用於改變含油酵母內多不飽和脂肪酸水平的△－12去飽和酶基因的製作方法

2023-09-19 22:22:05

專利名稱：用於改變含油酵母內多不飽和脂肪酸水平的△－12去飽和酶基因的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域。更具體而言，本發明涉及對特定核酸片段的鑑定，該核酸片段編碼有助於破壞或提高諸如含油酵母的含油微生物內多不飽和脂肪酸(PUFAs)產量的Δ12脂肪酸去飽和酶。
背景技術：
某些多不飽和脂肪酸或PUFAs早已被公認為是健康細胞的重要生物學組分。例如，這種PUFAs被公認為是●不可在哺乳動物體內被從頭合成，而必須通過飲食獲得或通過亞油酸(LA)或α-亞麻酸(ALA)的進一步去飽和和延伸而衍生獲得的「必需」脂肪酸；●細胞質膜的組分，在細胞質膜內可以諸如磷脂或三醯甘油的形式出現；●尤其對發育中的嬰兒腦的完全發育和對組織形成和修復而言是必需的；並且●是哺乳動物體內若干種重要的生物學活性類二十烷酸的前體，這些生物學活性類二十烷酸包括前列環素、類二十烷酸、白細胞三烯和前列腺素。
19世紀70年代對格陵蘭愛斯基摩人進行的觀察結果將心臟病的低發生率和長鏈ω-3 PUFAs的高攝取量聯繫起來(Dyerberg，J.et al.，Amer.J.Clin Nutr.28958-966(1975)；Dyerberg，J.et al.，Lancet 2(8081)117-119(July 15，1978))。最近的研究證實了ω-3 PUFAs的心血管保護作用(Shimokawa，H.，World Rev Nutr Diet，88100-108(2001)；von Schacky，C.，and Dyerberg，J.，World Rev Nutr Diet，8890-99(2001))。此外，業已發現用ω-3脂肪酸進行的治療所引起的若干種失調，諸如血管成形術後的再狹窄率、炎症和風溼性關節炎、哮喘、牛皮癬和溼疹的症狀。γ-亞麻酸(GLA，一種ω-6 PUFA)已被證明可降低與壓力有關的血壓升高並提高在運算測試方面的表現。GLA和二高-γ-亞麻酸(DGLA，另一種ω-6 PUFA)已被證實可抑制血小板聚集，使血管舒張、膽固醇水平降低並抑制血管壁平滑肌和纖維組織的增殖(Brenner et al.，Adv.Exp.Med.Biol.8385-101(1976))。單獨施用GLA或DGLA，或與十二碳五烯酸(EPA，一種ω-3 PUFA)組合施用已被證實可減少或預防胃腸出血和非類固醇抗炎症藥物導致的其它副作用(U.S.4,666,701)。此外，GLA和DGLA已被證實可預防或治療子宮內膜異位和經前期症候群(U.S.4,758,592)，和治療肌痛性腦脊髓炎和病毒感染後的慢性疲勞(U.S.5,116,871)。另有證據指出PUFAs可能參與調節了鈣代謝，說明它們可能有助於治療或預防骨質疏鬆症和腎或泌尿道結石。最後，還可將PUFAs應用於癌症和糖尿病的治療(U.S.4,826,877；Horrobin et al.，Am.J.Clin.Nutr.57(Suppl.)732S-737S(1993))。
PUFAs通常被劃分為兩大類(由ω-6和ω-3脂肪酸組成)，這兩大類是分別通過必需脂肪酸LA和ALA的去飽和和延伸而衍生獲得。有多種市售PUFAs是天然來源[例如，月見草、琉璃苣和紅醋慄的種子；絲狀真菌(被孢黴屬)、紫球藻(紅藻)，魚油和海洋浮遊生物(小環藻、菱形藻、隱甲藻)]，但存在與它們的製備方法相關的若干劣勢。首先，諸如魚和植物的天然來源傾向於具有高度不均勻的油組成。因此，由這些來源獲得的油需經過大量純化，才可分離或富集一種或多種目標PUFAs。天然來源的實用性還存在無法控制的波動(例如由於天氣、疾病或對魚群的捕撈過度)；可生成PUFAs的生物通常在經濟學上無法與被研發用於食品生產的雜合生物競爭。某些可自然生成PUFAs的生物(例如紫球藻、被孢黴)的大規模發酵也花費不菲和/或難以進行工業規模的培養。
針對上述局限性，業已在下述兩個方面進行了大量的研究工作1.)研發易於工業製備PUFAs的重組體來源；和2.)修飾脂肪酸生物合成途徑，使其能夠生成目標PUFAs。例如，過去若干年，業已在多種生物來源的脂肪酸去飽和酶和延伸酶基因的分離、克隆和操縱方面取得了進展。這些基因的序列信息使人們有希望在不可自然生成PUFAs的新型宿主生物內生成目標脂肪酸和/或脂肪酸組分。有文獻報導了釀酒酵母內的大量實例，諸如●Domergue，F.，et al.(Eur.J.Biochem.2694105-4113(2002))，其中海洋硅藻三角褐指藻來源的兩種去飽和酶被克隆進釀酒酵母內，導致生成了EPA；●Beaudoin F.，et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97(12)6421-6426(2000))，其中利用了秀麗新杆線蟲來源的基因在釀酒酵母內重構了ω-3和ω-6 PUFA生物合成途徑；●Dyer，J.M.et al.(Appl.Eniv.Microbiol.，59224-230(2002))，其中在釀酒酵母內表達了植物脂肪酸去飽和酶(FAD2和FAD3)，導致生成了ALA；以及●U.S.6,136,574(Knutzon et al.，Abbott Laboratories)，其中將甘藍型油菜來源的一種去飽和酶和真菌高山被孢黴來源的兩種去飽和酶克隆進釀酒酵母內，導致生成了LA、GLA、ALA和STA。
但仍然需要可表達上述類型的基因並可經濟地生產工業量的一種或多種PUFAs的合適微生物系統。此外，還需將油富集為特定PUFAs，尤其是EPA和DHA。
之前尚未作為PUFAs的生產平臺被研究的一類微生物是含油酵母。這些生物累積的油可高達其細胞乾重的80％。高油含量的含油酵母的培養技術已充分發展(例如，參見EP 0 005 277B1；Ratledge，C.，Prog.Ind.Microbiol.16119-206(1982))，與製備ω-3或ω-6 PUFAs的工業微藻發酵相比，該技術可能具有成本優勢。完整酵母細胞還體現一種封裝了ω-3或ω-6 PUFA富集油的實用方法，適用於功能食品和動物飼料添加劑中。
儘管具有上述優勢，大部分含油酵母卻自然缺乏ω-6和ω-3PUFAs，因為這些生物內自然生成的PUFAs通常局限於18:2脂肪酸(和較不常見的18:3脂肪酸)。因此，需解決的問題是研發可累積富含ω-3和/或ω-6脂肪酸的油的含油酵母。針對該目標，不僅需要將合成和累積ω-3和/或ω-6脂肪酸所需的去飽和酶和延伸酶導入含油酵母，還需要提高18:2底物(即LA)的有效性。通常，該底物的有效性受可催化從油酸到LA的轉化的Δ12去飽和酶的活性控制。
已有公開文獻公開了多種已知的Δ12去飽和酶，一部分來源於真菌(例如高山被孢黴、構巢裸殼孢菌、魯氏毛黴)。已知這些去飽和酶並不能有效地改變含油酵母內的脂肪酸組成，因而不被優選應用在含油酵母內。因此，需要鑑定和分離編碼適合在這些特定宿主生物內表達的Δ12去飽和酶的基因，並將其應用在PUFAs的生產中。
發明者通過從含油酵母解脂耶氏酵母(Yarrowia)中分離出Δ12去飽和酶的編碼基因，從而解決了上述難題。
發明概述本發明涉及從耶氏酵母中分離獲得的Δ12去飽和酶編碼基因，該基因有助於操縱可生成ω-3和/或ω-6脂肪酸的生化途徑。本發明相應提供了編碼耶氏酵母Δ12去飽和酶的分離核酸分子，選自(a)編碼SEQ ID NO24所示胺基酸序列的分離核酸分子；(b)可在下述雜交條件下與(a)雜交的分離核酸分子0.1X SSC、0.1％SDS、65℃，並相繼用2X SSC、0.1％SDS和0.1X SSC、0.1％SDS洗滌；或者是與(a)或(b)互補的分離核酸分子。
本發明還提供了包括本發明所述核酸分子、遺傳嵌合體及其編碼的多肽的轉化宿主細胞。
在一種可選實施方案中，本發明提供了製備亞油酸的方法，包括a)提供包括下列元件的酵母(i)本發明編碼Δ12去飽和酶多肽的嵌合基因；和(ii)由油酸組成的去飽和酶底物源；b)在可表達Δ12去飽和酶多肽編碼基因並使油酸轉化為亞油酸的條件下培養步驟(a)的酵母；並c)任選地回收步驟(b)的亞油酸。
在另一種實施方案中，本發明提供了製備ω-3脂肪酸的方法，包括a)改造微生物宿主細胞，使其包括下列元件(i)編碼Δ12去飽和酶多肽並且已破壞的內源基因；和(ii)編碼ω-3脂肪酸生物合成途徑的酶的基因；並b)提供由α-亞麻酸組成的去飽和酶底物源；c)在可表達ω-3脂肪酸生物合成途徑的基因的條件下培養步驟(a)的酵母，生成ω-3脂肪酸；並
d)任選地回收步驟(c)的ω-3脂肪酸。
同樣，本發明還提供了調節ω-3或ω-6脂肪酸在宿主細胞內的生物合成的方法，包括a)提供包括功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑的宿主細胞；b)使Δ12去飽和酶基因在(a)所述宿主細胞內超量表達；由此調節ω-3或ω-6脂肪酸的生物合成。
在另一種實施方案中，本發明提供了獲得編碼Δ12去飽和酶的核酸分子的方法，包括(a)用本發明所述核酸分子探測基因組文庫；(b)鑑定可與本發明所述核酸分子雜交的DNA克隆；並(c)對包括步驟(b)所鑑定克隆的基因組片段測序，其中測序的基因組片段編碼Δ12去飽和酶。
同樣，本發明還提供了另一種獲得編碼Δ12去飽和酶的核酸分子的方法，包括(a)合成至少一個與SEQ ID NO23所示序列的一部分對應的寡核苷酸引物；並(b)利用步驟(a)的寡核苷酸引物擴增存在於克隆載體內的插入片段；其中擴增的插入片段編碼Δ12去飽和酶編碼胺基酸序列的一部分。
附圖簡述和序列描述

圖1所示為含油酵母內脂質累積生化機制的示意圖。
圖2所示為ω-3和ω-6脂肪酸生物合成途徑。
圖3所示為適合解脂耶氏酵母內的基因表達的質粒載體pY5的構建。
圖4所示為適合解脂耶氏酵母內的基因表達的質粒載體pY5-13和pY5-4的構建。
圖5所示為利用ClustalW分析法(DNASTAR軟體的Megalign程序)在不同的酵母和真菌Δ12去飽和酶同源物之間和當中進行的兩兩比較(％同一性)。
圖6所示為中間載體pYZM5CHPPA的構建示意圖。
圖7所示為在異絲水黴Δ17去飽和酶基因和經過密碼子最優化後適合在解脂耶氏酵母內表達的合成基因二者的DNA序列之間進行的比較。
圖8所示為解脂耶氏酵母內的翻譯起始密碼子『ATG』周圍所偏好的共有序列。
圖9所示為體外合成密碼子最優化Δ17去飽和酶基因的方案。
圖10所示為適合在解脂耶氏酵母內表達合成的密碼子最優化Δ17去飽和酶基因和野生型Δ17去飽和酶基因的質粒。
圖11A和11B所示為對在分別經過野生型Δ17去飽和酶基因和合成的密碼子最優化Δ17去飽和酶基因轉化的解脂耶氏酵母內生成的脂肪酸進行氣相色譜分析的結果。
圖12所示為中間載體pY24-4的構建示意圖。
圖13所示為中間載體pYZV16的構建示意圖。
圖14所示為整合載體pYZM5EL6的構建示意圖。
圖15所示為整合載體pYZV5EL6和pYZV5EL6/17的構建示意圖。
通過下文的詳述內容和構成本申請一部分的附帶序列描述可以更完整地理解本發明。
下列序列遵循37 C.F.R.§1.821-1.825(「對含有核苷酸序列和/或胺基酸序列公開內容的專利申請的要求---序列規則」)，並符合世界智慧財產權組織(WIPO)標準ST.25(1998)以及EPO和PCT的序列列表要求(管理細則的規則5.2和49.5(a-bis)，以及第208節和附錄C)。應用於核苷酸和胺基酸序列信息的符號和格式遵循37 C.F.R.§1.822所述規則。
SEQ ID NO1和2分別對應於引物TEF5』和TEF3』，被用於分離TEF啟動子。
SEQ ID NO3和4分別對應於引物XPR5』和XPR3』，被用於分離XPR2轉錄終止子。
SEQ ID NO5-18分別對應於引物YL1、YL2、YL3、YL4、YL23、YL24、YL5、YL6、YL9、YL10、YL7、YL8、YL61和YL62，被用於構建質粒。
SEQ ID NO19和21分別對應於被命名為P73和P76的簡併引物，被用於分離解脂耶氏酵母Δ12去飽和酶基因。
SEQ ID NO20和22是分別對應於簡併引物P73和P76的胺基酸共有序列。
SEQ ID NO23所示為解脂耶氏酵母Δ12去飽和酶基因的DNA序列，而SEQ ID NO24所示為解脂耶氏酵母Δ12去飽和酶的胺基酸序列。
SEQ ID NO25-28分別對應於引物P99、P100、P101和P102，被用於定向破壞解脂耶氏酵母Δ12去飽和酶基因。
SEQ ID NO29-32分別對應於引物P119、P120、P121和P122，被用於對已破壞的解脂耶氏酵母Δ12去飽和酶基因的定向整合進行篩選。
SEQ ID NO33和34分別對應於引物P147和P148，被用於擴增全長解脂耶氏酵母Δ12去飽和酶基因。
SEQ ID NO35所示為異絲水黴Δ17去飽和酶基因的DNA序列。
SEQ ID NO36所示為高山被孢黴Δ6去飽和酶基因的DNA序列，而SEQ ID NO37所示為高山被孢黴Δ6去飽和酶的胺基酸序列。
SEQ ID NO38所示為高山被孢黴Δ5去飽和酶基因的DNA序列，而SEQ ID NO39所示為高山被孢黴Δ5去飽和酶的胺基酸序列。
SEQ ID NO40和41分別對應於引物YL11和YL12，被用於擴增高山被孢黴Δ5去飽和酶。
SEQ ID NO42和43分別對應於引物YL21A和YL22，被用於擴增野生型異絲水黴Δ17去飽和酶。
SEQ ID NO44所示為高山被孢黴高親和性延伸酶基因的DNA序列，而SEQ ID NO45所示為高山被孢黴高親和性延伸酶的胺基酸序列。
SEQ ID NO46所示為經過密碼子最優化後適合在解脂耶氏酵母內表達的合成Δ17去飽和酶基因的DNA序列，而SEQ ID NO47所示為異絲水黴Δ17去飽和酶的對應胺基酸序列。
SEQ ID NO48-69對應於11對寡核苷酸，這11對寡核苷酸合起來包括了異絲水黴Δ17去飽和酶基因的完整密碼子最優化編碼區(例如，分別為D17-1A、D17-1B、D17-2A、D17-2B、D17-3A、D17-3B、D17-4A、D17-4B、D17-5A、D17-5B、D17-6A、D17-6B、D17-7A、D17-7B、D17-8A、D17-8B、D17-9A、D17-9B、D17-10A、D17-10B、D17-11A和D17-11B)。
SEQ ID NO70-75分別對應於引物D17-1、D17-4R、D17-5、D17-8D、D17-8U和D17-11，在合成密碼子最優化Δ17去飽和酶基因期間被用於PCR擴增。
SEQ ID NO76和77分別對應於引物YL53和YL54，被用於定點誘變，以生成pYSD17M。
SEQ ID NO78和79分別對應於引物KU5和KU3，被用於擴增含有耶氏酵母URA3基因的1.7kB DNA片段(SEQ ID NO80；胺基酸序列如SEQ ID NO81所示)。
SEQ ID NO82和83分別對應於引物KI5和KI3，被用於擴增含有Impatient balsama的接合酶基因的1.1kB DNA片段(SEQ IDNO84；胺基酸序列如SEQ ID NO85所示)。
SEQ ID NO86和87分別對應於引物KTI5和KTI3，被用於擴增含有TEF::接合酶::XPR嵌合基因的1.7kB DNA片段(SEQ ID NO88；胺基酸序列如SEQ ID NO89所示)。
SEQ ID NO90和91分別對應於引物KH5和KH3，被用於擴增含有大腸桿菌潮黴素抗性基因的1kB DNA片段(SEQ ID NO92；胺基酸序列如SEQ ID NO93所示)。
SEQ ID NO94和95分別對應於引物KTH5和KTH3，被用於擴增含有TEF::HPT::XPR融合基因的1.6kB DNA片段(SEQ ID NO96；胺基酸序列如SEQ ID NO97所示)。
SEQ ID NO98和99分別對應於解脂耶氏酵母URA3基因中401bp的5』-序列和568bp的3』-序列，被用於將表達盒直接整合進耶氏酵母基因組的Ura位點。
SEQ ID NO100-103分別對應於引物YL63、YL64、YL65和YL66，被用於定點誘變，以生成pY24-4。
SEQ ID NO104-107分別對應於引物YL81、YL82、YL83和YL84，被用於定點誘變，以生成pYZM5CH。
SEQ ID NO108和109分別對應於引物YL105和YL106，被用於定點誘變，以生成pYZM5CHPP。
SEQ ID NO110和111分別對應於引物YL119和YL120，被用於定點誘變，以生成pYZM5CHPPA。
SEQ ID NO112和113分別對應於引物YL121和YL122，被用於擴增解脂耶氏酵母URA3基因上遊440bp的5』-非編碼DNA序列。
SEQ ID NO115和116分別對應於引物YL114和YL115，被用於定點誘變，以生成pYZV5和pYZV5P。
SEQ ID NO117對應於適合在解脂耶氏酵母基因組內整合和表達Δ5去飽和酶基因的5.2kB DNA片段。
SEQ ID NO118和119分別對應於引物YL69和YL70，被用於定點誘變，以生成pY58BH。
SEQ ID NO120-123分別對應於引物YL77、YL78、YL79A和YL80A，被用於定點誘變，以生成pY54PC。
SEQ ID NO124對應於適合在解脂耶氏酵母基因組內整合和同步表達Δ6去飽和酶、PUFA延伸酶和Δ5去飽和酶基因的8.9kB DNA片段。
SEQ ID NO125-128分別對應於引物YL101、YL102、YL103和YL104，被用於定點誘變，以生成pYSD17SPC。
SEQ ID NO129對應於適合在解脂耶氏酵母基因組內整合和同步表達Δ6去飽和酶、PUFA延伸酶和Δ5去飽和酶和Δ17去飽和酶基因的10.3kB DNA片段。
SEQ ID NO130對應於最適合在耶氏酵母種內表達的基因的密碼子最優化翻譯起始位點。
發明詳述根據本發明，申請人分離了解脂耶氏酵母的Δ12去飽和酶編碼基因，並確定了其同一性。此外，本發明還提供了可改變諸如解脂耶氏酵母的含油酵母內的長鏈多不飽和脂肪酸(PUFA)含量的方法和組合物。
本發明涉及新型Δ12去飽和酶及其編碼基因，該基因可被用於操縱可生成有益健康的PUFAs的生化途徑。本發明發現了多種應用。本文所公開方法製備的PUFAs或其衍生物可作為膳食替代品或補充劑，尤其是嬰兒配方的補充劑，被應用於接受靜脈攝食的患者，或被用於預防或治療營養失調。可選地，純化PUFAs(或其衍生物)可被摻入烹調用油、脂肪或人造黃油配方中，使受者可通過正常渠道接受膳食補充所需量的PUFAs。PUFAs還可被摻入嬰兒配方、營養補充劑或其它食品中，可發現其作為抗炎症劑或降膽固醇劑的用途。任選地，所述組合物可被用作藥物(人用或獸用)。在該情況中，PUFAs通常被口服，但也可通過任意的可使其被成功吸收的途徑施用，例如腸胃外(例如皮下、肌內或靜脈內)、直腸、陰道或體表(例如作為皮膚用軟膏或洗液)。
人或動物對通過重組方法生成的PUFAs的補充可使該附加PUFAs及其代謝產物的水平升高。例如，用花生四烯酸(ARA)進行的治療不僅使ARA水平升高，還使諸如前列腺素的ARA下遊產物的水平升高。為了阻止、控制或克服這種機制，在個體內獲得預期的特定PUFAs水平，可採用複雜的調節機制將多種PUFAs組合或加入不同PUFAs結合物。
定義在本公開內容中，應用了大量術語和縮寫詞。相關定義如下所述。
「可讀框」縮寫為ORF。
「聚合酶鏈反應」縮寫為PCR。
「美國典型培養物保藏中心」縮寫為ATCC。
「多不飽和脂肪酸」縮寫為PUFA(s)。
術語「脂肪酸」指鏈長度變化範圍是大約C12到C22的長鏈脂肪族酸(鏈烷酸)(但已知也有更長或更短鏈長度的酸)。大部分鏈長度介於C16和C22之間。脂肪酸的結構由簡單的符號方法「X:Y」表示，其中X是特定脂肪酸中碳(C)原子的總數量，Y是雙鍵數量。
脂肪酸通常被劃分為飽和或不飽和兩種。術語「飽和脂肪酸」指那些碳主鏈之間無「雙鍵」的脂肪酸。與之相反，「不飽和脂肪酸」沿其碳主鏈則具有「雙鍵」(最常見的是順式構型)。「單不飽和脂肪酸」沿碳主鏈僅具有一個「雙鍵」(例如對棕櫚油酸(16:1)和油酸(18:1)而言通常位於第9和第10個碳原子之間)，而「多不飽和脂肪酸」(或「PUFAs」)沿碳主鏈具有至少2個雙鍵(例如，對亞油酸(18:2)而言是位於第9和第10個碳原子之間和第12和第13個碳原子之間；對α亞麻酸(18:3)而言則位於第9和第10個碳原子之間、第12和第13個碳原子之間和第15和第16個碳原子之間)。
「PUFAs」可被劃分為兩大類(取決於距脂肪酸碳鏈甲基末端最近處的第一個雙鍵位置(n))。因此，「ω-6脂肪酸」(ω-6或n-6)在距其分子ω(甲基)末端的第6個碳原子處具有第一個不飽和雙鍵，並另外具有共計2個或以上的特定雙鍵，後續的每一次不飽和均發生在接近該分子羧基末端的另外3個碳原子處。與之相反，「ω-3脂肪酸」(ω-3或n-3)在距其分子ω末端的第3個碳原子處具有第一個不飽和雙鍵，並另外具有共計3個或以上的雙鍵，後續的每一次不飽和均發生在接近該分子羧基末端的另外3個碳原子處。
就本公開內容的目的而言，ω-參考系被用於說明從ω碳開始記數(就該目的而言，將其編號為1)的碳數量、雙鍵數量和最接近該ω碳的雙鍵位置。該命名法如下表1中的「簡化符號」一欄所示。該表還概括了ω-3和ω-6脂肪酸的通用名、本說明書通篇將用到的縮寫詞和各化合物的化學名稱。
表1多不飽和脂肪酸目錄
術語「必需脂肪酸」指個體為了存活所必須攝取的特定PUFA，因為個體無法從頭合成該特定必需脂肪酸。亞油酸(18:2，ω-6)和亞麻酸(18:3，ω-3)是「必需脂肪酸」，因為人類不能合成，而必須通過飲食才能獲得它們。
術語「脂肪」指在25℃為固態並通常為飽和的脂類物質。
術語「油」指在25℃為液態並通常為不飽和的脂類物質。PUFAs被發現存在於某些藻類、含油酵母和絲狀真菌的油內。「微生物油」或「單細胞油」是由微生物在其存活期間自然生成的那些油。這種油可含有長鏈PUFAs。
術語「PUFA生物合成途徑酶」指與PUFA的生物合成相關的下述任意一種酶(和編碼該酶的基因)，包括Δ4去飽和酶、Δ5去飽和酶、Δ6去飽和酶、Δ12去飽和酶、Δ15去飽和酶、Δ17去飽和酶、Δ9去飽和酶和/或延伸酶。
術語「ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑」指一組在合適條件下表達時可編碼特定酶的基因，該酶可催化ω-3和ω-6脂肪酸二者或其中之一的生成。參與了ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑的基因典型地編碼下述所有酶或其中一部分Δ12去飽和酶、Δ6去飽和酶、延伸酶、Δ5去飽和酶、Δ17去飽和酶、Δ15去飽和酶、Δ9去飽和酶和Δ4去飽和酶。代表性的途徑如圖2所示，該圖顯示了油酸經過多種中間產物到DHA的轉化，說明了如何從共同的來源同時生成ω-3和ω-6脂肪酸。該途徑被自然地劃分為兩個部分，其中一個部分將生成ω-3脂肪酸，另一個部分則僅生成ω-6脂肪酸。僅生成ω-3脂肪酸的部分在本文被稱為ω-3脂肪酸生物合成途徑，而僅生成ω-6脂肪酸的部分則在本文被稱為ω-6脂肪酸生物合成途徑。
