抗成纖維細胞生長因子23的抗體的製作方法

2023-09-09 19:12:05 2

專利名稱：抗成纖維細胞生長因子23的抗體的製作方法
技術領域：
本發明涉及抗成纖維細胞生長因子-23(FGF-23)的抗體。
更具體地說，本發明涉及一些抗體，它們提供通過適當地檢測和測定FGF-23而診斷FGF-23蛋白在體內積累或降低所伴隨的疾病或病理狀態的方法，所述方法能夠通過阻遏FGF-23而改善或治療由FGF-23過量的作用導致的疾病的症狀或病理狀態，本發明同時涉及製備抗體的方法和利用抗體的方法。
背景技術：
成纖維細胞生長因子是首次作為刺激成纖維細胞系NIH3T3的物質從小牛的垂體純化的。然後，在各種組織中鑑定了類似的蛋白，一組這些物質形成了多肽家族(FGF家族)。至今，屬於FGF家族的22個類型的蛋白已經在脊椎動物中鑑定。關於這些類型的蛋白的生物學活性，不僅成纖維細胞生長刺激活性而且大範圍的作用也是已知的，如發育期間中胚層和神經外胚層的生長，血管發生，肢芽的形成。FGF家族成員是關於基因的表達位點和表達時間而變更的。在發育時期或成人中經常只在特定的位點表達其基因。作為編碼FGF受體的基因，至少有4個類型是已知的FGFR1，FGFR2，FGFR3和FGFR4。另外，已知在FGFR1，FGFR2和FGFR3中，由於拼接的不同，在受體蛋白的細胞外的結構域中的差異是獨立存在的。另外，已知肝素和類肝素(heparan)硫酸糖蛋白與FGF和FGF受體反應，以便調節其作用。另外，有許多蛋白由於其結構上的相似性屬於FGF家族，但它們的生物活性，它們的受體結合能力等等仍然幾乎是未知的。FGF家族的表徵已經如綜述所述完成(Ornitz，D.M.和Itoh N.，成纖維細胞生長因子，基因組生物學23005.1-3005.12，2001)。
FGF-23首先是通過資料庫檢索，利用它與FGF-15的同源性和PCR方法，從小鼠中克隆的，然後，利用它與小鼠FGF-23的序列同源性來複製人FGF-23(Yamashita T.，Yoshioka M.，和Itoh N.，新成纖維細胞生長因子FGF-23的鑑定，其在腦的腹側丘腦核中優先表達，Biochem.Biophy.Res.Commun.，277494-498，2000)。隨後，根據對常染色體顯性的低磷酸鹽血症性(hypophosphatemic)佝僂病/骨軟化症(下文中稱為ADHR)的研究，在ADHR患者的FGF-23基因中特徵性地發現錯義突變，同時使ADHR患者中突變基因的區域變窄並且鑑定了致病基因(ADHR協會，常染色體顯性低磷酸鹽血症性佝僂病是與FGF-23的突變相關的，Nature Genet.26345-348，2000)。這一發現明顯地表明了體內FGF-23的生理重要性。但是，FGF-23的生物學活性仍然是未知的。同時，通過對腫瘤誘導的骨軟化症的研究已經確定了FGF-23的生物活性。可以認為，在這一疾病中，與疾病有關的腫瘤產生了並且分泌了誘導疾病的體液因子，並且通過這一因子的作用，發生了疾病，如低磷酸鹽血症(hypophosphatemia)或軟骨病。
在尋找這樣的致病腫瘤產生的疾病誘導因子中，FGF-23已經作為腫瘤中高水平表達的基因來克隆。另外，已經顯示，通過施用這一因子，再現了(reproduced)低磷酸鹽血症和骨軟化症(Shimada T.，Mizutani S.，Muto T.，Yoneya T.，Hino R.，Takeda S，Takeuchi Y.，FujitaT.，Fukumoto S和Yamashita T.，作為腫瘤誘導的骨軟化症的成因因子的FGF-23的克隆和表徵，美國國家科學院院刊986500-6505，2001)。這一研究顯示了FGF-23參與了與磷和鈣有關的體內代謝控制，並且表明，FGF-23作為系統性因子表現其作用，同時在體內循環。但是，表現FGF-23作用所需要的體內濃度和代謝並未被顯示，FGF-23的生理作用仍然大部分未知。另外，作為呈現臨床發現有類似症狀的疾病，與性連遺傳型(X-linked)低磷酸鹽血症性佝僂病是已知的。但是，還沒有發現發病過程中FGF-23的參與。除了ADHR和腫瘤誘導的骨軟化症，還沒有已知的疾病被證明是與FGF-23相關的。
通過顯示異常低水平的血磷和1α，25-二羥基維生素D(下文中稱為1，25D)以及腫瘤的發生可以表徵上面的腫瘤誘導的骨軟化症。該病症伴隨肌肉力量降低或骨軟化症，可以導致步行障礙或起立困難。在大多數情況中，導致(responsible)這一疾病的腫瘤是從間充質細胞(mesenchymal cells)派生的良性腫瘤。大多數致病腫瘤生長能力較弱，並且在隨訪中很少觀察到明顯的增大。另外，雖然觀察到了發病(morbidity)的進展，通常需要詳細的檢測如全身MRI掃描檢測來發現致病(responsible)腫瘤。因此，對於沒有給出明確診斷，或者作出由未知原因導致低磷酸鹽血症的一些情況，懷疑它們是腫瘤誘導的骨軟化症。目前，對腫瘤誘導的骨軟化症的唯一經證實的診斷方法是證明通過腫瘤切除術(tumorectomy)從疾病症狀中恢復。這是因為還沒有通過臨床實驗檢測腫瘤發生與疾病症狀的成因和效果關係的方法。在一些情況中，進行了完全與疾病症狀無關的非致病性腫瘤的去除。為了改進這些情況，人們期望開發臨床實驗的方法，從而可以進行腫瘤誘導的骨軟化症的差異(differential)診斷。
已經發現了FGF-23在體內具有控制磷代謝作用。已知具有控制磷代謝作用的甲狀旁腺激素和1，25D在鈣代謝而不是磷代謝的控制中起更重要的作用。主要控制磷代謝的分子還沒有發現，而FGF-23可以期望具有這樣的活性。同時，磷代謝和鈣代謝之間的密切關係在臨床上是已知的。特別是，關於骨組織的鈣化和病理異位鈣化，將兩者分開考慮是困難的。基於FGF-23在過量狀態時可誘導骨軟化症和其具有降低1，25D作用的事實，FGF-23不僅可能與磷的代謝有關，而且還可能廣泛地與控制鈣化和骨代謝有關。此外，在主要包括腸道、腎和骨組織的控制礦物質代謝的器官中的異常性疾病可能與FGF-23的過量積累和缺乏有關。人們期望發展一種測定體內FGF-23濃度的方法以利於了解上述疾病，以及對該疾病進行精確的治療。
從由過量FGF-23誘導的發病體中抑制或除掉FGF-23可以成為治療該疾病的一種方法。一種可能的方法是利用FGF-23的受體的拮抗物或者可結合FGF-23的物質來抑制配體-受體的相互作用，另外一種可能的方法是利用一種可結合FGF-23的物質除去FGF-23。然而，利用上述方法有選擇性地抑制或除去FGF-23的物質還未發現。
發明概述本發明的一個目的是提供可識別FGF-23的抗體，診斷方法，有效的治療方法，和利用所述抗體抵抗由FGF-23引發的疾病的預防方法。
為了達到上述目標，我們進行了大量的研究，目前該發明已經得到了一種抗體，該抗體可特異性識別並與FGF-23蛋白的部分結構相結合，並且我們發現利用該抗體可檢測FGF-23。
本發明如下(1)通過利用多肽免疫動物而得到的抗體，所述多肽包含如SEQID NO1所示的胺基酸序列，或包含從SEQ ID NO1所示的胺基酸序列中通過缺失、替代或添加一個或幾個胺基酸而衍生得到的胺基酸序列，並且所述抗體具有成纖維細胞生長因子-23的活性，具有控制磷酸鹽代謝或維生素D代謝的活性，並且如以下(a)、(b)或(c)所示(a)識別如SEQ ID NO1所示的介於第180位和第194位，或第237位和第251位胺基酸殘基之間的一段胺基酸序列的抗體；(b)由保藏號為FERM BP-7838，FERM BP-7839，FERM BP-7840，或FERM BP-8268的雜交瘤所產生的抗體；或(c)通過結合由SEQ ID NO1所示的胺基酸序列所組成的多肽，與保藏號為FERM BP-7838，FERM BP-7839，FERM BP-7840，或FERMBP-8268的雜交瘤所產生的抗體競爭的抗體。
(2)一種藥物組合物，其包含上述抗體作為活性成分。
本發明的藥物組合物包含一種可識別如SEQ ID NO1所示的介於第180位和第194位胺基酸殘基之間的胺基酸序列的抗體。本發明的藥物組合物可有效地抵抗至少一種下述的疾病腫瘤誘導骨軟化症，ADHR，XLH，腎性骨營養不良，透析性骨病，骨質疏鬆症，低磷酸鹽血症，佝僂病，骨軟化症，腎小管機能障礙，骨量減少，低鈣血症，骨延長障礙，骨鈣化障礙，甲狀旁腺功能亢進症，異位鈣化，搔癢，骨硬化，佩吉特氏病，高鈣血特發性綜合症，甲狀旁腺功能減退症，骨痛，肌力下降，骨骼畸形，發育不良，和低1，25D疾病(血液中1，25D低於某一水平的疾病)，並且能用於治療或預防這些疾病。
該藥物組合物包含一種藥劑，該藥劑利用上述抗體作為活性組分可促進骨的生成。
(3)一種檢測成纖維細胞生長因子-23的方法，包括使識別如SEQ ID NO1所示的介於第25位和第179位胺基酸殘基之間的部分胺基酸序列的抗體，和一種可識別如SEQ ID NO1所示的介於第180位和第251位胺基酸殘基之間的部分胺基酸序列的抗體，與測試樣品發生反應。
用於上述檢測方法中的識別如SEQ ID NO1所示的介於第180位和第251位胺基酸殘基之間的部分胺基酸序列的抗體是一種識別如SEQ ID NO1所示的介於第180和第196位胺基酸殘基之間的胺基酸序列的抗體。此外，本發明的檢測方法中也使用了一種凝血酶抑制劑。
(4)一種檢測成纖維細胞生長因子-23的試劑盒，它包含識別如SEQ ID NO1所示介於第25位和第179位胺基酸殘基之間的部分胺基酸序列的抗體，和識別如SEQ ID NO1所示介於第180位和第251位胺基酸殘基之間的部分胺基酸序列的抗體。
本發明的試劑盒包含識別如SEQ ID NO1所示胺基酸殘基中的介於第180位和第196位之間的胺基酸序列的抗體，作為識別如SEQ IDNO1所示胺基酸殘基中的介於第180位和第251位之間的部分胺基酸序列的抗體。
(5)一種抗成纖維細胞生長因子-23抗體的結合物質，該物質至少結合一種選自上面的抗體。
(6)一種醫療器具，裝備有上述結合物質。本發明提供的這種醫療器具能用於除去血液中的成纖維細胞生長因子-23。
(7)一種藥物組合物，該藥物組合物包含至少2種如上所述的可識別不同位點的抗體作為活性成分。
本發明的詳細介紹如下已知FGF-23在致病腫瘤誘導的骨軟化症的腫瘤中可高水平地表達。當分泌FGF-23的細胞被實驗性地轉移進裸鼠的體內時，低磷酸鹽血症或者是骨軟化症就發生了，它們都是腫瘤誘導的骨軟化症的特徵疾病。因此，FGF-23被認為是腫瘤誘導骨軟化症的一種誘導劑。對產生常染色體顯性低磷酸鹽血症性佝僂病(ADHR)的基因的單獨探索和研究已經展開，ADHR是遺傳性低磷酸鹽血症的一種模式。因此，FGF-23被認為是其突變可在ADHR病人體內特別觀察到的基因。這些結果表明FGF-23是造成低磷酸鹽血症的一種致病因素。對FGF-23的生物學活性，在一種對小鼠施用重組體FGF-23的實驗中，證明了FGF-23可誘導低磷酸鹽血症。基於這些結果，可以假定FGF-23在體內起到了控制磷代謝和骨代謝的體液因子的作用。因此，定量的和定性地評價體內的FGF-23對理解和診斷疾病具有非常重要的意義。而且，期望控制FGF-23的生物學活性不僅能夠治癒低磷酸鹽血症(上面的描述已經說明了FGF-23與低磷酸鹽血症有關)，而且能夠控制磷的代謝和骨的代謝，還能夠應用到礦物質代謝異常、代謝性骨病等的治療上。
通過對本發明中的一些術語的說明來對本發明進行詳細描述。
在本發明的說明書和附圖中的單字母符號通常用於表示胺基酸，其表述如下(G)甘氨酸，(A)丙氨酸，(V)纈氨酸，(L)亮氨酸，(I)異亮氨酸，(S)絲氨酸，(T)蘇氨酸，(D)天門冬氨酸，(E)穀氨酸，(N)天門冬醯胺，(Q)穀氨醯胺，(K)賴氨酸，(R)精氨酸，(C)半胱氨酸，(M)甲硫氨酸，(F)苯基丙氨酸，(Y)酪氨酸，(W)色氨酸，(H)組氨酸，和(P)脯氨酸。另外，單字母符號的意義通常也用於表示DNA的構成物，表述如下(A)腺嘌呤，(C)胞嘧啶，(G)鳥嘌呤，和(T)胸腺嘧啶。
活性控制磷酸鹽(activity controlling phosphate)指的是血液中活性控制磷酸鹽濃度。
活性控制維生素D代謝(activity controlling vitamin D metabolism)的是指存在於體內的維生素D和在體內利用維生素D合成的代謝物的絕對水平的變化，或者是指控制維生素D存在率變化的潛能。
1.抗體識別FGF-23在本發明中所用的人類FGF-23是一種具有如下面描述的胺基酸序列(SEQ ID NO1)，並且具有上面所述的特性(活性)的多肽。此外，本發明中的FGF-23和它的一部分包含一種人類FGF-23的衍生物(該衍生物在一級結構方面與天然類型的FGF-23具有基本上相同的胺基酸序列)，和人類FGF-23的衍生物的一部分，只要是在本發明中後面所描述的抗體具有反應活性。
這裡，「具有基本上相同胺基酸序列的人類FGF-23衍生物」這一術語指的是一種具有通過替代，缺失和/或修飾一個或幾個胺基酸而衍生得到的胺基酸序列的蛋白，條件是該蛋白具有與天然類型的人類FGF-23基本上相同的特性(活性)。而且，多個替代、缺失、修飾和添加可結合使用。人類FGF-23的活性指的是能夠誘導類似於上述情況的低磷酸鹽血症或骨軟化症的活性。
本發明的人類FGF-23可以用本領域已知的方法適當地製備，比如，除基因重組技術外，有化學合成方法，細胞培養方法，或這些方法的改進方法。而且，人類FGF-23的一部分序列也能夠利用基因重組技術，或按照如下描述的技術領域中一種已知的方法，如化學合成的方法，或這些方法的改進方法來製備，或者可利用蛋白水解酶適當地切割通過細胞培養方法分離的人類FGF-23的方法來製備。
本發明中的抗體是一種對上面所定義的人類FGF-23或其一部分具有反應活性的抗體，或是這種抗體的一部分。本發明的抗體包括單克隆抗體，該單克隆抗體包含重鏈和/或輕鏈，其胺基酸序列通過一個或幾個胺基酸的缺失、替代或添加衍生於組成抗體的每一條重鏈和/或輕鏈的胺基酸序列，並且可與FGF-23相結合。上面描述的胺基酸的部分變化(缺失，替代，插入和添加)能通過部分改變編碼胺基酸序列的核苷酸序列被引入到人類FGF-23的胺基酸序列或本發明的抗體中。用於這些變化的技術對本領域技術人員是已知，並且可使用用於引入突變等的商業化試劑盒。
(1)能特異性識別並能與FGF-23蛋白部分結構結合的抗體為了獲得一種用於測定FGF-23和控制FGF-23的生物學活性的抗體，獲得可識別FGF-23結構特徵的抗體，對FGF-23有高度的親和力的抗體，能中和生物活性的抗體等等是有效的。由於FGF-23的結構和抗原性是未知的，所以合成了相應於FGF-23部分序列的許多肽，並且得到了針對每一種肽的抗體。利用這些抗體通過Western印跡法測定了由表達細胞分泌的FGF-23，揭示了表達細胞培養物上清液中除成熟的FGF-23蛋白外，包含大量低分子量的肽，這些肽是由FGF-23蛋白衍生得到的。而且，所獲得的抗體表現出了抵抗成熟的FGF-23和由成熟的FGF-23切割產生的肽的各種結合特異性。
此外，利用免疫沉澱方法發現了該抗體在液相中的結合活性。而且，聯合使用這些位點特異性抗體使得對從FGF-23中衍生得到的各種各樣的肽中檢測出具有特定序列區域的肽成為可能。關於FGF-23的修飾和代謝的細節仍然未知。我們通過利用本發明的各種抗體進行檢測實驗，證明了當FGF-23在CHO細胞中表達時，不僅存在沒有信號序列的全長蛋白，而且存在由於第179位精氨酸殘基和第180位絲氨酸殘基之間切割產生的代謝產物。除此以外，通過採集血漿的血樣和含有FGF-23的血清的血樣，和檢測代謝物的實驗，以及將純化後的重組體與血清混合的實驗，我們還揭示了雖然FGF-23在血漿中以全長形式存在，在血清中，FGF-23的第196位精氨酸殘基和第197位丙氨酸殘基之間會發生切割。這可能是由於凝血酶的原因，切割也在第198位精氨酸和第199位甲硫氨酸之間發生。
(2)抗體的產生作為例子，通過下面的生產方法可以產生本發明的抗體。具體地說，例如，對一種非人類的哺乳動物，例如產生人抗體的轉基因小鼠，利用結合上面定義的人FGF-23或其一部分的產物，或它們與適當的物質(例如，小牛血清白蛋白)的結合複合物進行免疫，來增強抗原以及佐劑(如果需要的話，例如費氏佐劑)的抗原性。或者，通過施用其中摻入了FGF-23的表達載體進行免疫。從免疫動物得到的血清可以得到多克隆抗體。此外，單克隆抗體能夠通過下述過程產生從由被免疫的動物獲得的產生抗體的細胞，和不能自身產生抗體的骨髓瘤細胞製備雜交瘤，克隆這些雜交瘤，並且篩選產生對免疫所用抗原有特異親和性的單克隆抗體的克隆。
更具體地說，單克隆抗體可利用下面描述的方法來進行生產。分泌的單克隆抗體的雜交瘤可通過並按照Khler和Milstein等人的方法(Nature，1975，256卷，495-497)來製備。具體地說，雜交瘤是通過融合如上所述被免疫的動物的脾臟、淋巴結、骨髓、扁桃體，優選淋巴結或脾臟中包含的抗體產生細胞，和不能生產優選來源於哺乳動物，如小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔子或者人的抗體的骨髓瘤細胞來製備。篩選產生單克隆抗體的雜交瘤克隆可通過例如在微量滴定平板裡培養雜交瘤，在培養物的上清液裡檢測其對免疫原的反應活性，其中利用酶免疫測定方法，比如酶聯免疫特異性測定(ELISA)觀察到其生長。
單克隆抗體能從雜交瘤中產生，方法是體外培養雜交瘤並且從培養上清中分離抗體，或體內培養雜交瘤，例如在小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠或者兔子的腹水中進行培養，然後從腹水中分離抗體。
另外，重組抗體可以通過以下方法製備從一種抗體生產細胞，比如雜交瘤中克隆編碼人類單克隆抗體的基因，將該基因整合到合適的載體上，再將載體引入到宿主(例如，哺乳動物細胞系，大腸桿菌，酵母細胞，昆蟲細胞和植物細胞)中，然後利用基因重組技術生成抗體(P.J.Delves，抗體生產基本技術，1997 WILEY；P Shepherd和CDean，單克隆抗體，2000年，牛津大學出版社，J.W.Goding，單克隆抗體，原理和應用，1993學術出版社)。而且，利用轉基因動物生產技術將一靶抗體基因整合到內源基因上，從而產生轉基因牛，山羊，綿羊或豬，然後可由轉基因動物的乳汁中大量獲得抗體基因衍生出的單克隆抗體。當在體外培養雜交瘤時，可以依照各種各樣的條件進行培養，這些條件包括待培養細胞類型的特性，實驗和研究的目的，培養方法等等，可以利用已知類型的營養培養基生長、維持和貯藏雜交瘤，所述營養培養基可以用於在培養物上清液中產生單克隆抗體，或是從已知的基本培養基中誘導和製備的任何類型的營養培養基。
關於本發明的多克隆抗體，如實施例5所示，將一種化學合成的FGF-23的部分肽與一種牛甲狀腺球蛋白(載體蛋白)相結合，再利用該產物對兔子免疫。然後利用親和層析柱對這種抗體(該抗體通過免疫接種已誘導其抵抗各種肽的作用)進行純化，用於免疫接種的肽已經被固定化在層析柱上。這樣得到的抗體的特性通過Western印跡法和ELISA方法進行了檢測，可以清楚地得到其抵抗FGF-23蛋白的反應活性。
關於製備本發明的單克隆抗體，可以通過兩種方法進行免疫接種，如實施例3所示。對這樣獲得的雜交瘤產生出的單克隆抗體的特性，即，抵抗固定化的FGF-23部分肽的反應活性(如實施例9所示)，在免疫沉澱實驗中抵抗FGF-23蛋白的反應活性(如實施例10所示)，進行了測定，以便揭示每一種抗體同FGF-23的結合特性和識別位點的專一性。
2.檢測FGF-23的方法(1)從生物學樣品中定量檢測和鑑別FGF-23與其代謝產物在臨床試驗中，必須對生物學樣品中的FGF-23的活性進行精確測定。然而，由FGF-23生成的FGF-23蛋白的切割或由血樣製備的FGF-23蛋白的切割產生的片段化產物(這些我們已經觀察到)，可能是妨礙FGF-23的測定的因素。具體地說，我們的試驗已表明，如SEQ ID NO1所示的介於第179位和第180位胺基酸殘基之間的切割導致了活性的喪失。因此，為了檢測在生物學樣品中具有活性的FGF-23，利用一種可識別如SEQ ID NO1所示的介於第25位和第179位胺基酸殘基之間的部分胺基酸序列的抗體和一種可識別如SEQ IDNO1所示的介於第180位和第251位胺基酸殘基之間的胺基酸序列的抗體的組合的夾心式(sandwich)ELISA方法是有效的。這種檢測方法能夠通過將2C3B抗體或2C5L抗體(我們已經得到了這種N-末端識別抗體)與3C1E抗體或1D6A抗體(C-末端識別抗體)相結合來進行(見圖5)。而且，當利用血清樣品製備血樣時，存在於血中的全長FGF-23在介於第196位和第197位胺基酸殘基之間或介於第198位和第199位胺基酸殘基之間的位置可能發生切割。在這一情況下，當使用一種可識別位於C-末端上的第197位和該位置後的胺基酸殘基部分的抗體時，利用這種方法不能對反映存在於血液中的這種蛋白的原始量進行測定。由於即使使用了血清樣品，在血漿中也不能觀察到這種切割(見實施例26)，而如利用我們所得到的可以識別處於第180位和第196位胺基酸殘基之間的一個位點的3C1E抗體，作為識別C-末端的抗體，可以使得測定反映存在於血液中的蛋白的原始量的方法成為可能。
另外，在製備一個血清樣品時，凝血酶被證明是一種可以切割FGF-23的酶(見實施例17)。因此，在製備血清樣品時，通過加入凝血酶抑制劑，可避免檢測中的FGF-23的切割產生的效果，使得抑制伴隨血清樣品的製備的FGF-23的大部分切割是可能的。凝血酶抑制劑可以是任何不妨礙FGF-23檢測的物質，並且優選是水蛭素。
而且，本申請涉及檢測FGF-23的試劑盒，該試劑盒含有一種可識別如SEQ ID NO1所示的介於第25位和第179位胺基酸殘基之間的胺基酸序列的一部分的抗體和一種可識別如SEQ ID NO1所示的介於第180位和第251位胺基酸殘基之間的胺基酸序列的一部分的抗體。本申請中檢測FGF-23的試劑盒中除了包括抗FGF-23抗體之外，如有必要的話，還可包括穩定劑、pH調節劑等。
(2)高靈敏度檢測FGF-23的方法闡明FGF-23的體內作用和發病率之間的關係在臨床上是有意義的，並且對腫瘤誘導骨軟化症的差異診斷和遺傳性低磷酸鹽血症佝僂病(ADHR，XLH性連遺傳型低磷酸鹽血症佝僂病)的診斷也是有意義的。低磷酸鹽血症，佝僂病，和骨軟化症，對已證實沒有營養不良和家族病史的病人來說，是不能夠確定病因的疾病，因此對該疾病的診斷在目前很困難。只有檢測到上述患者血液中FGF-23的濃度升高時，才有可能基於基因突變的確認，通過遺傳性疾病的差異診斷，或者利用一種檢測腫瘤的詳細方法來發現腫瘤，使擬定治療腫瘤誘導的骨軟化症的治療方案成為可能。而且，由於FGF-23作為一種控制磷代謝的因子和/或控制維生素D代謝的因子可能與生物功能緊密相關，因此認為血液濃度在礦物質代謝異常，腎功能障礙，骨代謝疾病等的病症中是波動的。因此，將健康的成年人血液中FGF-23濃度的平均值同患有上述疾病的患者體內血液中FGF-23濃度的平均值相比，對於我們了解發病原因，選擇治療方法，和確定治療方案是有意義的。為了構建這樣一種FGF-23的測定系統，需要能夠對血液中FGF-23濃度進行檢測的檢測靈敏度。我們已經利用夾心式ELISA方法檢測了我們所得到的各種各樣的抗體組合，使得我們能夠定量測定健康的人體血液中和患有上述疾病的患者的血液中的FGF-23的濃度。
利用抗體檢測能夠被抗體識別的物質(指的是一種抗原分子)的方法的實例，包括利用抗體與抗原分子相結合來採集達到可檢測數量的底物的方法，通過檢測與待測抗原分子特異性結合的抗體來檢測抗原分子存在的方法，和通過檢測待測抗原分子與已知數量的底物和抗體特異性結合之間的競爭來測定抗原分子的存在的方法。利用Western印跡方法，免疫沉澱方法，和免疫染色法可進行定性測定。而且，已知的定量檢測方法的實例包括放射免疫法，ELISA法，螢光激活細胞分類法(FACS)等。當被修飾或切割時，被抗體識別的抗原可以為多種形式。作為一種包括使其中的一部分形式專一化的檢測方法，將可識別靶物質不同位點的抗體進行組合是有效的。這種方法的代表性例子是夾心式ELISA法。
基於本發明檢測FGF-23的方法的完成，在

