微菌落分子信標培養結核菌診斷試劑盒及製備方法和應用的製作方法

2023-09-19 23:04:05 2

專利名稱：微菌落分子信標培養結核菌診斷試劑盒及製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明所屬領域包括以下內容
(一) 分子生物學範疇。
(二) 細菌生物特徵研究領域。
(三) 傳染性疾病診斷醫學研究領域。
二背景技術：
(一) 分子生物學本申請的主體是結核桿菌的分子信標探針。選擇結核桿菌特有的序列
ropB, IS6110為耙序列設計引物和探針檢測結核桿菌。
(二) 細菌生物特徵研究通過結核桿菌的微菌落培養以後，證明接種的細菌是活菌。
(三) 傳染性疾病診斷醫學研究。
結核病俗稱"肺癆"，是由結核桿菌侵入人體後引起的一種具有強烈傳染性的慢性消耗性 疾病。近年來由於結核桿菌耐藥性增強、人口流動增加、愛滋病發病率升高、以及有些國家 和地區忽視對結核病的控制，結核病有重薪抬頭的趨勢，再次成為危害人類健康的疾病之一。
據世界衛生組織估計，目前全世界約有20億人受結核分枝桿菌感染，5000萬人感染耐藥 結核桿菌，每年有800萬人新感染結核桿菌，300萬人死於結核病。我國是世界上22個結核病 高負擔國家之一，患者人數僅次於印度居全球第二位。世界衛生組織2004年召開的第二屆全 球遏制結核病夥伴論壇大會上，將我國列在需要特別引起警示的國家和地區的首位。具體表 現為6 "多"感染人數多、患病人數多、新發患者多、死亡人數多、農村患者多、耐 藥患者多。
目前常用的方法1.抗酸染色2.培養法3.分子生物學法。 為了克服抗酸染色特異性和敏感性低、傳統培養耗時長，PCR方法存在假陽性、假陰性、產 物分析容易汙染環境等缺點，探索建立一種微菌落培養法和分子信標檢測法聯合應用檢測結 核桿菌的方法。
三
發明內容
(一)發明的特徵
1、由於結核桿菌生長非常緩慢，大約需要12小時才能分裂一代，需要4-8周才能長出可見 菌落，不利於結核病的診斷和流行病學調査。為了達到快速檢驗的目的，本發明提供了一種用於快速檢測生物樣品中是否存在結核桿菌以及鑑定結核桿菌死活的方法。其特徵是將結 核桿菌塗布於貼在結核桿菌選擇性培養基上的醋酸纖維素膜上孵育，12-72小時，可藉助於普 通光學顯微鏡觀察到結核桿菌的微菌落形態。
2、 微菌落法看到形成微菌落以後，證明接種的細菌是活菌，但不能判斷是否是結核分枝桿菌
為此本發明提供了一種具有高特異性、高靈敏度的用於結核桿菌檢測的分子信標探針。其特
徵是選擇結核桿菌特有的序列r叩B,IS6110為靶序列設計引物(具有序列表〈210〉 3，序列 表〈210〉 4，序列表〈210〉6，序列表 7的多核苷酸序列)和雙重探針(具有序列表〈210〉5， 序列表〈210> 8的多核苷酸序列)檢測結核桿菌。
3、 由2、所描述的多核苷酸序列經PCR擴增出215/233bp (rpoB)和114bp (IS6110)兩個結 核桿菌的片段，分別是具有序列表〈210〉1，序列表〈210〉 2的多核苷酸序列。其特徵是與 結核桿菌的原基因序列完全相同。
4、 ropB、 IS6110雙分子信標方法的特異性為95-100%，靈敏度1-100個菌/ml。
5、 所建立的微菌落(microcolony， MC)-分子信標檢測法的線性範圍是103-1011copies/ml， 擴增效率達90%以上。
(二)微菌落-分子信標檢測的應用特點
1、 高特異性結核分枝桿菌微菌落培養+ DNA分子信標。
2、 高靈敏度臨床標本中結核分枝桿菌濃度《10—20個/ml即可檢出。
3、 快速 標本處理後，僅12-72小時內可報告結果。
4、 準確 10-12 h可看到結核桿菌菌落，不僅只檢出結核分枝桿菌的活菌，而且由於在同
一個PCR反應中採用多種不同的分子信標探針來檢測結核分枝桿菌對利福平的耐藥 情況，每種探針用不同的螢光素標記，不同種探針與靶序列完全結合後覆蓋了 MTB RNA聚合酶rpoB基因的整個核區域，因此，可同步檢測結核分枝桿菌的耐藥株。
5、 簡單,常規操作，極易掌握。