本文所用與ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑相關的術語「功能性」指該途徑中的所有基因或其中一部分可表達活性酶。應當理解的是，「ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑」或「功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑」並不意味著該節所列的所有基因均是必需的，因為許多脂肪酸產物僅需該途徑中部分基因的表達。
術語「去飽和酶」指可去飽和，即可將雙鍵導入一個或多個脂肪酸從而生成單或多不飽和脂肪酸的多肽。儘管本說明書通篇就特定脂肪酸而言採用了ω-參考系，但通過利用Δ系從所述底物羧基末端開始記數更易於說明去飽和酶的活性。本文尤其關注Δ12去飽和酶，該酶可在脂肪酸分子中從羧基末端開始編號為第12和第13的碳原子之間實現去飽和並催化從油酸到LA的轉化。與本公開內容相關的其它去飽和酶包括可催化從LA到ALA的轉化的Δ15去飽和酶；可在脂肪酸分子中從羧基末端開始編號為第17和第18的碳原子之間實現去飽和並且可以例如，催化從ARA到EPA和/或DGLA到ETA的轉化的Δ17去飽和酶；可催化從LA到GLA和/或ALA到STA的轉化的Δ6去飽和酶；可催化從DGLA到ARA和/或ETA到EPA的轉化的Δ5去飽和酶；可催化從DPA到DHA的轉化的Δ4去飽和酶；以及可催化從棕櫚酸到棕櫚油酸(16:1)和/或硬脂酸到油酸(18:1)的轉化的Δ9去飽和酶。
術語「延伸酶」指可延伸脂肪酸碳鏈生成比其作用的脂肪酸底物多2個碳的酸的多肽。該延伸過程發生在與脂肪酸合酶相關的多步機制中，其中的輔酶A為醯基載體(Lassner et al.，The Plant Cell8281-292(1996))。簡言之，用長鏈醯基輔酶A縮聚丙二醯輔酶A，產生CO2和β-酮醯基輔酶A(其中該醯基部分已延伸2個碳原子)。後續反應包括還原為β-羥醯基輔酶A、脫水為烯醯基輔酶A並第二次還原生成延伸的醯基輔酶A。延伸酶催化的反應實例是從GLA到DGLA的轉化、從STA到ETA的轉化和從EPA到DPA的轉化。延伸酶可相應具有不同特異性(例如，C16/18延伸酶優選C16底物，C18/20延伸酶優選C18底物，C20/22延伸酶則優選C20底物)。
術語「轉化效率」和「底物轉化百分率」指特定酶(例如去飽和酶或延伸酶)將底物轉化為產物的效率。該轉化效率是根據下列公式測定的([產物]/[底物+產物])*100，其中『產物』包括中間產物和在該途徑中由其衍生的所有產物。
術語「含油的」指那些傾向於儲備脂質形式的能量源的生物(Weete，InFungal Lipid Biochemistry，2nded.，Plenum，1980)。通常，含油微生物的細胞油或三醯甘油含量符合S形曲線，其中脂質濃度升高至對數期晚期或生長穩定期早期達到最大，並在穩定期晚期和死亡期期間逐漸降低(Yongmanitchai and Ward，Appl.Environ.Microbiol.57419-25(1991))。
術語「含油酵母」指那些被歸類為酵母並可累積佔其幹細胞重量至少25％的油的微生物。含油酵母的實例包括但不限於下列屬耶氏酵母屬、假絲酵母屬、紅酵母屬、紅冬孢酵母屬、隱球酵母屬、絲孢酵母屬和油脂酵母屬。
術語「可發酵碳底物」指可被微生物代謝並使其獲得能量的碳源。本發明的典型碳底物包括，但不限於單糖、寡糖、多糖、鏈烷、脂肪酸、脂肪酸的酯、甘油單酯、二氧化碳、甲醇、甲醛、甲酸和含碳的胺。
術語「密碼子最優化」與用於轉化多種宿主的核酸分子的基因或編碼區有關時，指對該核酸分子的基因或編碼區內的密碼子進行的改變可反應宿主生物的典型密碼子選擇，而不改變由該DNA編碼的多肽。
本文所用的「分離核酸片段」指單或雙鏈形式並任選地地含有合成、非天然或改變的核苷酸鹼基的RNA或DNA聚合體。DNA聚合體形式的分離核酸片段可包括cDNA、基因組DNA或合成DNA的一個或多個片段。
當單鏈形式的核酸分子可在合適的溫度和溶液離子強度條件下退火至另一個核酸分子時，該核酸分子與所述的另一個核酸分子是「可雜交的」。雜交和洗滌條件眾所周知，實例參見由Cold Spring HarborLaboratoryCold Spring Harbor，NY(1989)出版Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.編輯的第二版Molecular CloningALaboratory Manual，尤其是其中的第11章和表11.1(完整引入本文作為參考)。溫度和離子強度的條件決定了雜交的「嚴格性」。可調節嚴格條件，以篩選中度相似片段(諸如遠緣相關生物來源的同源序列)，乃至高度相似片段(諸如可複製近緣相關生物來源的功能酶的基因)。雜交後洗滌決定了嚴格條件。一組優選條件採用了系列洗滌步驟，首先於室溫用6X SSC、0.5％SDS洗滌15分鐘，接著於45℃用2X SSC、0.5％SDS重複洗滌30分鐘，再於50℃用0.2X SSC、0.5％SDS洗滌30分鐘並重複2次。更優選的一組嚴格條件採用了較高溫度，其中的洗滌步驟除了最後兩次用0.2X SSC、0.5％SDS洗滌30分鐘的溫度提高為60℃外，其它條件與上述一致。另一種優選的高度嚴格條件所採用的最後兩次洗滌是於65℃在0.1X SSC、0.1％SDS中進行。另一組嚴格條件包括例如，於65℃在0.1X SSC、0.1％SDS中進行雜交，和相繼在2X SSC、0.1％SDS和0.1X SSC、0.1％SDS中進行洗滌。
雜交要求兩個核酸含有互補序列，但根據雜交的嚴格性，仍然可能出現鹼基之間的錯配。使核酸雜交所用的合適嚴格性取決於雜交核酸的長度和互補程度，這些變量是本領域所熟知的。兩個核苷酸序列之間的相似性或同源性程度越高，含有這些序列的核酸雜合體的Tm值越高。核酸雜交的相對穩定性(對應於較高Tm)按照下列次序降低RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。業已推導出計算長度大於100個核苷酸的雜合體的Tm的方程式(參見Sambrook et al.，同上，9.50-9.51)。錯配位置對較短核酸，即寡核苷酸的雜交而言更為重要，且該寡核苷酸的長度決定了其特異性(參見Sambrook et al.，同上，11.7-11.8)。在一種實施方案中，可雜交核酸的長度至少為大約10個核苷酸。可雜交核酸的優選最小長度是至少大約15個核苷酸；更優選的是至少大約20個核苷酸；最優選長度是至少大約30個核苷酸。此外，技術人員應認識到的是，可根據諸如探針長度等因素的需要調節溫度和洗滌液的鹽濃度。
胺基酸或核苷酸序列的「主要部分」指包括了多肽的特定胺基酸序列或基因的特定核苷酸序列的部分，通過本領域技術人員對這些特定序列的人工評估，或者通過利用諸如BLAST的算法進行的計算機自動序列比對和鑑定，便足以根據這些特定序列推斷上述多肽或基因的同一性(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.，et al.，J.Mol.Biol.215403-410(1993))。通常，為了推定多肽或核酸序列與已知蛋白或基因的同源性，序列必須包括10個或以上的相鄰胺基酸或30個或以上的核苷酸。此外，就核苷酸序列而言，包括20-30個相鄰核苷酸的基因特異性寡核苷酸探針可被應用在基因鑑定(例如DNA雜交)和分離(例如細菌菌落或噬斑的原位雜交)的序列依賴性方法中。還可將具有12-15個鹼基的短寡核苷酸作為擴增引物應用於PCR，以獲得包括該引物的特定核酸片段。相應地，核苷酸序列的「主要部分」包括特定序列，根據該特定序列足以特異性地鑑定和/或分離包括該序列的核酸片段。本說明書描述了編碼特定酵母蛋白的完整胺基酸和核苷酸序列。了解本文所報導序列優勢的技術人員可將全部公開序列或其主要部分應用在本領域技術人員已知的許多方面。本發明相應包括附帶序列列表所提供的完整序列，以及上述序列的主要部分。
術語「互補」被用於描述能夠彼此雜交的核苷酸鹼基之間的關係。例如，就DNA而言，腺苷與胸腺嘧啶互補，胞嘧啶與鳥嘌呤互補。本發明還相應包括與附帶序列列表所報導的完整序列互補的分離核酸片段，以及那些基本相似的核酸序列。
正如本領域所知，術語「同一性百分率」指兩個或以上的多肽序列或兩個或以上的多核苷酸序列之間的關係，是通過對這些序列進行比較而得以確定的。在本領域中，「同一性」還指多肽或多核苷酸序列之間的序列相關性程度，在該情況中，可根據這些序列之間的匹配情況得以確定。通過已知方法，包括但不限於1.)ComputationalMolecular Biology(Lesk，A.M.，Ed.)Oxford UniversityNY(1988)；2.)BiocomputingInformatics and Genome Projects(Smith，D.W.，Ed.)AcademicNY(1993)；3.)Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，Eds.)HumanaNJ(1994)；4.)Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinie，G.，Ed.)Academic(1987)；以及5.)Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.and Devereux，J.，Eds.)StocktonNY(1991)中所描述的那些方法，可快速計算「同一性」和「相似性」。確定同一性的優選方法被設計用於提供受檢序列之間的最佳匹配。確定同一性和相似性的方法被編成了公用電腦程式。序列比對和同一性百分率計算可利用LASERGENE生物信息處理系統(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的Megalign程序進行。序列多重比對是利用Clustal比對法(Higgins andSharp，CABIOS.5151-153(1989))並採用默認參數(GAPPENALTY＝10，GAP LENGTH PENALTY＝10)進行。利用Clustal法進行兩兩比對的默認參數是KTYPLE 1、GAP PENALTY＝3、WINDOW＝5和DIAGONALS SAVED＝5。
合適的核酸片段(本發明的分離多核苷酸)編碼與本文所報導的胺基酸序列具有至少大約70％同一性，優選至少大約75％同一性，更優選至少大約80％同一性的多肽。優選的核酸片段編碼與本文所報導的胺基酸序列具有大約85％同一性的胺基酸序列。更優選的核酸片段編碼與本文所報導的胺基酸序列具有至少大約90％同一性的胺基酸序列。最優選的核酸片段則編碼與本文所報導的胺基酸序列具有至少大約95％同一性的胺基酸序列。合適的核酸片段不僅具有上述同源性，還典型地編碼具有至少50個胺基酸的多肽，該多肽優選地具有至少100個胺基酸，更優選地具有至少150個胺基酸，還要更優選地具有至少200個胺基酸，最優選地具有至少250個胺基酸。
「密碼子簡併」指遺傳密碼允許核苷酸序列變異而不影響被編碼多肽的胺基酸序列的特性。技術人員熟知特定宿主細胞在選擇核苷酸密碼子以確定特定胺基酸方面所表現的「密碼子偏倚性」。因此，當合成一種基因，使其提高在宿主細胞內的表達時，理想的方法是對該基因進行設計，使其密碼子選擇頻率接近該宿主細胞的優選密碼子選擇頻率。
與DNA序列相關的「化學合成的」指在體外裝配組分核苷酸。DNA的人工化學合成可通過已完善的方法實現；或者可以利用許多商業可提供機器進行自動化學合成。「合成基因」可從利用本領域技術人員已知方法化學合成的寡核苷酸構件裝配而得。將這些構件連接並使它們退火形成可繼續通過酶促方法被裝配並構建完整基因的基因片段。可以在優化核苷酸序列以反映宿主細胞密碼子偏倚性的基礎上，對所述基因進行相應調整，使其實現最佳的基因表達。技術人員知道當密碼子選擇偏向宿主所偏好的那些密碼子時基因表達成功的可能性。可根據對宿主細胞來源的基因的調查確定優選密碼子，其中的序列信息是已知的。
「基因」指可表達特定蛋白的核酸片段，包括在編碼序列之前(5』非編碼序列)和之後(3』非編碼序列)的調節序列。「天然基因」指被發現存在於自然界中並具有自身調節序列的基因。「嵌合基因」指並非天然基因且包括被發現無法同時存在於自然界中的調節和編碼序列的所有基因。嵌合基因可相應包括不同來源的調節序列和編碼序列，或來源相同但排列方式不同於在自然界中所發現方式的調節序列和編碼序列。「內源基因」指位於生物基因組內的自然位置上的天然基因。「外源」基因指通常不存在於宿主生物內，而是通過基因轉移被導入該宿主生物內的基因。外源基因可包括被插入非天然生物內的天然基因，或嵌合基因。「轉基因」指通過轉化方法已被導入基因組內的基因。「密碼子最優化基因」指所具有的密碼子選擇頻率經過設計後模擬了宿主細胞的優選密碼子選擇頻率的基因。
「編碼序列」指編碼用於特定胺基酸序列的DNA序列。「合適的調節序列」指位於編碼序列上遊(5』非編碼序列)、內部或下遊(3』非編碼序列)並影響關聯編碼序列的轉錄、RNA加工或穩定性或翻譯的核苷酸序列。調節序列可包括啟動子、翻譯前導序列、內含子、多腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應子結合位點和莖-環結構。
「啟動子」指能夠控制編碼序列或功能RNA的表達的DNA序列。編碼序列通常位於啟動子序列的3』端。啟動子可能全部來源於天然基因，或者由來源於自然界存在的不同啟動子的不同元件構成，或者甚至包括合成的DNA片段。本領域技術人員應理解的是，不同啟動子可引導基因在處於不同發育期或對不同環境或生理條件反應的不同組織或細胞類型內的表達。可使基因在大部分細胞類型中的大部分時間內表達的啟動子通常被稱為「組成型啟動子」。應進一步認同的是，由於大多數情況是調節序列的準確邊界尚未被完整定義，因此不同長度的DNA片段可能具有一致的啟動子活性。
術語「3』非編碼序列」或「轉錄終止子」指位於編碼序列下遊的DNA序列。該術語包括多腺苷酸化識別序列及其它編碼特定調節信號的序列，該調節信號能夠影響mRNA加工或基因表達。多腺苷酸化信號的特徵通常在於可影響mRNA前體3』末端添加聚腺苷酸束。該3』區域可影響關聯編碼序列的轉錄、RNA加工或穩定性或翻譯。
「RNA轉錄物」指DNA序列在RNA聚合酶催化下轉錄的產物。當RNA轉錄物是所述DNA序列的完全互補拷貝時，它被稱為初級轉錄物，或者當其可能是所述初級轉錄物的轉錄後加工衍生的RNA序列時，則被稱為成熟RNA。「信使RNA」或「mRNA」指無內含子並且可被細胞翻譯成蛋白的RNA。「cDNA」指與mRNA互補和由其衍生的雙鏈DNA。「有義」RNA指包括上述mRNA並因此可被細胞翻譯成蛋白的RNA轉錄物。「反義RNA」指與靶初級轉錄物或mRNA的全部或一部分互補並可阻斷靶基因表達的RNA轉錄物(U.S.5,107,065；WO99/28508)。反義RNA可能與特定基因轉錄物的任意部分，即5』非編碼序列、3』非編碼序列或編碼序列均具有互補性。「功能RNA」指反義RNA、核糖酶RNA或其它不被翻譯但仍然影響細胞過程的RNA。
術語「可操作連接的」指核酸序列與單個核酸片段的連接使二者之一的功能受另一方的影響。例如，當啟動子能夠影響編碼序列的表達時，該啟動子與該編碼序列是可操作連接的(即該編碼序列受該啟動子的轉錄控制)。編碼序列可與調節序列按有義或反義方向可操作連接。
本文所用術語「表達」指來源於本發明所述核酸片段的有義(mRNA)或反義RNA的轉錄和穩定累積。表達還可指mRNA翻譯成多肽。
「成熟」蛋白指經過翻譯後加工的多肽；即已除去初級翻譯產物中存在的所有前肽後獲得的產物。「前體」蛋白指mRNA的初級翻譯產物；即還具有前肽的產物。前肽可能是(但不限於)胞內定位信號。
「轉化」指將核酸分子轉移進宿主生物內，獲得在基因方面穩定的遺傳。該核酸分子可能是質粒，例如自主複製質粒；或者可以整合進宿主生物的基因組內。含有該轉化核酸片段的宿主生物被稱為「轉基因」或「重組」或「轉化」生物。
術語「質粒」、「載體」和「盒」指通常攜帶了不屬於細胞中樞代謝部分的基因，並且通常為環狀雙鏈DNA片段形式的額外染色體元件。這種元件可能是任意來源的自主複製序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列、線型或環狀的單或雙鏈DNA或RNA，其中的許多核苷酸序列已被加入或重組進特定的獨特結構中，該獨特結構能夠將用於特定基因產物的啟動子片段和DNA序列連同合適的3』未翻譯序列一起導入細胞。「轉化盒」指除了含有外源基因之外還含有有利於轉化特定宿主細胞的其它元件的特異性載體。「表達盒」指除了含有外源基因之外還含有可增強該基因在外源宿主內的表達的其它元件的特異性載體。
術語「改變的生物學活性」指與核苷酸序列編碼的蛋白有關並可通過分析方法測定的活性，且該活性高於或低於天然序列的相關活性。「增強的生物學活性」指經過改變後比天然序列的相關活性高的活性。「降低的生物學活性」指經過改變後比天然序列的相關活性低的活性。
術語「同源重組」指兩個DNA分子之間的DNA片段交換(交換期間)。被交換片段的兩側是所述兩個DNA分子的一致核苷酸序列位點(即「同源區」)。術語「同源區」指核酸片段上的幾段核苷酸序列，這些核苷酸序列彼此同源並且參與了同源重組。有效的同源重組將發生在那些長度至少為大約10bp，優選長度至少為大約50bp的同源區域上。被計劃用於重組的片段典型地含有至少兩個需要定向基因破壞或置換的同源區域。
術語「序列分析軟體」指有助於分析核苷酸或胺基酸序列的所有計算機算法或軟體程序。「序列分析軟體」可通過商業渠道或自主研發獲得。典型的序列分析軟體包括但不限於1.)GCG系列程序(Wisconsin Package Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2.)BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215403-410(1990))；3.)DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison，WI)；4.)Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)；以及5.)編入Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992，111-20.Editor(s)Suhai，Sandor.PlenumNewYork，NY)。應當理解的是，在本申請的上下文中，如無另外指明，序列分析軟體均被用於分析，且分析結果將基於上述程序的「默認值」。本文所用的「默認值」指軟體最初在首次初始化時便加載的所有數值或參數組。
本文所用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域熟知的，參見由Cold Spring Harbor LaboratoryCold Spring Harbor，NY(1989)出版Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.編輯的第2版MolecularCloningA Laboratory Manual；由Cold Spring Harbor LaboratoryCold Spring Harbor，NY(1984)出版Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.編輯的Experiments with Gene Fusions；以及由GreenePublishing Assoc.和Wiley-Interscience(1987)出版Ausubel，F.M.等人編輯的Current Protocols in Molecular Biology。
脂肪酸的微生物生物合成含油微生物內的脂質累積通常是在響應培養基的總體碳氮比時被引發的(圖1)。當細胞耗盡可利用的氮源時(例如當碳氮比大於大約40時)，細胞腺苷酸(AMP)的耗盡導致線粒體中的AMP-依賴性異檸檬酸脫氫酶活性終止和檸檬酸的累積，檸檬酸被轉運進細胞溶膠中，並隨後被ATP-檸檬酸裂解酶裂解生成乙醯輔酶A。乙醯輔酶A是重新生物合成脂肪酸所需的主要構件。所有可被有效代謝生成乙醯輔酶A的化合物均可充當脂肪酸的前體，但該類型反應中的主要碳源是葡萄糖(圖1)。葡萄糖通過糖酵解被轉化為丙酮酸，丙酮酸則接著被轉運進線粒體中，並在此被丙酮酸脫氫酶(「PD」)轉化為乙醯輔酶A。由於乙醯輔酶A不能直接穿過線粒體膜被轉運進胞質中，乙醯輔酶A的兩個碳與草醯乙酸縮聚生成了檸檬酸(由檸檬酸合酶催化)。檸檬酸被直接轉運進胞質中，並在此被ATP-檸檬酸裂解酶裂解，再次生成乙醯輔酶A和草醯乙酸。該草醯乙酸再次進入三羧酸循環，通過轉化成為蘋果酸。
丙二醯輔酶A的合成是脂肪酸生物合成的第一個關鍵步驟，發生在胞質內。丙二醯輔酶A是通過乙醯輔酶A羧化酶(「ACC」)對乙醯輔酶A的羧化而生成的。脂肪酸合成由多酶脂肪酸合酶複合物(「FAS」)催化，並通過8個雙碳片段(來源於乙醯輔酶A的乙醯基)的縮聚，形成16-碳飽和脂肪酸，即棕櫚酸。更具體而言，FAS催化了一系列的7個反應，包括下述反應(Smith，S.FASEB J，8(15)1248-59(1994))1.乙醯輔酶A和丙二醯輔酶A被轉移至FAS的醯基載體肽(ACP)。該醯基接著被轉移至丙二醯基，形成β-酮丁醯-ACP並釋放CO2。
2.β-酮丁醯-ACP經過還原(藉助於β-酮醯還原酶)和脫水(藉助於β-羥醯脫水酶)，形成反-單不飽和脂肪醯基。
3.雙鍵被NADPH還原，生成比初始脂肪醯基多2個碳的飽和脂肪醯基。丁醯基與新的丙二醯基縮聚並重複延長過程的能力被再生。
4.當脂肪醯基為16個碳長時，被硫酯酶活性水解後可釋放游離棕櫚酸。
棕櫚酸(16:0)是較長鏈的飽和和不飽和脂肪酸(例如硬脂酸(18:0)、棕櫚油酸(16:1)和油酸(18:1))通過內質網膜中存在的延伸酶和去飽和酶作用的前體。棕櫚酸和硬脂酸在Δ9去飽和酶的作用下分別轉化為它們的不飽和衍生物，即棕櫚油酸(16:1)和油酸(18:1)。
三醯甘油(脂肪酸的主要貯存單位)是通過下述步驟形成的，即2個分子的乙醯輔酶A與甘油-3-磷酸酯化生成1，2-二醯甘油磷酸(通常被鑑定為磷脂酸)(圖1)。該磷酸接著被磷脂酸磷酸酶除去，生成1，2-二醯甘油。三醯甘油是在例如二醯甘油-醯基轉移酶的作用下加入第三個脂肪酸後形成的。
ω脂肪酸的生物合成簡言之，將LA轉化為GLA、DGLA和ARA(ω-6途徑)以及將ALA轉化為STA、ETA、EPA、DPA和DHA(ω-3途徑)的代謝過程包括通過加入雙碳單位使碳鏈延長和通過加入雙鍵使所述分子去飽和(圖2)。這需要一系列存在於內質網膜內的特定去飽和酶和延伸酶的參與。
ω-6脂肪酸油酸在Δ12去飽和酶作用下轉化為第一種ω-6脂肪酸LA(18:2)。後續ω-6脂肪酸的生成步驟如下1.)LA在Δ6去飽和酶活性作用下轉化為GLA；2.)GLA在延伸酶作用下轉化為DGLA；和3.)DGLA在Δ5去飽和酶作用下轉化為ARA。
ω-3脂肪酸亞油酸(LA)在Δ15去飽和酶作用下轉化為第一種ω-3脂肪酸ALA。後續ω-3脂肪酸的系列生成步驟與上述ω-6脂肪酸類似。具體而言1.)ALA在Δ6去飽和酶活性作用下轉化為STA；2.)STA在延伸酶活性作用下轉化為ETA；以及3.)ETA在Δ5去飽和酶活性作用下轉化為EPA。可選地，ETA和EPA可以是DGLA和ARA在Δ17去飽和酶活性作用下分別生成的。EPA可在延伸酶和Δ4去飽和酶活性作用下進一步轉化為DHA。