圖1A中明確地表示了由於FGF-23蛋白的切割而導致產生許多分子物種(species)。尤其是，實施例16所示表明，FGF-23在血液中以全長蛋白的形式存在，而在血清中被切割。正因為如此，考慮到這種切割，為了在體內定量和精確地檢測FGF-23，有必要發展一種檢測系統。為達到這一目的，組合使用可識別FGF-23蛋白部分序列的上述抗體被證明非常有用。關於利用多克隆抗體的ELISA技術，如實施例7所示，表明FGF-23蛋白和其已切割的片段是可以選擇性地測定的。另外，關於實施例3和實施例4中得到的抗FGF-23的單克隆抗體，其對FGF-23蛋白上的識別位點的專一性被分析了，證明了其與FGF-23結合的特性可應用於夾心式ELISA技術。實驗揭示了在獲得的抗體中，1D6A抗體，2C3B抗體，和3C1E抗體均可獨立作為固定化的抗體，並也能被當作檢測用的抗體。另一方面，2A2B抗體不適於任何這樣的用途。而且，實驗表明，在體內和在製備血清時FGF-23蛋白均可被切割。通過組合使用可分別識別如SEQ ID NO1所示的FGF-23蛋白中的介於第25位和第179位胺基酸之間的一段序列的抗體，識別介於第180位和第196位胺基酸之間的一段序列的抗體，和識別介於第197位和第251位胺基酸之間的一段序列的抗體，可以實現FGF-23蛋白的代謝物的檢測和測定。在本發明的抗體中，2C3B抗體可識別如SEQ IDNO1所示的FGF-23蛋白中的介於第25位和第179位胺基酸之間的一段序列，3C1E抗體可識別如SEQ ID NO1所示的介於第180位和第196位胺基酸之間的一段序列。1D6A抗體可識別如SEQ ID NO1所示的介於第237位和第251位胺基酸之間的一段序列。需要特別指出的是，為了臨床實驗等目的而檢測具有活性的FGF-23蛋白，根據製備血清時出現的切割現象，最好使用可識別介於第25位和第179位胺基酸之間的一段序列的抗體和可識別介於第180位和第196位胺基酸之間的一段序列的抗體的組合。特別地，利用2C3B抗體或者2C5L抗體作為固定化抗體，用3C1E作為檢測抗體，可以實現高靈敏度的檢測系統。而且，為了檢測全長FGF-23蛋白，最好使用可識別介於第25位和第179位胺基酸之間的一段序列的抗體和可識別介於第237位和第251位胺基酸之間的一段序列的抗體的組合。尤其是，利用2C3B抗體作為固定化抗體，1D6A抗體作為檢測抗體，可實現高靈敏度的檢測系統。
3.低磷酸鹽血症，佝僂病和骨軟化症的診斷方法已有人提出，在ADHR病人中，FGF-23基因的錯義突變參與了低磷酸鹽血症的誘導(ADHR協會，常染色體顯性的低磷酸鹽血症佝僂病與FGF23突變有關，Nature Genet.26345-348，2000)。另外，我們已經鑑定FGF-23是一種疾病誘導因子，從而在腫瘤誘導的骨軟化症中會產生腫瘤(Shimada T，Mizutani S，Muto T，Yoneya T，Hino R，Takeda S，Takeuchi Y，Fujita T，Fukumoto S，和Yamashita T.，對作為腫瘤誘導的骨軟化症的致病因子的FGF23的克隆與表徵，美國國家科學院院刊，986500-6505，2001)。這些研究表明FGF-23可能參與了低磷酸鹽血症、佝僂病和骨軟化症伴隨的疾病。但是，尚未有在活的生物體中定量分析FGF-23的方法。在本發明中，我們已經建立了如上所述的特異性FGF-23檢測系統。如實施例19中所示利用這種系統，可以定量測定腫瘤切除之前和腫瘤切除後從患有腫瘤誘導的骨軟化症的患者中採集到的血樣中所含的FGF-23。如圖14B所顯示的，雖然手術前表現出明顯高的血液FGF-23水平，但是腫瘤切除之後，血液中FGF-23的濃度降低至近檢測極限值。在腫瘤誘導的骨軟化症中，腫瘤一般較小，雖然諸如低磷酸鹽血症，肌力下降，骨痛，或者骨軟化症的病症顯現出來，但是沒有發現致病性腫瘤。除此之外，當腫瘤被觀察到時，不可能確定腫瘤是否產生FGF-23，以至於區分腫瘤誘導的骨軟化症和表現出相似症狀的其它血磷酸鹽過少疾病的診斷是非常困難的。本發明中的測定方法使得從腫瘤誘導的骨軟化症患者的血液中檢測出FGF-23的增長值成為可能，因此就能夠對一些用傳統方法檢測不出來的疾病進行診斷。
XLH，一種在遺傳性低磷酸鹽血症患者中發病率最高的疾病，據說每兩萬人中就有大約1例。造成XLH疾病的基因被鑑定為PHEX基因。該基因包含22個外顯子，基因區跨越220個kb，使得目前分析導致這種遺傳性低磷酸鹽血症的突變來用於診斷的目的還不可能。該疾病發生突然，並且以在成人中發病為特徵的類型已經有過報導。迄今為止，PHEX基因和FGF-23的關係尚未澄清。一種Hyp小鼠是已知的，它是一種自發性突變的小鼠，可作為XLH的模型動物。在這種小鼠中，已證實PHEX基因的3』區缺失，並且已知該小鼠會發展成低磷酸鹽血症，佝僂病或骨軟化症。利用本發明中的測定系統，如實施例23所示，我們測定了Hyp小鼠中FGF-23的血液濃度，發現其中FGF-23的濃度非常高。
相應於此，本發明的抗體，和利用該抗體的檢測方法或測定方法使得能夠診斷腫瘤誘導的骨軟化症和XLH。另外，應該考慮本發明中的測定方法也可用於ADHR，該疾病是低磷酸鹽血症的另一種形式，可能是由於FGF-23中的變異引起。
FGF-23具有降低血液中的磷濃度和1，25D濃度的活性。但是，其生理作用尚未得到很好的解釋。通過後面所述的中和FGF-23活性的實驗，我們發現，即使是在正常的情況下，FGF-23在維持磷或1，25D的代謝平衡中發揮了重要的作用。因此，FGF-23可能參與了磷代謝，並參與了腎臟疾病、腸道疾病、礦物質代謝紊亂和維生素D代謝異常的疾病的發生，這些疾病與磷代謝密切相關。而且，給病人施用1，25D或它的一種衍生物，FGF-23的波動可能影響發病和治療效果。本發明中的測定系統被認為可以加深人們對於這些疾病發病的理解並完成了更為精確的醫療實踐。
4.以抑制FGF-23活性為特徵的疾病治療方法已知，在腫瘤誘導的骨軟化症和ADHR中，FGF-23的過度作用誘導了這些疾病。另外，在本發明中，我們也揭示了在XLH疾病中，血液中具有高水平的FGF-23。人們認為抑制FGF-23可改善低磷酸鹽血症，佝僂病和骨軟化症。根據FGF-23作用於腎臟的近端小管的上皮細胞的事實，抑制FGF-23可能對治療腎小管功能紊亂有意義。另外，根據FGF-23在控制磷代謝和維生素D代謝中的作用，FGF-23在與磷代謝異常有關的疾病，與鈣代謝異常有關的疾病，與骨代謝異常有關的疾病，伴隨腎功能下降的代謝異常疾病，伴隨著給腎衰竭病人進行血液透析時的代謝異常疾病，和伴隨腎移植過程的疾病中可能發揮了不利的作用。與此類似，有報導說低磷酸鹽血症在腎移植後有高發病率，該疾病伴隨著骨量減少的症狀，表明FGF-23也在其中發揮了作用。在這些病例中，不但要將FGF-23從異常提高的水平恢復至正常水平，還需要進一步降低正常值的FGF-23作為藥理治療手段。我們認為實施例27和實施例28中所顯示能夠中和或者是修飾FGF-23活性的抗體對治療各種疾病是具有重要意義的。如實施例25所示，我們發現由於腎功能的下降而出現高磷酸鹽血症的動物具有明顯高的FGF-23水平。據認為伴隨著腎功能下降的維生素D代謝異常疾病至少一部分是由於FGF-23水平升高引起的。另外我們也認為伴隨FGF-23水平異常升高的疾病能夠利用本發明的抗體通過中和或除去FGF-23的活性來治療。需要指出的是，由於磷的代謝，鈣的代謝，和維生素D的代謝通過利用本發明的抗體進行了改善，這些抗體在抵抗伴隨著礦物質代謝異常的疾病，例如低血鈣症，甲狀旁腺功能亢進，異位鈣化，和搔癢，或者是伴隨著腎功能下降的骨代謝異常疾病，例如腎性骨營養不良，和透析性骨病方面可能是有療效的。而且，利用本發明的抗體在治療伴隨著鈣化的心血管機能減退疾病(該疾病是困擾血液透析病人的疾病)方面也可能是有療效的。此外，如實施例27所示，揭示了即使在正常的代謝條件下，FGF-23在礦物質代謝和維生素D代謝中也發揮了非常重要的作用。考慮到FGF-23不僅可誘導高磷酸鹽血症的事實，而且考慮到FGF-23可以快速的降低1，25D和通過1，25D可快速誘導FGF-23的事實，本發明的能中和或修飾FGF-23活性的抗體在抵抗礦物質代謝異常的疾病方面可能得到廣泛的應用。這是因為該抗體通過抑制FGF-23的作用不僅控制磷的代謝，維生素D的代謝和鈣的代謝，而且間接地控制用於鈣代謝的激素，例如甲狀旁腺激素和降血鈣素。尤其是，本發明的抗體有望在治療有與礦物質代謝和代謝轉換平衡有關各種各樣的發病形式的骨質疏鬆症、骨量減少症、骨硬化症或佩吉特氏病中發揮作用。正如上面所描述的那樣，本發明的抗體可抵抗上面所述的一種或多種疾病。
5.中和FGF-23生物學活性的抗體如上面所描述的那樣，FGF-23被認為具有控制活體代謝的重要作用。控制這樣的因子的生物學活性的方法對於治療和預防各種疾病是有意義的。抗體的特徵在於可與抗原分子特異性結合，並已知依賴於其識別位點，其對抗原分子結構和功能有影響。因此，我們以分離和鑑定一種可控制FGF-23功能，特別是，能夠抑制FGF-23的生物學活性的抗體為目標。如實施例27和實施例28所示，我們已經發現將一種可識別FGF-23的抗體進行給藥後導致了血清中磷的濃度和血清中1，25D濃度的升高。特別是，在這些實施例中使用的本發明的抗體導致人類FGF-23的降低血清磷和1，25D的活性完全消失，所述人類FGF-23是在小鼠體內實驗性地產生的。另外，在還沒有產生人類FGF-23的對照小鼠中，證實了血清中的磷和維生素D的水平升高。這一現象與施用FGF-23時觀察到的變化完全相反。因此，本發明的這種抗體也被認為能抑制小鼠的內源性FGF-23。另外，這一現象表明，FGF-23作為控制磷代謝和維生素D代謝的因子，不僅在致病狀態中，而且在正常狀態中可以起作用。本發明的具有能導致FGF-23的生物學活性消失或弱化的抗體能控制生理學狀況和病理學病症，這些病症是FGF-23生物學活性的反應。本發明的抗體能夠控制的FGF-23生物學活性的範圍不僅僅局限於磷代謝和維生素D的代謝。該抗體能控制FGF-23的每一種生物學活性和生理學活性。
此外，如實施例31所示，可利用識別FGF-23不同位點的兩種或多種類型的抗體，即不同的抗原決定部位。在這一情況下，抗體的中和活性被提高了，這樣抗體的作用時間也能夠維持一段較長的時間。兩種或多種類型抗體組合的實例，包括可識別如SEQ ID NO1所示的介於第180位和第194位或介於第237位和第251位胺基酸殘基之間的胺基酸序列的抗體，和通過雜交瘤產生的抗體，所述雜交瘤的保藏號是FERM BP-7838，FERM BP-7839，FERM BP-7840，或FERMBP-8268。
6.包含抗FGF-23抗體的藥物組合物本發明的抗體或者是藥物組合物能應用於由FGF-23在體內產生的或涉及細胞表達FGF-23的各種疾病或症狀的治療或預防上。本發明的抗體能用於抵抗腫瘤誘導的骨軟化症、ADHR和XLH的藥物組合物，並且可望在改善一般在低磷酸鹽血症，骨鈣化功能障礙，骨痛，肌力下降，骨骼畸形，發育不良，和低1，25D症(血液中1，25D水平低)等疾病中觀察到的病症方面起作用。正如上面所描述的，FGF-23在生理狀況方面發揮了重要的作用。本發明的抗體能作為一種用於治療和預防由礦物質或維生素D代謝異常引起的疾病(例如骨質疏鬆症，佝僂病，高鈣血特發性綜合症，低鈣血症，異位鈣化，骨硬化，骨生長障礙，骨鈣化機能障礙，佩吉特氏病，甲狀旁腺功能亢進症，甲狀旁腺功能減退症，和搔癢)的藥物組合物，所述治療和預防是通過控制FGF-23的磷代謝控制作用，或由FGF-23控制的由維生素D的代謝介導的鈣代謝控制作用而實現的。而且，對患有腎功能衰竭的患者來說，其血液中FGF-23的濃度升高是明確的。因此，本發明的抗體能作為藥物組合物用於治療和預防腎功能衰竭或血液透析的併發症，該併發症表現為腎性骨營養不良、透析性骨病、腎小管機能障礙等。
另外，本發明的抗體結合一種治療劑後能用作藥物組合物。在腫瘤誘導的骨軟化症中，已知由於腫瘤過多地產生FGF-23，誘發病症。目前，唯一的治療方法包括除掉致病腫瘤。然而，致病腫瘤通常很小。已經有許多研究報導了致病腫瘤最終被高能磁共振成像(MRI)搜索發現的實例。除此以外，還可能有許多因為沒有發現腫瘤，而未知致病原因的低磷酸鹽血症或骨軟化症的診斷實例。本發明的抗體被認為能在這樣的疾病中在產生FGF-23的腫瘤中積累，這是由於與FGF-23的親和性。作為一種利用上述特性來退變(degenerating)腫瘤的方法，將治療劑同本發明的抗體相結合是有效的。能與抗體結合的治療劑的示例有(1)放射性同位素，例如碘(131碘131I；125碘125I)，釔(90釔90Y)，銦(111銦111In)，和鎝(99m鎝99mTc)(J.W.Goding，單克隆抗體原理和應用，1993學術出版社)，(2)細菌毒素，例如假單胞菌毒素(假單胞菌外毒素)、白喉毒素和蓖麻毒素，和(3)化學治療劑，例如氨甲蝶呤、絲裂黴素和加利車黴素(calicheamicin)(D.J.King，單克隆抗體應用和工程化，1998 T.J.International Ltd，M.L.Grossbard.，基於單克隆抗體治療癌症，1998 Marcel Dekker Inc)。更優選地，藥物前體，例如美登木素生物鹼是比較好的選擇(Chari et al.，Cancer Res.，1992 52卷，Liu等，美國國家科學院院刊，1996，193卷8681)。
此外，本發明的範圍也包括一種藥物製劑，其包含抗人類FGF-23抗體的純化產物。這樣的藥物製劑除了包含抗體外，優選包含生理學相容的稀釋劑或載體，並且可以是混合了其它抗體或者是其它藥物(例如抗菌素)的產品。合適載體的例子包括，但不局限於，生理鹽水，磷酸鹽緩衝鹽水，磷酸鹽緩衝鹽水葡萄糖溶液，和緩衝生理鹽水。抗體可以冷凍並乾燥(冷凍乾燥)，如果需要，上述的緩衝含水溶液可以加到抗體中，這樣可以重建和利用該抗體。服藥的方法可以是口服或者是非腸道吸收給藥方法，包括靜脈、肌肉、皮下和腹膜注射或者是藥物遞送。
當利用本發明的藥物組合物對病人進行給藥時，每次給藥的有效劑量可以選自每千克體重施用介於20ng和200mg之間的劑量。或者，每位病人按體重施用劑量介於0.001到10000mg之間，優選0.005到2000mg之間，更優選0.01至1000mg之間。然而，本發明的藥物組合物的劑量並不局限於上述劑量。
7.包含抗FGF-23抗體的醫療器具(medical appliance)在血液透析、血漿交換和細胞採集這樣的醫療技術中，將活體中的物質從一部分採集到的體液或參與體外循環的體液中除掉、交換、採集。在這樣的醫療技術中，可利用本發明的抗體特異性結合FGF-23分子的特性，選擇性地除掉活體中的FGF-23分子並選擇性地採集表達FGF-23的細胞。在血液透析和血漿交換中，有潛力的治療方法包括將本發明的抗體固定到與體液接觸的部分物質上。作為透析膜的材料，除了纖維素膜以外，合成的聚合物膜，例如聚丙烯腈膜，聚甲基丙烯酸甲酯膜，聚乙烯-乙烯醇膜，聚碸膜，聚醯胺膜，聚醚碸/聚多芳基化合物膜等都可作為血液透析膜使用。對於這樣的膜，將抗體通過共價鍵固定在膜上後，可用於血液透析。而且，可以用填充有結合了抗體的珠子(例如瓊脂糖凝膠珠)的柱子分離體液。此外，另一種可能的方法包括將抗體固定在磁性珠上，將該抗體和抗體結合分子混合以提高其結合力，然後利用磁鐵收集抗體和靶物質的複合物。利用這樣的方法收集到了細胞並且可用於治療。如上面描述的那樣，結合在基物上的本發明的抗體(所述基物適於作為醫療裝置)可作為醫療器具。
8.控制FGF-23分子結構和生物學活性的方法在體內保持蛋白的生物學活性的重要一點是允許該蛋白在體內維持其三維結構。在生物學因子當中，正像實施例中針對胰島素樣生長因子(IGF)或者是轉化生長因子β(TGF-β)觀察到的那樣，有許多這樣的例子一種生物學因子在體內與另一種蛋白相結合以控制生物學活性。對FGF-23來說，沒有已知的結合蛋白。本發明抗體的實例包括2C3B抗體，如實施例9所示，該抗體被認為不用與部分肽結合，就可強烈識別FGF-23的結構。因此可以設想能夠通過創造一種這些抗體或抗體的一部分結合到FGF-23上的狀態，來控制體內FGF-23的生物學活性。
9.有效除去FGF-23的方法腎功能顯著下降要求從體內除去尿毒症物質。對於除掉低分子量的尿毒症物質，在臨床上是利用透析膜來進行血液透析。然而，除掉高分子量的蛋白在臨床上仍是一個問題。本發明的抗體能夠用於專一性的除去FGF-23。和做血液透析一樣，將體外循環的血液與一種材料接觸，所述材料已固定了本發明的抗體，這樣FGF-23就能被選擇性的除掉。將該抗體作為一種用於治療FGF-23過量存在的疾病的工具是可行的。如實施例25所示，基於當腎功能衰竭時FGF-23呈現高水平的事實，FGF-23可能是一種誘導透析性併發症的因素。需要特別指出的是，由於FGF-23具有降低1，25D的作用，這樣FGF-23就非常有可能是誘導1，25D隨腎功能下降而降低的因子。因此，利用本發明的抗體去除透析病人的FGF-23的方法可用於透析性併發症的治療。
如上面描述的那樣，我們通過獲得不僅能識別FGF-23，而且能控制涉及FGF-23的生理學作用、藥理學作用和病理學作用的抗體而完成了本發明，並且所述抗體能用於治療，預防，和診斷疾病。
10.競爭性抗體的說明在結合FGF-23方面，可識別與本發明的抗體所識別的位點相同的位點，或者與該位點非常接近的位點的抗體被認為顯示與本文所示特性等同的特性。這樣一種基本上等同的抗體能通過進行與競爭性相關的試驗來和其它的抗體相區別。當允許2種或多種抗體共存時，顯示與抗原的結合時相互專一結合的特性的抗體被定義為競爭性抗體。為了明確本發明的競爭性抗體，在被標記的本發明的抗體與FGF-23蛋白結合的條件下，使未作標記的抗體過量存在，這樣就能進行測定。當加入的抗體顯著地降低了本發明的抗體與FGF-23蛋白的結合時，就能夠確定加入的抗體同本發明的抗體競爭。
本說明書包括了日本專利申請第2001-401689號和第2002-262020號的說明書和/或附圖中公開的部分或全部內容，上述兩項申請是本申請的優先權文本。
附圖簡述圖1A表明了利用抗FGF-23的多克隆抗體通過Western印跡法對重組體FGF-23蛋白和其代謝產物的測定結果，該多克隆抗體利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)經過分離CHO-FGF23H細胞培養物的上清液得到。在培養物的上清液中，提供了由在SEQ ID NO1所示的胺基酸序列中的介於第179位和第180位胺基酸殘基之間的切割產生的全長FGF-23H蛋白，和N-末端片段和C-末端片段。利用hFGF23-48抗體和hFGF23-148抗體對全長FGF-23H蛋白和N-末端片段肽進行了識別。對於N-末端片段，觀察到了小片段肽的存在。對全長蛋白和N-末端片段利用抗6組氨酸標記的抗體(anti-His6-tag抗體)進行了測定。(實施例2)圖1B表明了從CHO-FGF-23細胞培養物的上清液中純化出的全長FGF-23蛋白，N-末端片段和C-末端片段，CHO-FGF-23的細胞培養物上清液利用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離後通過考馬斯亮藍(CBB)染色後所得到的測定結果。
圖1C表明了利用一種抗FGF 23-148抗體通過Western印跡法對一種重組體FGF-23蛋白，一種重組體FGF-23RQ蛋白，和其代謝產物的測定結果，這種抗FGF 23-148抗體是先通過分離CHO-FGF-23H細胞和CHO-FGF-23RQ細胞的培養物上清液，然後再利用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離細胞得到的。(實施例5)圖2表明了利用一種hFGF23-25抗體作為固定化抗體，和一種hFGF23-237作為檢測抗體(這種檢測抗體是抗FGF-23的多克隆抗體)通過夾心式ELISA法對FGF-23H蛋白進行測定後所得的結果。
(實施例7)圖3表明了利用抗FGF-23的單克隆抗體免疫沉澱FGF-23H蛋白後，利用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離該蛋白，然後利用2A2B抗體和1C3H抗體對該蛋白進行檢測的結果。(實施例10)圖4表明了利用抗FGF-23單克隆抗體作為固定化抗體和抗FGF-23多克隆抗體作為檢測抗體通過夾心式ELISA法對純化後的FGF-23H全長蛋白，N-末端多肽片段和C-末端多肽片段的測定結果。(實施例11)圖5概略性的表明了全長FGF-23蛋白和其切割點，和抗FGF-23的單克隆抗體的識別位點。(實施例12)圖6表明了利用2C3B抗體作為一種固定化的抗體和1C3H，1D6A，和3C1E抗體作為檢測抗體通過ELISA系統對純化後的FGF-23蛋白進行定量檢測得到的結果。(實施例13)圖7表示了用固定了1C3H，1D6A，和2C3B抗體的樹脂將CHO-FGF23H細胞轉移至裸鼠體中，從該裸鼠中採集血清，通過免疫沉澱方法從血清中採集了FGF-23H蛋白，然後通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離該蛋白，最後利用2A2B和1C3H抗體對蛋白進行檢測的結果。(實施例15)圖8表明了向20ng純化後的FGF-23蛋白中加入大鼠的血清，獲得了最終濃度為50％的混合溶液，混合該溶液，然後利用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離經過0，0.5，1，2，4，8，或24小時培育後的代謝產物，利用2A2B抗體對該代謝產物進行Western印跡法測定的結果。(實施例16)圖9表明了向20ng純化後的FGF-23蛋白中加入人類的血清或人類的血漿，獲得了最終濃度為50％的混合溶液，將該混合溶液在37℃的環境中培育3小時，然後利用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離培養物，利用2A2B抗體對該分離物進行Western印跡法測定的結果。
(實施例16)圖10表明了向20ng純化後的FGF-23蛋白中加入凝血酶，獲得了最終濃度為1單位/毫升的混合溶液，將該混合溶液在37℃的環境中培育3小時，然後利用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳對培育物進行分離，利用2A2B抗體對該分離物進行Western印跡法測定的結果。(實施例17)圖11表明了向20ng純化後的FGF-23蛋白中在添加有或未添加水蛭素(一種凝血酶選擇性抑制劑)的條件下加入大鼠的血清，獲得了一種最終濃度為50％的混合溶液，將該混合溶液培育4小時，然後利用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳對培育物進行分離，利用2A2B抗體對該分離物進行Western印跡法測定的結果。(實施例17)圖12表明了將10μg純化後的FGF-23蛋白和大鼠血清混合24小時以產生22kDa(一種分子量單位，為千道爾頓)的多肽，利用抗2A2B抗體柱純化這種22kDa多肽，然後利用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳對純化後的產物進行分離，再通過CBB染色法進行鑑別的結果。(實施例18)圖13表明了利用ELISA系統(該系統利用2C3B抗體作為固定化抗體，和3C1E抗體或者是1D6A抗體作為檢測抗體來進行檢測)測定的血液樣品中FGF-23蛋白的測定結果，該蛋白採集自患有腫瘤性骨軟化症的病人體內中的致病性腫瘤提取前和提取後的血樣。(實施例19)圖14表明了對血液樣品中FGF-23蛋白的定量測定結果，該蛋白採集自患有腫瘤性骨軟化症的病人體內中的致病性腫瘤提取前和提取後的血樣。(實施例19)圖15表明了利用免疫組織學染色法測定的腫瘤組織中在FGF-23蛋白存在時的結果，該腫瘤組織採集自患有腫瘤性骨軟化症的患者。
(實施例20)圖16A表明了利用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離純化後的小鼠FGF-23RQ蛋白，然後利用3C1E抗體(該抗體是一種抗人類FGF-23的單克隆抗體)通過Western印跡法對小鼠的FGF-23RQ蛋白進行了測定的結果。(實施例22)圖16B表明了利用2C3B抗體作為一種固定化抗體和3C1E抗體作為一種檢測抗體來測定純化後的小鼠FGF-23蛋白經連續稀釋後的溶液的結果。(實施例22)圖17表明了利用2C3B抗體作為一種固定化抗體，和3C1E抗體作為一種檢測抗體通過ELISA系統對血清中內生性FGF-23蛋白進行測定的結果，該血清採集自27周至30周大的Hyp小鼠和對照小鼠。
(實施例23)
圖18A表明了給6個6周大的BALB/c雄性小鼠進行給藥，劑量為每隻小鼠5μg經純化後的FGF-23蛋白，然後分別採集給藥1，4，和9小時後的血清，圖18A表明了對血清中1，25D濃度的測定結果。