6、 方便且適用範圍廣泛1)可檢測痰液、胸水、腹水、腦脊液、尿、骨髓等多種標本。 2)用於結核病的實驗診斷。3)抗癆玲療效果的評價。4)尤其是初診病人的鑑別診斷。 5)用於結核菌耐藥性的快速檢測。6)用於HIV高危人群的鑑別診斷。7)可檢出大 量塗片漏診患者，可用於HIV高危人群的鑑別診斷。8)對環境無汙染。
四、發明目的
針對現有檢測結核分枝桿菌技術的不足，本發明的目的在於建立一種微菌落快速培養結 核桿菌以及提供一種用於檢測結核分枝桿菌的特有的引物和分子信標及其試劑盒的製備方 法，以便供臨床檢測和科學研究之用。
本發明為快速培養檢測結核桿菌而設計的微菌落培養方法、靶序列RT-PCR引物、DNA 分子信標探針、試劑盒和檢測方法及其應用。
51、 本發明還提供了一種用於快速檢測生物樣品中是否存在結核桿菌以及鑑定結核桿菌死活的 方法。其步驟包括，
(1) 將生物標本接種到貼在羅琴氏培養基上的醋酸纖維素膜上，培養前後均做微菌落實 驗，看是否有微菌落形成，以確定細菌的死活。
(2) 採集接種有結核桿菌且培養12-72小時的醋酸纖維素膜，用無菌剪刀剪碎後放入EP 管中，加入200ulDNA提取液
(3) 然後置於沸水中水浴10分鐘，製備DNA模板，
(4) 將步驟b)得到的DNA模板進行real time PCR擴增處理
(5) 反應結束後利用軟體進行數據分析
由於結核桿菌生長非常緩慢，大約需要12小時才能分裂一代，需要4-8周才能長出可見 菌落，不利於結核病的診斷和流行病學調查。為了達到快速檢驗的目的，利用顯微鏡儘可能 早的觀察結核桿菌的生長情況不失為一種可行的方法。
用微菌落培養法看到形成微菌落以後，證明接種的細菌是活菌，但不能判斷是否是結核 分枝桿菌。為此選擇結核桿菌特有的序列ropB,IS6110為靶序列設計引物和探針檢測結核杆 菌。
2、 為了實現上述目的針對結核桿菌的特點，首先選擇相應的靶序列，然後針對相應的靶序 列設計特異性的'引物，擴增出特異性的目的DNA片段。因此待測基因兩端的DNA序列的引 物設計也是本發明的要點。本發明提供了兩對檢測結核桿菌的引物序列，如下
Tbl f: CAAggAgTTCTTCggCACC
Tbl r: AgCCgATCAgACCgATgTT TB2 f:gCCTACgTggCCTTTgTC TB2 r:ggTCCAgATggCTTgCTC
3、 本發明還提供了檢測上述兩個靶序列的而設計的兩個探針，其序列為
Tbl probe: fam+CAgCgCgTgAgCgTgCCgggCTgCgCTg+dabcyl
Tb2 probe: hex+CAgCgACgCCTACgCTCgCAggATCCTCgCTg+dabcyl
其中環狀部分與所述靶序列是完全互補的序列。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體/轉錄調控元件(如啟動子、增強子等) 和選擇性標記基因。
4、 提供分別含有結核桿菌ropB和IS6110的多核苷酸基因工程化的宿主細胞。本發明中， 結核桿菌ropB和IS6110多核苷酸或含有該多核苷酸的重組載體可轉化或轉導入宿主細胞， 以構成含有該多核苷酸或重組載體的基因工程化宿主細胞。術語"宿主細胞"指原核細胞， 如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表 性例子有大腸桿菌，鏈黴菌屬；細菌細胞如鼠傷寒沙門氏菌；真菌細胞如酵母；植物細胞; 昆蟲細胞如果蠅S2或Sfi>;動物細胞如CHO、 COS或Bowes黑素瘤細胞等。
5、 提供生產微菌落-分子信標檢測試劑盒的方法。用本發明所述的DNA序列或含有所述DNA
6序列的重組載體轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物 如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaCl2法處理，所用的 步驟在本領域眾所周知。可供選擇的是用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。 當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉澱法，或者常規機械方法如 顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
