降低90%的抗體濃度。為了計算抗體的中和活性，通過ELISA測定培養上清液IgG濃度。為此目的，用抗-人IgG、Fe Y片段-特異性捕獲抗體塗覆ELISA板(Jackson Immuno-Research,美國)。ELISA緩衝液中的SM-抗體培養上清液的兩倍系列稀釋液與已知濃度的多克隆IgG標準相比較(II. lmg/ml的儲備濃度；Cat No :009-000-003, Jackson Immuno-Research,美國)。使用 ELISA Softmax Pro 3. O 軟體計算樣品的IgG濃度(Molecular Devices, Sunnyvale, CA,美國)。下表I中顯示了相對於EBV細胞系培養上清液的IgG濃度的中和活性復I EBV-永生化的記憶B細胞系的性質
權利要求
1.一種針對人類巨細胞病毒(hCMV)gB蛋白的經分離的結合成員，其在殘基100到447內的區域結合hCMV gB蛋白，所述殘基編號為根據全長gB株AD169胺基酸SEQ ID No: 239定義的。
2.一種針對hCMV gB蛋白經分離的結合成員，其結合Kd至多是由表面細胞質基因組共振定義的InM的hCMV gB蛋白。
3.根據權利要求2所述的結合成員，其中，所述KD至多是O.5nM。
4.根據權利要求2或權利要求3所述的結合成員，其中，所述KD至多是O.InM。
5.根據前述權利要求中的任意一項所述的結合成員，其中所述結合成員不結合至hCMVgB蛋白的抗原區I (AD-I)或抗原區2 (AD-2)。
6.根據前述權利要求中的任意一項所述的經分離的結合成員，其中需要中和50%hCMV的臨床分離株的結合成員的濃度為10μ g/ml或小於在中和試驗中用於人包皮成纖維細胞的hCMV感染的中和。
7.一種針對hCMV的經分離的結合成員，包括一組CDR :HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、IXDR2和IXDR3，其中所述組的⑶R具有來自以下一組⑶R的22個以下的胺基酸改變 HCDRl具有胺基酸SEQ ID No: 3 ; HCDR2具有胺基酸SEQ ID No: 4 ; HCDR3具有胺基酸SEQ ID No: 5 ; LCDRl 具有胺基酸 SEQ ID No: 93 ； LCDR2具有胺基酸SEQ ID No:94 ;以及 IXDR3具有胺基酸SEQ ID No: 95，並且其中，所述結合成員具有至多由表面細胞質基因組共振定義的50nM的Kd。
8.根據權利要求I至6中任意一項所述的針對hCMV的經分離的結合成員，包括一組⑶R :HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDRl、IXDR2和IXDR3，其中所述組的⑶R具有來自以下一組⑶R的22個以下的胺基酸改變，其中 HCDRl具有胺基酸SEQ ID No: 3 ; HCDR2具有胺基酸SEQ ID No: 4 ; HCDR3具有胺基酸SEQ ID No: 5 ; LCDRl 具有胺基酸 SEQ ID No: 93 ； LCDR2具有胺基酸SEQ ID No:94 ;以及 LCDR3 具有胺基酸 SEQ ID No:95。
9.根據任何權利要求7或8任意一項所述的結合成員，包括HCDRl，其中Kabat 殘基 31 是 Asp 或 Gly ；Kabat 殘基 32 是 His、Phe 或 Tyr ；Kabat 殘基 33 是 Tyr ； Kabat殘基34是Met、Ile或Leu ；以及 Kabat 殘基 35 是 Val 或 Asn0
10.根據權利要求9所述的結合成員，其中，HCDRl是SEQID No:3。
11.根據權利要求7至10中任意一項所述的結合成員，包括HCDR2，其中Kabat 殘基 50 是 Trp、Ser 或 Cys ；Kabat 殘基 53 是 Gin、Asn 或 His ；Kabat 殘基 54 是 Ser 或 Thr ； Kabat 殘基 58 是 Gly、Lys、Asn 或 His ； Kabat殘基60是Gly或Ala ；以及 Kabat 殘基 64 是 Gln 或 Arg。
12.根據權利要求11所述的結合成員，其中，HCDR2具有胺基酸SEQID No:4。