(實施例24)圖18B表明了給6個6周大的BALB/c雄性小鼠通過腹腔進行給藥，劑量為每隻小鼠0.025μg的1，25D，然後採集給藥8小時後的血樣，圖18B表明了對血清中FGF-23的定量測定結果。(實施例24)圖19A表明了給7周大的的威斯塔氏小鼠服用以0.75％的一種比例混合了腺嘌呤的CE-2(日本CLEA公司)，這樣可在威斯塔氏小鼠體中產生一種腎功能衰竭性高磷酸鹽血症模式，給一對照組威斯塔氏小鼠只服用CE-2(未混合腺嘌呤)。在給小鼠服用混合了腺嘌呤的藥劑3周之後，採集小鼠血樣後的血清中磷酸鹽濃度的測定結果。(實施例25)圖19B表明了給7周大的威斯塔氏小鼠服用以0.75％的一種比例混合了腺嘌呤的CE-2(日本CLEA公司)，這樣可在威斯塔氏小鼠體中產生一種腎功能衰竭性高磷酸鹽血症模式，給一對照組威斯塔氏小鼠只服用CE-2(未混合腺嘌呤)。在給小鼠服用混合了腺嘌呤的藥劑3周之後，採集血樣和尿樣(血樣採集完後，將小鼠飼養在代謝性的籠子中，採集尿樣進行24小時)，圖19B表明了對血清中和尿中脲肌酸酐濃度的測定結果。(實施例25)圖19C表明了給7周大的威斯塔氏小鼠服用以0.75％的一種比例混合了腺嘌呤的CE-2(日本CLEA公司)，這樣可在威斯塔氏小鼠體中產生一種腎功能衰竭性高磷酸鹽血症模式，給一對照組威斯塔氏小鼠只服用CE-2。在給小鼠服用混合了腺嘌呤的藥劑3周之後，採集小鼠血樣，然後利用2C3B抗體作為一種固定化抗體，和3C1E抗體作為一種檢測抗體通過ELISA系統對血清中的FGF-23濃度進行了測定的結果。(實施例25)圖20表明了利用免疫沉澱方法對FGF-23蛋白的測定結果，該蛋白存在於患有腫瘤性骨軟化症的病人體內的血漿中。(實施例26)圖21A表明了在接種各種單克隆抗體和一種載體24小時後，對血清中磷酸鹽，鈣，和1α，25-二羥基維生素D的濃度進行測定的結果。(實施例27)圖21B表明了在接種3C1E單克隆抗體和一種載體8小時後，對血清中1α，25-二羥基維生素D的濃度進行測定的結果。(實施例28)圖22A表明了在一組服用混合腺嘌呤(腺嘌呤組)的藥劑和一組服用一般的藥劑(對照組)之後第7天對血清中1α，25-二羥基維生素D的濃度進行測定的結果。測定結果利用平均值+/-標準偏差來表示。「*」和「**」分別表示p＜0.05和p＜0.01，上述內容均為通過Student-t(一種統計學方法)進行顯著性測定的結果。(實施例29)圖22B表明了在一組服用混合腺嘌呤(腺嘌呤組)的藥劑和一組服用一般的藥劑(對照組)之後第7天對血清中FGF-23的濃度進行測定的結果。測定結果利用平均值+/-標準偏差來表示。「*」和「**」分別表示p＜0.05和p＜0.01，上述內容均為通過Student-t進行顯著性測定的結果。(實施例29)圖22C是兩種濃度的關係圖，兩種濃度分別為服用混合了已給出的腺嘌呤(腺嘌呤組)藥劑之後第7天測定的血清中FGF-23的濃度和1α，25-二羥基維生素D的濃度，該圖是通過個體小鼠的測定數據得到的。(實施例29)圖22D表明在一組服用混合腺嘌呤(腺嘌呤組)的藥劑和一組服用一般的藥劑(對照組)之後第7天，在接種3C1E抗體或一種載體，12小時之後測得的血清中1α，25-二羥基維生素D的濃度變化情況。測定結果利用平均值+/-標準偏差來表示。「*」和「**」分別表示p＜0.05和p＜0.01，上述內容均為通過Student-t進行顯著性測定的結果。(實施例29)圖23顯示了患有性連遺傳型低磷酸鹽血症的6位病人的性別，已鑑定的phex基因的突變位點，被採集患者的年齡，和血清的FGF-23的濃度。(實施例30)圖24顯示給正常小鼠接種2種抗體(2C3B抗體和3C1E抗體)的混合物或一種載體(PBS)之後第1天和第2天對血清中的磷酸鹽濃度。測定值用平均值+/-標準偏差來表示。「*」和「**」分別表示p＜0.05和p＜0.01，上述內容均為通過Student-t進行顯著性測定的結果，上述結果與只給服用載體的組的測定結果進行了比較。「a」和「b」分別表示p＜0.05和p＜0.01，上述內容為通過Student-t進行顯著性測定的結果。(實施例31)圖25A顯示的是給野生型小鼠(WT)和Hyp小鼠(Hyp)重複接種包含有2C3B抗體和3C1E抗體的抗體(Ab)的混合物，或一種載體(PBS)後的第1天和第7天對血液中磷酸鹽濃度，1α，25-二羥基維生素D的濃度，和鹼性磷酸酶總活性。血液中磷的濃度和鹼性磷酸酶的活性值測定結果用平均值+/-標準偏差來表示。「*」和「**」分別表示p＜0.01和p＜0.001，上述內容為通過Student-t進行顯著性測定的結果。血液中1α，25-二羥基維生素D的濃度通過混合體積相同的從每一組小鼠中採集的血漿樣品而製得的血漿進行測定。(實施例32)圖25B顯示的是給野生型小鼠(WT)和Hyp小鼠(Hyp)用包含有2C3B抗體和3C1E抗體的混合物的抗體(Ab)，或一種載體(PBS)進行一次接種後的第4天對血液中磷酸鹽濃度和1α，25-二羥基維生素D的濃度進行測定的結果。測定結果用平均值+/-標準偏差來表示。「*」和「**」分別表示p＜0.01和p＜0.001，上述內容為通過Student-t進行顯著性測定的結果。(實施例32)圖25C顯示的是用Wester印跡法分析從腎臟中製得的腎近位細管刷狀緣膜囊(BBMV)中的NaPi2a蛋白的表達量的結果(上面)，和給野生型小鼠(WT)和Hyp小鼠(Hyp)用包含有2C3B抗體和3C1E抗體的混和抗體(Ab)，或一種載體(PBS)進行一次接種之後的第4天對磷酸鹽轉移活性測定的結果(下面)。利用測試來校正BBMV的蛋白水平，用於Western印跡法CBB染色，染色後β-肌動蛋白的影像同時顯示出來。每個實例中磷酸鹽轉移活性的測定結果用平均值+/-標準偏差和n＝3來表示。(實施例32)圖25D給野生型小鼠(WT)和Hyp小鼠(Hyp)用包含有2C3B抗體和3C1E抗體的混和抗體，或一種載體(PBS)進行一次接種之後的第4天，從小鼠腎臟中製備RNA，利用Northern(RNA轉移)吸印技術分析一個1αOH基因的表達變化，圖25D顯示了該基因的表達變化情況。(實施例32)圖26顯示了給正常的大鼠接種3C1E抗體或一種載體時，血液中骨鈣素濃度隨時間的變化情況。測定結果用平均值+/-標準偏差來表示。「*」和「**」分別表示p＜0.01和p＜0.001，上述內容為通過Student-t進行顯著性測定的結果。(實施例33)圖27顯示了給野生型小鼠(WT)和Hyp小鼠(Hyp)接種包含有2C3B抗體和3C1E抗體的混和抗體(Ab)，或一種載體(PBS)之後，從小鼠中所提取的股骨，脛骨和肋骨的放大的X-射線影像。(實施例32)圖28顯示的是兩種影像的比較，一種影像是給Hyp小鼠(Hyp/抗體)重複接種含有2C3B抗體和3C1E抗體的混和抗體後，其脛骨近端和股骨遠端的骨組織影像，另一種影像是給Hyp小鼠(Hyp/載體)和野生型小鼠(WT/載體)服用載體後，其相應位置的組織影像。提取的脛骨和股骨用Villanueva Bone染色。將它們植入樹脂中，然後製備成一種大約5μm厚的非脫鈣切片。這些樣品被染成不同的顏色類骨質染成紫色，鈣化骨染成亮橙色，低鈣化骨染成亮棕色，包埋進樹脂中的細胞在可見光下呈亮紫色。(實施例32)圖29A顯示下組進行卵巢切除一組小鼠(假切除/PBS)是假切除，施用載體(PBS)，一組小鼠(卵巢切除/混合抗體)卵巢切除，施用含有2C3B抗體和3C1E抗體的混和抗體，或一組小鼠(卵巢切除/PBS)後給其接種載體(PBS)後2星期時的血液中骨鈣素濃度(IRMA試劑盒，Immutopics，Inc.)。血液中骨鈣素濃度利用平均值+/-標準偏差來表示。「*」和「**」分別表示p＜0.01和p＜0.001，上述內容為通過Student-t進行顯著性測定的結果。(實施例34)圖29B顯示了下組進行卵巢切除一組小鼠(假切除/PBS)是假切除，施用載體(PBS)，一組小鼠(卵巢切除/混合抗體)進行卵巢切除，施用接種含有2C3B抗體和3C1E抗體的混和抗體，或一組小鼠(卵巢切除/PBS)進行卵巢切除，施用載體(PBS)後4星期時血液中骨鈣素濃度(IRMA試劑盒，Immutopics，Inc.)。血液中骨鈣素濃度利用平均值+/-標準偏差來表示。「*」和「**」分別表示p＜0.01和p＜0.001，上述內容為通過Student-t進行顯著性測定的結果。(實施例34)圖30A顯示了對如下組進行卵巢切除一組小鼠(假切除/PBS)是假切除，給其接種載體(PBS)，一組小鼠(卵巢切除/混合抗體)進行卵巢切除，給其接種含有2C3B抗體和3C1E抗體的混和抗體，或一組小鼠(卵巢切除/PBS)進行卵巢切除，給其接種載體(PBS)後4星期的股骨中的骨鹽數量。股骨中的骨鹽數量和骨密度利用平均值+/-標準偏差來表示。「*」和「**」分別表示p＜0.05和p＜0.01，上述內容為通過Student-t進行顯著性測定的結果。(實施例34)圖30B顯示了對下組進行卵巢切除一組小鼠(假切除/PBS)是假切除，給其接種載體(PBS)，一組小鼠(卵巢切除/混合抗體)進行卵巢切除，給其接種含有2C3B抗體和3C1E抗體的混和抗體，或一組小鼠(卵巢切除/PBS)進行卵巢切除，給其接種載體(PBS)。後4星期時的骨密度(骨密度計，DCS-600型，日本阿洛卡公司)。股骨中的骨鹽數量和骨密度利用平均值+/-標準偏差來表示。「*」和「**」分別表示p＜0.05和p＜0.01，上述內容為通過Student-t進行顯著性測定的結果。(實施例34)圖31A顯示了在對Hyp小鼠(Hyp/載體)重複皮下給藥(一星期一次)載體，含有2C3B抗體和3C1E抗體，量為4mg/kg的Hyp小鼠(Hyp/抗體低劑量)，16mg/kg的相同的混合物對Hyp小鼠(Hyp/低劑量的抗體，16mg/kg的相同的混合物對Hyp小鼠(Hyp/高劑量的抗體)後定期測量尾椎骨的全長的結果。這些結果利用平均值+/-標準偏差來表示。「**」表示p＜0.01，其為當測量結果與接種載體的Hyp組結果相比較時，通過Student-t進行顯著性測定而得到的。
(實施例35)圖31B同樣顯示了共分四組的實驗，一組Hyp小鼠(Hyp/載體)通過皮下注射重複接種載體；一組Hyp小鼠(Hyp/低劑量抗體)按4毫克/千克的劑量通過皮下注射重複接種含有2C3B抗體和3C1E抗體的混和抗體；相同的混合抗體按16mg/千克的劑量通過皮下注射重複接種另一組Hyp小鼠(Hyp/高劑量抗體)；或一組野生型小鼠(WT/載體)通過皮下注射重複接種載體，之後定期(每周一次)測量這些小鼠的脛骨全長的結果。這些結果利用平均值+/-標準偏差來表示。「**」表示p＜0.01，其為當測量結果與接種載體的Hyp組結果相比較時，通過Student-t進行顯著性測定而得到的。(實施例35)
圖31C顯示了共分四組的實驗，一組Hyp小鼠(Hyp/載體)通過皮下注射重複接種載體；一組Hyp小鼠(Hyp/低劑量抗體)按4毫克/千克的劑量通過皮下注射重複接種含有2C3B抗體和3C1E抗體的混和抗體；相同的混合抗體按16mg/千克的劑量通過皮下注射重複接種另一組Hyp小鼠(Hyp/高劑量抗體)；或一組野生型小鼠(WT/載體)通過皮下注射重複接種載體，之後定期(每周一次)測量這些小鼠的體重變化的結果。這些結果用平均值+/-標準偏差來表示。*」和「**」分別表示p＜0.05和p＜0.01，其為當測量結果與接種載體的Hyp組結果相比較時，通過Student-t進行顯著性測定而得到的。
(實施例35)圖32顯示了在對Hyp(載體)皮下重複給藥(一星期一次)，含有2C3B抗體和3C1E抗體的抗體混合物，量4mg/kg的Hyp小鼠(Hyp/低劑量抗體)；或對Hyp小鼠16mg/kg的相同的混合物抗體(Hyp/高劑量抗體)，和對野生型小鼠(野生型/載體)的載體後提取股骨並且焚燒31天後的幹骨重中骨灰重的比例。這些結果利用平均值+/-標準偏差來表示。*」表示p＜0.001，其為當測量結果與施用載體的Hyp組結果相比較時，通過Student-t進行顯著性測定而得到的。
圖33顯示了利用以2C3B或2C5L抗體作為固定抗體，3C1E作為檢測抗體的ELISA系統對純化的FGF-23蛋白進行了定量測定的結果。(實施例36)圖34顯示了在給藥之前和對未處理的正常小鼠的組(未處理/載體)施用一種載體，和載體(FGF-23/PBS)，2C5L抗體(FGF-23/2C5L)，或對已經用等滲泵連續施用人重組FGF-23的各組施用2C3B抗體(FGF-23/2C3B)後24小時時的血液磷酸的濃度。這些結果利用平均值+/-標準偏差來表示。*」表示p＜0.001，該結果為每一組在抗體接種前，其測量結果與服用載體的組結果相比較時，通過Student-t進行顯著性測定而得到的。「#」和「##」分別表示p＜0.01和p＜0.001，其為通過Student-t對每一組在接種抗體前和接種抗體後第24小時進行測定的結果。「+」，「++「和「+++」分別表示p＜0.05，p＜0.01和p＜0.001，其為當接種抗體的每一組與接種FGF-23/PBS 24小時後的組相比較時，通過Student-t進行顯著性測定而得到的。(實施例38)。
序列表內容SEQ ID NOs2-8合成DNASEQ ID NOs9-24合成肽SEQ ID NOs25-36合成DNA完成本發明的最佳模式參照以下實施例，本發明將可解釋的更加明確，但本發明並不限於這些實施例所描述的實施方案及技術範疇。
實施例1重組體FGF-23表達型載體的構建(1)FGF-23H蛋白表達型載體的製備編碼FGF-23的cDNA在96℃的條件下保持1分鐘後，進行35個PCR循環，每一個循環包括96℃，30秒；55℃，30秒；和72℃，30秒。PCR反應的模板為腫瘤性骨軟化症的腫瘤中的cDNA文庫，引物為F1EcoRI(見SEQ ID NO2)和LHisNot(見SEQ ID NO3)，酶為LA-TaqDNA聚合酶。F1EcoRI引物對與編碼FGF-23的5』端遠上遊核苷酸序列進行退火反應，使得在編碼FGF-23 5』端的擴增片段上增加一個EcoRI限制性酶切位點。LHisNot引物包含一段在編碼FGF-23的序列的5』端終止密碼子序列處退火的序列，和編碼一個6組氨酸標記序列(His-His-His-His-His-His)的一段序列，還包括終止密碼子和一個Not I限制性酶切序列。因此，擴增片段編碼FGF-23蛋白的一段序列，該序列在C-末端增加有6個組氨酸，在6個組氨酸序列的下遊還有一個Not I限制性酶切位點。該擴增片段用EcoR I和Not I消化，然後連接到pcDNA3.1 Zeo載體上(美國，Invitrogen公司)，該載體為一種動物細胞的表達載體，具有與EcoR I和Not I消化方式相類似的消化特徵。克隆製備的該表達載體，測定其核苷酸序列，以保證其編碼的靶FGF-23蛋白具有6個組氨酸序列。該載體指的是pcDNA FGF-23H。
F1EcoRICCGGAATTCAGCCACTCAGAGCAGGGCACG(見SEQ ID NO2)
LHisNotATAAGAATGCGGCCGCTCAATGGTGATGGTGATGATGGATGAACTTGGCGAA(見SEQ ID NO3)(2)FGF-23蛋白表達載體的構建在94℃的條件下保持1分鐘，然後進行25個PCR循環，每一個循環的條件是利用pcDNA/FGF-23H作為模板，並且利用F1EcoRI和LNoT(見SEQ ID NO4)作為引物，和LA-Taq DNA聚合酶，94℃，30秒；55℃，30秒；和72℃，1分鐘。經過反應以後，利用T4 DNA聚合酶(瑞士羅氏公司)處理PCR產物使其具有粘性末端製備一種編碼FGF-23的cDNA片段，和利用多核苷酸激酶(瑞士羅氏公司)使DNA末端磷酸化。一種pCAGGS表達載體(Niwa H等，基因，1991，108193-199)利用EcoR I進行消化，用Klenow片段(瑞士羅氏公司)使其末端粘性化，然後利用牛的小腸鹼性磷酸酶(日本寶酒造公司)脫磷酸。這樣製備的編碼FGF-23的cDNA片段結合到一種pCAGGS載體上。對如此製備的表達載體進行克隆並且對核苷酸序列進行測定，這樣確保一種編碼FGF-23蛋白的靶序列能精確的插入到載體中。這裡的載體指的是pCAGGS/FGF-23。
上述編碼FGF-23的片段利用F1EcoRI引物和LNot引物進行擴增，然後用EcoR I和Not I消化，最後對其進行純化。純化的產物通過插入到一種已經通過將分子內的核糖體進入序列(IRES)和增強類型的綠螢光蛋白(EGFP)連接到pEAK表達載體(Edge生物系統，美國)而製備的pEAK8/IRES/EGFP載體的EcoR I和Not I的限制性酶切位點中得以克隆。對獲得的質體核苷酸序列進行測定，證明該序列編碼FGF-23蛋白。這個載體指的是pEAK8/IRES/EGFP/FCG-23。
LNotATAAGAATGCGGCCGCTCAGATGAACTTGGCGAA(見SEQ ID NO4)pCAGGS/FGF-23用EcoR I消化後，變得線性化，然後用Klenow片段(瑞士羅氏公司)使其具有粘性末端。用BamH I進一步消化。一段含有FGF-23的cDNA的DNA片段被分離得到並用瓊脂糖電泳進行純化。而且，一個INPEP4表達載體用Bgl II消化，用Klenow片段(瑞士羅氏公司)使其具有粘性末端，用BamH I消化，然後進行瓊脂糖電泳，純化載體。含有FGF-23 cDNA的片段與載體相連。克隆製備出來的表達載體，測定其核苷酸序列，證實準確插入了編碼FGF-23的蛋白的靶序列。該載體指的是INPEP4/FGF-23。
(3)FGF-23RQH表達載體的構建已經發現FGF-23蛋白在第179位精氨酸和第180位絲氨酸之間易於切割。切割位點的N-末端胺基酸序列是精氨酸(第176位)-組氨酸(第177位)-蘇氨酸(第178位)-精氨酸(第179位) (見SEQID NO31)，與精氨酸-X-X-精氨酸序列相同，該序列為一種蛋白轉化酶的識別序列。而且，已知ADHR中的錯義突變是第176位或第179位的精氨酸殘基的替代突變。因此，為了製備一個突變的FGF-23蛋白(這裡指FGF-23RQH)作為突變的FGF-23在ADHR中可進行識別的模型，我們構建了一個載體，該載體通過蛋白轉化成的酶而表現出對切割具有抗性，其在C-末端具有6組氨酸標記，和因替代第176位和第179位的精氨酸殘基而具有穀氨醯胺殘基。在該製備方法中，合成了兩條引物，一條是RQF正向引物(見SEQ ID NO5)，另一條是RQR反向引物(見SEQ ID NO6)，它們包含有核苷酸替代序列，並可用穀氨醯胺代替精氨酸。而且，為了擴增5』端和3』端突變引入位點的FGF-23序列，與這些核苷酸替代引物一起，還製備了另外兩條引物ME1(見SEQ ID NO7)和HNt(見SEQ ID NO8)。ME1是一個正向引物，含有由FGF-23 cDNA編碼的起始密碼子，並具有EcoR I限制性酶識別序列。HNt是一個反向引物，能在由FGF-23 cDNA編碼的起始密碼子前插入一個編碼6組氨酸標記序列的密碼子，並增加一個Not I限制性酶識別序列。
RQFATACCACGGCAGCACACCCAGAGCGCCGAG(見SEQID NO5)RQRCTCGGCGCTCTGGGTGTGCTGCCGTGGTAT(見SEQID NO6)ME1ATGAATTCCACCATGTTGGGGGCCCGCCTCAGG(見SEQ ID NO7)HNtATGCGGCCGCCTA ATGATGATGATGATGATGGATGAACTTGGCGAAGGG (見SEQ ID NO8)PCR反應體系包括10ng pGAGGS/FGF-23作為模板，RQF和HNt的結合引物，ME1和RQR的結合引物(每個引物200nM)。反應所用的酶為pfu DNA聚合酶(美國普洛麥格公司)。在94℃的條件下保持1分鐘，然後進行25個PCR循環，每一個循環包括94℃，30秒；55℃，30秒；和72℃，1分鐘。得到的兩種類型的反應溶液均稀釋10倍。將反應溶液混合(每種1μl)，製成模板。ME1和HNt以終濃度為200nM加到模板中，製備成50μl的PCR反應溶液。在94℃的條件下保持1分鐘，然後進行25個PCR循環，每一個循環包括94℃，30秒；55℃，30秒；和72℃，1分鐘。反應中用的酶為LA TaqDNA聚合酶(日本寶酒造公司)。得到的長約800bp(鹼基對)的擴增產物用EcoR I和Not I消化，然後純化，產物中包含有插入的DNA序列。它是通過插入到pEAK8/IRES/EGFP載體的EcoR I和Not I限制酶位點中得以克隆的，pEAK8/IRES/EGFP載體通過在pEAK8表達載體(Edge生物系統公司，美國)上連接分子內核糖體進入序列(IRES)和加強型綠色螢光蛋白(RGFP)而得。測定得到的質體的核苷酸序列，證實第176位和第179位的精氨酸殘基如期轉換成穀氨醯胺殘基，並且編碼加於C-末端含有6個組氨酸標記的突變FGF-23蛋白。該載體指的是pEAK8/IRES/EGFP/FGF-23RQH。
實施例2重組體FGF-23蛋白和重組體突變FGF-23蛋白的表達(1)FGF-23H表達細胞的獲得通過在載體中的抗氨苄青黴素基因內的Fsp I限制酶位點處切割使大約20μg的pcDNAFGF-23H線性化，然後被純化。純化的產物溶於10μl純水中，與1×107CHO Ras克隆-1細胞(Shirahata S.等，生物科學、技術與生物化學，59345-347，1995)混合，利用Gene PulserII(Bio Rad，美國)通過電穿孔法將該基因引入到細胞中。這些培育細胞在含有10％胎牛血清(FCS)的MEMα培育溶液(Gibco BRL，美國)中培育24小時後，Zeocin(美國英傑生命技術公司)以終濃度為0.5mg/ml加到溶液中，混合溶液，培育1周。粘著的和生長的細胞用胰蛋白酶培育，然後在Zeocin最終濃度為0.3mg/ml時用限制稀釋法對其進行克隆，由此得到了35種類型的克隆細胞。所有細胞中表達FGF-23H蛋白的細胞通過下面的Western印跡法以最高水平得以鑑定。收集每一種克隆細胞的培養物上清液，進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳。然後得到的蛋白轉移至一種聚偏氟乙烯膜(美國Millipore公司)上，利用抗組氨酸標記(C-末端)的抗體(美國英傑生命技術公司)和ECL發光系統(美國Amersham Pharmacia Biotech公司)對FGF-23H蛋白上的信號分子序列(約32KDa)進行檢測。檢測的結果，表達量最高的#20克隆命名為CHO-OST311，然後利用與2000年8月11日(編號為FERM BP-7273)的申請相同的方法保存在日本現代產業科學和技術國家研究所的國際專利生物體保藏中心(Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)。這裡的CHO-OST311指的就是CHO-FGF23H。
(2)表達FGF-23和表達FGF-23RQH的細胞的獲得利用膜融合脂，通過基因轉移方法將pEAK8/IRES/EGFP/FGF-23和pEAK8/IRES/EGFP/FGF-23RQH載體轉入到CHO Ras克隆-1細胞中。CHO Ras克隆-1細胞培育至細胞覆蓋6孔板的底面約60％的程度。然後，將培育溶液轉移，加入1ml不含血清的MEMα培育液。2.5μg的載體和10μl的Transfectam(商標)(美國普洛麥格公司)各自與50μl的不合血清的MEMα培育液相混合。然後這兩種混合溶液再混合，培育10分鐘，混合，然後再加到原來的6孔板中。培育2小時之後，含有DNA的培育溶液被轉移，由含有10％FCS的培養液代替，然後培養液培育過夜。次日，加入最終濃度為5μg/ml的嘌羅黴素(美國Sigma公司)，以選擇抗藥性細胞。以這種方式獲得的抗藥性細胞通過類似於上述獲得FGF-23H表達細胞的限制稀釋法進行克隆。而且，通過Western印跡法選擇最高水平表達靶蛋白的細胞線。這些細胞分別指CHO-FGF23和CHO-FGF23RQ。
(3)重組蛋白的純化當利用抗6組氨酸標記序列的抗體通過Western印跡法從CHO-FGF23H的培養物上清液中檢測出重組體時，一條約32kDa的帶和一條約10kDa的帶被識別，見圖1A。當把兩條帶從凝膠中切下來，測定N-末端的胺基酸序列時，從大分子量的帶中檢測出一個起始於SEQID NO1中的第25位胺基酸殘基的一段胺基酸序列，表明信號分子序列在從FGF-23蛋白分泌的過程中被除去。另一方面，已確定小分子量的帶含有的一段胺基酸序列始於SEQ ID NO1中的第180位胺基酸殘基，表明該片段是從第179位和第180位切割處產生的。通過利用識別FGF-23的N-末端的多克隆抗體進行檢測，證明存在一段至第179位的序列。
