使用單個納米新月形表面增強拉曼散射探針檢測蛋白酶和蛋白酶活性的製作方法

2023-09-20 18:09:35

專利名稱：：使用單個納米新月形表面增強拉曼散射探針檢測蛋白酶和蛋白酶活性的製作方法
技術領域：
：本發明涉及利用納米探針檢測蛋白酶的表面增強拉曼散射(SERS)領域。具體來說，本發明涉及在前列腺癌的診斷應用中前列腺特異性抗原(PSA)和有蛋白水解活性的PSA的檢測。
背景技術：
：前列腺癌是歐洲和北美的男性中最常見的癌症(Crawford(2003)t/ra/o^62:3-12;Gronberg等人92003361:859-864;Pienta等人(2006)t/ra/ogy48:676-683)。前列腺癌的臨床診斷方式之一是測量前列腺特異性抗原(PSA或hK3)的血漿蛋白濃度，該抗原是通常從前列腺內腔上皮細胞分泌的大的激肽釋放酶(hK)蛋白酶家族中的一員(回顧參見，例如，Yousef和Diamandis(2001)iev.，22:184-204;Denmeade和Isaacs(2002)淑Tev.C畫er2:389-396;Denmeade和Isaacs(2004)5Jf7/"93Suppl1:10-15)。與其它激肽釋放酶家族成員不同，PSA是類胰凝乳蛋白酶絲氨酸蛋白酶(Robert等人(1997)Aoc/^m^o;36:3811-3819)。在前列腺癌中，藉助於蛋白水解活性，PSA與對抗細胞外基質的組織改造有關，對肺瘤入侵或發展的關鍵控制機制有作用。其它蛋白酶也在癌症中具有相似的作用。始於二十世紀八十年代的血漿PSA篩查的引入已經極大地改善了前列腺癌的診斷、分期和處置(Denmeade和Isaacs(2002)Ato.Ca"cer2:389-396);然而，血漿PSA濃度的測量並沒有將前列腺癌病人與良性前列腺增生病人區分開，導致高的錯誤陽性率，需要更昂貴的活檢，並且甚至進行不必要的外科程序(Denmeade和Isaacs(2004)93Suppl1:10-15;Robert等人(1997)歷0c/2e附&^y36:3811-3819)。提高PSA的臨床價值以進行前列腺癌早期檢測的努力包括對PSA的各種分子異構物的表徵(Mikolajczyk等人(2004)C7/".Ozem"50:1017-1025;Mikolajczyk和Rittenhouse(2003)/Med52:86-91;Mikolajczyk等人(2004)C7/".歷oc/zem.37:519-528)。在那些各種異構物當中，PSA的有蛋白水解活性的亞群被接受作為是比血清PSA濃度更有效的胂瘤標誌物和惡性預測物(Wu等人(2004)屍mstote58:354-353;Wu等人(2004)C7/w.Oze肌，50:125-129)。通過常規的免疫染色方法對PSA存在的簡單檢測不能揭示PSA的蛋白水解活性；因此，開發新的方法以區分蛋白水解活性異構物是非常重要的。已經證實精液攜帶有大量的有蛋白水解活性的PSA並且是用於蛋白酶活性測定的PSA生物資源(Brillard隱Bourdet等人(2002)>/A0c/2em.,269:390-395;Rehault等人(2002)所oc/h.附.Jcto1596:55-62)。有蛋白水解活性的PSA在精液中的濃度為10-150|aM(Rehault等人(2002)S/oc/>w.