用於遺傳和化學分析的單分子陣列的製作方法

2023-09-20 06:23:00 2

專利名稱：：用於遺傳和化學分析的單分子陣列的製作方法
技術領域：
：本發明涉及用於高通量分析個體分子群的方法和組合物，更具體的說，涉及有關單分子陣列製作的方法和組合物及其應用，尤其是在高通量核酸測序和遺傳分析中。
背景技術：
：大規模分子分析對於了解有關人類和經濟上重要的植物和動物中健康和疾病狀態的廣泛生物學現象是重要的，例如Collins等(2003)，Nature,422:835-847;Hirschhorn等(2005),NatureReviewsGenetics,6:95-108;NationalCancerInstitute,ReportofWorkingGrouponBiomedicalTechnology,"RecommendationforaHumanCancerGenomeProject",(2005年2月)。樣史型化已證實對於此類分析增大規模和降低成本極其重要，而達到微型化的重要途徑是使用探針或分析物的微陣列。這樣的陣列在大多數目前可利用的或者新出現的大規模遺傳分析和蛋白質組技術中發揮重要作用，包括那些用於單核苦酸多態性檢測、拷貝數估量、核酸測序等等的，例如Kennedy等(2003),NatureBiotechnology,21:1233-1237;Gunderson等(2005)，NatureGenetics,37:549-554;Pinkel和Albertson(2005)，NatureGeneticsSupplement,37:S11-S17;Leamon等(2003),Electrophoresis,24:3769-3777;Shendure等(2005),Science,309:1728-1732;Cowie等(2004),HumanMutation,24:261-271;等等。不過，目前用於此類技術的微陣列的規模仍然不符合達到真正低成本分析目標的要求，那樣的分析會實現如下搡作，諸如個人基因組測序、環境測序(用以利用複雜微生物群落的變化作為個人或環境健康狀態的指標)、將基因組特12徵與複雜特性(諸如對癌症、糖尿病、心血管疾病的易感性)聯繫起來的研究等等，例如Collins等(見上文)；Hirschhom等(見上文)；Tringe等(2005),NatureReviewsGenetics,6:805-814;Service(2006),Science,311:1544-1546。由於陣列的特徵大小降低到了分子水平，因而在用於DNA測序的基於陣列的方案中增大分析的規模是特別具有挑戰性的，因為大多數方案不僅需要形成高密度陣列的規程，而且還需要重複使陣列完整性、信號產生、信號檢測等等問題變複雜的複雜生化步驟循環，例如Metzker(2005),GenomeResearch,15:1767-1776;Shendure等(2004)，NatureReviewsGenetics,5:335-344;Weiss(1999)，Science,283:1676-1683。有些方法採用未擴增耙序列的高密度陣列，當使用"通過合成測序(sequencingbysynthesis)"化學法時，存在嚴重的信噪比考驗，例如Balasubramanian等，美國專利6，787.308。其它方法採用原位擴增隨機部署的靶序列，隨後應用"通過合成測序"化學法。這樣的方法也引起了各種各樣的困難，包括(i)靶序列簇的大小的顯著變異性，(ii)用聚合酶進行的延伸步驟中相(phase)的逐漸丟失，(iii)抑制閱讀長度的測序循環效率缺乏，等等，例如Kartalov等(2004),NucleicAcidsResearch,32:2873-2879;Mitra等(2003)，Anal.Biochem.，320:55-65;Metzker(見上文)。由於以上原因，如果存在可利用的分子陣列和排列技術，允許在單一的分析操作中平行的、有效且方便的分析大量個體分子，諸如基本上覆蓋了整個哺乳動物大小基因組的DNA片段，那麼對於醫學、生命科學和農業領域而言將是有利的。發明概述一方面，本發明提供了高密度單分子陣列、製備和使用所述組合物的方法、及用於實施所述方法的試劑盒。一種形式的本發明組合物包括部署在表面上的眾多不同單分子的隨機陣列，其中所述單分子各自包含一個大分子結構和至少一個分析物，使得各個大分子結構包含能夠與所述表面上的一個或多個官能度形成鍵的眾多附著官能度。一方面，所述分析物是大分子結構的組分；另一方面，所述分析物通過所述結構上的獨特官能度與所述分析物上的反應性基團或附著模塊之間的聯接而附著於所述大分子結構。另一方面，本發明的組合物包括部署在表面上的單分子隨機陣列，其中所述單分子各自包含至少一個耙多核苷酸的串聯物且各自通過所述表面上的一個或多個官能度與所述串聯物上的互補官能度之間形成的聯接而附著於所述表面。另一種形式的本發明組合物包括部署在表面上的單分子隨機陣列，其中所述單分子各自包含至少一個靶多核苷酸與至少一個銜接頭寡核苷酸的串聯物且各自通過所述表面上的捕捉寡核苦酸與所述串聯物中的附著寡核苷酸之間形成雙鏈體而附著於所述表面。又一種形式的本發明組合物包括部署在表面上的單分子隨機陣列，其中各個單分子包含具有一個獨特官能度和眾多互補官能度的雙功能大分子結構，且其中各個單分子通過所述表面上的一個或多個官能度與所述雙功能大分子結構上的互補官能度之間的聯接而附著於所述表面，所述獨特官能度具有就所述互補官能度而言的正交化學反應性(orthogonalchemicalreactivity)且能夠與某種分析物形成共價聯接。關於以上組合物，另一方面，所述單分子部署在平坦陣列中，其隨機分布於具有限定位置的離散分隔區上。優選的，在這方面.，所述離散分隔區各自具有允許捕所圍繞。一方面，本發明包括聚合物分子的陣列，其包含(a)具有表面的支持物；及(b)附著於所述表面的眾多聚合物分子，其中各個聚合物分子具有隨機纏繞狀態且包含一個或多個線性聚合單元的多拷貝的分支或線性結構，使得所述聚合物分子在基本上相當於所述隨機纏繞在所述表面上的投影的區域內附部署。正如下文更充分論述的，只要聚合物分子是線性的，在一個實施方案中，"基本上相當的"就上述投影而言指直徑等於所述線性聚合物末端至末端距離均方根的基本上圓形的區域。在另一個實施方案中，對於線性的或分支的聚合物，"基^上相當的"指直徑是所述聚合物總長度的一半或更小的、或者在另一個實施方案中是十分之一或更小的、或者在又一個實施方案中是百分之一或更小的基本上圓形的區域。另一方面，本發明包括多核苷酸分子的陣列，其包含(a)具有表面的支持物；及(b)附著於所述表面的眾多多核芬酸分子，其中各個多核苷酸分子具有隨機纏繞狀態且包含多拷貝的靶序列的串聯物，使得所述多核苷酸分子在基本上相當於所述隨機纏繞在所述表面上的投影的區域內附著於所述表面且以使得至少30。/。的所述多核苷酸分子的最近相鄰距離為至少50nm的密度隨機部署。本發明提供了製備所提供的聚合物分子的陣列的方法，其中各個聚合物分子具有隨機纏繞或相似的或其它三維狀態且包含一個或多個線性聚合單元的多拷貝的分支或線性結構，使得現有的聚合物分子在基本上相當於所述隨機纏繞在所述表面上的投影的區域內或者大小是所述聚合物總長度的一半或更小、十分之一或更小、或者百分之一或更小的區域內附著於所述表面，且以使得至少20%或至少30%的所述聚合物分子可獨立檢測的密度隨機部署。又一方面，本發明提供了單分子的陣列，其包含(a)具有平坦表面的支持物，所述表面具有離散分隔區的規則陣列，其中各個離散分隔區的面積小於lpn^且其上附著有反應性官能度；及(b)附著於所述表面的眾多單分子，其中各個單分子包含一個大分子結構和至少一個具有附著模塊的分析物，使得各個大分子結構包含一個獨特官能度和能夠與所述離散分隔區的所述反應性官能度形成聯接的眾多附著官能度，且使得所述分析物通過所述獨特官能度與所述分析物的所述附著模塊之間的聯接而附著於所述大分子結構，其中所述眾多單分子隨機部署於所述離散分隔區上，使得至少大多數所述離散分隔區只包含一個單分子。另一方面，本發明提供了多核苷酸分子的陣列，其包含(a)具有表面的支持物，所述表面其上附著有捕捉寡核苷酸；及(b)附著於所述表面的眾多多核苷酸分子，其中各個多核苦酸分子包含多拷貝的耙序列與銜接頭寡核香酸的串聯物，使得所述多核苷酸分子通過所述捕捉寡核苷酸與所述銜接頭寡核苷酸之間形成的一個或多個複合物而附著於所述表面，所述多核苷酸分子以使得至少大多數所述多核香酸分子的最近相鄰距離為至少50nm的密度隨機部署在所述表面上。在這個方面的一個實施方案中，所述表面是具有離散分隔區陣列的平坦表面，其中各個離散分隔區的大小相當於所述多核苷酸分子的大小且其上附著有捕4足寡核苷酸，且其中基本上所有這樣的區域附著有至多一個所述多核苷酸分子。本發明進一步包括製備多核苷酸分子陣列的方法，其包括以下步驟(a)產生眾多多核苷酸分子，各自包含來自來源DNA的DNA片段與銜接頭寡核苷酸的串聯物；並(b)將所述眾多多核苷酸分子部署至具有表面的支持物上，所述表面其上附著有捕捉寡核香酸，使得所述多核香酸分子通過所述捕捉寡核苷酸與所述銜接頭寡核苷酸之間形成的一個或多個複合物而固定於所述表面且使得所述多核苷酸分子以使得大多數所述多核苷酸分子的最近相鄰距離為至少50nm的密度隨機分布在所述表面上，從而形成多核苷酸分子陣列。另一方面，本發明提供了測定靶多核苷酸的核芬酸序列的方法，所述方法包括以下步驟(a)產生眾多來自靶多核苷酸的靶串聯物，各個靶串聯物包含多拷貝的靶多核苷酸片段且所述眾多靶串聯物包含基本上覆蓋所述靶多核苷酸的許多片段；(b)形成所述靶串聯物的隨機陣列，其以使得至少大多數所述靶串聯物在光學上可分辨的密度固定於表面；(c)鑑定各個靶串聯物中各個片段的至少一部分的序列；並(d)由所述串聯物所述片段所述部分的序列的身份重建所述靶多核苷酸的核苷酸序列。在這方面的一個優選實施方案中，所述鑑定步驟包括以下步驟(a)使來自第一套探針的一種或多種探針與所述隨機陣列在允許所述一種或多種探針與靶串聯物上互補序列之間形成完美匹配雙鏈體的條件下進行雜交；(b)使來自第二套4笨針的一種或多種揮:針與所述隨機陣列在允許所述一種或多種探針與靶串聯物上互補序列之間形成完美匹配雙鏈體的條件下進行雜交；(c)連接與靶串聯物在毗鄰位點處發生雜交的來自第一套和第二套的探針；(d)鑑定所連接的第一和第二探針的序列；並(e)重複步驟(a)至(d)直至所述靶多核苷酸的序列可以由所連接探針的序列身^f分而確定。陣列應用(具體是一種或多種靶多核苷酸的高通量分析)的試劑盒。本發明通過提供單分子陣列展示了微陣列領域內的重大進展，所述單分子包含可能摻入了或附著有靶分析物分子的線性的和/或分支的聚合物結構。一種形式的所述單分子是以允許高效、高解析度分析哺乳動物大小基因組的密度排列的靶多核苷酸串聯物，所述分析包括所有的或實質部分的所述基因組的序列測定，來自多個基因組的選定區域的標記片段的序列測定，基因表達的數字讀出，及拷貝數模式、曱基化模式、染色體穩定性、個體遺傳變異的基因組範圍評估，等等。附圖簡述圖1A-1I圖解了本發明方法和組合物的各種實施方案。圖2A-2B圖解了環化基因組DNA片段用於產生多核苦酸分析物串聯物的方法。圖3是包含大腸桿菌片段串聯物部署的玻璃表面的圖像。圖4是衍生自用寡核苷酸探針選擇性標記的、兩個不同生物體的串聯物的圖像。圖5是包含一個簡併鹼基的DNA片段的串聯物的圖像，各自是通過特異的連接探針鑑定的。圖6是包含一段簡併鹼基的DNA片段的串聯物的圖像，各對是通過特異的探針鑑定的。圖7是關於用酶促錯配檢測來鑑定參比序列與測試序列之間序列差異並由此構建DNA環的示意圖。圖8是關於用酶促錯配檢測來鑑定參比序列與測試序列之間序列差異並由此構建DNA環的另一示意圖。發明詳述除非另有說明，本發明的實施可採用有機化學、聚合物工藝、分子生物學(包括重組技術)、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規技術和描述，它們都在本領域的技術範圍內。所述的常規技術包括聚合物陣列合成、雜交、連接和用標記物進行的雜交^r測。參考下文實施例對合適的^^術進行了具體說明。然而，當然也可以使用其它等效的常規規程。所述的常規技術和描述可參閱標準實驗室手冊，諸如《GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries》(第I-IV巻)、《UsingAntibodies:ALaboratoryManual》、《Cells:ALaboratoryManual》、《PCRPrimer:ALaboratoryManual》禾口《MolecularCloning:ALaboratoryManual》(都來自ColdSpringHarborLaboratoryPress)、《Biochemistry》第4版(Stryer，L.(1995)Freeman,NewYork)、《01igonucleotideSynthesis:APracticalApproach》(Gait(1984)IRLPress,London)、《Lehninger,PrinciplesofBiochemistry》第3版(Nelson和Cox(2000)W.H.FreemanPub.，NewYork,N.Y.)和《Biochemistry》第5版(Berg等(2002)W.H.FreemanPub"NewYork,N.Y)，所有這些均全文收入本文作為所有目的的參考。本發明提供了隨機單分子陣列，用於大規模平行分析分子群體，特別是DNA片段，諸如基因組DNA片段。本發明的單分子一般包含附著部分和分析物部分。附著部分包含大分子結構，供多價附著至表面，特別是表面上緊湊的或受限的區域，使得由它(附著部分)或所附著的分析物產生的信號是集中的。就是說，大分子結構佔據了表面的一個緊湊的且有限的區域。本發明的大分子結構可以以多種方式結合於表面。多價的鍵可以是共價的或非共價的。非共價鍵包括在表面上的捕捉寡核苷酸與大分子結構中的互補序列之間形成雙鏈體，通過有吸引力的非共價相互作用諸如範德華力、氫鍵、離子相互作用和疏7jC相互作用吸附於表面，等等。正如下文將要更充分描述的，多價的共價鍵合可通過在表面上提供可以與大分子結構中的眾多互補官能度起反應的反應性官能度來實現。分析物部分可以經由獨特的聯接附著於大分子結構，或者可以形成大分子結構的一部分且與其是整合的。本發明的單分子通常自溶液隨機部署到支持材料的表面上；如此，一方面，單分子均一分布在表面上，非常接近泊松分布。另一方面，單分子部署在包含離散分隔區的表面上，單分子就附著在所述離散分隔區中。大分子結構、製備方法及所述離散分隔區的面積優選選擇成基本上所有這樣的區域包含至多只有一個單分子。本發明的單分子(特別是串聯物)優選大致以隨機纏繞構型位於表面上且限制於離散分隔區的範圍。一方面，離散分隔區在規則陣列中有限定的位置，它可以符合直線樣式、六邊形樣式、等等。所述區域的規則陣列有利於分析過程中從所述陣列收集的信號的檢測和數據分析。此外，單分子限制在離散分隔區的受限範圍內使得信號更加集中或強烈，特別是在分析操作中使用螢光探針時，從而提供了更高的信噪比。本發明的單分子隨機分布在離散分隔區上，使得給定區域通常同等可能的接受不同單分子中的任一種。換言之，所得陣列不是在製作後立即在空間上可設定地址的，但這可以通過進行鑑定或解碼操作來實現。就是說，單分子的身份是可辨別的，但不是已知的。正如下文更充分描述的，在有些實施方案中，存在離散分隔區的子集，它們接受只來自相應子集的單分子，例如通過捕捉寡核苷酸與銜接頭寡核香酸的互補序列所限定的。本發明的大分子結構包括聚合物，或分支的或線性的，而且可以是合成的，例如分支DNA，或者可以衍生自天然來源，例如來自患者基因組DNA的線性DNA片段。大分子結構通常包含線性單鏈DNA片段串聯物，所述DNA片段可以是合成的，衍生自天然來源，或者可以是二者的組合。在用於本文時，術語"靶序列"指合成的核酸或衍生自天然來源(諸如患者標本)的核酸，等等。靶序列通常是通過本發明方法(例如通過RCR)產生的串聯物的一部分，但也可以是其它結構諸如樹狀聚體和其它分支結構的一部分。當靶序列是合成的或衍生自天然來源時，通常在形成本發明的大分子結構或單分子的過程中通過各種方式來複製它們。應當了解所述方法可能在拷貝中引入錯誤，但它們仍然為術語"靶序列"所涵蓋。可選擇大分子結構的特定特徵或組分來滿足特定實施方案中的各種設計目標。例如，在有些實施方案中，維持分析物分子儘可能遠離表面可能是有利的，例如通過提供不易彎曲的分子間隔物作為獨特聯接的一部分。再例如，可以將反應性官能度選擇為具有有效阻止多個大分子結構附著於一個離散分隔區的尺寸。又例如，為了多種其它目的，例如增強溶解性、通過氬鍵促進二級結構形成、等等，可以提供具有其它官能度的大分子結構。一方面，大分子結構充分大，以致於它們的大小例如在常規生理鹽水中所佔據體積的線性尺度(諸如直徑)大約相當於離散分隔區的大小。對於線性多核苷酸的大分子結構，一方面，大小的範圍可以是幾千個核芬酸(例如IO,OOO個)至數十萬個核苷酸(例如10-20萬個)。正如下文更充分解釋的，在數個實施方案中，所述大分子結構可通過產生環狀DNA然後在滾環複製反應中複製它們以形成環狀DNA互補物的串聯物來製備。以上概念在圖1A-1G所示實施方案中有更充分的說明。在描述這些圖之面，本發明的大分子結構是包含靶序列或片段串聯物的單鏈多核苷酸。具體而言，這樣的多核苷酸可以是耙序列與銜接頭寡核苦酸的串聯物。例如，來源核酸(1000)經處理(1001)形成單鏈片段(1006)，優選在50-600個核香酸的範圍內，更優選在300-600個核苷酸的範圍內，然後與銜接頭寡核瞽酸(1004)連接以形成銜接頭-片段偶聯物群體(1002)。來源核酸(1000)可以是使用常規技術從樣品中提取的基因組DNA,或者是通過常規技術產生的cDNA或基因組文庫，或者合成的DNA,等等。處理(1001)通常需要通過常規技術進行斷裂，諸如化學斷裂、酶促斷裂或機械斷裂，隨後變性以產生單鏈DNA片段。在此實施例中，使用銜接頭寡核苦酸(1004)通過圖2A所示方法形成(1008)DNA環群體(1010)。一方面，群體(1010)內的各成員具有包含相同引物結合位點的銜接頭和來自來源核酸(1000)的DNA片段。銜接頭也可以具有其它功能性元件，包括但不限於標籤序列、附著序列、迴文序列、限制性位點、功能化序列、等等。在其它實施方案中，可以通過提供具有不同引物結合位點的銜接頭來創建多個種類的DNA環。在形成DNA環(1010)後，可以加入引物和滾環複製(RCR)試劑，用以在常規RCR^應中產生(1011)銜接頭寡核苷酸與DNA片段的互補物的串聯物(1015)群體(1012)，然後可以將該群體使用常規分離技術進行分離。或者，可以從包含所有可能序列的混合物中或者(在環是合成的時)從具有為環複製而選擇的序列之寡核苷酸的有限混合物中通過連續連接短寡核苷酸(例如6聚物)來執行RCR。還可以通過存在與靶分子起點和終點二者互補的橋接模板DNA時連接靶DNA以產生串聯物。一群不同的靶DNA可通過相應橋接模板的混合物轉變成串聯物。然後將分離的串聯物(1014)部署(1016)到支持物表面(1018)上以形成單分子隨機陣列。附著還可以包括不同嚴格性的清洗步驟以除去不完全附著的單分子或來自較早製備步驟且其存在不合需要的或者與表面(1018)非特異性結合的其它試劑。串聯物(1020)可通過多種技術固定至表面(1018)，包括共價附著和非共價附著。在一個實施方案中，表面(1018)可附著有捕捉寡核苦酸，該捕捉寡核苷酸與銜接頭寡核苷酸區段(諸如引物結合位點或其它元件)形成複合物例如雙鏈的雙鏈體。在其它實施方案中，捕捉寡核苷酸可以包含與銜接頭寡核苷酸形成三鏈體的寡核苷酸鉗(clamp)或類似結構，例如Gryaznov等，美國專利5,473,060。在另一個實施方案中，表面(1018)可具有與串聯物上互補官能度起反應而形成共價聯接的反應性官能度，例如通過用於將cDNA附著至微陣歹寸的相同4支術，例如Smirnov等(2004),Genes,Chromosomes&Cancer,40:72-77;Beaucage(2001)，CurrentMedicinalChemistry,8:1213-1244,收入本文作為參考。長DNA分子(例如數百個核苷酸或更長)也可以有效附著於疏水表面，諸如具有低濃度的各種反應性官能度(諸如-OH基團)的乾淨玻璃表面。在表面部署後，DNA片段的串聯物還可以進一步原位擴增。例如在部署後，可以通過寡核苷酸雜交而重建銜接頭序列內的限制性位點來切割串聯物，之後將片段如下所述環化並通過RCR^應而原位擴增。圖1B圖示了單分子(諸如單鏈多核苷酸)隨機陣列表面的剖面圖(1102)。所述分子以本領域眾所周知的方式在常規條件下(常規的DNA緩衝液，例如TE、SSC、SSPE等，室溫)在溶液中形成大致填充直徑大約100-300nm(取決於DNA的大小和緩衝條件)的球形體積的隨機纏繞，例如Edvinsson,"Onthesizeandshapeofpolymersandpolymercomplexes",Dissertation69620(UniversityofUppsala,2002)。隨才幾纏繞聚合物(諸如單鏈DNA)的大小的一種量度是末端至末端距離的均方根，它大致是隨機纏繞結構直徑的量度。所述的直徑，在此稱為"隨機纏繞直徑"，可以通過光散射來測量，使用諸如ZetasizerNanoSystem(MalvernInstruments,UK)的裝置或類4以裝置。本發明大分子結構的別的大小量度包括分子量(例如以道爾頓為單位)和聚合物總長度(在分支聚合物的情況中是其所有分支長度的總和)。在附著至表面後，取決於附著化學、聯接密度、表面特性、等等，單鏈多核苷酸填充了平均由虛線圓圈(1108)所限定的區域(1107)為界的變平的球形體積，該虛線圓圏(1108)的直徑大約等於隨機纏繞構型的串聯物的直徑。換一種說法，一方面，大分子結構(例如串聯物等)在基本上相當於其隨機纏繞狀態在表面(1102)上的投影的區域內附著於表面(1102)，例如虛線圓圏(1108)所示。大分子結構所佔據的面積可以變化，以致於在有些實施方案中，預期的面積可以在投影(1108)面積的2-3倍到所述區域的有些分數例如25-50%的範圍內。如別處所示，在表面上保持緊湊形式的大分子結構使探針所產生的信號更強烈，所述探針例如焚光標記的寡核苷酸，具體是針對大分子結構或串聯物的組分的。區域(1107)直徑(1110)的大小和距包含單分子的最近相鄰區的距離(1106)是陣列製造中感興趣的兩項數量(參數)。可釆用多種距離尺度來測量表面上單分子的緊密度，包括區域(1107)的中心至中心距離、區域(1107)的邊界至邊界距離、等等。在此通常採用中心至中心距離。本發明製造陣列中這些參數的選擇部分取決於分析過程中所用的信號產生和檢測系統。一般選擇允許至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少大多數分子通過所用信號產生和檢測系統可單獨解析的單分子密度。一方面，選擇允許至少70。/。的信號分子可單獨解析的密度。一方面，只要採用掃描電子顯微術，例如用具有金納米顆粒標記物的分子特異性探針，例如Nie等(2006)，Anal.Chem.,78:1528-1534,收入本文作為參考，選擇的密度使得至少大多數單分子具有50nm或更大的最近相鄰距離；另一方面，選擇的密度保證至少70%的單分子的最近相鄰距離為100nm或更大。另一方面，只要採用光學顯微術，例如用具有螢光標記物的分子特異性探針，選擇的密度使得至少大多數單分子的最近相鄰距離為200nm或更大；另一方面，選擇的密度保證至少70%的單分子的最近相鄰距離為200nm或更大。又一方面，只要使用光學顯微術，例如用具有靈光標記物的分子特異性探針，選擇的密度使得至少大多數單分子的最近相鄰距離為300nm或更大；另一方面，選擇的密度保證至少70%的單分子的最近相鄰距離為300nm或更大、或者400nm或更大、或者500nm或更大、或者600nm或更大、或者700nm或更大、或者800nm或更大。在又一個實施方案中，只要使用光學顯微術，選擇的密度使得至少大多數單分子的最近相鄰距離為顯微4fe最小特徵解析度的至少兩倍。另一方面，本發明的聚合物分子部署在表面上使得可獨立檢測的聚合物分子的密度是至少1000個/pm2、或至少10,000個/,2或至少100,000個/,2。本發明的另一方面，如圖1C圖示的一個具體實施方案，通過在表面上提供基本上是用於附著單分子的唯一位點的離散分隔區，避免了為保證理想的最近相鄰距離而選擇隨機部署單分子密度的需要。即，在所述實施方案中，表面上離散分隔區之間的區域，在此稱為"區域間空間/地帶"，就串聯物或其它大分子結構不與這樣的區域結合而言是惰性的。在有些實施方案中，這樣的區域間地帶可以用封閉劑處理，例如與串聯物DNA無關的DNA、其它聚合物、等等。