參與ω脂肪酸生成的基因包括藻類、細菌、黴菌和酵母在內的許多微生物可以在普通的細胞代謝過程中合成PUFAs和ω脂肪酸。被著重深入研究的是真菌，包括Schizochytrium aggregatm、破囊壺菌屬和高山被孢黴屬的種。此外，還有許多腰鞭毛蟲(甲藻綱)可自然生成高濃度PUFAs。同樣，業已通過遺傳方法鑑定了多種參與油生成的基因，在這些基因中，有若干個基因的DNA序列已公開(非限制性實例如下表2所示)
表2參與PUFA生成的若干公開基因
此外，專利文獻還提供了其它許多參與PUFA生成的基因的DNA序列(和/或與上述若干基因及它們的分離方法相關的細節)。參見例如，U.S.5,968,809(Δ6去飽和酶)；U.S.5,972,664和U.S.6,075,183(Δ5去飽和酶)；WO 91/13972和U.S.5,057,419(Δ9去飽和酶)；WO 93/11245(Δ15去飽和酶)；U.S.2003/0196217 A1(Δ17去飽和酶)；WO 02/090493(Δ4去飽和酶)；以及WO 00/12720和U.S.2002/0139974 A1(延伸酶)。這些專利和申請均被完整引入本文作為參考。
本文尤其關注的是Δ12去飽和酶，更具體而言，是適合在含油酵母(例如解脂耶氏酵母)內表達的Δ12去飽和酶。業已公開了多種編碼真菌Δ12脂肪酸去飽和酶的序列，可被用於在含油解脂耶氏酵母內的異源表達(例如GenBank編號AAG36933、AF110509、AAL13300、AF417244、AF161219(同上))。此外，例如，WO 94/11516、U.S.5,443,974和WO 03/099216公開的大豆、甘藍型油菜、擬南芥、蓖麻、玉米、粗糙脈孢菌和灰葡萄孢黴的Δ12脂肪酸去飽和酶。
許多因素影響對具有Δ12去飽和酶活性並可在宿主細胞內表達生成PUFAs(任選地與其它去飽和酶和延伸酶一起作用)的特異性多肽的選擇。根據宿主細胞、底物有效性和預期終產物，有若干種多肽可以被關注；但對選擇具有去飽和酶活性的特異性多肽而言，需考慮的因素則包括該多肽的底物特異性、該多肽或其組成是否限速酶、去飽和酶是否是合成目標多不飽和脂肪酸所必需的，和/或該多肽所需的輔因子。被表達多肽優選地具有可與其所在宿主細胞內的生化環境相容的參數。例如，該多肽在宿主細胞內可能必須與其它酶一起競爭底物。因此，在確定特定多肽是否適用於改變特定宿主細胞內的PUFA產量時，應考慮分析該多肽的KM和特異性活性。應用於特定宿主細胞內的多肽是可在指定宿主細胞內存在的生化條件下發揮作用的多肽，但在其它方面，該多肽可以是具有Δ12去飽和酶活性並能夠改變目標脂肪酸(即油酸)(產量)的任意多肽。因此，其序列可能是任意來源，例如分離自天然源(來源於細菌、藻類、真菌、植物、動物等)，或通過半合成途徑或從頭合成的方式生成。
對解脂耶氏酵母Δ12去飽和酶的序列鑑定儘管業已公開了多種編碼真菌Δ12脂肪酸去飽和酶(同上)的序列，但與異源(或「外源」)酶相比，仍然優選天然酶的表達，因為1.)天然酶最適合與細胞內其它酶和蛋白相互作用；且2.)異源基因不太可能與宿主生物共有相同的優選密碼子。此外，已知天然基因序列時的優勢在於，易於通過定向破壞將內源基因破壞。
就天然Δ12脂肪酸去飽和酶基因的破壞而言，可能有助於改造在某些實施方案中無法生成PUFAs的含油酵母。需要該功能性缺乏的工業應用包括生產高值可可油替代品、氧化性穩定的油和由18:1衍生的特殊脂肪酸(例如羥基和環氧基脂肪酸)。可選地，通過用合適的基因(例如Δ6去飽和酶、延伸酶、Δ5去飽和酶、Δ4去飽和酶)轉化缺乏Δ12脂肪酸去飽和酶活性的含油酵母，並以ALA作為底物飼養該生物，便可將其用於生產ALA的「純」ω-3衍生物(例如STA、ETA、EPA、DPA、DHA)；ω-6脂肪酸在這些條件下將不能被合成(參見圖2)。
因此，申請人試圖從解脂耶氏酵母中分離Δ12脂肪酸去飽和酶。利用Clustal比對法對Δ12去飽和酶核苷酸鹼基和推導胺基酸序列與公開資料庫進行的比較表明，比對長度為419個胺基酸時，最相似的已知序列與本文報導的Δ12去飽和酶的胺基酸序列(SEQ ID NO24)具有大約53％的同一性(Thompson et al.，Nucleic Acids Res.224673-4680(1994))。更優選的胺基酸片段與本文公開序列具有至少大約70％-80％的同一性，尤其優選的是具有85％-90％同一性的那些序列，最優選的是具有大約95％同一性的那些序列。同樣，與本文所述ORF對應的優選Δ12去飽和酶編碼核酸序列是編碼活性蛋白並與本文所報導的Δ12去飽和酶核酸序列具有至少大約70％-80％同一性的那些序列，尤其優選的是具有85％-90％同一性的那些序列，最優選的是具有大約95％同一性的那些序列。
同源物的分離本發明的Δ12去飽和酶核酸片段可被用於分離編碼來源於上述或其它細菌、藻類、真菌或植物種類的同源蛋白的基因。利用序列依賴性方案分離同源基因是本領域熟知的。序列依賴性方案的實例包括，但不限於1.)核酸雜交法；2.)可通過核酸擴增技術的多種應用進行說明的DNA和RNA擴增法[例如聚合酶鏈反應(PCR)，Mullis et al，U.S.Patent 4,683,202；連接酶鏈反應(LCR)，Tabor，S.et al.，Proc.Acad.Sci.USA 821074(1985)；或鏈置換擴增(SDA)，Walker，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89392(1992)]，以及3.)文庫構建和互補篩選法。
例如，通過利用本領域技術人員熟知的方法，並以本發明核酸片段或其部分作為DNA雜交探針篩選任意指定酵母或真菌來源的文庫(其中優選可生成LA和/或LA-衍生物的酵母或真菌)，便可直接分離編碼與本文所述去飽和酶類似的蛋白或多肽的基因。基於本發明核酸序列的特異性寡核苷酸探針可通過本領域已知的方法設計併合成(Maniatis，同上)。此外，通過採用本領域技術人員已知的方法(例如隨機引物DNA標記、切口平移或末端標記技術)，可將該完整序列直接用於合成DNA探針，或者是通過利用有效的體外轉錄系統將其用於合成RNA探針。此外，可設計特異性引物並將其用於擴增本發明所述序列的一部分(或其全長)。所獲擴增產物可在擴增反應期間被直接標記，或是在擴增反應後被標記，並被用作探針，以在合適的嚴格條件下分離全長DNA片段。
在PCR型擴增技術中，引物典型地具有不同序列，並且彼此不互補。根據預期的試驗條件，應對引物序列進行設計，以有效並可靠地複製靶核酸。PCR引物的設計方法是本領域技術人員常用並熟知的(Thein和Wallace在由IRLHerndon，VA出版K.E.Davis編輯(1986)的Human Genetic DiseasesA Practical Approach第33-50頁發表的「The use of oligonucleotide as specific hybridization probes inthe Diagnosis of Genetic Disorders」；以及Rychlik，W.在由HumaniaTotowa，NJ出版White，B.A.編輯的Methods in Molecular Biology(1993)Vol.15第31-39頁發表的PCR ProtocolsCurrent Methods andApplications。
本發明所述序列的兩個短片段通常可被應用在聚合酶鏈反應方案中，以擴增編碼DNA或RNA來源的同源基因的較長核酸片段。聚合酶鏈反應還可基於克隆核酸片段的文庫進行，其中一種引物的序列來源於本發明所述的核酸片段，另一種引物的序列則利用編碼微生物基因的mRNA前體的3』末端存在的聚腺苷酸束。
可選地，第二種引物序列可基於克隆載體來源的序列。例如，技術人員可遵循RACE流程(Frohman et al.，PNAS USA 858998(1988))，通過PCR擴增介於轉錄物中的一個位點與3』或5』末端之間的特定區域的拷貝，以生成cDNAs。由本發明所述序列可設計出以3』和5』方向定向的引物。可利用商業可提供的3』RACE或5』RACE系統(BRL，Gaithersburg，MD)分離特定3』或5』cDNA片段(Ohara etal.，PNAS USA 865673(1989)；Loh et al.，Science 243217(1989))。
在另一些實施方案中，本發明所述的去飽和酶序列可作為雜交試劑被用於鑑定同源物。核酸雜交試驗的基本組成包括探針、疑似含有被關注基因或基因片段的樣品以及特定雜交方法。本發明的探針典型地是與待檢核酸序列互補的單鏈核酸序列。探針與待檢核酸序列是「可雜交的」。探針長度的變化範圍是5個到數萬個鹼基，這將取決於待進行的特定實驗。典型的合適探針長度為大約15到大約30個鹼基。該探針分子只需要一部分與待檢核酸序列互補。此外，探針與靶序列之間無需完全互補。不完全互補分子之間雜交的結果是雜交區內某一部分的鹼基與正確互補鹼基不配對。
業已明確定義了雜交方法。探針和樣品典型地必須在允許核酸雜交的條件下混合。這包括使探針和樣品在合適的溫度和合適濃度的無機或有機鹽存在條件下接觸。探針和樣品核酸必須接觸足夠長的時間，以使該探針和樣品核酸之間所有可能的雜交均可發生。混合物中的探針或靶的濃度決定發生雜交所需的時間。探針或靶的濃度越高，所需的雜交溫育時間越短。可任選地加入離液劑。離液劑通過抑制核酸酶活性使核酸穩定。此外，離液劑可使短寡核苷酸探針在室溫下實現靈敏和嚴格雜交(Van Ness and Chen，Nucl.Acids Res.195143-5151(1991))。合適的離液劑包括氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸鈉、四氯乙酸鋰、高氯酸鈉、四氯乙酸銣、碘化鉀和三氟乙酸銫等。離液劑的終濃度典型地為大約3M。如果需要，可將甲醯胺加入雜交混合物中，其濃度典型地為30-50％(v/v)。
可應用多種雜交溶液。這些溶液典型地包括大約20-60％體積，優選30％體積的極性有機溶劑。常用雜交溶液應用了大約30-50％v/v甲醯胺，大約0.15-1M氯化鈉、大約0.05-0.1M緩衝劑(例如檸檬酸鈉、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH範圍大約6-9))、大約0.05-0.2％去汙劑(例如十二烷基硫酸鈉)，或0.5-20mM EDTA、FICOLL(Pharmacia Inc.)(大約300-500kdal)、聚乙烯吡咯烷酮(大約250-500kdal)和血清白蛋白。典型雜交溶液還可包括大約0.1-5mg/mL的未標記載體核酸、片段化核DNA(例如小牛胸腺或鮭精DNA或酵母RNA)，並任選地含有重量體積比約為0.5-2％的甘氨酸。還可包括其它添加劑，諸如體積排阻劑，包括多種極性水溶性或可膨脹劑(例如聚乙二醇)、陰離子聚合物(例如聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯)和陰離子糖聚合物(例如葡聚糖硫酸酯)。
核酸雜交可適用於多種試驗形式。其中一種最適形式是夾心試驗。夾心試驗尤其適用於非變性條件下的雜交。夾心型試驗的主要組成是固相支持物。該固相支持物通過吸附或共價偶聯方式固定了未被標記並與所述序列的一部分互補的核酸探針。
本發明所述核苷酸和推導胺基酸序列的可用性有利於對DNA表達文庫的免疫學篩選。可以合成代表本發明所述胺基酸序列的若干部分的合成肽。這些肽可被用於使動物免疫，以生成對包括該胺基酸序列的肽或蛋白具有特異性的多克隆或單克隆抗體。接著，這些抗體便可被用於篩選DNA表達文庫，進而分離被關注的全長DNA克隆(Lerner，R.A.Adv.Immunol.361(1984)；Maniatis，同上)。
用於改良異源表達的基因最優化有多種技術可被用於改良Δ12去飽和酶在可選宿主內的表達。其中的兩種技術包括基因的密碼子最優化技術和誘變技術。
密碼子最優化在某些實施方案中，可能需要改變Δ12去飽和酶多肽的一部分編碼密碼子，例如，以提高該多肽的編碼基因在可選宿主內的表達(例如除解脂耶氏酵母外的其它含油酵母)。
通常，通過在被關注的特定宿主種類內檢驗蛋白質(優選表達量最大的那些蛋白質)的密碼子選擇，並確定哪一個密碼子被選用的頻率最高，便可確定宿主優選密碼子。接著，可全部或部分地利用該宿主種類優選的密碼子合成具有去飽和酶活性的目標多肽的編碼序列。還可合成該DNA的全部(或其部分)以除去將存在於所述轉錄mRNA中的所有失穩序列或二級結構的若干區域。還可合成該DNA的全部(或其部分)以將其鹼基組成改變為指定宿主細胞所更優選的鹼基組成。
誘變有文獻明確定義了合成序列和將序列集合在一起的方法。例如，可應用體外誘變和選擇、定點誘變、易錯PCR(Melnikov et al.，NucleicAcids Research，27(4)1056-1062(February 15，1999))、「基因改組」(U.S.5,605,793；U.S.5,811,238；U.S.5,830,721；和U.S.5,837,458)或其它方法使天然存在的去飽和酶基因，諸如本文所述Δ12去飽和酶實現突變。這將可能生成具有體內去飽和酶活性及其在宿主細胞內發揮作用所需的更理想物理和動力學參數(例如，預期PUFA的半衰期較長或生成速率較高)的多肽。
如需要，可通過常規誘變、所獲突變多肽的表達和對其活性的測定，確定去飽和酶多肽中對酶活性起重要作用的區域。突變可包括缺失、插入和點突變，或它們的組合。典型的功能性分析首先是缺失誘變，以確定發揮功能所必需蛋白的N-和C-末端界限，接著進行內部缺失、插入或點突變，以進一步確定發揮功能所必需的區域。還可採用諸如盒誘變或全合成的其它技術。缺失誘變是通過例如，利用外切核酸酶序貫除去5』或3』編碼區而實現的。該技術可應用試劑盒。缺失誘變後，可通過將含有起始或終止密碼子的寡核苷酸與上述5』或3』缺失後分別產生的的缺失編碼區連接，使該編碼區完整。可選地，可通過包括定點誘變、誘變PCR在內的多種方法將編碼起始或終止密碼子的寡核苷酸插入所述編碼區內，或者通過連接反應將其與在既有限制位點上消化的DNA連接。通過多種方法，包括利用DNA內的既有限制位點、通過利用誘變引物進行的定點誘變或誘變PCR，也可同樣實現內部缺失。插入是通過諸如接頭分區誘變、定點誘變或誘變PCR的方法實現的。點突變是通過諸如定點誘變或誘變PCR的技術實現的。
還可採用化學誘變以鑑定去飽和酶多肽中對活性起重要作用的區域。突變構建體被表達後，測定相應突變蛋白發揮去飽和酶功能的能力。這種結構功能分析可確定哪一個區域可能被缺失、哪一個區域允許插入以及哪一個點突變可使突變蛋白以與天然去飽和酶基本相同的方式發揮功能。所有這樣的突變蛋白及其來源於本文所述去飽和酶的編碼核苷酸序列均屬於本發明範疇。
因此，本發明包括附帶序列列表所公開的完整Δ12去飽和酶序列、該完整序列的互補序列、該序列的主要部分、由其衍生的密碼子最優化去飽和酶，以及與其基本上同源的那些序列。
ω-3和/或ω-6脂肪酸的微生物生產與從諸如魚或植物的天然來源純化的方法相比，微生物生產ω-3和/或ω-6脂肪酸具有若干優勢。例如1.)與高等生物的油組成相比，已知許多微生物的油組成非常簡單，因而更易於純化目標組分；2.)微生物生產不受諸如天氣和食物供給等外部變量導致的波動影響；3.)微生物生成的油基本上不存在環境汙染物造成的汙染；4.)微生物可提供可能具有特殊用途的特定形式的PUFAs；且5.)微生物油生產可通過控制培養條件，尤其是通過提供微生物表達酶所需的特定底物，或者是通過加入化合物或進行遺傳改造方法抑制不需要的生化途徑而實現操縱。
除上述優勢外，由重組微生物生成ω-3和/或ω-6脂肪酸的方法還可通過使宿主獲得新的生物合成途徑，或者通過抑制不需要的途徑，以改變天然存在的微生物脂肪酸譜，從而提高目標PUFAs(或其共軛形式)的水平和降低不需要的PUFAs的水平(參見本文完整引入作為參考的同時待決的美國臨時申請60/468677)。
多種ω-3和/或ω-6脂肪酸的生成方法在合適啟動子的控制下導入編碼本文所述Δ12去飽和酶的嵌合基因被認為將提高LA的產量。同樣，本發明包括直接生成PUFAs的方法，該方法包括使脂肪酸底物(即油酸)暴露於本文所述的PUFA酶(即Δ12去飽和酶)，使該底物轉化為目標脂肪酸產物(即LA)。
可選地，可採用本文所述的PUFA基因及其對應酶產物間接生成PUFAs。PUFAs的間接生成是通過中間步驟或途徑中間產物而得以發生的，其中脂肪酸底物被間接轉化為目標脂肪酸產物。因此，本文所述Δ12去飽和酶被認為可與一種或多種編碼其它酶的基因同時表達，以發生一系列的反應並進而生成目標產物。在一種優選實施方案中，例如，可用包括了PUFA生物合成途徑中的其它酶編碼基因的載體共轉化宿主生物，以較高水平地生成ω3和/或ω-6脂肪酸(例如GLA、DGLA、ARA、ALA、STA、ETA、EPA、DPA和DHA)。具體而言，例如，可能需要在還表達1.)編碼Δ6去飽和酶並用於超量產生GLA的基因；2.)包括編碼Δ6去飽和酶和高親和性延伸酶並用於超量產生DGLA的基因的表達盒；3.)編碼Δ6去飽和酶、高親和性延伸酶和Δ5去飽和酶並用於超量產生ARA的基因；或4.)編碼Δ6去飽和酶、高親和性延伸酶、Δ5去飽和酶和Δ17去飽和酶並用於超量產生EPA的基因的宿主細胞內超量表達本文所述的Δ12去飽和酶。在可選實施方案中，可能需要在還表達1.)編碼Δ15去飽和酶並用於超量產生ALA的基因；2.)編碼Δ15去飽和酶和Δ6去飽和酶並用於超量產生STA的基因；3.)編碼Δ15去飽和酶、Δ6去飽和酶和高親和性延伸酶並用於超量產生ETA的基因；或4.)編碼Δ15去飽和酶、Δ6去飽和酶、高親和性延伸酶和Δ5去飽和酶並用於超量產生EPA的基因的細胞內超量表達本文所述的Δ12去飽和酶。正如本領域技術人員所熟知的，下列酶活性的其它多種組合可能適合與本文所述去飽和酶一起在宿主內表達Δ15去飽和酶、Δ4去飽和酶、Δ5去飽和酶、Δ6去飽和酶、Δ17去飽和酶、Δ9去飽和酶和/或延伸酶(參見圖2)。被包括在特定表達盒內的特定基因應取決於宿主細胞(及其PUFA譜和/或去飽和酶譜)、底物的有效性及目標終產物。
在可選實施方案中，以本文所述的完整序列、這些完整序列的互補序列、這些序列的主要部分、由其衍生的密碼子最優化去飽和酶以及與其基本同源的那些序列為基礎破壞宿主生物的天然Δ12去飽和酶可能是有用的。例如，定向破壞解脂耶氏酵母內的本文所述Δ12去飽和酶導致產生了無法合成LA的突變菌株。該突變菌株可被用於1.)生成其它特殊的油(例如高值可可油替代品、氧化性穩定的油和由18:1衍生的脂肪酸，諸如羥基和環氧基脂肪酸)；或2.)當該宿主細胞生長在例如ALA上時，則生成ALA的「純」ω-3脂肪酸衍生物(而不共合成ω-6脂肪酸)。
表達系統、盒和載體本發明所述序列的基因和基因產物可在多種微生物宿主細胞內生成，尤其是在含油酵母(例如解脂耶氏酵母)的細胞內。在重組微生物宿主內的表達可能有助於生成多種PUFA途徑的中間產物，或者有助於調節該宿主內已存在的PUFA途徑，以合成迄今為止利用該宿主尚不可能獲得的新產物。
含有可直接高水平表達外源蛋白的調節序列的微生物表達系統和表達載體是本領域技術人員所熟知的。它們均可被用於構建嵌合基因，以生成本發明所述序列的所有基因產物。這些嵌合基因接著可以通過轉化方法被導入合適的微生物內，以獲得高水平表達的編碼酶。
有助於轉化合適宿主細胞的載體或DNA盒是本領域所熟知的。對所述構建體內存在的序列的特定選擇取決於目標表達產物(同上)、宿主細胞的特性和擬採用的將轉化細胞與未轉化細胞分離的方法。不過，所述載體或盒典型地含有引導相關基因轉錄和翻譯的序列、可選擇標記和允許自主複製或染色體整合的序列。合適的載體包括控制轉錄起始的基因的5』區和控制轉錄終止的DNA片段的3』區。雖然這種控制區域被認為無需來源於被選定作為生產宿主的特定宿主種類的天然基因，但最優選的仍然是這兩個控制區域均來源於轉化宿主細胞的基因。
有助於驅動本發明所述ORF在指定宿主細胞內的表達的起始控制區或啟動子為數眾多，是本領域技術人員所熟知的。事實上，所有能夠引導該基因在選定宿主細胞內的表達的啟動子均適用於本發明。在宿主細胞內的表達可以瞬時或穩定方式實現。瞬時表達可通過誘導與被關注基因可操作連接的可調節啟動子的活性而得以實現。穩定表達可通過利用與被關注基因可操作連接的組成型啟動子而得以實現。例如，當宿主細胞為酵母時，便提供可在酵母細胞內發揮作用，尤其是來源於該宿主種類的轉錄和翻譯區。該轉錄起始調節區可獲得自例如1.)糖酵解途徑中的基因，諸如醇脫氫酶、甘油醛-3-磷酸-脫氫酶(參見美國專利申請60/482263)、磷酸甘油酸變位酶(參見美國專利申請60/482263)、果糖-二磷酸醛縮酶(參見美國專利申請60/519971)、磷酸葡糖異構酶、磷酸甘油酸激酶等；或2.)可調節基因，諸如酸性磷酸酶、乳糖酶、金屬硫蛋白、葡糖澱粉酶、翻譯延伸因子EF1-α(TEF)蛋白(U.S.6,265,185)、核糖體蛋白S7(U.S.6,265,185)等。根據是否需要組成型或誘導型轉錄、啟動子在表達被關注ORF方面的效率、構建的難易程度等因素，可採用諸多調節序列中的任意一種。
業已發現翻譯起始密碼子『ATG』周圍的核苷酸序列可影響酵母細胞內的表達。如果本發明所述去飽和酶在非解脂耶氏酵母的酵母內表達不足，可修飾外源基因的核苷酸序列，使其包括有效的酵母翻譯起始序列，從而獲得最佳基因表達。通過定向誘變低效表達基因，即將其融合進內源酵母基因，優選高度表達的基因的讀框內，便可使其實現在酵母內的表達。可選地，可確定所述宿主內的共有翻譯起始序列，並將該序列改造進異源基因中，以實現其在被關注宿主內的最優表達。
終止區可來源自獲得起始區的基因的3』區域或者來源自不同基因。有大量終止區是已知的，並且可以在多種宿主內良好地發揮功能(當被利用在其來自的相同和不同屬和種時)。通常是考慮方便的因素而對終止區進行選擇，而不考慮任何特定屬性。該終止區優選地來源自酵母基因，尤其是酵母、裂殖酵母、假絲酵母屬、耶氏酵母或克魯維酵母。還已知編碼γ-幹擾素和α-2幹擾素的哺乳動物基因的3』區可在酵母內發揮功能。終止控制區還可來源自優選宿主的多種天然基因。任選地，終止位點可能並非必要；但最優選的仍是將其包括在內。
就本領域技術人員所知，僅將基因插入克隆載體並不能保證其能夠以要求的水平成功表達。為了滿足高表達率的需要，業已通過操縱許多可控制轉錄、翻譯、蛋白質穩定性、氧限度和宿主細胞分泌方面的不同遺傳元件，構建了許多專用表達載體。更具體而言，已被操縱用於控制基因表達的若干分子特徵包括1.)相關轉錄啟動子和終止序列的性質；2.)克隆基因的拷貝數量和該基因是質粒所具有的還是被整合進宿主細胞內的；3.)合成外源蛋白的最終細胞定位；4.)在宿主生物內的翻譯效率；5.)克隆基因蛋白在宿主細胞內的固有穩定性；和6.)該克隆基因內的密碼子選擇，可使其頻率接近宿主細胞的優選密碼子選擇頻率。這些修飾類型均被包括在本發明中，被用於進一步優化本文所述Δ12去飽和酶的表達。
微生物宿主的轉化一旦獲得適合在含油酵母內表達的多肽編碼DNA，便可將其置入能夠在宿主細胞內自主複製的質粒載體內，或者將其直接整合進該宿主細胞的基因組內。表達盒的整合可隨機發生在宿主基因組內，或者可以通過利用含有特定區域的構建體而被導向，該特定區域與宿主基因組同源並足以導向該宿主位點內的重組。構建體被導向內源位點的情況中，全部或部分的轉錄和翻譯調節區域可由該內源位點提供。