13.根據前述權利要求中任意一項所述的結合成員，包括HCDR3，其中Kabat 殘基 99 是 Thr 或 Ala ；Kabat 殘基 100 是 Val 或 Met ； Kabat 殘基 100A 是 Ser 或 Thr Kabat 殘基 100B 是 Asn 或 Thr ；Kabat 殘基 100C 是 Ser 或 Phe ；Kabat 殘基 100E 是 Leu、Met 或 Ala ；Kabat 殘基 100F 是 Ser 或 Gly ；Kabat 殘基 100K 是 His 或 Tyr ；Kabat 殘基 100L 是 Asn、Ser 或 Asp ；Kabat 殘基 100M 是 Arg、VAl 或 Ile ;Kabat 殘基 100N 是 Leu 或 Met ； Kabat殘基101是Asp或Gly ；以及 Kabat 殘基 102 是 Ala、Val 或 Ile0
14.根據權利要求13所述的結合成員，其中，HCDR3具有胺基酸SEQID No:5。
15.根據權利要求7至14中任意一項所述的結合成員，其中LCDRl中的Kabat殘基26是Ser或Asn,或其中IXDRl中的Kabat殘基27是Ser或Arg0
16.根據權利要求15所述的結合成員，其中，LCDRl是SEQID No:930
17.根據權利要求7至16中任意一項所述的結合成員，其中LCDR2中的Kabat殘基56是 Ser 或 Pro。
18.根據權利要求17所述的結合成員，其中，LCDR2是SEQID No:94。
19.根據前述權利要求中任意一項所述的結合成員，包括LCDR3，其中Kabat 殘基 89 是 Gly 或 Ala ；Kabat 殘基 91 是 Pro 或 Trp ；Kabat 殘基 93 是 Arg 或 Ser ；Kabat 殘基 94 是 Ser 或 Asp ；Kabat 殘基 95a 是 Ser、Gly 或 Ala ； Kabat殘基96是Val或Tyr ；以及 Kabat 殘基 97 是 Ile 或 Val。
20.根據權利要求19所述的結合成員，包括具有胺基酸SEQID No:95的IXDR3。
21.—種針對hCMV gB蛋白質的經分離的結合成員，包括抗體Ab-Ol至Ab-46的任意一種的 HCDR3、LCDR3 和 / 或一組 CDR。
22.根據權利要求21所述的經分離的結合成員，其在殘基121至132和344至438內的區域結合hCMV gB蛋白，所述殘基編號為根據全長gB菌株AD169的胺基酸序列SEQ ID:239定義的。
23.根據前述權利要求中任意一項所述的成員，包括一組CDR=HCDRl, HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2 和 LCDR3，其中HCDRl 是 SEQ ID NO:3 ；HCDR2 是 SEQ ID NO:4 ；HCDR3 是 SEQ ID NO:5 ；LCDRl 是 SEQ ID NO:93 ； LCDR2 是 SEQ ID NO: 94;以及 LCDR3 是 SEQ ID NO:95。
24.根據前述權利要求中任意一項所述的結合成員，其中所述結合成員包括抗體分子或其功能片段，所述抗體分子或其功能片段包括抗體Vh區，並且其中所述Vh區具有在SEQID No: 2中顯示的所述Vh區胺基酸序列。
25.根據前述權利要求中任意一項所述的結合成員，其中所述結合成員包括抗體分子或其功能片段，所述抗體分子或其功能片段包括抗體\區，並且其中所述\區具有在SEQID No:92中顯示的所述VL區胺基酸序列。
26.—種包括重鏈和輕鏈的經分離的抗體分子，所述重鏈包括胺基酸SEQ ID No:2並且所述輕鏈包括胺基酸序列SEQ ID No:92。
27.—種結合hCMV gB蛋白的經分離的抗體分子，其中所述抗體分子包括至少90%同一於SEQ ID No:2的Vh區胺基酸序列和至少90%同一於SEQ ID No:92的\區胺基酸序列。
28.—種用於hCMV gB蛋白質的經分離的結合成員，包括抗體Ab-47至Ab-50的任意一種的 HCDR3、LCDR3 和 / 或一組 CDR。
29.根據權利要求28所述的經分離的結合成員，其在胺基酸殘基133至343內的區域結合hCMVgB蛋白，所述殘基編號為根據全長gB菌株AD169胺基酸SEQ ID No:239定義的。