1000ml CHO-FGF23H細胞的培養物上清液在4℃，16,200g離心15分鐘，以除去懸浮的細胞。然後上清液通過一個充滿SP-瓊脂糖凝膠FF(商標)(美國Amersham Pharmacia生物技術有限公司)的柱子(內徑為30mm×200mm長)，以使相應於SEQ ID NO1中的第180位至第251位胺基酸殘基的肽和具有6組氨酸標記序列的肽通過柱子而不被吸收，而相應於SEQ ID NO1(從這裡開始，該段可能也指全長FGF-23蛋白)中的具有6組氨酸標記序列的第25位至第251位胺基酸殘基的肽被吸附在柱子上。當柱子上吸附的物質用氯化鈉濃度梯度溶液(用50mM的磷酸鈉緩衝液配製成從0至0.7M的氯化鈉溶液，pH 6.7)洗脫時，發現用約0.3M的氯化鈉溶液可將一部分含有6組氨酸標記的全長FGF-23蛋白洗脫掉，從SEQ ID NO1的第179位胺基酸殘基至N-末端的序列可用約0.4M的氯化鈉溶液洗脫掉。用SP-瓊脂糖凝膠柱以這種方式分離得到的片段可進一步將它們通過Talon Superflow(商標)(Clontech公司，美國)金屬親和柱進行分離。由於從第179位胺基酸殘基至N-末端範圍的序列也與金屬柱有親和性，這對於提高純化效果是有效的。為了全長FGF-23蛋白通過CBB染色可得到單一條帶，利用SP-瓊脂糖凝膠柱進一步純化。結果見圖1B。
FGF-23蛋白也可用一種相似的方法進行純化。CHO-FGF23的培養物上清液通過一個孔徑為0.2μm的SuperCap(商標)(Pall Gelman實驗室，美國)膜過濾，然後過濾後的溶液加到SP-瓊脂糖凝膠FF(美國Amersham Pharmacia生物技術有限公司)。和柱子親和力弱的物質用50mM的磷酸鈉緩衝液(pH 6.7)洗滌下來。當滯留在柱子中的蛋白用0至0.7M的氯化鈉濃度梯度溶液洗脫時，發現全長FGF-23蛋白被洗脫進了0.3MnaCl的組分中。蛋白被吸附於Talon Superflow(商標)(克隆技術公司(Clontech)，美國)金屬親和柱上，用50mM的磷酸鈉緩衝液(pH 6.7)洗脫，然後向柱內加入各種濃度的咪唑，洗脫和純化蛋白。而且，進一步將含有靶蛋白的級分吸附於一種SP-瓊脂糖凝膠FF柱上進行洗脫，然後純化。利用類似方法，全長FGF-23RQ蛋白從CHO-FGF23RQ的上清液中純化出來。
實施例3產生抗人類FGF-23的小鼠單克隆抗體的雜交瘤的獲得根據「單克隆抗體實驗方案的介紹」等中敘述的一般方法，在本實施例中製備了單克隆抗體(Tamie Ando，等，Tan-kurokh KoutaiJikken Sosa Nyumon，KODANSHA，1991)。用於免疫的動物是Balb/c小鼠。人類FGF-23免疫是根據免疫原的差異，在2個類型的方法後進行的。
(1)利用載體的給藥和重組蛋白的給藥的結合來免疫初始時對Balb/c小鼠進行免疫是通過引入實施例1中製備的INPEP4/FGF-23載體(10或50μg/小鼠)利用Trans IT(商標)體內基因多樣性系統試劑(日本寶酒造公司) 進行靜脈注射。助促進免疫反應是通過初始免疫後每周一次引進相同載體來進行的。將實施例2中製備的FGF-23RQH蛋白(20-30μg/小鼠)懸浮於含有三十碳六烯，吐溫80(聚山梨醇酯80)，單磷醯脂A和海藻糖黴菌酸酯的RIBI佐劑(Corixa，美國)中。加強免疫是通過腹膜注射乳液4或5次來進行的。隨後，在得到下面描述的脾細胞之前第4天時，小鼠用尾靜脈注射實施例2中製備的FGF-23H蛋白(18μg/小鼠)的方法進行免疫。
(2)用人類FGF-23進行免疫初始免疫利用Balb/c小鼠通過腹膜注射一種懸浮液，該懸浮液是通過在上述RIBI佐劑中懸浮實施例2中製備的FGF-23(22μg/小鼠)而製得的。加強免疫是通過腹膜注射同一種蛋白，每周一次，持續4周以上。在得到下面描述的脾細胞之前第3天時，通過尾靜脈給小鼠注射實施例2中製備的FGF-23H蛋白(10μg/鼠)的方法進行免疫。
(3)雜交瘤的製備和選擇切除小鼠的脾臟，按照上述方法進行免疫。從脾臟中採集到的脾細胞與小鼠的骨髓瘤SP2/0(ATCC∶CRL 1581)以5∶1的比例混合，然後細胞用聚氧乙烯1500(日本羅氏診斷產品有限公司)作為一種融合劑進行融合，製備雜交瘤。雜交瘤通過在含有HAT，含有10％胎牛血清(FCS)，次黃嘌呤(H)，氨基喋呤(A)和胞嘧啶(T)的DMEM培氧基(Gibco BRL，美國)上培育細胞而進行選擇。克隆是利用含有HT的DMEM(達爾伯克氏必需基本培養基)培養基通過限制稀釋法而進行。因此，最終獲得從單個細胞衍生而來的克隆雜交瘤。
(4)產生抗FGF-23抗體的克隆雜交瘤的選擇產生專一性識別FGF-23蛋白抗體的雜交瘤通過檢測由雜交瘤產生的抗體和FGF-23蛋白的結合來選擇。根據第一種免疫方法獲得的雜交瘤以下面的方法來進行選擇。向用於ELISA(Maxisorp(商標)，Nunc，美國)實驗的一個96孔微量培養板中加入50μl在50mM碳酸氫納溶液中稀釋至1μg/ml的FGF-23H蛋白溶液。在37℃培育30分鐘或4℃培育10小時，使得FGF-23H蛋白吸附在微量培養板上。接下來，除去該溶液，一種阻滯劑(SuperBlock(商標)Blocking Buffer，PIERCE，美國)加到每個孔中，然後在室溫培育30分鐘。每個孔用含有0.1％吐溫20(包含500mM氯化鈉的TRIZMA預置晶體(商標)，美國Sigma公司)(T-TBS，為三羥甲基氨基甲烷緩衝鹽水)的Tris(三羥甲基氨基甲烷緩衝液)緩衝鹽溶液洗滌兩次。取每種類型的雜交瘤培養物上清液50μl加入到已被上述的FGF-23H蛋白包被的微量培養板的每個孔中。反應30分鐘後，每個孔用T-TBS(Tris緩衝鹽溶液)洗滌兩次。接下來，向每個孔中加入50μl稀釋3000倍的過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體(Zymed實驗室，美國)，在室溫培育30分鐘。利用T-TBS(三羥甲基氨基甲烷緩衝鹽水，下同)洗滌每個孔3次後，向孔中加入50μl含有N-四甲聯苯胺(丹麥，DAKO)的底物緩衝液，在室溫培育15分鐘。隨後，向每個孔中加入50μl 0.5M的硫酸，以停止反應。450nm波長下的吸收值通過一個微量培養板閱讀器(MTP-300，CORONA ELECTRIC CO.，LTD.，日本)參照570nm波長的吸收值進行測定。選擇吸收值明顯增加的雜交瘤，利用FGF-23蛋白做相同實驗，再次確保選擇的是與FGF-23結合的克隆。因此，得到了9種類型的作為產生識別FGF-23蛋白的抗體的雜交瘤克隆。
在這些克隆中，包括下述的1C3H，1D6A，2A2B，2C3B和2C5L。
通過二次免疫方法獲得的雜交瘤按照下列步驟進行選擇。向用於ELISA(Maxisorp(商標)，Nunc，美國)實驗的96孔微量培養板的每個孔中加入50μl在50mM的碳酸氫鈉溶液中稀釋至1μg/ml的FGF-23蛋白溶液。在4℃培育10小時，以使FGF-23蛋白吸附在微量培養板上。隨後，除去溶液，一種阻滯劑(SuperBlock(商標)BlockingBuffer，PIERCE，美國)加到每個孔中，然後在室溫培育30分鐘。每個孔用含有0.1％吐溫20的Tris緩衝溶液(T-TBS)洗滌兩次。取每種類型的雜交瘤的培養物上清液50μl加入到已被上述的FGF-23H蛋白包被的微量培養板的每個孔中。反應30分鐘後，每個孔用含有0.1％吐溫20的T-TBS(Tris緩衝鹽溶液)洗滌兩次。接下來，向每個孔中加入50μl稀釋3000倍的過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體(Zymed實驗室，美國)，在室溫培育30分鐘。每個孔用T-TBS溶液洗滌3次，向每個孔中加入50μl含有四基甲聯苯胺(丹麥，DAKO)的底物緩衝液，在室溫培育15分鐘。隨後，向每個孔中加入50μl的0.5M的硫酸，以停止反應。450nm波長下的吸收值通過一個微量培養板閱讀器(MTP-300，CORONA ELECTRIC CO.，LTD.，日本)參照570nm波長的吸收值進行測定。選擇吸收值明顯增加的雜交瘤。因此，得到了9種類型的作為產生識別FGF-23蛋白的抗體的雜交瘤克隆。在這些克隆中，包括3C1E。
這樣得到的專一性識別FGF-23蛋白的抗體的亞類利用一種IsoStrip小鼠單克隆抗體isotyping試劑盒(Roche公司，美國)進行鑑定。結果如表1所示。
表1抗人類FGF-23的抗體

在上述的雜交瘤克隆中，有3個雜交瘤克隆(2C3B，3C1E，和1D6A)利用與2001年12月26日的申請相同的方法被國際性的保存在布達佩斯協議認可的日本現代產業科學技術國家研究院的國際生物體儲藏處(Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)。而且，2C5L雜交瘤克隆利用與2003年1月6日的申請相同的方法被國際性地保存在布達佩斯條約認可的日本現代科學技術研究所的國際專利生物體保藏處(Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)。這些克隆的保藏號如下所示2C3BFERM BP-78383C1EFERM BP-78391D6AFERM BP-78402C5LFERM BP-8268實施例4單克隆抗體的製備(1)包含有抗FGF-23抗體的培養物上清液的製備產生抗FGF-23抗體的雜交瘤在eRDF培養基(KYOKUTOPHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO.，LTD.日本)中進行馴化，培養基包含有10μg/ml的牛胰島素(美國Sigma公司)，5.5μg/ml的人轉鐵蛋白(美國Sigma公司)，0.01mM的乙醇胺溶液(美國Sigma公司)，和5ng/ml的亞硒酸鈉溶液(美國Sigma公司)。用於製備抗體的雜交瘤在旋轉式燒瓶中進行培養。培養後的溶液利用孔徑為0.2μm的濾紙(Pall Gelman實驗室，美國)進行過濾以除去如雜交瘤這樣的廢物，然後收集包含抗體的培養物上清液。
(2)利用G蛋白純化單克隆抗體包含有抗FGF-23抗體的培養物上清液通過一種G蛋白瓊脂糖親和柱(美國Amersham Pharmacia生物技術有限公司)進行分離，這樣抗體被吸附在了親和柱上。然後利用一種0.1M的甘氨酸緩衝液(pH值為2.8)進行淋洗。1M的Tris-HCL溶液加入進洗脫部分的溶液中以調節pH值為7.2。對這樣製備的抗體溶液利用一種透析膜(Spectrum實驗室，美國)用PBS(-)進行透析和取代，該透析膜的最大分子量為10000，並且利用一種孔徑為0.22μm的濾紙膜(美國Millipore公司)進行過濾滅菌，這樣得到純化後的抗FGF-23抗體。通過在280nm波長處的吸收值來計算純化抗體的濃度，然後通過利用1mg/ml作為1.35OD的標準進行計算。
(3)利用A蛋白純化單克隆抗體抗體利用一種A蛋白載體親和柱(IBL Co.，Ltd.，日本)，一種甘氨酸緩衝溶液(pH值為8.9)作為吸附緩衝溶液，一種檸檬酸緩衝液(pH值為4.0)作為洗脫緩衝溶液來親和性純化包含有抗FGF-23抗體的培養物上清液。1M的Tris-HCL溶液加入進包含有該抗體的洗脫部分溶液中以調節pH值為7.2。然後，對包含有抗體的溶液利用PBS(-)溶液通過一種透析膜和一種孔徑為0.22μm，已滅菌的濾紙膜進行透析和取代。通過在280nm波長處的吸收值來計算純化抗體的濃度，然後通過利用1mg/ml作為1.35OD的標準進行計算。
這樣獲得的每一種純化後的單克隆抗體利用產生這種抗體的雜交瘤的名稱來命名。例如，由1D6A雜交瘤產生的抗體命名為1D6A抗體。
實施例5抗FGF-23部分肽的多克隆抗體的製備(1)對應FGF-23部分序列的肽的合成SEQ ID NO1多肽的疏水性程度通過利用版本為6.5.1的MacVector計算函數來預測，然後對製備的肽抗體的合適的位點進行預測。在去除了具有高度親水性，並經過糖鏈改性或磷酸化位點之後，適於製備抗體的部分序列被提取出來。因此，一種從SEQ ID NO1的第25位酪氨酸(殘基號為25)開始的包含有15個胺基酸殘基和C-末端上加有一個半胱氨酸殘基的hFGF23-25的肽(SEQ ID NO9)；一種從第48位精氨酸開始的包含有20個胺基酸殘基和C-末端上加有一個半胱氨酸殘基的hFGF23-48的肽(SEQ ID NO10)；一種從第114位精氨酸開始的包含有15個胺基酸殘基和C-末端上加有一個半胱氨酸殘基的hFGF23-114的肽(SEQ ID NO11)；一種從第148位甘氨酸開始的包含有16個胺基酸殘基和C-末端上加有一個半胱氨酸殘基的hFGF23-148的肽(SEQ ID NO12)；一種從第170位天門冬醯胺開始的包含有20個胺基酸殘基和N-末端上加有一個半胱氨酸殘基的hFGF23-170肽(SEQ ID NO13)；一種從第174位脯氨酸開始的包含有14個胺基酸殘基和C-末端上加有一個半胱氨酸殘基的hFGF23-174肽(SEQ ID NO14)；一種從第180位絲氨酸開始的包含有15個胺基酸殘基和C-末端上加有一個半胱氨酸殘基的hFGF23-180肽(SEQ IDNO15)；一種從第210位亮氨酸開始的包含有13個胺基酸殘基和C-末端上加有一個半胱氨酸殘基的hFGF23-210肽(SEQ ID NO16)；一種從第237位甘氨酸開始的包含有15個胺基酸殘基的hFGF23-237肽(SEQ ID NO17)被選擇作為抗原，並且通過化學方法進行了合成。
hFGF23-25YPNASPLLGSSWGGLC (SEQ ID NO9)hFGF23-48RNSYHLQIHKNGHVDGAPHQC (SEQ ID NO10)hFGF23-114RFQHQTLENGYDVYHSPQYHC (SEQ ID NO11)hFGF23-148GMNPPPYSQFLSRRNEC (SEQ ID NO12)hFGF23-170CNTPIPRRHTR (SEQ ID NO13)hFGF23-174PRRHTRSAEDDSERC(SEQ ID NO14)hFGF23-180SAEDDSERDPLNVLKC (SEQ ID NO15)hFGF23-210LPSAEDNSPMASDC (SEQ ID NO16)hFGF23-237GGTGPEGCRPFAKFI (SEQ ID NO17)(2)抗FGF-23部分肽的多克隆抗體的製備所有上述製備的肽通過它們自己的半胱氨酸殘基結合到牛的甲狀腺球蛋白上(載體蛋白)，然後用於免疫接種。對於免疫接種，每一種抗原肽用3隻兔子。第一次接種利用結合到載體蛋白(利用弗羅德氏完全佐劑作為載體蛋白)上的肽作為乳液(100μg/兔子)，然後將該乳液通過真皮或皮下接種的方式給兔子進行接種。第一次接種1周以後，利用結合到載體蛋白(利用弗羅德氏不完全佐劑作為載體蛋白)上的肽作為乳液，以100μg/兔子的劑量進行類似的給藥。以2周的間隔進行同樣的給藥6次，最後一次給藥完成後1周，對兔子進行放血，採集抗血清。
為了製備用於從兔子的血清中純化抗部分肽抗體的一種親和性層析柱，用於免疫的每一種肽利用SulfoLink試劑盒(PIERCE，美國)固定在了凝膠上。抗血清加入進利用PBS(-)溶液作為吸附緩衝溶液的親和柱中，這樣可在親和柱中滯留結合到用於免疫接種的肽上的抗體。接下來，利用0.1M的甘氨酸緩衝溶液(pH值為2.5至3.3)作為洗脫緩衝溶液對結合到親和柱上的抗體進行洗脫，然後收集洗脫部分溶液。1M的Tris-HCL溶液加入進洗脫溶液中以調節pH值為7.2左右。將這樣製備的抗體溶液加入到一種NAP25凝膠過濾親和柱(美國Amersham Pharmacia生物技術有限公司)中，這樣緩衝溶液就被PBS(-)取代了。利用一種孔徑為0.22μm，型號為MILLEX-GV的濾紙膜(美國Millipore公司)進行消毒過濾，這樣可得到抗每一種肽的抗體。通過在280nm波長處的吸收峰來計算純化抗體的濃度，然後通過用1mg/ml作為1.35OD的標準進行計算。這樣獲得的每一種純化後的抗體用一種用於免疫接種的肽的名稱來命名。例如，一種通過SEQ ID NO9的hFGF23-25肽進行免疫接種所得到的抗體命名為一種hFGF23-25抗體。
(3)利用抗FGF-23部分肽抗體識別FGF-23蛋白和其代謝產物利用Western印跡法(該印跡法利用由上述方法得到的h FGF23-48和hFGF23-148抗體)對CHO-FGF23H-表達細胞培養物上清液中的FGF-23H蛋白和其代謝產物進行了分析。如圖1所示，利用這兩種抗體對大約為32kDa的全長FGF-23H蛋白進行了測定。而且，觀察到了一種大小約為18或小於18kDa的代謝產物，並且它們被認為是由FGF-23蛋白(該蛋白介於如SEQ ID NO1所示的胺基酸序列中的第179位和第180位之間的胺基酸殘基)的切割所導致的N-末端片段衍生出來的。hFGF23-48抗體可識別小片段的代謝產物。CHO-FGF23RQ培養物上清液中的FGF-23RQ蛋白和其代謝物，由於產生了變異蛋白從而避免了介於第179位和第180位之間的胺基酸殘基的切割，利用hFGF23-148對FGF-23RQ蛋白和其代謝物進行了檢測。如圖1C所示，在FGF-23H例子中已被識別的片段的肽未被檢測出來。基於上述結果，通常認為在FGF-23蛋白切割的代謝中，介於第179位和第180位胺基酸殘基之間的切割產生的N-末端片段進一步斷裂成小片段，但是這樣的小片段是經過介於第179位和第180位胺基酸殘基之間的切割之後產生的。因此，當考慮FGF-23蛋白的代謝作用時，檢測介於第179位和第180位胺基酸殘基之間的切割與否非常重要。
實施例6生物素化抗體的製備利用上述9種類型經純化後的抗FGF-23部分肽的多克隆抗體和13種類型的抗FGF-23的單克隆抗體進行生物素化(biotinylated)。將Biotin-AC5-Osu(DOJINDO實驗室，日本)溶解到N，N-二甲基甲醯胺中，得到濃度為1.82mg/ml的溶液，取10μl加入到一種抗體溶液(該抗體溶液已經利用一種濃度為50mM的碳酸氫納溶液稀釋到了1mg/ml)中，然後將生成物在4℃通過上下搖蕩的方式混合2小時。接下來，將反應溶液加入到一種NAP10親和柱(美國AmershamPharmcia生物技術有限公司)中，除去未反應的Biotin-AC5-Osu，並且溶劑被PBS(-)取代了。這樣，獲得了9種類型的生物素標記的抗FGF-23部分肽的多克隆抗體和5種類型的生物素標記的抗FGF-23的單克隆抗體(1C3H抗體，1D6A抗體，2A2B抗體，2C3B抗體，和3C1E抗體)。
實施例7利用識別FGF-23專一性位點的多克隆抗體的夾心式ELISA法(1)夾心式ELISA系統的構建從上述9種類型的抗FGF-23部分肽序列的多克隆抗體中通過結合其中8種類型的抗體(hFGF23-25抗體，hFGF23-48抗體，hFGF23-114抗體，hFGF23-148抗體，hFGF23-170抗體，hFGF23-180抗體，hFGF23-210抗體，和hFGF23-237抗體)作為固定化抗體和檢測抗體對一種夾心式ELISA系統的構建進行了檢測。
為了固定抗體，用50mM的碳酸氫納溶液稀釋8種類型的抗FGF-23部分肽的多克隆抗體(hFGF23-25抗體，hFGF23-48抗體，hFGF23-114抗體，hFGF23-148抗體，hFGF23-170抗體，hFGF23-180抗體，hFGF23-210抗體，和hFGF23-237抗體)至30μg/ml。向進行ELISA系統(Maxisorp(商標)，Nunc，美國)實驗的96孔板的每一個孔中加入50μl的這種溶液，然後將該溶液在37℃培育1.5小時。接下來，除去反應溶液，向每孔中加入50μl的Superblock(商標)(PIERCE，美國)，室溫培育60分鐘，以阻滯反應的進行。在溶液除掉以後，向每一個孔中加入50μl濃度為1μg/ml的FGF-23H蛋白溶液，並且在室溫培育1小時，以將該蛋白結合到固定化的抗體上。經過抗體反應，利用T-TBS溶液洗滌孔3次。利用含量為10％Blockace(日本製藥公司)的T-TBS溶液稀釋上述8種類型的生物素標記的抗FGF-23部分肽的抗體(hFGF23-25抗體，hFGF23-48抗體，hFGF23-114抗體，hFGF23-148抗體，hFGF23-170抗體，hFGF23-180抗體，hFGF23-210抗體，和hFGF23-237抗體)到10μg/ml。這些抗體和作為對照的一種含量為10％Blockace的T-TBS溶液以50μl/孔的量加入到每一個孔中。每一種溶液在室溫培育30min，以進行次級反應。利用T-TBS溶液將每一孔洗滌3次後，利用含Blockace量為10％的T-TBS溶液稀釋標記的抗生物素蛋白鏈菌素(DAKO，丹麥)溶液到5000倍，取50μl稀釋後的溶液加入到每一個孔中。用T-TBS溶液洗滌每一孔4次，將50μl的N-四甲聯苯胺(是一種過氧化物生色底物)加入到每孔中，室溫作用15分鐘，以使其發生顏色反應。50μl濃度為0.5M的硫酸溶液加入到每孔中以停止反應。利用MTP-300(用於吸收峰測定的系統)對該96孔板(CORONA ELECTRIC CO.，LTD.，日本)進行測定，測量值為450nm處的光吸收值減去570nm處的光吸收值(見表2)。對於未加生物素標記的抗體的對照組，從450nm-570nm範圍內獲得的所有測定值都是0.06或低於0.06。然而，如表2所示，由於固定化抗體和檢測用抗體的多重結合，致使450nm-570nm的光吸收值明顯升高。如圖1所示，由於通過FGF-23蛋白的切割產生多肽的事實在目前來說是已知的，那麼在同一樣品中就可能產生由FGF-23衍生得到的不同分子類型的多肽。基於這裡的抗體可識別FGF-23的特異性位點這一事實，根據抗體的重組體可縮減所要測定的分子類型。比如，當使用一種重組體時，hFGF23-170抗體被固定化，hFGF23-25抗體作為檢測抗體，因為兩種抗體的抗原位點均包含在如SEQ ID NO1所示的胺基酸序列中的介於第25位和第179位殘基之間的N-末端部分多肽片斷，那麼就不僅能預測SEQ ID NO1所示的介於第25位和第251位殘基之間的多肽的全長，而且能利用這種重組體通過夾心式ELISA對N-末端部分多肽片段進行測定。另一方面，當hFGF23-180抗體被固定化，並且利用hFGF23-237抗體進行測定時，不僅能預測N-末端部分多肽片斷，而且能測定一種相當於如SEQ ID NO1所示的FGF-23蛋白中的第180位至第251位殘基之間的C-末端部分多肽片段。而且，舉例來說，當hFGF23-237抗體被固定化，hFGF23-25抗體作為檢測抗體時，據估計只有全長FGF-23蛋白可被檢測出(未能檢測出切割後產生的N-末端和C-末端部分多肽)。因此，利用這些重組體的複合物能夠對分析物(如生物樣品)中的FGF-23全長多肽和部分多肽進行絕對量的測定，也使得我們能夠區分這些多肽的存在比例。
表2利用抗FGF-23的多克隆抗體結合夾心式ELISA系統測定FGF-23蛋白(450nm-570nm的光吸收值)

固定化抗體的種類列在了表2中頂部的水平線之上，檢測抗體的種類如表2中的最左一列所示。表中的數字是利用每一種重組體測定得到的。
(2)利用夾心式ELISA法定量測定FGF-23蛋白根據以上描述的製備夾心式ELISA系統的方法，利用hFGF23-25抗體做固定化抗體，hFGF23-237抗體做檢測抗體對測定物質，濃度分別為1，0.33，0.1，0.033，0.01，0.0033，和0.001μg/ml的FGF-23H蛋白溶液進行了測定。測定結果如Figure2所示。在0.1-1μg/ml的濃度範圍之內，觀察到了由450nm-570nm處測定所得值的濃度依賴性增加，表明了至少在該濃度範圍內，FGF-23H蛋白能以一種濃度依賴型的方式進行測定。
實施例8FGF-23部分肽的製備除了如實施例5中所製備的對應FGF-23部分序列的肽以外，還通過化學方法合成了具有下述FGF23的部分序列的肽一種從SEQ ID NO1的殘基號38(甘氨酸)開始的13個胺基酸殘基和具有在肽的C末端加入半胱氨酸殘基的hFGF23-38肽(SEQID NO18)；一種從SEQ ID NO1中的殘基號為68(蘇氨酸)開始的包含有28個胺基酸殘基的hFGF23-68肽(SEQ ID NO19)；一種從SEQID NO1中的殘基號為96(甲硫氨酸)開始的包含有18個胺基酸殘基的hFGF23-96肽(SEQ ID NO20)；一種從SEQ ID NO1中的殘基號為129(絲氨酸)開始的包含有22個胺基酸殘基和肽的C-末端上加有一個半胱氨酸殘基的hFGF23-129肽(SEQ ID NO21)；一種從SEQID NO1中的殘基號為161(精氨酸)開始的包含有13個胺基酸殘基和肽的C-末端上加有一個半胱氨酸殘基的hFGF23-161肽(SEQ IDNO22)；一種從SEQ ID NO1中的殘基號為197(丙氨酸)開始的包含有16個胺基酸殘基的hFGF23-197肽(SEQ ID NO23)；和一種從SEQID NO1中的殘基號為220(絲氨酸)開始的包含有24個胺基酸殘基的hFGF23-220肽(SEQ ID NO24)。