所0;7/7,爿cto1596:55-62),而其在血漿中的濃度則低得多，從健康個體中小於O.lnM到有前列腺疾病的病人中高於lnM(Rittenhouse等人(1998)O".C7/w.丄W.5W.，35:275-368)。然而，測量精液中或來自細針抽吸的活組織檢查樣品中PSA的蛋白水解活性的測定仍沒有被廣泛接受，這是由於蛋白水解活性的快速衰減，以及從年老病人可獲得的精液量或活組織檢查樣品的量有限。現有檢測方法的靈敏度達到了PSA蛋白質的亞納摩濃度(Acevedo等人(2002)C7/".C/n'm.爿cto317:55-63;Charrier等人(1999)五/ecra//wm^20:1075-1081;Bjartell等人C""cwPD2:140-147)(大部分通過抗體對PSA的結合親和力確定)，並且需要相對大的樣品體積(毫升)。然而，酶的化驗並不享有相同的靈敏度增強。
發明內容在某些實施方式中，本發明展示了使用單一的至少具有納摩靈敏度的肽8結合納米新月體表面增強拉曼散射(SERS)指示物(探針)的蛋白酶體外檢測。該指示物能夠以極小的體積檢測蛋白水解活性。在某些實施方式中，檢測體積小於約80飛升(femtoliter)，優選小於約50飛升，更優選小於約40或30飛升，且進一步更優選小於約20或15飛升。在某些實施方式中，使用高度聚焦的激發源允許檢測體積僅為約10飛升。在各種實施方式中，納摩樣品的實際蛋白酶分子數小於約40個分子，優選小於約40個分子，更優選小於約30、20、或10個，且在某些實施方式中接近於單分子水平。與其它癌生物標誌物檢測測定相比，本發明的生物結合的納米新月體允許檢測飛升體積中蛋白水解活性蛋白酶分子的納摩濃度，特別是對於單一癌細胞水平的癌症篩查來說，這是關鍵的。小體積性能的主要優點和應用之一是其可用於在單一細胞水平下檢測癌細胞的蛋白酶例如前列腺特異性抗原(PSA)的活性。小體積的要求和靈敏度水平能夠在捕獲的循環前列腺癌細胞中檢測PSA活性用於指示轉移，這對於常規技術來說是不可行的。在精液中，PSA濃度為10-150)LiM,其中約三分之二的PSA有酶活性。用納米新月體PSA探針(納摩範圍)實現的靈敏度水平對基於精液的測定是足夠的，因此，這裡描述的納米新月體SERS平臺可用於臨床應用。在某些實施方式中，底物是納米新月體表面增強拉曼散射(SERS)探針。表面增強拉曼散射(SERS)探針由綴合到納米新月體芯和殼的肽組成，其中該探針的特徵在於連接到拉曼活性標記的可以由蛋白酶特異性剪切的序列(例如，蛋白酶識別位點)。因此，該肽綴合的納米新月體可用作特定的篩查工具以提供生物性樣品中一種或多種蛋白酶的存在、濃度和蛋白水解活性的信息，所述蛋白酶包括但不限於各種癌症的生物標誌物，例如前列腺特異性抗原(PSA)。在一個實施方式中，該納米新月體包括芯和殼，具有綴合或粘連到該納米新月體表面的肽。該肽包括被待檢測的相應蛋白酶特異識別和剪切的底物。在某些實施方式中，對蛋白酶有特異性的其它肽底物可用於納米探針。可能存在這樣的情況，具有較好的動力學性質的底物肽可以用於加快檢測過程。在一個實施方式中，對PSA具有較好特異性的其它肽也可用於更精確地檢測PSA。9在各種實施方式中，不僅測量蛋白質的存在，實時反應監測還提供有關蛋白酶活性的信息。