如圖1A所示，來源核酸(1000)被斷裂並銜接(1002)以供環化(1010)，之後通過RCR(1012)形成串聯物。然後將分離的串聯物(1014)應用於具有離散分隔區(1122)規則陣列的表面(1120),各個離散分隔區的最近相鄰距離(1124)由表面(1120)的設計和製造確定。如下文更充分描述的，具有微米和亞微米尺度、用於用捕捉寡核香酸或反應性官能度衍生化的離散分隔區(l122)陣列可以用常規半導體製造技術製造，包括電子束刻(electronbeamlithography)、糹內米印刻4支術(nanoimprinttechnology)、光刻(photolithography)、等等。一般連同附著化學、採用的大分子結構、等等來選擇離散分隔區(1122)的面積，以符合本發明單分子的大小，使得當單分子應用於表面(1120)時基本上每個區域(1122)被不超過一個單分子所佔據。通過選擇反應性官能度或捕捉寡核苷酸的密度而導致所述模塊比單分子上它們各自互補物要少，可以提高每個離散分隔區只具有一個單分子的可能性。因此，單分子將"佔據"特定離散分隔區處所有與表面的聯接，從而減少第二個單分子也將結合同一區域的機會。具體而言，在一個實施方案中，離散分隔區中基本上所有的捕捉寡核苷酸都與單個大分子結構上的銜接頭寡核苷酸發生雜交。一方面，離散分隔區包含許多反應性官能度或捕捉寡核苦酸，它們的數目是單分子的互補官能度或銜接頭寡核苷酸數目的大約10%至大約50%。捕捉寡核苷酸的長度和序列可以變化很大，而且可以依照眾所周知的原則來選擇，例如Wetmur,CriticalReviewsinBiochemistryandMolecularBiology,26:227-259(1991);Britten和Davidson,第1章，Hames等糹扁，NucleicAcidHybridization:APracticalApproach(IRLPress,Oxford,1985)。一方面，捕捉寡核香酸的長度在6-30個核苷酸的範圍內；另一方面，在8-30個核苷酸的範圍內，或者在10-24個核苦酸的範圍內。選擇捕捉寡核苷酸的長度和序列(i)以致於大分子結構與表面有效結合，使得分析操作各步驟(諸如清洗等)中大分子結構的丟失降至最低，並(ii)以致於避免對分析物分子的分析操作的幹擾，特別是在分析物分子是串來物中的DNA片段時。關於(i),一方面，選擇序列和長度使得捕捉寡核香酸與其互補物之間的雙鏈體足夠穩定，以致於它們在嚴格的清洗中不解離。關於(ii)，若DNA片段來自特定物種的生物體，則在可獲得的情況下可以利用資料庫來篩選可以與DNA片段形成虛假的或不合需要的雜合物的潛在捕捉序列。在選擇捕捉寡核苷酸的序列時的其它因素與選擇引物、雜交探針、寡核苷酸標籤、等等中所考慮的那些因素類似，對此有許多指導手冊，正如下文定義部分所引用的參考文獻所證實的。在有些實施方案中，離散分隔區可以包含一種以上的捕捉寡核苷酸，且每種不同的捕捉寡核香酸可以具有不同的長度和序列。在採用離散分隔區規則陣列的實施方案的一個方面，選擇捕捉寡核苷酸的序列以致於位於最近相鄰區的捕捉寡核香酸具有不同的序列。在直線陣列中，這樣的構型是通過成排交替的序列類型實現的。在其它實施方案中，表面可具有眾多離散分隔區子陣列，其中各個不同的子陣列的捕捉寡核苷酸具有不同於其它子陣列捕捉寡核苷酸的獨特核苷酸序列。眾多子陣列可包括2個子陣列，或者4個或更少子陣列，或者8個或更少子陣列，或者16個或更少子陣列，或者32個或更少子陣列，或者64個或更少子陣列。在其它實施方案中，表面可包含5000個或更少子陣列。一方面，捕4足寡核苦酸通過間隔物分子例如聚乙二醇或類似惰性鏈附著於陣列的表面，如同微陣列所做的，這是為了使表面基團不合需要的影響或者與捕捉寡核苷酸或其它試劑的相互作用降至最低。一方面，離散分隔區(1122)的面積小於lnm另一方面，離散分隔區(1122)的面積在0.04|11112至1|11112的範圍內；又一方面，離散分隔區(1122)的面積在0.2|^112至1|_11112的範圍內。另一方面，當離散分隔區的形狀大約是圓形或正方形，使得其大小可以用單個線性尺度指示時，所述區域的大小在125nm至250nm的範圍內，或者在200nm至500nm的範圍內。一方面，區域(1122)的最近鄰居的中心至中心距離在0.25^im至20pm的範圍內；另一方面，所述距離在l(am至10iimi的範圍內，或者在50-1000nm的範圍內。一方面，區域(1122)可以實質上任何樣式排列在表面(1120)上，其中區域(1122)具有限定的位置，即在任何規則陣列中，這使得信號收集和數據分析功能更加高效。這樣的樣式包括但不限於區域(1122)的同心圓、螺線樣式、直線樣式、六角形樣式、等等。區域(1122)優選以直線或六角形樣式排列。如圖1D所示，在某些實施方案中，從來源核酸(1200)製備的DNA環不需要包含銜接頭寡核苷酸。如前，將來源核酸(1200)斷裂並變性(1202)以形成單鏈片段群體(1204),優選大小在大約50-600個核香酸的範圍內，更優選大小在大約300-600個核苷酸的範圍內，之後在非模板驅動反應中用環化連接酶i者如CircLigase(EpicentreBiotechnologies,Madison,WI)等3尋它們環4匕。在形成DNA環(1206)後，通過提供與選定序列結合的引物混合物而產生串聯物。引物混合物可以選擇成使DNA環(1206)的全部成員中只有一個子集產生串聯物。在串聯物產生之後(1208),將它們分離並應用至表面(1210)以形成本發明的隨機陣列。如上所述，本發明的單分子包含附著部分和分析物部分，附著部分包含使得該單分子多價附著至表面的大分子結構。如圖1E所示，大分子結構可以是通過RCR^應製備的串聯物，其中反應中的DNA環是合成的。然後單分子的分析物部分經由串聯物上的獨特官能度而附著。實質上任何序列的合成DNA環都可以使用眾所周知的技術來產生，方便的是大小高達數百個核香酸(例如200個)，而4交困難的是好幾百個核香酸(例如長達500個)，例如Kool,美國專利5,426,180;Dolinnaya等(1993),NucleicAcidsResearch,21:5403-5407;Rubin等(1995)，NucleicAcidsResearch,23:3547-3553;等等，均收入本文作為參考。將包含引物結合位點(1301)的合成DNA環(1300)在RCR反應(1306)中與引物(1302)聯合以產生串聯物(1308)。在此實施方案中，所有的環通常具有相同的序列，儘管可以採用不同的序列，例如用於通過互補附著模塊(諸如銜接頭序列與捕捉寡核苷酸)引導串聯物子集至預先選定的陣列區域。將引物(1302)合成為在其5，端具有能夠與分析物上的互補官能度起反應以形成共價聯接的官能度(1304，表示為"R")。例示性的官能度包括氨基、巰基、等等，它們可以用商品化化學(例如GlenResearch)附著。將串聯物(1308)應用至表面(1310)以形成陣列(1314),之後將具有附著模塊的分析物(1312)應用至表面(1310)，在此通過獨特官能度R(1311)與附著模塊的反應與串聯物形成聯接。或者，在應用至表面(1310)前，可以將串聯物(1308)與分析物(1312)結合，使得附著模塊和獨特官能度可以起反應以形成聯接，之後將所得偶聯物應用至表面(1310)。在選擇適當的附著模塊和獨特官能度用於連接串聯物(1308)和許多種類分析物的方面，文獻中有許多指導。一方面，為了將蛋白質或肽分析物與串聯物連接，有許多同型和異型雙功能試劑是商品化的(例如Pierce),而且才皮露於文獻中諸如Hermanson,BioconjugateTechniques(AcademicPress,NewYork,1996)，收入本文作為參考。例如，只要獨特官能度是氨基，那麼就可以使用3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(N-succinimidyl3畫(2-pyridyldithio)propionate，SPDP)、琥珀醯亞氨基氧羰基-ot匿曱基-a-(2-吡啶基二硫代)甲苯(succinimidyloxycarbonyl-a-methyl-oc-(2-pyridyldithio)toluene，SMPT)、4-(N-馬來醯亞胺曱基)環己胺-1-羧酸琥珀醯亞胺酯(succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylate，SMCC)、間陽馬來醯亞胺苯曱醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(m-maldmidobenzoyl—N匿hydroxysucxinimideester,MBS)、(4匿》#。S^l)m曱酸N-琥珀醯亞胺酯(N-succinimidyl(4-iodoacetyl)aminobenzoate,SIAB)、6-((碘乙醯基)氨基)己酸琥珀醯亞胺酯(succinimidyl6-((iodoacetyl)amino)hexanoate,SIAX)等等試劑將串聯物(1308)與分析物上的巰基連接。分析物上合適的互補官能度包括氨基、巰基、羰基，它們可以是天然存在於分析物上的，或者可以通過與合適的同型或異型雙功能試劑的反應而添加上去。分析物分子還可以通過非共價聯接的方式而附著於大分子結構，諸如生物素-鏈黴親合素聯接、附著於串聯物的第一寡核苷酸與附著於分析物的或者形成分析物一部分的互補寡核苷酸之間複合物(例如雙鏈體)的形成、或類似聯接。分析物包括生物分子，諸如核酸(例如DNA或RNA片段)、多糖、蛋白質等等。如上所述，本發明的大分子結構可以包括分支聚合物和線性聚合物，諸如DNA片段的串聯物。例示性的分支聚合物結構如圖1F和1G中所示。在圖1F中，圖示了包含一個主鏈多核苷酸(1400)和多個支鏈多核苷酸(1402)的分支DNA結構，各個分支多核芬酸(1402)通過其5，端與主鏈多核香酸(1400)連接以形成梳子樣結構，所述結構的所有末端都是3，的，只有主鏈多核苷酸(1400)上有單個5，末端(1404),該5，末端(1404)經過書f生而具有一個獨特官能度。如下所述，所述獨特官能度可以是反應性化學基團，例如受到保護的或不受保護的氨基、巰基、等等，或者它可以是具有獨特序列的寡核苷酸，用於捕捉具有序列與其互補的寡核苷酸的分析物。類似的，所述獨特官能度可以是捕捉模塊，諸如生物素等。這樣的分支DNA結構是用已知技術合成的，例如Gryaznov，美國專利5，571,677;Urdea等，美國專利5，124,246;Seeman等，美國專利6，255,469;等等，均收入本文作為參考。只要所述大分子結構是多核苷酸，其組分的序列就可以選擇成便於自我裝配，或者它們可以經由專門的連接化學而連接，例如下文所公開的，在此情況中基於其它因素選擇序列，包括在有些實施方案中的避免自身退火、容易與表面上的捕捉寡核苷酸結合、等等。在圖1G中，圖示了包含寡核苷酸(1406)的樹狀結構，它用各自具有兩個官能度(1410，表示為"R")的多個三價連接基團(1408)衍生，通過所述官能度(1410)可附著另外的聚合物(1407)例如多核苷酸以與寡核苷酸(1406)形成聯接從而形成大分子結構(1409)，繼而，如果類似地用多價接頭衍生，該大分子結構(1409)可形成核酸樹狀聚體。用於寡核苷酸的三價接頭(1408)披露於Iyer等，美國專利5，916,750，收入本文作為參考。如圖1H所示，一旦構建了這樣的樹狀聚體的或分支的結構(1411),它們就可以如上文關於線性多核香酸的描述附著於陣列(1420),之後分析物(1430)可以經由獨特官能度(1410)而附著。任選的是，可以用常規技術給未反應的獨特官能度(1422)加帽。或者，樹狀聚體的或分支的結構(1411)可以首先例如在溶液中與分析物(1430)結合，從而形成偶聯物，然後將該偶聯物部署在陣列(1420)上。當所述分析物是具有游離3，末端的多核苷酸(1440)時，如圖1I所示，所述末端可以在原位RCR反應中延伸以形成靶序列的串聯物或用於進一步添加的其它序列。類似的，多核苷酸分析物可以用常規技術通過連接來延伸。來源核酸和耙序列環化在本發明的一個方面，大分子結構包含多核苷酸分析物即靶序列的串聯物，所述分析物提取或衍生自樣品，諸如來自患者、有經濟利益的生物體、等等的基因組DNA或cDNA。包含所述單分子的本發明隨機陣列可用於提供基因組範圍的分析，包括序列測定、SNP測量、等位基因定量、拷貝數測量、等等。對於哺乳動物大小的基因組，優選以至少兩個階^a進行斷裂，第一階段是產生大小在大約100Kb(千鹼基)至大約250Kb範圍內的一群片段，而第二階段，分開應用於各個100-250Kb片段，產生大小在大約50-600個核苷酸範圍內、更優選大約300-600個核苷酸範圍內的片段，用於產生供隨機陣列使用的串聯物。在本發明的有些方面，第一階段斷裂還可用於選擇所述片段的預定子集，例如包含編碼信號轉導途徑蛋白質的基因的片段等。構建本發明陣列所需基因組DNA的量可變化很大。一方面，對於哺乳動物大小的基因組，自至少10個基因組當量的DNA產生片段；另一方面，自至少30個基因組當量的DNA產生片段；又一方面，自至少60個基因組當量的DNA產生片段。基因組DNA使用常規技術來獲得，例如披露於Sambrook等，見上文，1999;CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等，編(JohnWileyandSons,Inc.,NY,1999);等等。分離基因組DNA的重要因素包括l)DNA不含DNA加工酶和汙染性鹽類；2)整個基因組同等呈現；和3)DNA片段的長度在大約5,000和100,000bp之間。在許多情況中，不需要消化所提取的DNA，因為溶胞和提取過程中產生的剪切力將產生期望範圍中的片段。在另一個實施方案中，可以使用限制性內切核酸酶通過酶促斷裂而產生更短的片段(1-5kb)。在一個實施方案中，10-100個基因組當量的DNA保證片段群體覆蓋整個基因組。在有些情況中，倘若只能得到小量的樣品DNA且有經由非特異性結合(例如對容器壁的)而損失的風險等等，有利的是提供載體DNA，例如無關環狀合成雙鏈DNA，與樣品DNA混合併一起使用。在任一階段產生片段時，片段或者可以衍生自整個基因組，或者可以衍生自基因組的選定子集。許多技術可用於從基因組子集分離或富集片段，見收入本文作為參考的以下文獻Kandpal等(1990),NucleicAcidsResearch,18:1789-1795;Callow等,美國專利出版物2005/0019776;Zabeau等，美國專利6,045,994;Deugau等,美國專利5,508,169;Sibson,美國專利5,728,524;Guilfoyle等,美國專利5,994,068;Jones等,美國專利出版物2005/0142577;Gullberg等，美國專利出版物2005/0037356;Matsuzaki等，美國專利出版物2004/0067493;等等。對於哺乳動物大小的基因組，基因組DNA的初步斷裂可以通過用一種或多種"罕見"切割限制性內切核酸酶(諸如NotI、Ascl、Bael、CspCI、PacI、Fsel、Sapl、Sfil、Psrl等)進行消化來實現。所得片段可以直接使用，或者對於已經測序的基因組，可以從所述經消化的DNA分離特定片段供後續加工使用，如圖2B所示。將基因組DNA(230)用罕見切割限制性內切核酸酶消化(232)以產生片段(234)，之後將片段(234)用5，單鏈外切核酸酶(諸如人夕卜切核酸酶)進一步短期(即不讓反應進行完全)消化以暴露片l殳末端與限制性位點序列相鄰的序列(237)。所述暴露的序列對於每個片段將是獨特的。因此，可以將對期望片段的末端特異性的生物素化引物(241)與捕捉寡核苷酸退火以供分離；或者，可以將所述片段與具有捕捉模塊(諸如生物素)的引物退火併用沒有鏈置換活性的DNA聚合酶(諸如Taq聚合酶Stoffel片段)延伸。所述延伸後，引物(241)的3，末端鄰接片段的頂鏈(242)，使得它們可以連接而形成連續的鏈。後一種方法還可以用具有鏈置換活性並通過合成置換頂鏈(242)的DNA聚合酶來進行。在任一種方法中，然後可以使用經鏈黴親合素衍生化的固相支持物(239)來分離(240)生物素化的片段。另一方面，將基因組DNA模板的引物延伸用於產生目的基因組區域周圍大於10kb的選定序列的線性擴增。例如，為了產生限定大小的靶物群體，用正向引物進行20個循環的線性擴增，然後用反向引物進行20個循環。在應用第二種引物前，將第一種引物用長DNA純化標準柱除去或者降解(如果摻入了少數尿嘧咬鹼基的話)。產生了相對於正向鏈更大數目的反向鏈，得到雙鏈分子和單鏈反向鏈的群體。反向引物可以生物素化以捕捉至鏈黴親合素珠，其可以加熱以使所捕獲的任何雙鏈同型雙鏈體解鏈。所有附著的分子將是單鏈的且代表最初基因組DNA的一條鏈。所產生的產物可以斷裂至大小為0.2-2kb，更優選大小為0.3-0.6kb(將它們自固相支持物有效釋放)並環化供RCR^應。在一種環化方法中，如圖2A所示，在將基因組DNA(200)斷裂和變性(202)後，首先將單鏈DNA片段(204)用末端轉移酶處理(206)以將聚dA尾(208)附著至3，末端。然後藉助一端與聚dA尾互補且另一端與任何序列互補(依靠一段簡併核苷酸)的橋接寡核苦酸(210)進行分子內游離末端的連接(212)。橋接寡核香酸(210)的雙鏈體區域(214)包含至少一個RCR引物結合位點，在有些實施方案中，還有提供捕捉寡核苷酸互補物的序列，它可以與引物結合位點序列相同或不同，或者可以與引物結合位點序列交疊。捕捉寡核苷酸的長度可以變化很大。一方面，捕捉寡核香酸及其在橋接寡核苦酸中的互補物的長度在10-100個核苷酸的範圍內，更優選在10-40個核苷酸的範圍內。在有些實施方案中，雙鏈體區域(214)可以包含別的元件，諸如寡核苦酸標籤，例如用於鑑定其關聯DNA片段來源的來源核酸。就是說，在有些實施方案中，來自不同來源核酸的環或銜接頭連接或串聯物可以分開製備，期間使用包含獨特標籤的橋接銜接頭，之後將它們混合以製備串聯物或應用至表面以產生隨機陣列。所述關聯片段可以在這樣的隨機陣列上通過用與串聯物中其相應標籤序列互補的經標記標籤雜交或通過對整個銜接頭或銜接頭的標籤區域測序來鑑定。環狀產物(218)可以通過常Mi屯化柱、用一種或多種適宜的外切核酸酶消化非環狀DNA、或二者而方i^更的分離。如上所述，期望大小範圍(例如50-600個核苦酸)的DNA片段可以使用環化酶(諸如CircLigase的無需模板就環化單鏈DNA的單鏈DNA連接酶)環化。CircLigase依照製造商(Epicentre,Madison,WI)的說明書使用。用於形成包含DNA片段和一種或多種銜接頭的單鏈DNA環的一種優選規程使用標準連接酶(諸如T4連接酶)將銜接頭連接至DNA片段的一個末端，然後使用CircLigase來閉環，如下文更完整描述的。用於產生包含銜接頭寡核苷酸和靶序列的DNA環的例示性規程使用T4連接酶。靶序列是合成寡聚物T1N(序列5'-NNNNNNNNGCATANCACGANGNCGNNNNNNNN-3')(SEQIDNO:1)。銜接頭由兩條分開的寡聚物構成。連接至T1N5'末端的銜接頭寡聚物是BR2-ad(序列5'-TATCATCTGGATGTTAGGAAGACAAAAGGAAGCTGAGGACATTAACGGAC-3')(SEQIDNO:2),連接至T1N3'末端的銜接頭寡聚物是UR3-ext(序列5'-ACCTTCAGACCAGAT-3')(SEQIDNO:3)。UR3-ext包含IIs型限制性酶位點(AcuI:CTTCAG)以提供將DNA環線性化供插入第二銜接頭的方法。將BR2-ad與BR2-temp(序列5'-NNNNNNNGTCCGTTAATGTCCTCAG-3')(SEQIDNO:4)退火以形成雙鏈銜接頭BR2銜接頭。將UR3-ext與生物素化的UR3-temp(序列5'-[生物素]ATCTGGTCTGAAGGTNNNNNNN-3')(SEQIDNO:5)退火以形成雙鏈銜接頭UR3銜接頭。將lpmol靶TlN在單個連接反應中連接至25pmo1BR2銜接頭和10pmo1UR3銜接頭，該反應含有50mMTris-Cl,pH7.8,10%PEG,lmMATP，50mg/LBSA,10mMMgCl2，0.3個單位/VlT4DNA連接酶(EpicentreBiotechnologies,WI)和10mMDTT，終體積10pl。將連接反應溫育，溫度循環程序為15。Cll分鐘、37。Cl分鐘，重複18次。通過70。C加熱10分鐘終止反29應。通過用鏈黴親合素-茲珠(NewEnglandBiolabs,MA)捕捉連接產物來除去過量的BR2銜接頭。將3.3pl4x結合緩沖液(2MNaCl,80mMTrisHC1pH7.5)加至連接反應，然後加入lx結合緩衝液(0.5MNaCl,20mMTrisHC1pH7.5)中的15嗎鏈黴親合素磁珠。於室溫溫育15分鐘後，將磁珠用4倍體積的低鹽緩衝液(0.15MNaCl，20mMTrisHC1pH7.5)清洗兩次。將洗脫緩沖液(10mMTrisHC1pH7.5)預先加熱至70。C,取l(Hd加至磁珠，於70。C溫育5分鐘。磁力分離後，保存上清液，作為初級純化樣品。將此樣品進一步純化，通過用預先結合有生物素化寡聚物BR-rc-bio(序列5'-[生物素]CTTTTGTCTTCCTAACATCC-3')(SEQIDNO:6)的磁珠除去過量的UR3銜接頭，所述寡聚物與BR2-ad反向互補，與上文所述類似。通過尿素聚丙烯醯胺凝膠電泳分析來評估最終純化樣品中銜接頭-靶連接產物的濃度。進行環化，通過在供應商提供的標準緩沖液和lmMATP中用0.2個單位/plT4多核苷酸激酶(EpicentreBiotechnologies)褲酸化連接產物並使用0.3個單位/jilT4DNA連接酶(EpicentreBiotechnologies)和lmMATP用IO倍摩爾過量的夾板(splint)寡聚物UR3-closing-88(序列5'-AGATGATAATCTGGTC-3')(SEQIDNO:7)環化。通過如下所述進行RCR^應來驗證環化產物。通過滾環複製產生多核苷酸串聯物在本發明的一個方面，單分子包含在常規滾環複製(RCR)反應中產生的多核苷酸串聯物，所述多核苷酸通常是多核苷酸分析物，即靶序列。關於選擇RCR^應的條件和試劑的指導參見普通技術人員可得到的許多參考文獻，例如收入本文作為參考的以下文獻Kool,美國專利5，426，180;Lizardi,美國專利5,854,033和6，143,495;Landegren,美國專利5，871,921;等等。RC版應成分一般包括單鏈DNA環、一種或多種能與DNA環退火的引物、具有鏈置酶延伸以形成DNA環成分串聯物的條件下合併。例示性的RCR反應規程如下在50ial反應混合液中，混合以下成分2-50pmol環狀DNA,0.5個單位/|11噬菌體cp29DNA聚合酶，0.2嗎/^lBSA，3mMdNTP，IXcp29DNA聚合酶反應緩衝液(Amersham)。RCR^應於30。C進行12小時。在有些實施方案中，聚合酶反應中環狀DNA的濃度可以選擇成低的(每ml含大約IOO-IOOO億個環，或每皮升含10-100個環)，以避免糾纏和其它分子間相互作用。通過RCR產生的串聯物優選在大小方面是大致均一的；因此，在有些實施方案中，製造本發明陣列的方法可以包括選擇串聯物大小的步驟。例如，一方面，串聯物選擇成分子量變異係數小於大約30%的群體；而在另一個實施方案中，小於大約20%。一方面，通過向RCR^應混合液中添加低濃度的鏈終止物(諸如ddNTP)以減少很大串聯物(例如由聚合酶以更高速率合成的DNA環產生的)的存在，進一步提高了大小均一性。在一個實施方案中，所用ddNTP的濃度導致預期串聯物大小在50-250Kb範圍內，或者在50-100Kb範圍內。另一方面，可以使用常規分離技術來富集特定大小範圍的串聯物，例如大小排阻層析、膜過濾、等等。包含分支聚合物和DNA裝配物的大分子結構的產生在本發明的一個方面，大分子結構包含具有至少一個獨特官能度(對於多核苷酸通常是5，或3，末端的官能度)和眾多互補官能度(能夠與固相支持物表面的反應性官能度特異性起反應)的聚合物。包含分支聚合物(尤其是分支多核苷酸)的大分子結構可以以多種方式來合成，4皮露於Gryaznov,見上文；Urdea,見上文；等等。一方面，本發明的分支聚合物包括;阮子型分支聚合物，其包含一個線性聚合單位，該線性聚合單位具有一個或多個位於內部單體和/或聯接模塊的分支點。本發明的分支聚合物還包括叉子型分支聚合物，其包含一個線性聚合單位，該線性聚合單位具有一個或多個位於末端單體和/或聯接模塊的分支點。本發明的大分子結構還包括通過一個或多個雙鏈體或三鏈體結合在一起的線性和/或分支多核香酸的裝配物。