當兩個或多個基因是從分離的複製載體中表達時，各載體需要具有不同的選擇方式，並應缺乏與另一個構建體的同源性，以維持穩定表達並避免元件在構建體中的重配。調節區的明智選擇、選擇方法和導入構建體的增殖方法可通過試驗確定，使所有導入基因均以必需水平表達，以實現目標產物的合成。
包括被關注基因的構建體可通過任意標準技術被導入宿主細胞內。這些技術包括轉化(例如乙酸鋰轉化[Methods in Enzymology，194186-187(1991)])、原生質體融合、基因槍衝擊、電穿孔、微量注射或其它所有可將被關注基因導入宿主細胞內的方法。可應用於含油酵母(即解脂耶氏酵母)的更多具體學說包括美國專利4,880,741和5,071,764，以及Chen，D.C.等人的學說(Appl Microbiol Biotechnol.48(2)232-235(1997))。
為方便起見，本文將已通過任意方法被操縱並獲得DNA序列(例如表達盒)的宿主細胞稱為是「轉化的」或「重組的」。該轉化宿主應具有至少一個拷貝的表達構建體，根據所述基因是被整合進基因組的、擴增的還是存在於具有多重拷貝數的染色體外元件上的，則可具有兩個或多個拷貝的表達構建體。通過對導入構建體所含標記的選擇可對轉化宿主細胞進行鑑定。可選地，由於許多轉化技術可將多個DNA分子導入宿主細胞中，因此可用目標構建體共轉化單個標記構建體。對轉化宿主的選擇典型地基於它們在選擇性培養基上生長的能力。選擇性培養基可摻入抗生素或者缺乏未轉化宿主生長所必需的因子，諸如營養或生長因子。導入的標記基因可具有抗生素抗性或編碼必需生長因子或酶，從而當其在轉化宿主內表達時能夠允許宿主在選擇性培養基上生長。當被表達的標記蛋白可被直接或間接檢測時，也可對轉化宿主進行選擇。該標記蛋白可以單獨或與另一種蛋白融合的形式表達。可藉助於標記蛋白的1.)酶活性(例如β-半乳糖苷酶可將底物X-gal[5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃糖苷半乳糖]轉化為有色產物；螢光素酶可將蟲螢光素轉化為發光產物)；或者其2.)產生或改變光的特徵(例如當用藍光照射維多利亞水母時，其綠色螢光蛋白將發出螢光)將其檢出。可選地，可採用抗體檢測標記蛋白或位於例如，被關注蛋白上的分子標記。可通過例如，直觀或諸如FACS或利用抗體淘選等技術選擇可表達該標記蛋白或標記的細胞。對酵母轉化體的選擇而言，所有可在酵母內發揮功能的標記均可被採用。值得關注的是對卡那黴素、潮黴素和氨基糖苷G418的抗性，以及在缺乏尿嘧啶或亮氨酸的培養基上的生長能力。
轉化後，適用於本發明所述Δ12去飽和酶(和任選的其它可在宿主細胞內共表達的PUFA酶)的底物可由宿主通過天然或轉基因方式生成，或者由外源提供。
微生物內ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成的代謝工程對本發明所述Δ12去飽和酶序列的認識將有助於操縱含油酵母，尤其是解脂耶氏酵母內的ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成。這可能需要直接在PUFA生物合成途徑內進行的代謝改造或另外操縱可向該PUFA生物合成途徑提供碳的途徑。有助於操縱生化途徑的方法是本領域技術人員熟知的。
上調理想生物合成途徑的技術可典型地通過利用多拷貝質粒，將額外拷貝的去飽和酶和延伸酶基因導入宿主內，以提高ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途徑的輸出量。還可通過利用較強的啟動子(可調型或組成型)使表達提高、使所述mRNA或編碼蛋白除去/缺失去穩定序列，或者通過將穩定化序列加入該mRNA，以在轉錄水平提高所述去飽和酶或延伸酶基因的表達(U.S.4,910,141)。另一種提高異源去飽和酶或延伸酶基因表達的方法是通過將天然基因內的密碼子置換為選定宿主微生物內表達最佳的基因的密碼子，以提高所述編碼mRNA的翻譯效率。
下調不良生物合成途徑的技術與之相反，可通過基因破壞或其它方法(例如反義mRNA)進行的下調消除與上述ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途徑競爭能量或碳的生化途徑，或幹擾生成特定PUFA終產物的天然PUFA生物合成途徑酶。基因破壞是將外源DNA片段(典型的是可選擇標記基因)插入待破壞的結構基因中，以破壞其編碼序列並從而在功能上鈍化該基因。將破壞盒轉化進宿主細胞可導致功能性天然基因通過同源重組被置換為非功能性的已破壞基因(參見例如Hamilton et al.，J.Bacteriol.1714617-4622(1989)；Balbas et al.Gene 136211-213(1993)；Gueldeneret al.Nucleic Acids RES.242519-2524(1996)；和Smith et al.MethodsMol.Cell.Biol.5270-277(1996))。
當靶基因序列已知時，反義技術是另一種下調基因的方法。該方法的實現是通過克隆目標基因來源的核酸片段，並將其與啟動子可操作連接，從而得以轉錄RNA的反義鏈。接著將該構建體導入宿主細胞中，生成RNA的反義鏈。反義RNA通過阻止編碼目標蛋白的mRNA的累積而抑制了基因表達。本領域技術人員將了解的是，為了降低特定基因的表達所需考慮的特殊因素與反義技術的應用有關。例如，反義基因的合適表達水平可能需要利用不同的嵌合基因，應用到本領域技術人員已知的不同調節元件。
雖然定向基因破壞和反義技術提供了當序列已知時有效下調基因的方法，人們仍然研發了另一些特異性較差並且不以序列為基礎的方法。例如，可使細胞暴露於UV輻射，接著篩選目標表型。用化學製劑進行的誘變還有助於生成突變體，通常採用的物質包括可影響非複製型DNA的化學製劑(例如HNO2和NH2OH)，以及可影響複製型DNA的試劑(例如可導致移碼突變的吖啶染料)。本領域有文獻詳細記錄了利用放射或化學試劑產生突變體的特定方法。參見例如Thomas D.Brock在Sinauer AssociatesSunderland，MA出版的第二版BiotechnologyA Textbook of Industrial Microbiology(1989)中的報導；或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36227(1992)。
另一種非特異性的基因破壞方法是利用轉座因子或轉座子。轉座子是可被隨機插入DNA但稍後可基於序列將其重新獲得並從而確定其插入位置的遺傳因子。體內和體外轉座方法均是已知的。這兩種方法均包括將轉座因子與轉座酶結合應用。當轉座因子或轉座子在轉座酶存在條件下與核酸片段接觸時，轉座因子將被隨機插入該核酸片段中。該技術有助於隨機誘變和基因分離，因為可以基於轉座因子的序列鑑定已破壞的基因。用於體外轉座的試劑盒可通過商業渠道獲得[參見例如1.)可獲得自Perkin Elmer Applied Biosystems，Branchburg，NJ的以酵母Ty1元件為基礎的Primer Island Transposition Kit；2.)可獲得自New England Biolabs，Beverly，MA的以細菌轉座子Tn7為基礎的Genome Priming System；和3.)可獲得自EpicentreTechnologies，Madison，WI的以Tn5細菌轉座因子為基礎的EZ::TNTransposon Insertion Systems]。
在本發明的上下文中，通過上述任意方法均可能有助於調節脂肪酸生物合成途徑的表達。例如，本發明提供了可導致生成ω-3和/或ω-6脂肪酸的生物合成途徑中的關鍵酶的編碼基因(即Δ12去飽和酶)。利用多種可代謝改造宿主生物的方法將尤其有助於該基因在18:2脂肪酸產量不足的含油酵母內的表達，並且有助於調節該基因及其它PUFA生物合成基因的表達，從而最大化優選PUFA產物的產量。同樣，為用該基因最大化PUFA產量，可能必須破壞直接與PUFA生物合成競爭碳通量的途徑。在可選實施方案中，可能需要破壞本文所述的Δ12去飽和酶，促進ω-3脂肪酸合成的同時阻止ω-6脂肪酸的共合成。在另一種可選實施方案中，可能通過使本發明的Δ12去飽和酶基因處於誘導型或可調型啟動子的控制下，以調節ω-3/ω-6脂肪酸的生成。
用於重組表達Δ12去飽和酶的優選微生物宿主用於表達本發明所述基因和核酸片段的宿主細胞可能包括可在廣泛的溫度和pH值條件下在多種原料上生長的微生物宿主，所述原料包括簡單或複雜糖類、有機酸和醇和/或烴。雖然業已將本發明所述基因分離用於在含油酵母內的表達，但由於轉錄、翻譯和蛋白質生物合成設備是高度保守的，仍然可以設想所有細菌、酵母、藻類和/或絲狀真菌均是適合表達本發明所述核酸片段的宿主。
優選的微生物宿主是含油生物，諸如含油酵母。這些含油生物天然地具有合成並累積油的能力，其中油含量可大於細胞乾重的大約25％，更優選地大於細胞乾重的大約30％，最優選地大於細胞乾重的大約40％。被鑑定為含油酵母的屬典型地包括，但不限於耶氏酵母、被孢黴屬、假絲酵母屬、紅酵母屬、紅冬孢酵母屬、隱球酵母屬、絲孢酵母屬和油脂酵母屬。更具體而言，例證性的油合成酵母包括Rhodosporidium toruloides、Lipomyces starkeyii、L.lipoferus、Candidarevkaufi、鐵紅假絲酵母、熱帶假絲酵母、產朊假絲酵母、Trichosporonpullans、T.cutaneum、Rhodotorula glutinus、R.graminis、高山被孢黴和解脂耶氏酵母(曾被劃分為解脂假絲酵母)。
最優選的是含油酵母解脂耶氏酵母；在進一步的實施方案中，最優選的是被指定為ATCC#20362、ATCC#8862、ATCC#28944、ATCC#76982和/或LGAM S(7)1的解脂耶氏酵母菌株(PapanikolaousS.，和Aggelis G.，Bioresour.Technol.82(1)43-9(2002))。
用於PUFA生產的發酵方法轉化微生物宿主細胞生長在可優化脂肪酸生物合成基因的活性並以最經濟方式最大產量地生產脂肪酸(例如，可依次提高多種ω-3和/或ω-6脂肪酸產量的LA)的條件下。可優化的培養基條件通常包括碳源的類型和數量、氮源的類型和數量、碳-氮比率、氧水平、生長溫度、pH、生物量生產期的長度、油累積期的長度和細胞收穫時間。被關注的微生物，諸如含油酵母生長在複合培養基(例如酵母提取物-蛋白腖-葡萄糖液體培養基(YPD))或缺乏生長必需組分並因而迫使微生物選擇預期表達盒的確定成分的基本培養基(例如酵母氮源(DIFCOLaboratories，Detroit，MI))中。
本發明的發酵培養基必須含有合適的碳源。合適的碳源包括，但不限於單糖(例如葡萄糖、果糖)、二糖(例如乳糖、蔗糖)、寡糖、多糖(例如澱粉、纖維素或它們的混合物)、糖醇(例如甘油)或可再生原料的混合物(例如乾酪乳清透過物、玉米漿、甜菜糖漿、大麥芽)。可選的碳源可包括鏈烷、脂肪酸、脂肪酸的酯、甘油單酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂和多種市售脂肪酸，包括植物油(例如豆油)和動物脂肪。碳底物還可包括已被證實可被代謝轉化為關鍵生化中間產物的單碳底物(例如二氧化碳或甲醇)。因此設想應用於本發明的碳源可包括廣泛多種含碳底物，並僅受限於宿主生物的選擇。儘管上述所有碳底物和它們的混合物均被認為適用於本發明，優選碳底物仍然是糖和/或脂肪酸。最優選的是葡萄糖和/或含有10-22個碳的脂肪酸。
氮可由無機(例如(NH4)2SO4)或有機來源(例如尿素或穀氨酸)提供。除了合適的碳和氮源外，發酵培養基還必須含有合適的無機物、鹽、輔因子、緩衝劑、維生素及本領域技術人員已知適用於微生物的生長並可促進PUFA生成所必需酶途徑的其它組分。尤其關注的是若干種可促進脂質和PUFAs的合成的金屬離子(例如Mn+2、Co+2、Zn+2、Mg+2)(Nakahara，T.et al.，Ind.Appl.Single Cell Oils，D.J.Kyle和R.Colin，eds.pp61-97(1992))。
本發明優選的生長培養基是常見的商業製備培養基，諸如酵母氮源(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)。也可利用其它成分明確的或合成的生長培養基，而適用於特定微生物生長的合適培養基是微生物學或發酵學領域的技術人員已知的。對發酵而言合適的pH範圍典型地為大約pH4.0-pH8.0，其中優選pH5.5-pH7.0作為初始生長條件適用的範圍。該發酵可在需氧或厭氧條件下進行，其中優選微好氧條件。
PUFA在含油酵母細胞內的高水平累積典型地需要兩個階段的過程，因為代謝狀態必須在生長和/或脂肪的合成/貯藏之間獲得「平衡」。因此，含油酵母內的PUFAs生成最優選地必需兩個階段的發酵過程。在該方法中，發酵的第一個階段是生成並累積細胞物質，其特徵在於快速的細胞生長和細胞分裂。在發酵的第二個階段中，可優選的是在培養中建立脫氮條件，以促進高水平的脂質累積。該脫氮的作用是降低AMP在細胞內的有效濃度，從而降低線粒體的NAD-依賴性異檸檬酸脫氫酶活性。脫氮發生時將累積檸檬酸，從而在胞質內形成大量乙醯輔酶A，並引發脂肪酸合成。因此，該階段的特徵在於細胞分裂的終止及其後發生的脂肪酸合成和油累積。
儘管細胞典型地生長在大約30℃的條件下，仍有若干研究顯示較低的溫度可提高不飽和脂肪酸的合成(Yongmanitchai and Ward，Appl.Environ.Microbiol.57419-25(1991))。根據過程經濟學，該溫度變動很可能發生在上述兩階段發酵的第一個階段之後，即大部分生物開始生長時。
需要利用本發明所述Δ12去飽和酶工業生產ω脂肪酸時，預期可應用多種發酵方法設計。例如，可通過分批、補料分批或連續發酵方法由重組微生物宿主工業生產PUFAs。
分批發酵方法是封閉系統，其中的培養基組成在該過程之初便固定，除了在該過程期間為維持pH和氧水平所必需的添加之外不再添加其它物質。因此，在培養過程之初，用指定生物接種培養基，並在不向該培養基添加其它物質(即碳和氮源)的條件下使該生物生長或具有代謝活性。在分批方法中，系統的代謝產物和生物量組成穩定地發生變化，直到培養結束。在典型的分批方法中，細胞經歷了靜態遲滯期、快速生長對數期和最終的穩定期，其中穩定期的生長速率是降低或停止的。不加處理的話，穩定期的細胞將最終死亡。標準分批方法的變化是補料分批方法，其中的底物是在發酵過程期間被連續加入發酵罐中。補料分批方法也適用於本發明。當分解代謝物抑制傾向於抑制細胞代謝或者需要使培養基中的底物量在任意時刻均受限時，補料分批方法是有效的。由於補料分批系統的底物濃度難以測定，所以可基於可測因素，諸如pH、溶解氧和廢氣(例如CO2)分壓的變化進行估計。分批和補料分批培養方法是本領域常用並熟知的，實例可參見被引入本文作為參考的Thomas D.Brock在Sinauer AssociatesSunderland，MA出版的第二版BiotechnologyA Textbook of IndustrialMicrobiology(1989)中的報導或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36227(1992)。
利用本發明所述Δ12去飽和酶工業生產ω脂肪酸還可通過連續發酵方法實現，其中成分確定的培養基被連續加入生物反應器內，同時取出等量的培養體積用於產物回收。連續培養通常使細胞維持在對數生長期且細胞密度恆定。連續或半連續培養方法允許調節可影響細胞生長或終產物濃度的一種或任意多種因素。例如，一種方法可能限制碳源而不限定其它所有參數，以調節代謝。在另一些系統中，影響生長的許多因素可被連續改變，而通過培養基濁度測定的細胞濃度則保持恆定。連續系統需要維持穩態生長，因此必須平衡細胞生長率，以補償因為培養期間取出了培養基所造成的細胞損失。調節連續培養方法所需營養物和生長因子的方法，以及最大化產物形成速率的技術均是工業微生物學領域所熟知的，多種方法的詳述參見上述Brock的文獻資料。
PUFAs的純化PUFAs可以諸如醯基甘油、磷脂、硫脂或糖脂的游離脂肪酸或酯化形式存在於宿主微生物中，可通過本領域熟知的多種方法將其從宿主細胞中提取出來。一份與針對酵母脂質而言的提取技術、性質分析和可接受性標準有關的綜述由Z.Jacobs所著(Critical Reviews inBiotechnology 12(5/6)463-491(1992))。有關下遊加工的簡述可參見A.Singh和O.Ward所著文獻(Adv.Appl.Microbiol.45271-312(1997))。
通常，PUFAs的純化方法可包括用有機溶劑提取、超聲處理、超臨界流體提取(例如利用二氧化碳)、皂化和諸如壓力的物理方法，或這些方法的組合。尤其關注的方法是在水存在條件下，用甲醇和氯仿進行的提取(E.G.Bligh W.J.Dyer，Can.J.Biochem.Physiol.37911-917(1959))。需要時，水層可被酸化為帶負電荷的質子化部分，並從而使分配進入有機層的目標產物增多。提取結束後，可通過在氮氣流條件下進行的蒸發，除去有機溶劑。當產物以共軛形式分離時，可通過酶促或化學方法將其裂解，以釋放游離脂肪酸或被關注的較不複雜的共軛物，並可對其進行進一步的操作，以獲得目標終產物。用氫氧化鉀可理想地裂解脂肪酸的共軛形式。
如果需要進一步的純化，可應用標準方法。這些方法可包括提取、尿素處理、分部結晶、HPLC、分部蒸餾、矽膠層析、高速離心或蒸餾，或這些技術的組合。對反應基，諸如酸或烯烴基的保護可通過已知技術(例如烷基化、碘化)在任意步驟進行。所用方法包括對脂肪酸的甲基化，以製備甲基酯。同樣，保護基可在任意步驟被除去。對含有GLA、STA、ARA、DHA和EPA的部分的純化可理想地通過尿素處理和/或分部蒸餾而得以實現。
優選實施方案詳述本文所述工作的最終目標是研發可累積富含ω-3和/或ω-6 PUFAs的油的含油酵母。為實現該目標，就必須確定可在含油酵母內有效發揮功能的Δ12去飽和酶，以使優選PUFAs能夠在這些宿主內得以合成和高度累積。對有效Δ12去飽和酶的鑑定也是控制宿主細胞內所生成的ω-3/ω-6 PUFAs比率所必需的。
在本發明中，申請人分離並克隆了解脂耶氏酵母內唯一編碼Δ12去飽和酶的基因。對該基因活性的證實是基於1.)可檢測LA在特定菌株內的缺乏，其中該菌株內的天然Δ12去飽和酶已通過利用同源重組方法進行的定向基因置換而被破壞(實施例2)；2.)LA生物合成(互補)在上述已破壞菌株經由嵌合基因轉化後所獲菌株內的恢復(實施例4)；以及3.)LA在野生型細胞經由嵌合基因轉化後所獲細胞內的超量生成(實施例4)。因此，該Δ12去飽和酶基因可在多種微生物宿主內有效表達，尤其適合在含油酵母(例如天然宿主解脂耶氏酵母)內的超量表達。由於Δ12去飽和酶的表達還可受不具有天然基因調節約束的強組成型或可調型啟動子的控制，所以還可產生其它益處。
初步證實Δ12去飽和酶在解脂耶氏酵母內的功能性之後，申請人繼續探索了可優化該模型宿主生物內的PUFA生產的方法。具體而言，構建了已將Δ12去飽和酶破壞的宿主菌株解脂耶氏酵母，並用含有異源Δ6去飽和酶、延伸酶、Δ5去飽和酶和Δ17去飽和酶的表達盒轉化。當補以ALA作為底物時，該轉化宿主能夠生成STA，而不共合成任何ω-6脂肪酸(實施例8)。因此，該研究證實在用ω-3生物合成途徑中的合適基因轉化並補以ALA作為底物時，缺乏Δ12去飽和酶活性的耶氏酵母菌株僅可合成(即不共合成ω-6脂肪酸)ω-3脂肪酸(例如ETA、EPA、DPA、DHA)。
實施例下述實施例進一步定義了本發明。應當理解的是，這些實施例雖然指出了本發明的優選實施方案，但僅用於例證。通過上文的論述和這些實施例，本領域技術人員可確定本發明的基本特徵，並且在不背離本發明精神和範疇的前提下，可對其進行多種改變和改進，使其適用於多種用途和條件。
常規方法應用在實施例中的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域熟知的，相關描述可參見1.)Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular CloningA Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory；Cold Spring Harbor，NY(1989)(Maniatis)；2.)T.J.Silhavy，M.L.Bennan和L.W.Enquist，Experiments with GeneFusions；Cold Spring Harbor LaboratoryCold Spring Harbor，NY(1984)；以及3.)由Greene Publishing Assoc.and WileyInterscience(1987)出版的Ausubel，F.M等人所著的Current Protocols inMolecular Biology。
適用於微生物培養的維持和生長的材料和方法是本領域熟知的。適用於下述實施例的技術可參見American Society for MicrobiologyWashington，D.C.(1994)出版的Manual of Methods for GeneralBacteriology(由Phillipe Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.BriggsPhillips編輯的)；或Thomas D.Brock在Sinauer AssociatesSunderland，MA(1989)出版的第二版BiotechnologyA Textbook ofIndustrial Microbiology中的報導。如無另外指明，用於微生物細胞的生長和維持的所有試劑、限制酶和材料獲自Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)、DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)。
大腸桿菌TOP10細胞和大腸桿菌Electromax DH10B細胞獲自Invitrogen(Carlsbad，CA)。大腸桿菌DH5α的最高效感受態細胞獲自GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)。大腸桿菌(XL 1-Blue)感受態細胞購自Stratagene Company(San Diego，CA)。大腸桿菌菌株典型地在37℃條件下生長在Luria Bertani(LB)平板上。
常規分子克隆是根據標準方法進行的(Sambrook等人的報導，同上)。寡核苷酸由Sigma-Genosys(Spring，TX)合成。PCR產物被克隆進Promega的pGEM-T-easy載體(Madison，WI)。
DNA序列是利用染料終止技術(U.S.5,366,860；EP 272,007)和載體與插入片段特異性引物的組合在ABI自動測序儀上生成的。序列編輯在Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)中進行。所有序列在兩個方向上均表現了至少兩次的覆蓋。遺傳序列的比較是利用DNASTAR軟體(DNA Star，Inc.)實現的。