不同的拉曼標記分子都可以使用並成功地用於實施例中，從而證明了可以通過多重化肽綴合納米新月體進行兩種或更多種類型的癌症相關(或其它)的蛋白酶的檢測。在某些實施方式中，芯可包括磁性材料以允許獨立納米顆粒的空間訪問。在某些實施方式中，在特異性上彼此正交或有少量重疊的不同的肽底物可以用於檢測相應的蛋白酶。肽庫可以綴合到納米新月體探針並以隨機陣列或有序微陣列的形式在空間上分開。肽納米新月體雜化探針的多重化陣列可以用於同時檢測多種蛋白酶。也可通過雷射或磁場操作納米新月體以以高的空間精確度編址(Liu等人(2006)A^Ma^5:27-32),使得它們能夠多重化為高密度陣列(具有亞微升體積)。另外，磁場或雷射可操作性允許在期望位置進行生物傳感(Liu等人(2005)A/v.M^ec17:2683-2688)，有利於在細胞內獲得原位測量。在某些實施方式中，本發明提供用於檢測活性蛋白酶的指示物(探針)。該指示物通常包括附接於肽(底物)的納米新月體，其中該肽包括蛋白酶的識別位點。在某些實施方式中，該指示物進一步包括附接於該肽的拉曼標籤。合適的拉曼標籤包括但不限於螢光團、生色團、量子點、螢光微球、生物素等。在某些實施方式中，該拉曼標籤包括羅丹明、焚光素、或外源化學分子。在某些實施方式中，該拉曼標籤包括選自下列的部分TRIT(四曱基羅丹明異硫醇)、NBC(7-硝基苯-2-氧雜-l,3-二唑)、德克薩斯紅染料、鄰苯二曱酸、對苯二曱酸、間苯二曱酸、甲苯基堅牢紫、曱苯基藍紫、亮曱苯基藍、對氨基苯曱酸、赤蘚紅、生物素、洋地黃毒苷、5-羧基-4，,5，-二氯-2，，7，-二曱氧基螢光素、5-羧基-2，,4，,5，，7，-四氯螢光素、5-羧基螢光素、5-羧基羅丹明、6-羧基羅丹明、6-羧基四甲基氨基酞菁、6-羧基-X-羅丹明、曱亞胺、花青、黃嘌呤、琥珀醯螢光素、氨基吖啶、和氰化物(CN)、石克醇(SH)、氯(C1)、溴(Br)、曱基、磷(P)、硫(S)、SN、Al、Cd、Eu、和Te。該拉曼標籤可直接或通過接頭(linker)附接於肽。類似的，肽可直接或通過接頭附接於納米新月體。在某些實施方式中，該納米新月體包括殼而沒有芯。在某些實施方式中，該納米新月體包括芯和殼。在各種實施方式中，該芯包括提供恆定拉曼光i普的材料(例如，塑料(如聚苯乙烯)、二氧化矽或其它m族、IV族、或V族材料、右旋糖苷、磁性材料等)。在某些實施方式中，該納米新月體包括選自下列的金屬Ga、Au、Ag、Cu、Al、Ta、Ti、Ru、Ir、Pt、Pd、Os、Mn、Hf、Zr、V、Nb、La、Y、Gd、Sr、Ba、Cs、Cr、Co、Ni、Zn、Ga、In、Cd、Rh、Re、W、Mo，和它們的氧化物、和/或合金、和/或混合物、和/或氮化物、和/或燒結的基質。在某些實施方式中，該納米新月體具有約20-約800nm的外徑。在某些實施方式中，該納米新月體具有約10nm到約500nm的內徑。在某些實施方式中，該納米新月體通過內徑r、和外徑R、以及內徑r和外徑R限定的圓的圓心距來表徵，其中r為約10nm到約500nm;R為約20nm到約800nm;且d為約5nm到約300nm。在某些實施方式中，該納米新月體通過內徑r、和外徑R、以及內徑r和外徑R限定的圓的圓心距來表徵，其中r為約25nm到約500nm;R為約20nm到約800nm;且d為約5nm到約200nm。