hFGF23-38GLIHLYTATARNSC (SEQ ID NO18)hFGF23-96TIYSALMIRSEDAGFVVITGVMSRRYLC (SEQ IDNO19)
hFGF23-96MDFRGNIFGSHYFDPENC (SEQ ID NO20)hFGF23-96SPQYHFLVSLGRAKRAFLPGMNC (SEQ ID NO21)hFGF23-96RNEIPLIHFNTPIC (SEQ ID NO22)hFGF23-96ARMTPAPASCSQELPS (SEQ ID NO23)hFGF23-96SDPLGVVRGGRVNTHAGGTGPEGC (SEQ ID NO24)實施例9對單克隆抗體中FGF-23識別區域的檢測通過檢測含有人類FGF-23的部分序列的肽的反應活性對包含能夠被抗FGF-23單克隆抗體所識別的胺基酸序列的區域進行測定。
(1)實驗1與固定的肽相結合利用50mM的碳酸氫納溶液將實施例5中合成的肽(SEQ ID NOS7-17)稀釋到濃度為1μg/ml的溶液。50μl的這種溶液加入到ELISA系統(Maxisorp(商標)，Nunc，美國)中的96孔板中，然後將該溶液在37℃培育1小時，以固定FGF-23部分肽。接下來，除去反應溶液，向每孔中加入50μl的一種阻滯溶液(Superblock(商標)，PIERCE，美國)，然後室溫培育60分鐘，以阻滯反應的進行。在溶液除掉以後，向每一個孔中加入50μl實施例3製備的雜交瘤的培養物上清液或一種作為對照的包含有DMEM介質的HT溶液，然後將該溶液在室溫培育1小時以結合FGF-23部分肽。在抗體結合反應的後期，利用T-TBS溶液洗滌孔3次。利用一種含10％封閉溶液(Blockace(商標)，(日本製藥公司)的T-TBS溶液稀釋HRP標記的羊抗鼠IgG(H+L)-F(ab』)2片段至3000倍，取50μl稀釋後的溶液加入進每一孔中，然後將該溶液在室溫培育30分鐘以結合次級抗體。利用T-TBS溶液洗滌每個孔3次，將50μl的N-四甲聯苯胺(是一種過氧化物生色底物，丹麥，DAKO)加入到每孔中，室溫作用3分鐘，以使其發生顏色反應。下一步，50μl濃度為0.5M的硫酸溶液加入到每孔中以停止反應。利用一種吸收峰測定系統(MTP-300，CORONA ELECTRIC CO.，LTD.，日本)對該96孔板進行測定，獲得的測定值為450nm處的光吸收值減去570nm處的光吸收值。對於對照組(僅加有包含DMEM基質的HT溶液)，從450nm-570nm範圍內獲得的所有測定值都是0.06或低於0.06。然而，在該實例中(已經加入了雜交瘤培養物的上清液和固定了專一性的肽)，觀察到了光吸收值的明顯增加。這些結果如表3所示。2A2B抗體結合在了SEQ ID NO12的一種hFGF23-96肽上。1D6A表明可與SEQ ID NO17的hFGF23-148肽相結合。因此，可得出如下結論2A2B雜交瘤產生的抗體與SEQ ID NO1所示的FGF-23中的介於第148位和第163位胺基酸殘基之間的區域或部分區域相結合。而且，1C3H結合在了SEQ ID NO1所示的FGF-23中的介於第180位和第194位胺基酸殘基之間的區域或部分區域，1D6A結合在了SEQ ID NO1所示的FGF-23中的介於第237位和第251位胺基酸殘基之間的區域或部分區域。
表3具有FGF-23部分序列的固定化肽與由產生單克隆抗體的雜交瘤培養物上清液中的抗體的反應活性

(2)實驗2與固定化的肽相結合對於FGF-23，觀察到切割發生在SEQ ID NO1所示的第179位和第180位胺基酸殘基之間。為了詳細檢測識別切割位點至C-末端的區域的抗體，利用含有相應部分區域的序列的合成肽進行了結合實驗。利用50mM的碳酸氫納溶液將實施例5中合成的肽(SEQ ID NOS14，15，16和17)和實施例8中合成的肽(SEQ ID NOS23和24)稀釋到1μg/ml。50μl的這種溶液加入到ELISA系統(Maxisorp(商標)，Nunc，美國)中的96孔板中，然後將該溶液在4℃培育12小時以使其固定在平板上。接下來，除去反應溶液，向每孔中加入50μl的封閉溶液(Superblock(商標)，PIERCE，美國)，然後室溫培育60分鐘，以停止反應的進行。在溶液除掉以後，向每一個孔中加入50μl用含有10％封閉溶液(SuperBlock(商標)，PIERCE，美國)的T-TBS溶液稀釋實施例3和實施例4中純化得到的1D6A和3C1E抗體至其濃度為10μl/ml。作為對照，向一孔中加入50μl含有10％封閉溶液(Blockace(商標)，日本製藥公司)的T-TBS溶液。將該溶液在室溫培育1小時，這樣固定化的肽可與抗體進行反應。在抗體反應的後期，利用T-TBS溶液洗滌孔4次，取50μl稀釋後(稀釋方法為利用一種含10％阻滯溶液(Blockace(商標)，日本製藥公司)的T-TBS溶液稀釋HRP標記的羊抗鼠IgG(H+L)-F(ab』)2片段至3000倍)的溶液加入進每一孔中。將該溶液在室溫培育60分鐘以同次級抗體發生反應。經過T-TBS溶液洗滌每孔4次以後，向每個孔中加入50μl的N-四甲聯苯胺(DAKO，丹麥)，是一種過氧化物生色底物，室溫作用20分鐘，以使其發生顏色反應。然後，向每一孔中加入50μl濃度為0.5M的硫酸溶液以停止反應。利用一種用於96孔板的吸收峰測定系統(MTP-300，CORONA ELECTRIC CO.，LTD.，日本)對溶液進行測定，獲得的測定值為450nm處的光吸收值減去570nm處的光吸收值。結果表示在Table4。對於對照組孔板(僅加有稀釋溶液)，從450nm-570nm範圍內獲得的所有測定值均小於或等於0.05。與其相反，3C1E抗體與hFGF23-180肽(SEQ ID NO15)相結合，1D6A抗體與hFGF23-237肽(SEQ ID NO17)相結合。
表4具有FGF-23的部分序列的固定化肽與純化後單克隆抗體的反應活性

實施例10利用免疫沉澱法檢測FGF-23蛋白和從FGF-23蛋白衍生出的多肽應用免疫沉澱法的目的在於為了揭示獲得的單克隆抗體與FGF-23和從FGF-23衍生出的多肽在液相中(與固定化的肽相比，更接近生理條件)進行反應的活性，沉澱的蛋白可以利用Western印跡法進行檢測。
實施例2中製備的表達FGF-23H的CHO-FGF23細胞在CHO-S-SFM II介質(Gibco BRL，美國)中培育4天，這樣可得到包含有FGF-23蛋白，N-末端多肽片段，和C-末端多肽片段的培養物上清液。每400μl的上清液中分別加入0.5μg實施例3和實施例4中製備的抗FGF-23單克隆抗體5種類型中的1種，以製備溶液。一組僅添加緩衝溶液的樣作為對照溶液。利用上下搖蕩的方式將這些溶液在4℃混合1.5小時以確保抗體同培養物上清液中的蛋白發生反應。接下來，30μl的G蛋白4FF瓊脂糖(凝膠)(美國Amersham Pharmacia生物技術有限公司)加入到反應液中，利用上下搖蕩的方式將該溶液在4℃混合3小時，然後利用PBS溶液洗滌樹脂3次，這樣未結合到樹脂上的物質就被洗滌掉了。取一半洗滌後的樹脂，向其中加入30μl的20mM的含有DDT的緩衝溶液和20mM的不含DDT樣品的緩衝溶液(50mM的Tris-Cl溶液，pH為6.8，1％的SDS溶液，10％的甘油溶液，0.001％的溴酚藍溶液，2mM的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液)。將該溶液在95℃加熱5分鐘後進行離心分離，收集分離後的上清液。對這樣採集到的免疫沉澱物利用濃度為10％-20％的濃度梯度聚丙烯醯胺凝膠電泳進行分離。利用一種半乾印跡轉移槽(Owl Separation Systems，美國)將凝膠中的蛋白轉移到一種固定化的聚偏氟乙稀膜(美國Millipore公司)上。利用一種阻滯溶液(Blockace(商標)，日本製藥公司)阻滯PVDF膜以後，在一種生物素標記的2A2B抗體或1C3E抗體(這兩種抗體均溶解在T-TBS溶液中，將抗體稀釋到1μg/ml)溶液中在4℃培育12小時。而且，HRP標記的抗生物素蛋白鏈菌素(DAKO，丹麥)同生成物進行反應。經過洗滌之後，將生成物利用一種ECL Plus發光系統(一種電化學發光脈衝系統，美國AmershamPhamacia生物技術有限公司)曝光到一張膠片上1小時，然後膠片用自動處理器進行處理(日本富士膠片公司)。其結果如圖3所示。用於Western印跡實驗的2A2B抗體識別的位點相當於SEQ ID NO1中的長為148至163位的胺基酸序列。而且，該實驗所用的1C3H抗體表明可識別一個相當於SEQ ID NO1中的長為180至194的胺基酸序列的位點。利用這兩種抗體，可區分並識別由介於第179位和第180位胺基酸殘基之間的切割所產生的多肽片段與其它的多肽。本實驗的一個結果，單克隆抗體被分為下面的3種類型。具體地說，即為(1)兩種類型的抗體(2C3B抗體和2C5L抗體)在相應於SEQ ID NO1中的第25位和第179位之間的胺基酸序列的N-末端多肽內有一個識別序列，或者與N-末端多肽片段和FGF-23全長蛋白形成免疫複合體；(2)兩種類型的抗體(1D6A抗體和3C1E抗體)在相應於SEQ IDNO1中的第180位和第251位之間的胺基酸序列的C-末端多肽內有一個識別序列，並與C-末端多肽片段和FGF-23全長蛋白形成免疫複合體；(3)一種抗體(2A2B抗體)未檢測到免疫沉澱物。
實施例11利用抗FGF-23的單克隆抗體和抗FGF-23的多克隆抗體通過ELISA測定FGF-23蛋白2種類型的單克隆抗體(1D6A抗體和2C3B抗體)分別固定化，然後利用5種類型的多克隆抗體(hFGF23-25抗體，hFGF23-170抗體，hFGF23-180抗體，hFGF23-210抗體，和hFGF23-237抗體。這5種類型的多克隆抗體在實施例7中表明其作為檢測抗體是有效的)中的一種通過夾心式ELISA系統對純化後FGF-23蛋白進行了測定。
利用50mM的碳酸氫納溶液稀釋上述經由一種G蛋白親和層析柱純化過的兩種類型的單克隆抗體，使稀釋後單克隆抗體的濃度為10μl/ml。50μl的這種溶液加入到ELISA系統(Maxisorp(商標)，Nunc，美國)的96孔板中，然後將該溶液在37℃培育1小時以進行固定化。接下來，除去反應溶液，向每孔中加入50μl的阻滯溶液(Superblock(商標)，PIERCE，美國)，然後在室溫培育30分鐘，以阻滯反應的進行。在溶液除掉以後，利用含吐溫20為0.05％的PBS(T-PBS)溶液洗滌每個孔3次。每個孔中加入50μl濃度均為0.1μg/ml的下列溶液之一純化後的FGF-23H蛋白，純化後的N-末端多肽片段，和純化後的具有6組胺基酸標記的C-末端多肽片段。將該溶液在室溫培育2小時以使其和固定化抗體進行反應。抗體經過反應後，利用T-TBS溶液洗滌孔3次。5種類型的生物素標記的抗FGF-23部分肽的多克隆抗體(hFGF23-25抗體，hFGF23-170抗體，hFGF23-180抗體，hFGF23-210抗體，和hFGF23-237抗體) 利用含阻滯溶液為0.05％的T-TBS溶液稀釋到2.5μg/ml，將該溶液在室溫培育30分鐘以進行次級抗體反應。利用T-TBS溶液洗滌每個孔3次之後，利用含阻滯溶液為10％的(Blockace(商標)，日本製藥公司)T-TBS溶液稀釋HRP標記的抗生物素蛋白鏈菌素(DAKO，丹麥)溶液至5000倍，取50μl稀釋後的溶液加入進每個孔中，將該溶液在室溫培育30分鐘以使抗生物素蛋白鏈菌素與生物素標記的抗體相結合。利用T-TBS溶液洗滌每一個孔4次之後，將50μl的N-四甲聯苯胺(是一種過氧化物生色底物，DAKO，丹麥)加入到每一個孔中，接下來在室溫進行培育。7分鐘之後，50μl濃度為0.5M的硫酸溶液加入到每一孔中以停止反應。利用一種測定96孔板的光吸收值的系統(MTP-300，CORONAELECTRIC CO.，LTD.，日本)進行測定，獲得的測定值為450nm處的光吸收減去570nm處的光吸收。結果如圖4所示。對於沒有加抗體的對照組，從450nm-570nm範圍內獲得的所有測定值均小於0.015或低於0.015。然而，倚賴於固定化抗體和檢測用抗體的結合，反應對於FGF-23全長蛋白(圖4A)，N-末端多肽片段(圖4B)，和C-末端多肽片段(圖4C)而言是特異性的。基於在反應活性上的差別，能夠證實抗FGF-23單克隆抗體的識別位點。尤其是，利用2C3B抗體的重組體作為一種固定化抗體，3種類型的生物素化了的多克隆抗體(hFGF23-180抗體，hFGF23-210抗體，和hFGF23-237抗體)之一作為檢測抗體，對全長FGF-23蛋白進行了檢測。但是，既沒有檢測到N-末端多肽片段，也沒有檢測到C-末端多肽片段。另一方面，利用生物素標記的可識別N-末端多肽片段的多克隆抗體(hFGF23-25抗體和hFGF23-170抗體)檢測到了全長FGF-23蛋白和N-末端多肽片段，但沒有檢測到C-末端多肽片段。
因此，這就證實了2C3B抗體能夠識別N-末端多肽片段。當1D6A抗體被固定時，利用多克隆抗體作為識別N-末端多肽片段的檢測抗體，檢測全長蛋白。但是，未檢測到N-末端多肽片段和C-末端多肽片段。另一方面，當利用多克隆抗體作為識別C-末端多肽片段的檢測抗體，檢測全長蛋白和C-末端多肽片段時，利用1D6A抗體與hFGF23-180結合的檢測方法是可行的。這些結果表明1D6A抗體可與hFGF23-237多克隆抗體競爭，這樣就證實了可識別SEQ ID NO1中的介於第237位和第251位胺基酸殘基之間的一段區域。
實施例12利用組合的抗FGF-23的單克隆抗體通過夾心式ELISA法檢測FGF-23蛋白純化後的FGF-23蛋白利用實施例3和實施例4中獲得的4種固定類型的抗FGF-23的單克隆抗體通過夾心式ELISA法進行檢測，這4種類型的生物素標記的抗FGF-23的單克隆抗體為實施例6中作為檢測抗體而製得的。
利用50mM的碳酸氫納溶液稀釋4種類型的FGF-23單克隆抗體(1D6A抗體，2A2B抗體，2C3B抗體，和3C1E抗體)至濃度為10μg/ml。50μl的這種溶液加入到ELISA系統(Maxisorp(商標)，Nunc，美國)的96孔板中，然後在4℃培育12小時以進行固定化。接下來，除去反應溶液，向每孔中加入50μl的阻滯溶液(Superblock(商標)，PIERCE，美國)。生成物在室溫培育20分鐘，以阻滯反應的進行。在溶液除掉以後，利用含吐溫20為0.1％的TBS(T-TBS)溶液洗滌每個孔3次。每個孔中加入50μl濃度均為0.1μg/ml的純化後的FGF-23蛋白溶液。將該溶液在室溫培育1小時以使其和固定化抗體進行反應。抗體經過反應後，利用T-TBS溶液洗滌孔4次。3種類型的生物素標記的抗FGF-23單克隆抗體(1D6A抗體，2C3B抗體，和3C1E抗體)利用含阻滯溶液為10％的T-TBS溶液稀釋到10μg/ml，取這樣的溶液加入每一孔板中。將該溶液在室溫培育1小時以進行次級抗體反應。利用T-TBS溶液洗滌每一個孔4次之後，利用含阻滯溶液為10％的(Blockace(商標)，(日本製藥公司)T-TBS溶液稀釋HRP標記的抗生物素蛋白鏈菌素(DAKO，丹麥)溶液至5000倍，取50μl稀釋後的溶液加入進每一孔中，將該溶液在室溫培育20分鐘以使抗生物素蛋白鏈菌素與生物素標記的抗體相結合。利用T-TBS溶液洗滌每個孔4次並且將50μl的N-四甲聯苯胺(是一種過氧化物生色底物，DAKO，丹麥)加入到每一個孔中，接下來在室溫進行培育。30分鐘之後，50μl濃度為0.5M的硫酸溶液加入到每一孔中以停止反應。測定通過利用一種測量96孔板的光吸收值的系統(MTP-300，CORONA ELECTRIC CO.，LTD.，日本)而進行，測量值為450nm下的光吸收值減去570nm下的光吸收值。結果如表6所示。對於沒有加固定化抗體或檢測抗體的對照組，從450nm-570nm範圍內獲得的所有測定值均小於0.033或等於0.033。然而，倚賴於固定化抗體和檢測用抗體的結合，觀察到光吸收值有增加的現象。舉例來說，當進行夾心式ELISA實驗時，利用2C3B抗體作為固定化抗體(在SEQ IDNO1所示的FGF-23蛋白的胺基酸序列中的介於第25位和第179位胺基酸殘基之間的區域內具有一個識別位點)，生物素標記的1D6A和3C1E抗體作為檢測用抗體(在SEQ ID NO1所示的FGF-23蛋白的胺基酸序列中的介於第180位和第251位胺基酸殘基之間的區域內具有識別位點)，得到的所有450nm-570nm的光吸收值均高達2.9或更高。由SEQ ID NO1所示的FGF-23蛋白的胺基酸序列中的介於第179位精氨酸和第180位絲氨酸之間的切割所得到的多肽片段以該種方式通過夾心式ELISA實驗從被測定的序列中去除掉了。因此，利用這樣一種抗體的重組體，不用識別N-末端多肽片段或C-末端多肽片段就能夠將未切割的FGF-23蛋白高靈敏度地檢測出來。當將實施例2中製備的全長FGF-23H蛋白，N-末端多肽片段，和C-末端多肽片段以與以前報導相似的方式接種小鼠時，僅在全長FGF-23H蛋白的病例中出現了血清中磷的量誘導降低的現象。因此，如SEQ IDNO1所示的FGF-23蛋白的胺基酸序列中的介於第179位精氨酸和第180位絲氨酸之間的切割極大的改變了FGF-23蛋白的活性。利用這裡所示的方法(包括去除切割的多肽的同時，選擇性檢測未切割的FGF-23H蛋白)，可以更加精確地檢測和測定樣品中具有活性的FGF-23。另一方面，當如SEQ ID NO1所示的FGF-23蛋白的胺基酸序列中的介於第180位和第251位胺基酸殘基之間的區域內具有識別位點的1D6A抗體和3C1E抗體被作為固定化抗體，並且生物素標記的1D6A抗體和3C1E抗體也被用於檢測用抗體時，通過抗體間的競爭相似地表明了具有可識別如SEQ ID NO1所示的胺基酸序列中的介於第180位和第194位胺基酸殘基之間的區域的3C1E抗體組其識別位點與具有可識別如SEQ ID NO1所示的胺基酸序列中的介於第237位和第251位胺基酸殘基之間的區域的1D6A抗體的識別位點不同。而且，實驗還表明結合使用這些抗體可以建立一種測定方法，利用該測定方法可除去位於SEQ ID NO1所示的胺基酸序列中的介於第25位和第179位胺基酸殘基之間的多肽片段，並且可以高靈敏度檢測出第180位至第251位殘基之間的C-末端多肽片段。
表5結合利用抗FGF-23的單克隆抗體(作為固定化抗體)和生物素化的抗體(作為檢測抗體)通過夾心式ELISA法檢測FGF-23蛋白獲得的光吸收值。

實施例13利用抗FGF-23的單克隆抗體通過夾心式ELISA法定量測定FGF-23蛋白利用50mM的碳酸氫納溶液稀釋2C3B抗體至濃度為10μg/ml。50μl的這種溶液加入到ELISA系統(Maxisorp(商標)，Nunc，美國)的96孔板中，然後在4℃培育12小時以進行固定化。接下來，除去反應溶液，向每孔中加入250μl的阻滯溶液(Superblock(商標)，PIERCE，美國)，然後生成物在室溫培育20分鐘，以阻滯反應的進行。在溶液除掉以後，利用含吐溫20為0.1％的TBS(T-TBS)溶液洗滌每一個孔2次。利用含阻滯溶液(SuperBlock(商標)，PIERCE，美國)為10％的T-TBS溶液稀釋實施例2中純化後得到的FGF-23蛋白，得到一組濃度分別為10，3，1，0.3，0.1，0.03，0.01，或0.003ng/ml的FGF-23蛋白溶液。每種溶液取50μl加入到每個孔中。將該溶液在室溫培育1小時以使其和固定化抗體進行反應。抗體經過反應後，利用T-TBS溶液洗滌孔4次，2種類型的生物素標記的抗FGF-23單克隆抗體(1D6A抗體和3C1E抗體)利用含封閉溶液(Blockace(商標)，(日本製藥公司)為10％的T-TBS溶液稀釋到10μg/ml，取這樣的溶液加入每一孔板中。將該溶液在室溫培育30分鐘以進行次級抗體反應。利用T-TBS溶液洗滌每一個孔4次之後，利用含阻滯溶液為10％的(Blockace(商標)，(日本製藥公司)T-TBS溶液稀釋HRP標記的抗生物素蛋白鏈菌素(DAKO，丹麥)的溶液至5000倍，取50μl稀釋後的溶液加入進每一孔中。將該溶液在室溫培育30分鐘以使抗生物素蛋白鏈菌素與生物素標記的抗體相結合。利用T-TBS溶液洗滌每個孔4次後，將50μl的N-四甲聯苯胺(是一種過氧化物生色底物，DAKO，丹麥)加入到每個孔中，接下來在室溫進行培育。25分鐘之後，50μl濃度為0.5M的硫酸溶液加入到每一孔中以停止反應。測定通過利用一種測量96孔板的光吸收值的系統(MTP-300，CORONA ELECTRIC CO.，LTD.，日本)而進行，測量值為450nm下的光吸收值減去570nm下的光吸收值。結果如圖6所示。由於FGF-23蛋白(濃度至少為0.03ng/ml)的存在，觀察到了測定值的顯著增大，並且在0.03-大約3ng/ml的濃度範圍之內，獲得了在450nm-570nm範圍內所有測定值具有濃度倚賴性增加的結果，表明在該濃度範圍之內可測定FGF-23蛋白。
實施例14抗FGF-23單克隆抗體固定層析柱的製備利用一種商業化的固定試劑(SulfoLink(商標)，PIERCE，美國)製備了一種固定化的抗FGF-23抗體的層析柱，該層析柱通過免疫沉澱方法在收集FGF-23蛋白或純化FGF-23蛋白方面是有效的。將1C3H抗體，1D6A抗體，和2C3B抗體在pH值為6.0，濃度為0.1M的磷酸鹽緩衝液(含5mM的乙二胺四乙酸)中進行稀釋，分別製得濃度為1mg/ml，1mg/ml，和0.4mg/ml的溶液。向1ml的這種抗體溶液中加入6mg的2-巰基乙醇胺，所得溶液在37℃以上下搖蕩的方式混合1小時，然後，抗體內的二硫鍵通過約簡反應被切割。當緩衝液利用1.5ml的一種結合緩衝溶液(50mM的Tris/HCl溶液，pH值為8.5，5mM的EDTA)在NAP 10層析柱(美國Amersham Pharmacia生物技術有限公司)中進行交換時，除掉2-巰基乙醇胺以停止約簡反應。這些抗體溶液加入到已利用結合緩衝溶液洗滌過的1ml的SulfoLink(商標)結合凝膠(PIERCE，美國)中。該溶液在室溫以上下搖蕩的方式混合30分鐘以進行結合反應。經過離心過濾後，利用一種結合緩衝液對樹脂進行洗滌。為了阻滯未反應的硫醇基，加入1ml濃度為0.05mM的左旋半胱氨酸-鹽酸溶液，然後將該溶液在室溫以上下搖蕩的方式混合30分鐘。接下來，利用1M的氯化鈉溶液洗滌樹脂以除去未反應的抗體和左旋半胱氨酸。