所述裝配物可以是由線性多核苷酸成分自我裝配得到的，例如披露於Goodman等，Science,310:1661-1665(2005);Birac等，J.Mol.GraphModel,(April18，2006);Seeman等，美國專利6,255，469;等等，收入本文作為參考。一方面，本發明的線性聚合單位的形式為"-(M-L)n--"，其中L是接頭模塊而M是可以選自極其廣泛的化學結構以提供一系列功能的單體，所述功能包括充當惰性非空間阻礙間隔物模塊和提供反應性官能度，所述反應性官能度可充當供附著其它成分的分支點、供附著標記物的位點、供附著寡核苷酸或其它結合聚合物(供雜交或結合至擴增鏈或結構)的位點(例如披露於Urdea等，美國專利5,124,246或Wang等，美國專利4,925，785)、供附著"鉤子"(hook)的位點(例如4皮露於Whiteley等，美國專利4，883，750)、或供附著影響溶解性、促進雙鏈體和/或三鏈體形成的其它基團(諸如嵌入劑、烷化劑、等等)的位點。以下參考文獻披露了適用於本發明的數種亞磷醯胺(phosphoramidite)和/或氫膦酸酯(hydrogenphosphonate)單體並提供了關於其合成和摻入寡核苷酸的指導Newton等,NucleicAcidsResearch,21:1155-1162(1993);Griffin等，J.Am.Chem.Soc"114:7976-7982(1992);Jaschke等，TetrahedronLetters,34:301-304(1992);Ma等，國際申請PCT/CA92/00423;Zon等，國際申請PCT/US90/06630;Durand等，NucleicAcidsResearch,18:6353-6359(1990);Salunkhe等，J.Am.Chem.Soc"114:8768-8772(1992);Urdea等，美國專利5,093，232;Ruth,美國專利4,948,882;Cruickshank,美國專利5,091,519;Hamlambidis等，NucleicAcidsResearch,15:4857-4876(1987);等等。更具體的說，M是直鏈的、環狀的、或分支的有機分子結構，含l-20個碳原子和0-10個選自氧、氮和硫的雜原子。優選的是，M是含l-16個碳原子的烷基、烷氧基、烯基或芳基；含3-8個碳原子和l-3個選自氧、氮和硫的雜原子的雜環基；糖基；或核苷基。更優選的是，M是含l-8個碳原子的烷基、烷氧基、烯基或芳基；糖基；或核苷基。優選的是，L是磷(V)連接基團，可以是磷酸二酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酸酯、膦酸酯的曱酯或.乙酯、等等。衍生自亞磷醯胺或氫膦酸酯前體的聯接一般是優選的，使得本發明的線性聚合單位可以用商業性自動化DNA合成儀來常規合成，例如AppliedBiosystems,Inc.(FosterCity,Calif.)394型等。n可以顯著變化，取決於M和L的性質。n的變化範圍通常為大約3到大約100。當M是核苷或其類似物或者核苷大小的單體且L是磷(V)聯接時，n的變化範圍為大約12到大約100。優選的是，當M是核苷或其類似物或者核苷大小的單體且L是磷(V)聯接時，n的變化範圍為大約12到大約40。聚合單位通過在它們之間形成一個或多個共價橋接而裝配。一方面，橋接是通過一個或多個成分上的硫醇、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯基團與一個或多個其它成分上的卣代醯基或卣代烷基氨基基團起反應而形成一個或多個硫代或二硫代磷醯基醯基或者硫代或二硫代磷醯基烷基橋接而形成的。所述橋接一般具有一種或多種以下形式—NHRSP(=Z)(0>--或-NHRS-，其中R是烷基或醯基而Z是硫或氧。裝配反應可以牽涉2-20個成分，取決於具體的實施方案；但優選牽涉2-8個成分；更優選牽涉2-4個成分。優選的是，卣代醯基或卣代烷基氨基基團是卣代乙醯基氨基基團；更優選的是，滷代乙醯基氨基基團是溴代乙醯基氨基基團。卣代醯基或卣代烷基氨基基團的醯基或烷基模塊含1-12個碳原子；更優選的是，所述模塊含l-8個碳原子。反應可以在極其多種溶劑系統中進行；但裝配反應一般在液態含水條件下或者在冷凍狀態中在冰中進行，例如通過P條低液態含水反應混合液的溫度而得到的。或者，DMSO/H20中硫代磷醯基乙醯基氨基橋接的形成已有報導，見Thuong等，TetrahedronLetters,28:4157-4160(1987)及Francois等，Proc.Natl.Acad.Sci.，86:9702-9706(1989)。典型的含水條件在25mMNaCl和15mM磷酸鹽緩衝液(pH7.0)中含4pM反應物。硫代或二硫代磷醯基醯基或者硫代或二硫代磷醯基烷基氨基橋接是優選的，因為它們可以由氧化劑容易的且選擇性的切割，諸如硝酸銀、碘化鉀、等等。優選用碘化鉀Kl3在相當於大約100倍摩爾過量於橋接的濃度切割橋接。通常採用Kl3的濃度為大約0.1M。這些橋接易於切割在複雜大分子結構的合成方面是極其有利的，因為它提供了用於分析最終產物和驗證最終產物的結構是正確的便利方法。將3'-卣代醯基或卣代烷基氨基(在此實施例中是卣代乙醯基氨基)衍生化寡核苷酸l與5'-硫代磷酸酯衍生化寡核苦酸2依照以下方案起反應5'-BBB...B-NHC(=0)CH2X+(1)S-P(O)(O國)-BBB...B-3，~>(2)5'畫BBB...B-NHC(=0)CH2SP(=0)(0)0-BBB…B-3，其中X是卣素而B是核苷酸。應當了解核苷酸僅僅是更一般的聚合單位即上文所述(M-L)n的例示。化合物1可以通過將N,N-二曱基曱醯胺(DMF)中的卣代乙酸N-琥珀醯亞胺酯與硼酸鈉緩沖液中的3'-氨基脫氧核糖核苦酸前體於室溫起反應來製備。大約35分鐘後，將混合物稀釋(例如用H20)，脫鹽，並純化(例如通過反相HPLC)。Y-氨基脫氧核糖核苦酸前體可以如Gryaznov和Letsinger,NucleicAcidsResearch,20:3403-3409(1992)所述來製備。簡言之，去保護後，將經標準琥珀醯基聯接與支持物相連的脫氧胸苦的5'羥基通過在適宜溶劑(諸如二氯曱烷/二異丙基乙胺)中與氯-(二異丙基乙基氨基)-曱氧基膦的反應而膦酸化(phosphitylate)。用四唑活化後，將5'-膦酸化胸苷與5'-三苯曱基-0-3'-氨基-3'-脫氧核苷起反應而形成核苷-胸苷二聚體，其中核苷模塊通過氨基磷酸酯聯接而共價連接。寡核苷酸的剩餘部分通過標準亞磷醯胺化學來合成。切割琥珀醯基聯接後，通過酸處理(例如80%含水乙酸，18-20小時，室溫)切割氨基磷酸酯聯接而產生含3'末端氨基基團的寡核苷酸。5，-33單硫代磷酸(酯)寡核苦酸2如下形成將5'單磷酸酯附著至寡核苷酸的5'末端，或是通過化學方法或是用激酶酶促的'，例如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,1989。優選的是，作為寡核苦酸合成的最後一步，通過化學磷酸化添力口單石舞酸酉旨，3口Thuong和Asscline，Eckstein編6々《OligonucleotidesandAnalogues))中的第12章(IRLPress,Oxford,1991)或Hom和Urdea,TetrahedronLett.，27:4705(1986)(例如^f吏用商業性試劑，諸如ClontechLaboratories(PaloAlto,Calif.)的5'Phosphate-ON.TM.)所述。然後使用常規硫化劑將5'-單磷酸酯碌L/f匕，例如用Ss在吡。^/CS2(1:1，v/v)中的5。/。溶液處理(45分鐘，室溫)；或者用美國專利5，003，097、5,151，510或5，166,387所述硫化劑處理。單二硫代磷酸酯通過類似規程來製備，例如Froehler等，歐洲專利出版物0360609A2;Caruthers等，國際申請PCT/US89/02293;等等。與上文類似，將5'-閨代乙醯基氨基衍生化寡核苷酸3與3'-單硫代磷酸(酯)寡核苷酸4依照以下方案起反應3，-BBB..B-NHC(=0)CH2X+(3)S陽P(O)(CT)O-BBB…B-5，■>(4)3，-BBB...B-NHC(=0)CH2SP(=0)(0>BBB...B-5，其中各符號的定義與上文相同，只是j聚物和k聚物的核苷酸單體取向相反。在這種情況中，化合物3可以通過將N，N-二曱基曱醯胺(DMF)中的滷代乙酸N-琥珀醯亞胺酯與硼酸鈉緩沖液中的5'-氨基脫氧核糖核苷酸前體於室溫起反應來製備，如上文關於3'-氨基寡核苷酸所述。5'-氨基脫氧核苷依照以下參考文獻所述來製備Glinski等,J.Chem.Soc.Chem.Comm.,915-916(1970);Miller等,J.Org.Chem.29:1772(1964);Ozols等,Synthesis,7:557-559(1980);Azhayev等，NucleicAcidsResearch,6:625-643(1979);收入本文作為參考。3'-單硫代磷酸(酯)寡核苷酸4可以如Thuong和Asscline(見上文)所述來製備。末端的聚合單位。用於附著支鏈的反應性官能度可以在多個位點引入。優選的是，氨基官能度引入到選定單體的聚合單位或環上或者連接模塊上，然後轉變成卣代乙醯基氨基基團，如上所述。核苷單體的氨基衍生化鹼基可以如以下文獻所述來引入Urdea等，美國專利5,093,232;Ruth，美國專利4,948,882;Haralambidis等，NucleicAcidsResearch,15:4857-4876(1987);等等。氨基官能度還可以通過ClontechLaboratories(PaloAlto,Calif.)的商業性脫保護羥胺亞磷醯胺像AminomodifierII.TM.來引入。優選的是，氨基官能度通過用12和烷基二胺氧化亞磷酸酯聯接產生衍生化氨基磷酸酯聯接來引入，例如Agrawal等，NucleicAcidsResearch,18:5419-5423(1990)及Jager等，Biochemistry,27:7237-7246(1988)。一般而言，對於上述規程，優選卣代醯基或卣代烷基氨基衍生化聚合單位與硫代磷酸酯衍生化聚合單位分開製備，否則硫代磷酸酯模塊需要保護基團。用於構建隨機陣列的固相表面極其多種支持物可用於本發明。一方面，支持物是具有表面、優選基本上平坦的表面的剛性固體，使得待查詢的大分子處於同一平面。後一特徵容許高效信號採集，例如通過檢測光學。另一方面，本發明的固體支持物是無孔的，特別是在單分子隨機陣列通過要求小體積的雜交反應來分析時。合適的固體支持物材料包括諸如玻璃、聚丙烯醯胺包被的玻璃、陶瓷、矽土/珪石、矽、石英、各種塑料等材料。一方面，平坦表面的面積可以在0.5-4cr^的範圍內。一方面，固體支持物是具有均一石圭烷化表面的玻璃或石英，諸如顯樣史鏡載玻片/蓋玻片。這可以使用常規方案來實現，例如用酸處理，然後浸入3-縮水甘油氧基丙基三曱氧基矽烷、N,N-二異丙基乙胺和無水二曱苯(8:1:24v/v)的80。C溶液，它形成環氧矽烷化表面，例如Beattie等(l"5)，MolecularBiotechnology,4:213。這樣的表面易於處理成容許捕捉寡核苷酸的末端附著，例如通過在應用於表面前提供具有3，或5，三甘醇磷醯基間隔物的捕捉寡核苷酸(參閱Beattie等，見上文)。許多其它方案可用於將反應性官能度添加至3皮璃和其它表面，如Beaucage(見上文)所糹皮露的。只要不需要酶促加工，捕捉寡核苷酸可以包含賦予有利特性(諸如提高的雙鏈體穩定性)的非天然核芬單元和/或聯接，所述化合物包括但不限於肽核酸(PNA)、鎖定核酸(lockednucleicacid,LNA)、寡核苷酸N3'—P5'氨基磷酸酯、寡聚-2'-0-烷基核糖核苷酸、等等。在本發明的需要離散分隔區樣式的實施方案中，光刻(photolithography)、電子束刻(electronbeamlithography)、糹內米印刻(nanoimprintlithography)禾口糹內米印刷(nanoprinting)可用於在極其多種表面上產生所述樣式，例如Pimmg等,美國專利5,143,854;Fodor等，美國專利5,774,305;Guo，(2004)JournalofPhysicsD:AppliedPhysics,37:R123扁141;收入本文作為參考。一方面，包含眾多離散分隔區的表面通過光刻來製作。將商業性的、光學上扁平的石英基片旋轉覆蓋上100-500nm厚的一層光抗蝕劑。然後將光抗蝕劑烘烤到石英基片上。使用分檔器(stepper)將具有待活化區域樣式的標線圖像投影到光抗蝕劑表面上。曝光後，將光抗蝕劑顯影，除去對UV源曝光的投射樣式的區域。這是通過等離子刻蝕(一種能夠產生很細細節的幹法顯影技術)實現的。然後將基片烘烤以加強剩餘的光抗蝕劑。烘烤後，石英晶片準備好進行官能化了。然後將晶片進行3-氨基丙基二甲基乙氧基矽烷的蒸氣沉積。氨基官能化單體的密度可以通過改變單體的濃度和基片的曝光時間而嚴密控制。只有通過等離子刻蝕而暴露的石英區域能與單體反應並捕獲單體。然後將基片再次烘烤以使氨基官能化單體單層固化(cure)至暴露的石英。烘烤後，可以用丙酮除去剩餘的光抗蝕劑。由於抗蝕劑與矽烷間附著化學的差異，基片上的氨基矽烷官能化區域可以在丙酮漂洗中保持完整。這些區域可以通過將它們與吡啶和N,N-二曱基曱醯胺溶液中的對苯二異碌b氰酸酯起反應而進一步官能化。此時基片能夠與胺修飾的寡核苷酸起反應。或者，寡核苷酸可以用5，-羧基修飾的clO接頭(GlenResearch)來製備。這種技術容許寡核苷酸直接附著至胺修飾的支持￥,由此避免另外的官能化步驟。另一方面，包含眾多離散分隔區的表面通過納米印刻(NIL)來製作。為了生成DNA陣列，將石英基片旋轉覆蓋上一層抗蝕劑，通常稱為轉移層。然後將第二種類型的抗蝕劑應用到轉移層之上，通常稱為印刻層。然後用原版印刻工具在印刻層上做出印痕。然後通過等離子刻蝕減小印刻層的整體厚度直至印記的底面到達轉移層。因為轉移層比印刻層難以除去，所以它很大程度上保持不變。然後通過加熱來硬化印刻層和轉移層。然後將基片置入等離子刻蝕機，直至印記的底面到達石英。然後如上所述通過蒸氣沉積將基片衍生化。另一方面，包含眾多離散分隔區的表面通過納米印刷來製作。這種方法使用光刻、印刻或電子束刻來產生母模，它是列印頭上所需要的特徵的陰像。列印頭通常由柔軟的、柔性的聚合物製成，諸如聚二曱基矽氧烷(PDMS)。將這種材料或具有不同特性的材料層旋轉覆蓋到石英基片上。然後在受控溫度和壓力條件下用模子將特徵壓紋到抗蝕劑材料的頂層上。然後將列印頭進行基於等離子體的刻蝕以提高列印頭的高寬比並消除列印頭由於隨壓紋材料的時間而鬆弛產生的畸變。通過將胺修飾寡核苷酸的樣式沉積到均勻衍生化表面上，使用納米印刷來製作隨機陣列基片。這些寡核苷酸將充當RCR產物的捕捉探針。納米印刷的一個潛在優點是將不同捕捉探針的交錯樣式印刷到隨機陣列支持物上的能力。這將通過用多個列印頭連續印刷來實現，各列印頭具有不同的樣式且所有樣式組合在一起形成最終的結構化支持物樣式。所述方法容許隨機陣列內有一些DNA元件的位置編碼。例如，包含特定序列的對照串聯物可以以規則間隔結合於整個隨機陣列。又一方面，亞微米大小的捕捉寡核苦酸斑點的高密度陣列使用自一束帶芯線和包覆材料的大約l萬-l億根光纖或多束光纖成捆製備的列印頭或印記原版來製備。通過拉扯和熔融纖維，產生了大約50-1000nm芯線以大小相似或者小/大2-5倍的包覆材料分隔的獨特材料。通過差異刻蝕(溶解)包覆材料，得到具有很大數目納米大小斑點的納米列印頭。該列印頭可用於沉積寡核苷酸或其它生物學化合物(蛋白質、寡肽、DNA、適體)或化學化合物諸如具有各種活性基團的矽烷。在一個實施方案中，使用玻璃纖維工具作為壓花支持物來沉積寡核苷酸或其它生物學或化學化合物。在這種情況中，只有通過刻蝕產生的斑點可以接觸待沉積的材料。同樣，可以使用熔融纖維束的平切(flatcut)來引導光穿過芯線並容許光誘導的化學只在芯線的頂端表面發生，由此消除對刻蝕的需要。在這兩種情況中，可以使用相同支持物作為光引導/收集裝置，用於對標籤寡核苦酸或其它反應物的焚光標記物成像。該裝置提供了具有大數值光圈(可能大於l)的大視野。可以使用執行活性材料或寡核苷酸沉積的衝壓或印刷工具以交錯樣式印刷2-1OO種不同寡核苷酸。這種方法要求將列印頭精確布置至大約50-500nm。這種類型的寡核苷酸陣列可用於附著2-100種不同DNA群體，諸如不同來源DNA。它們還可用於通過使用DNA特異性錨或標籤對亞光解析度(sub-lightresolution)斑點進行平行閱讀。可以通過DNA特異性標籤得到信息，例如16種特異錨用於16種DNA，並通過5-6種顏色的組合、使用16個連接循環或者一個連接循環和16個解碼循環閱讀2個鹼基。這種陣列製作方法是有效的，如果每種片段需要有限的信息(例如少數循環)，如此每個表面每個循環或更多循環提供更多信息的話。在一個實施方案中，使用"惰性"串聯物來製備供附著測試串聯物的表面。首先將表面用與兩種類型合成串聯物(一種是捕捉串聯物，另一種是間隔物串聯物)上存在的結合位點互補的捕捉寡核香酸覆蓋。間隔物串聯物沒有與製備測試串聯物時所使用的銜接頭互補的DNA區段，以大約5-50倍、優選10倍過量於捕捉串聯物使用它們。將帶捕捉寡核苦酸的表面用合成串聯物(通過鏈連接或RCR製備)的混合物(其中使用大約10倍或5-50倍過量於捕捉串聯物的間隔物串聯物)."飽和"。因為間隔物與捕捉串聯物間大約10:1的比率，捕捉串聯物大多成為間隔物串聯物海洋中的單獨小島。IO:I的比率使得兩個捕捉串聯物平均由兩個間隔物串聯物分開。如果串聯物的直徑是大約200nm，那麼兩個捕捉串聯物的中心至中心距離是大約600nm。然後將該表面用於附著測試串聯物或其它分子結構，它們具有與捕捉串聯物上存在但間隔物串聯物上不存在的區域互補的結合位點。捕捉串聯物可以製備成拷貝數少於測試串聯物中的結合位點數，以保證每個捕捉串聯物斑點附著單個測試串聯物。因為測試DNA只能結合捕捉串聯物，所以測試串聯物陣列可以製備成具有高位點佔有率而無聚集。由於隨機附著，表面上的有些區域可能沒有附著任何串聯物，但帶游離捕捉寡核苦酸的這些區域可能不能結合測試串聯物，因為它們設計成沒有供捕捉寡核苷酸結合的位點。所述的個體測試串聯物的陣列不會排列成柵格樣式。有序柵格樣式應當簡化數據收集，因為需要更少的像素且還需要不太複雜的圖像分析系統。一方面，可以將本發明的多個陣列置於單個表面上。例如，壓花(pattemed)陣列基片可以製備成匹配標準的96孔或384孔板格式。生產格式可以是單片玻璃或塑料和其它光學相容材料上6mmx6mm陣列的9mm孔距(pitch)的8x12樣式或者3.33mmx3.33mm陣列的4.5mm孔距的16x24樣式。在一個例子中，每個6mmx6mm陣列由36xl(^個l(om孔距的250-500nn^區域組成。可以使用疏水性或其它表面或物理屏障來防止單位陣列間不同反應的混合。舉例而言，供DNA樣品結合的位點(即離散分隔區)通過用3-氨基丙基二曱基乙氧基矽烷或類似矽烷化試劑矽烷化矽、石英或玻璃表面上二氧化矽上光刻限定的位點，接著用對苯二異硫氰酸(鹽/酯)或類似衍生化試劑衍生化來製備。例如，結合位點可以是通過光刻、直接書寫電子束、或納米印刻產生的正方形、圓形、或規則/不規則多邊形。將結合位點間區域的非特異性結合降至最低。可以控制結合位點周圍區域的溼潤性(wetability)(疏水性比親水性)和反應性以防止DNA樣品在該區域中結合；就是說，在結合位點以38外的地方。例如，該區域可以用共價鍵合至表面的六曱基二矽氮烷(HMDS)或類似試劑製備成疏水性的，因此不適於DNA樣品的親水性鍵合。類似的，該區域可以用化學試劑覆蓋，諸如基於氟的碳化合楊，使得它不與DNA樣品起反應。關於前兒段中列出的三種表面製作工序，遵循以下例示性步驟。對於光刻1)清潔玻璃晶片2)用HMDS預備(prime)表面3)在光抗蝕劑中繪製結合位點樣式4)用氧反應性離子刻蝕結合位點表面以除去HMDS5)用.3%3-氨基丙基二曱基乙氧基矽烷矽烷化6)用光抗蝕劑覆蓋以在鋸切過程中保護晶片7)將晶片鋸切成晶片8)剝去光抗蝕劑9)用10%吡咬和90%N，N-二曱基曱醯胺(DMF)中的對苯二異硫氰酸(鹽/酯)(PDC)溶液(每ml溶液使用2.25mgPDC)衍生化結合位點2小時，接著用曱醇、丙酮、和水漂洗。對於直接書寫電子束表面製作1)清潔玻璃晶片2)用HMDS予員備(prime)表面3)用電子束在HMDS中繪製結合位點樣式4)用氧反應性離子刻蝕結合位點表面以除去HMDS5)用.3%3-氨基丙基二甲基乙氧基矽烷矽烷化6)用光抗蝕劑覆蓋以在鋸切過程中保護晶片7)將晶片鋸切成晶片8)剝去光抗蝕劑9)用10%吡啶和90%N，N-二曱基曱醯胺(DMF)中的對苯二異碌u氰酸(鹽/酯)(PDC)溶液(每ml溶液使用2.25mgPDC)衍生化結合位點2小時，接著用甲醇、丙酮、和水漂洗。對於納米印刻表面製作1)清潔玻璃晶片392)用HMDS預備(prime)表面3)用轉移層覆蓋晶片4)使列印樣式接觸轉移層頂部的納米印刻才莫板和光聚合物5)將樣式幹法刻蝕到轉移層中6)用氧反應性離子刻蝕結合位點表面以除去HMDS7)用.3%3-氨基丙基二曱基乙氧基矽烷矽烷化8)用光抗蝕劑覆蓋以在鋸切過程中保護晶片9)將晶片鋸切成晶片10)剝去光抗蝕劑11)用10%吡啶和90%N，N-二曱基曱醯胺(DMF)中的對苯二異硫氰酸(鹽/酯)(PDC)溶液(每ml溶液使用2.25mgPDC)衍生化結合位點2小時，接著用曱醇、丙酮、和水漂洗。如上所述，還可以卩吏用玻璃表面來構建本發明的隨機陣列。例如，合適的玻璃表面可以自顯微鏡蓋玻片構建。將顯微鏡蓋玻片(22mm2，約170阿厚)置於Teflon架子中。將它們在含3MKOH的95。/。乙醇/水中浸泡2分鐘。然後將它們在水中漂洗，接著是丙酮漂洗。這除去了表面汙染並將玻璃準備好進行矽烷化。等離子清潔是KOH清潔的替代方法。還可以用熔融矽土/矽石或石英替代玻璃。將乾淨的、幹的蓋玻片浸泡在含.3%3-氨基丙基二曱基乙氧基矽烷、.3%水的丙酮中。讓它們反應45分鐘。然後將它們在丙酮中漂洗，並於100。C固化1小時。可以用3-氨基丙基二曱基乙氧基矽烷替換3-氨基丙基三乙氧基矽烷，因為它在玻璃表面上形成單層。單層表面提供了更低的背景。還可以4吏用蒸氣沉積來應用矽烷化試劑。3-氨基丙基三乙氧基矽烷在溶液相中沉積時趨向於形成更多的聚合表面。然後用硫氰酸根基團終止氨基修飾的矽烷。這是在10%吡啶和90%>^\[-二曱基曱醯胺(DMF)的溶液中進行的，每ml溶液使用2.25mg對苯二異硫氰酸(鹽/酯)(PDC)。反應運行2小時，然後將蓋玻片在曱醇中清洗，接著是丙酮和水漂洗。然後將蓋玻片乾燥並準備好結合探針。有別的化學可用於修飾矽烷化試劑末端的氨基基團。例如，可以用戊二醛將矽烷化試劑末端的氨基基團修飾成醛基，它可以偶聯至氨基修飾的寡核苷酸。將捕捉寡核苷酸結合至蓋玻片表面，通過將10-50mM捕捉寡核苷酸在100mM碳酸氫鈉水溶液中的溶液應用至表面。讓溶液乾燥，然後在水中清洗。避免用PDC終止3-氨基基團並進行直接偶聯(3-氨基末端的)至已經在5，末端用羧基基團或醛基基團修飾過的捕捉寡核苦酸可能是有益的。在羧基基團的情況中，寡核苷酸在含EDC(l-乙基-3-(3-二曱基氨基丙基)-碳二亞胺)的溶液中應用。在醛基基團的情況中，寡聚物保持溼潤達5-10分鐘，然後用硼氫化鈉的1%溶液處理表面。在本發明的另一個方面，使用納米大小的珠子來製備隨機陣列。使用亞微米玻璃或其它類型的珠子(例如在20-50nm範圍內)，將其用與環中的銜接頭寡核苷酸互補的短寡核苷酸(例如6-30個核苷酸)衍生化以產生串聯物。可以控制珠子上寡核苷酸的數目和序列的長度以微弱結合溶液中的串聯物。珠子的反應速率應當大大快於單獨使用固體支持物的反應速率。在結合串聯物後，容許珠子沉降在陣列基片的表面上。陣列基片具有更長、更穩定、更多的寡核苷酸，使得可以選擇條件來容許優先結合至表面，從而形成串聯物的帶間隔陣列。如果珠子是磁性的，可以使用磁場將它們拉至表面，還可以使用磁場使它們圍繞表面移動。或者，可以使用離心機將珠子集中至表面。例示性的規程如下1.將20(il串聯物溶液(每jil含lxl0S個串聯物)與20xl(^個納米珠(帶大約500條捕捉寡核苷酸，長度為大約8個鹼基，可以在不同條件下使用6-16個鹼基)混合。100nm納米珠的面積為大約40,000nm2,可持有多達4000條短寡核苷酸。控制捕捉探針密度的一種方法是在使用具有與捕捉探針相同的附著化學、長度為2-4個鹼基的寡核苷酸多大約8倍的情況中混合。同樣，可以使用小得多的納米珠(20-50nm)。2.調節反應條件(溫度、pH、鹽濃度)，使得具有超過300個拷貝的串聯物將以顯著數目附著至納米珠。