縮寫詞的含義如下「sec」指秒、「min」指分鐘、「h」指小時、「d」指天、「μL」指微升、「mL」指毫升、「L」指升、「μM」指微摩爾、「mM」指毫摩爾、「M」指摩爾、「mmol」指毫摩爾、「μmole」指微摩爾、「g」指克、「μg」指微克、「ng」指納克、「U」指單位、「bp」指鹼基對，「kB」指千鹼基。
解脂耶氏酵母的培養解脂耶氏酵母菌株ATCC#76982和ATCC#90812購自美國典型培養物保藏中心(Rockville，MD)。解脂耶氏酵母菌株通常在28℃條件下生長在YPD瓊脂(1％酵母提取物、2％細菌用蛋白腖、2％葡萄糖、2％瓊脂)上。為選擇轉化體，採用的是基本培養基(不含硫酸銨或胺基酸的0.17％酵母氮源(NIFCO Laboratories，Detroit，MI)、2％葡萄糖、0.1％脯氨酸、pH6.1)。作為補充的腺嘌呤、亮氨酸、賴氨酸和/或尿嘧啶是被適當地加入直至終濃度0.01％。
解脂耶氏酵母的脂肪酸分析為了分析脂肪酸，先通過離心收集細胞，並如Bligh，E.G. Dyer，W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.37911-917(1959))所述方法提取脂質。脂肪酸甲基酯是通過下述方法製備的，即用甲氧基鈉使脂質提取物轉酯(Roughan，G.和Nishida I.Arch Biochem Biophys.276(1)38-46(1990))，並接著用裝配有30-m X 0.25mm(內徑)HP-INNOWAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard 6890 GC對其進行分析。爐溫以3.5℃/分鐘的速度從170℃(保持25分鐘)上升至185℃。
為了直接進行鹼基轉酯，先收穫耶氏酵母培養物(3mL)，在蒸餾水中洗滌一次，並在Speed-Vac內的真空條件下乾燥5-10分鐘。向樣品中加入甲氧基鈉(100μl，1％)，接著渦旋並振搖樣品20分鐘。加入3滴1M NaCl和400μl己烷後，渦旋並離心樣品。移出上層並如上所述通過GC對其進行分析。
實施例1適合解脂耶氏酵母內的基因表達的質粒的構建本實施例描述了質粒pY5、pY5-4、pY5-13和pY5-20的構建。
質粒pY5的構建質粒pY5是pINA532的衍生物(由Insitut National Agronomics，Centre de biotechnologie AgroIndustrielle，laboratoire de GenetiqueMoleculaire et Cellularie INRACNRS，F-78850 Thiverval-Grignon，France的Dr.Claude Gaillardin所贈)，被構建用於解脂耶氏酵母內的異源基因表達，如圖3所示。
首先，將經過部分消化後含有pINA532的ARS18序列和LEU2基因的3598bp EcoRI片段亞克隆進pBluescript的EcoRI位點(Strategene，San Diego，CA)，生成pY2。TEF啟動子(Muller S.，et al.，Yeast，141267-1283(1998))是通過以TEF5』(SEQ ID NO1)和TEF3』(SEQ ID NO2)為引物進行PCR從解脂耶氏酵母基因組DNA擴增而得。PCR擴增在總體積為50μl並含有下述物質的混合物中進行100ng耶氏酵母基因組DNA，含有10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl(pH8.75)、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100、100μg/mLBSA(終濃度)、均為200μM的各種脫氧核苷三磷酸、均為10pmol的各種引物和1μl Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene)的PCR緩衝液。擴增步驟如下95℃初始變性3分鐘，接著進行35個循環，每個循環包括95℃1分鐘、56℃30秒、72℃1分鐘。最終的延伸循環於72℃進行10分鐘，接著於4℃終止反應。將418bp的PCR產物連接進pCR-Blunt中，生成pIP-tef。將pIP-tef的BamHI/EcoRV片段亞克隆進pY2的BamHI/Smal位點，可生成pY4。
XPR2轉錄終止子是通過以pINA532為模板，以XPR5』(SEQ IDNO3)和XPR3』(SEQ ID NO4)為引物進行PCR而得以擴增的。該PCR擴增是在總體積為50μl的反應混合物中進行，採用了上述組分和條件。用SacII消化179bp的PCR產物後，將其連接進pY4的SacII位點，可生成pY5。因此，pY5(如圖3和4所示)可作為耶氏酵母-大腸桿菌穿梭質粒應用，含有1.)耶氏酵母自主複製序列(ARS18)；2.)ColE1質粒複製起點；3.)氨苄青黴素抗性基因(AmpR)，用於在大腸桿菌中進行的選擇；4.)耶氏酵母LEU2基因(E.C.1.1.1.85，編碼異丙基蘋果酸異構酶)，用於在耶氏酵母中進行的選擇；5.)翻譯延伸啟動子(TEFP)，用於耶氏酵母內的異源基因表達；和6.)胞外蛋白酶基因終止子(XPR2)，用於耶氏酵母內異源基因表達的轉錄終止。
質粒pY-4、pY5-13和pY5-20的構建pY5-4和pY5-13(圖4)是pY5的衍生物，被構建用於促進解脂耶氏酵母內的亞克隆和異源基因表達。
具體而言，pY5-4是通過以pY5為模板進行的3輪定點誘變而得以構建的。利用寡核苷酸YL1和YL2(SEQ ID NO5和6)除去pY5中位於Leu2報導基因內部的Ncol位點，可生成pY5-1。通過利用寡核苷酸YL3和YL4(SEQ ID NO7和8)進行的定點誘變，將Ncol位點導入pY5-1中的TEF啟動子和XPR2轉錄終止子之間，可生成pY5-2。接著利用寡核苷酸YL23和YL24(SEQ ID NO9和10)，將Pacl位點導入pY5-2中的TEF啟動子和XPR2轉錄終止子之間，可生成pY5-4。
pY5-13是通過以pY5為模板進行的6輪定點誘變而得以構建的。通過利用寡核苷酸YL5和YL6(SEQ ID NO11和12)進行的定點誘變，除去pY5中的Sall和Clal位點，可生成pY5-5。通過利用寡核苷酸YL9和YL10(SEQ ID NO13和14)進行的定點誘變，將Sall位點導入pY5-5中的Leu2基因和TEF啟動子之間，可生成pY5-6。利用寡核苷酸YL7和YL8(SEQ ID NO15和16)，將Pacl位點導入pY5-6中的LEU2基因和ARS18之間，可生成pY5-8。利用寡核苷酸YL3和YL4(SEQ ID NO7和8)，將Ncol位點導入pY5-8中TEF啟動子的翻譯起始密碼子周圍，可生成pY5-9。利用YL1和YL2寡核苷酸(SEQID NO5和6)除去pY5-9中Leu2基因內的Ncol位點，可生成pY5-12。最後，利用寡核苷酸YL61和YL62(SEQ ID NO17和18)，將BsiWI位點導入pY5-12中的ColEI和XPR2區之間，可生成pY5-13。
質粒pY20是pY5的衍生物。是通過將含有嵌合潮黴素抗性基因(潮黴素-B磷酸轉移酶；GenBank Accession No.P00557)的Not I片段插入pY5的Not I位點而得以構建。該嵌合基因具有潮黴素抗性ORF，並受解脂耶氏酵母TEF啟動子的控制。
實施例2部分解脂耶氏酵母Δ12去飽和酶的克隆和內源Δ12去飽和酶基因的破壞根據被證實為是可生成LA(18:2)而不生成ALA(18:3)的生物的野生型解脂耶氏酵母(ATCC#76982)的脂肪酸組成，設想解脂耶氏酵母很可能含有具有Δ12去飽和酶活性而不具有Δ15去飽和酶活性的基因。因此，本實施例描述了簡併PCR引物在分離解脂耶氏酵母Δ12去飽和酶的部分編碼序列方面的用途，和該部分序列在破壞所述天然基因方面的用途。
通過利用簡併PCR引物進行的PCR對解脂耶氏酵母來源的部分推定Δ12去飽和酶序列的克隆利用DNeasy Tissue Kit(Qiagen，Catalog #69504)從解脂耶氏酵母(ATCC#76982)中分離出基因組DNA，並將其重懸浮在試劑盒緩衝液AE中，DNA濃度為0.5μg/μl。PCR擴增是以該基因組DNA為模板並採用了若干組簡併引物進行的，其中的簡併引物被製備用於不同真菌Δ12去飽和酶(即高山被孢黴、魯氏毛黴、構巢裸殼孢菌和Pichiaaugusta)所共同保守的胺基酸序列。如下表所示，用上簡併引物和下簡併引物分別為P73和P76的引物組所獲的結果最好。
表3被用於擴增部分推定Δ12去飽和酶的簡併引物 PCR是利用Eppendorf Mastercycler Gradient熱循環儀並根據生產商的推薦方法進行。擴增步驟如下95℃初始變性1分鐘，接著進行30個循環，每個循環包括95℃變性30秒、58℃退火1分鐘和72℃延伸1分鐘。最終的延伸循環於72℃進行10分鐘，接著於4℃終止反應。
通過瓊脂糖凝膠電泳檢測預期(大約740bp)大小的PCR產物，分離、純化後，將其克隆進pTA載體(Invitrogen)，並對其測序。基於BLAST程序分析(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.，et al.，J.Mol.Biol.215403-410(1993))發現所獲序列(被包括在SEQ ID NO23內)與已知的Δ12去飽和酶同源。
對解脂耶氏酵母Δ12去飽和酶基因的定向破壞對解脂耶氏酵母#76982中天然Δ12去飽和酶基因的定向破壞是通過用被命名為pY23D12的導向盒置換Δ12去飽和酶基因而得以實現的，該置換是同源重組介導的。pY23D12衍生自質粒pY20(實施例1)。具體而言，pY23D12是通過將642bp的Hind III/Eco RI片段插入同樣線性化的pY20而得以構建的。該642bp片段包括(從5』到3』方向)從+718到+1031號位的3』同源序列(SEQ ID NO23中的編碼序列(ORF))、Bgl ll限制位點和從+403到+717號位的5』同源序列(SEQID NO23中的編碼序列(ORF))。該片段是通過分別利用PCR引物組，即P99和P100(SEQ ID NO25和26)以及P101和P102(SEQID NO27和28)，對642bp PCR產物的3』和5』序列進行PCR擴增而得以製備。
通過Bal ll限制酶切消化使pY23D12線性化，並根據Chen，D.C.等人所述方法通過乙酸鋰法將其轉化進對數中期的解脂耶氏酵母細胞內(Appl Microbiol Biotechnol.48(2)232-235(1997))。簡言之，將解脂耶氏酵母ATCC#76982劃線接種在YPD平板上，使其於30℃生長大約18小時。從平板上刮取若干次大菌環量的細胞，將其重懸浮在1mL轉化緩衝液中，該緩衝液含有●2.25mL的50％PEG，平均MW 3350；●0.125mL的2M乙酸鋰，pH6.0；●0.125mL的2M DTT；和●50μg剪切的鮭精DNA。
將大約500ng質粒DNA溫育在100μl重懸浮細胞中，並於39℃每15分鐘渦旋混合一次，保持1小時。將細胞接種至YPD潮黴素選擇平板上，並於30℃溫育2到3天。
分離4個潮黴素抗性菌落，並通過PCR篩選定向破壞。設計一組PCR引物(P119[SEQ ID NO29]和P120[SEQ ID NO30])用於擴增同源重組後的特異性結合片段。設計另一組PCR引物(P121[SEQ IDNO31]和P122[SEQ ID NO32])以檢測所述天然基因。在上述4個潮黴素抗性菌落中，有3個菌落對所述結合片段顯示陽性，而對所述天然片段顯示陰性，由此證實了定向整合。
對Δ12去飽和酶已破壞菌株內的脂肪酸譜的確定通過對命名為「Q-d12D」的Δ12去飽和酶已破壞菌株內的全部脂質進行的GC分析，進一步證實Δ12去飽和酶基因的破壞。於30℃、3mL基本培養基(配方/L20g葡萄糖、1.7g酵母氮源、1g L-脯氨酸、0.1g L-腺嘌呤、0.1g L-賴氨酸、pH6.1)中分別培養野生型(ATCC#76982)和Q-d12D解脂耶氏酵母的單菌落，直至OD600～1.0。收穫細胞，用蒸餾水洗滌，真空離心蒸發濃縮乾燥後進行直接轉酯和GC分析(如常規方法一節所述)。
野生型耶氏酵母和包括已破壞的Δ12去飽和酶的轉化體Q-d12D的脂肪酸譜如表4所示。對脂肪酸的鑑定結果為16:0(棕櫚酸)、16:1(棕櫚油酸)、18:0、18:1(油酸)和18:2(LA)；各脂肪酸組成均以在總脂肪酸中所佔百分比的形式表示。
表4野生型和轉化體解脂耶氏酵母內的脂肪酸組成(在總脂肪酸中的％)
*nd＝不可檢出結果表明Q-d12D菌株內的天然Δ12去飽和酶基因失活了。因此，推斷解脂耶氏酵母ATCC#76982內僅有一個編碼功能性Δ12去飽和酶的基因是合理的。
實施例3對全長解脂耶氏酵母Δ12去飽和酶基因的克隆本實施例描述了通過質粒拯救，即利用被拯救質粒中的序列進行PCR擴增所述天然基因內的完整可讀框，對已破壞基因兩側基因組序列的回收。將全長基因及其推導胺基酸序列與另一些真菌去飽和酶進行比較。
對解脂耶氏酵母Δ12去飽和酶基因的質粒拯救由於所述Δ12去飽和酶基因是通過插入還含有大腸桿菌氨苄青黴素抗性基因和大腸桿菌ori的完整pY23D12載體而被破壞的，因此，拯救大腸桿菌中的側翼序列是可能的。為實現該拯救，利用了DNeasyTissue Kit分離解脂耶氏酵母菌株Q-d12D(攜帶有已破壞的Δ12去飽和酶基因；實施例2)的基因組DNA。接著，用50μl限制酶Age l、Avr ll、Nhe l和Sph l消化10μg基因組DNA，反應體積為200μl。用苯酚:氯仿提取已消化的DNA，並將其重懸浮於40μl去離子水中。已消化的DNA(10μl)在含有3U T4 DNA連接酶的200μl連接混合物中自身連接。該連接在16℃條件下進行12小時。用苯酚:氯仿提取已連接DNA，並將其重懸浮於40μl去離子水中。最後，通過電穿孔，用1μl重懸浮的連接DNA轉化大腸桿菌，並將轉化體接種在含有氨苄青黴素(Ap)的LB平板上。分離Ap-抗性菌落，並通過小量製備分析所述質粒的存在。在被回收或拯救質粒中發現了下列插入片段大小(表5)表5回收質粒中與限制酶對應的插入片段大小
對所述質粒的測序是由測序引物P99(SEQ ID NO25)和P102(SEQ ID NO28)起始的。
基於測序結果，裝配了編碼解脂耶氏酵母Δ12去飽和酶基因的全長基因(1936bp；SEQ ID NO23)。具體而言，SEQ ID NO23編碼具有1257個鹼基的可讀框(核苷酸+283到+1539)，其推導胺基酸序列的長度為419個殘基(SEQ ID NO24)。
利用絲狀真菌的可用序列資料庫查詢解脂耶氏酵母Δ12去飽和酶蛋白(SEQ ID NO24)，其中所述序列資料庫包括1.)粗糙脈孢菌、稻瘟病菌、構巢麴黴和Kluyveromuces lactis的公用資料庫；和2.)串珠鐮孢黴菌菌株M-8114的DuPont EST文庫(E.I.du Pont de Nemoursand Co.，Ind.，Wilmingtong，DE)(串珠鐮孢黴菌菌株M-8114可獲自Fusarium Research Center，University Park，PA；還可參見PlantDisease 81(2)211-216.(1997))。這些BLAST研究鑑定了下列同源物(表6)。
表6對Δ12去飽和酶同源物的說明
上述所有同源物不是未註明就是被註明為脂肪酸去飽和酶。此外，構巢麴黴的核苷酸序列不完整和/或基因組具有推定內含子序列；申請人對推導胺基酸進行了試驗性裝配，用於與其它同源物來源的胺基酸序列做比較。
對解脂耶氏酵母Δ12去飽和酶的推導胺基酸序列(SEQ IDNO24)與真菌同源物的比較結果如上表6所示，另一些已知的Δ12去飽和酶如下表7所示。
表7已知的Δ12去飽和酶
具體而言，該分析是利用DNASTAR軟體包(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的ClustaIW比對算法(Slow/Accurate，Gonnet option；Thompson et al.，Nucleic Acids Res.224673-4680(1994))進行。比較結果表明存在配對距離，如圖5所示，其中「YI」對應於解脂耶氏酵母Δ12去飽和酶。相似性百分率和序列差異百分率分別如上方的三角和下方的三角所示。因此，解脂耶氏酵母Δ12去飽和酶與其它Δ12去飽和酶同源物具有至少53％的同一性(與構巢麴黴序列(An2)具有最高同一性)。
實施例4解脂耶氏酵母Δ12去飽和酶ORF在異源耶氏酵母啟動子控制下的表達本實施例描述的是嵌合基因中的Δ12去飽和酶ORF在異源(非-Δ12去飽和酶)耶氏酵母啟動子控制下的表達可補充Δ12去飽和酶已破壞突變體，並使LA能夠在野生型菌株內超量產生。
解脂耶氏酵母Δ12去飽和酶在解脂耶氏酵母內的表達編碼解脂耶氏酵母Δ12去飽和酶的ORF是通過利用上引物P147(SEQ ID NO33)和下引物P148(SEQ ID NO34)進行PCR從解脂耶氏酵母ATCC#76982的基因組DNA中擴增而得。分離正確大小(1260bp)的片段，純化並用Nco I和Not I消化後，將其克隆進NcoI-NotI酶切的pY5-13載體中(實施例1)，使該基因受TEF啟動子控制。通過小量製備分析證實轉化體正確，並將相應質粒命名為pY25-d12d。
將質粒pY5-13(「對照」)和pY25-d12d分別轉化進解脂耶氏酵母ATCC#76982野生型(WT)和d12d已破壞菌株(Q-d12D，在下表中也被稱為「d12KO」)中，並在Bio 101 DOB/CSM-Leu平板上進行選擇。
轉化體的單菌落長出後，如常規方法一節所述進行GC分析。結果如下表所示。脂肪酸鑑定結果為16:0、16:1、18:0、18:1(油酸)和18:2(LA)；各脂肪酸組成均以在總脂肪酸中所佔百分比的形式表示。根據公式([18:2]/[18:1+18:2])*100計算「D12d SC」，表示底物轉化百分率。
表8脂肪酸組成(在總脂肪酸中所佔百分比)
*nd＝不可檢出結果顯示Δ12去飽和酶啟動子在強度上等同於TEF啟動子(在受TEF啟動子控制下表達Δ12去飽和酶的d12KO菌株中的底物轉化百分率為57％，與之相比，在受天然Δ12去飽和酶啟動子控制下表達Δ12去飽和酶的野生型菌株中的底物轉化百分率為59％)。基於此，Δ12去飽和酶啟動子被認為可被用於其它ORF在耶氏酵母中的異源表達。
此外，該結果還證實Δ12去飽和酶在野生型細胞中的超量表達導致了更高水平的LA產量(18:2)。具體而言，在受TEF啟動子控制下超量表達Δ12去飽和酶的野生型菌株中觀測到74％的底物轉化百分率，與之相比，在野生型菌株中僅觀測到59％的底物轉化百分率。基於這些結果可以預期，與其它用於PUFA生物合成的基因(例如Δ6去飽和酶、延伸酶、Δ5去飽和酶、Δ17去飽和酶)組合時，Δ12去飽和酶的超量表達將導致生成更高產量的ω-3和/或ω-6 PUFAs。此外，還可預期天然Δ12去飽和酶的破壞和其它用於PUFA生物合成的基因(例如Δ6去飽和酶、延伸酶、Δ5去飽和酶、Δ17去飽和酶)表達將導致「純」ω-3 PUFAs的產生，而不共合成任何ω-6 PUFAs。
實施例5對適合在解脂耶氏酵母內表達的Δ6去飽和酶、Δ5去飽和酶、Δ17去飽和酶和高親和性PUFA延伸酶基因的選擇將編碼ω-3和/或ω-6生物合成途徑的特異性基因導入含有已破壞的Δ12去飽和酶的解脂耶氏酵母內之前(實施例8)，有必要證實在耶氏酵母中表達的異源Δ6去飽和酶、延伸酶、Δ5去飽和酶和Δ17去飽和酶基因的功能性。這是通過測定各野生型蛋白在可選宿主內的轉化效率而得以實現的。具體而言，即分別表達高山被孢黴Δ5去飽和酶、高山被孢黴Δ6去飽和酶、異絲水黴Δ17去飽和酶和高山被孢黴高親和性PUFA延伸酶，並在底物補料試驗中進行活性篩選。
表達質粒的構建通常是通過限制酶切消化分離野生型去飽和酶或延伸酶基因，或通過PCR擴增，並將其插入合適的載體中進行表達。各PCR擴增均在總體積為50μl並包括PCR緩衝液的反應混合物中進行，所述PCR緩衝液含有10ng模板、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl(pH8.75)、2mM MgSO4、0.1％ Triton X-100、100μg/mL BSA(終濃度)、均為200μM的各種脫氧核苷三磷酸、均為10pmole的各種引物和1μl Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene，San Diego，CA)。擴增步驟如下(如無另外指明)95℃初始變性3分鐘，接著進行35個循環，每個循環包括95℃1分鐘、56℃30秒、72℃1分鐘。最終延伸循環於72℃進行10分鐘，接著於4℃終止反應。
野生型高山被孢黴(編號#AF465281)Δ6去飽和酶將含有高山被孢黴Δ6去飽和酶基因(SEQ ID NO36)的pCGR5(U.S.5,968,809)的1384bp Ncol/Notl片段插入pY5-2(實施例1)的Ncol/Notl位點，可生成pY54。
野生型高山被孢黴(編號#AF067654)Δ5去飽和酶通過以寡核苷酸YL11和YL12(SEQ ID NOs40和41)為引物、以質粒pCGR-4(U.S.6,075,183)為模板進行PCR擴增高山被孢黴Δ5去飽和酶基因(SEQ ID NO38)。PCR擴增步驟如上所述，但延伸步驟延長至1.5分鐘(對循環1-35而言)。用Ncol/Notl消化1357bp的PCR產物，並與Ncol/Notl消化的pY5-13(如實施例1所述)連接生成pYMA5bp(圖6)。
野生型異絲水黴(ATCC#56851)Δ17去飽和酶通過以寡核苷酸YL21A(SEQ ID NO42)和YL22(SEQ IDNO43)為引物進行PCR，從質粒pRSP19(US 2003/0196217 A1)擴增異絲水黴的野生型Δ17去飽和酶基因。用Ncol/Pacl消化PCR產物，並接著與Ncol/Pacl消化的pY5-4(圖4；如實施例1所述)連接生成pYSD17。
野生型高山被孢黴(編號#AX464731)高親和性延伸酶將含有高山被孢黴高親和性PUFA延伸酶基因編碼區(SEQ IDNO44)的pRPB2(WO 00/12720)的973bp Notl片段插入pY5(如實施例1所述；圖3和4)的Notl位點，可生成pY58。
解脂耶氏酵母的轉化根據Chen，D.C.等人所述方法(Appl Microbiol Biotechnol.48(2)232-235(1997))，將質粒pY54、pYMA5pb、pYSD17和pY58分別轉化進解脂耶氏酵母ATCC#76982中，如實施例2所述(除了採用亮氨酸營養缺陷型耶氏酵母用於轉化和在缺乏亮氨酸的基本培養基平板上選擇轉化體之外)。