30.根據權利要求I至6、28和29中任意一項所述的結合成員，包括一組⑶R=HCDRl,HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2 和 LCDR3，其中HCDRl 是 SEQ ID No:243 ；HCDR2 是 SEQ ID No:244 ；HCDR3 是 SEQ ID No:245 ；LCDRl 是 SEQ ID No:263 ； LCDR2 是 SEQ ID No :264;以及 LCDR3 是 SEQ ID No:265。
31.根據權利要求I至6、28和29中任意一項所述的結合成員，包括一組⑶R=HCDRl,HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2 和 LCDR3，其中HCDRl 是 SEQ ID No:248 ；HCDR2 是 SEQ ID No:249 ；HCDR3 是 SEQ ID No:250 ；LCDRl 是 SEQ ID No:268 ；LCDR2 是 SEQ ID No :269;以及LCDR3 是 SEQ ID No:270。
32.根據權利要求I至6、28和29中任意一項所述的結合成員，包括一組⑶R=HCDRl,HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2 和 LCDR3，其中HCDRl 是 SEQ ID No:253 ；HCDR2 是 SEQ ID No:254 ；HCDR3 是 SEQ ID No:255 ；LCDRl 是 SEQ ID No:273 ；LCDR2 是 SEQ ID No :274;以及LCDR3 是 SEQ ID No:275。
33.根據權利要求I至6、28和29中任意一項所述的結合成員，包括一組⑶R=HCDRl,HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2 和 LCDR3，其中HCDRl 是 SEQ ID No:258 ；HCDR2 是 SEQ ID No:259 ；HCDR3 是 SEQ ID No:260 ；LCDRl 是 SEQ ID No:278 ；LCDR2 是 SEQ ID No :279;以及LCDR3 是 SEQ ID No:280。
34.根據權利要求I至6和28至30中任意一項所述的結合成員，其中，所述結合成員包括抗體分子或其功能片段，所述抗體分子或其功能片段包括抗體Vh區，並且其中所述Vh區具有在SEQ ID No :242中顯示的所述Vh區域胺基酸序列。
35.根據權利要求I至6和28、29和31中任意一項所述的結合成員，其中，所述結合成員包括抗體分子或其功能片段，所述抗體分子或其功能片段包括抗體Vh區，並且其中所述Vh區具有在SEQ ID No:247中顯示的所述Vh區胺基酸序列。
36.根據權利要求I至6和28、29和32中任意一項所述的結合成員，其中，所述結合成員包括抗體分子或其功能片段，所述抗體分子或其功能片段包括抗體Vh區，並且其中所述Vh區具有在SEQ ID No:252中顯示的所述Vh區胺基酸序列。
37.根據權利要求I至6和28、29和33中任意一項所述的結合成員，其中，所述結合成員包括抗體分子或其功能片段，所述抗體分子或其功能片段包括抗體Vh區，並且其中所述Vh區具有在SEQ ID No:257中顯示的所述Vh區胺基酸序列。
38.根據權利要求I至6和28至30和34中任意一項所述的結合成員，其中，所述結合成員包括抗體分子或其功能片段，所述抗體分子或其功能片段包括抗體'區，並且其中所述' 區具有在SEQ ID No:242中顯示的所述' 區胺基酸序列。
39.根據權利要求I至6和28、29、31和35中任意一項所述的結合成員，其中，所述結合成員包括抗體分子或其功能片段，所述抗體分子或其功能片段包括抗體\區，並且其中所述\區具有在SEQ ID No:267中顯示的所述\區胺基酸序列。
40.根據權利要求I至6和28、29、32和36中任意一項所述的結合成員，其中，所述結合成員包括抗體分子或其功能片段，所述抗體分子或其功能片段包括抗體\區，並且其中所述'區具有在SEQ ID No :272中顯示的所述'區胺基酸序列。