3.在相同嚴格條件下將反應應用於支持物，4x4mm的壓花表面有16xl(^個大小為大約200nm的活性位點，並容許或迫使納米珠帶著大串聯物沉降在基片表面上。納米珠-串聯物需要移動的最大距離是大約lmm。珠子的垂直移動使可能遇到的串聯物-串聯物數目降至最低。反應液可以以等分試樣應用，例如應用4次，每次5pl。在這種情況中，所應用溶液的厚度(例如納米珠最大移動距離)只有大約250微米。4.進一步提高反應的嚴格性以從納米珠釋放串聯物並將它們附著至支持物上的活性位點(帶大約300條捕捉寡核苷酸，長度為20-50個鹼基)。5.附著於納米珠的串聯物最初將主要沉降在支持物上活性位點之間，因為無活性表面比活性表面多25倍。可以應用輕微的水平移動力(例如基片傾斜等其它力量)使納米珠-串聯物在周圍移動大約l微米至數微米。檢測設備如上所述，自依照本發明製備的隨機陣列上的單分子產生信號並可通過多種檢測系統來檢測，包括但不限於掃描電子顯微術、近場掃描光學顯微術(NSOM)、完全內部反射螢光顯微術(TIRFM)、等等。文獻中可以找到將此類技術應用於分析和檢測表面上納米尺度結構的豐富指導，正如收入本文作為參考的以下文獻所i正明的Reimer等,編，ScanningElectronMicroscopy:PhysicsofImageFormationandMicroanalysis,第2版(Springer,1998);Nie等,Anal.Chem.,78:1528-1534(2006);Hecht等，JournalChemicalPhysics,112:7761-7774(2000);Zhu等，編，Near-FieldOptics:PrinciplesandApplications(WorldScientificPublishing,Singapore,1999);Drmanac,國際專利出版物WO2004/076683;Lehr等,Anal.Chem.,75:2414-2420(2003);Ne露hafer等,Biosensors&Bioelectronics，18:489-497(2003);Neuschafer等,美國專利6，289，144;等等。特別感興趣的是TIRFM，例如披露於Neuschafer等，美國專利6,289,144;Lehr等(見上文)；及Drmanac，國際專利出版物WO2004/076683。一方面，與本發明陣列一起使用的儀器包含三個基本構件(i)用於保存和轉移檢測和加工試劑(例如探針、洗液、等等)至陣列的流控系統；(ii)容納或包含陣列且具有流通和溫度控制能力的反應室或流動槽；及(iii)光照和檢測系統。在一個實施方案中，流動槽具有溫度控制於系統，其有能力將溫度維持在大約5-95。C的範圍內，或者更具體的是10-85。C，而且能以每秒鐘大約0.5-2。C的速率改變溫度。一方面，可以使用適合l平方英寸、170微米厚的蓋玻片的流動槽，所述蓋玻片已經衍生化以結合本發明的大分子結構。該槽通過在兩個平面之間夾有玻璃和墊片而包圍住"陣列"。一個平面有一個大小足以容許成像的開口和一個供蓋玻片的分度溝(indexingpocket)。另一個平面有一個供墊片的分度溝、多個流體搶口、和一個溫度控制系統。一個流體艙口連接注射泵，它自流動槽中"吸出"液體或向流動槽中"注入"液體。另一個艙口連接漏鬥樣混合室。該室繼而配備液面傳感器。將溶液分發到漏鬥中，在需要時混合，然後吸到流動槽中。當液面傳感器讀到與流動槽相連的漏鬥中有空氣時，將泵翻轉已知量，使液體回到漏鬥中。這防止了空氣進入流動槽。蓋玻片表面可以分區，分成條，以適應由夾心式引起的液體流動/毛細管效應。此類基片42可以安置在"敞口"/"敞開，，室中以通過消除毛細管流效應而促進緩衝液均勻流過基片。成像可以用100倍物鏡使用TIRF或epi照明和130萬像素Hamamatsuorca-er-ag在Zeissaxiovert200或類似系統上實現。這種配置對隨機結合至基片的RCR串聯物(無序陣列)成像。通過降低物鏡放大倍數、使用柵格壓花的陣列和提高各圖像中所收集的數據的像素數目，可以提高成像速度。例如，可以使用多達4臺或更多照相機，優選在1000-1600萬像素的範圍內。還可以使用多帶濾過器(multiplebandpassfilter)和分色鏡來收集橫跨多達4個或更多發射光譜的像素數據。為了補償放大倍數降低的物鏡的更低光收集功率(lowerlightcollectingpower)，可以提高激發光源的功率。通過對各照相機使用一個或多個流動室,可以提高通過量，使得成像系統在樣品進行雜交/反應時不是空閒的。因為探查陣列可以是不連續的，可以使用超過一臺成像系統自一套陣列收集數據，進一步縮短測定時間。在成像過程中，基片必須保持焦點對準。維持焦點對準的一些關鍵因素是基片的平整度、基片與焦點面(focusplane)的正交性、和基片上可能使其變形的機械力。基片平整度可以較好的控制，很容易得到平整度優於^波的玻璃板。基片上不均勻的機械力可以通過正確設計雜交室而降至最低。與焦點面的正交性可以通過經過精細調整的高精度載物臺來實現。自焦(即自動對焦)例程一般需要另外的時間來運行，所以只在必要時運行。在得到各圖像後，使用快速算法進行分析以確定圖像是否焦點對準。在圖像焦點未對準的情況中，運行自動對焦例程。然後它將存儲在下一個成像循環過程中返回該陣列該部分時將使用的物鏡Z位置信息。通過在基片上多個位置定位物鏡Z位置，我們將降低獲取基片圖像所需要的時間。一種適用於基於焚光的信號的照明和檢測系統是ZeissAxiovert200,其配備了TIRF滑塊(slider)，與80毫瓦532nm固態雷射器偶聯。所述滑塊經物鏡以正確的TIRF照明角照明基片。通過經與基片光學偶聯的稜鏡照明基片，TIRF還可以在不使用物鏡的條件下實現。還可以使用平面波導(planarwaveguide)在基片上實施TIRF。還可以採用Epi照明。光源可以加光柵，傳播光束，相干的/耦合的(coherent)，非相干的/非耦合的(incoherent),且源自單光譜或多光譜源。成像系統的一個實施方案包含視野為1.25mm的20倍透鏡，檢測使用l千萬像素照相機來進行。這樣的系統對以l微米孔距附著於壓花陣列的大約150萬個串聯物成像。在此配置下，每個串聯物有大約6.4個像素。通過擴大或縮小物鏡的視野，可以調整像素數目/串聯物。例如，lmm視野將產生10個像素/串聯物的數值，而2mm視野將產生2.5個像素/串聯物的數值。可以相對於物鏡的放大倍數和NA來調整視野以產生仍能夠通過光學裝置和圖像分析軟體來分辨的最低像素計#1/串聯物。TIRF和EPI這兩種照明容許使用幾乎任何光源。一個照明方案是在成像儀間共享一套公用的單色照明源(大約4臺6-8種顏色的雷射器)。各成像儀在不同波長以任何給定時間收集數據，而各光源經光學轉換系統(6pticalswitchingsystem)轉向各成像儀。在這樣的一個實施方案中，照明源優選產生至少6種、但更優選8種不同波長。這樣的照明源包括氣體雷射器、經光纖耦合器(fibercoupler)組合的複式二極體抽運的固態雷射器(multiplediodepumpedsolidstatelaser)、過濾氣弧燈(filteredXenonArclamp)、可調諧雷射器(tunablelaser)、或更新穎的SpectralumLightEngine(不久將由TidalPhotonics提供)。SpectralumLightEngine使用稜鏡在光譜上將光分開。光譜4皮才殳射到數字光處理器(DigitalLightProcessor,TexasInstruments)上，它能選擇性的將光i普的任何部分反射到光纖或光連接器中。該系統能夠監測和校準橫跨各波長的功率輸出以保持它們恆定，從而自動補償因燈泡壽命或燈泡變化間的強度差異。下表呈現了可能的雷射、染料和濾光器的例子。tableseeoriginaldocumentpage44在24個小時裡通過每個區域大約350幅(每種顏色大約60幅)圖像對60億個串聯物成功的打分，可能需要聯合平行的圖像獲取、提高的圖像獲取速度、和對每臺成像儀擴大的視野。另外，成像儀可能支持6-8種顏色。商品化顯微鏡通常以0.8的NA在20倍放大倍數對大約lmm的視野成像。在0.5微米建議的串聯物孔距，這翻譯成約略4百萬個串聯物/圖像。這為每個雜交循環60億個斑點產生大約1，500幅圖像，或者350個成像循環產生50萬幅圖像。在大規模測序操作中，各成像儀優選每天獲得大約200,000幅圖像，基於對1600萬像素CCD的300毫秒曝光時間。如此，一種優選的裝置設計是4臺成像儀模塊，各自服務於4個流動槽(總共16個流動槽)。上述成像方案假設各成像儀具有1千萬像素的CCD檢測器且以約略300毫秒的曝光時間使用。這應當是收集6種螢光團標記物數據的可接受方法。這種成像技術的一種可能的缺點是某些螢光團可能遭到光源的非故意光致褪色，而其它螢光團得到成像。保持照明功率低且曝光時間最短將大大降低光致褪色。通過使用增強型CCD(ICCD),在照明強度和曝光時間比標準CCD低數個數量級的條件下，可以收集品質與標準CCD約略相同的數據。一般可利用在100-140萬像素範圍內的ICCD。因為它們需要短得多的曝光時間，在標準CCD獲取單幅圖像的時間裡，1百萬像素ICCD能獲取10幅或更多圖像。在聯合快濾光輪(fastfilterwheel)和高速流動槽載物臺使用時，1百萬像素ICCD應當能夠收集與l千萬像素標準CCD相同量的數據。能夠以高數值光圈對更大視野成像的光學裝置可以製作成定製透鏡裝配物(customlensassembly)。指示是可以製作能夠以大於0.9的NA對3mm視野成像的20倍光學裝置。兩種這樣的成像系統，在聯合高像素計數CCD或CCD馬賽克(即鑲嵌)陣列時，應當能夠在約略14個小時內對全部的八個流動槽測定成像。如所述的，使用16個流動槽可以實現更多的收穫。通過減少每個視野的圖像數，流動槽數目加倍將使成像時間縮短至9個小時。對串聯物和其它隨機DNA陣列的反應功效可能依賴於探針、錨或引物、和酶的有效j吏用。這可以通過混合液體(諸如在流通室中來回合併液體)、施加攪動或使用水平或垂直電場以4吏來自反應體積不同部分的DNA接近表面來實現。有效、低花費測定反應的一種方法是在薄層中應用反應混合物，諸如大小/厚度為大約l微米至幾微米、但優選小於10微米的小滴或薄層。在為lxW效米斑點區域指派的lxlxl微米體積中，在lpmo1/1(^1(lpM濃度)中將有大約1000個分子的探針，密切接近1-1000個拷貝的DNA。4吏用多達100-300個分子的探針，不會顯著降低探針濃度，而且將會提供足夠的發生反應的探針以得到顯著的信號。這種方法可用於開放式反應室，在清除和清洗探針和酶時可以保持開放或閉合。如上所述，可以使用多個照相機和多個流動槽來實現更高的吞吐量。單個機械臂液體操作臺可以服務於例如16個流動槽。另外，所述系統的所有構件可以共享公用溫度控制系統和成套試劑。對於組合式SBH測序操作，機械臂可以配製將要分發到流動槽漏鬥中的探針集合和連接緩衝液。專用注射泵可以將清洗緩衝液和雜交緩沖液直接分發到各流動槽的漏鬥搶口中。各成像儀可服務於一組2-4個流動槽。各組流動槽可定位在XY運動平臺上，與研究用顯微鏡上經常看到的自動化載物臺相似。所有系統構件間的系統控制和協調可以經由在主計算機上運行的軟體來進行。控制軟體可以異步運行測定循環，容許各成像儀在整個測定法期間連續運行。流動槽與具有一個加熱器和一個冷卻器的溫度控制系統相連，容許根據指令獨立加熱或冷卻各個流動槽或2-4個流動槽模塊。可以監測各流動槽的溫度，而且當流動槽的溫度降至設定閾值以下時，可以打開通向熱水再循環的閥門。類似的，當流動槽的溫度超過設定閾值時，可以打開通向冷水再循環的閥門。如果流動槽在設定的溫度範圍內，那麼兩個閥門都不打開。再循環的熱水和冷水流經鋁製流動槽體，但與測定緩沖液和試劑保持分開和分離。耙序列串聯物隨機陣列的序列分析如上所述，生物分子(諸如基因組DNA片段或cDNA片段)的隨機陣列提供了基於對序列標籤計數的大規模序列測定和基因組範圍測量的平臺，其方式與通過基因表達連續分析(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)或大量平4亍籤名測序(massivelyparallelsignaturesequencing)進4亍的觀"量相似，例如Velculescu等，(1995)，Science270:484-487及Brenner等(2000),NatureBiotechnology,18:630-634。所述基因組範圍測量包括但不限於多態性(包括核苷酸替代、刪除和插入、倒位、等等)的測定、曱基化樣式的測定、拷貝數樣式等等，諸如可通過極其多種本領域普通技術人員知道的測定法來進4亍,侈'Ji口Syvanen(2005),NatureGeneticsSupplement,37:S5-S10;Gunderson等(2005),NatureGenetics,37:549-554;Fan等(2003)，ColdSpringHarborSymposiaonQuantitativeBiology,LXVIII:69-78;及美國專利4,883,750;6,858,412;5,871,921;6,355,431;等等，收入本文作為參考。46多種測序方法學可用於本發明的隨機陣列，包括7f旦不限於基於雜交的方法，諸如披露於Drmanac，美國專利6,864,052;6,309,824;和6，401,267;及Drmanac等，美國專利出版物2005/0191656,收入本文作為參考；通過合成方法進行的測序，例如Nyren等，美國專利6,210,891;Ronaghi,美國專利6，828，100;Ronaghi等(1998)，Science,281:363-365;Balasubramanian,美國專利6,833,246;Quake,美國專利6,911，345;Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.,100:414-419(2003)，收入本文作為參考；和基於連接的方法，例如Shendure等(2005)，Science,309:1728-1739,收入本文作為參考。一方面，依照本發明測定靶多核苷酸的核苦酸序列的方法包括以下步驟(a)自靶多核苦酸產生眾多靶串聯物，各靶串聯物包含靶多核香酸的一個片段的多個拷貝，且所述眾多靶串聯物包括基本上覆蓋靶多核苷酸的許多片段；(b)形成使得至少大多數靶串聯物以光學上可分辨的密度固定在表面上的靶串聯物隨機陣列；(c)鑑定各靶串聯物中各片段的至少一部分的序列；並(d)自串聯物各片段各部分的序列的身份重建靶多核苷酸的核苷酸序列。通常，"基本上覆蓋"指所分析DNA的量相當於靶多核苷酸的至少2個拷貝；或者另一方面，至少10個拷貝；或者另一方面，至少20個拷貝；或者另一方面，至少100個拷貝。靶多核苷酸可以包括DNA片段(包括基因組DNA片段和cDNA片段)和RNA片段。法包括以下步驟(a)產生眾多多核苦酸分子，各自包含DNA或RNA片段的串聯物；(b)形成使得至少大多數靶串聯物以光學上可分辨的密度固定至表面的多核苷酸分子隨機陣列；並(c)使用光學上可檢測的反應物的至少一種化學反應鑑定可分辨多核苷酸中各DNA或RNA片段至少一部分的序列。在一個實施方案中，所述光學上可檢測的反應物是寡核苷酸。在另一個實施方案中，所述光學上可^r測的反應物是核苷三磷酸，例如焚光標記的核苷三磷酸，其可用於延伸與串聯物發生雜交的寡核苷酸。在另一個實施方案中，所述光學上可檢測的試劑是通過連接在串聯物上形成鄰近雙鏈體的第一和第二寡核苷酸而形成的寡核苷酸。在另一個實施方案中，所述化學反應是DNA或RNA的合成，例如通過延伸與串聯物發生雜交的引物。在又一個實施方案中，上述光學上可檢測的反應物是與核酸結合的寡肽或多肽或蛋白質。一方面，隨機陣列上串聯物的多核苷酸分析物的平行測序是通過組合SBH(cSBH)實現的，披露於Drmanac，見上文引用的專利。一方面，提供了第一套和第二套寡核苷酸探針，其中對於各套探針的規定長度，各套的成員探針包含具有每一種可能序列的寡核苷酸。例如，如果有一套包含長度為6的探針，那麼它包含4096(即46)種探針。另一方面，第一套和第二套寡核香酸探針包含具有選定核苷酸序列的探針，所述序列設計用於檢測選定組的靶多核苷酸。序列是如下測定的，用一種探針或探針集合進行雜交，用第二探針或第二探針集合進行雜交，連接在其輩巴序列上形成完美匹配雙鏈體的探針，鑑定那些連接的揮:針以獲得關於耙序列的序列信息，重複以上步驟直至所有探針或探針集合進行了雜交，並自雜交和鑑定步驟中積累的序列信息確定靶物的核芬酸序列。對於測序操作，在有些實施方案中，各套(探針)可以分成在集合中一起使用的子集，如美國專利6,864,052所披露的。來自第一套和第二套的探針可以與靶序列進行雜交，或是一起的或是序貫的，或是作為整套或是作為子集，或集合。一方面，第一套和第二套探針的長度在5-10個核苷酸的範圍內，另一方面，在5-7個核苦酸的範圍內，使得它們在連接後形成長度分別在10-20和10-14範圍內的連^~產物。另一方面，使用此類技術，各個所附著DNA串聯物的序列身份可以通過"籤名"方法來測定。使用大約50-100種或者可能200種探針，使得將會有大約25-50%或在有些應用中10-30°/。的所附著串聯物對各探針具有完全匹配的序列。這種類型的數據容許串聯物內的各擴增DNA片段定位至參比序列。例如，通過這樣的方法，可以在4色標記方案中使用16個雜交/剝離循環對64種4聚物(即所有可能的256種4聚物的25%)進行評分。在串聯物中所擴增的60-70個鹼基的片段上，64種探針中有大約16種將會是陽性的，因為長64個鹼基的序列中存在64種可能的4聚物(即所有可能的4聚物的四分之一)。無關的60-70個鹼基的片段將會有一套非常不同的大約16種陽性解碼探針。64種探針中取16種探針的組合在每10億個片段中出現的隨機機率是l,這實際上提供了該串聯物的獨特籤名。在20個循環中對80種探針進行評分並產生20種陽性探針，這產生了甚至更有可能是獨特的籤名發生機率是1018分之一。以前將"籤名法"用於自cDNA文庫中選出新基因。籤名法的一種實施是分揀所有經測試探針得到的強度並選出直到滿足陽性探針閾值的探針達到預定(預期)數目。這些探針將定位至預計在陣列中存在的所有DNA片段的序列(可以使用更長參比序列的滑動窗)。將具有所有或統計學足夠數目的所選陽性探針的序列指派為給定串聯物中DNA片段的序列。在另一種方法中，可以用預先測量的完全匹配和錯配雜交/連接功效為所有所用探針定義預期信號。在這種情況中，可以計算與關聯因子(correlationfactor)相似的量度。對4聚物進行評分的一種優選方式是連接各對探針，例如N(w)BBB與BN(7_9),其中B是規定鹼基而N是筒並鹼基。為了在更長DNA串聯物探針上產生籤名，將使用更多獨特鹼基。例如，長度為1000個鹼基的片段中25%的陽性率將通過N(4.6)BBBB和BBN(6.8)來實現。注意，更長片段需要相同數目的大約60-80種探針(15-20個連接循環，使用4種顏色)。在一個實施方案中，可以使用給定長度的所有探針(例如4096種N2.4BBBBBBN2.4)或所有連接對來測定串聯物中DNA的完整序列。例如，可以對N(5.7)B3與BBN(6.s)的1024種組合進行評分(256個循環，如果使用4種顏色的話)以測定直到大約250個鹼基、優選直到大約100個鹼基的DNA片段的序列。含多個N的測序解碼探針可以自簡併鹼基處序列子集的多重合成來製備以將功效差異降至最低。將各子集以適當濃度加至混合物。還有，有些子集可以具有比其它子集更多的簡併位置。例如，來自那套N(w)BBB的64種探針各自可以在4次不同合成中製備。第一次是規則的，所有5-7個鹼基都是完全簡併的；第二次是N0-3(A,T)5BBB;第三次是N0-2(A，T)(GC)(A,T)(G,C)(A,T)BBB;而第四次是N0-2(G,C)(A,T)(GC)(A,T)(GC)BBB。將來自三項特異合成的寡核苦酸製備物以實驗測定的量添加至規則合成物中以提高與靶序列的雜合物產生，所述靶序列在BBB序列的前面有富含AT的序歹'J(例如AATAT)或(A或T)與(G或C)交替的序列(例如ACAGT或GAGAC)。預計這些序列形成雜合物方面不太有效。可以對所有1024種靶序列測試與N。.3NNNNNBBB探針形成雜合物的功效，而那些給出最微弱結合的類型可以在大約1-10項另外的合成中製備並添加至基礎探針製備物。根據籤名的解碼。用於少數不同樣品的更少數探針20種探針(5個循環，使用4種顏色)中有5-7種陽性有能力區分大約l-10萬種不同片段。8-20聚物RCR產物的解碼。在此應用中，陣列形成為DNA串聯物形式的獨特的8-20個鹼基的識別序列的隨機分布。需要對探針解碼以確定8-20個鹼基的探針區的序列。至少有兩種選擇可用於實現此目的，下面的例子描述了用於12聚物的方法。首先，通過利用短探針的雜交特異性和完全匹配雜合物的連接特異性，確定一半序列。與12聚物相鄰的6-10個鹼基預先確定並充當6聚物至10聚物寡核苷酸的支持物。這種短6聚物將在其3，末端連接至4種經過標記的6聚物至10聚物之一。這些解碼探針由4種寡核苷酸的集合組成，其中每種寡核苦酸由4-9個簡併鹼基和l個確定鹼基組成。這種寡核苷酸還將用四種螢光標記物之一標記。因此4種可能的鹼基即A、C、G或T各自將由一種螢光染料來代表。例如，這5組4種寡核苷酸和1種通用寡核苷酸(U)可用於連接測定法以測定12聚物前5個鹼基的序列B-4種鹼基中的每一種，末端結合有特定染料或標籤UUUUUUUU.BNNNNNNN*UUUUUUUU.NBNNNNNNUUUUUUUU.NNBNNNNNUUUUUUUU.NNNBNNNNUUUUUUUU.NNNNBNNN用另外的探針集合可以測定6個或更多鹼基的序列。為了提高12聚物中央附近位置的辨別力，可以進一步將6聚物寡核苷酸定位到12聚物序列中。這使將簡併鹼基摻入未標記寡核苷酸的3，末端成為必要以適應移位。這是用於12聚物中第6和7位的解碼探針的一個例子。UUUUUUNN.NNNBNNNNUUUUUUNN.NNNNBNNN以相似的方式，可以通過使用固定的寡核苦酸和5，標記的探針來解碼12聚物右側的6個鹼基。在上文所述系統中，需要6個循環來界定12聚物一側的6個鹼基。憑藉遠離連接位點的鹼基的多餘循環分析，此方法可增至7個或8個循環。那麼，總的來說，12聚物的完全測序可通過12-16個連接循環來實現。通過聯合兩種不同類型的解碼探針文庫進行的排列好的DNA的部分或完全測序。在這種方法中，一套探針是通用型N3.sB4-6(錨)，與來自各套BN6-8、NBN5-7、N2BN4.6和N3BN3.5的前2種或前3種或前4種探針/探針集合連接。主要的要求是在少數循環中測試來自第一套的l種探針及來自第二套的2-4種或甚至更多種探針以在僅僅3-4個循環中讀出更長連續序列，諸如5-6+3-4=8-10。在一個例子中，其過程是501)將l-4種4聚物或更多種5聚物錨進行雜交以獲得70-80。/。的DNA每個有1種或2種錨。區別來自集合的哪種錨是陽性的一種方法是混合具有不同雜合物穩定性的特異探針(可能另外有不同數目的N)。錨還可以進行標記以確定來自集合的哪種錨與斑點發生了雜交。可以將標籤(像另外的DNA區段)用於可調整的置換，作為4企測方法。例如，EEEEEEEENNNAAAAA和相應的置換物差異性的消除EEEEEEEENNNNN和FFFFFFFFNNNNNNNN，其中第二種更有效。可以使用分開的循環，僅僅用於確定哪種錨是陽性的。為此目的，可以將用多種顏色標記的錨連接至未標記的N7-N10支持物寡核苷酸。2)將對應於4種鹼基有4種顏色的BNNNNNNNN探針進行雜交；有區別的進行清洗(或被標籤的互補物置換)以讀出哪兩種評分鹼基與哪種錨有關聯，如果兩種錨在一種DNA中是陽性的。如此，可以同時對兩種7-10個石鹹基的序列打分。在為另外的2-4個鹼基延伸至4-6個鹼基的錨的2-4個循環中，每個陣列運行16種不同的錨(32-64個物理循環，如果使用4種顏色的話)以測定每個片段大約16種可能的8聚物(總共大約100個鹼基)(足以將其定位至參比序列(100聚物具有一套10種8聚物的概率小於1024分之一。通過組合在另一個陣列中在同一片段上平行打分的不同錨的數據，可以自交疊的7-10聚物產生該片段的完整序列，並延伸至整個基因組。為了解碼或序列測定探針的更大多重性用DNA標籤標記探針。代替直接標記探針，可以用天然鹼基或新型合成鹼基(諸如isoG和isoC)製成的不同寡核苷酸序列標記它們。使用不同的寡核苷酸長度(大約6-24個鹼基)和/或序列，包括GC含量，標籤可以設計成對它們的抗標籤物具有非常精確的結合功效。例如，可以設計4種不同標籤，它們可以用特異性抗標籤物在4個序貫循環中或者在一個雜交繼以區別性清洗的循環中來識別。