實施例15利用免疫沉澱法對存在於CHO-FGF23H細胞轉導小鼠中的FGF-23蛋白進行檢測為了檢測FGF-23蛋白在血液中的存在狀態，表達FGF-23H的細胞被轉移至裸鼠中，然後，由這些細胞分泌到血液中的FGF-23H蛋白利用免疫沉澱法檢測到了。2×107的CHO-FGF23H細胞，或CHO ras克隆1細胞作為對照以皮下轉導方式轉導至每一隻Balb/c裸鼠中。轉導後的第32天，從細胞已成功粘附形成腫瘤的小鼠中採集血清。將從5隻CHO ras克隆1轉導小鼠中採集到的血清和從6隻CHO-FGF23H轉導的小鼠中採集到的相同量的血清以相同的體積各自獨立地混合。向150μl各自混勻的血清中分別加入下列物質10μl實施例14中製備的已固定上1D6A抗體的樹脂，10μl實施例14中製備的已固定上2C3B抗體的樹脂，和10μl未固定抗體的樹脂。將生成物在4℃以上下搖蕩的方式混合1小時。以利於抗體和FGF-23進行反應。利用PBS溶液洗滌該樹脂3次以除去未反應的產物。向每一種樹脂中加入一種50μl的緩衝液(50mM的Tris-Cl溶液，pH值為6.8，1％的SDS溶液，10％的甘油溶液，0.001％溴酚藍溶液，2mM的EDTA溶液，和20mM的DDT溶液)。生成物在95℃加熱5min，然後進行離心分離。收集這樣得到的上清液。利用濃度為10％-20％的梯度聚丙烯醯胺凝膠電泳對上清液進行分離，通過一種半乾印跡轉移槽(Owl Separation Systems，美國)將凝膠中的蛋白轉移到一種聚偏氟乙烯膜(美國Millipore公司)上。聚偏氟乙烯膜在經由(Blockace(商標)，日本製藥公司)稀釋至0.5μg/ml的一種生物素標記的2A2B或1C3H抗體溶液中在4℃條件下培育12小時。而且，HRP標記的抗生物素蛋白鏈菌素(DAKO，丹麥)同生成物進行反應。利用一種ECL Plus發光系統(美國Amersham Pharmacia Biotech公司)將混合溶液暴露於膠片上1小時，然後用自動處理器(日本富士膠片公司)進行處理。結果如圖7所示。對於沒有固定化抗體的樹脂，根本就沒有檢測到信號分子。然而，當利用1C3H抗體進行免疫沉澱，利用2A2B抗體作檢測之用時，檢測到了一種22kDa的信號分子。當利用1C3H抗體進行檢測之用時，檢測到了22kDa和10kDa的信號分子。此外，當利用1D6A抗體進行免疫沉澱，利用2A2B抗體作檢測之用時，未檢測到22kDa的信號分子，當1C3H抗體作為檢測之用時，僅檢測到了一種10kDa的信號分子。而且，當利用2C3B抗體進行免疫沉澱和利用2A2B抗體作檢測之用時，檢測到了22kDa和16kDa的信號分子，當利用1C3H抗體進行檢測時，僅檢測到了一種22kDa的信號分子。表明2A2B抗體可識別SEQ ID NO1中的介於第148位和第163位胺基酸殘基之間的區域，1C3H抗體可識別SEQ ID NO1中的介於第180位和第194位胺基酸殘基之間的區域。而且，通過Western印跡法實驗表明2A2B抗體可識別N-末端多肽片段(該片段相當於SEQ ID NO1所示的介於第25位和第179位胺基酸殘基之間一段序列)，通過電泳檢測信號分子的分子量為16kDa。已經表明1C3H抗體可識別如SEQ ID NO1所示的介於第180位和第251位胺基酸殘基之間的C-末端多肽片段，檢測到的信號分子的分子量為16kDa。因此，這就清楚的表明了該實驗中測定到的16kDa的信號分子是N-末端多肽片段，10kDa的信號分子表明是C-末端多肽片段。此外，從小鼠血清中採集到的分子量為22kDa的多肽能夠被下列抗體所識別能識別第25位至第179位胺基酸殘基之間的N-末端區域的2C3B抗體；能識別第148位至第163位胺基酸殘基之間區域的2A2B抗體，和由1C3H產生的能識別介於第180位和第194位胺基酸殘基之間的抗體，但該多肽不能被1D6A抗體所識別(該抗體能識別如SEQ IDNO1所示的介於第237位和第251位胺基酸殘基之間的區域)。本實驗中觀察到的分子量大約為22kDa的信號分子可能由FGF-23蛋白的切割產生，切割位點位於1C3H抗體識別區域的C-末端。在對血清進行測定的實驗中觀察到了與發生於SEQ ID NO1所示的第179位精氨酸和第180位絲氨酸之間的切割不同的切割和由切割產生的片段，對此我們予以了注意。
實施例16血清中FGF-23蛋白的切割(1)大鼠血清和純化後的FGF-23蛋白的混合實驗通過混合純化後的FGF-23蛋白和大鼠血清對血清中FGF-23蛋白的切割進行了檢測。大鼠血清加入到20ng純化後的FGF-23蛋白中，得到最終濃度為50％。將兩種溶液混合併進行培養0，0.5，1，2，4，8，和24小時。通過聚丙烯醯胺電泳分離溶液，然後通過一種半乾印跡轉移槽(Owl Separation Systems，美國)將凝膠中的蛋白轉移到一種聚偏氟乙烯(美國Millipore公司)膜上。利用2A2B抗體通過Western印跡法進行測定，可測定由純化後的FGF-23蛋白衍生得到的代謝物。其結果如圖8所示。和血清混合以後，存在於溶液中的全長FGF-23蛋白的數量隨培育時間的增加而降低，並且觀察到了分子量為22kDa的新片段的出現及增加。
(2)人的血清或血漿與純化後的FGF-23蛋白的混合實驗將人的血清或人血漿以最後50％的濃度加入到20ng的純化的FGF-23蛋白，接著在37℃溫育3小時。將溶液通過聚丙烯醯胺凝膠分離，然後將凝膠上的蛋白利用半乾印跡系統(Owl分離系統，美國)轉移到PVDF膜上(Millipore美國)。利用2A2B抗體通過Western印跡法進行測定，可測定由純化後的FGF-23蛋白衍生得到的代謝物。其結果如圖9所示。當人的血清與FGF-23蛋白混合時，出現了一條分子量為22kDa的條帶。但是，當人的血漿與FGF-23蛋白混合時，未出現一條分子量為22kDa的條帶。因此，推斷該22kDa的條帶來源於存在於血清中的蛋白切割酶。
實施例17切割FGF-23蛋白的酶的鑑定(1)凝血酶作用下的FGF-23的切割凝血酶(美國Sigma公司)加入到20ng純化後的FGF-23蛋白中，得到最終濃度為1單位/ml的溶液，接下來培育3小時。將培育後的溶液利用聚丙烯醯胺凝膠電泳進行分離，然後通過一種半乾印跡轉移槽(Owl Separation Systems，美國)將凝膠中的蛋白轉移到一種PVDF膜(美國Millipore公司)上。利用2A2B抗體通過Western印跡法進行測定，可測定由純化後的FGF-23蛋白衍生得到的代謝物。其結果如圖10所示。全長FGF-23蛋白消失，並且其帶轉換成22kDa的帶。
(2)水蛭素對血清中FGF-23蛋白切割的抑制作用為了檢測血清中凝血酶對FGF-23切割的作用，對水蛭素(已知其為一種凝血酶選擇性抑制劑)的效果進行了檢測。以最後濃度為50％，在20ng的純化的FGF-23蛋白中加入大鼠血清，接著溫育4小時。而且，加入大鼠血清的同時，加入了濃度為1.0單位/ml的水蛭素，接下來進行類似的溫育。將該溶液利用聚丙烯醯胺凝膠電泳進行分離，然後將凝膠中的蛋白利用一種半乾印跡轉移槽(Owl SeparationSystems，美國)轉移到一種PVDF膜(美國Millipore公司)上。利用2A2B抗體通過Western印跡法進行測定，可測定由純化後的FGF-23蛋白衍生得到的代謝物。其結果如圖11所示。對於加入大鼠血清的溶液，一些FGF-23蛋白轉化成了22kDa的多肽，並且由於水蛭素的存在，抑制了22kDa條帶的出現。所以，實驗表明血清中產生的FGF蛋白的切割是由於凝血酶或與其類似的酶。
實施例18血清中FGF-23蛋白切割位點的鑑定為了鑑定血清中FGF-23的切割位點，10μg純化後的FGF-23蛋白和大鼠血清混合24小時，由此產生22kDa的多肽。該溶液中22kDa的多肽被吸附於實施例14中製備的抗1C3H的抗體柱上，洗脫，並純化。用於此處的抗體柱通過在500μl固定鏈黴抗生素的樹脂(美國Amersham Pharmacia生物技術有限公司)上吸附200μg生物素化的1C3H抗體而製得。衍生得到的FGF-23蛋白利用0.1M的甘氨酸溶液(pH值為2.7)從抗體柱上洗脫。這樣純化的多肽通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳進行分離，用CBB進行染色，以致可以如圖12中所示鑑定純化的22kDa多肽。切出這條帶，進行MALDI-TOF MS分析。基於從該分析中得到的分子量，表明這種22kDa的多肽具有如SEQ IDNO1所示的胺基酸序列中的從第25位酪氨酸至第196位精氨酸之間的一段序列。
這些結果顯示在血清中，FGF-23蛋白被血清中的凝血酶在SEQID NO1所示的胺基酸序列中的從第196位精氨酸之後的位置進行切割，然後，轉換成SEQ ID NO1中的介於第25位和第196位胺基酸殘基之間的一段序列所示的多肽。如上所述，測定血液中具有活性的FGF-23蛋白需要檢測SEQ ID NO1所示的胺基酸序列中的介於第179位和第180位胺基酸殘基之間未進行切割的多肽。實驗表明具有活性的全長FGF-23蛋白在製備血清樣品過程中在第196位和第197位胺基酸殘基之間發生了部分切割，識別C-末端的抗FGF-23單克隆抗體不能識別由其本身產生的代謝物。尤其是，當利用可識別SEQ ID NO1所示胺基酸序列中的介於第25位和第179位胺基酸殘基之間的區域的一種抗體，和可識別SEQ ID NO1所示胺基酸序列中的介於第180位和第196位胺基酸殘基之間的區域的一種抗體結合進行夾心式ELISA實驗時，血清製備過程中所導致的切割效應可以忽略不計。然而，當利用一種可識別SEQ ID NO1所示胺基酸序列中的介於第25位和第179位胺基酸殘基之間的區域的抗體，和一種可識別SEQ IDNO1所示胺基酸序列中的介於第197位和第251位胺基酸殘基之間的區域的抗體時，與血漿相比，血清中的測定值可能下降。在得到的抗FGF-23的單克隆抗體中，1C3H抗體和3C1E抗體可識別SEQ IDNO1所示胺基酸序列中的介於第180位和第194位胺基酸殘基之間的區域。因此，血清中FGF-23的切割得到的22kDa的蛋白(對應於SEQ ID NO1所示胺基酸序列中的第25位和第196位胺基酸殘基之間的一段序列)可被識別，其與在SEQ ID NO1所示胺基酸序列中的介於第179位和第180位胺基酸殘基之間的切割產生的多肽片段具有明顯差異。因此，表明這些抗體在建立測定血清樣品的方法中是非常有用。
實施例19對患有腫瘤誘導骨軟化症病人中血清和血漿中FGF-23蛋白濃度的定量分析已有報導表明在腫瘤誘導的骨軟化症中，FGF-23在腫瘤中過量的生成，已知該疾病可通過除去病原性腫瘤而治癒。但是，腫瘤誘導的骨軟化症中的病原性腫瘤由於生長力弱，一般較小，經常很難辨別。因此，腫瘤誘導的骨軟化症和低磷酸鹽血症很難辨別診斷。因此，如果證明血液中FGF-23的濃度能夠作為診斷腫瘤誘導的骨軟化症的指示劑，就可發展一種定量測定血液中FGF-23濃度的方法，這樣的方法在臨床上非常有用的。
從腫瘤誘導的骨軟化症病人中獲得血清和血漿樣品，利用抗FGF-23的單克隆抗體通過夾心式ELISA系統對分析物中的FGF-23進行定量分析。上述方法利用了抗FGF-23單克隆抗體和ELISA系統。2C3B抗體用作固定化抗體，生物素標記的3C1E或1D6A抗體用於檢測用抗體。純化的2C3B抗體用50mM的碳酸氫鈉溶液稀釋至10μg/ml。向ELISA(Maxisorp(商標)，Nunc，美國)實驗用的96孔板中的每個孔加入50μl得到的溶液，然後在4℃溫育12小時固定。隨後，除去反應溶液，每孔中加入250μl的阻滯溶液(SuperBlock(商標)，PIERCE，美國)，得到的溶液在室溫培育30分鐘，由此進行封閉。溶液被除去之後，每一個孔用含有0.1％吐溫20的TBS(T-TBS)溶液洗滌2次。為了避免與小鼠抗體發生非特異性反應，腫瘤誘導骨軟化症病人的血清和血漿樣品利用含有小鼠IgG1的T-TBS溶液稀釋2倍，濃度為80μg/ml的小鼠IgG1作為同型對照。而且，為了確保與FGF-23蛋白發生特異性反應，樣品均用含有過量體積(80μg/ml)的用於固定化的2C3B抗體的T-TBS溶液稀釋2倍。產生標準曲線的標準溶液為通過向正常受試者的血清或血漿中添加純化的FGF-23蛋白，用類似含有同型對照抗體的溶液進行稀釋，最終形成濃度分別為0.5，0.25，0.125，0.061，0.031，和0.015ng/ml的溶液。加50μl各樣品至微量滴定盤的每孔中，然後溶液在室溫培育1小時，以使分析物中的FGF-23蛋白與固定化的抗體發生反應。抗體反應完成之後，每一個孔用T-TBS溶液洗滌4次，然後向孔中加入兩種類型用生物素標記的含有10％阻滯劑(Blockace(商標)，日本製藥公司)的T-TBS溶液稀釋至10μg/ml的抗FGF-23的單克隆抗體的溶液(含有1D6A抗體和3C1E抗體)。該溶液在室溫培育30分鐘，以進行次級抗體反應。用T-TBS溶液將孔洗滌4次後，每孔加入50μl用含有10％封閉液(Blockace(商標)，日本製藥公司)的T-TBS溶液稀釋5000倍的HRP(辣根過氧化物酶)標記的抗生物素蛋白鏈菌素(DAKO，丹麥)。該溶液在室溫培育30分鐘，以使抗生物素蛋白鏈菌素與生物素標記的抗體相結合。每個孔用T-TBS溶液將孔洗滌4次，然後向每孔加入50μl的N-四甲聯苯胺溶液(是一種過氧化物酶生色底物，DAKO，丹麥)，室溫培育。30分鐘後，每孔加入50μl 0.5M的硫酸溶液，以停止反應。利用一個測定96孔板(MTP-300，CORONAELECTRIC CO.，LTD.，日本)的光吸收的系統進行測定，其值為450nm的吸收值減去570nm的吸收值。一個代表FGF-23特異性反應的吸收值為存在過量同型對照抗體時所測得的450nm的吸收值減去570nm的吸收值。結果見圖13。當1D6A抗體用作檢測抗體時，血漿和血清樣品的測量值分別為0.033和0.008。測得的血清樣品的吸收值明顯低於血漿。另一方面，當3C1E用作檢測抗體時，血清和血漿中樣品的吸收值幾乎完全相同。這些結果表明，如實施例18描述的在血清中切割那樣，FGF-23蛋白可能在樣品中部分切割。因此，結果表明臨床樣品的測量值隨上述檢測用的抗體的不同而存在差異。因此，利用3C1E抗體作為一種檢測抗體的夾心式ELISA系統也能夠對血清中產生的切割產物進行測定，然後對腫瘤切除前後採集的血漿中FGF-23的濃度進行了測定。利用通過向正常受試者的血漿樣品中加入不同濃度的純化後的FGF-23蛋白而製得的標準溶液，基於純化的蛋白量的增加光吸收值也增加的事實製得一條標準曲線。由此得到的標準曲線見圖14A。由此得到的標準曲線也能被用於在稀釋了2倍的人的血清或血漿樣品中利用檢測變化範圍介於30pg/ml和至少約500pg/ml(該值在標準曲線中是一個明顯增加的濃度值)之間定量分析FGF-23蛋白。在這樣的條件下，從腫瘤誘導的骨軟化症病人腫瘤切除之前的一天和腫瘤切除之後的一個月或更長時間對血漿樣品中的FGF-23濃度進行了定量測定，測定結果見圖14B。腫瘤切除之前血漿樣品中的FGF-23蛋白濃度約為270pg/ml。但是，在腫瘤切除之後的樣品中，FGF-23蛋白濃度降至檢測閾值(30pg/ml)或更少。因此，清楚表明在腫瘤誘導的骨軟化症中，由於病原腫瘤的存在，血液中FGF-23以可檢測到的濃度存在，腫瘤切除之後FGF-23蛋白的濃度顯著降低。利用抗FGF-23單克隆抗體的ELISA法在診斷腫瘤誘導的骨軟化症中非常有用，利用具有特異識別位點的抗體(將血清中FGF-23的切割效應也考慮進來)，使定量測定成為可能。
實施例20用抗FGF-23單克隆抗體進行免疫組織學染色腫瘤誘導的骨軟化症中的病原腫瘤用一個抗FGF-23的單克隆抗體進行染色。將切除的一個腫瘤浸泡在一種包埋性溶液中，為冷凍做好準備，冷凍劑使用液氮冷卻的丙酮，由此製得冷凍的腫瘤結塊。除此以外，將從腫瘤組織周緣確定為正常組織的部分切取一塊作為對照，冷凍成結塊。用低溫保持器(CMI1900，LEICA，德國)將冷凍的結塊切成厚度為4μm的薄片。該切片被粘附到MAS包被的載玻片上(MATSUNAMI GLAS IND.，LTD.，日本)，進行冷凍和乾燥。由此製得的切片在零下20℃下保藏。粘附上冷凍切片的載玻片在丙酮中於室溫培育5分鐘，以使組織固定在載玻片上。用磷酸鹽緩衝液洗滌之後，在含有1％過氧化氫和0.1％疊氮化鈉的磷酸鹽緩衝液中，室溫培養30分鐘，以使內生性過氧化物酶失活。隨後，混合溶液用含有0.1％吐溫20的磷酸鹽緩衝液洗滌，然後在含有4％脫脂乳的磷酸鹽緩衝液中室溫培養30分鐘，進行封閉反應。隨後，在含有10μg/ml的生物素標記的1C3H和2C3B抗體的磷酸鹽緩衝液中室溫培養1小時，使組織中的FGF-23與加入的單克隆抗體發生反應。用含有0.1％吐溫20的磷酸鹽緩衝液洗滌之後，用一個過氧化物酶試劑盒(Vectastain Elite ABC(商標)，VECTOR實驗室，美國)將山葵過氧化物酶與和組織特異性結合的生物素標記的單克隆抗體相結合。用含有0.1％吐溫20的磷酸鹽緩衝液洗滌之後，進行過氧化物酶與底物(DAKO液相DAB底物顯色系統(商標)，DAKO，丹麥)的反應，然後用磷酸鹽緩衝液中止反應。用離子交換水洗滌之後，在用離子交換水稀釋5倍的蘇木精染色液(Merck Co.，美國)中室溫培養30秒，然後用活水洗滌。接下來，用乙醇進行脫水，用二甲苯進行滲透，然後混合溶液用封裝液封面。結果見圖15。認為與腫瘤組織中的FGF-23發生反應的位點被染成褐色。可是，沒有在腫瘤周緣組織中觀察到染色的影像。因此，確定在腫瘤誘導的骨軟化症的病原性腫瘤中存在高濃度的FGF-23。
實施例21小鼠FGF-23蛋白的表達與純化小鼠FGF-23的序列已經有過報導(Yamashita，T.等，生物化學與生物物理研究通訊，277494-498，2000)。小鼠FGF-23的序列信息能通過搜索NCBI基因序列資料庫而獲得。基於由此得到的序列信息，利用嵌套PCR以獲得編碼小鼠FGF-23蛋白的cDNA。擴增反應第一階段使用的引物為一個mF5引物(見SEQ ID NO25)和一個mF3引物(見SEQ ID NO26)(5』端和3』端不翻譯的區域分別互補)，小鼠FGF-23蛋白的cDNA序列被合成。94℃保持1分鐘後，以從小鼠肺部取得的cDNA(克隆技術公司，美國)為模板，進行30個PCR循環。使用的酶為LA-Taq DNA聚合酶(日本寶酒造公司)，每個循環包括94℃，30秒；55℃，30秒；72℃，45秒。接下來，反應的第二階段利用如下兩個引物一個含有SEQ ID NO27所示的從初始密碼子至翻譯區域的mF23F引物，和一個含有SEQ ID NO28所示的從翻譯區域至終止密碼子的mF23R引物。在mF23F引物中，引入了一個克隆用的EcoR I限制酶識別序列和一個Kozak序列。同時，在mF23R引物中，在終止密碼子後面引入了一個Not I限制酶識別序列。98℃保持1分鐘後，以第一階段反應的反應溶液作為模板，進行35個PCR循環。使用的酶為PyroBest DNA聚合酶(日本寶酒造公司)，每個循環包括98℃，10秒；58℃，10秒；72℃，60秒。因此，編碼小鼠FGF-23蛋白的cDNA序列得以擴增。該cDNA被克隆至一個pEAK8載體(EdgeBiosystem，美國)的EcoR I位點和Not I位點。該載體即pEAK8mFGF-23。而且，根據實施例1中製備FGF-23RQH的方法，構建小鼠的FGF-23RQ，其中引入一個突變，即在小鼠的FGF-23切割酶識別位點以一個穀氨酸殘基代替一個精氨酸殘基。該突變的引入方法參見實施例1(3)中所描述的方法。為了引入該突變，合成了兩個引物一個是正向引物mRQF(見SEQ ID NO29)，另一個是反向引物mRQR(見SEQ ID NO30)。首先，利用pEAK8mFGF-23為模板，一個mF23F引物和mRQR引物的重組體，和一個mF23R引物和mRQF引物的重組體，進行PCR反應，由此獲得每種樣品的PCR片段。接下來，利用兩種產物的混合物作為模板，位於小鼠FGF-23cDNA兩個末端的一個mF23F和一個mF23R引物，進行PCR反應，由此擴增了引入突變的FGF-23 cDNA的片段。產物被克隆至一個pEAK8/IRES/EGFP質粒的EcoR I限制酶位點和Not I限制酶位點。混合溶液被純化，然後測定其核苷酸序列，確保引入了靶突變的小鼠FGF-23 cDNA被成功克隆。命名其為pEAK8/IRES/EGFP/mFGF-23RQ。該質粒還被引入到CHO ras克隆1細胞中，加入5μg/ml的嘌呤黴素(美國Sigma公司)，然後選擇具有抗藥性的細胞。克隆完後，獲得了小鼠表達FGF-23的細胞。這樣的細胞命名為CHO-mFGF23RQ。這樣的CHO-mFGF23RQ細胞在輥式瓶中培養，由此獲得了約12升的培養物上清液。根據實施例2(3)中描述的純化FGF-23蛋白的方法對該溶液進行純化，由此獲得了純化的FGF-23RQ。
本實驗所用引物的序列如下mF5ATTAGCCACTCGTGCTGTGCAATG (SEQ ID NO25)mF3GCAGCCTGGCCTGGGGACCTA (SEQ ID NO26)mF23FGGAATTCCACCATGCTAGGGACCTGCCTTAGACTC(SEQ ID NO27)mF23RATAGTTTAGCGGCCGCCTAGACGAACCTGGGAAAGGGGCGACA(SEQ ID NO28)mRQFTTCGCCCACGGCAACACACGCAAAGCGCCGAGGAC(SEQ ID NO29)mRQRGTCCTCGGCGCTTTGCGTGTGTTGCCGTGGGCGAA(SEQ ID NO30)實施例22抗人FGF-23的單克隆抗體和FGF-23的交叉反應活性利用聚丙烯醯胺凝膠電泳對純化後的小鼠FGF-23RQ蛋白進行分離，轉移到一種聚偏氟乙稀膜(美國Millipore公司)上，然後利用3C1E抗體進行Western印跡法測定。因此，得到了一條分子量大約為32.5kDa的條帶，如圖16A所示。純化後的小鼠FGF-23RQ蛋白溶液被系列稀釋，然後通過利用抗人FGF-23的單克隆抗體的夾心式ELISA方法對其進行嘗試性測定。這裡所用的純化後小鼠FGF-23RQ蛋白溶液的濃度未能精確的獲得。通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離條帶，並進行測定，與純化的已知濃度的人FGF-23蛋白進行比對，並用CBB染色。實驗人員認為當以圖16B所示的相對值為10進行表達時，小鼠FGF-23RQ蛋白溶液的濃度範圍在1至5μg/ml之間。利用2C3B抗體作為固定化抗體，3C1E抗體作為檢測抗體對稀釋後的小鼠FGF-23RQ蛋白溶液進行了測定。測定結果如圖16B所示。由於所得到的450nm-570nm範圍內的測定值隨純化後的小鼠FGF-23RQ蛋白溶液的濃度增加而增大，那麼小鼠的FGF-23蛋白就能夠以一種濃度依賴方式利用抗人FGF-23單克隆抗體通過ELISA法進行檢測了。而且，可證明抗人FGF-23的單克隆抗體能夠識別小鼠的FGF-23蛋白，表明實施例27和28中所觀察到的抗人FGF-23單克隆抗體通過結合小鼠的內生性FGF-23能中和或修飾其活性。
實施例23對患有遺傳性血磷酸鹽過少疾病的小鼠血液中的FGF-23蛋白進行檢測FGF-23已知是一種誘導腫瘤誘導的骨軟化症的因子，因為在ADHR的FGF-23基因中發現了錯義突變，所以已知其也參與誘導ADHR。然而，遺傳性血磷酸鹽過少疾病的另一種形式，XLH，儘管已闡明其對應的基因，但目前對引發該疾病的機理還沒有完全弄清。此外，該疾病和FGF-23的關係也是未知的。為了檢測該疾病中FGF-23的參與情況，所以對Hyp小鼠(患有XLH疾病)血液中的FGF-23的濃度進行了嘗試性測定。
ELISA方法中利用2C3B抗體作為固定化抗體，生物素標記的3C1E抗體作為檢測抗體進行測定。利用一種50mM的碳酸氫納溶液稀釋純化後的2C3B抗體至濃度為10μl/ml。50μl的生成物溶液加入到ELISA系統(Maxisorp(商標)，Nunc，美國)中的96孔板中，然後將該溶液在4℃培育12小時以進行固定化。接下來，除去反應溶液，向每孔中加入250μl的阻滯溶液(Superblock(商標)，PIERCE，美國)，然後在室溫培育30分鐘，以阻滯反應的進行。除掉溶液以後，每個孔用含有0.1％吐溫20的TBS(T-PBS)溶液洗滌兩次。從27-30周大小的同一窩出生的Hyp小鼠和正常的對照組小鼠眼眶中採集血樣，然後製得血清樣品。血清樣品用含有2C3B抗體或一個小鼠IgG1抗體(作為同型對照)的T-TBS溶液稀釋2倍，濃度為40μg/ml。每一種血清樣取50μl加入進微量滴定盤的每個孔中，然後在室溫培育1小時，這樣可使分析物中的FGF-23蛋白與固定化抗體進行反應。經過抗體反應後，利用T-TBS溶液洗滌孔4次，然後向每個孔中加入稀釋後的濃度為2μl/ml的2C3B抗體溶液(稀釋方法為利用一種含10％阻滯溶液(Blockace(商標)，日本製藥公司)的T-TBS溶液稀釋2C3B抗體至2μl/ml)。將該溶液在室溫培育30分鐘以同次級抗體進行反應。經過T-TBS溶液洗滌每一個孔4次以後，取50μl稀釋後(稀釋方法為利用一種含10％阻滯溶液(Blockace(商標)，日本製藥公司)的T-TBS溶液稀釋HRP標記的抗生物素蛋白鏈菌素(DAKO，丹麥)至5000倍)的溶液加入進每一孔中。該溶液在室溫培育30分鐘以使抗生物素蛋白鏈菌素和生物素標記的抗體相結合。利用T-TBS溶液洗滌每個孔4次，然後向每個孔中加入50μl的N-四甲聯苯胺(DAKO，丹麥)，是一種過氧化物生色底物，在室溫進行培育。30分鐘後，向每一孔中加入50μl濃度為0.5M的硫酸溶液以停止反應。利用測量96孔板(MTP-300，CORONA ELECTRIC CO.，LTD.，日本)的光吸收值的系統進行測定，得到的值(A450-A570)為450nm下的光吸收值減去570nm下的光吸收值。一個表明FGF-23特異性反應的光吸收值是通過如下方法獲得的在反應中加入同型對照獲得的A450-A570值減去在反應中加入2C3B抗體作為吸收抗體獲得的A450-A570值。結果如圖17所示。圖17清楚的表明了Hyp小鼠血液中FGF-23濃度的顯著升高。由於Hyp小鼠患低磷酸鹽血症是由於PHEX的基因缺陷，並且XLH，人類的低磷酸鹽血症，是由於PHEX基因的變異或缺陷所引起的，因此Hyp小鼠被認為是XLH模型小鼠。該結果有力的表明了血液中FGF-23濃度的升高可作為XLH中誘導低磷酸鹽血症的一個因素。