41.根據權利要求I至6和28、29、33和37中任意一項所述的結合成員，其中，所述結合成員包括抗體分子或其功能片段，所述抗體分子或其功能片段包括抗體\區，並且其中所述'區具有在SEQ ID No :277中顯示的所述'區胺基酸序列。
42.一種包括重鏈和輕鏈的經分離的 抗體分子，所述重鏈包括胺基酸SEQ ID No:242並且所述輕鏈包括胺基酸序列SEQ ID No:262。
43.一種包括重鏈和輕鏈的經分離的抗體分子，所述重鏈包括胺基酸SEQ ID No:247並且所述輕鏈包括胺基酸序列SEQ ID No:267。
44.一種包括重鏈和輕鏈的經分離的抗體分子，所述重鏈包括胺基酸SEQ ID No:252並且所述輕鏈包括胺基酸序列SEQ ID No:272。
45.一種包括重鏈和輕鏈的經分離的抗體分子，所述重鏈包括胺基酸SEQ ID No :257並且所述輕鏈包括胺基酸序列SEQ ID No:277。
46.一種結合hCMV gB蛋白的經分離的抗體分子，其中所述抗體分子包括至少90%同一於SEQ ID:242的Vh區胺基酸序列和至少90%同一於SEQ ID No:92的\區胺基酸序列。
47.一種結合hCMV gB蛋白的經分離的抗體分子，其中所述抗體分子包括至少90%同一於SEQ ID:247的Vh區胺基酸序列和至少90%同一於SEQ ID No:267的\區胺基酸序列。
48.一種結合hCMV gB蛋白的經分離的抗體分子，其中所述抗體分子包括至少90%同一於SEQ ID:252的Vh區胺基酸序列和至少90%同一於SEQ ID No:272的\區胺基酸序列。
49.一種結合hCMV gB蛋白的經分離的抗體分子，其中所述抗體分子包括至少90%同一於SEQ ID:257的Vh區胺基酸序列和至少90%同一於SEQ ID No:277的\區胺基酸序列。
50.一種與前述權利要求中任意一項所述的結合成員或經分離的抗體分子競爭結合於hCMV gB蛋白的結合成員或抗體分子。
51.根據任何權利要求26、27、42至50中任意一項所述的抗體分子，其中抗體分子是IgG0
52.根據權利要求24、26、27、34至37和42至51中任意一項所述的抗體分子的經分離的VH區。
53.根據任何權利要求25至27和38至51中任意一項所述的抗體分子的經分離的VL區。
54.一種組合物，包括根據權利要求I至25和28至41中任意一項所述的經分離的結合成員、或根據權利要求26、27和42至51中任意一項所述的抗體分子，以及藥用賦形劑。
55.一種組合物，包括根據權利要求I至25和28至41中任意一項所述的經分離的結合成員、或根據權利要求26、27和42至51中任意一項所述的抗體分子，在通過治療對人類和動物體進行治療的方法中的應用。
56.根據權利要求55的組合物，在治療與hCMV相關的紊亂中的應用。
57.一種組合物，包括根據權利要求I至25和28至41中任意一項所述的經分離的結合成員、或根據權利要求26、27和42至51中任意一項所述的抗體分子，在治療與hCMV相關的紊亂中的應用。
58.根據權利要求56所述的組合物或根據權利要求57所述的應用，其中所述紊亂是hCMV感染。
59.根據權利要求55至58中任意一項所述的組合物，進一步包括結合hCMVgB、gH、gL、UL128、UL130和/或UL131A蛋白質的經分離的結合成員或抗體分子。
60.一種治療個體與hCMV相關的紊亂的方法，包括向所述個體給予根據權利要求I至25和28至41中任意一項所述的結合成員、或根據權利要求26、27和42至51中任意一項所述的抗體分子，並優選其中所述個體具有缺乏抵抗力的免疫系統。
61.根據權利要求60所述的方法，其中，所述個體是孕婦、新生兒，移植接受者或感染HIV的個體。
62.—種經分離的核酸分子,包括編碼根據權利要求I至25和28至41中任意一項所述的結合成員、根據權利要求52所述的Vh區、根據權利要求53所述的\區、或根據權利要求26、27和42至51中任意一項所述的抗體分子的核苷酸序列。
63.一種用根據權利要求62所述的核酸分子在體外轉染或轉導的宿主細胞。
64.一種產生結合成員、抗體分子或抗體Vh或\區的方法，包括在產生所述結合成員、抗體分子或抗體Vh或\區的條件下培養根據權利要求63的宿主細胞。