在區別性清洗中，各標籤的初始信號分別降至95-99%、30-40%、10-20%和0-5%。在這種情況中，通過獲取兩幅圖像，得到了4項量度，假設具有不同標籤的探針將很少與同一圓點發生雜交。具有許多不同標籤(即使它們序貫解碼，或者用2-16種不同顏色標記時一次2-16種)的另一個好處是在同一測定反應中使用大量可獨立識別探針的能力。這樣，可承擔得起4-64倍更長測定時間(可提51供更特異性或更強烈的信號)，如果探針在短溫育和消除反應中解碼的話。解碼過程需要使用48-96種或更多種解碼探針。通過將它們用四種各自具有不同發射光i普的螢光團編碼，這些集合將進一步組合成12-24個或更多個集合。使用20倍物鏡時，使用l千萬像素照相機的話，各6mmx6mm陣列的完全覆蓋可能需要約略30幅圖像。各1微米陣列面積由大約8個像素讀出。各圖像在250毫秒中獲得，150ms用於曝光，100ms用於移動載物臺。使用這種快速獲取，各陣列的成像將需要大約7.5秒，或者各基片上整套96個陣列的成像需要12分鐘。在成像系統的一個實施方案中，這種高圖像獲取速率是通過使用四臺各自對不同螢光團的發射光i普成像的1千萬像素照相機來實現的。將照相機通過一系列分色光束分離器(dichroicbeamsplitter)偶聯至顯微鏡。只在所得圖像對焦不準時運行需要額外時間的自動對焦例程。然後它將存儲在下一個成像循環過程中返回該陣列該部分時將使用的Z軸位置信息。通過在基片上定位各位置的自動對焦位置，我們將大大降低獲取圖像所需要的時間。各陣列需要大約12-24個循環來解碼。各循環包括雜交、清洗、陣列成像、和剝離步驟。對於上文的例子，這些步驟以它們各自的次序可能各需要5、2、12和5分鐘，每個循環總共24分鐘，或者約略各陣列5-10個小時，如果各操作是線性進行的話。通過容許系統持續成像，務陣列解碼需要的時間可以縮短一半。為了實現這一目的，各顯微鏡上兩個分開的基片的成像交錯進行。當一個基片在反應時，另一個基片在成像。使用cSBH的例示性解碼循環包括以下步驟(i)將陣列的溫度設成雜交溫度(通常在5-25。C範圍內)；(ii)使用機械臂移液器來預先混合小量的解碼探針與適宜量的雜交緩沖液；(iii)將混合後的試劑轉移到雜交室中；(iv)雜交預定的時間；(v)使用泵(注射器或其它)從(雜交)室中排出試劑；(vi)添加緩沖液以清洗非雜合物的錯配；(vii)將(雜交)室的溫度調整至適宜的清洗溫度(大約10-40。C);(viii)排乾(雜交)室;(ix)添加更多的清洗緩沖液，如果改進成像需要的話；(x)對各陣列成像，優選用中間放大率(20倍)顯微鏡物鏡，其在光學上偶聯至高像素計數、高靈敏度ccd照相機、或照相機；載物臺在物鏡上移動(雜交)室(或者可能是具有輸入漏鬥的流動槽)，或者物鏡-光學裝置裝配物在(雜交)室下移動；可以採用某些光學排列(使用分色鏡/光束分離器)來同時收集多光譜圖像，如此降低圖像獲取時間；可以部分的或整個的對陣列成像，取決於陣列/圖像大小/像素密度；可以通過排列圖像將各部分裝配在一起，使用統計學顯著的在基片上預編碼的空白區域(在活性位點產生過程中)，或者可以使用多步驟納米印刷技術來進行，例如可以使用特異捕捉探針列印位點(激活位點的柵格)，剩下柵格中的空白區域；然後，使用分開的列印頭在該區域中印刷不同的樣式或捕捉探針；(xi)排乾(雜交)室並用探針剝離緩衝液(或者用早就加載的緩衝液)置換，然後將(雜交)室加熱至探針剝落溫度(60-90。C);剝離步驟中可以使用高pH緩沖液以降低剝離溫度；等待規定的時間；(xii)除去緩沖液；(xiii)用成套的下一種解碼探針集合開始下一個循環。標記物和通過針對本發明陣列上的多核苷酸的探針進行的信號產生本發明的寡核苷酸探針可以以多種方式標記，包括放射性模塊、螢光模塊、比色模塊、化學發光模塊、等等的直接或間接附著。用於標記DNA和構建DNA銜接頭的方法學的許多全面評論提供了可用於構建本發明寡核苷酸探針的指導。此類綜述包括Rricka,Ann.Clin.Biochem.,39:114-129(2002);Schaferling等，Anal.Bioanal.Chem.,(April12，2006);Matthews等，Anal.Biochem"Vol169,pgs.1-25(1988);Haugland,HandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals,第10片反(Invitrogen/MolecularProbes,Inc.,Eugene,2006);KellerandManak，DNAProbes,第2版(StocktonPress,NewYork,1993);及Eckstein,編,OligonucleotidesandAnalogues:APracticalApproach(IRLPress,Oxford,1991);Wetmur,CriticalReviewsinBiochemistryandMolecularBiology,26:227-259(1991);Hermanson,BioconjugateTechniques(AcademicPress，NewYork,1996);等等。可應用於本發明的許多更具體方法學披露於以下參考文獻例子Fung等，美國專利4,757,141;Hobbs,Jr.等，美國專利5,151，507;Cmickshank,美國專利5,091，519;(用於附著報導基團的官能化寡核苷酸的合成)；Jablonski等，NucleicAcidsResearch,14:6115-6128(1986)(酶-寡核苷酸偶聯物)；Ju等，NatureMedicine,2:246-249(1996);Bawendi等，美國專利6,326,144(衍生化螢光納米晶體)；Bruchez等，美國專利6,274,323(書亍生化螢光納米晶體)；等等。一方面，使用一種或多種螢光染料作為用於寡核苷酸探針的標記物，例如披露於Menchen等，美國專利5,188,934(4,7-二氯螢光素染料)；Begot等，美國專利5,366,860(光譜可分辨的羅丹明染料)；Lee等，美國專利5,847，162(4,7-二氯羅丹明染料)；Khanna等，美國專利4,318，846(醚取代的螢光素染料);Lee等，美國專利5，800,"6(能量轉移染料)；Lee等，美國專利5，066，580(咕噸染料)；Mathies等，美國專利5,688,648(能量轉移染料)；等等。標記還可以用量子點(quantumdot)來進行，如收入本文作為參考的以下專利和專利出版物所披露的:6,322,901;6,576,291;6,423,551;6,251,303;6,319,426;6,426,513;6，444,143;5,990,479;6,207,392;2002/0045045;2003/0017264;等等。在用於本文時，術語"焚光信號產生模塊"指發信號的手段，它經由一種或多種分子的焚光吸收和/或發射特性來傳送信息。所述螢光特性包括螢光強度、螢光壽命、發射光譜特徵、能量轉移、等等。可用於摻入標記寡核苷酸的商業性螢光核苷酸類似物包括例如Cy3畫dCTP、Cy3-dUTP、Cy5-dCTP、Cy5-dUTP(AmershamBiosciences,Piscataway,NewJersey,USA)、螢光素-12-dUTP、四曱基羅丹明-6-dUTP、TexasRed-5-dUTP、CascadeBlue⑧畫7畫dUTP、BODIPYFL-14國dUTP、BODIPYR-14-dUTP、BODIPYTR-14-dUTP、RhodamineGreenTM-5-dUTP、OregonGreen488-5-dUTP、TexasRed-12-dUTP、BODIPY630/650-14-dUTP、BODIPY650/665-14陽dUTP、AlexaFluor488匿5-dUTP、AlexaFluor532-5-dUTP、AlexaFluor568-5-dUTP、AlexaFluor594-5-dUTP、AlexaFluor546-14-dUTP、焚光素-12-UTP、四曱基羅丹明-6-UTP、TexasRed-5-UTP、CascadeBlue-7-UTP、BODIPYFL-14-UTP、BODIPYT證-14-UTP、BODIPYTR匿14-UTP、RhodamineGreenTM-5-UTP、AlexaFluor488-5-UTP、AlexaFluor546-14-UTP(MolecularProbes,Inc.Eugene,OR,USA)。可用於合成後附著的其它焚光團包括AlexaFluor350、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor647、BODIPY493/503、BODIPYFL、BODIPYR6G、BODIPY530/550、BODIPYTMR、BODIPY558/568、BODIPY558/568、BODIPY564/570、BODIPY576/589、BODIPY581/591、BODIPY630/650、BODIPY650/665、CascadeBlue、CascadeYellow、丹醯、麗絲胺羅丹明B、MarinaBlue、OregonGreen488、OregonGreen514、PacificBlue、羅丹明6G、羅丹明綠、羅丹明紅、四曱基羅丹明、TexasRed(MolecularProbes,Inc.,Eugene,OR,USA)、及Cy2、Cy3.5、Cy5.5和Cy7(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ,USA等)等。還可以使用FRET串聯萸光團，諸如PerCP-Cy5.5、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-TexasRed和APC畫Cy7;還有PE-Alexa染料(610、647、680)和APC-Alexa染料。生物素或其書f生物也可以作為標記物用在檢測寡核苷酸上，隨後由可糹企測標記的親合素/鏈黴親合素衍生物(例如藻紅蛋白偶聯的鏈黴親合素)或可檢測標記的抗生物素抗體所結合。可以摻入地高辛配基(digoxigenin)作為標記物，隨後由可4企測標記的抗地高辛配基抗體(例如螢光素化抗地高辛配基)所結合。可以將氨基烯丙基-dUTP殘基摻入檢測寡核芬酸，隨後偶聯至N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)衍生化螢光染料，諸如上文所列。一般而言，可以將偶聯物對的任何成員摻入檢測寡核苷酸，倘若可檢測標記的偶聯物配偶體在結合後容許進行檢測。在用於本文時，術語抗體指任何類別的抗體分子，或其子片段，諸如Fab。其它適用於檢測寡核苷酸的標記物可以包括螢光素(FAM)、地高辛配基、二硝基酚(DNP)、丹醯、生物素、溴脫氧尿苷(BrdU)、六組氨酸(6xHis)、磷-胺基酸(例如P-tyr、P-ser、P-thr)、或任何其它合適的標記物。在一個實施方案中，使用以下半抗原/抗體對來進行檢測，其中各抗體用可檢測標記物進行衍生化生物素/抗生物素、.地高辛配基/抗地高辛配基、二硝基酚(DNP)/抗DNP、5-歡基螢光素(FAM)/抗FAM。如下文方案所述，探針還可以進行間接標記，尤其是用半抗原，之後該半抗原得到捕捉劑的結合，例如披露於Holtke等，美國專利5,344,757;5,702,888;和5,354,657;Huber等，美國專利5,198,537;Miyoshi,美國專利4,849，336;Misiura和Gait，PCT出版物WO91/17160;等等。許多不同的半抗原-捕捉劑對可用於本發明。例示性的半抗原包括生物素、des-生物素和其它衍生物、二硝基酚、丹醯、螢光素、CY5和其它染料、地高辛配基、等等。對於生物素，捕捉劑可以是親合素、鏈黴親合素或抗體。抗體可以用作其它半抗原的捕捉劑(許多染料-抗體對已商業化，例如MolecularProbes)。本發明的試劑盒在本文所述方法的商業化中，用於構建本發明隨機陣列和用於將本發明隨機陣列用於各種應用的某些試劑盒是特別有用的。用於應用本發明隨機陣列的試劑盒包括但不限於用於測定靶多核苷酸的核苷列的試劑盒、用於大規模鑑定參比DNA序列與測試DNA序列間差異的試劑盒、用於外顯子序型分析的試劑盒、等等。試劑盒通常包含至少一種具有表面的支持物和一種55或多種構建本發明隨^L陣列或用其實施應用所必需或有用的試劑。所述試劑包括但不限於核酸引物、探針、銜接頭、酶、等等，而且各自包裝在容器中，諸如但不限於小瓶、管或瓶，在適於商業分發的包裝中，諸如但不限於盒子、密封袋、泡罩(blisterpack)和硬紙盒。包裝通常包含標籤或包裝插頁，指明所包裝物質的用途。在用於本文時，"包裝材料"包括為了分發試劑盒中的物質而進行的包裝中所使用的任何物品，包括但不限於容器、小瓶、管、瓶、袋、泡罩(blisterpackaging),標籤、標牌、指示頁和包裝插頁。一方面，本發明提供了用於自來源核酸製備DNA片段的串聯物的隨機陣列的試劑盒，其包含以下成分(i)具有表面的支持物；及(ii)至少一種銜接頭寡核香酸，用於連接至各DNA片段並與其形成DNA環，各DNA環能夠通過滾環複製反應進行複製以形成能夠隨機部署到表面上的串聯物。在此類試劑盒中，所述表面可以是具有離散分隔區陣列的平坦表面，其中各離散分隔區的大小相當於所述串聯物的大小。離散分隔區可以形成最近相鄰距離在0.1-20iLim範圍內的規則陣列。離散分隔區上的串聯物可以具有使得它們在光學上可分辨的最近相鄰距離。離散分隔區可以附著有捕捉寡核苦酸，而銜接頭寡核苷酸可以各自具有與捕捉寡核苷酸互補的區域使得串聯物能夠通過在捕捉寡核苷酸與銜接頭寡核苷酸的互補區域之間形成複合物而附著至離散分隔區。在有些實施方案中，串聯物隨機分布在所述離散分隔區上且最近相鄰距離在0.3-3卞m範圍內。此類試劑盒可以進一步包含(a)末端轉移酶，用於將同聚物尾附著至所述DNA片段以提供供所述銜接頭寡核苷酸的第一末端結合的位點，(b)連接酶，用於將所述銜接頭寡核苷酸的一條鏈連接至所述DNA片段的末端以形成所述DNA環，(c)引物，用於與所述銜接頭寡核苷酸鏈的一個區域退火，及(d)DNA聚合酶，用於使與鏈退火的引物在滾壞複製反應中延伸。上述銜接頭寡核芬酸的第二末端可以具有數目在4-12個範圍內的簡併;鹹基。另一方面，本發明提供了用於靶多核苷酸測序的試劑盒，其包含以下成分(i)具有平坦表面的支持物，所述表面具有光學上可分辨的離散分隔區的陣列，其中各離散分隔區的面積小於lnm、(ii)第一套探針，用於與隨機部署在離散分隔區上的眾多串聯物雜交，所述串聯物各自包含靶多核苷酸的DNA片段的多個拷貝；及(iii)第二套探針，用於與眾多串聯物雜交，使得只要來自第一套的探針和來自第二套的探針(與靶物)發生毗鄰的雜交，兩探56針就得到連接。此類試劑盒可以進一步包含連接酶、連接酶緩沖液、和雜交緩衝液。在有些實施方案中，離散分隔區可以附著有捕捉寡核苷酸，而串聯物可以各自具有與捕捉寡核苷酸互補的區域，使得所述串聯物能夠通過形成捕捉寡核香酸與所述串聯物的互補區域間的複合物而附著至離散分隔區。又一方面，本發明提供了用於構建單分子陣列的試劑盒，其包含以下成分(i)具有表面的支持物，所述表面具有反應性官能度；及(ii)眾多大分子結構，各自具有一個獨特官能度和多個互補官能度，所述大分子結構能夠隨機附著在表面上，其中所述附著是通過一個或多個反應性官能度與一個或多個互補官能度的反應所形成的一個或多個聯接而形成的；且其中所述獨特官能度能夠與分析物分子上的官能度選擇性起反應以形成單分子陣列。在此類試劑盒的有些實施方案中，所述表面是具有離散分隔區陣列的平坦表面，該離散分隔區包含所述反應性官能度，且其中各離散分隔區的面積小於lpm2。在又一個實施方案，所述離散分隔區形成最近相鄰距離在0.1-20(im範圍內的規則陣列。在又一個實施方案，離散分隔區上的串聯物具有使得它們在光學上可分辨的最近相鄰距離。在還有一個實施方案中，所述大分子結構可以是一個或多個DNA片段的串聯物且其中所述獨特官能度位於串聯物的3，末端或5"末端。另一方面，本發明包括用於環化DNA片段的試劑盒，其包含以下成分(a)至少一種銜接頭寡核苷酸，用於連接至一種或多種DNA片段並與其形成DNA環；(b)末端轉移酶，用於將同聚物尾附著至所述DNA片段以提供供所述銜接頭寡核香酸的第一末端結合的位點，(c)連接酶，用於將所述銜接頭寡核苦酸的一條鏈連接至所述DNA片段的末端以形成所述DNA環，(d)引物，用於與所述銜接頭寡核苷酸的所述鏈的一個區域退火，及(e)DNA聚合酶，用於在滾環複製反應中延伸與所述鏈退火的引物。在此類試劑盒的一個實施方案中，上述銜接頭寡核苷酸的第二末端可以具有數目在4-12個範圍內的筒並鹼基。上述試劑盒可以進一步包含用於末端轉移酶、連接酶和DNA聚合酶的反應緩衝液。又一方面，本發明包括用於<吏用Circligase酶(EpicentreBiotechnologies,Madison,WI)環化DNA片段的試劑盒，該試劑盒包含體積排阻聚合物(volumeexclusionpolymer)。另一方面，此類試劑盒進一步包含以下成分(a)反應緩衝液，用於為Circligase控制pH和提供經過優化的鹽組合物，及(b)Circligase輔因子。另一方面，用於此類試劑盒的反應緩沖液含0.5MMOPS(pH7.5),0.1MKC1,50mMMgCl2，和10mMDTT。另一方面，此類試劑盒包含Circligase,例如10-100]liLCircligase溶液(濃度為100個單位/iiL)。例示性的體積排阻聚合物披露於美國專利4,886,741，包括聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、硫酸右旋糖苷、及類似聚合物。一方面，聚乙二醇(PEG)是500/0PEG4000。一方面，用於環形成的試劑盒包含以下成分量成分終濃度2jiLCircligaseIO版應緩衝液IX0單lmMATP250.5pL50mMMnCl21.25mM4)iL50%PEG400010%Circligase單鏈DNA連接酶(l00個單位/pL)10個單位/[iL單鏈DNA模板0.5-10pmol/fiL無菌水反應終體積20|iL。在如下規程中4吏用上述成分1.於60-96。C加熱DNA，取決於DNA(具有5，-磷酸根和3，-羥基的單鏈DNA模板)的長度。2.於60。C預熱2.2X^應混合液大約5-10分鐘。3.若DNA預熱至96。C，讓其於60。C冷卻。4.於60。C混合DNA和緩沖液，沒有讓它冷卻，並溫育2-3小時。5.加熱滅活酶以終止連4妻反應。通過錯配酶切割進行的大規^莫突變發現所使用的本發明陣列和測序方法可用於使用錯配切割技術的大規模多態性鑑定。數種突變檢測方法採用異源雙鏈體，其中利用錯配自身來進行切割識別。在用羥胺或四氧化鋨修飾的錯配處用哌啶進行化學切割，提供了釋方丈切割片l殳的一種方法。以相似的方式，酶T7內切核酸酶I或T4內切核酸酶VII已經用於酶錯配切割(EMC)技術，例如Youil等，Proc.Natl.Acad.Sci.,92:87-91(1995);Mashal等，NatureGenetics,9:177-183(1995);Babon等,MolecularBiotechnology,23:73-81(2003);Ellis等，NucleicAcidsResearch,22:2710-2711(1994);等等，收入本文作為參考。切割片段長度多態性(CFLP)技術中使用了切割酶，這種技術已經由ThirdWaveTechnologies實現商業化。當58容許單鏈DNA摺疊並採耳又二級結構時，DNA將形成內部髮夾環，其位置取決於鏈的鹼基序列。切割酶將切割環5，端的單鏈DNA,然後可以通過PAGE或類似的大小解析技術來分離片段。錯配結合蛋白(諸如MutS和MutY)鑑定突變位點的能力也依賴於異源雙鏈體的形成。錯配通常得到修復，但是酶的結合作用可用於經由凝膠電泳中的泳動率變化或通過針對外切核酸酶的保護而選擇片段，例如Ellis等(見上文)。供異源雙鏈體形成的模板是通過自基因組DNA延伸引物而製備的。對於參比DNA的同一基因組區域，以與測試DNA相同的方式但在分開的反應中製備過量的相對鏈。所生成的測試DNA鏈進行生物素化並附著至鏈黴親合素支持物。通過力口熱和消除互補鏈來防止同源雙鏈體形成。現在將參比製備物與單鏈測試製備物混合併退火以生成異源雙鏈體。此異源雙鏈體有可能包含許多錯配。在添加錯配內切核酸酶之前洗去殘餘DNA,所述錯配內切核酸酶預計將會為10kb引物延伸物產生大約10個片段，如果每lkb有一處錯配的話。切割後，各個片段可以在各個末端結合銜接頭並進入錯配片段環選擇過程。自大基因組片段捕捉錯配切割的DNA。如上所述自大基因組片段製備的5-10kb基因組片,殳通過用末端轉移酶在3，末端添加生物素化雙脫氧核苷酸而生物素化，並通過過濾除去過量的生物素化核苷酸。用同一6鹼基切割酶消化覆蓋同一序列區域的參比BAC克隆以匹配自測試DNA產生的片段。將生物素化的基因組片段在存在BAC參比DNA時熱變性並緩慢退火以產生生物素化異源雙鏈體。參比BACDNA大大過量於基因組DNA，使得大多數生物素化產物將是異源雙鏈體。然後可以將生物素化DNA附著至表面供消除參比DNA。在添加錯配內切核酸酶之前洗去殘餘DNA。切割後，各個片段可以在各個末端結合銜接頭並進入如下錯配環選擇過程。(a)在錯配的兩側切割DNA。(b)產生可連接的5，懸垂(也通過用具有4鹼基識別位點的適宜限制性內切核酸酶進行消化而產生3，懸垂)。(c)引入在一側包含活性懸垂的銜接頭。(d)將銜接頭連接至兩個所產生片段中的每一個(在將序列添加至上鏈的3，末端後，只連接至5，磷酸根的右邊)。(e)將分子磷酸化並使用橋接寡核苷酸來連接單鏈分子的兩個末端。(f)環化後，通過在RCR^應中延伸引物而生成串聯物。自錯配切割產物形成環方法I。上文產生的異源雙鏈體可用於選擇小DNA環，如圖7和8所示。如圖7所示，在此方法中，將樣品的異源雙鏈體(700)用錯配酶處理，在兩條鏈(704和706)上突變位點(702)附近都進行了切割，產生片段(707)和(705)。T7內切核酸酶I或類似的酶在兩條鏈上在突變附近切割突變位點的5，端以展現不同長度的5，端懸垂。下一階段是以適於擴增和測序的形式捕捉切割產物。將銜接頭(710)連接至通過錯配切割產生的懸垂(只顯示了片段(705))，但是因為懸垂的本質未知，所以需要至少三種銜接頭且每種銜接頭用筒並鹼基合成以適應所有可能的末端。銜接頭可以製備成在非環化鏈上有內部生物素(708)以容許捕獲物進行緩衝液交換和樣品清潔，還在需要時容許在表面上直接擴增。因為突變之間的居間序列不需要測序且降低了系統的測序能力，所以在研究基因組衍生樣品時將其消除。序列複雜性的降低是通過在遠離酶識別序列的一個點處切割DNA的IIs型酶實現的。在這樣做時，切割位點和所得懸垂將是所有鹼基變體的組合。可以使用的酶包括MmeI(20個鹼基，具有2個鹼基的3，懸垂)和EcoP151(25個鹼基，具有2個鹼基的5，懸垂)。銜接頭的長度約為50bp,為序列提供滾環複製的起始，還為環的形成提供填充序列，以及Hs型限制性內切核酸酶的識別位點(715)。一旦銜接頭連接至片段，將DNA用IIs型限制酶消化(720)以釋放所有序列，但包含突變位點的20-25個鹼基仍然附著於銜接頭。現在將連有銜接頭的DNA片段附著至鏈黴親合素支持物以消除過量的DNA片段。未與錯配切割的末端連接的過量銜接頭也將結合至鏈黴親合素固相支持物。現在可以將由IIs型酶產生的新的簡併末端連接至第二銜接頭，其通過第二銜接頭一條鏈的磷酸化來實現。另一條鏈是非磷酸化的且3，末端是用雙脫氧核普酸封閉的。所形成的結構基本上是兩個不同銜接頭之間捕獲的目的基因組片段。由此結構產生環僅僅需要該分子的兩個末端聚到一起並連接，例如經由通過限制性位點(722)和(724)處的消化形成交錯的末端，接著進行分子內連接。儘管此事件應當高效發生，但是仍有可能另一分子的末端與該分子的另一末端連接，產生二聚體分子或各個單元分子的更高級的多聚體。將此降至最低的一種方法是在稀釋的條件下進行連接，使得只有分子內連接是有利的，然後將樣品重新濃縮供將來的步驟4吏用。將環形成的效率升至最高且沒有分子間連接的另一種策略是封閉表面上的過量銜接頭。這可通過使用X外切核酸酶消化下鏈來實現。如果第二銜接頭已經附著，那麼它將免受消化，因為沒有可用的5，磷酸。如果只有第一銜接頭附著於表面，那麼5'磷酸因銜接頭下鏈的降解而暴露。這將導致過量的第一銜接頭自表面上喪失。人外切核酸酶處理後，第一銜接頭上鏈的5，末端準備好供連接第二銜接頭的3，末端。這可通過將限制酶位點引入銜接頭使得該分子可在連接時發生重新環化來實現。捕獲到環狀分子中的DNA的擴增以滾環複製進行，形成環的長線性串聯物拷貝。