實施例24 FGF-23和1，25D的相互控制作用(1)接種FGF-23H引起1，25D下降純化後的FGF-23H蛋白通過臀靜脈給6隻6周大的BALN/c雄性小鼠以每隻小鼠5μg的劑量進行接種。接種1，4，和9小時後，採集血樣，並且對血液中1，25D的濃度進行了測定。結果如圖18A所示。接種FGF-23H後3小時，觀察到了血液中1，25D的濃度有了顯著的下降，並且接種9小時後，其濃度進一步的降低。
(2)接種1，25D誘導產生FGF-23給小鼠接種1，25D，並且檢測了血中FGF-23的濃度變化。6隻7周大的雄性小鼠構成一組。一組接種0.025μg溶於含有0.05％吐溫的磷酸鹽緩衝液中的1，25D，對照組接種含有0.05％吐溫的磷酸鹽緩衝液。通過腹腔進行接種。接種後8小時，在麻醉狀態下從小鼠的心臟中採集血樣，然後製得了血清樣品。利用如實施例23相同的方法通過ELISA對這些血清樣品進行檢測，然後血液中的FGF-23的數量利用由人FGF-23蛋白標準溶液獲得的標準曲線進行測定。這些結果如圖18B所示。接種1，25D後8小時，觀測到了血中FGF-23濃度的顯著升高。
所以，結果表明FGF-23與1，25D具有密切的相互作用關係。
實施例25患有腎功能衰竭性高磷酸鹽血症的病人血液中的FGF-23濃度給七周大小的威斯塔氏小鼠服用CE-2(日本CLEA公司，該CE-2已經以0.75％的一種比例混合了腺嘌呤)，這樣可在威斯塔氏小鼠體中產生一種腎功能衰竭性高磷酸鹽血症模式。作為一對照組，同樣給威斯塔氏小鼠服用CE-2(未混合腺嘌呤)。服用混合藥劑3周後，從臀動脈中採集血樣，收集血清。採集血樣後，兔子飼養在代謝性籠舍中並採集尿樣24小時。對血清中的磷酸鹽濃度進行測定。結果如圖19A所示。血清和尿中的肌酸酐利用一種商業化的試劑盒(CRE-Ag Kainos(商標)，KAINOS實驗室，INC.，日本)通過一種酶法進行測定。結果如圖19B所示。而且，利用2C3B抗體作為一種固定化抗體和3C1E抗體作為一種檢測抗體通過ELISA系統對血清中FGF-23的濃度進行了測定。結果如圖19C所示。
在這種腎功能障礙的疾病中病情發展情況通過尿中肌氨酸酐濃度下降和血清中肌氨酸酐濃度升高而得以清楚體現。隨著病情發展，演變成了血磷酸鹽過高疾病。在該病例中，血液中FGF-23蛋白的濃度在一個顯著的高水平值。這種病例被認為反映了腎功能衰竭的一種模式，表明了FGF-23可能是一種誘導腎功能下降和血液透析病人的某些併發症的因素。
實施例26利用免疫沉澱法檢測存在於腫瘤誘導的骨軟化症病人血漿中的FGF-23蛋白為了檢測FGF-23蛋白在血液中的存在狀態，對正常受試者的血漿或腫瘤誘導的骨軟化症病人的血漿通過免疫沉澱方法進行了檢測。向400μl混合血漿樣品中加入20μl已固定2C3B抗體的樹脂(實施例14中製備)，或加入20μl未固定抗體的樹脂。利用上下搖蕩的方式將該溶液在4℃混合1小時以確保抗體同FGF-23進行反應。接下來，利用PBS溶液洗滌樹脂4次，這樣可除掉未反應的產物。50μl樣品緩衝液(50mM的Tris-Cl溶液，pH為6.8，1％的SDS溶液，10％的甘油溶液，0.001％的溴酚藍溶液，2mM的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，和20mM的DTT溶液)加入進每一種類型的樹脂中。將該溶液在95℃加熱5分鐘後進行離心分離，收集分離後的上清液。上清液利用濃度為10％-20％的濃度梯度聚丙烯醯胺凝膠電泳進行分離，然後利用一種半乾印跡轉移槽(Owl Separation Systems，美國)將凝膠中的蛋白轉移到一種聚偏氟乙稀膜(美國Millipore公司)上。然後，PVDF膜在室溫下用T-TBS(美國Sigma公司)溶液稀釋後的生物素標記的3C1E抗體溶液(稀釋後的濃度為0.5μg/ml)中培育2小時。而且，將HRP標記的抗生物素蛋白鏈菌素(DAKO，丹麥)同生成物進行反應。利用一種ECL Plus發光系統(美國AmershamPharmacia Biotech公司)將混合溶液暴露於膠片上1小時，然後膠片用一個自動處理器(日本富士膠片公司)進行處理。結果見圖20。在未固定抗體的樹脂中，僅觀察到了血漿產生的非特異性信號分子。然而，利用2C3B抗體進行免疫沉澱得到的產物中，檢測到了一條分子量為32kDa的帶，懷疑其代表了腫瘤誘導的骨軟化症病人血漿中的全長FGF-23。而且，在用凝血酶切割的產物中未檢測到22kDa的條帶。同時，在正常受試者中，22kDa的帶和32kDa的帶均未檢測到。從這些結果中可以表明腫瘤誘導的骨軟化症中高水平表達的FGF-23以未經切割的全長形式存在於血液中。
實施例27正常小鼠接種抗人FGF-23的單克隆抗體實驗為了檢測抗人FGF-23的單克隆抗體對正常小鼠的影響，進行了下列實驗。正常小鼠(BALB/c，雄性，12周大)被隨機分成5組，每組由4隻小鼠組成。如圖21A所示，0.15ml磷酸鹽緩衝液作為載體通過臀靜脈單一接種組1中的每隻小鼠，0.67mg/ml抗人FGF-23的單克隆抗體(1D6A抗體，2C3B抗體，和3C1E抗體)通過臀靜脈分別單一接種組2，3和4中的每隻小鼠，0.67mg/ml抗TPO的單克隆抗體作為對照通過臀靜脈單一接種組5中的每隻小鼠。接種24小時後，在乙醚麻醉的狀態下從小鼠的心臟中採集血樣，然後利用一種微量採血管(美國Becton Dickinson公司)分離出血清。按照附件中的方法利用一種磷-測試Wako(日本和光純藥工業公司)，鈣-測試Wako(日本和光純藥工業公司)，和1，25(OH)2D RIA試劑盒TFB(TFB，美國)對這樣採集到的血清中的磷酸鹽濃度，鈣濃度和1，25D的濃度分別進行了測定。在接種至血樣採集期間，每組小鼠均被關在一隻塑料籠中，包含有1％的磷和1％的鈣的CE-2固體飼料(日本CLEA公司)和自來水採取任意採食的方式進行飼喂。
測定結果如圖21A所示。每組的測定值利用平均值+/-標準偏差來表示。標記有一個「*」號的組表明當通過Student-t法進行顯著性測試時，接種載體(磷酸鹽緩衝液)的組和接種抗TPO抗體的組其p值均小於0.01。
實施例28實施例27中，在接種3C1E抗體的實驗中儘管觀察到了血清中磷濃度的升高，但是同時也觀察到了血清中1，25D濃度的降低。然而，已知血液中1，25D的濃度是快速變化的，1，25D的這樣一種特性，使得當觀察到其濃度暫時增大的時候，稍後也能觀察到其濃度的降低。因此，重做一次接種3C1E抗體的實驗。3C1E抗體以400μg/只的劑量通過靜脈接種的方式給6隻正常小鼠接種。接種8小時以後，對血清中1，25D的濃度進行檢測。作為一對照組，對通過相似的接種方式接種PBS的小鼠血清中的1，25D濃度也進行了檢測。結果如圖21B所示。在該實驗中，觀察到了由於接種3C1E抗體而引起了小鼠血清中1，25D濃度明顯升高的現象。
實施例29抗FGF-23的抗體(3C1E抗體)在患有腺嘌呤誘導的腎功能障礙的大鼠中恢復1，25(OH)2D水平的作用如實施例25所描述的那樣，產生這種疾病(腺嘌呤誘導的腎功能障礙)的第3周，在大鼠的血清中觀察到了磷濃度和血液中FGF-23濃度的顯著升高。而且，在這種疾病中，在接種腺嘌呤之後第七天，觀察到了血液中1，25D濃度的下降(腎功能也是下降的)(見圖22A)。因此，為了比較和檢測腎功能紊亂早期時血液中FGF-23的濃度，按如下的方式對其進行了定量檢測。
在ELISA化驗中，2C3B抗體作為一種固定化抗體，生物素標記的3C1E抗體作為檢測抗體。首先，利用50mM的碳酸氫納溶液稀釋純化後的2C3B抗體至50μg/ml。50μl的生成物溶液加入到ELISA系統(Maxisorp(商標)，Nunc，美國)中的96孔板中，然後將該溶液在4℃培育12小時以使其固定在平板上。接下來，除去反應溶液，向每孔中加入250μl的阻滯溶液(Superblock(商標)，PIERCE，美國)，然後在室溫培育30分鐘，以阻滯反應的進行。除掉溶液以後，每個孔用含有0.1％吐溫20的TBS(T-PBS)溶液洗滌兩次。血清樣被製得，並利用T-TBS溶液稀釋2倍。除此之外，標準產物用實施例14中製備的已經應用於固定抗2C3B抗體的樹脂實驗中的大鼠血清進行稀釋，目的是除去內生性FGF-23，然後再用T-TBS溶液稀釋2倍。每一種樣品取50μl加入進微量滴定盤的每個孔中，然後在室溫培育1小時，這樣可使分析物中的FGF-23蛋白與固定化抗體進行反應。經過抗體反應後，利用T-TBS溶液洗滌孔4次，然後向每個孔中加入稀釋後的濃度為1.5μg/ml的3C1E抗體溶液(稀釋方法為利用一種含10％阻滯溶液(Blockace(商標)，日本製藥公司)的T-TBS溶液稀釋3C1E抗體至1.5μg/ml)。將該溶液在室溫培育30分鐘，以使同生物素標記的抗體相結合。利用T-TBS溶液洗滌每個孔4次，然後向每個孔中加入50μl的N-四甲聯苯胺(DAKO，丹麥)，是一種過氧化物生色底物，在室溫進行培育。30分鐘後，向每一孔中加入5μl濃度為0.5M的硫酸溶液以停止反應。利用測量96孔板的光吸收值的一種系統進行測定，得到的值(A450-A570)為450nm下的光吸收值減去570nm下的光吸收值。基於標準曲線，通過將獲得的測定值轉換為純化後的人抗FGF-23蛋白的重組體的產物的指示濃度值對濃度進行測定。
結果如圖22B所示，在餵養混合了腺嘌呤的組中觀察到了血液中FGF-23濃度的明顯升高。如實施例25所示，給正常小鼠接種FGF-23後能導致血液中1，25D濃度的快速下降，表明當腎功能下降時，血液中1，25D濃度的下降和血液中FGF-23濃度的增加之間存在某些聯繫。為了證實這種可能性，將餵養混合了腺嘌呤的大鼠血液中的1，25D濃度和FGF-23濃度對單個大鼠作圖。因此，從圖中可見二者之間有一明顯的負的線性相關性(圖22C)。這些結果表明通過控制血液中FGF-23的濃度來校正1，25D濃度下降的方法具有可行性。因此，按下述的方式進行了一個給這種模式的受試者接種中和抗FGF-23抗體的實驗。
12隻7周大的雄性威斯塔氏鼠用適於齧齒動物的並混合了腺嘌呤[(6-氨基嘌呤，美國Sigma公司)，腺嘌呤的最終濃度為0.75％]的CE-2商業粉狀飼料(日本CLEA公司)飼餵7天，飼餵方式為任意採食的方式，產生了腎功能下降疾病。給一對照組的12隻小鼠只飼餵CE-2(未混合腺嘌呤)。為了使在病發第七天腎功能紊亂的程度與使用一種血液肌氨酸水平相當，每組用混合有腺嘌呤的飼料餵養的鼠與對照組中的鼠均應分別被分成2組(6隻/組)，然後通過臀靜脈用3C1E抗體或磷酸鹽緩衝液以1mg/kg的劑量單一接種。接種12小時後，從臀動脈採集部分血樣，然後將血樣進行離心分離，這樣獲得血清。利用一種1，25(OH)2D RIA Kit TFB(TFB，美國)對這樣獲得的血清中的1，25D濃度進行檢測，並且利用CRE-EN Kainos((商標)，KAINOS實驗室，Inc.，日本)對這樣獲得的血清中的肌酸酐濃度也進行了檢測。
檢測結果如圖22D所示，與只餵養載體(PBS)的每一組相比，在所有的對照組和餵養混合了腺嘌呤的組中觀察到了1，25D濃度的明顯升高。上述結果表明FGF-23參與產生維生素D低下(一種血液中低水平的1，25D疾病)疾病，並伴隨腎功能下降，此時抑制FGF-23的作用能夠改善維生素D低下的狀況。
實施例30對患有性連遺傳型低磷酸鹽血症佝僂病(XLH)的病人血液中FGF-23蛋白的測定XLH是一種低磷酸鹽血症佝僂病的形式，顯示一種性連遺傳型的遺傳特性，而且其發病率與腫瘤誘導的骨軟化症具有許多相同點。近年來，屬於金屬內肽酶家族的phex基因被認為是產生這種疾病的致病性基因，並且一種假定的底物表明是誘導成病的一種因子。同時，如實施例23所示，在Hyp小鼠的血液中FGF-23的濃度極高，這種小鼠是在phex基因中有一個基因發生變異(同XLH中的基因變異相同)的遺傳性低磷酸鹽血症的模式小鼠。這些現象表明對於患有XLH的病人的低磷酸鹽血症，同腫瘤誘導的骨軟化症相似，是由於血液中FGF-23濃度升高所導致的。因此，首先，為了檢測FGF-23在該疾病中所起的作用，對正常受試者和患有XLH的病人的血清中的FGF-23濃度進行了測定。除此之外，在獲得充足的phex基因突變之前的正常受試者和被證實在phex基因中有變異基因的XLH病人之後，用於測定的血清才能大量提供。病人的年齡，性別，和phex基因中的變異點如圖23所示。
在ELISA化驗中，2C3B抗體被作為一種固定化抗體，生物素標記的3C1E抗體被作為一種檢測抗體。首先，利用50mM的碳酸氫納溶液稀釋純化後的2C3B抗體至10μg/ml。50μl的生成物溶液加入到ELISA系統(Maxisorp(商標)，Nunc，美國)中的96孔板中，然後將該溶液在4℃培育12小時以使其固定在平板上。接下來，除去反應溶液，向每孔中加入250μl的阻滯溶液(Superblock(商標)，PIERCE，美國)，然後在室溫培育30分鐘，以阻滯反應的進行。除掉溶液以後，每個孔用含有0.1％吐溫20的TBS(T-PBS)溶液洗滌兩次。從XLH病人中採集的血清被製備成測試樣，用含有一種在100μg/ml的濃度時不與FGF-23結合的包含有小鼠IgG1抗體的T-TBS溶液稀釋2倍。此外，利用正常受試者的血清(該血清利用一種在100μg/ml的濃度時不與FGF-23結合的包含有小鼠IgG1抗體的T-TBS溶液稀釋了2倍)對標準產物進行稀釋(利用向實施例14中製備的固定了抗2C3B抗體的樹脂中加入血清除去內生性FGF-23)。每一種樣品取50μl加入進微量滴定盤的每個孔中，然後在室溫培育1小時，這樣可使分析物中的FGF-23蛋白與固定化抗體進行反應。經過抗體反應後，利用T-TBS溶液洗滌孔4次，然後向每個孔中加入稀釋後的濃度為1.5μg/ml的3C1E抗體溶液(稀釋方法為利用一種含10％阻滯溶液(Blockace(商標)，日本製藥公司)的T-TBS溶液稀釋3C1E抗體至1.5μg/ml)。將該溶液在室溫培育30分鐘，以進行次級抗體反應。利用T-TBS溶液洗滌每個孔4次後，利用一種含10％阻滯溶液(Blockace(商標)，日本製藥公司)的T-TBS溶液稀釋HRP標記的抗生物素蛋白鏈菌素(DAKO，丹麥)至5000倍，取50μl稀釋後的溶液加入進每一孔中。該溶液在室溫培育30分鐘，以使抗生物素蛋白鏈菌素同生物素標記的抗體相結合。利用T-TBS溶液洗滌每個孔4次，然後向每個孔中加入50μl的N-四甲聯苯胺(DAKO，丹麥)，是一種過氧化物生色底物，在室溫進行培育。30分鐘後，向每一孔中加入50μl濃度為0.5M的硫酸溶液以停止反應。利用測量96孔板的光吸收值的一種系統進行測定，得到的值(A450-A595)為450nm下的光吸收值減去595nm下的光吸收值。
結果，在104位正常成人中(30男性和74位女性)中，血液中的FGF-23濃度聚集在8.2-54.3ng/l的範圍內，並且平均值和標準偏差是28.9+/-1.1ng/l。同時，如圖23所示，所有患有XLH疾病的病人血清中的FGF-23濃度值均高於正常受試者的平均值。而且，即使是患有XLH疾病的病人血清中FGF-23的平均濃度值也明顯高於正常受試者的平均濃度值(p＜0.0001，利用Student-t計算得到的)。這些結果強烈地暗示XLH患者血清中高濃度的FGF-23作為誘發疾病的因子的可能性。
實施例31兩種不同的中和抗體混合時增強中和活性的作用當識別不同位點的中和抗體混合時，利用正常小鼠對其生理活性的變化進行了檢測。
8周大的C57BL/6雄性小鼠被隨機分成4組，每組由6隻小鼠組成。PBS溶液作為載體通過臀靜脈單一接種組1中的每隻小鼠，100μg的2C3B抗體通過臀靜脈分別單一接種組2中的每隻小鼠，100μg的3C1E抗體通過臀靜脈分別單一接種組3中的每隻小鼠，100μg的抗體混合物(50μg的2C3B抗體和50μg的3C1E抗體)通過臀靜脈分別單一接種組4中的每隻小鼠。接種後的第1天和第二天，在乙醚麻醉的狀態下從眼眶中採集血樣，利用一種微量採血管(美國BectonDickinson公司)分離出血清。然後按照附件中的方法利用一種磷測試Wako(日本和光純藥工業公司)對這樣採集到的血清中的磷酸鹽濃度進行了測定。在接種至血樣採集期間，每組小鼠均被關在一隻塑料籠中，CE-2(日本CLEA公司)和自來水採取任意採食的方式進行飼喂。
所得結果如圖24所示。單獨的100μg 2C3B抗體或100μg 3C1E抗體在接種後第一天就導致血清中磷濃度的顯著增加。另一方面，在接種抗體混合物的組中，雖然每種抗體的劑量均減半，但還是顯示了血清中磷濃度的顯著增加，而且與任何只接種一種抗體的組相比其血清中的磷濃度都非常高。而且，在接種後的第二天，接種2C3B抗體或3C1E抗體的組中，提高血清中磷濃度的作用消失了，而接種抗體混合物的組中血清中磷濃度仍然急劇增加。上述結果表明與只接種一種類型的抗體病例相比，識別不同位點的2種類型的抗體混合物能夠進一步增強中和活性，並更長時間地維持這種作用。
實施例32給患有遺傳性低血磷酸鹽病的小鼠接種FGF-23中和抗體實驗如實施例23和實施例30所示，在XLH和Hyp小鼠中觀察到了血液中FGF-23濃度的升高，表明FGF-23是一種對應低血磷酸鹽病(維生素D代謝異常，或骨鈣化障礙都是這種疾病的發病原因)的因子。因此，給Hyp小鼠接種抗FGF-23中和單克隆抗體，然後對該抗體是否能改善上述病症進行了檢測。
(1)重複接種抗FGF-23中和抗體實驗利用4-7周大的C57BL/6-Hyp雄性小鼠和同一窩出生的野生型C57BL/6雄性小鼠，給Hyp小鼠重複接種中和抗體後對血液中磷濃度和1，25D濃度的影響進行了檢測。本實驗中的四組包括一組接種載體的野生型小鼠，一組接種抗體的野生型小鼠，一組接種載體的Hyp小鼠，和一組接種抗體的Hyp小鼠。每組包括4隻小鼠。在接種抗體的小鼠組實例中，具體的說，3C1E抗體和2C3B抗體混合，它們的終濃度均為1.7mg/ml，然後生成物(混合溶液)以17mg/kg的劑量通過皮下至脊背區間接種每隻小鼠。在接種抗體的小鼠組中，具體的說，PBS以10mg/kg，同接種抗體的組相同體積的劑量接種該組中的每隻小鼠。經過最初接種後的第2，第4和第6天，截取小鼠的尾部末端，然後在乙醚麻醉的狀態下採集部分血樣。然後利用一種磷測試Wako(商標，日本和光純藥工業公司)，鈣-測試Wako(商標，日本和光純藥工業公司)，1，25(OH)2D RIA Kit TFB(TFB，美國)和鹼磷B-測試Wako(商標，日本和光純藥工業公司)對這樣採集到的血液中的磷酸鹽濃度，鈣濃度，1，25D濃度和總鹼性磷酸酶活性分別進行了測定。
結果如圖25A所示。在接種抗體的野生型小鼠組中，在接種後的1至7天觀察到了血清中的磷酸鹽濃度明顯的升高了。同接種載體的Hyp小鼠組，在接種後的1至7天觀察到的血清中的磷酸鹽濃度相比，觀察到了接種抗體的Hyp小鼠組血清中的磷酸鹽濃度明顯的升高了。這些增高值在接種後的第7天變得更加明顯，表明濃度可達到與接種野生型小鼠抗體相同程度的濃度值。而且，通過接種中和抗體，在接種後的第1天，在野生型小鼠和Hyp小鼠組中都觀察到了血液中1，25D濃度的顯著升高。同時，在Hyp小鼠或患有低磷酸鹽血症佝僂病(例如XLH)的病人中，其血液中總鹼磷酸酶活性異常增高的現象已經有過報導。表明從接種後24小時開始，給Hyp小鼠接種的中和抗體逐漸減弱，血液中總的鹼性磷酸酶活性水平比正常小鼠的活性水平異常的高，並且進一步導致了活性顯著降低至與野生型小鼠初始接種後第七天時的程度相當的水平。
利用4-7周大的雄性C57BL/6J-Hyp小鼠組和同一窩出生的雄性野生型C57BL/6J小鼠組和正常小鼠作為對照組，給Hyp小鼠重複接種抗FGF-23中和抗體後對骨組織的影響進行了檢測。本實驗中的四組包括一組接種載體的野生型小鼠，一組接種抗體的野生型小鼠，一組接種載體的Hyp小鼠，和一組接種抗體的Hyp小鼠。每組包括4隻小鼠。在接種抗體的小鼠組實例中，具體的說，3C1E抗體和2C3B抗體混合，它們的終濃度均為1.7mg/ml，然後生成物(混合溶液)以17mg/kg的劑量通過皮下至脊背區間接種每隻小鼠。在接種載體的組中，具體的說，PBS以10mg/kg的劑量通過皮下至脊背區間接種該組中的每隻小鼠。最初接種的時間被定為是第0天，那麼在第2天，第4天，第6天，第8天，第21天和第40天時，進行相同的接種。在最初接種後的第49天，在乙醚麻醉的狀態下從心臟中採集部分血樣，和右股骨樣，右脛骨樣，和肋樣。利用一種μF FX-1000微焦X-射線放大影像系統(日本富士膠片公司)在電流為100μA，電壓為25kV的輸出條件下輻射5秒，然後利用一種BAS影像分析儀(日本富士膠片公司)數位化後，得到所截取的股骨，脛骨和肋骨的放大的X-射線影像。
這樣所獲得的提取後的股骨，脛骨，和肋骨的放大X-射線影像如圖27所示。在Hyp小鼠或像低磷酸鹽血症佝僂病(例如XLH疾病)這樣的病例中，對於鈣化紊亂，長骨的幹骨後端或助肋的軟骨關節處的增大現象相關聯的軟骨細胞增加的現象已有過報導。作為X射線影像分析的結果，在存在幹骨後端增長現象的Hyp小鼠組中，發現接種抗體後病情得到緩解，而在接種載體的組中發現骨密度下降，腿節和脛骨的皮質骨變薄。而且，在接種抗體的Hyp小鼠組中發現病情得到緩和，而在接種載體的Hyp小鼠組中發現腿節和脛骨不能縱向增長。接種載體的的Hyp小鼠組中肋脈關節和肋的軟骨增大，而這些現象在接種抗體的Hyp小鼠組中消失。表明給Hyp小鼠重複接種抗FGF-23的中和抗體可改善骨延伸紊亂和骨鈣化紊亂。
而且，為了詳細檢測抗FGF-23抗體對骨組織的作用，從進行本實驗的動物中製得了骨組織樣品。實驗後的動物經宰殺後，左脛骨和右股骨被提取出來，將其加入進70％的乙醇中，進行VillanuevaBone(Villanueva Bone Stain Powder，MARUTO INSTRUMENT CO.，LTD.，日本)染色，利用濃度連續升高的乙醇溶液對骨進行脫水，然後包埋進Technovit 7100(德國Kulzer公司)中。生成物切成大約5μm厚的薄片，然後將脛骨的近端部分和股骨的遠端部分在顯微鏡下進行觀察。骨組織樣品的影像如圖28所示。在野生型小鼠中觀察到了軟骨細胞中的生長片以有序的方式進行排列(圖28A和D)，在Hpy小鼠的骨組織中，觀察到了有一被幹擾的柱結構區域，其特徵為具有生長片的擴大區域和軟骨細胞的不規則序列(圖28B和E)。相反，對於進行重複接種抗FGF-23中和抗體的Hyp小鼠中，觀察到了生長片寬度的增加得到了抑制和軟骨細胞的不規則序列消失的現象(圖28C和F)。
(2)單一接種抗FGF-23中和抗體的實驗利用12-20周大的雄性C57BL/6-Hyp小鼠和同一窩出生的野生型雄性C57BL/6J小鼠，給Hyp小鼠單一接種抗FGF-23中和抗體後對血液中磷酸鹽濃度和1,25D濃度的影響進行了檢測。本實驗中的四組包括一組接種載體的野生型小鼠(n＝4)，一組接種抗體的野生型小鼠(n＝5)，一組接種載體的Hyp小鼠(n＝3)，和一組接種抗體的Hyp小鼠(n＝3)。在接種抗體的小鼠組實例中，具體的說，3C1E抗體和2C3B抗體混合，它們的終濃度均為1.7mg/ml，然後生成物(混合溶液)以17mg/kg的劑量通過皮下至脊背區間接種每隻小鼠。在接種載體的小鼠組中，具體的說，PBS以10mg/kg的劑量接種該組中的每隻小鼠。接種後的第4天，在乙醚麻醉的狀態下從小鼠中提取出來的心臟和腎臟中採集血樣。
對這樣獲得的血清中的磷酸鹽和1，25D的濃度進行測定，結果如圖25B所示。通過給野生型小鼠單一接種這種抗體，血清中磷酸鹽濃度和1，25D的濃度在接種後的第4天均表現了明顯的升高。在Hyp小鼠中也觀察到了濃度升高的這種效應。通過接種抗體，血清中磷酸鹽的濃度被從低水平值校正到了高水平值，並且1,25D的濃度顯著增大。
(3)抗FGF-23中和抗體控制NaPi2a和1αOHase的表述的作用利用倚賴鈉的磷酸鹽協同運輸效應(NaPi2a該效應主要出現在腎小管中)通過重吸收率對血清中磷酸鹽濃度進行了測定。而且，已經有過對重吸收率被倚賴NaPi2a自身的表達水平或NaPi2a蛋白的定位率所控制的報導。因此，對抗FGF-23中和抗體是否有通過NaPi2a的調控來提高血清中磷酸鹽濃度的效應進行了檢測。
利用一種凍融的腎臟，按照Katai等人在生物化學雜誌(1999年，274卷，28845-28848頁)上報導的一種鈣沉澱方法製備了固定有NaPi2a的腎近位尿細管刷狀緣膜囊(BBMV)。按照實施例16中描述的Western印跡法對每一種的得到的BBMV膜20μg進行測定。利用從抗血清[利用和實例5相似的方法通過免疫兔子而得到抗血清，該抗血清具有小鼠的NaPi2a蛋白中的C-末端肽片段(SEQ ID NO32)]中純化得到的抗鼠NaPi2a的兔多克隆抗體對NaPi2a蛋白進行了測定。結果如圖25C所示。已經有過報導表明NaPi2a蛋白水平在Hyp小鼠的BBMV中被顯著降低了。然而，通過接種抗FGF-23中和抗體，NaPi2a的表達被顯著提高了。