65.根據權利要求64所述的方法，其中，進一步包括分離和/或純化所述結合成員、抗體分子、Vh區或'區。
66.根據權利要求64或權利要求65的方法，進一步包括將所述結合成員、抗體分子、Vh區或\區配製成包括至少一種另外組分的組合物。
67.一種用於產生針對hCMV抗體的抗原結合區的方法，所述方法包括，通過在包括HCDR1,HCDR2和HCDR3的母體Vh區的胺基酸序列中增加、缺失、替換或插入一個或多個胺基酸，其中，所述母體Vh區HCDR1、HCDR2和HCDR3是在表19中顯示的一組HCDR，提供Vh區，其為母體Vh區的胺基酸序列變異體，以及可選地結合Vh區從而與一個或多個\區一起提供，以提供一種或多種VH/VL組合體；並且測試所述Vh區，其為母體Vh區或VH/VL的一種組合體或多種組合物以鑑定針對hCMV的抗體抗原結合區。
68.根據權利要求67所述的方法，其中所述一種或多種\區通過在包括LCDRl、LCDR2和LCDR3的母體' 區的胺基酸序列中增加、缺失、替換或插入一個或多個胺基酸的方式提供，其中所述母體\區IXDRl、IXDR2和IXDR3是如表19所示的⑶R的\組，產生一個或多個\區，其中的每一個是所述母體\區的胺基酸序列變異體。
69.根據權利要求67或權利要求68的方法，其中所述Vh區通過⑶R誘變提供，所述Vh區是母體Vh區的胺基酸序列變異體。
70.根據任何權利要求67至69所述的方法，進一步包括以組分IgG、scFv、Fab或雙特異性抗體分子或多特異性抗體產生抗體抗原結合區。
71.一種用於產生結合hCMV的結合成員的方法，所述方法包括提供編碼Vh區的起始核酸或各自編碼Vh區的系列起始核酸，其中所述一個Vh區或多個Vh區包括編碼將要替換的HCDRl、HCDR2和/或HCDR3或缺少HCDRl、HCDR2和/或HCDR3編碼區；將所述起始核酸或起始系列核酸與編碼或由如表19所示的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3的胺基酸序列的變異體產生的一種供體核酸或多種供體核酸組合,使得所述一種供體核酸或多種供體核酸插入所述起始核酸或起始系列核酸的CDR1、CDR2和/或CDR3區，以便提供編碼Vh區的核酸的產物系列；表達所述產物系列的核酸以產生Vh區產物；可選地使所述VHg產物和一個或多個' 區結合；選擇針對hCMV的結合成員，所述結合成員包括Vh區產物或可選地' 區產物；並且回收所述結合成員或編碼它的核酸。
72.根據權利要求71所述的方法，其中所述供體核酸由所述HCDRl和/或HCDR2和/或HCDR3的突變產生。
73.根據權利要求72所述的方法，包括通過核酸的隨機突變提供所述供體核酸。
74.根據權利要求67至73中任意一項所述的方法，進一步包括附著Vh區產物，所述Vh區被包含在所述回收的結合成員到抗體恆定區內。
75.根據權利要求67到74中任意一項所述的方法，包括提供IgG、scFv、Fab或雙特異性抗體分子或多特異性抗體，其包括所述Vh區產物和\區產物。
76.根據權利要求67至75中任意一項所述的方法，進一步包括測試所述抗體抗原結合區或結合成員結合hCMV以中和hCMV的能力。
77.根據權利要求76所述的方法，其中，獲得包括結合和中和hCMV的抗體分子的結合成員。
78.一種中和對象或樣品中hCMV的方法，包括以有效量的、從約O. I至約5. O μ g/ml的濃度給予所述對象或樣品根據權利要求I至25和28至41中任意一項所述的結合成員、或根據權利要求26、27和42至51中任意一項所述的抗體分子，以降低hCMV感染至少50%。
全文摘要
本發明涉及結合成員，特別是抗體分子，其中和人類巨細胞病毒(hCMV)的生物效應。該結合成員可用於治療和預防hCMV感染。
文檔編號C07K16/08GK102892782SQ201080064592
公開日2013年1月23日 申請日期2010年12月22日 優先權日2009年12月23日
發明者烏爾夫·格拉文德爾, 麥可·馬赫, 路易斯·馬丁-帕拉, 索尼婭·珀奇, 納賈·施平德勒, 海因裡希·施蒂希特, 安娜-卡塔琳娜·維格斯, 託馬斯·溫克勒 申請人:4-抗體股份公司