如果延伸在生物素的5，端起始，那麼環和新合成的鏈釋放到溶液中。表面上的互補寡核苷酸負責濃縮並提供足夠附著供下遊應用。一條鏈是閉環並充當模板。3'末端暴露的另一條鏈充當起始引物並延伸。方法II。如圖8所示，此方法與上述規程類似，但做了以下修改l)銜接頭可製備成非環化鏈上有3，端生物素(808)以容許捕獲物進行緩沖液交換和樣品清潔。2)上文所述10kb異源雙鏈體片段的序列複雜性降低經由切割4個鹼基的限制酶的使用而發生，例如限制性位點(810)、(812)和(814)。一個反應中使用2種或3種酶，可以將基因組片段的大小降低至大約100個鹼基。銜接頭-DNA片段可附著至鏈黴親合素支持物以消除過量的DNA片段。未連接至錯配切割末端的過量銜接頭也將結合至鏈黴親合素固相支持物。現在可通過自5，末端降解的X外切核酸酶消除生物素化且磷酸化的鏈但非磷酸化鏈保持完整。為了自此結構產生環，現在需要分子的兩個末端聚到一起並連接以形成環。數種方法可用於使用橋接寡核苷酸來形成環，如上所述。可以用末端轉移酶將一條多核苷酸添加至3，末端以產生供橋接寡核苷酸(818)的一半與之發生雜交的序列，顯示為polyA尾(816)。另一半將結合銜接頭中的序列。或者，在添加外切核酸酶之前，可以將銜接頭添加至由4鹼基切割酶產生的末端，這將提供在用外切核酸酶消除一條鏈後供橋(橋接寡核苷酸)與之發生雜交的序列。這種選擇規程的一個關鍵方面是選擇供環化和擴增的鏈的能力。這確保了只有具有初始突變的鏈(來自5，端懸垂)而非來自銜接頭的鏈得到擴增。如果3，端凹進鏈得到擴增，那麼來自銜接頭的錯配會在突變位點處或附近產生虛假鹼基呼叫(falsebasecall)。捕獲到環狀分子中的DNA的擴增以滾環複製進行，形成環的線性串聯物拷貝。錯配衍生環的其它應用。錯配衍生的小環狀DNA分子可通過其它手段來擴增，諸如PCR。可以將公用引物結合位點摻入銜接頭序列。擴增得到的物質可用於通過諸如Sanger測序或基於陣列的測序等方法進行的突變檢測。cDNA的無細胞克隆選擇。傳統的克隆方法有數項缺點，包括細菌傾向於排斥來自質粒複製的序列、產生個體cDNA分子的克隆所需要的方案費時且費試劑。可以自關閉到環狀形式中的DNA分子的擴增來製備線性單鏈。當分到單個反應室中時，這些大型串聯的、線性形式源自單分子且可充當高效的、分離的PCR把物，與挑取細菌菌落以獲取包含cDNA的質粒的方式非常相似。我們計劃將這種方法開發成無需經過基於細胞的克隆選擇步驟就選擇cDNA克隆的手段。此規程的第一步將牽涉連接針對5，末端的基因特異性寡核苷酸，其具有polydA序列供結合cDNA3，末端的polydT序列。此寡核苷酸充當橋以容許T4DNA連接酶來連接兩個末端並形成環。反應的第二步是使用引物或橋接寡核苷酸，供鏈置換聚合物諸如Phi29聚合物產生環的串聯物。然後將長線性分子稀釋並排列在1536孔板中，使得可選擇具有單分子的孔。為了確保大約10%的孔包含1個分子，將不得不犧牲大約90%的孔，即它們沒有分子。為了檢測陽性的孔，使識別靶物中通用子。通過與i《物素化捕捉寡聚物的雜交^^肖lj過量的樹狀聚體。用螢光讀板儀分析各孔並對DNA的存在情況評分。然後將陽性孔重新排列，即將克隆合併，使板中的全部孔供進一步擴增。剪接變g測和外顯子序型分析所述方法基於隨機DNA陣列和"巧妙的"探針集合，用於對數以千計的基因及其剪接變體進行鑑定和表達水平定量。在真核生物中，隨著自轉錄複合體出現初級轉錄物，剪接體與初級轉錄物上的剪接位點相互作用以切出內含子，例如Maniatis等，Nature,418:236-243(2002)。然而，或是因為改變剪接位點序列的突變或是因為影響剪接體與剪接位點相互作用的外部因素，可變剪接位點或隱蔽剪接位點可能得到選擇，導致由具有不同外顯子組的mRNA編碼的蛋白質變體得以表達。對來自大規模EST測序計劃的cDNA序列的調查指出超過50%的基因具有已知的剪接變體。在使用基於微陣列方法的最近的一項研究中，估計高達75%的基因是可變剪接的，例如Johnson等,Science,302:2141-2144(2003)。通過可變剪接產生的蛋白質的多樣性可部分促成高等真核生物中的生物學過程的複雜性。這還暗示蛋白質變體形式的異常表達可引起疾病的發病機理。事實上，已經發現可變剪接與多種疾病有關聯，像生長激素缺乏、帕金森氏病、嚢性纖維化和強直性肌營養不良，例如Garcia-Blanco等，NatureBiotechnology,22:535-546(2004)。由於難以分離和表徵新的剪接變體，暗示剪接變體在癌症中的作用的證據可代表冰山的一角。憑藉能迅速且可靠的表徵mRNA剪接樣式的工具的可用性，它將有助於闡明可變剪接在癌症中和在疾病發展中的一般作用。一方面，本發明的方法容許以如下步驟大規模測量剪接變體(a)製備所輩巴向的或所有的mRNA的全長的第一條cDNA鏈。(b)通過摻入銜接頭序列將所產生的全長的(或所有的)第一條cDNA鏈分子環化。(c)通過使用與銜接頭序列互補的引物，進行cDNA環的滾環複製(RCR)以形成具有超過100個拷貝起始cDNA的串聯物。(d)通過將RCR所生成的"cDNA球"附著於用捕捉寡核苦酸(其與銜接頭序列的一部分互補)包被的玻璃表面來製備隨機陣列；憑藉高級亞孩t米壓花表面，lmn^可以有100-1000萬個cDNA斑點；注意，附著是分子過程且不需要用機械臂對各個"cDNA球"或串聯物點斑點。(e)自4096種6聚物和1024種經過標記的5聚物的預製通用文庫開始，使用複雜的電腦程式和筒易的機械臂移液器來創建40-80個大約200種6聚物和20種5聚物的集合，用於測試樣品生物體/組織中所靶向的1000種或更多直至所有已知基因中的所有10,000個或更多個外顯子。(f)在一個4-8小時.的進程中，在相同的隨機陣列上在40-80個循環中雜交/連接所有探針集合，使用配有靈敏的1千萬像素CCD檢測器的自動化顯微鏡樣儀器為每個循環生成陣列圖像。(g)使用電腦程式來進行斑點信號強度分析以鑑定哪種cDNA在哪個斑點上及任何所分析的基因中是否缺失了任何預期的外顯子。通過對陣列中的出現計數，獲得每種剪接變體的精確表達水平。此系統使用與經過標記的mRNA/cDNA雜交的當前表達陣列提供了單一轉錄物上外顯子樣式的完整分析，而非僅僅提供關於外顯子使用率的比率或所轉錄基因整個群體上剪接事件的定量的信息。在其最大限度的靈敏度，它容許精確至數以百計的其它細胞中只有一個中存在mRNA各類型單個分子的詳細分析；這將提供癌細胞早期診斷的獨特潛力。選擇性cDNA製備與標準384孔格式的"隨機陣列的陣列，，及與通用短探針的"巧妙的"集合的組合在設計陣列時提供了極大的靈活性；例如，所選擇的樣品中少數基因的深入分析、或更多數目樣品中更普遍的分析、或更小數目樣品中多數基因的分析。這些分析同時提供了l)每種特定剪接變體的檢測，2)野生型和可變剪接mRNA的表達的定量。它還可用於基於基因刪除和基因易位的檢測來監測總的染色體改變，其通過來自隨機陣列上單一斑點上的相同轉錄物中兩種基因的兩種外顯子子集的存在和雜合性的喪失。這種陣列的非凡容量(capacity)和忠實度(informativeness)與自非常小數量的mRNA的簡單樣品製備，基於所有預先製備的、經過驗證的試劑(包括經過標記的和未經標記的通用探針及最終將為所有人類和模式生物基因開發的引物/銜接頭的文庫)的完全自動化的測定法有關係。建議的剪接變體序型分析方法相當於個別全長cDNA克隆的高通量測序；rSBH通過量可達到在4-8小時的測定中對十億個cDNA分子進行序型分析。此系統將提供強有力的工具來監測疾病出現和進展過程中各種剪接變體表達水平的變化。它使人們能夠發現新的剪接變體或者驗證已知的剪接變體，用以充當生物標誌物來監測癌症進展。它還可提供進一步了解可變剪接變體的作用及其作為治療靶的可能用途的手段。這種低成本、高通量測定法的通用性質和靈活性為癌症研究和診斷學及在所有其它生物醫學領域提供了極大的商業機會。這種高容量系統對提供服務的實驗室和公司是理想的。供體外轉錄的模板的製備。將外顯子序列克隆入質粒pBluescript或類似載體的多克隆位點(MCS)。為證明探針集合的有用性，不必克隆毗鄰的全長序列，也不必維持正確的蛋白質編碼框。對於短於lkb的基因，使用全長序列的基因特異性寡聚物自cDNA產生PCR產物。對於較長的基因，產生包含大約500bp的PCR產物，對應於外顯子的毗鄰嵌萃殳，並通過克隆入pBluescript的MCS中適宜克隆位點而安排好片段。這也是用於克隆可變剪接型式的方法，因為期望的變體可能不存在於用於PCR的cDNA來源中。MCS的最後一個位點用於插入一串40個A以模擬細胞mRNA的polyA尾。這是為了控制polyA尾可能干擾下文所述樣品製備步驟的可能性，儘管預計這不是問題，因為如所述的在基因組片段的樣品製備中摻入了poly-dA尾。T7RNA聚合酶將用於產生複印(run-off)轉錄物，而所產生的RNA將用標準方法純化。供排列的樣品的製備。因為探針集合是為特定基因設計的，所以只為那些特定基因製備cDNA。為引發逆轉錄反應，使用基因特異性引物，因此為641000種基因使用1000種引物。小心選擇逆轉錄的引發位點的位置，因為期望高效合成》kb的cDNA是不合理的。相當常見的是，最後一個外顯子將由編碼序列末端和長3'非翻譯區組成。在例如CD44的情況中，儘管全長mRNA是大約5.7kb，3'UTR包含3kb，而編碼區只有2.2kb。因此，逆轉錄引物位點的合理位置通常緊挨著編碼序列末端的下遊。對有些剪接變體，可選外顯子常常簇集在一起成一嵌段(block)以創建變異性區域。在TenascinC變體(8.5kb)的情況中，最常見的同等型(isoform)具有8個額外外顯子的嵌段，而且有證據表明該區域的外顯子使用率存在變異性。因而對於TenascinC，引物將緊挨著該區域的下遊。因為對於合成長度〉2kb的cDNA的擔心，對於長基因，用多種引物將外顯子分成2kb的嵌段可能是必需的。逆轉錄反應可以用商業系統進行，例如Invitrogen(Carlsbad,CA)的SuperscriptIII系統和Stratagene(LaJolla,CA)的StrataScript系統。一旦產生單鏈cDNA分子，剩餘規程牽涉放上銜接頭序列、分子的環化、和RCR,如上所述。cDNA的5'末端基本上是摻入的基因特異性引物，其用於起始逆轉錄。通過在逆轉錄引發寡聚物的5'末端摻入7個鹼基的通用標籤，產生的所有cDNA將在5'末端攜帶相同的7個石成基的序列。如此，與梯f接頭序列和通用標籤二者互補的單一模板寡核苷酸可用於將銜接頭與所有靶分子連接，無需使用具有筒並鹼基的模板寡核苷酸。至於通常限定較弱的cDNA3'末端(mRNA5'末端)，它可以像基因組片段的隨機序列末端來對待。將應用添力口polyA尾的類似方法，如此還可以使用相同的閉環反應。逆轉錄酶傾向於過早終止而產生截短的cDNA。嚴重截短的cDNA大概不會具有足夠的探針結合位點以鑑定出基因指派(名稱)(geneassignment),如此不會進行分析。接近但非全然全長的cDNA分子可能表現為缺失5'外顯子的剪接變體。如果沒有來自序列資料庫的確實證據支持這樣的變體，可忽視它們。避免此類問題的一種方法是只選擇全長cDNA(或那些具有期望的3'末端的)以與閉環反應相容，則任何截短的分子將不會進行環化，也不會進行複製。首先，可以將雙脫氧胞嘧啶殘基添加至所有cDNA的3'末端以封閉連接，然後通過使用靶向期望序列的錯配寡聚物，可以使用T4內切核酸酶VI1通過酶錯配切割產生新的3'末端。憑藉新的3'末端，cDNA可以繼續前行，即添加poly-dA尾及環化和複製的標準方案。經過複製且排列好的外顯子片段串聯物可以使用組合SBH來進行，如上第l步選擇1000-2000個最短的外顯子(合計約20-50kb)，並為1024種可利用的已標記5聚物中的每一種找出匹配序列。平均每種5聚物將在20kb上出現20次，但有些可能出現超過50次或超過100次。通過選擇最頻繁的5聚物，將用單一已標記探針檢測到最大數目的短外顯子。一個目的是每個循環檢測出大約50-100個短外顯子(500個外顯子的10%-20%)。如此，少於10種已標記探針和50-100種未標記6聚物就將是足夠的。小數目的已標記探針是有利的，因為它使總體螢光背景降至最低。第2步找出與所有1000種基因中與10種選定的5聚物互補的所有位點毗鄰的所有6聚物。平均每2kb基因中將存在20個這樣的位點。位點總數將是大約20，000個，例如，每種6聚物平均將出現5次。根據命中頻率分揀6聚物。最頻繁的可具有超過20次命中，例如這樣的6聚物通過聯合10種已標記探針將檢測出20種基因。如此，為了對500種基因中的每一種得到單一探針對，將需要最少25種6聚物探針。實際上，可能需要100-200種6聚物。由於使用預製的6聚物和5聚物探針文庫的組合SBH的好處，使用已建立的移液機械臂容易的製備了40個探針集合，每個集合有大約200種探針。所產生的信息相當於每個外顯子上有超過3種探針，因此8000種5聚物和6聚物的使用有效取代了單組1000種基因所需要的30,000種較長外顯子特異性探針。外顯子序型分析。外顯子的序型分析可以以兩個階^殳進行基因鑑定階段和外顯子鑑定階段。在基因鑑定階段，陣列上的每個串聯物可唯一的鑑定為特定基因。理論上，使用如下方案10個探針集合或雜交循環將足以鑑定IOOO種基因。每種基因指派一個唯一的二進位代碼。二進位數字的位數如此取決於基因總數8種基因需要3位數，1024種基因需要10位數。每個探針集合設計成對應於二進位代碼的一個數位，而且包含將會命中半數基因的獨特組合的探針，而且每種基因只有一次命中。如此，對於每個雜交循環，對於該數位，獨特的一半基因將得分1而另一半將得分0。使用IO個探針集合的IO個雜交循環將產生1024種唯一的二進位代碼，足以將1OOO種獨特基因指派給陣列上的所有串聯物。為了提供鑑定數據的冗餘，將使用15-20個循環。若使用20個循環，它將提供l百萬個獨特的二進位代碼，而且應當有足夠信息來解決由於缺失外顯子或基因刪除引起的信號喪失。它還將相當於平均每種基因有10個數據點(20個循環，每個循環500個數據點，合計產生10,000個數據點)，或每個外顯子有一個陽性探針對。在這點上，在20個循環後，這種系統能夠將1百萬個獨特基因身份指派給串連物(ampliot)。因此通過對串連物的基因身份計數，可定量測定任何給定樣品中所有基因的表達水平(但非剪接變體的亞型分型)。在將每個串連物鑑定為基因指派(名稱)後，它的外顯子樣式將在外顯子鑑定階段中進行序型分析。對於外顯子鑑定階段，每個雜交循環測試所有或大多數基因中的一個外顯子每種基因。在大多數情況中，10-20個外顯子鑑定循環應當是足夠的。如此，在使用20個外顯子鑑定循環的情況中，我們將得到每種基因中10個外顯子每個2種探針的信息。對具有超過20個外顯子的基因，可以發展方法從而在同一循環中可以探查每種基因2個外顯子。一種可能性是使用不同顏色的多種螢光團，另一種可能性是使用不同連接探針對的差異雜合物穩定性。總之，合計大約40個測定循環將提供足夠信息以獲得每個斑點處的基因身份，及為10,000個外顯子中的每一個提供3個匹配的探針對，以足夠的信息冗餘提供因可變剪接或染色體刪除而^:失的外顯子的精確鑑定。實施例實施例l:蓋玻片作為隨機陣列支持物衍生化方案在此實施例中，將蓋玻片(glasscoverslip)準備好用作部署DNA串聯物(concatemer)的支持物。使用了以下材料Millipore去離子(DI)水2.5ml3-氨基丙基二曱基乙氧基矽烷(Gelest)1.6克對苯二異碌b氰酸(鹽/酉旨)(AcrosOrganics/fisher)210克KOH(VWR)乙醇(VWR)曱醇(VWR)吡啶(VWR)N,N-二曱基曱醯胺(VWR)丙酮(VWR)設備100。C烘箱》茲力4覺4半臺(magneticstirplate)l個2"x.5"》茲力4覺4半豐奉(magneticstirbar)2個4升Nunc燒杯7個4"x8"x4"玻璃容器l升量筒l個100ml量筒l臺實驗室天平l臺Metzle沃平l個大稱量碟(weighboat)l個小稱量石萊l對厚的腈手套l個大漏鬥lml移液器及帶濾板的尖頭l個nalgene攪拌棒l個密^J"容器(tupperware)使用大量筒量取950ml乙醇並倒入4升Nunc燒杯。用小量筒量取50ml去離子水並倒入前述Nunc燒杯。在實驗室天平上在稱量碟中稱取21O克KOH顆粒。將攪拌棒和KOH顆粒置入燒杯。將燒杯置於攪拌臺上並以低速攪動直至KOH完全溶解。在KOH溶解時，擺出6個預先清洗過的玻璃容器。向容器2-5中倒入去離子水至距頂部^英寸(約800ml)。向容器6中倒入丙酮至距頂部1/2英寸。將溶解後的K0H溶液小心倒入容器1至距頂部^英寸。將擱在架子上的蓋玻片在容器1中放置3分鐘，從容器l中取出架子並在容器2-5中清洗，即在每個容器中放置最少15秒鐘。將架子在容器6中短暫淹沒。將架子置於一邊，使用大漏鬥和厚腈手套將容器l和2中的溶液倒入鹼性廢水容器(basicwastecontainer),清潔和乾燥實驗器具。擺出7個乾淨且乾燥的玻璃容器。將775ml丙酮倒入容器l並將2.5ml去離子水倒入容器l。用移液器尖頭攪動容器l達20秒鐘。用一個新的移液器尖頭將2.5ml3-氨基丙基二曱基乙氧基矽烷加至容器l。用移液器尖頭攪動10秒鐘。將全部5個架子上的蓋玻片浸入容器1。用聚丙烯盒蓋蓋上容器l。等待45分鐘。反應完成前15分鐘，向容器2-4中倒入丙酮至距頂部^英寸，向容器5中倒入水至距頂部K英寸。向容器6中倒入68丙酮至距頂部K英寸。在反應完成時U5分鐘)，將蓋玻片架子1-5從容器1轉移至容器2，等待15秒鐘。重複這一操作至容器6。將架子置入空的容器7並置入100。C烘箱。等待1小時。擺出7個玻璃容器。從烘箱中取出架子後，使用Meltzer天平在小稱量碟中稱取1.6克對苯二異疏氰酸(鹽/西旨)(PDC)。將720ml二曱基曱醯胺倒入清潔過的l升量筒，用吡啶補至800ml。將50%的前述溶液倒入一個乾淨的玻璃容器，然後倒回量筒以混勻(重複一次)。將前述溶液倒入容器1至距頂部1/2英寸。將PDC從稱量碟加至容器1。使用攪拌棒混合溶液。碾壓未溶解的PDC團塊，然後再次攪動。蓋玻片架子現在應當是涼的。將全部5個架子置入容器l。蓋上聚丙烯盒蓋。等待2小時。反應完成前10分鐘，向容器2和3中倒入曱醇至距頂部K英寸。向容器4和5中倒入丙酮至距頂部乂2英寸。向容器6中倒入65。/。丙酮35。/c)水至距頂部i/2英寸。向容器7中倒入丙酮。將架子相繼轉移經過全部容器，在每次轉移間等待15秒鐘。從容器7中取出架子，並將容器l-7的內容物倒入有機廢液缸(organicwastedrum)。將架子放回容器7，並在供箱中乾燥15分鐘。將乾燥的架子置入密封的容器，它們現在為附著做好準備了。實施例2:自大腸桿菌基因組DNA製備RCR產物並部署在蓋玻片上將大腸桿菌基因組DNA(32嗎)(SigmaChemicalCo)用0.16UDNA酶I(Epicentre)於37。C消化10分鐘，然後於95。C熱滅活10分鐘。根據瓊脂糖凝膠電泳的測定，反應產物的分布以200bp為平均大小。如果反應產物沒有達到所需大小分布，那麼添加新鮮的酶進一步消化它們。終濃度為200ng/(xl基因組DNA。將DNA酶消化後的DNA(26ng/Vl)與購自NewEnglandBiolabs(NEB)的末端脫氧核芬酸轉移酶(0.66U/^)在NEB供應的反應緩衝液中進行反應。反應含有dATP(2mM)並於37。C進行30分鐘，然後於70。C熱滅活10分鐘。然後將DNA樣品加熱至95。C達5分鐘，之後在冰上迅速冷卻。然後將合成的DNA銜接頭連接至基因組DNA的5，端，這通過首先65個鹼基的寡核香酸(TATCATCTACTGCACTGACCGGATGTTAGGAAG寡核苷酸(NNNNNNNGTCCGTTAATGTGAC3'2'3'ddC)(SEQIDNO:9)在該65聚物的3，端形成雜合物，其中7個"N"形成突出端。較短的寡聚物將充當該65聚物與基因組片段5，端連接的夾板(splint)。夾板分子在其5，端包含7個筒並鹼基以與基因組DNA5'端的可變鹼基發生雜交。銜接頭雜合物是通過在52(1l中緩慢雜交1200pmol銜接頭與1200pmol夾板自95。C至室溫達l小時形成的。將T4DNA連接酶(0.3U/V1)與基因組DNA(17ng/nl)和銜接頭-夾板(0.5pM)在NEB供應的1X連接酶反應緩衝液中混合。連接於15。C進行30分鐘、20°C進行30分鐘，然後於70。C滅活10分鐘。然後將第二夾板分子(AGATGATATTTTTTTT3'2'3'ddC)(SEQIDNO:10)(0.6^M)加至反應體系中並向混合液中添加更多的連接酶緩沖液和T4DNA連接酶(0.3U4U)。反應於15。C進行30分鐘，然後於20。C進行30分鐘，之後於70。C滅活1O分鐘。然後將連接混合液用外切核酸酶I(NEB)(lU4il)於"。C處理60分鐘，接著於80。C滅活20分鐘。在含BSA(0.1pg/^1)、dNTP(每種0.2mM)、起始S1物(TCAGCTTCCTTTTGTCTTCCTAAC)(SEQIDNO:11)(2finol/Vl)、經外切核酸酶處理的基因組DNA連接物(24pg/pl)、和Phi29聚合酶(0.2U/)il)的NEB供應的反應緩衝液中進行滾環複製(RCR)。反應於30。C進行1小時，然後於70。C熱滅活10分鐘。將RCR^應產物附著至蓋玻片的表面，這通過首先將經胺修飾的寡核苷酸附著於蓋玻片的表面。在O.lpMNaHC03中將捕捉探針GG)(SEQIDNO:12)(50pM)加至經DITC衍生化的蓋玻片並使之於40。C乾燥約30分鐘。將蓋玻片在DDI水中漂洗15分鐘並乾燥。然後將RCR^應產物(4.5pl)與0.5^120XSSPE混合併加至蓋玻片的中央。讓樣品風乾並洗去未附著的物質，即在3xSSPE中清洗10分鐘，然後在DDI水中短暫清洗。然後將蓋玻片乾燥，之後裝配到顯微鏡上。顯現附著的RCR產物，這通過TAMRA標記的、與銜接頭的一個區域互補的ll聚物探針的雜交來實現。AAAAAAAAAAAA)(SEQIDNO:13)形成RCIL良應產物，只是未用TDT(末端脫氧核苦酸轉移酶)添加polyA。RCR反應含有靶物分子，估算為12.6finol/pl。將反應產物(5pl)與SSPE(2X)和SDS(0.3%)在20^1總反應體積中混合。將樣品施加至蓋玻片，其中數行在含0.1pMNaHCO3的50nM溶液中沉積的捕捉探針([AMINOC6][Sp-C18]在溼盒(humidchamber)中放置30分鐘。然後洗去溶液，即在3xSSPE中清洗IO分鐘，然後在水中短暫清洗。對多種反應成分測試了它們對RCR產物形成的影響。發現將Phi29以0.1U4il而非0.2U/ial的終濃度添加至RCRA應產生更大比例的RCR產物，即在用檢測探針進行雜交後亮度更大。還發現以相對於估算的靶物濃度10-100倍摩爾比添加起始？1物是最佳的。延長延伸時間產生更強的螢光信號但趨向於產生更散布的串聯物。就當前的附著方案而言，2小時的延伸時間相對於1小時的溫育產生增強的信號，對RCR產物形態學的有害影響最小。通過將RCR反應中合成的和基因組的靶物的估算濃度降低至0.1-0.25fmoLVl，實現了RCR產物的進一步優化。這通常使用附著方法l在顯微鏡蓋玻片的表面上產生獨特且唯一的RCR產物。對於RCRA應中可能存在更高濃度的靶物(例如〉5fmol4d)的合成靶物，可通過方法2來附著RCR產物。附著方法l:將RCR^應產物(4.5iil)與0.511120XSSPE混合併加至蓋玻片的中央。使樣品風乾並洗去未附'著的物質，即在3xSSPE中清洗10分鐘，然後在DDI水中短暫清洗。然後將蓋玻片乾燥，之後裝配到顯微鏡上。顯現附著的RCR產物，這通過TAMRA標記的、與銜接頭的一個區域互補的ll聚物探針的雜交來實現。附著方法2:將RCR^應產物(l[il)與5(Hil3XSSPE混合併加至附著有捕捉探針的蓋玻片的中央。發現添加SDS(0.3%)促進特異性附著至捕捉探針而非經衍生化的表面。將樣品於室溫溫育30分鐘並洗去未附著的物質，即在3xSSPE中清洗10分鐘，然後在DDI水中短暫清洗。然後將蓋玻片乾燥，之後裝配到顯微鏡上。顯現附著的RCR產物，這通過TAMRA標記的、與銜接頭的一個區域互補的ll聚物探針的雜交來實現。上述方案提供了大約每2-4平方微米有l個RCR產物的RCR產物密度。所得蓋玻片的例示性圖像見圖3。實施例3:使用螢光標記的探針來區分隨機陣列上的RCR產物將來自炭疽芽孢桿菌CBacZ〃wsawf/2racz》和鼠疫耶爾森氏菌(re"z'"/ape幼》的診斷區的PCR產物轉變成單鏈DNA並附著至通用銜接頭(universaladaptor)。然後將這兩份樣品混合，使用RCR—起複製並作為隨機陣列沉積到玻璃表面上。