6、本發明還涉及本發明的檢測試劑盒在結核病的診斷、預防和治療中的應用，也可用於流行 病學的調查。
本發明的其它方面由於本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
五

下列附圖用於說明本發明的具體實施方案，而不用於限定由權利要求書所界定的本發明 範圍。
圖1是本發明的結核桿菌的微菌落形態。
圖2是本發明擴增出的結核桿菌ropB片段凝膠電泳圖，233bp。 圖3是本發明擴增出的結核桿菌IS6110片段凝膠電泳圖，114bp。
六具體實施例方式
(一)實施案例
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不 用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 sanlbrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York: cold Spring Harbor Laboratory Pres s， 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例l:微菌落培養法
1. 按照《臨床微生物學手冊》的方法配製改良L-J培養基，分裝到直徑為9cm的培養皿 中。置於烤箱中85'C凝固滅菌30分鐘，連續滅菌3天，每天一次。
將MC膜剪成邊長2cm的方塊，置於紫外燈下雙面各照射30分鐘，置於無菌容器中備用。
2. 用無菌鑷子將紫外線雙面照射過(無菌實驗陰性)的MC膜貼於製備的培養基表面。 然後載每張膜上滴加慶大黴素和青黴素各10ul，待其吸收後取臨床標本10ul加到膜上。
3. 微菌落的觀察
① 用無菌鑷子將MC膜輕輕取下貼於潔淨的載玻片上用電熱盤烘乾。用無菌鑷子將乾燥 的MC膜從玻片上取下浸入透明液。
② 將MC膜取出貼於玻片上透明。
7③ 將膜連同玻片一起浸入95%乙醇。
④ 取出後馬上用中性樹膠固定膜的四周。
⑤ 在油鏡下觀察細菌微菌落形態，並且拍照記錄。
實施例2:提取結核桿菌的DNA-
採集接種有結核桿菌且培養12-72小時的醋酸纖維素膜，用無菌剪刀剪碎後放入EP管中， 加入DNA提取液，然後置於沸水中水浴IO分鐘，製備DNA模板，12000rpm離心5分 鍾備用。優點在於相當於增菌後提取DNA,增加了檢測的靈敏度。
實施例3:標準品的製備
1. 利用基因工程技術，將大小分別為IS6110 (114bp)和RopB (233bp) DNA片斷克隆到 PMD-19T載體上，經PCR及測序鑑定，確認構建了標準品重組質粒。
2. 通過梯度稀釋質粒濃度，經PCR反應、3%瓊脂糖凝膠電泳做靈敏度實驗，確認普通PCR 檢測結核桿菌下限為103copies/ml。
3. 利用稀釋好不同濃度的重組質粒，進行real-time PCR反應，構建陽性標準品，制定標準曲 線，為分子信標螢光定量PCR技術檢測結核桿菌奠定了基礎。
實施例4:螢光定量PCR(分子信標)進行核算擴增和雜交檢測樣本的DNA:
根據本發明用於檢測生物樣品中的結核桿菌是否存在的方法包括以下步驟
a)採集生物樣品，進行微菌落試驗b)製備DNA模板c)將b步驟得到的DNA模板進行螢光
定量PCR擴增處理，其中所用的引物和探針分別如下
Tbl f: CAAggAgTTCTTCggCACC Tbl r: AgCCgATCAgACCgATgTT
Tbl probe: fam+CAgCgCgTgAgCgTgCCgggCTgCgCTg+dabcyl TB2 f:gCCTACgTggCCTTTgTC TB2 r:ggTCCAgATggCTTgCTC
TB2probe:hex+CAgCgACgCCTACgCTCgCAggATCCTCgCTg+dabcyl