底物轉化百分率的確定於30℃、3mL基本培養基(20g/L葡萄糖、1.7g/L無胺基酸的酵母氮源、1g/L L-脯氨酸、0.1g/L L-腺嘌呤、0.1g/L L-賴氨酸、pH6.1)中分別培養含有pY54、pYMA5pb、pYSD17或pY58的轉化體解脂耶氏酵母的單菌落，直至OD600～1.0。為補料底物，接著於30℃，在含有10μg底物的3mL基本培養基中傳代培養100μl細胞大約24小時。隨後通過離心收集細胞，並如常規方法一節所述方法提取脂質。脂肪酸甲基酯是通過脂質提取物的轉酯化而得以製備。底物轉化百分率計算公式為[產物/(底物+產物)]*100。
高山被孢黴Δ6去飽和酶的底物轉化百分率高山被孢黴Δ6去飽和酶可將LA轉化為GLA和/或將ALA轉化為STA。如上所述培養含pY54的解脂耶氏酵母菌株(無需底物補料)並分析脂質。結果顯示具有pY54的耶氏酵母菌株可將大約30％的LA轉化為GLA。
高山被孢黴Δ5去飽和酶的底物轉化百分率高山被孢黴來源的Δ5去飽和酶可將DGLA轉化為ARA和/或將ETA轉化為EPA。從單菌落開始培養含pYMA5pb的解脂耶氏酵母，在含有10μg DGLA的基本培養基中進行傳代培養，並接著如上所述對其進行脂質分析。具有pYMA5pb的耶氏酵母菌株可將大約30％的胞內DGLA轉化為ARA。
異絲水黴Δ17去飽和酶的底物轉化百分率異絲水黴Δ17去飽和酶可將ARA轉化為EPA和/或將DGLA轉化為ETA。從單菌落開始培養含pYSD17的解脂耶氏酵母，在含有10μgARA的基本培養基中進行傳代培養，並如上所述對其進行脂質分析。ARA補料試驗的結果顯示具有pYSD17的耶氏酵母菌株可將大約23％的胞內ARA轉化為EPA。
野生型高山被孢黴高親和性延伸酶的底物轉化百分率高山被孢黴高親和性PUFA延伸酶可將GLA轉化為DGLA、將STA轉化為ETA和/或將EPA轉化為DPA。從單菌落開始培養含有pY58的解脂耶氏酵母菌株，在含有10μg GLA的基本培養基中進行傳代培養，並如上所述對其進行脂質分析。GLA補料試驗的結果顯示具有pY58的耶氏酵母菌株可將大約30％的胞內GLA轉化為DGLA。
實施例6
密碼子最優化Δ17去飽和酶基因在解脂耶氏酵母內的合成和表達基於實施例5的結果，可利用的基因是編碼Δ6去飽和酶、延伸酶和Δ5去飽和酶活性的基因，因為這些基因在解脂耶氏酵母內均能夠實現～30％的底物轉化百分率。但異絲水黴來源的Δ17去飽和酶的最大轉化效率僅為23％。因此，根據耶氏酵母的密碼子選擇模式、『ATG』翻譯起始密碼子周圍的共有序列和RNA穩定性的普遍規律，並基於異絲水黴DNA序列(SEQ ID NO35)設計了密碼子最優化Δ17去飽和酶基因(Guhaniyogi，G.和J.Brewer，Gene 265(1-2)11-23(2001))。
除了對翻譯起始位點的修飾外，還對1077bp編碼區中包括了117個密碼子的127bp片段進行了密碼子最優化。該密碼子最優化DNA序列(SEQ ID NO46)與異絲水黴Δ17去飽和酶基因DNA序列(SEQ IDNO35)之間的比較如圖7所示，其中粗體所示核苷酸對應於密碼子最優化基因中被改動的核苷酸。該密碼子最優化基因中的所有變更均未改變編碼蛋白的胺基酸序列(SEQ ID NO47)。
合成的密碼子最優化Δ17去飽和酶適合與其它用於PUFA生物合成的基因一起表達，被用於驗證一種假設，即其在自身天然Δ12去飽和酶已破壞的解脂耶氏酵母宿主內的表達是否將導致生成「純」ω-3PUFAs，而不共合成任何ω-6PUFAs(如下所述，實施例8)。
對解脂耶氏酵母內的優選密碼子選擇的確定在美國國立生物技術信息中心的公開資料庫中發現了解脂耶氏酵母的大約100個基因。通過DNAStar的Editseq程序，將這些基因中121,167bp的編碼區翻譯為對應40,389個胺基酸，並制表以確定解脂耶氏酵母密碼子選擇譜，如表9所示。「No.」欄指特定密碼子在包括40,389個胺基酸的樣品中編碼特定胺基酸的次數。「％」欄指特定密碼子編碼特定胺基酸的頻率。粗體所示項目代表在解脂耶氏酵母中佔優勢的密碼子。
表9解脂耶氏酵母內的密碼子選擇
為了進一步優化解脂耶氏酵母內的基因表達，還檢驗了『ATG』起始密碼子周圍含79個基因的共有序列。如圖8所示，下劃線ATG翻譯密碼子中的第一個「A」被設定為+1。所分析基因中的77％均於-3號位具有『A』，說明該號位對『A』具有強的偏好。此外，-4、-2和-1號位偏好『A』或『C』，+5號位偏好『A』、『C』或『T』，+6號位偏好『G』或『C』。因此，對基因在解脂耶氏酵母內的最佳表達而言，密碼子最優化翻譯起始位點的優選共有序列是『MAMMATGNHS』(SEQ ID NO130)，其中被採用的核酸簡併密碼為M＝A/C；S＝C/G；H＝A/C/T和N＝A/C/G/T。
密碼子最優化基因的體外合成被用於合成密碼子最優化Δ17去飽和酶基因的方法如圖9所示。首先，設計11對寡核苷酸，以延伸異絲水黴Δ17去飽和酶基因的密碼子最優化編碼區的全長(例如D17-1A、D17-1B、D17-2A、D17-2B、D17-3A、D17-3B、D17-4A、D17-4B、D17-5A、D17-5B、D17-6A、D17-6B、D17-7A、D17-7B、D17-8A、D17-8B、D17-9A、D17-9B、D17-10A、D17-10B、D17-11A和D17-11B，對應於SEQ ID NOs48-69)。每一對有義(A)和反義(B)寡核苷酸除5』-末端具有4bp突出端外，其它部分均互補。此外，引物D17-1A、D17-4B、D17-5A、D17-8A和D17-8B還分別導入了用於後續亞克隆的Ncol、Bglll和Sall限制位點。
於37℃、體積為20μl並含有50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mMMgCl2、10mM DTT、0.5mM亞精胺、0.5mM ATP和10U T4多核苷酸激酶的混合液中，使均為100ng的各種寡核苷酸磷酸化。將各有義和反義寡核苷酸對混合，並在採用下列參數的熱循環儀中退火95℃(2分鐘)、85℃(2分鐘)、65℃(15分鐘)、37℃(15分鐘)、24℃(15分鐘)和4℃(15分鐘)。因此，D17-1A(SEQ ID NO48)退火至D17-1B(SEQ ID NO49)可生成雙鏈產物「D17-1AB」。同樣，D17-2A(SEQ ID NO50)退火至D17-2B(SEQ ID NO51)可生成雙鏈產物「D17-2AB」，依次類推。
接著將退火雙鏈寡核苷酸分別混合所獲得的三個集合體連接在一起，如下所示●集合體1包括D17-1AB、D17-2AB、D17-3AB和D17-4AB；●集合體2包括D17-5AB、D17-6AB、D17-7AB和D17-8AB；和
●集合體3包括D17-9AB、D17-10AB和D17-11AB。
將各退火寡核苷酸集合體混合在體積為20μl並含有10U T4 DNA連接酶的混合物中，並於16℃溫育過夜。
接著通過PCR擴增各連接反應的產物。具體而言，是通過以連接的「集合體1」混合物(即D17-1AB、D17-2AB、D17-3AB和D17-4AB)為模板，以寡核苷酸D17-1(SEQ ID NO70)和D17-4R(SEQ IDNO71)為引物進行PCR，擴增密碼子最優化Δ17去飽和酶基因的第一個部分。該PCR擴增是在總體積為50μl並包括PCR緩衝液的混合物中進行，其中的PCR緩衝液含有10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl(pH 8.75)、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100、100μg/mLBSA(終濃度)、均為200μM的各種脫氧核苷三磷酸、均為10pmole的各種引物和1μl Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene，San Diego，CA)。擴增步驟如下於95℃初始變性3分鐘，接著進行35個循環，每個循環包括95℃1分鐘、56℃30秒、72℃40秒。最終延伸循環於72℃進行10分鐘，接著於4℃終止反應。將430bp PCR片段亞克隆進pGEM-T easy載體(Promega)中，可生成pT17(1-4)。
同樣，通過以連接的「集合體2」混合物(即D17-5AB、D17-6AB、D17-7AB和D17-8AB)為模板，以寡核苷酸D17-5(SEQ ID NO72)和D17-8D(SEQ ID NO73)為引物進行PCR，擴增密碼子最優化Δ17去飽和酶基因的第二個部分，並將其克隆進pGEM-T-easy載體中，可生成pT17(5-8)。最後，同樣通過以「集合體3」連接混合物(即D17-9AB、D17-10AB和D17-11AB)為模板，以寡核苷酸D17-8U(SEQID NO74)和D17-11(SEQ ID NO75)為引物進行PCR，擴增密碼子最優化Δ17去飽和酶基因的第三個部分，並將其克隆進pGEM-T-easy載體中，可生成pT17(9-11)。
分別用pT17(1-4)、pT17(5-8)和pT17(9-11)轉化大腸桿菌，並從氨苄青黴素抗性轉化體中分離質粒DNA。純化質粒DNA，並用合適的限制性內切核酸酶消化，以釋放出pT17(1-4)的420bp Ncol/Bglll片段、pT17(5-8)的400bp Bglll/Sall片段和pT17(9-11)的300bpSall/Notl片段。接著將這些片段組合、連接在一起作為模板，並以D17-1(SEQ ID NO70)和D17-11(SEQ ID NO75)為引物擴增完整的合成密碼子最優化Δ17去飽和酶基因。對Δ17去飽和酶基因的每一個部分均採用上述條件，在總體積為50μl的混合物中進行PCR擴增，熱循環程序如下於95℃初始變性3分鐘，接著進行35個循環，每個循環包括95℃1分鐘、56℃30秒、72℃1.1分鐘。最終延伸循環於72℃進行10分鐘，接著於4℃終止反應。生成1.1kB PCR產物。
含密碼子最優化Δ17去飽和酶的質粒pYSD17S的構建用Ncol/Notl消化包括完整合成Δ17去飽和酶的上述1.1kB PCR產物，並將其亞克隆進Ncol/Notl消化的pY5-13(實施例1)中，可生成pYSD17S(圖10A)。
為比較野生型和合成基因在耶氏酵母內的效率，另一個「對照」是通過以YL53(SEQ ID NO76)和YL54(SEQ ID NO77)為引物進行定點誘變，消除pYSDl7(包括所述野生型基因；如實施例5所述)中富含AT的Pacl位點，可生成pYSD17M(圖10B)。
用密碼子最優化Δ17去飽和酶基因對解脂耶氏酵母的轉化根據實施例5所述方法，分別將含有野生型和密碼子最優化Δ17去飽和酶的質粒轉化進解脂耶氏酵母ATCC#76982中。利用該技術，獲得含有下述質粒的轉化體表10轉化體耶氏酵母中的盾粒一覽表
密碼子最優化Δ17去飽和酶基因的底物轉化百分率Δ17去飽和酶可將ARA轉化為EPA(參見圖2)。野生型和密碼子最優化Δ17去飽和酶基因的底物轉化百分率([產物]/[底物+產物]*100)是通過利用實施例5所述方法，在含有各可選質粒構建體的解脂耶氏酵母中測定的。
ARA補料試驗結果顯示具有對照質粒pYSD17或pYSD17M的耶氏酵母菌株可將大約23％的胞內ARA轉化為EPA(圖11A)，而含有pYSD17S中的密碼子最優化Δ17去飽和酶基因的菌株則可將大約45％的胞內ARA轉化為EPA(圖11B)。因此，含有密碼子最優化Δ17去飽和酶的耶氏酵母可轉化比含有野生型異絲水黴基因的菌株多大約2倍的ARA。
實施例7適合解脂耶氏酵母內多種ω脂肪酸生物合成基因同步表達的質粒的構建構建多種表達質粒，以獲得含有Δ6去飽和酶、延伸酶、Δ5去飽和酶和Δ17去飽和酶並適合被整合進解脂耶氏酵母基因組內的構建體。該構建體的表達是檢驗下述假設所必需的，即含有已破壞的天然Δ12去飽和酶的解脂耶氏酵母宿主可生成「純」ω-3 PUFAs，而不共合成任何ω-6 PUFAs(如下所述，實施例8)。
質粒pY24的構建質粒pY24(圖12)是用於構建適合被整合進解脂耶氏酵母基因組內的表達盒的親本載體。pY24的構建方法如下以寡核苷酸KU5和KU3(SEQ ID NOs78和79)為引物，以耶氏酵母基因組DNA為模板，通過PCR擴增含有耶氏酵母URA3基因的1.7kB DNA片段(SEQ ID NO80)。該PCR擴增是在總體積為50μl的混合物中進行，該混合物包括100ng耶氏酵母基因組DNA和含有10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl(pH8.75)、2mMMgSO4、0.1％ Triton X-100、100μg/mL BSA(終濃度)、均為200μM的各種脫氧核苷三磷酸、均為10pmole的各種引物和1μl Pfu TurboDNA聚合酶(Stratagene，San Diego，CA)的PCR緩衝液。擴增步驟如下於95℃初始變性3分鐘，接著進行35個循環，每個循環包括95℃1分鐘、56℃30秒、72℃2分鐘。最終延伸循環於72℃進行10分鐘，接著於4℃終止反應。將該PCR產物插入pGEM-T easy載體(Promega，Madison，WI)中，可生成pGYUM。
利用寡核苷酸KI5和KI3(SEQ ID NOs82和83)進行PCR，擴增含有Impatients balsama的接合酶基因(或「imp H8」)(clone ids.pk0001.h8；E.I.du Pont de Nemours and Company，Inc.，Wilmington，DE)的1.1kB DNA片段(SEQ ID NO84)。該PCR擴增是利用上述組成進行，但所用模板是ids.pk0001.h8的10ng質粒DNA。擴增步驟如下於95℃初始變性3分鐘，接著進行35個循環，每個循環包括95℃1.5分鐘、56℃30秒、72℃1.2分鐘。最終延伸循環於72℃進行10分鐘，接著於4℃終止反應。用Notl消化該PCR產物，並接著將其插入pY5(圖3)的Notl位點，可生成pY9。
利用寡核苷酸KTI5和KTI3(SEQ ID NOs86和87)進行PCR，擴增含有pY9的TEF::IMP H8::XPR嵌合基因的1.7kB DNA片段(SEQID NO88)。如上所述進行該PCR擴增，但所用模板是pGYUM的10ng質粒DNA。擴增步驟如下於95℃初始變性3分鐘，接著進行35個循環，每個循環包括95℃1分鐘、56℃30秒、72℃2分鐘。最終延伸循環於72℃進行10分鐘，接著於4℃終止反應。將該PCR產物插入PCR-Script(Stratagene)中，可生成pY9R。用pGYUM的Xhol/EcoRV片段置換pY9R的1.7kB Xhol/EcoRV片段，可生成pY21。
以寡核苷酸KH5和KH3(SEQ ID NOs90和91)為引物，以KS65的基因組DNA為模板進行PCR，擴增含有大腸桿菌潮黴素抗性基因(「HPT」；Kaster，K.R.，et al.，Nucleic Acids Res.116895-6911(1983))的1kB DNA片段(SEQ ID NO92)。該PCR擴增是利用上述組分在總體積為50μl的混合物中進行，但所用模板是ids.pk0001.h8的10ng質粒DNA。擴增步驟如下於95℃初始變性3分鐘，接著進行35個循環，每個循環包括95℃1分鐘、56℃30秒、72℃1.2分鐘。最終延伸循環於72℃進行10分鐘，接著於4℃終止反應。用Notl消化該PCR產物，並接著將其插入pY5的Notl位點(圖3)，可生成pTHPT-1。
以寡核苷酸KTH5和KTH3(SEQ ID NOs94和95)為引物，以pTHPT-1質粒DNA為模板，如上所述擴增含有TEF::HPT::XPR融合基因的1.6kB DNA片段(SEQ ID NO96)。用Bglll消化該PCR產物，並接著將其插入pY21中，可生成pY24。
pY24-4的構建質粒pY24(圖12)被用於構建適合被整合進解脂耶氏酵母基因組的表達盒。利用pY24質粒中解脂耶氏酵母URA3基因的401bp 5』序列(SEQ ID NO98)和568bp 3』-序列(SEQ ID NO99)將表達盒直接整合進耶氏酵母基因組的Ura位點。通過BamHI消化，首先從pY24中移出兩個嵌合基因(TEF::HPT::XPR和TEF::IMP H8::XPR)，使它們自連接生成pY24-1。通過分別利用YL63和YL64(SEQ ID NOs100和101)和YL65和YL66(SEQ ID NOs102和103)引物對進行定點誘變，將Pacl和BsiWI位點導入pY24-1中，可生成pY24-4。
用於Δ5去飽和酶表達的整合載體的構建將pYMA5pb的4261bp Pacl/BsiWI片段(包括高山被孢黴Δ5去飽和酶基因；如實施例5所述)連接進pY24-4的Pacl/BsiWI位點，可生成pYZM5(圖6)。通過分別利用引物對YL81和YL82(SEQ IDNOs104和105)和YL83和YL84(SEQ ID NOs106和107)進行定點誘變，將Hindlll和Clal位點導入pYZM5，可生成pYZM5CH(圖6)。通過以YL105和YL106(SEQ ID NO108和109)為引物進行定點誘變，將Pmel位點導入pYZM5CH，可生成pYZM5CHPP。通過以YL119和YL120(SEQ ID NO110和111)為引物進行定點誘變，將Ascl位點導入pYZM5CHPP，可生成pYZM5CHPPA(圖6)。
為優化該整合載體，以YL121和YL122(SEQ ID NOs112和113)為引物進行PCR，擴增解脂耶氏酵母URA3基因(SEQ ID NO114)上遊的440bp 5』非編碼DNA序列。用Ascl和BsiWI消化該PCR產物，並接著用pYZM5CHPPA的Ascl/BsiWI片段置換(圖6和13)，可生成pYZM5UPA(圖13)。通過利用寡核苷酸YL114和YL115(SEQ IDNOs115和116)進行定點誘變，將Ascl位點導入pYZM5UPA，可生成pYZV5。為了減小pYZV5中URA3基因的3』非編碼區的大小，通過利用寡核苷酸YL114和YL115(如上所述)進行的定點誘變，將第二個Pacl位點導入該區域的中部，可生成pYZV5P。通過Pacl消化切除pYZV5P的Pacl片段，再次連接後生成pYZV16(圖13)。用Ascl消化pYZV16，可釋放適用於Δ5去飽和酶基因(「MAD5」)在解脂耶氏酵母基因組內的整合和表達的5.2kB DNA片段(SEQ IDNO117)。
適合高親和性延伸酶和Δ5去飽和酶的表達的整合載體的構建通過分別利用引物對YL61和YL62(SEQ ID NOs17和18)和YL69和YL70(SEQ ID NOs118和119)進行定點誘變，將BsiWI和Hindlll位點導入pY58(含有高山被孢黴高親和性PUFA延伸酶的編碼區；如實施例5所述)，可生成pY58BH(圖14；延伸酶基因被標記為「EL」)。將pY58BH中含有TEF::EL::XPR嵌合基因的1.7kBBsiWI/Hindlll片段連接進pYZM5CHPP(構建方法如圖6所示)的BsiWI/Hindlll位點，可生成pYZM5EL(圖14)。該質粒適用於高山被孢黴Δ5去飽和酶和高親和性PUFA延伸酶基因在解脂耶氏酵母中的整合和同步表達。
適合Δ6去飽和酶、高親和性延伸酶和Δ5去飽和酶的表達的整合載體的構建通過分別利用引物對YL77和YL78(SEQ ID NOs120和121)和YL79A和YL80A(SEQ ID NOs122和123)進行的定點誘變，將Pacl和Clal位點導入pY54(含有高山被孢黴Δ6去飽和酶；如實施例5所述)，可生成pY54PC(圖14；Δ6去飽和酶基因被標記為「MAD6」)。將pY54PC中含有TEF::MAD6::XPR嵌合基因的2kB Clal/Pacl DNA片段連接進pYZM5EL的Clal/Pacl位點，可生成pYZM5EL6(圖14)。該質粒適用於高山被孢黴Δ6去飽和酶、Δ5去飽和酶和高親和性PUFA延伸酶基因在解脂耶氏酵母基因組內的整合和同步表達。
適合被整合進入耶氏酵母基因組、適合Δ6去飽和酶、PUFA延伸酶和Δ5去飽和酶表達的DNA片段的構建採用質粒pYZV16(構建方法如圖13所示)構建含有多種表達盒的質粒。
首先，將pYZV16的3.5kB BsiWI/Pacl片段與pYZM5EL6(構建方法如圖14所示)的7.9kB BsiWI/Pacl片段連接，可生成pYZV5EL6(圖15)。用Ascl消化pYZV5EL6，可釋放適合Δ6去飽和酶、PUFA延伸酶和Δ5去飽和酶基因在解脂耶氏酵母基因組內的整合和同步表達的8.9kB DNA片段(SEQ ID NO124)。
適合被整合進耶氏酵母基因組、適合Δ6去飽和酶、PUFA延伸酶、Δ5去飽和酶和Δ17去飽和酶表達的DNA片段的構建將合成的異絲水黴Δ17去飽和酶基因插入pY5-13的Ncol/Notl位點，可生成pYSD17S(圖10A)。通過分別利用引物對YL101和YL102(SEQ ID NOs125和126)和YL103和YL104(SEQ ID NOs127和128)進行定點誘變，將Clal和Pmel位點導入pYSD17S中，可生成pYSD17SPC(圖15)。
用來源於pYSD17SPC並含有Δ17去飽和酶表達盒的1760bpClal/Pmel片段置換pYZV5EL6(圖15)的347bp Clal/Pmel片段，可生成pYZV5E6/17。用Ascl消化pYZV5E6/17，可釋放適合Δ6去飽和酶、PUFA延伸酶、Δ5去飽和酶和Δ17去飽和酶基因在解脂耶氏酵母基因組內的整合和同步表達的10.3kB DNA片段(SEQ ID NO129)。
實施例8Δ12去飽和酶已破壞菌株左通過底物補料生成純ω-3脂肪酸方面的用途本實施例描述了含有合適異源基因(例如Δ6去飽和酶、延伸酶、Δ5去飽和酶、Δ17去飽和酶，如實施例7所述)且Δ12去飽和酶已破壞的解脂耶氏酵母宿主菌株在生成ω-3 PUFAs而不共合成任何ω-6PUFAs方面的用途。補料研究是以ALA為底物進行的。結果證實其在缺乏ω-6 PUFAs條件下生成ω-3 PUFAs是可能的。
補料研究用含有Δ6去飽和酶、PUFA延伸酶、Δ5去飽和酶和Δ17去飽和酶的整合10.3kB DNA片段(SEQ ID NO129)(獲自實施例7)轉化野生型解脂耶氏酵母ATCC#76982。可構建獲得菌株「WT+4G」。接著，如實施例2所述，將菌株WT+4G中的Δ12去飽和酶破壞。可構建獲得菌株「D12KO+4G」。
於30℃條件下，在不添加底物、含有10μg LA、10ug ALA或含有各5ug的LA和ALA的3mL基本培養基中培養下表11所列四種菌株的細胞(100μl)24小時。
表11對補料研究所測試菌株的說明
如常規方法一節所述方法，通過直接轉酯化測定脂肪酸組成。在無添加底物、含有10μg LA、10ug ALA或含有各5ug的LA和ALA的培養基中生長的各菌株的脂肪酸譜如下表12所示。脂肪酸的鑑定結果為16:0、16:1、18:0、18:1(油酸)、18:2(LA)、GLA、DGLA、ALA和STA。各脂肪酸組成均以在總脂肪酸中所佔百分比的形式表示。
表12脂肪酸組成(在總脂肪酸中的％)
*nd＝不可檢出結果顯示對D12KO細胞補料ALA將導致僅產生ω-3脂肪酸(即ALA和STA)，而不生物合成任何ω-6脂肪酸(即GLA或DGLA)。
序列表110E.I.du Pont de Nemours and Company，Inc.