在野生型小鼠中，也進一步觀察到了NaPi2a蛋白濃度的升高。而且，利用上述的BBMV對NaPi2a蛋白調控的磷酸鹽轉移活性進行了檢測。利用從每一個體製備的每一種BBMV 0.1mg，通過一種快速過濾方法對60秒內的倚賴鈉的磷酸鹽攝取活性進行了檢測。反應物和反應條件按照Katai等人在生物化學雜誌(1999年，274卷，28845-28848頁)上的報導進行結果如圖25C所示，對野生型小鼠和Hyp小鼠，由於接種了抗FGF-23中和抗體，導致了磷酸鹽轉移活性的升高。這些結果表明通過給野生型小鼠和Hyp小鼠接種抗FGF-23中和抗體後血清中磷酸鹽濃度升高的效應是由於存在於腎小管中的NaPi2a蛋白的水平值生高所導致的。
mNpt2CLALPAHHNATRLC(SEQ ID NO32)下一步，為了闡明提高血清中1，25D濃度的作用機理，對腎25-羥維生素D-羥化酶(1αOHase)的表達模式進行了分析。利用一種ISOGEN試劑(NIPPON GENE CO.，LTD.，日本)從一冷凍的腎中將總RNA提取出來。取20μg所得到的每一種RNA按照標準方法利用北方印跡法對其進行了檢測。一種PerfectHyb試劑(日本Toyobo公司)用於進行雜交，雜交點的反應和洗滌按照附件中所述的方法進行。通過PCR方法擴增小鼠的1αOHase部分cDNA而製得這裡所用的探針，該PCR反應利用從小鼠腎臟中製備的cDNA文庫作為模板，SEQID NOS33和34所示的寡核苷酸作為引物，或者通過PCR擴增一個3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的部分cDNA作為一種內部標準，利用SEQ ID NOS35和36所示的寡核苷酸作為引物，通過一種MeagaprimeDNA標記系統(美國Amersham Pharmacia Biotech公司)利用32P標記cDNA。利用一種BAS影像分析儀(日本富士膠片公司)對信號進行了檢測。結果如圖25D所示。證實了在野生型小鼠和Hyp小鼠中通過接種中和抗體，1αOHase的表達顯著提高了。這些結果表明抗FGF-23中和抗體在提高野生型小鼠和Hyp小鼠血清中1,25D濃度的作用是由於存在於腎中的1αOHase的基因表達水平值的提高。
m1alphaFWcagacagagacatccgtgtag (SEQ ID NO33)m1alphaRVccacatggtccaggttcagtc (SEQ ID NO34)gapdhFWaccacagtccatgccatcac (SEQ ID NO35)gapdhRVtccaccaccctgttgctgta (SEQ ID NO36)上述結果表明FGF-23在降低Hyp小鼠血液中的磷酸鹽濃度和1，25D濃度中發揮了非常重要的作用，換句話說，對於患有XLH的病人，通過接種抗FGF-23中和抗體可以抑制FGF-23作用的發揮，因此就能改善發病症狀。而且，伴隨著骨增長障礙和骨鈣化障礙的Hyp小鼠血液中總鹼磷活性異常高的水平值這一現象，通過接種FGF-23中和抗體也能使其值正常化。因此，該方法對治癒骨軟化症並使骨重塑過程正常化是有療效的。
實施例33抗FGF-23抗體(3C1E)對骨重塑的作用如實施例32(1)所描述的那樣，表明了抗FGF-23抗體在骨重塑過程中的作用。為了進一步檢測該結果，對經過接種抗FGF-23抗體後血清中骨鈣素濃度隨時間的變化進行了分析。該實驗按如下程序進行3C1E抗體以3mg/kg的劑量，或者是載體(PBS溶液)以1.1mg/kg的劑量通過臀靜脈給7周大的雄性S.D.大鼠進行單一接種。在接種後的4，12，24，48，和72小時，從臀動脈中採集部分血樣，然後製得血清樣。利用一種骨鈣素ELISA試劑盒(日本Amersham生物科學公司)對血清中骨鈣素的濃度進行了檢測。結果如圖26所示。在接種抗體後的12，24，48小時後，觀察到了血清中骨鈣素濃度的顯著升高。這些結果表明該種可能性，即接種的抗FGF-23抗體在骨重塑過程中有一種直接的或間接的影響。
實施例34抗FGF-23中和抗體(2C3B抗體和3C1E抗體的混合物)對骨質疏鬆症小鼠的作用為了進一步檢測如實施例33中所描述的抗FGF-23中和抗體在骨代謝過程中的作用，在絕經後的骨質疏鬆症受試者中對抗FGF-23抗體在卵巢切除後骨量降低模型小鼠(被認為其可反映骨量減少)中的作用進行了檢測。將8周大的ddy小鼠中的卵巢提取出來後，將小鼠分成2組一組接種載體，另一組接種抗FGF-23抗體。此外，作為一手術對照組，對一組小鼠進行了假切除手術。對於接種抗體的組(n＝10)，接種在手術後3天開始，抗體通過混合兩種體積相同的2C3B抗體和3C1E抗體(2C3B抗體和3C1E抗體的接種劑量同為1.5mg/kg，接種總劑量為3mg/kg)而製得，將該混合抗體通過皮下至脊背區域給小鼠進行接種，一周3次，連續接種4周。而且，對於接種載體的組(n＝9)和進行了假切除的對照組(n＝10)，將載體溶液以和抗體溶液相同的劑量(10ml/kg)給小鼠進行接種。卵巢切除的第2周，在乙醚麻醉的狀態下從小鼠眼眶中採集血樣，卵巢切除的第4周，在乙醚麻醉的狀態下從小鼠心臟中採集血樣。通過離心分離(在8000轉/分鐘的轉速下離心分離10分鐘)從採集的血樣中製得血清，然後對血清中骨鈣素的濃度(IRMA試劑盒，Immutopics，日本)進行測定。卵巢切除後的第四周，從由於採集血樣而宰殺掉的小鼠中提取股骨，然後對骨中礦物質含量和骨密度(骨密度計，DCS-600型，ALOKA CO.，LTD.)進行了測定。
如圖29A和B所示，同接種載體的組相比，卵巢切除後的第2周和第4周在接種抗FGF-23抗體(2C3B抗體和3C1E抗體的混合物)的組中都觀察到了血清中骨鈣素水平的明顯升高。骨鈣素是由造骨細胞特定產生的一種蛋白。由於體內血清中骨鈣素的水平升高被認為是骨生成的一種指示劑，因此表明了該種可能性，即通過接種抗FGF-23抗體可促進骨的生成。
而且，如圖30A和B所示，同進行了卵巢假切除並接種了載體的組相比，進行了卵巢切除並接種了載體的組表現出了骨量的顯著減少。通過與卵巢切除後骨礦物質含量和骨礦物質密度明顯下降相對比，實行了卵巢切除並接種了抗FGF-23抗體的組表現出了異常高的骨礦物質含量和骨礦物質密度的水平值。基於這些結果，我們認為接種抗FGF-23抗體可抑制由於卵巢切除後所導致的骨量減少。
實施例35給患有遺傳性低磷酸鹽血症佝僂病的小鼠接種抗FGF-23中和抗體(2C3B抗體和3C1E抗體的混合物)實驗如實施例32所示，表明了抗FGF-23的中和抗體可改善Hyp小鼠的骨增增長紊亂和骨鈣化紊亂。因此，利用4周大的雄性C57BL/6-Hyp小鼠和同一窩出生的野生型C57BL/6小鼠(該野生型小鼠比例32中所用的小鼠在周年齡上小，這樣生長更明顯)對抗FGF-23中和抗體在改善Hyp小鼠的骨增長紊亂和骨鈣化紊亂疾病中所起的作用進行了詳細檢測。本實驗中的四組包括一組接種載體(PBS)的野生型小鼠，一組接種載體(PBS)的Hyp小鼠，一組接種低劑量抗體的Hyp小鼠，和一組接種高劑量抗體的Hyp小鼠。每組包括6-7隻小鼠。中和抗體是由相同濃度的2C3B抗體和3C1E抗體相互混合而製得的。對低劑量組，這樣製得的中和抗體溶液中兩種類型抗體的總量為4mg/kg，對高劑量組，這樣製得的中和抗體溶液中兩種類型抗體的總量為16mg/kg。中和抗體或載體以10ml/kg的劑量通過皮下至脊背區域接種每隻小鼠，將最初接種的時間定為第0天，那麼在第7天，第14天，第21天，和第28天時，對小鼠進行重複接種。第7天，第14天，第21天，和第28天進行重複接種時對小鼠的體重，尾巴的長度，和脛骨的thel長度進行了測量。而且，最初接種後的第31天，在乙醚麻醉的狀態下從小鼠心臟中採集血樣，小鼠也被宰殺，然後提取左右的股骨和脛骨。
(1)抗FGF-23中和抗體對增長尾巴長度，脛骨長度和增大體重的作用Hyp小鼠的骨頭提供了佝僂病骨的表型(伴隨著骨發育不全的特徵，例如長骨在徑向方向的增長障礙)。對於單個的小鼠，同野生型的小鼠相比，Hyp小鼠在體長方面明顯小，體重方面明顯輕。為了檢測抗FGF-23中和抗體對Hyp小鼠中像骨發育不全這樣的疾病的作用，進行了對本實驗中所用Hyp小鼠的尾部長度，脛骨長度和體重變化的測定。結果如圖31A，B和C所示。也在本實驗中，同正常小鼠相比，Hyp小鼠尾巴和脛骨的增長程度明顯低，體重明顯輕。而且，同接種載體的Hyp小鼠組相比，接種了中和抗體的Hyp小鼠，中和抗體盡其最大作用使Hyp小鼠的尾部長度和脛骨長度得到了最大程度的增長，並且在增加體重方面是一種倚賴接種劑量的方式。
(2)抗FGF-23中和抗體對骨鈣化的作用同正常的小鼠相比，已知Hyp小鼠的骨組織中未鈣化和低鈣化骨的比例是高的，但是在礦物質含量方面是低的。因此，對抗FGF-23中和抗體能否提高Hyp小鼠股骨中礦物質的含量進行了測定。在該實驗中，提取後的左股骨在100℃的乾燥器中乾燥12小時，然後稱重，得到乾燥後骨的重量。接下來，將乾燥後的骨在600℃的馬弗爐中焚燒12小時。對生成物稱重以得到骨灰的重量。結果如圖32所示。同野生型小鼠相比，在Hyp小鼠中，骨灰重量在幹骨重量中所佔的比例非常低。在接種了抗體的Hyp小鼠組中，骨灰重量在幹骨重量中所佔的比例表現出了明顯增加(以一種隨重複接種的中和抗體的劑量增加而增加的方式)。尤其是，在接種了高劑量抗體的組中，其骨灰重量在幹骨重量中所佔的比例表現出了同野生型小鼠組所示的同一水平值。
這些結果表明通過接種抗FGF-23中和抗體可抑制FGF-23的作用，因此能夠改善如Hyp小鼠所示的骨增長障礙和骨鈣化疾病。
實施例36利用2C5L抗體通過夾心式ELISA方法定量測定人的FGF-23蛋白按照實施例3中的方法得到2C5L克隆雜交瘤，按照實施例4中的純化方法對其進行純化後得到2C5L抗體。通過實施例10中所述的方法對其識別位點的分析表明同2C3B抗體的形式一樣，2C5L抗體在N-末端多肽片段(該多肽片段相當於SEQ ID NO1的介於第25位和第179位胺基酸殘基之間的一段區域)內有一個識別位點，並且和N-末端多肽片段和一種全長FGF-23蛋白形成了一種免疫複合體。而且，如實施例12所描述的一種方法，對一種利用2C5L抗體和2C3B抗體的一種重組體的夾心式ELISA方法的建立做了嘗試。利用每一種抗體都可和FGF-23蛋白相結合的事實，表明這兩種抗體之間並不存在彼此競爭性抑制的現象。根據這一結論，2C5L抗體在N-末端多肽片段(該多肽片段相當於SEQ ID NO1的介於第25位和第179位胺基酸之間的一段區域)內有一個識別位點，但該識別位點不同於2C3B抗體的也位於N-末端多肽片段內的識別位點。這表明利用一種兩種類型抗體作為重組體的ELISA方法是可行的。接下來，當生物素標記的3C1E抗體作為檢測抗體，並且2C3B抗體或2C5L抗體作為固定化抗體時，對利用實施例13中所描述的方法測定FGF-23蛋白的能力進行了檢測。結果如圖33所示。證實了2C5L抗體，在10pg/ml至10ng/ml的濃度範圍內，以一種濃度倚賴型的方式可識別純化後的人類FGF-23蛋白的重組體。
實施例37 2C5L抗體和小鼠FGF-23的交叉反應活性如實施例22和23所示的利用2C3B抗體和3C1E抗體的一種重組體的夾心式ELISA系統中，同人的FGF-23相似，小鼠的FGF-23也能被識別出來。因此，對2C5L抗體是否能夠識別小鼠的FGF-23做了檢測。同實施例24類似，在血液中具有高水平值的FGF-23的小鼠血清製得後，利用2C3B抗體和生物素標記的3C1E抗體的一種重組體對其進行了檢測，因此得到了一種濃度值顯示為大約600pg/ml的一種樣品。對於該樣品，利用2C3B抗體和生物素標記的3C1E抗體的一種重組體通過夾心式ELISA系統對其進行了檢測。然而，沒有觀察到反應活性。該結果表明2C5L抗體與人的FGF-23有強的結合能力，但是與小鼠的FGF-23有非常弱的結合能力或根本就沒有結合能力。
實施例38 2C5L抗體對人的FGF-23中和活性的能力測定實施例37的結果表明由於同2C3B抗體或3C1E抗體與小鼠的FGF-23的結合能力相比，2C5L抗體的結合能力顯得非常低，因此2C5L抗體對小鼠內生性FGF-23的中和活性的能力也將不明顯。然而，根據實施例36所示的結果，由於2C5L抗體與人的FGF-23有強的結合能力，2C5L抗體對於人的內生性FGF-23可能有中和活性的能力。為了證實該能力，按照如下程序利用動物通過一種檢測系統對2C5L抗體中和人的FGF-23的活性做了測定，然後利用該系統對2C5L抗體對人的內生性FGF-23的中和活性做了檢測。
一種被調節後的以1.2μg/天的劑量逐漸釋放人的FGF-23重組體的微型滲透泵(alzet微型滲透泵型號1007D，加拿大)通過皮下至脊背區域移植進7周大的雄性C57BL/6小鼠體內，這樣就構建了一種人的FGF-23重組體能連續接種的模式。在移植泵後的第3天，給小鼠通過腹腔接種一種包含2C5L抗體的抗FGF-23中和抗體或一種載體，然後對連續存在的人的FGF-23重組體降低血清中磷酸鹽濃度的作用是否被接種後的抗體抑制而進行了檢測。本實驗中的四組包括一組(未處理/載體)接種載體的未處理過的小鼠，一組(FGF-23/載體)接種載體的人類FGF-23重組體連續接種模式的小鼠，一組(FGF-23/2C5L)接種2C5L抗體的人類FGF-23重組體連續接種模式的小鼠，和一組(FGF-23/2C3B)接種2C5L抗體的人類FGF-23重組體連續接種模式的小鼠。PBS作為載體並用於稀釋抗體。抗FGF-23中和抗體以一種20mg/kg的劑量進行接種。載體和中和抗體以每10g體重接種0.1mL的劑量進行接種。在抗體接種前和抗體接種後，在乙醚麻醉的狀態下從小鼠眼眶中採集血樣以獲得血清樣。利用一種磷測試Wako(商標)，日本和光純藥工業公司)對血清中磷酸鹽濃度進行檢測。
結果如下。利用該微型滲透泵通過連續接種人的FGF-23重組體，在移植進泵後的第3天，同接種載體的未處理過的小鼠組相比，血液中磷酸鹽的濃度出現了明顯升高(圖34，左)。同FGF-23/載體接種組或抗體接種前相比，當給一組人類FGF-23重組體連續接種模式的小鼠組(FGF-23/2C5L)接種2C5L抗體時，24小時後，重組體降低血清中磷酸鹽濃度的作用被抗體明顯抑制了。血清中磷酸鹽的濃度被提高到了同未處理過的/載體接種組相同的程度(圖34，右)。根據上述結果和實施例37中的結論，清楚的表明2C5L抗體具有抵抗倚賴連續的接種人類FGF-23重組體而導致血液中磷酸鹽濃度下降的作用的中和活性。另一方面，對於接種2C3B抗體的組，24小時後，血清中磷的濃度比未處理過的/載體接種組的磷濃度值明顯高。該結果可能由於以下事實具有與小鼠的FGF-23有強的結合能力的2C3B抗體不但對接種人的FGF-23重組體有中和活性，而且對內生性的小鼠FGF-23也有中和活性。
工業應用依照本發明，提供了抗FGF-23的抗體。本發明中的抗體在通過適當地在體內進行測定和檢測FGF-23而診斷伴隨FGF-23蛋白的累積或下降的疾病或病理狀況中非常有效。而且，本發明的抗體具有中和FGF-23作用的活性，因此能夠通過抑制FGF-23的作用治療或改善由FGF-23的過量作用所導致的疾病或病理狀況。
將這裡引用的出版物，專利和專利申請引入本申請作為參考。未背離本發明技術精神或範疇的一些改變和變化對本領域的專業人員來說顯而易見。本發明包含這樣的變化和修正。
序列表110KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA120抗FGF-23抗體130PH-1707-PCT140
141
150JP2001/4016891512001-12-28150JP2002/2620201512002-09-0616036170Patentln Ver.2.02101211251212PRT213人4001Met Leu Gly Ala Arg Leu Arg Leu Trp Val Cys Ala Leu Cys Ser Val1 5 10 15
Cys Ser Met Ser Val Leu Arg Ala Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu20 25 30Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu Ile His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg35 40 45Asn Ser Tyr His Leu Gln Ile His Lys Asn Gly His Val Asp Gly Ala50 55 60Pro His Gln Thr Ile Tyr Ser Ala Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala65 70 75 80Gly Phe Val Val Ile Thr Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met85 90 95Asp Phe Arg Gly Asn Ile Phe Gly Ser His Tyr Phe Asp Pro Glu Asn100 105 110Cys Arg Phe Gln His Gln Thr Leu Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr His115 120 125Ser Pro Gln Tyr His Phe Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala130 135 140Phe Leu Pro Gly Met Asn Pro Pro Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg145 150 155 160Arg Asn Glu Ile Pro Leu Ile His Phe Asn Thr Pro Ile Pro Arg Arg165 170 175
His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val180 185 190Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln195 200 205Glu Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu210 215 220Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly225 230 235 240Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile245 250210221130212DNA213人工序列220
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權利要求
1.通過利用多肽免疫動物而得到的抗體，所述多肽包含如SEQ IDNO1所示的胺基酸序列，或包含從SEQ ID NO1所示的胺基酸序列中通過缺失、替代或添加一個或幾個胺基酸而衍生得到的胺基酸序列，並且所述抗體具有成纖維細胞生長因子-23的活性，具有控制磷酸鹽代謝或維生素D代謝的活性，並且如以下(a)、(b)或(c)所示(a)識別如SEQ ID NO1所示的介於第180位和第194位，或第237位和第251位胺基酸殘基之間的一段胺基酸序列的抗體；(b)由保藏號為FERM BP-7838，FERM BP-7839，FERM BP-7840，或FERM BP-8268的雜交瘤所產生的抗體；或(c)通過結合由SEQ ID NO1所示的胺基酸序列所組成的多肽，與保藏號為FERM BP-7838，FERM BP-7839，FERM BP-7840，或FERMBP-8268的雜交瘤所產生的抗體競爭的抗體。
2.權利要求1所述的抗體，該抗體是單克隆抗體。
3.權利要求1或2所述的抗體，該抗體是由保藏號為FERM BP-7838，FERM BP-7839，FERM BP-7840，或FERM BP-8268的雜交瘤所產生的抗體。
4.一種藥物組合物，其包含權利要求1至3任一項所述的抗體作為活性成分。
5.權利要求4所述的藥物組合物，它可有效抵抗至少一種下述疾病腫瘤誘導的骨軟化症，ADHR，XLH，腎性骨營養不良，透析骨病，骨質疏鬆症，低磷酸鹽血症，佝僂病，骨軟化症，腎小管機能障礙，骨量減少，低鈣血症，骨生長障礙，骨鈣化機能障礙，甲狀旁腺功能亢進症，異位鈣化，搔癢，骨硬化，佩吉特氏病，高鈣血特發性綜合症，甲狀旁腺功能減退症，骨痛，肌力下降，骨骼畸形，發育不良和維生素D缺乏症。
6.權利要求5所述的藥物組合物，它可有效抵抗至少一種下述的疾病腫瘤誘導的骨軟化症，XLH，低磷酸鹽血症，骨質疏鬆症，骨生長障礙，骨鈣化機能障礙和骨軟化症。
7.一種促進骨生成的藥劑，其包含權利要求1至3任一項所述的抗體作為活性成分。
8.權利要求4至6中任一項的藥物組合物，其包含至少2種可識別不同位點的如權利要求1所述的抗體。
9.根據權利要求4所述的藥物組合物，其中的抗體可識別如SEQID NO1所示的介於第180位和第194位胺基酸殘基之間的一段胺基酸序列。
10.一種檢測成纖維細胞生長因子-23的方法，該方法包括使識別如SEQ ID NO1所示的介於第25位和第179位胺基酸殘基之間的部分胺基酸序列的抗體，和一種識別如SEQ ID NO1所示的介於第180位和第251位胺基酸殘基之間的部分胺基酸序列的抗體，與測試樣品發生反應。
11.權利要求10所述的檢測方法，其中識別如SEQ ID NO1所示的介於第180位和第251位胺基酸殘基之間的部分胺基酸序列的抗體是一種識別如SEQ ID NO1所示的介於第180位和第196位胺基酸殘基之間的胺基酸序列的抗體。
12.根據權利要求10所述的檢測方法，該方法利用了凝血酶抑制劑。
13.根據權利要求10或11所述的檢測方法，其中的抗體是由保藏號為FERM BP-7838，FERM BP-7839，FERM BP-7840，或FERMBP-8268的雜交瘤所產生的。
14.一種檢測成纖維細胞生長因子-23的試劑盒，該試劑盒包含識別如SEQ ID NO1所示的介於第25位和第179位胺基酸殘基之間的部分胺基酸序列的抗體，和識別如SEQ ID NO1所示的介於第180位和第251位胺基酸殘基之間的部分胺基酸序列的抗體。
15.權利要求14所述的試劑盒，其中識別如SEQ ID NO1所示的介於第180位和第251位胺基酸殘基之間的部分胺基酸序列的抗體是識別如SEQ ID NO1所示的介於第180位和第196位胺基酸殘基之間的胺基酸序列的抗體。
16.權利要求14或15所述的試劑盒，其中的抗體是由保藏號為FERM BP-7838，FERM BP-7839，FERM BP-7840，或FERM BP-8268的雜交瘤所產生的。
17.一種抗成纖維細胞生長因子-23的抗體結合物質，該物質可結合至少一種選自權利要求1至3的抗體。
18.一種醫療器具，其裝備有權利要求17中所述的結合物質。
19.根據權利要求18中所述的醫療器具，該器具被用於除去血液中的成纖維細胞生長因子-23。
全文摘要
本發明的目的是提供抗成纖維細胞生長因子－23的抗體。即，具有控制磷酸鹽代謝或維生素D代謝的活性的抗體，和相應於(a)，(b)，(c)中的抗體，該抗體是通過利用包含一種如SEQ ID NO1所示的胺基酸序列的多肽或包含一種從SEQ ID NO1所示的胺基酸序列中通過缺失、替代或添加一個至多個胺基酸而衍生得到的一段胺基酸序列，並且具有成纖維生長因子23活性的多肽免疫動物得到的。(a)一種識別如SEQ ID NO1所示胺基酸序列中的介於第180至第194位或第237至第251位之間的胺基酸序列的抗體。(b)一種由保藏號為FERM BP－7838，FERM BP－7839，FERM BP－7840，或FERM BP－8268的雜交瘤所產生的抗體。(c)一種可與保藏號為FERM BP－7838，FERM BP－7839，FERM BP－7840，或FERM BP－8268的雜交瘤所產生的抗體競爭的抗體。
文檔編號A61K39/00GK1639193SQ0380485
公開日2005年7月13日 申請日期2003年1月6日 優先權日2001年12月28日
發明者山崎雄司, 島田考志, 山下武美 申請人:麒麟麥酒株式會社