實施例5:微菌落分子信標培養結核菌診斷試劑盒的應用研究 1、微菌落-分子信標聯合運用的敏感性的驗證
配置一定濃度(例如0.25MCF)結核桿菌菌液，進行不同倍數稀釋，然後利用前面建立起來 的標準進行定量，分別定量出1個/10ul、 10個/10ul、 100個/10ul、 1000個/10ul， 10000
8個/10ul， 100000個/10ul等。然後分別取10ul接種於貼在羅氏培養基上的醋酸纖維素膜上， 共3張， 一張用於觀察培養前形態， 一張用於觀察培養12小時後形態，另外一張用於提取 DNA做螢光定量PCR。
此項實驗的目的在於驗證微菌落-分子信標方法的敏感性。
2、微菌落-分子信標聯合運用的特異性的驗證
(1) 購買如下菌株分枝桿菌包括結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、堪薩斯分枝杆 菌、戈登分枝桿菌、胃分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、偶然種,母牛分枝桿菌，不產色分校桿菌、蟾蜍分 枝桿菌、次要分枝桿菌、草分枝桿菌、淡黃分枝桿菌、胞內分枝桿菌和鳥分枝桿菌。非分枝桿菌 包括肺炎桿菌、甲鏈桿菌、金黃色葡萄球菌、假白喉桿菌、克雷伯桿菌、銅綠假單胞桿菌、表皮葡 萄球菌,大腸埃希菌和卡他球菌等。採用微菌落-分子信標法進行檢測。取上述細菌配成一定濁 度的菌液，然後做不同倍數的稀釋。
(2) 然後每一種細菌的每一個稀釋度取10ul接種到貼在培養基上的醋酸纖維素膜上，共3
張，塗抹均勻。培養12小時，觀察生長情況，取一張提取DNA做PCR。
(3) 然後再取上述細菌的混合菌液(包括兩種、多種、全部)，取10ul接種到貼在培養基上 的醋酸纖維素膜上，共3張，塗抹均勻。培養12小時，觀察生長情況，取一張提取DNA做 PCR。
做此項實驗的目的在於驗證微菌落-分子信標整個方法的敏感性和特異性。
序列表
〈110〉福建醫科大學朱玲 人分枝結核桿菌基因序列 〈140〉 20080410141226 〈141〉 2008-04-10 233 〈212〉 DNA
〈213〉人分枝結核桿菌rpoB基因序列 〈400〉 1
ca aggagttctt cggcaccagc cagctgagcc 1295 aattcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg ggttgaccca caagcgccga ctgtcggcgc 1355 tggggcccgg cggtctgtca cgtgagcgtg ccgggctgga ggtccgcgac gtgcacccgt 1415 cgcactacgg ccggatgtgc ccgatcgaaa cccctgaggg gcccaacatc ggtctgatcg 1475 get 2 〈211〉 114 〈212〉 ■
〈213〉人分枝結核桿菌IS6110基因序列 <柳〉2
855 gcctacg tggcctttgt caccgacgcc tacgctcgca ggatcctggg
901 ctggcgggtc gcttccacga tggccacctc catggtcctc gacgcgatcg agcaagccat 961 ctggacc
〈210〉 3 〈211> 27 3
Tbl f: CAAGGAGTTCTTCGGCACC
4 〈211> 20 〈212〉 DNA 人工序列 〈400> 4
Tbl r: AGCCGATCAGACCGATGTT
〈210> 5 〈211〉 20 〈212〉腿 〈213〉人工序列 〈400〉 5
Tbl probe: fam+CAGCGCGTGAGCGTGCCGGGCTGCGCTG+dabcyl
10〈210〉 6 21 腿 人工序列 〈400〉 6
TB2 f:GCCTACGTGGCCTTTGTC
22 <212〉讓 〈213〉人工序列 〈400〉 7
TB2 r:GGTCCAGATGGCTTGCTC
<210〉 8 人工序列 〈400〉 8