Yadav，Narendra120用於改變含油酵母內多不飽和脂肪酸水平的Δ-12去飽和酶基因130CL2301150US 60/4842091512003-06-30150US 60/4686771512003-05-07160130170PatentIn version 3.2210121119212DNA213人工序列220
223引物TEF5′4001agagaccggg ttggcggcg 19210221130212DNA213人工序列220
223引物TEF3′4002ttggatcctt tgaatgattc ttatactcag 30210321129212DNA213人工序列220
223引物XPR5′4003tttccgcggc ccgagattcc ggcctcttc29210421131212DNA
213人工序列220
223引物XPR3′4004tttccgcgga cacaatatct ggtcaaattt c 31210521130212DNA213人工序列220
223引物YL14005cagtgccaaa agccaaggca ctgagctcgt 30210621131212DNA213人工序列220
223引物YL24006gacgagctca gtgccttggc ttttggcact g 31210721136212DNA213人工序列220
223引物YL34007gtataagaat cattcaccat ggatccacta gttcta36210821136212DNA213人工序列220
223引物YL44008tagaactagt ggatccatgg tgaatgattc ttatac36
210921136212DNA213人工序列220
223引物YL234009atggatccac tagttaatta actagagcgg ccgcca362101021136212DNA213人工序列220
223引物YL2440010tggcggccgc tctagttaat taactagtgg atccat362101121139212DNA213人工序列220
223引物YL540011cccccctcga ggtcgatggt gtcgataagc ttgatatcg 392101221139212DNA213人工序列220
223引物YL640012cgatatcaag cttatcgaca ccatcgacct cgagggggg 392101321135212DNA213人工序列220
223引物YL940013
tggtaaataa atgatgtcga ctcaggcgac gacgg 352101421135212DNA213人工序列220
223引物YL1040014ccgtcgtcgc ctgagtcgac atcatttatt tacca 352101521137212DNA213人工序列220
223引物YL740015caaccgattt cgacagttaa ttaataattt gaatcga 372101621137212DNA213人工序列220
223引物YL840016tcgattcaaa ttattaatta actgtcgaaa tcggttg 372101721133212DNA213人工序列220
223引物YL6140017acaattccac acaacgtacg agccggaagc ata 332101821133212DNA213人工序列220
223引物YL6240018tatgcttccg gctcgtacgt tgtgtggaat tgt 332101921126212DNA213人工序列220
223簡併引物P73220
221綜合特徵222(24)..(24)223n為a，c，g或t40019tgggtcctgg gccaygartg yggnca 26210202119212PRT213人工序列220
223Δ12去飽和酶中的共有序列40020Trp Val Leu Gly His Glu Cys Gly His1 52102121130212DNA213人工序列220
223簡併引物P76220
221綜合特徵222(25)..(25)223n為a，c，g或t220
221綜合特徵222(28)..(28)223n為a，c，g或t
40021ggtggcctcc tcggcgtgrt araanggnat 302102221110212PRT213人工序列220
223Δ12去飽和酶中的共有序列220
221綜合特徵222(1)..(1)223Xaa＝Met或Ile40022Xaa Pro Phe Tyr His Ala Glu Glu Ala Thr1 5 10210232111936212DNA213解脂耶氏酵母220
221CDS222(283)..(1539)40023cgtagttata tacaagaggt agatgcgtgc tggtgttaga ggggctctca ggattaggag 60gaaaatttga cattggccct caacatataa cctcgggtgt gcctctgttt accctcagct120tttgcttgtc cccaagtcag tcacgccagg ccaaaaaggt tggtggattg acagggagaa180aaaaaaaagc ctagtgggtt taaactcgag gtaagacatt gaaatatata ccggtcggca240tcctgagtcc ctttctcgta ttccaacaga ccgaccatag aa atg gat tcg acc 294Met Asp Ser Thr1acg cag acc aac acc ggc acc ggc aag gtg gcc gtg cag ccc ccc acg 342Thr Gln Thr Asn Thr Gly Thr Gly Lys Val Ala Val Gln Pro Pro Thr5 10 15 20gcc ttc att aag ccc att gag aag gtg tcc gag ccc gtc tac gac acc 390Ala Phe Ile Lys Pro Ile Glu Lys Val Ser Glu Pro Val Tyr Asp Thr25 30 35ttt ggc aac gag ttc act cct cca gac tac tct atc aag gat att ctg 438Phe Gly Asn Glu Phe Thr Pro Pro Asp Tyr Ser Ile Lys Asp Ile Leu
40 45 50gat gcc att ccc cag gag tgc tac aag cgg tcc tac gtt aag tcc tac 486Asp Ala Ile Pro Gln Glu Cys Tyr Lys Arg Ser Tyr Val Lys Ser Tyr55 60 65tcg tac gtg gcc cga gac tgc ttc ttt atc gcc gtt ttt gcc tac atg 534Ser Tyr Val Ala Arg Asp Cys Phe Phe Ile Ala Val Phe Ala Tyr Met70 75 80gcc tac gcg tac ctg cct ctt att ccc tcg gct tcc ggc cga gct gtg 582Ala Tyr Ala Tyr Leu Pro Leu Ile Pro Ser Ala Ser Gly Arg Ala Val85 90 95 100gcc tgg gcc atg tac tcc att gtc cag ggt ctg ttt ggc acc ggt ctg 630Ala Trp Ala Met Tyr Ser Ile Val Gln Gly Leu Phe Gly Thr Gly Leu105 110 115tgg gtt ctt gcc cac gag tgt ggc cac tct gct ttc tcc gac tct aac 678Trp Val Leu Ala His Glu Cys Gly His Ser Ala Phe Ser Asp Ser Asn120 125 130acc gtc aac aac gtc acc gga tgg gtt ctg cac tcc tcc atg ctg gtc 726Thr Val Asn Asn Val Thr Gly Trp Val Leu His Ser Ser Met Leu Val135 140 145cct tac tac gcc tgg aag ctg acc cac tcc atg cac cac aag tcc act 774Pro Tyr Tyr Ala Trp Lys Leu Thr His Ser Met His His Lys Ser Thr150 155 160ggt cac ctc acc cgt gat atg gtg ttt gtg ccc aag gac cga aag gag 822Gly His Leu Thr Arg Asp Met Val Phe Val Pro Lys Asp Arg Lys Glu165 170 175 180ttt atg gag aac cga ggc gcc cat gac tgg tct gag ctt gct gag gac 870Phe Met Glu Asn Arg Gly Ala His Asp Trp Ser Glu Leu Ala Glu Asp185 190 195gct ccc ctc atg acc ctc tac ggc ctc atc acc cag cag gtg ttt gga 918Ala Pro Leu Met Thr Leu Tyr Gly Leu Ile Thr Gln Gln Val Phe Gly200 205 210tgg cct ctg tat ctg ctg tct tac gtt acc gga cag aag tac ccc aag 966Trp Pro Leu Tyr Leu Leu Ser Tyr Val Thr Gly Gln Lys Tyr Pro Lys215 220225ctc aac aaa tgg gct gtc aac cac ttc aac ccc aac gcc ccg ctg ttt1014Leu Asn Lys Trp Ala Val Asn His Phe Asn Pro Asn Ala Pro Leu Phe230 235 240gag aag aag gac tgg ttc aac atc tgg atc tct aac gtc ggt att ggt1062Glu Lys Lys Asp Trp Phe Asn Ile Trp Ile Ser Asn Val Gly Ile Gly245 250 255 260atc acc atg tcc gtc atc gca tac tcc atc aac cga tgg ggc ctg gct1110Ile Thr Met Ser Val Ile Ala Tyr Ser Ile Asn Arg Trp Gly Leu Ala265 270 275
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223引物YL2240043cccttaatta attagtccga cttggccttg gcggcc3621044211957212DNA213高山被孢黴AX46473140044atggagtcga ttgcgccatt cctcccatca aagatgccgc aagatctgtt tatggacctt 60gccaccgcta tcggtgtccg ggccgcgccc tatgtcgatc ctctcgaggc cgcgctggtg120gcccaggccg agaagtacat ccccacgatt gtccatcaca cgcgtgggtt cctggtcgcg180gtggagtcgc ctttggcccg tgagctgccg ttgatgaacc cgttccacgt gctgttgatc240gtgctcgctt atttggtcac ggtctttgtg ggcatgcaga tcatgaagaa ctttgagcgg300ttcgaggtca agacgttttc gctcctgcac aacttttgtc tggtctcgat cagcgcctac360atgtgcggtg ggatcctgta cgaggcttat caggccaact atggactgtt tgagaacgct420gctgatcata ccttcaaggg tcttcctatg gccaagatga tctggctctt ctacttctcc480aagatcatgg agtttgtcga caccatgatc atggtcctca agaagaacaa ccgccagatc540tccttcttgc acgtttacca ccacagctcc atcttcacca tctggtggtt ggtcaccttt600
gttgcaccca acggtgaagc ctacttctct gctgcgttga actcgttcat ccatgtgatc660atgtacggct actacttctt gtcggccttg ggcttcaagc aggtgtcgtt catcaagttc720tacatcacgc gctcgcagat gacacagttc tgcatgatgt cggtccagtc ttcctgggac780atgtacgcca tgaaggtcct tggccgcccc ggatacccct tcttcatcac ggctctgctt840tggttctaca tgtggaccat gctcggtctc ttctacaact tttacagaaa gaacgccaag900ttggccaagc aggccaaggc cgacgctgcc aaggagaagg caaggaagtt gcagtaa 95721045211318212PRT213高山被孢黴AX46473140045Met Glu Ser Ile Ala Pro Phe Leu Pro Ser Lys Met Pro Gln Asp Leu1 5 10 15Phe Met Asp Leu Ala Thr Ala Ile Gly Val Arg Ala Ala Pro Tyr Val20 25 30Asp Pro Leu Glu Ala Ala Leu Val Ala Gln Ala Glu Lys Tyr Ile Pro35 40 45Thr Ile Val His His Thr Arg Gly Phe Leu Val Ala Val Glu Ser Pro50 55 60Leu Ala Arg Glu Leu Pro Leu Met Asn Pro Phe His Val Leu Leu Ile65 70 75 80Val Leu Ala Tyr Leu Val Thr Val Phe Val Gly Met Gln Ile Met Lys85 90 95Asn Phe Glu Arg Phe Glu Val Lys Thr Phe Ser Leu Leu His Asn Phe100 105 110Cys Leu Val Ser Ile Ser Ala Tyr Met Cys Gly Gly Ile Leu Tyr Glu115 120 125Ala Tyr Gln Ala Asn Tyr Gly Leu Phe Glu Asn Ala Ala Asp His Thr130 135 140Phe Lys Gly Leu Pro Met Ala Lys Met Ile Trp Leu Phe Tyr Phe Ser145 150 155 160
Lys Ile Met Glu Phe Val Asp Thr Met Ile Met Val Leu Lys Lys Asn165 170 175Asn Arg Gln Ile Ser Phe Leu His Val Tyr His His Ser Ser Ile Phe180 185 190Thr Ile Trp Trp Leu Val Thr Phe Val Ala Pro Asn Gly Glu Ala Tyr195 200 205Phe Ser Ala Ala Leu Asn Ser Phe Ile His Val Ile Met Tyr Gly Tyr210 215 220Tyr Phe Leu Ser Ala Leu Gly Phe Lys Gln Val Ser Phe Ile Lys Phe225 230 235 240Tyr Ile Thr Arg Ser Gln Met Thr Gln Phe Cys Met Met Ser Val Gln245 250 255Ser Ser Trp Asp Met Tyr Ala Met Lys Val Leu Gly Arg Pro Gly Tyr260 265 270Pro Phe Phe Ile Thr Ala Leu Leu Trp Phe Tyr Met Trp Thr Met Leu275 280 285Gly Leu Phe Tyr Asn Phe Tyr Arg Lys Asn Ala Lys Leu Ala Lys Gln290 295 300Ala Lys Ala Asp Ala Ala Lys Glu Lys Ala Arg Lys Leu Gln305 310 315210462111077212DNA213異絲水黴40046atggctgagg ataagaccaa ggtcgagttc cctaccctga ctgagctgaa gcactctatc 60cctaacgctt gctttgagtc caacctcgga ctctcgctct actacactgc ccgagcgatc120ttcaacgcat ctgcctctgc tgctctgctc tacgctgccc gatctactcc cttcattgcc180gataacgttc tgctccacgc tctggtttgc gccacctaca tctacgtgca gggtgtcatc240ttctggggtt tctttaccgt cggtcacgac tgtggtcact ctgccttctc ccgataccac300
tccgtcaact tcatcattgg ctgcatcatg cactctgcca ttctgactcc cttcgagtcc 360tggcgagtga cccaccgaca ccatcacaag aacactggca acattgataa ggacgagatc 420ttctaccctc atcggtccgt caaggacctc caggacgtgc gacaatgggt ctacaccctc 480ggaggtgctt ggtttgtcta cctgaaggtc ggatatgctc ctcgaaccat gtcccacttt 540gacccctggg accctctcct gcttcgacga gcctccgctg tcatcgtgtc cctcggagtc 600tgggctgcct tcttcgctgc ctacgcctac ctcacatact cgctcggctt tgccgtcatg 660ggcctctact actatgctcc tctctttgtc tttgcttcgt tcctcgtcat tactaccttc 720ttgcatcaca acgacgaagc tactccctgg tacggtgact cggagtggac ctacgtcaag 780ggcaacctga gctccgtcga ccgatcgtac ggagctttcg tggacaacct gtctcaccac 840attggcaccc accaggtcca tcacttgttc cctatcattc cccactacaa gctcaacgaa 900gccaccaagc actttgctgc cgcttaccct cacctcgtga gacgtaacga cgagcccatc 960attactgcct tcttcaagac cgctcacctc tttgtcaact acggagctgt gcccgagact1020gctcagattt tcaccctcaa agagtctgcc gctgcagcca aggccaagag cgactaa 107721047211358212PRT213異絲水黴40047Met Ala Glu Asp Lys Thr Lys Val Glu Phe Pro Thr Leu Thr Glu Leu1 5 10 15Lys His Ser Ile Pro Asn Ala Cys Phe Glu Ser Asn Leu Gly Leu Ser20 25 30Leu Tyr Tyr Thr Ala Arg Ala Ile Phe Asn Ala Ser Ala Ser Ala Ala35 40 45Leu Leu Tyr Ala Ala Arg Ser Thr Pro Phe Ile Ala Asp Asn Val Leu50 55 60Leu His Ala Leu Val Cys Ala Thr Tyr Ile Tyr Val Gln Gly Val Ile65 70 75 80Phe Trp Gly Phe Phe Thr Val Gly His Asp Cys Gly His Ser Ala Phe85 90 95
Ser Arg Tyr His Ser Val Asn Phe Ile Ile Gly Cys Ile Met His Ser100 105 110Ala Ile Leu Thr Pro Phe Glu Ser Trp Arg Val Thr His Arg His His115 120 125His Lys Asn Thr Gly Asn Ile Asp Lys Asp Glu Ile Phe Tyr Pro His130 135 140Arg Ser Val Lys Asp Leu Gln Asp Val Arg Gln Trp Val Tyr Thr Leu145 150 155 160Gly Gly Ala Trp Phe Val Tyr Leu Lys Val Gly Tyr Ala Pro Arg Thr165 170 175Met Ser His Phe Asp Pro Trp Asp Pro Leu Leu Leu Arg Arg Ala Ser180 185 190Ala Val Ile Val Ser Leu Gly Val Trp Ala Ala Phe Phe Ala Ala Tyr195 200 205Ala Tyr Leu Thr Tyr Ser Leu Gly Phe Ala Val Met Gly Leu Tyr Tyr210 215 220Tyr Ala Pro Leu Phe Val Phe Ala Ser Phe Leu Val Ile Thr Thr Phe225 230 235 240Leu His His Asn Asp Glu Ala Thr Pro Trp Tyr Gly Asp Ser Glu Trp245 250 255Thr Tyr Val Lys Gly Asn Leu Ser Ser Val Asp Arg Ser Tyr Gly Ala260 265 270Phe Val Asp Asn Leu Ser His His Ile Gly Thr His Gln Val His His275 280 285Leu Phe Pro Ile Ile Pro His Tyr Lys Leu Asn Glu Ala Thr Lys His290 295 300Phe Ala Ala Ala Tyr Pro His Leu Val Arg Arg Asn Asp Glu Pro Ile305 310 315 320Ile Thr Ala Phe Phe Lys Thr Ala His Leu Phe Val Asn Tyr Gly Ala325 330 335
Val Pro Glu Thr Ala Gln Ile Phe Thr Leu Lys Glu Ser Ala Ala Ala340 345 350Ala Lys Ala Lys Ser Asp35521048211105212DNA213人工序列220
223引物D17-1A40048catggctgag gataagacca aggtcgagtt ccctaccctg actgagctga agcactctat 60ccctaacgct tgctttgagt ccaacctcgg actctcgctc tacta 10521049211106212DNA213人工序列220
223引物D17-1B40049cagtgtagta gagcgagagt ccgaggttgg actcaaagca agcgttaggg atagagtgct 60tcagctcagt cagggtaggg aactcgacct tggtcttatc ctcagc10621050211106212DNA213人工序列220
223引物D17-2A40050cactgcccga gcgatcttca acgcatctgc ctctgctgct ctgctctacg ctgcccgatc 60tactcccttc attgccgata acgttctgct ccacgctctg gtttgc10621051211106212DNA213人工序列
220
223引物D17-2B40051gtggcgcaaa ccagagcgtg gagcagaacg ttatcggcaa tgaagggagt agatcgggca 60gcgtagagca gagcagcaga ggcagatgcg ttgaagatcg ctcggg10621052211105212DNA213人工序列220
223引物D17-3A40052gccacctaca tctacgtgca gggtgtcatc ttctggggtt tctttaccgt cggtcacgac 60tgtggtcact ctgccttctc ccgataccac tccgtcaact tcatc 10521053211105212DNA213人工序列220
223引物D17-3B40053ccaatgatga agttgacgga gtggtatcgg gagaaggcag agtgaccaca gtcgtgaccg 60acggtaaaga aaccccagaa gatgacaccc tgcacgtaga tgtag 10521054211105212DNA213人工序列220
223引物D17-4A40054attggctgca tcatgcactc tgccattctg actcccttcg agtcctggcg agtgacccac 60cgacaccatc acaagaacac tggcaacatt gataaggacg agatc 10521055211105212DNA213人工序列220
223引物D17-4B40055tagaagatct cgtccttatc aatgttgcca gtgttcttgt gatggtgtcg gtgggtcact 60cgccaggact cgaagggagt cagaatggca gagtgcatga tgcag 10521056211105212DNA213人工序列220
223引物D17-5A40056acgagatctt ctaccctcat cggtccgtca aggacctcca ggacgtgcga caatgggtct 60acaccctcgg aggtgcttgg tttgtctacc tgaaggtcgg atatg 10521057211107212DNA213人工序列220
223引物D17-5B40057aggagcatat ccgaccttca ggtagacaaa ccaagcacct ccgagggtgt agacccattg 60tcgcacgtcc tggaggtcct tgacggaccg atgagggtag aagatct 10721058211105212DNA213人工序列220
223引物D17-6A40058ctcctcgaac catgtcccac tttgacccct gggaccctct cctgcttcga cgagcctccg 60ctgtcatcgt gtccctcgga gtctgggctg ccttcttcgc tgcct 10521059211106212DNA213人工序列220
223引物D17-6B
40059aggcgtaggc agcgaagaag gcagcccaga ctccgaggga cacgatgaca gcggaggctc 60gtcgaagcag gagagggtcc caggggtcaa agtgggacat ggttcg10621060211104212DNA213人工序列220
223引物D17-7A40060acgcctacct cacatactcg ctcggctttg ccgtcatggg cctctactac tatgctcctc 60tctttgtctt tgcttcgttc ctcgtcatta ctaccttctt gcat 10421061211103212DNA213人工序列220
223引物D17-7B40061ttgtgatgca agaaggtagt aatgacgagg aacgaagcaa agacaaagag aggagcatag 60tagtagaggc ccatgacggc aaagccgagc gagtatgtga ggt 10321062211106212DNA213人工序列220
223引物D17-8A40062cacaacgacg aagctactcc ctggtacggt gactcggagt ggacctacgt caagggcaac 60ctgagctccg tcgaccgatc gtacggagct ttcgtggaca acctgt10621063211106212DNA213人工序列220
223引物D17-8B
40063gtgagacagg ttgtccacga aagctccgta cgatcggtcg acggagctca ggttgccctt 60gacgtaggtc cactccgagt caccgtacca gggagtagct tcgtcg10621064211102212DNA213人工序列220
223引物D17-9A40064ctcaccacat tggcacccac caggtccatc acttgttccc tatcattccc cactacaagc 60tcaacgaagc caccaagcac tttgctgccg cttaccctca cc10221065211102212DNA213人工序列220
223引物D17-9B40065cacgaggtga gggtaagcgg cagcaaagtg cttggtggct tcgttgagct tgtagtgggg 60aatgataggg aacaagtgat ggacctggtg ggtgccaatg tg1022106621176212DNA213人工序列220
223引物D17-10A40066tcgtgagacg taacgacgag cccatcatta ctgccttctt caagaccgct cacctctttg 60tcaactacgg agctgt 762106721176212DNA213人工序列220
223引物D17-10B40067
cgggcacagc tccgtagttg acaaagaggt gagcggtctt gaagaaggca gtaatgatgg 60gctcgtcgtt acgtct 762106821167212DNA213人工序列220
223引物D17-11A40068gcccgagact gctcagattt tcaccctcaa agagtctgcc gctgcagcca aggccaagag 60cgactaa672106921162212DNA213人工序列220
223引物D17-11B40069ttagtcgctc ttggccttgg ctgcagcggc agactctttg agggtgaaaa tctgagcagt 60ct 622107021132212DNA213人工序列220
223引物D17-140070tttccatggc tgaggataag accaaggtcg ag 322107121134212DNA213人工序列220
223引物D17-4R40071ccctagaaga tctcgtcctt atcaatgttg ccag 34
2107221127212DNA213人工序列220
223引物D17-540072cccacgagat cttctaccct catcggt272107321124212DNA213人工序列220
223引物D17-8D40073gaaagctccg tacgatcggt cgac 242107421124212DNA213人工序列220
223引物D17-8U40074gtcgaccgat cgtacggagc tttc 242107521134212DNA213人工序列220
223引物D17-1140075aaagcggccg cttagtcgct cttggccttg gctg 342107621136212DNA213人工序列220
223引物YL5340076
gccaagtcgg actaagctgc taactagagc ggccgc 362107721136212DNA213人工序列220
223引物YL5440077gcggccgctc tagttagcag cttagtccga cttggc 362107821135212DNA213人工序列220
223引物KU540078tttgcccggg cgagtatctg tctgactcgt cattg 352107921133212DNA213人工序列220
223引物KU340079aaagcccggg caaaggcctg tttctcggtg tac 33210802111710212DNA213解脂耶氏酵母40080gtcgacgagt atctgtctga ctcgtcattg ccgcctttgg agtacgactc caactatgag 60tgtgcttgga tcactttgac gatacattct tcgttggagg ctgtgggtct gacagctgcg 120ttttcggcgc ggttggccga caacaatatc agctgcaacg tcattgctgg ctttcatcat 180gatcacattt ttgtcggcaa aggcgacgcc cagagagcca ttgacgttct ttctaatttg 240gaccgatagc cgtatagtcc agtctatcta taagttcaac taactcgtaa ctattaccat 300aacatatact tcactgcccc agataaggtt ccgataaaaa gttctgcaga ctaaatttat 360