與擴增子特異性4笨針的相繼雜交顯示，陣列上的每個斑點唯一的對應於兩種序列之任一，而且它們可以用探針特異性的鑑定，如圖4所示。這個結果證明了鑑定亞微米大小的DNA串聯物(其具有通過RCR反應產生的大約100-1000個拷貝的DNA片段)中存在的DNA的靈敏性和特異性。使用標準PCR才支術用PCR引物(引物對中的一條引物是-岸酸化的)擴增來自炭疽芽孢桿菌的155bp擴增子序列和來自鼠疫耶爾森氏菌的275bp擴增子序列。通過使用X外切核酸酶降解磷酸化的那條鏈，產生單鏈形式的PCR產物。然後使用T4DNA多核苷酸激酶將剩餘那條鏈的5'末端磷酸化，以容許單鏈產物與通用銜接頭的連接。使用T4DNA連接酶將通用銜接頭連接至靶物分子的5'末端，其得到與靶物的5，末端和通用銜接頭的3'末端互補的模板寡核苷酸的輔助。然後使用其鹼基與銜接頭和靶物的3'末端互補的橋接寡核苷酸將連接了銜接頭的靶物環化。通過外切核酸酶I的處理，除去線性DNA分子。通過混合單鏈模板和使用Phi29聚合酶環繞經環化的銜接頭-靶物分子進行複製(以橋接寡核苷酸作為起始引物)，產生RCR產物(DNA串聯物)。為了準備好蓋玻片供附著經胺修飾的寡核苷酸，將蓋玻片首先在鉀/乙醇溶液中清潔，接著漂洗和乾燥。然後將它們用3-氨基丙基二曱基乙氧基矽烷、丙酮、和水的溶液處理45分鐘，並在烘箱中於100。C固化(cure)l小時。作為第一步，將蓋玻片用對苯二異硫氰酸(鹽/酯)(PDC)、吡啶、和二曱基曱醯胺的溶液處理2小時。捕捉寡核苦酸(序列5'-GGATGTTAGGAAGACAAAAGGAAGCTGAGG-3')(SEQIDNO:14)與通用銜接頭序列互補，而且在5'末端用胺基團和2個C-18接頭修飾。為了附著，將10pl以1(HiM溶於0.1MNaHC03的捕捉寡聚物點到經衍生化的蓋玻片的中央，在70。C烘箱中乾燥10分鐘，並用水漂洗。為了創建DNA串聯物陣列，將含有DNA串聯物的RCR^應液用3XSSPE稀釋10倍，然後取20pl沉積在蓋玻片表面上的固定化後的捕捉寡核苷酸之上，即在飽和溼盒(moisturesaturatedchamber)中放置30分鐘。然後將帶有DNA串聯物的蓋玻片裝配到反應盒(reactionchamber)中並用2ml3XSSPE漂洗。對排列好的、衍生自炭疽芽孢桿菌和鼠疫耶爾森氏菌PCR擴增子的靶物串聯物分子用TAMRA標記的以下寡聚物相繼探查探針BrPrb3(序列5'-CATTAACGGAC-3'(SEQIDNO:15),與通用銜接頭序列特異性互補)、探針Ba3(序列5'-TGAGCGATTCG-3'(SEQIDNO:16),與Ba3擴增子序列特異性互補)、探針Yp3(序列5'-GGTGTCATGGA-3'，與Yp3擴增子序列特異性互補)。將探針以0.1pM濃度與陣列在3XSSPE中於室溫雜交20分鐘。用2ml3XSSPE洗去過量的探針。用TIRF顯微鏡採集圖像。然後用lml3XSSPE於80。C5分鐘剝離探針，為下一輪雜交準備排列好的靶物分子。通過疊加自3種探針的相繼雜交得到的圖像，如圖4所示，可以看到與銜接頭探針雜交的排列好的分子大多數只是與擴增子l探針(例如圖4中的"A")和擴增子2探針(例如圖4中的"B")中任一發生雜交，很少與二者都發生雜交。這種特異性雜交樣式證明了陣列上的每個斑點只含有一種類型的序列，或是炭疽芽孢桿菌擴增子或是鼠疫耶爾森氏菌擴增子。實施例4:自含有一個簡併鹼基的合成80聚物寡核苷酸創建的排列好的串聯物中一個g位置的解碼可以將含有一個筒並鹼基的合成寡核苦酸的各個分子分成4個亞群，每個可以在該特定位置具有A、C、G和T鹼基中任一。在用這種合成DNA創建的串聯物陣列中，含有每種鹼基的斑點可各佔大約25%。通過對4種鹼基中每一種特異性的成對探針的四項相繼雜交和連接，證明了這些串聯物亞群的成功鑑定，如圖5所示。將5'磷酸化的、3'TAMRA標記的5聚物寡核苷酸與四種6聚物寡核苷酸之一配對。這4對連接探針中每一對應當與含A、C、G或T型式的耙物中任一發生雜交。對大多數靶物得到了大於3的鑑別得分(discriminationscore)，證明了鑑定納米球(nanoball)靶物間單鹼基差異的能力。鑑別得分為斑點的最高得分除以同一斑點的其它3種鹼基特異性信號平均值。通過調整測定條件(緩衝液組成、所有成分的濃度、循環中每個步驟的時間和溫度)，預期可以得到更高的信號對背景比和完全匹配對錯配比。在6聚物探針的斑點陣列上進行的類似連接測定實驗證明了這一點。在這種情況中，完全匹配/背景比為大約50,而平均完全匹配M告配比為30。結果進一步證明了測定串聯物中存在的DNA的部分或完全序列的能力，其通過增加連貫探針循環數或通過每個循環使用4種或更多種用不同染料標記的探針來實現。合成的寡核苷酸(T1A:5'-NNNNNNNNGCATANCACGANGTCATNAAAAAA-3')(SEQIDNO:13)在第32位包含一個筒並鹼基。將通用銜接頭連接73至此寡核苦酸並將銜接頭-TlADNA環化，如上所述。將使用滾環複製(RCR)反應在此靶物上製備的DNA串聯物排列到隨機陣列上。因為此隨機陣列上的每個斑點對應於源自單分子T1A的串聯複製拷貝，因此特定排列斑點中的DNA在對應於T1A第32位的位置將包含A或C或G或T。為了鑑定這些亞群，使用對4種鹼基中每一種特異性的一組4種連接探針。將5'磷酸化的、3'TAMRA標記的對應於TlA第33-37位的5聚物寡核苷酸(序列為CAAAC(探針TlA9b))與對應於第27-32位的以下6聚物寡核苦酸之一配對ACTGTA(探針TlA9a)、ACTGTC(探針TlA10a)、ACTGTG(探針TlAlla)、ACTGTT(探針TlA12a)。這4對連接探針中每一對應當與含A、C、G或T型式的T1A之任一發生雜交。對每個雜交循環，將探針與陣列在含T4DNA連接酶的連接/雜交緩沖液中於20。C溫育5分鐘。於20。C洗去過量的探針並用TIRF顯微鏡採集圖像。剝離結合的探針，為下一輪雜交做準備。將銜接頭特異性探針(BrPrb3)與陣列雜交以確定所有斑點的位置。然後將4對連接探針以0.4jaM與有鹼基標識的陣列相繼雜交，如圖5為四個斑點所示。很清楚，大多數斑點只與4對連接探針之一有關，因此可特異性的確定位於T1A第32位的鹼基的性質。實施例5:位於合成80聚物寡核苷酸末端的兩個筒並鹼基的解碼上文所述相同的合成寡核苷酸在5'末端包含8個簡併鹼基以模擬隨機基因組DNA末端。由此寡核苦酸創建的串聯物可具有這8個簡併鹼基，緊挨著銜接頭序列後面。為了證明對與已知的銜接頭序列相鄰的兩個未知鹼基測序的可行性，使用具有能與銜接頭序列3'端雜交的特異性序列的12聚物寡核苷酸(UK0-12序列5'-ACATTAACGGAC-3')(SEQIDNO:17)作為錨(anchor)，並4吏用一組16種TAMRA標記的、BBNNNNNN形式的寡核苷酸作為序列閱讀探針(sequence-readingprobe)。對每個雜交循環，將0.2^MUK0-12錨探針和0.4一BBNNNNNN探針與陣列在含T4DNA連接酶的連接/雜交緩衝液中於20。C溫育10分鐘。於20。C洗去過量的探針並用TIRF顯微鏡採集圖像。剝離結合的探針，為下一輪雜交做準備。使用BBNNNM^N探針集的一個子集(即以GA、GC、GG和GT替換BB)，自靶物創建的串聯物陣列上的斑點能夠鑑定為與這4種探針之一特異性結合的斑點，平均完全匹配/錯配比超過20，如圖6所示。定義本文中所使用的核酸化學、生化、遺傳學和分子生物學的術語和符號遵循本領域標準i侖文和教科書的術語和符號，例如Kornberg和Baker,DNAReplication,第2版,W.H.Freeman,NewYork,1992;Lehninger,Biochemistry,第2版，WorthPublishers,NewYork,1975;Strachan和Read,HumanMolecularGenetics,第2版,Wiley-Liss,NewYork,1999;Eckstein,編，OligonucleotidesandAnalogs:APracticalApproach,OxfordUniversityPress,NewYork,1991;Gait,編,OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach,IRLPress,Oxford,1984;諸如此類。"擴增子"指多核苷酸擴增反應的產物。也就是說，它是自一條或多條起始序列複製得到的一群多核苷酸，通常是雙鏈的。所述一條或多條起始序列可以是相同序列的一個或多個拷貝，或者可以是不同序列的混合物。擴增子可以通過多種擴增反應(其產物是一條或多條靶核酸的多個複製品)來生成。生成擴增子的擴增反應一般是"模板驅動的"，即反應物(或是核苷酸或是寡核苷酸)的鹼基配對在需要創造反應產物的模板多核苷酸中有互補物。一方面，模板驅動的反應指使用核酸聚合酶的引物延伸或使用核酸連接酶的寡核苷酸連接。此類反應包括但不限於聚合酶鏈式反應(PCR)、線性聚合酶反應、基於核酸序列的擴增(NASBA)、滾環複製等等，參閱收入本文作為參考的以下文獻Mullis等,美國專利4,683,195;4,965,188;4,683,202;4,800,159(PCR);Gelfand等，美國專利5，210,015(使用"taqman"探針的實時PCR);Wittwer等，美國專利6,174,670;Kacian等，美國專利5,399,491("NASBA，，)；Lizardi,美國專利5,854,033;Aono等，日本專利發表物JP4-262799(滾環複製)；等等。一方面，本發明的擴增子是通過PCR生成的。擴增反應可以是"實時"擴增，如果能得到能隨擴增反應的進行而測量反應產物的檢測化學的話，例如下文所述"實時PCR"或Leone等，NucleicAcidsResearch,26:2150-2155(1998)及類似文獻中記載的"實時NASBA"。在用於本文時，術語"擴增"指進行擴增反應。"反應混合物"指含有進行反應所必需的所有反應物的溶液，可包括但不限於緩衝劑(用於在反應期間將pH維持於選定的水平)、鹽、輔因子、清除劑(scavenger)等等。"互補的或基本上互補的"指核香酸或核酸間雙鏈體的形成或鹼基配對或雜交，諸如例如雙鏈DNA分子的兩條鏈之間的或寡核苷酸引物與單鏈核酸上引物結合位點之間的。互補的核苷酸一般指A與T(或者A與U)、C與G。若一條核香酸鏈(最理想的是在比對和比較後且插入或刪除了適宜的核普酸後)與另一條核苷酸鏈的至少大約80%、通常是至少大約90%至95°/。、且最優選大約98至100%發生配對，則說這兩條單鏈RNA或DNA分子是基本上互補的。或者，若一條RNA或DNA鏈在選擇性雜交條件下與其互補鏈發生雜交，則存在實質性的互補性。典型的，若在至少14-25個核苷酸的區段上有至少大約65%互補性、優選至少大約75。/。、更優選至少大約90%互補性，則會發生選擇性雜交。參閱M.Kanehisa,NucleicAcidsRes.12:203(1984)，收入本文作為參考。"雙鏈體，，指至少兩條完全或部分互補的寡核普酸和/或多核苷酸在它們的所有或大多數核苷酸中發生Watson-Crick型鹼基配對，從而形成穩定的複合物。術語"退火"和"雜交"可互換使用，指形成穩定的雙鏈體。"完美匹配的"就雙鏈體而言指構成雙鏈體的多核苷酸或寡核苦酸鏈彼此形成雙鏈結構，使得每一條鏈中的每個核苷酸與另一條鏈中的核苷酸發生Watson-Crick鹼基配對。術語"雙鏈體"涵蓋可採用的核香類似物諸如脫氧肌苷、具有2-氨基嘌呤鹼基的核苷、PNA等等的配對。兩條寡核苷酸或多核苦酸間雙鏈體中的"錯配"指雙鏈體中的一對核苷酸不能發生Watson-Crick鍵合。"遺傳基因座"或"基因座，，就基因組或靶多核苷酸而言指基因組或靶多核苦酸的毗鄰(contiguous)亞區域(subregion)或區段。在用於本文時，遺傳基因座或基因座可以指核苷酸、基因、或基因的一部分在基因組(包括線粒體DNA)中的位置，或者它可以指基因組序列的任何毗鄰部分，無論它是否在基因內或與基因有關聯。一方面，遺傳基因座指基因組序列(包括線粒體DNA)的任何部分，長度從單個核苷酸至一段幾百個核香酸，例如100-300個。"遺傳變體"指遺傳基因座處一個或多個核苷酸的替代、倒位、插入或刪除，或者DNA自一個遺傳基因座至另一個遺傳基因座的易位。一方面，遺傳變體指一群個體中可能存在的遺傳基因座處的可選核苷酸序列，包括對該群體其它成員而言的核苷酸替代、插入和刪除。另一方面，遺傳基因座處的插入或刪除包括所述基因座處與該群體另一個體的同一基因座相比1-10個核苷酸的添加或缺失。"雜交，，指兩條單鏈多核苷酸非共價結合以形成穩定的雙鏈多核苷酸的過程。術語"雜交，，還可以指三鏈雜交。所得(通常的)雙鏈多核苷酸是"雜合物，，或"雙鏈體"。"雜交條件"通常將包括低於大約1M、更通常的是低於大約500mM和低於大約200mM的鹽濃度。"雜交緩沖液"指緩衝鹽溶液，諸如5XSSPE等等。雜交溫度可以低至5。C,但通常高於22。C，更通常的是高於大約30。C,且優選高於大約37。C。雜交通常在嚴格條件下進行，即探針會與其靶物子序列發生雜交的條件。嚴格條件是序列依賴性的，在不同情況中是不同的。較長的片段可能需要較高的雜交溫度以實現特異性雜交。因為其它因素可能影響雜交的嚴格性，包括互補鏈的鹼基組成和長度、有機溶劑的存在和鹼基錯配的程度，參數的組合比任何單獨一項的絕對度量更重要。嚴格條件一般選擇為比特定序列在限定的離子強度和pH的Tm低大約5。C。例示性的嚴格條件包括至少0.01M至不高於1MNa離子濃度(或其它鹽)的鹽濃度、7.0至8.3的pH、和至少25。C的溫度。例如，5XSSPE(750mMNaCl,50mM磷酸的鈉鹽，5mMEDTA,pH7.4)的條件和25-30。C的溫度適合於等位基因特異性探針雜交。關於嚴格條件參閱例如Sambrook,Fritsche和Maniatis，"MolecularCloningAlaboratoryManual"第2版ColdSpringHarborPress(1989)及Anderson,"NucleicAcidHybridization"第l版BIOSScientificPublishersLimited(1999),為上述所有目的完整收入本文作為參考。"與...(發生)特異性雜交"或類似表述指某分子與或只與某一種或某一些特定核苷酸序列在嚴格條件下在該序列存在於複雜的混合物(例如總的細胞DNA或RNA)中時結合、形成雙鏈體、或發生雜交。"連接"指在模板驅動的反應中在兩條或更多條核酸(例如寡核苷酸和/或多核苷酸)的末端之間形成共價鍵或聯接。所述4建或聯接的本質可以廣泛變化，而且連接可以是酶促或化學進行的。在用於本文時，通常酶促進行連接以在一條寡核苦酸的末端核苷酸的5，碳與另一條寡核苷酸的3，碳之間形成磷酸二酯聯接。收入本文作為參考的以下文獻中記載了多種模板驅動的連接反應Whitely等，美國專利4,883，750;Letsinger等，美國專利5，476,930;Fung等，美國專利5,593,826;Kool,美國專利5,426,180;Landegren等，美國專利5,871,921;Xu和Kool,NucleicAcidsResearch,27:875-881(1999);Higgins等,MethodsinEnzymology,68:50-71(1979》Engler等,TheEnzymes,15:3-29(1982);及Namsaraev,美國專利出版物2004/0110213。酶促連接通常在連接酶緩衝液中發生，即含有所採用的特定連接酶所需要的任何二價陽離子、輔因子、等等的緩衝鹽溶液。"微陣列"或"陣列"指具有通常是平坦的或基本上平坦的表面的固相支持物，其攜帶含有核酸的位點陣列，使得該陣列的每個成員位點包含固定化的寡核苦酸或多核苦酸的相同拷貝，而且在空間上是確定的、不與該陣列的其它成員位點交疊；也就是說，各位點在空間上是離散的。在有些情況中，微陣列的位點還可以是隔開的且離散的；也就是說，.不同位點不共享邊界，但是由位點間區域分開，所述位點間區域通常沒有結合核酸。在空間上確定的雜交位點可另外是"可設定地址的，，(addressable),即它的位置和它所固定化的寡核苷酸的身份是已知的或預先確定的，例如在使用前。在有些方面，寡核苷酸或多核芬酸是單鏈的，而且共價附著於固相支持物，通常經由5，末端或3，-末端。在其它方面，寡核苦酸或多核香酸非共價附著於固相支持物，例如通過生物素-鏈黴親合素聯接、與共價結合的捕捉寡核苷酸的雜交、諸如此類。以下文獻回顧了常規微陣列技術Schena,編，Microarrays:APracticalApproach,IRLPress,Oxford,2000;Southern,CurrentOpin.Chem.Biol"2:404-410(1998);NatureGeneticsSupplement,21:1-60(1999)。在用於本文時，"隨機陣列"或"隨機微陣列"指其在空間上離散的寡核苷酸或多核苷酸區在空間上未設定地址的微陣列。也就是說，所附著的寡核苷酸或多核苷酸的身份(至少最初)不能根據其位置而辨別，但是可通過對該陣列的特定操作而確定，例如測序、雜交解碼探針等等。隨機微陣列通常由微珠(microbead)平面陣列形成，例3oBrenner等，NatureBiotechnology,18:630-634(2000);Tulley等，美國專利6,133,043;Stuelpnagel等,美國專利6,396,995;Chee等，美國專利6，544,732;諸如此類。"錯配，，指Watson-Crick鹼基對G-C和A-T以外的任何兩個鹼基A、T(或RNA時的U)、G和C之間的鹼基對。八種可能的錯配是A-A、T-T、G-G、C-C、T-G、C-A、T-C和A-G。"突變，，和"多態性，，有時可互換使用，通常指核苷酸序列因一個或多個石鹹基、插入和/或刪除而與參比DNA序列或野生型序列或正常組織序列不同的DNA分子，諸如基因。在有些情況中，遵循Cotton(MutationDetection,OxfordUniversityPress,Oxford,1997)的用法，即突變理解為任何鹼基變化，78無論對生物體是否是病理性的，而多態性通常理解為沒有直接病理後果的鹼基變化。"核苷"在用於本文時包括天然的核苷，包括2'-脫氧和2'-羥基形式，例如Kornberg和Baker,DNAReplication,第2版,Freeman,SanFrancisco,1992中所記載的。"類似物"就核苷而言包括具有經修飾的鹼基模塊和/或經修飾的4唐才莫塊的合成核苦，例嗩口Scheit，NucleotideAnalogs,JohnWiley,NewYork,1980;Uhlman和Peyman,ChemicalReviews,90:543-584(1990)等等所記載的，前提是它們能夠進行特異性雜交。這樣的類似物包括設計用於增強結合特性、降低複雜性、提高特異性、諸如此類的合成核苷。包含具有增強的雜交或核酸酶抗性特性的類似物的多核香酸參閱Uhlman和Peyman(上文有引用)；Crooke等，Exp.Opin.Ther.Patents,6:855-870(1996);Mesmaeker等，CurrentOpinioninStructualBiology,5:343-355(1995);諸如此類。能夠增強雙鏈體穩定性的例示類型的多核香酸包括寡核苷酸N3'—P5'氨基磷酸酯(phosphoramidate)(本文中稱為"醯胺化物，，(amidates))、肽核酸(本文中稱為"PNA")、寡-2'-0-烷基核糖核苷酸、含有C-5丙炔基嘧啶的多核苷酸、鎖定核酸(lockednucleicacid,LNA)及類似化合物。這樣的寡核苷酸或是可通過商業途徑購買，或是可使用文獻中記載的方法合成。"聚合^式反應"或"PCR"指通過互補DNA鏈的同時引物延伸用於體外擴增特定DNA序列的反應。換言之，PCR指用於製備側翼為引物結合位點的靶核酸的多個拷貝或複製品的反應，這樣的反應包括一次或多次重複以下步驟(i)使靶核酸變性，(ii)使引物與引物結合位點退火，和(iii)在存在核香三磷酸時通過核酸聚合酶使引物延伸。通常，反應在熱循環設備中穿梭於為每個步驟優化的不同溫度而循環。具體的溫度、每個步驟的持續時間、和各步驟間變化的速率取決於本領域普通技術人員公知的許多因素，例如以下文獻所例示的McPherson等，編，PCR:APracticalApproach及PCR2:APracticalApproach(IRLPress,Oxford,分別於1991和1995)。例如，在使用TaqDNA聚合酶的常規PCR中，可以使雙鏈靶核酸於〉90。C的溫度變性，使引物於50-75。C範圍中的溫度退火，並使引物於72-78。C範圍中的溫度延伸。術語"PCR"涵蓋該反應的衍生形式，包括但不限於RT-PCR、實時PCR、嵌套PCR、定量PCR、多重PCR、諸如此類。反應體積的範圍自幾百納升例如200nL至幾百微升例如200pL。"逆轉錄PCR"或"RT-PCR"指首先進行逆轉錄反應將靶RNA轉變成互補的單鏈DNA,然後進行擴增的PCR，例如Tecott等，美國專利5,168,038,收入本文作為參考。"實時PCR"指隨反應進行而監測反應產物即擴增子的量的PCR。有多種形式的實時PCR，區別主要在於用於監測反應產物的檢測化學，例如Gelfand等，美國專利5,210,015("taqman，，);Wittwer等，美國專利6,174，670和6，569，627(嵌入染料)；Tyagi等，美國專利5,925,517(分子立標)；收入本文作為參考。用於實時PCR的檢測化學的綜述參閱Mackay等，NucleicAcidsResearch,30:1292-1305(2002)，也收入本文作為參考。"嵌套PCR"指如下的兩階段PCR，其中第一階段PCR的擴增子作為第二階段PCR的樣品，所述第二階段PCR使用一組新的引物，其中至少一條引物與第一擴增子的內部位置結合。在用於本文時，"初始引物"就嵌套擴增反應而言指用於產生第一擴增子的引物，而"第二引物"指用於產生第二或嵌套擴增子的一種或多種引物。"多重PCR"指在同一反應混合物中同時擴增多種靶序列(或者單一靶序列及一種或多種參比序列)的PCR,例如Bernard等，Anal.Biochem.,273:221-228(1999)(雙色實時PCR)。通常，為所擴增的每種序列採用不同引物組。"定量PCR"指設計用於測量樣品或標本中一種或多種特定靶序列的豐度的PCR。定量PCR包括所述耙序列的絕對定量和相對定量二者。定量測量^f吏用可以與耙序列分開或一起測定的一種或多種參比序列來進行。參比序列對於樣品或標本可以是內源的或外源的，在後一種情況中，可以包含一種或多種竟爭物模板。典型的內源參比序列包括以下基因的轉錄物區段p-肌動蛋白、GAPDH、^2-微球蛋白、核糖體RNA、諸如此類。用於定量PCR的技術是本領域普通技術人員公知的，在收入本文作為參考的以下文獻中有例示Freeman等，Biotechniques，26:112-126(1999);Becker-Andre等，NucleicAcidsResearch,17:9437-9447(1989);Zimmerman等,Biotechniques,21:268-279(1996);Diviacco等，Gene，122:3013-3020(1992);Becker-Andre等，NucleicAcidsResearch,17:9437-9446(1989);諸如此類。"多核苷酸"或"寡核苦酸"可互換使用，各指核苷酸單體的線性聚合物。在用於本文時，這些術語還可以指雙鏈形式。構成多核香酸和寡核苦酸的單體能夠經由規則樣式的單體-單體相互作用，諸如Watson-Crick型鹼基配對、鹼基堆積、Hoogsteen或反向(reverse)Hoogsteen型鹼基配對等等，與天然多核苷酸特異性結合，以形成雙鏈體或三鏈體形式。這樣的單體及其核香間聯接可以是天然存在的，或者可以是它們的類似物，例如天然存在的或非80天然存在的類似物。非天然存在的類似物可以包括PNA、石克代磷酸酯核苦間聯接、含有容許標記物諸如螢光團或半抗原附著的連接基團的石威基、諸如此類。每當寡核苷酸或多核苦酸的使用需要酶促力口工時，諸如使用聚合酶的延伸、使用連接酶的連接等等，普通技術人員會理解，當這樣的類似物與酶促反應不相容時，那些情況中的寡核苷酸或多核苦酸不會在任何或有些位置含有核苷間聯接、糖模塊或鹼基的某些類似物。多核苷酸的大小範圍通常是自幾個單體單位(例如5-40個，此時它們通常稱為"寡核香酸")至數千+單體單位。每當多核苷酸或寡核苷酸以字母(大寫的或小寫的)序列代表時，諸如"ATGCCTG"，應理解，核苷酸從左向右是5'—3'次序，而且"A"表示脫氧腺苷，"C"表示脫氧胞苷，"G"表示脫氧鳥苷，而"T"表示脫氧胸苷，'T，表示脫氧肌苷，"U"表示尿苷，除非另有說明或根據上下文顯而易見。