TB2 probe:hex+CAGCGACGCCTACGCTCGCAGGATCCTCGCTG+dabcyl
權利要求
1.為微菌落分子信標培養結核菌診斷試劑盒及製備方法和應用而設計的、為PCR擴增結核桿菌選定的靶序列而設計的兩對引物，所述引物為以下的兩對引物Tb1 fCAAggAgTTCTTCggCACC Tb1 rAgCCgATCAgACCgATgTTTB2 fgCCTACgTggCCTTTgTC TB2 rggTCCAgATggCTTgCTC
2. 為檢測結核桿菌而設計的兩條分子信標，所述的探針為以下的序列，其環狀部分與耙序列特異性互補，莖部為與靶序列無關的互補的寡核苷酸。其莖環序列是Tbl probe: fam+CAgCgCgTgAgCgTgCCgggCTgCgCTg+dabcylTb2 probe: hex+CAgCgACgCCTACgCTCgCAggATCCTCgCTg+dabcyl
3. 根據權利要求2所述的分子信標，其特徵在於，5端分別標記FAM和HEX的螢光素，而3 端標記DABCYL淬滅劑。
4. 一種用於檢測結核桿菌的方法，包括以下步驟a) 採集接種有結核桿菌且培養12-72小時的醋酸纖維素膜，用無菌剪刀剪碎後放入EP 管中，加入200ulDNA提取液，b) 然後置於沸水中水浴10分鐘，製備DNA模板，c) 將步驟b)得到的DNA模板進行real time PCR擴增處理，d) 反應結束後利用軟體進行數據分析。
5. 根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述生物樣品選自結核病人或者疑似結核病人的 痰液、胸腹水、血液、尿液、腦脊液等。且其步驟d)是採用分子信標螢光檢測。
6. 根據權利要求2所述的各分子信標的實驗優化條件包括鎂離子工作濃度為2. 5mM-3. 5mM, 退火溫度為52-6(TC,上遊、下遊引物濃度均選擇為0. 2-0. 4mM。
7. 根據權利要求2， 6所述的ropB、 IS6110雙分子信標方法的特異性為95-100%，靈敏度1-100 個菌/ml。
8. 根據權利要求2,4,7所述而建立的微菌落(microcolony，MC)-分子信標檢測法的線性範圍 是103-10"copies/ml，擴增效率達90%以上。特異性為》95°/0。
9. 一種用於檢測結核桿菌的試劑盒，包括根據權利要求1,2,3所述的兩對引物和兩條分子信 標探針，羅琴氏培養基，選擇性培養基的製備，醋酸纖維素膜，陽性對照液和陰性對照液， 所用DNA提取液為50腿ol/LNaOH、 10mmol/LTris.HCl(pH8.0)、 1% Triton、X-100、 l%NP-40、 0.5mmol/LEDTA(pH8.0)，載玻片，95%乙醇，酒精苯酚(無水乙醇苯酚=1: 10)，核酸擴增和雜交反應管內裝0.02-0.04ml的核酸擴增混合液，兩對序列分別為 Tbl f: CAAggAgTTCTTCggCACC Tbl r: AgCCgATCAgACCgATgTTTbl probe: fam+CAgCgCgTgAgCgTgCCgggCTgCgCTg+dabcyl TB2 f:gCCTACgTggCCTTTgTC TB2 r:ggTCCAgATggCTTgCTC TB2probe:hex+CAgCgACgCCTACgCTCgCAggATCCTCgCTg+dabcyl
10. —種用於檢測結核桿菌及其耐藥菌的試劑盒，其中選擇性培養基的製備特徵在於在羅琴氏培養基上加入對革蘭氏陽性球菌有效的抗生素(400ug/ml)和對革蘭氏陰性桿菌有效 的抗生素(400ng/ml)各50yl。
全文摘要
本發明公開了微菌落-分子信標檢測法，一種用於結核桿菌快速培養的診斷試劑盒。同時闡明了該診斷試劑盒的製備方法；並就其臨床應用做了科學的表述。尤為重要的是指明了該診斷試劑盒的臨床應用價值和巨大的開發前景。
文檔編號C12N15/11GK101560542SQ20081007088
公開日2009年10月21日 申請日期2008年4月14日 優先權日2008年4月14日 公開號200810070887.發明者玲 朱 申請人:福建醫科大學