ttcagtctcc tcttcaccac caaaatgccc tcctacgaag ctcgagctaa cgtccacaag 420tccgcctttg ccgctcgagt gctcaagctc gtggcagcca agaaaaccaa cctgtgtgct 480tctctggatg ttaccaccac caaggagctc attgagcttg ccgataaggt cggaccttat 540gtgtgcatga tcaagaccca tatcgacatc attgacgact tcacctacgc cggcactgtg 600ctccccctca aggaacttgc tcttaagcac ggtttcttcc tgttcgagga cagaaagttc 660gcagatattg gcaacactgt caagcaccag tacaagaacg gtgtctaccg aatcgccgag 720tggtccgata tcaccaacgc ccacggtgta cccggaaccg gaatcattgc tggcctgcga 780gctggtgccg aggaaactgt ctctgaacag aagaaggagg acgtctctga ctacgagaac 840tcccagtaca aggagttcct ggtcccctct cccaacgaga agctggccag aggtctgctc 900atgctggccg agctgtcttg caagggctct ctggccactg gcgagtactc caagcagacc 960attgagcttg cccgatccga ccccgagttt gtggttggct tcattgccca gaaccgacct1020aagggcgact ctgaggactg gcttattctg acccccgggg tgggtcttga cgacaaggga1080gacgctctcg gacagcagta ccgaactgtt gaggatgtca tgtctaccgg aacggatatc1140ataattgtcg gccgaggtct gtacggccag aaccgagatc ctattgagga ggccaagcga1200taccagaagg ctggctggga ggcttaccag aagattaact gttagaggtt agactatgga1260tatgtcattt aactgtgtat atagagagcg tgcaagtatg gagcgcttgt tcagcttgta1320tgatggtcag acgacctgtc tgatcgagta tgtatgatac tgcacaacct gtgtatccgc1380atgatctgtc caatggggca tgttgttgtg tttctcgata cggagatgct gggtacaagt1440agctaatacg attgaactac ttatacttat atgaggcttg aagaaagctg acttgtgtat1500gacttattct caactacatc cccagtcaca ataccaccac tgcactacca ctacaccaaa1560accatgatca aaccacccat ggacttcctg gaggcagaag aacttgttat ggaaaagctc1620aagagagaga agccaagata ctatcaagac atgtgtcgca acttcaagga ggaccaagct1680ctgtacaccg agaaacaggc ctttgtcgac171021081211286212PRT213解脂耶氏酵母40081Met Pro Ser Tyr Glu Ala Arg Ala Asn Val His Lys Ser Ala Phe Ala1 5 10 15
Ala Arg Val Leu Lys Leu Val Ala Ala Lys Lys Thr Asn Leu Cys Ala20 25 30Ser Leu Asp Val Thr Thr Thr Lys Glu Leu Ile Glu Leu Ala Asp Lys35 40 45Val Gly Pro Tyr Val Cys Met Ile Lys Thr His Ile Asp Ile Ile Asp50 55 60Asp Phe Thr Tyr Ala Gly Thr Val Leu Pro Leu Lys Glu Leu Ala Leu65 70 75 80Lys His Gly Phe Phe Leu Phe Glu Asp Arg Lys Phe Ala Asp Ile Gly85 90 95Asn Thr Val Lys His Gln Tyr Lys Asn Gly Val Tyr Arg Ile Ala Glu100 105 110Trp Ser Asp Ile Thr Asn Ala His Gly Val Pro Gly Thr Gly Ile Ile115 120 125Ala Gly Leu Arg Ala Gly Ala Glu Glu Thr Val Ser Glu Gln Lys Lys130 135 140Glu Asp Val Ser Asp Tyr Glu Asn Ser Gln Tyr Lys Glu Phe Leu Val145 150 155 160Pro Ser Pro Asn Glu Lys Leu Ala Arg Gly Leu Leu Met Leu Ala Glu165 170 175Leu Ser Cys Lys Gly Ser Leu Ala Thr Gly Glu Tyr Ser Lys Gln Thr180 185 190Ile Glu Leu Ala Arg Ser Asp Pro Glu Phe Val Val Gly Phe Ile Ala195 200 205Gln Asn Arg Pro Lys Gly Asp Ser Glu Asp Trp Leu Ile Leu Thr Pro210 215 220Gly Val Gly Leu Asp Asp Lys Gly Asp Ala Leu Gly Gln Gln Tyr Arg225 230 235 240Thr Val Glu Asp Val Met Ser Thr Gly Thr Asp Ile Ile Ile Val Gly245 250 255
Arg Gly Leu Tyr Gly Gln Asn Arg Asp Pro Ile Glu Glu Ala Lys Arg260 265 270Tyr Gln Lys Ala Gly Trp Glu Ala Tyr Gln Lys Ile Asn Cys275 280 2852108221135212DNA213人工序列220
223引物KI540082agagcggccg catgggagaa gtgggaccca caaac 352108321138212DNA213人工序列220
223引物KI340083gtggcggccg ctcaaatgtc gttattgtac caataaac 38210842111152212DNA213Impatients balsama40084atgggagaag tgggacccac aaaccgaacc aaaaccaagt tggacaagca acaagaatcc 60gaaaacaggg ttcctcacga gccacctcca ttcacactaa gtgaccttaa gaaagccatc120ccaccccatt gcttcgagcg ctccctcgtg aaatcattct accacgtgat tcacgacatt180atcatcctgt cctttttcta ctatgtcgcc gccaattaca tccccatgct accccaaaac240ctccgttacg ttgcatggcc aatttattgg gccatccaag gctgtgtcca acttggtata300ttggtcttag gccatgaatg cggccaccac gccttcagcg actaccaatg ggtagacgac360atggtcgggt tcgtcctcca ctcgtcccaa ttgattccct acttctcatg gaaacatagc420caccgtcgcc accactccaa cacggcctcc atcgagcgcg acgaggtcta cccgcccgcg480tacaaaaacg acctgccgtg gttcgccaaa tacctacgca accccgtcgg tcgtttcctc540
atgattttcg gggcgctact gttcggctgg ccgtcgtacc ttctgttcaa cgcgaacggc 600cgtctctacg accgcttcgc ttcccactac gacccgcaat ccccgatctt caacaaccgc 660gagaggctgc aagtgatcgc gtccgacgtc gggctcgtct tcgcgtactt tgtcctgtac 720aagatcgcgc tggccaaggg atttgtgtgg ttaatttgtg tgtatggcgt cccgtacgtg 780atcctcaacg ggcttatcgt cttgatcacg ttcctacagc acacgcaccc gaatctgccc 840cgttacgacc tttccgagtg ggactggctt aggggagccc tgtcgactgt ggaccgcgat 900tacgggatgt tgaataaggt gttccataac gtgacggaca cgcacttggt gcatcatttg 960ttcacgacca tgccacatta tcgcgccaag gaggcgaccg aggtgattaa accgatattg1020ggagactact ataagtttga cgacactccg tttctcaaag cgttgtggaa ggacatggga1080aagtgtattt atgtggagtc ggacgtgcct ggcaagaaca agggagttta ttggtacaat1140aacgacattt ga115221085211383212PRT213Impatients balsama40085Met Gly Glu Val Gly Pro Thr Asn Arg Thr Lys Thr Lys Leu Asp Lys1 5 10 15Gln Gln Glu Ser Glu Asn Arg Val Pro His Glu Pro Pro Pro Phe Thr20 25 30Leu Ser Asp Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Glu Arg Ser35 40 45Leu Val Lys Ser Phe Tyr His Val Ile His Asp Ile Ile Ile Leu Ser50 55 60Phe Phe Tyr Tyr Val Ala Ala Asn Tyr Ile Pro Met Leu Pro Gln Asn65 70 75 80Leu Arg Tyr Val Ala Trp Pro Ile Tyr Trp Ala Ile Gln Gly Cys Val85 90 95Gln Leu Gly Ile Leu Val Leu Gly His Glu Cys Gly His His Ala Phe100 105 110
Ser Asp Tyr Gln Trp Val Asp Asp Met Val Gly Phe Val Leu His Ser115 120 125Ser Gln Leu Ile Pro Tyr Phe Ser Trp Lys His Ser His Arg Arg His130 135 140His Ser Asn Thr Ala Ser Ile Glu Arg Asp Glu Val Tyr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Lys Asn Asp Leu Pro Trp Phe Ala Lys Tyr Leu Arg Asn Pro Val165 170 175Gly Arg Phe Leu Met Ile Phe Gly Ala Leu Leu Phe Gly Trp Pro Ser180 185 190Tyr Leu Leu Phe Asn Ala Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Arg Phe Ala Ser195 200 205His Tyr Asp Pro Gln Ser Pro Ile Phe Asn Asn Arg Glu Arg Leu Gln210 215 220Val Ile Ala Ser Asp Val Gly Leu Val Phe Ala Tyr Phe Val Leu Tyr225 230 235 240Lys Ile Ala Leu Ala Lys Gly Phe Val Trp Leu Ile Cys Val Tyr Gly245 250 255Val Pro Tyr Val Ile Leu Asn Gly Leu Ile Val Leu Ile Thr Phe Leu260 265 270Gln His Thr His Pro Asn Leu Pro Arg Tyr Asp Leu Ser Glu Trp Asp275 280 285Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ser Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Met Leu290 295 300Asn Lys Val Phe His Asn Val Thr Asp Thr His Leu Val His His Leu305 310 315 320Phe Thr Thr Met Pro His Tyr Arg Ala Lys Glu Ala Thr Glu Val Ile325 330 335Lys Pro Ile Leu Gly Asp Tyr Tyr Lys Phe Asp Asp Thr Pro Phe Leu340 345 350
Lys Ala Leu Trp Lys Asp Met Gly Lys Cys Ile Tyr Val Glu Ser Asp355 360 365Val Pro Gly Lys Asn Lys Gly Val Tyr Trp Tyr Asn Asn Asp Ile370 375 3802108621134212DNA213人工序列220
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223引物KTI340087ggtctcgaga tctccaccgc ggacacaata tctggtca38210882111756212DNA213人工序列220
223TEF/接合酶/XPR嵌合基因40088gaccgggttg gcggcgtatt tgtgtcccaa aaaacagccc caattgcccc aattgacccc 60aaattgaccc agtagcgggc ccaaccccgg cgagagcccc cttcacccca catatcaaac 120ctcccccggt tcccacactt gccgttaagg gcgtagggta ctgcagtctg gaatctacgc 180ttgttcagac tttgtactag tttctttgtc tggccatccg ggtaacccat gccggacgca 240aaatagacta ctgaaaattt ttttgctttg tggttgggac tttagccaag ggtataaaag 300accaccgtcc ccgaattacc tttcctcttc ttttctctct ctccttgtca actcacaccc 360gaaatcgtta agcatttcct tctgagtata agaatcattc aaaggatcca ctagttctag 420
agcggccgca tgggagaagt gggacccaca aaccgaacca aaaccaagtt ggacaagcaa 480caagaatccg aaaacagggt tcctcacgag ccacctccat tcacactaag tgaccttaag 540aaagccatcc caccccattg cttcgagcgc tccctcgtga aatcattcta ccacgtgatt 600cacgacatta tcatcctgtc ctttttctac tatgtcgccg ccaattacat ccccatgcta 660ccccaaaacc tccgttacgt tgcatggcca atttattggg ccatccaagg ctgtgtccaa 720cttggtatat tggtcttagg ccatgaatgc ggccaccacg ccttcagcga ctaccaatgg 780gtagacgaca tggtcgggtt cgtcctccac tcgtcccaat tgattcccta cttctcatgg 840aaacatagcc accgtcgcca ccactccaac acggcctcca tcgagcgcga cgaggtctac 900ccgcccgcgt acaaaaacga cctgccgtgg ttcgccaaat acctacgcaa ccccgtcggt 960cgtttcctca tgattttcgg ggcgctactg ttcggctggc cgtcgtacct tctgttcaac1020gcgaacggcc gtctctacga ccgcttcgct tcccactacg acccgcaatc cccgatcttc1080aacaaccgcg agaggctgca agtgatcgcg tccgacgtcg ggctcgtctt cgcgtacttt1140gtcctgtaca agatcgcgct ggccaaggga tttgtgtggt taatttgtgt gtatggcgtc1200ccgtacgtga tcctcaacgg gcttatcgtc ttgatcacgt tcctacagca cacgcacccg1260aatctgcccc gttacgacct ttccgagtgg gactggctta ggggagccct gtcgactgtg1320gaccgcgatt acgggatgtt gaataaggtg ttccataacg tgacggacac gcacttggtg1380catcatttgt tcacgaccat gccacattat cgcgccaagg aggcgaccga ggtgattaaa1440ccgatattgg gagactacta taagtttgac gacactccgt ttctcaaagc gttgtggaag1500gacatgggaa agtgtattta tgtggagtcg gacgtgcctg gcaagaacaa gggagtttat1560tggtacaata acgacatttg agcggccgcc accgcggccc gagattccgg cctcttcggc1620cgccaagcga cccgggtgga cgtctagagg tacctagcaa ttaacagata gtttgccggt1680gataattctc ttaacctccc acactccttt gacataacga tttatgtaac gaaactgaaa1740tttgaccaga tattgt175621089211383212PRT213人工序列220
223TEF/接合酶/XPR嵌合蛋白40089Met Gly Glu Val Gly Pro Thr Asn Arg Thr Lys Thr Lys Leu Asp Lys
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Ala Gly Ser Pro Arg Leu Arg Ala Tyr Met Leu Arg Ile Gly Leu Asp260 265 270Gln Leu Tyr Gln Ser Leu Val Asp Gly Asn Phe Asp Asp Ala Ala Trp275 280 285Ala Gln Gly Arg Cys Asp Ala Ile Val Arg Ser Gly Ala Gly Thr Val290 295 300Gly Arg Thr Gln Ile Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val Trp Thr Asp Gly305 310 315 320Cys Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Gly Asn Arg Arg Pro Ser Thr Arg325 330 335Pro Arg Ala Lys Glu3402109421134212DNA213人工序列220
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223引物KTH340095tttagatctc caccgcggac acaatatctg g31210962111650212DNA213人工序列220
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tctcctcttc accaccaaaa tgccctccta cgaagctcga g 40121099211568212DNA213解脂耶氏酵母40099atcataattg tcggccgagg tctgtacggc cagaaccgag atcctattga ggaggccaag 60cgataccaga aggctggctg ggaggcttac cagaagatta actgttagag gttagactat 120ggatatgtca tttaactgtg tatatagaga gcgtgcaagt atggagcgct tgttcagctt 180gtatgatggt cagacgacct gtctgatcga gtatgtatga tactgcacaa cctgtgtatc 240cgcatgatct gtccaatggg gcatgttgtt gtgtttctcg atacggagat gctgggtaca 300agtagctaat acgattgaac tacttatact tatatgaggc ttgaagaaag ctgacttgtg 360tatgacttat tctcaactac atccccagtc acaataccac cactgcacta ccactacacc 420aaaaccatga tcaaaccacc catggacttc ctggaggcag aagaacttgt tatggaaaag 480ctcaagagag agaagccaag atactatcaa gacatgtgtc gcaacttcaa ggaggaccaa 540gctctgtaca ccgagaaaca ggcctttg 56821010021136212DNA213人工序列220
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cattaatgca gctggcgcgc cacgacaggt ttcccg 3621011221134212DNA213人工序列220
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223引物YL114
400115tgatagtatc ttggcgcgcc ttctctctct tgagc 3521011621135212DNA213人工序列220
223引物YL115400116gctcaagaga gagaaggcgc gccaagatac tatca 352101172115218212DNA213人工序列220
223用於整合和表達Δ-5去飽和酶基因的5218bp片段400117tatcacatca cgctctcatc aagaatactt cttgagaacc gtggagaccg gggttcgatt 60ccccgtatcg gagtgtttat tttttgctca accataccct ggggtgtgtt ctgtggagca120ttctcacttt tggtaaacga cattgcttca agtgcagcgg aatcaaaaag tataaagtgg180gcagcgagta tacctgtaca gactgtaggc gataactcaa tccaattacc ccccacaaca240tgactggcca aactgatctc aagactttat tgaaatcagc aacaccgatt ctcaatgaag300gcacatactt cttctgcaac attcacttga cgcctaaagt tggtgagaaa tggaccgaca360agacatattc tgctatccac ggactgttgc ctgtgtcggt ggctacaata cgtgagtcag420aagggctgac ggtggtggtt cgtacgttgt gtggaagctt gtgagcggat aacaatttca480cacaggaaac agctatgacc atgattacgc caagctcgaa attaaccctc actaaaggga540acaaaagctg gagctccacc gcggacacaa tatctggtca aatttcagtt tcgttacata600aatcgttatg tcaaaggagt gtgggaggtt aagagaatta tcaccggcaa actatctgtt660aattgctagg tacctctaga cgtccacccg ggtcgcttgg cggccgaaga ggccggaatc720tcgggccgcg gtggcggccg cctactcttc cttgggacgg agtccaagaa cacgcaagtg780ctccaaatgt gaagcaaatg cttgccaaaa cgtatccttg acaaggtatg gaaccttgta840ctcgctgcag gtgttcttga tgatggccag aatatcggga taatggtgct gcgacacgtt900ggggaacaga tggtgcacag ccggtagttc aagctgccag tgatgctggt ccagaggtgc960
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223引物YL80A400123tctcctgaat tctgcatcga tgggctgcag gaat 342101242118894212DNA213人工序列220
223用於整合和表達Δ-6和Δ-5去飽和酶基因和延伸酶基因的8894bp片段400124tatcacatca cgctctcatc aagaatactt cttgagaacc gtggagaccg gggttcgatt 60ccccgtatcg gagtgtttat tttttgctca accataccct ggggtgtgtt ctgtggagca120ttctcacttt tggtaaacga cattgcttca agtgcagcgg aatcaaaaag tataaagtgg180
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223引物YL103400127atgatgactc aggcgtttaa acgacggaat tcctgc 3621012821136212DNA213人工序列220
223引物YL104400128gcaggaattc cgtcgtttaa acgcctgagt catcat 3621012921110328212DNA213人工序列220
223用於整合和表達Δ-6、Δ-5和Δ-17去飽和酶基因和延伸酶基因的10328bp片段400129tatcacatca cgctctcatc aagaatactt cttgagaacc gtggagaccg gggttcgatt 60ccccgtatcg gagtgtttat tttttgctca accataccct ggggtgtgtt ctgtggagca120ttctcacttt tggtaaacga cattgcttca agtgcagcgg aatcaaaaag tataaagtgg180gcagcgagta tacctgtaca gactgtaggc gataactcaa tccaattacc ccccacaaca240tgactggcca aactgatctc aagactttat tgaaatcagc aacaccgatt ctcaatgaag300gcacatactt cttctgcaac attcacttga cgcctaaagt tggtgagaaa tggaccgaca360agacatattc tgctatccac ggactgttgc ctgtgtcggt ggctacaata cgtgagtcag420aagggctgac ggtggtggtt cgtacgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca480caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agctcgaaat taaccctcac taaagggaac540aaaagctgga gctccaccgc ggacacaata tctggtcaaa tttcagtttc gttacataaa600tcgttatgtc aaaggagtgt gggaggttaa gagaattatc accggcaaac tatctgttaa660ttgctaggta cctctagacg tccacccggg tcgcttggcg gccgaagagg ccggaatctc720gggccgcggt ggcggccgct tactgcaact tccttgcctt ctccttggca gcgtcggcct780tggcctgctt ggccaacttg gcgttctttc tgtaaaagtt gtagaagaga ccgagcatgg840tccacatgta gaaccaaagc agagccgtga tgaagaaggg gtatccgggg cggccaagga900ccttcatggc gtacatgtcc caggaagact ggaccgacat catgcagaac tgtgtcatct960gcgagcgcgt gatgtagaac ttgatgaacg acacctgctt gaagcccaag gccgacaaga 1020agtagtagcc gtacatgatc acatggatga acgagttcaa cgcagcagag aagtaggctt 1080caccgttggg tgcaacaaag gtgaccaacc accagatggt gaagatggag ctgtggtggt 1140aaacgtgcaa gaaggagatc tggcggttgt tcttcttgag gaccatgatc atggtgtcga 1200caaactccat gatcttggag aagtagaaga gccagatcat cttggccata ggaagaccct 1260tgaaggtatg atcagcagcg ttctcaaaca gtccatagtt ggcctgataa gcctcgtaca 1320ggatcccacc gcacatgtag gcgctgatcg agaccagaca aaagttgtgc aggagcgaaa 1380acgtcttgac ctcgaaccgc tcaaagttct tcatgatctg catgcccaca aagaccgtga 1440ccaaataagc gagcacgatc aacagcacgt ggaacgggtt catcaacggc agctcacggg 1500ccaaaggcga ctccaccgcg accaggaacc cacgcgtgtg atggacaatc gtggggatgt 1560acttctcggc ctgggccacc agcgcggcct cgagaggatc gacatagggc gcggcccgga 1620caccgatagc ggtggcaagg tccataaaca gatcttgcgg catctttgat gggaggaatg 1680
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21013021110212DNA213解脂耶氏酵母220
221綜合特徵222(8)..(8)223n為a，c，g或t400130mammatgnhs10
權利要求
1.編碼耶氏酵母屬Δ12去飽和酶的分離核酸分子，選自(a)編碼SEQ ID NO24所示胺基酸序列的分離核酸分子；(b)可在下述雜交條件下與(a)雜交的分離核酸分子，所述雜交條件為0.1×SSC、0.1％SDS、65℃，並相繼用2×SSC、0.1％SDS和0.1×SSC、0.1％SDS洗滌；或與(a)或(b)互補的分離核酸分子。
2.權利要求1的分離核酸分子，如SEQ ID NO23所示。
3.由權利要求1所述分離核酸分子編碼的多肽。
4.權利要求3的多肽，如SEQ ID NO24所示。
5.一種分離核酸分子，含有編碼至少419個胺基酸組成的Δ12去飽和酶的第一種核苷酸序列，基於Clustal比對法發現該419個胺基酸與具有SEQ ID NO24所示序列的多肽具有至少53％的同一性；或者含有第二種核苷酸序列，該序列包括上述第一種核苷酸序列的互補序列。
6.含有與合適的調節序列可操作連接的權利要求1-2中任意一項所述的分離核酸分子的嵌合基因。
7.包括權利要求6所述嵌合基因的轉化宿主細胞。
8.權利要求7的轉化宿主細胞，選自植物、藻類、細菌、酵母和真菌。
9.權利要求8的轉化宿主細胞，其中酵母為含油酵母。
10.權利要求9的轉化宿主細胞，其中含油酵母選自耶氏酵母屬、被孢黴屬、假絲酵母屬、紅酵母屬、紅冬孢酵母屬、隱球酵母屬、絲孢酵母屬和油脂酵母屬。
11.權利要求10的轉化宿主細胞，其中含油酵母為耶氏酵母種。
12.權利要求11的轉化宿主細胞，選自解脂耶氏酵母ATCC#20362、解脂耶氏酵母ATCC#8862、解脂耶氏酵母ATCC#18944、解脂耶氏酵母ATCC#76982和解脂耶氏酵母LGAM S(7)1。
13.生成亞油酸的方法，包括a)提供微生物宿主細胞，該細胞含有(i)權利要求6所述編碼Δ12去飽和酶多肽的嵌合基因；和(ii)由油酸組成的去飽和酶底物源；b)在可表達Δ12去飽和酶多肽編碼基因並使油酸轉化為亞油酸的條件下培養步驟(a)的微生物宿主細胞；並c)任選地回收步驟(b)的亞油酸。
14.生成ω-3脂肪酸的方法，包括a)工程改造微生物宿主細胞，使其包括下列元件(i)已破壞的Δ12去飽和酶多肽編碼內源基因；和(ii)ω-3脂肪酸生物合成途徑中的酶的編碼基因；並b)提供由α-亞油酸組成的去飽和酶底物源；c)在可表達ω-3脂肪酸生物合成途徑中的基因的條件下培養步驟(a)的微生物宿主細胞，生成ω-3脂肪酸；並d)任選地回收步驟(c)的ω-3脂肪酸。
15.權利要求14的方法，其中ω-3脂肪酸生物合成途徑中的酶的編碼基因選自Δ6去飽和酶、延伸酶、Δ5去飽和酶和Δ4去飽和酶。
16.權利要求14的方法，其中的ω-3脂肪酸選自十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
17.權利要求13或14的方法，其中的宿主細胞為酵母細胞。
18.權利要求17的方法，其中的酵母細胞為含油酵母，選自耶氏酵母屬、假絲酵母屬、紅酵母屬、紅冬孢酵母屬、隱球酵母屬、絲孢酵母屬和油脂酵母屬。
19.權利要求18的方法，其中的含油酵母為耶氏酵母種。
20.權利要求19的方法，選自解脂耶氏酵母ATCC#20362、解脂耶氏酵母ATCC#8862、解脂耶氏酵母ATCC#18944、解脂耶氏酵母ATCC#76982和解脂耶氏酵母LGAM S(7)1。
21.調節ω-3或ω-6脂肪酸在微生物宿主細胞內的生物合成的方法，包括a)提供包括功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑的微生物宿主細胞；b)使Δ12去飽和酶基因在(a)所述宿主細胞內超量表達；由此調節ω-3或ω-6脂肪酸的生物合成。
22.權利要求21的方法，其中的宿主細胞為含油酵母。
23.權利要求22的方法，其中的宿主細胞為耶氏酵母屬，而所述Δ12去飽和酶基因編碼SEQ ID NO24所示的Δ12去飽和酶。
24.權利要求21的方法，其中的Δ12去飽和酶基因在多拷貝質粒上超量表達。
25.權利要求21的方法，其中的Δ12去飽和酶基因與誘導型或可調型啟動子可操作連接。
26.通過權利要求13-20中任意一項的方法生成的微生物油。
27.獲得編碼Δ12去飽和酶的核酸分子的方法，包括(a)用權利要求1的核酸分子探測基因組文庫；(b)鑑定可與權利要求1所述核酸分子雜交的DNA克隆；並(c)對包括步驟(b)所鑑定克隆的基因組片段測序，其中經測序的基因組片段編碼Δ12去飽和酶。
28.獲得編碼Δ12去飽和酶的核酸分子的方法，包括(a)合成至少一種與SEQ ID NO23所示序列的一部分對應的寡核苷酸引物；並(b)利用步驟(a)所述寡核苷酸引物擴增存在於克隆載體內的插入片段；其中被擴增的插入片段編碼Δ12去飽和酶編碼胺基酸序列的一部分。
全文摘要
本發明涉及能夠催化從油酸到亞油酸(LA；18∶2)的轉化的Δ12脂肪酸去飽和酶。本發明還描述了編碼該去飽和酶的核酸序列、可與其雜交的核酸序列、包括該去飽和酶基因的DNA構建體，以及表達該去飽和酶的水平提高了的重組宿主微生物。提高特定ω－3和/或ω－6脂肪酸產量的方法是通過超量表達Δ12脂肪酸去飽和酶或破壞該天然基因而進行描述的。
文檔編號C12N1/18GK1816630SQ200480019355
公開日2006年8月9日 申請日期2004年5月7日 優先權日2003年5月7日
發明者N·S·亞達夫, H·張 申請人:納幕爾杜邦公司