除非另有說明，術語學和原子編號規定將遵循Strachan和Read,HumanMolecularGenetics2，Wiley-Liss，NewYork,1999中所才皮露的。多核香酸通常包含通過磷酸二酯鍵聯接相連的四種天然核苷(例如對於DNA是脫氧腺苦、脫氧胞苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷，或者對於RNA是它們的核糖對應物)；然而，它們還可以包含非天然核芬酸類似物，例如包括經過》l"飾的石鹹基、糖或核苷間聯接。對本領域技術人員清楚的是，若酶的活性具有特定的寡核苦酸或多核苷酸底物要求，例如單鏈DNA、RNA/DNA雙鏈體等等，則寡核苷酸尤其是憑藉以下論文的指導，諸如Sambrook等，MolecularCloning,第2版,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork，1989及類似參考文獻。"引物"指在與多核苷酸模板形成雙鏈體後能夠充當核酸合成的起始點，並自其3，末端沿模板延伸，從而形成延伸的雙鏈體的寡核苦酸，或是天然的或是合成的。延伸過程中添加的核苷酸的序列是由模板多核苷酸的序列決定的。引物通常由DNA聚合酶延伸。引物的長度範圍通常是9-40個核苦酸，或者在有些實施方案中是14-36個核苷酸。"讀出"(Readout)指可轉變成數字或數值的測量和/或4企測的一項或多項參數。在有些情況中，讀出可以指這樣收集或記錄的悽t據的實際數字表示。例如，來自微陣列的螢光強度信號的讀出指在微陣列的每個雜交位點所產生的信號的位置和螢光強度；如此，這樣的讀出可以以多種方式登記或存儲，例如微陣列的圖像、數表等等。"固體支持物"、"支持物"和"固相支持物"可互換使用，指具有一個或多個剛性或半剛性表面的一種或一組物質。在許多實施方案中，固體支持物的至少一個表面是基本上平坦的，儘管在有些實施方案中可能希望它在物理上分隔不同化合物的合成區，例如以孔、凸起區、插針(pin)、蝕刻溝等等。依照其它實施方案，固體支持物採取珠、樹脂、凝膠、微球體或其它幾何外形的形式。微陣列通常包含至少一個平坦的固相支持物，諸如顯微鏡蓋玻片。DNA"參比序列"或"參比群，，指通過參比DNA群與測試DNA群二者的互補鏈間異源雙鏈體的形成與DNA或RNA測試群(或"測試DNA序列"或"測試DNA群")進行比較的個別DNA序列或DNA集合(或由其衍生的RNA)。若形成完美匹配的異源雙鏈體，則參比群和測試群各自的成員是相同的；否則，它們互為變體。參比群成員的核苷酸序列通常是已知的，序列通常列於序列資料庫中，諸如Genbank、Embl等等。一方面，DNA參比群可以包括來自已知細胞類型或組織來源的cDNA文庫或基因組文庫。例如，DNA參比群可以包括衍生自健康個體的組織的cDNA文庫或基因組文庫，而DNA測試群可以包括衍生自患病個體的同一組織的cDNA文庫或基因組文庫。DNA參比群還可以包括各個多核苷酸、cDNA、基因或其外顯子(例如編碼所有已知的p53變體或其子集的基因或外顯子)、信號轉導途徑的基因等等的裝酉己集A(assembledcollection)-"特異性的"或"特異性"就一種分子與另一種分子的結合而言，諸如經標記的靶序列對於探針，指兩種分子間的識別、接觸和穩定複合物的形成，加之該分子與其它分子顯著更少的識別、接觸或複合物形成。一方面，"特異性的"就第一分子與第二分子的結合而言指第一分子識別反應或樣品中的另一分子和與之形成複合物的程度，它與第二分子形成最大量的複合物。優選的，所述最大量是至少50%。牽涉特異性結合事件的分子一^:在它們的表面上或在穴(cavity)中有引起彼此結合的分子間的特異性識別的區域。特異性結合的例子包括抗體-抗原相互作用、酶-底物相互作用、多核苷酸和/或寡核香酸間雙鏈體或三鏈體的形成、受體-配體相互作用、諸如此類。在用於本文時，"接觸，，就特異性或特異性結合而言指兩分子足夠接近使得弱非共價化學相互作用，諸如範德華力、氫鍵、鹼基堆積相互作用、離子和疏水性相互作用、諸如此類，在分子的相互作用中佔優勢。在用於本文時，術語"Tm，，即"解鏈溫度"(meltingtemperature)。解鏈溫度指一群雙鏈核酸分子中有一半解離成單鏈時的溫度。本領域公知用於計算核酸Tm的數個方程。如標準參考文獻所示，Tm值的筒單估算可通過如下方程來計算Tm=8l.5+0.41(%G+C),當核酸存在於lMNaCl水溶液中時(參見例長口Anderson牙口Young,QuantitativeFilterHybridization,於NucleicAcidHybridization(1985》。其它參考文獻(例如Allawi,H.T.&SantaLucia,J.,Jr.,Biochemistry36:10581_94(l"")包括在計算Tm時考慮結構和環境以及序列特徵的備選計算方法。"樣品，，通常指來自生物學、環境、醫學或患者來源的一定數量的物質，試圖對其進行靶核酸的;f全測、測量或標記。一方面，它意圖包括標本或培養物(例如微生物學培養物)。另一方面，它意圖包括生物學樣品和環境樣品二者。樣品可包括合成來源的標本。生物學樣品可以是動物，包括人、流體、固體(例如大便)或組織，以及液體和固體食品和飼料產品及成分，諸如奶製品條目、蔬菜、肉類和肉類副產品、及水。生物學樣品可包括取自患者的物質，包括但不限於培養物、血液、唾液、腦脊液、胸水、乳汁、淋巴、痰、精液、穿刺樣品(needleaspirate)、諸如此類。生物學樣品可以從實足的屬於多個科的家畜以及野性的或野生的動物獲得，包括但不限於諸如有蹄類、熊、魚、嚙齒類等動物。環境樣品包括環境物質，諸如表面物質、土壤、水和工業樣品、以及從食品和奶製品加工儀器、裝置、設備、器具、一次性的和非一次性的條目獲得的樣品。這些例子不應解釋為限制可應用於本發明的樣品類型。上述教導意圖例示本發明，而非以其細節限制本發明權利要求的範圍。儘管描述了本發明的優選例示性實施方案，對本領域技術人員顯而易見的是可以在其中進行各種變化和修改而不偏離本發明，而且所附權利要求意圖覆蓋落入本發明真正精神和範圍內的所有此類變化和修改。權利要求1.聚合物分子的陣列，其包含-具有表面的支持物；及-附著於所述表面的眾多聚合物分子，其中各個聚合物分子具有隨機纏繞狀態且包含多拷貝的一個或多個線性聚合單元的分支或線性結構，使得所述聚合物分子在基本上相當於所述隨機纏繞在所述表面上的投影的區域內附著於所述表面並以使得至少30％的所述聚合物分子可獨立檢測的密度隨機部署。2.權利要求l的聚合物分子陣列，其中所說的一個或多個線性聚合單元各自是單鏈多核苷酸，且其中所說的表面其上附著有反應性官能度或捕捉寡核苷酸，且其中所說的聚合物分子各自通過一個或多個反應性官能度與所說的聚合物分子的互補官能度反應而形成的一個或多個聯接或者通過所述捕捉寡核苷酸與所述聚合物分子的互補序列之間形成的一個或多個複合物而附著於所說的表面。3.權利要求2的陣列，其中所說的表面是具有離散分隔區陣列的平坦表面，其中各個離散分隔區的大小基本上相當於所說的聚合物分子的所說的隨機纏繞的所說的投影且其上附著有所說的反應性官能度或所說的捕捉寡核苷酸。4.權利要求3的陣列，其中各個所說的離散分隔區的面積小於l^im2。5.權利要求4的陣列，其中所說的離散分隔區形成最近相鄰距離在0.1-20^im範圍內的規則陣列且其中大多數所說的離散分隔區包含不超過一個所說的聚合物分子。6.權利要求5的陣列，其中所說的聚合物分子隨機分布在所說的離散分隔區上且其中所說的最近相鄰距離在0.3-3pm範圍內。7.權利要求6的陣列，其中各個所說的聚合物分子是包含多拷貝的靶序列與銜接頭寡核苷酸的串聯物的多核苷酸分子。8.權利要求4的陣列，其中所說的離散分隔區是所說的支持物中的孔，所述孔各自具有面積等於或小於所說的離散分隔區的面積的開口。9.多核苷酸分子的陣列，其包含-具有表面的支持物；及-附著於所述表面的眾多多核苷酸分子，其中各個多核苷酸分子具有隨機纏繞狀態且包含多拷貝的靶序列的串聯物，使得所述多核苷酸分子在基本上相當於所述隨機纏繞在所述表面上的投影的區域內附著於所述表面並以使得至少30%的所述多核苷酸分子的最近相鄰距離為至少50nm的密度隨機部署。10.權利要求9的陣列，其中所說的表面其上附著有反應性官能度，且其中所說的多核苷酸分子各自通過一個或多個反應性官能度與所說的多核苷酸分子的互補官能度反應而形成的一個或多個聯接而附著於所說的表面。11.權利要求10的陣列，其中所說的表面是具有離散分隔區陣列的平坦表面，其中各個離散分隔區的大小基本上相當於所說的多核苦酸分子的所說的隨機纏繞的所說的投影且其上附著有所說的反應性官能度，且其中這樣的區域附著有至多一個所說的多核香酸。12.權利要求ll的陣列，其中所說的反應性官能度是疏水性官能度。13.權利要求ll的陣列，其中所說的離散分隔區的面積小於lpm2。14.權利要求13的陣列，其中所說的離散分隔區是所說的支持物中的孔，所述孔各自具有面積等於或小於所說的離散分隔區的面積的開口。15.權利要求13的陣列，其中所說的多核苦酸隨機分布在所說的離散分隔區上且其中所說的最近相鄰距離在0.3-3,範圍內。16.權利要求15的陣列，其中基本上每個所說的離散分隔區附著有一個多核苷酸。17.權利要求15的陣列，其中所說的串聯物包含交替拷貝的所說的耙序列和所說的銜接頭寡核苦酸。.18.權利要求17的陣列，其中各個所說的串聯物包含至少10個拷貝的其各自的耙序列。19.權利要求17的陣列，其中所說的靶序列各自的長度在50-500個核苷酸範圍內且其中所說的銜接頭寡核苷酸的長度在6-60個核苷酸範圍內。20.權利要求15的陣列，其中所有所說的反應性官能度是相同的。21.權利要求15的陣列，其中各個所說的串聯物包含至少一種解碼寡核普酸用於鑑定其各自的靶序列。22.權利要求15的陣列，其中所說的離散分隔區以直線模式部署在所說的平坦表面上，其中各個離散分隔區具有以直徑0.1-10(om的圓圈所圍繞的面積。23.權利要求ll的陣列，其中所說的離散分隔區形成最近相鄰距離在0.1-20^m範圍內的規則陣列。24.權利要求23的陣列，其中各個所說的離散分隔區被基本上沒有所說的多核苷酸的區域間空間所圍繞。25.權利要求10的陣列，其中所說的多核苷酸隨機部署在所說的平坦表面上，使得至少大多數所說的多核苷酸在光學上可分辨。26.權利要求25的陣列，其中至少70。/。的所說的多核苷酸是光學上可分辨的。27.單分子的陣列，其包含-具有表面的支持物，所述表面具有離散分隔區的規則陣列，其中各個離散分隔區的面積小於1(11112且其上附著有反應性官能度；及-附著於所述表面的眾多單分子，其中各個單分子包含大分子結構和至少一個具有附著模塊的分析物，使得各個大分子結構包含一個獨特官能度和能夠與所述離散分隔區的所述反應性官能度形成聯接的眾多附著官能度且使得所述分析物通過所述獨特官能度與所述分析物的所述附著模塊之間的聯接附著於所述大分子結構；-其中所述眾多單分子隨機部署在所述離散分隔區上，使得至少大多數所述離散分隔區只包含一個單分子。28.權利要求27的陣列，其中所說的大分子結構是分支的或線性的聚合物。29.權利要求28的陣列，其中所說的離散分隔區是所說的支持物中的孑L,所述孔各自具有面積等於或小於所說的離散分隔區的面積的開口。30.權利要求28的陣列，其中所說的離散分隔區各自的最近相鄰距離在31.權利要求30的陣列，其中所說的最近相鄰距離在0.3-3pm範圍內。32.權利要求31的陣列，其中基本上每個所說的離散分隔區附著有一個單分子。33.權利要求31的陣列，其中所說的大分子結構是線性的多核香酸。34.權利要求31的陣列，其中所說的離散分隔區以直線模式部署在所說的平坦表面上，其中各個離散分隔區具有以直徑0.1-10(im的圓圏所圍繞的面積。35.權利要求31的陣列，其中所說的分析物是多核苷酸或蛋白質。36.權利要求31的陣列，其中各個所說的離散分隔區被基本上沒有所說的大分子結構的區域間空間所圍繞。37.權利要求31的陣列，其中所說的獨特官能度是第一寡核香酸且其中所說的附著模塊是具有與第一寡核苷酸互補的序列的第二寡核苷酸。38.權利要求37的陣列，其中所說的分析物是多核苷酸。39.多核苷酸分子的陣列，其包含-具有表面的支持物，所述表面其上附著有捕捉寡核香酸；及-附著於所述表面的眾多多核苷酸分子，其中各個多核苷酸分子包含多拷貝的靶序列與銜接頭寡核苦酸的串聯物，使得所述多核苷酸分子通過所述捕捉寡核苷酸與所述銜接頭寡核苷酸之間形成的一個或多個複合物而附著於所述表面，所述多核苷酸分子以使得至少大多數多核苦酸分子的最近相鄰距離為至少50nm的密度隨機部署在所述表面上。40.權利要求39的陣列，其中所說的表面是具有離散分隔區陣列的平坦表面，其中各個離散分隔區的面積小於1|^1112且其上附著有捕捉寡核香酸，且其中基本上所有這樣的區域附著有至多一個所說的多核苷酸分子。41.權利要求40的陣列，其中所說的離散分隔區是所說的支持物中的孔，所述孔各自具有面積等於或小於所說的離散分隔區的面積的開口。42.權利要求40的陣列，其中所說的離散分隔區形成最近相鄰距離在0.l-20pm範圍內的規則陣列。43.權利要求42的陣列，其中所說的離散分隔區上的所說的多核香酸分子的最近相鄰距離使得這些多核苷酸分子在光學上可分辨。44.權利要求42的陣列，其中各個所說的離散分隔區被基本上沒有所說的多核苦酸分子的區域間空間所圍繞。45.權利要求42的陣列，其中所說的多核苷酸分子隨機分布在所說的離散分隔區上且其中所說的最近相鄰距離在0.3-3pm範圍內。46.權利要求45的陣列，其中基本上每個所說的離散分隔區附著有一個多核芬酸分子。47.權利要求45的陣列，其中所說的串聯物包含交替拷貝的所說的把序列和所說的銜接頭寡核苷酸。48.權利要求47的陣列，其中各個所說的串聯物包含至少10個拷貝的其各自的把序列。49.權利要求47的陣列，其中所說的靶序列各自的長度在50-500個核苷酸範圍內且其中所說的銜接頭寡核苷酸的長度在6-60個核苦酸範圍內。50.權利要求45的陣列，其中所有所說的捕捉寡核苷酸具有相同的核苷酸序列。51.權利要求45的陣列，其中各個所說的串聯物包含至少一種解碼寡核苦酸用於鑑定其各自的靶序列。52.權利要求45的陣列，其中所說的離散分隔區以直線模式部署在所說的平坦表面上，其中各個離散分隔區具有以直徑O.l-l(Hmi的圓圈所圍繞的面積。53.權利要求45的陣列，其中所說的捕捉寡核苦酸與所說的銜接頭寡核香酸之間的所說的一個或多個複合物是雙鏈體。54.權利要求40的陣列，其中所說的離散分隔區形成眾多規則亞陣列，使得同一亞陣列內的所說的離散分隔區具有核苷酸序列相同的捕捉寡核香酸且不同亞陣列內的所說的離散分隔區具有核苦酸序列不同的捕捉寡核苷酸，且其中在所述眾多亞陣列的任一個內各個所說的離散分隔區的最近相鄰距離在l-2(Him範圍內。55.權利要求54的陣列，其中所說的規則亞陣列各自是直線陣列且其中對於每一個而言所說的離散分隔區之間的所說的最近相鄰距離是相同的。56.權利要求39的陣列，其中所說的多核苷酸分子隨^L部署在所說的平坦表面上，使得至少大多數所說的多核苷酸分子在光學上可分辨。57.權利要求56的陣列，其中至少70。/。的所說的多核苷酸分子是光學上可分辨的。58.製備多核苷酸分子陣列的方法，所述方法包括以下步驟-產生眾多多核苷酸分子，各自包含來自來源DNA的DNA片段與銜接頭寡核苷酸的串聯物；-將所述眾多多核香酸分子部署至具有表面的支持物上，所述表面其上附著有捕捉寡核苷酸，使得所述多核苷酸分子通過所述捕捉寡核苷酸與所述銜接頭寡核苷酸之間形成的一個或多個複合物而固定於所述表面且使得所述多核苷酸分子以使得大多數所述多核苷酸分子的最近相鄰距離為至少50nm的密度隨機分布在所述表面上，^v而形成多核苷酸分子的陣列。59.權利要求58的方法，其中所說的表面是具有離散分隔區陣列的平坦表面，其中各個離散分隔區的面積小於1,2且其上附著有所說的捕捉寡核苷酸，且其中基本上所有這樣的區域附著有至多一個所說的多核苦酸分子。60.權利要求59的方法，進一步包括在將所說的多核苷酸分子部署至所說的支持物上後擴增它們的步驟。61.權利要求60的方法，其中所說的擴增步驟包括切割所說的串聯物以形成第二片段，環化所述第二片段，並在各個所說的串聯物的所說的離散分隔區內通過RCRA應擴增所述第二片段。62.權利要求61的陣列，其中所說的離散分隔區是所說的支持物中的孔，所述孔各自具有面積等於或小於所說的離散分隔區的面積的開口。63.權利要求59的方法，其中所說的離散分隔區形成最近相鄰距離在0.l-20pm範圍內的規則陣列。64.權利要求63的方法，其中所說的多核苷酸分子隨機分布在所說的離散分隔區上且其中所說的最近相鄰距離在0.3-3pm範圍內。65.權利要求64的方法，其中所說的產生步驟進一步包括以下步驟斷裂所說的來源DNA以產生所說的DNA片段，環化所說的DNA片段，並通過滾環複製形成所說的DNA片段的串聯物。66.權利要求65的方法，其中所說的離散分隔區上的所說的多核苦酸分子的最近相鄰距離使得這些多核苷酸分子在光學上可分辨。67.製備多核苷酸分子陣列的方法，所述方法包括以下步驟-產生眾多多核苷酸分子，各自包含來自來源核酸的DNA片段的串聯物；-將所述眾多多核苷酸分子部署至具有表面的支持物上，所迷表面其上附著有反應性官能度，使得所述多核苷酸分子通過所述反應性官能度與所述多核苷酸分子上的互補官能度之間形成的一個或多個聯接而固定於所述表面且使得所述多核苷酸分子以使得至少大多數多核香酸分子的最近相鄰距離為至少50nm的密度隨機部署在所述表面上，從而形成多核苷酸分子的陣列。68.權利要求67的方法，其中所說的表面是具有離散分隔區陣列的平坦表面，其中各個離散分隔區的面積小於1^2且其上附著有所說的反應性官能度，且其中基本上所有這樣的區域附著有至多一個所說的多核苷酸分子。69.權利要求68的方法，其中所說的產生步驟進一步包括以下步驟斷裂所說的來源DNA以產生所說的DNA片段，環化所說的DNA片段，並通過滾環複製形成所說的DNA片段的串聯物。70.測定靶多核苷酸的核苷酸序列的方法，所述方法包括如下步驟(a)產生眾多來自靶多核苷酸的靶串聯物，各個靶串聯物包含多拷貝的靶多核苷酸片段且所述眾多靶串聯物包含基本上覆蓋所述靶多核苷酸的許多片段；(b)形成所述靶串聯物的隨機陣列，其以使得至少大多數所述靶串聯物在光學上可分辨的密度固定於表面；(c)使來自第一套探針的一種或多種探針與所述隨機陣列在允許所述一種或多種探針與靶串聯物上互補序列之間形成完美匹配雙鏈體的條件下進行雜交；(d)使來自第二套探針的一種或多種探針與所述隨機陣列在允許所述一種或多種探針與靶串聯物上互補序列之間形成完美匹配雙鏈體的條件下進行雜交；(e)連接與靶串聯物在毗鄰位點處發生雜交的來自第一套和第二套的探針；(f)鑑定所連接的第一和第二探針的序列；並(g)重複步驟(c)至(f)直至靶多核苷酸的序列可以由所連接4罙針序列的身4分而確定。71.權利要求70的方法，其中所說的表面是具有離散分隔區陣列的平坦表面，其中各個離散分隔區的面積小於1,2且其中基本上所有這樣的區域附著有至多一個所說的靶串聯物。72.測定靶多核苷酸的核苷酸序列的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供靶串聯物的隨機陣列，其固定於具有光學上可分辨的離散分隔區陣列的平坦表面，其中各個離散分隔區的面積小於1^11112且其中基本上所有這樣的區域附著有至多一個所說的靶串聯物，各個靶串聯物包含多拷貝的靶多核*酸片段且存在許多不同的靶串聯物使得它們各自的片段基本上覆蓋所述靶多核苦酸；(b)使來自第一套探針的一種或多種探針與所述隨機陣列在允許所述一種或多種探針與靶串聯物上互補序列之間形成完美匹配雙鏈體的條件下進行雜交；(c)使來自第二套探針的一種或多種探針與所述隨機陣列在允許所述一下進行雜交；(d)連接與靶串聯物在毗鄰位點處發生雜交的來自第一套和第二套的探針；(e)鑑定所連接的第一和第二探針的序列；並(f)重複步驟(b)至(e)直至所述靶多核苷酸的序列可以由所連接探針序列的身份而確定。73.測定靶多核香酸的核普酸序列的方法，所述方法包括以下步驟(a)產生眾多來自靶多核苷酸的靶串聯物，各個靶串聯物包含多拷貝的靶多核苷酸片段且所述眾多靶串聯物包含基本上覆蓋所述靶多核苷酸的許多片段；(b)形成靶串聯物的隨機陣列，其以使得至少大多數靶串聯物在光學上可分辨的密度固定於表面；(c)鑑定各個靶串聯物中各個片段的至少一部分的序列；並(d)由所述串聯物所述片段所述部分的序列的身份重建所述靶多核苷酸的核苷酸序列。74.用於製備來自來源核酸的DNA片段串聯物隨機陣列的試劑盒，所述試劑盒包含-具有表面的支持物；-至少一種銜接頭寡核芬酸，用於與各個DNA片段連接並與之形成DNA環，各個DNA環能夠通過滾環複製反應進行複製以形成能夠隨機部署在所述表面上的串聯物。75.權利要求74的試劑盒，其中所說的表面是具有離散分隔區陣列的平坦平面，其中各個離散分隔區的大小相當於所說的串聯物的大小。76.權利要求75的試劑盒，其中所說的離散分隔區形成最近相鄰距離在,0.l-20pm範圍內的規則陣列。77.權利要求76的試劑盒，其中所說的離散分隔區上的所說的串聯物的最近相鄰距離使得這些串聯物在光學上可分辨。78.權利要求76的試劑盒，其中所說的離散分隔區附著有捕捉寡核苷酸且其中所說的銜接頭寡核香酸各自具有與所述捕捉寡核苷酸互補的區域，使得所說的串聯物能夠通過所述捕捉寡核苷酸與所說的銜接頭寡核苷酸互補區之間形成複合物而附著於所說的離散分隔區。79.權利要求78的試劑盒，其中所說的串聯物隨機分布在所說的離散分隔區上且其中所說的最近相鄰距離在0.3-3,範圍內。80.權利要求79的試劑盒，進一步包含(a)末端轉移酶，用於將同聚物尾附著至所說的DNA片段以提供供所說的銜接頭寡核苦酸的第一末端結合的位點，(b)連接酶，用於將所說的銜接頭寡核苷酸的一條鏈連接至所說的DNA片段的末端以形成所說的DNA環，(c)引物，用於與所說的銜接頭寡核苷酸所述鏈的一個區域退火，及(d)DNA聚合酶，用於在滾環複製反應中使與所述鏈退火的？1物延伸。81.權利要求80的試劑盒，其中所說的銜接頭寡核苷酸具有簡併鹼基數目在4-12個範圍內的第二末端。82.用於靶多核苷酸測序的試劑盒，所述試劑盒包含-具有平坦表面的支持物，所述表面具有光學上可分辨的離散分隔區陣歹寸，其中各個離散分隔區的面積小於l^m25-第一套探針，用於與隨機部署在所述離散分隔區上的眾多串聯物進行雜交，所述串聯物各自包含多拷貝的靶多核苷酸的DNA片段；-第二套探針，用於與眾多串聯物進行雜交，使得只要來自第一套的探針和來自第二套的探針與所述串聯物發生毗鄰的雜交，所說的探針就被連接。83.權利要求82的試劑盒，進一步包含連接酶、連接酶緩衝液和雜交緩衝液。84.權利要求83的試劑盒，其中所說的離散分隔區附著有捕捉寡核苷酸且其中所說的串聯物各自具有與所述捕捉寡核苷酸互補的區域，使得所說的串聯物能夠通過所述捕捉寡核苷酸與所說的串聯物互補區之間形成複合物而附著於所說的離散分隔區。85.用於構建單分子陣列的試劑盒，所述試劑盒包含-具有表面的支持物，所述表面具有反應性官能度；及-各自具有一個獨特官能度和多個互補官能度的眾多大分子結構，所述大分子結構能夠隨機附著在所述表面上，其中所說的附著是通過一個或多個反應性官能度與一個或多個互補官能度反應形成的一個或多個聯接而形成的；且其中所述獨特官能度能夠選擇性的與分析物分子上的官能度反應而形成單分子陣列。86.權利要求85的試劑盒，其中所說的表面是具有離散分隔區陣列的平坦表面且其中各個離散分隔區的面積小於l(im2,所述離散分隔區陣列包含所說的反應性官能度。87.權利要求86的試劑盒，其中所說的離散分隔區形成最近相鄰距離在0.1-20iim範圍內的規則陣列。88.權利要求87的試劑盒，其中所說的離散分隔區上的所說的串聯物的最近相鄰距離使得這些串^:物在光學上可分辨。89.權利要求88的試劑盒，其中所說的大分子結構是一個或多個DNA片段的串聯物且其中所說的獨特官能度位於所述串聯物的3，末端或5，末端。全文摘要本發明提供了單分子隨機陣列，用於執行大規模分析，特別是生物分子諸如基因組DNA、cDNA、蛋白質等等的大規模分析。一方面，本發明的陣列包含隨機部署在離散分隔區規則陣列上的DNA片段串聯物，使得基本上所有這樣的區域包含不超過單個串聯物。優選的是，所述區域的面積基本上小於1μm2且最近相鄰距離容許每cm2有109個單分子數量級的光學解析度。許多分析化學可應用於本發明的隨機陣列，包括通過雜交化學的測序、通過合成化學的測序、SNP檢測化學等等，用於大大擴充此類技術的規模和潛在應用。文檔編號C12Q1/68GK101466847SQ200680029826公開日2009年6月24日申請日期2006年6月13日優先權日2005年6月15日發明者喬治·楊,布賴恩·K·豪澤,拉多傑·德馬納克,斯尼扎納·德馬納克,馬修·J·卡洛申請人:考利達基因組股份有限公司