在各種實施方式中，該肽包括選自下列的蛋白酶的識別位點絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、和穀氨酸蛋白酶。在某些實施方式中，該肽包括細胞凋亡路途徑中蛋白酶(例如，胱天氨酸蛋白酶)的識別位點。在某些實施方式中，該肽包括選自下列胱天氨酸蛋白酶的識別位點胱天氨酸蛋白酶-8、胱天氨酸蛋白酶-9、胱天氨酸蛋白酶-3、胱天氨酸蛋白酶-6、和胱天氨酸蛋白酶-7。在某些實施方式中，該肽包括凝血酶的識別位點。在某些實施方式中，該肽包括絲氨酸蛋白酶的識別位點。在某些實施方式中，該肽包括PSA識別位點(例如，HSSKLQ(SEQIDNO:l))。在各種實施方式中，該肽的長度為2個胺基酸到10、20、或30個胺基酸。在某些實施方式中，該肽通過硫醇基團附接於納米新月體。在某些實施方式中，兩種不同的底物(例如，肽)附接於該納米新月體。在某些實施方式中，多於兩種不同的肽附接於該納米新月體。在某些實施方式中，該指示物為拉曼活性底物的組分。在某些實施方式中，本發明提供檢測活性核酸酶的指示物。這些指示物基本上與上述蛋白酶指示物相同，除了用核酸(例如，雙鏈或單鏈核酸)替代肽(底物)。在某些實施方式中，該核酸包括一個或多個核酸識別/剪切位點(例如，限制位點)。在某些實施方式中，附接於該納米新月體的底物(例如，肽、核酸、糖、碳水化合物等)可以包括一個或多個結合位點(而不是剪切位點)用於檢測例如同源結合配偶體(例如，受體、核酸結合蛋白、配體等)。還提供檢測或量化樣品中至少一種蛋白酶的存在、量或活性的方法。該ii方法包括使樣品與包括附接於肽的納米新月體的指示物接觸，所述肽包括蛋白酶(例如，如上所述的蛋白酶)的識別位點；和監測檢測的表面拉曼散射光鐠的光譜特徵中的差別，該差別是樣品中蛋白酶的存在、量或活性的指示。在各種實施方式中，樣品包括選自下列的材料全血、血級分、淋巴、腦脊液、口腔液(oralfluid)、粘液、尿、糞便、支氣管灌洗液(lavage)、腹水液、精液、骨髓抽出物、胸膜流出物、尿、和腫瘤細胞或組織。在各種實施方式中，該指示物還包括附接於肽的拉曼標籤。合適的拉曼標籤包括但不限於螢光團、生色團、量子點、螢光微球、生物素等。在某些實施方式中，該拉曼標籤包括羅丹明、螢光素、或外源化學分子。在某些實施方式中，該拉曼標籤包括選自下列的部分TRIT(四曱基羅丹明異硫醇)、NBC(7-硝基苯-2-氧雜-1，3-二唑)、德克薩斯紅染料、鄰苯二曱酸、對苯二曱酸、間苯二曱酸、曱苯基堅牢紫、曱苯基藍紫、亮曱苯基藍、對氨基苯曱酸、赤蘚紅、生物素、洋地黃毒苷、5-羧基-4，,5，-二氯-2，,7，-二曱氧基螢光素、5-羧基-2，，4，,5，,7，-四氯螢光素、5-羧基螢光素、5-羧基羅丹明、6-羧基羅丹明、6-羧基四曱基氨基酞菁、6-羧基-X-羅丹明、曱亞胺、花青、黃嘌呤、琥珀醯螢光素、氨基吖啶、和氰化物(CN)、硫醇(SH)、氯(C1)、溴(Br)、曱基、磷(P)、硫(S)、SN、Al、Cd、Eu、和Te。該拉曼標籤可以直接或通過接頭附接於肽。類似的，肽可以直接或通過接頭附接於納米新月體。在某些實施方式中，該納米新月體包括殼而沒有芯。在某些實施方式中，該納米新月體包括芯和殼。在各種實施方式中，該芯包括提供恆定拉曼光譜的材料(例如，塑料(例如，聚苯乙烯)、二氧化矽或其它III族、IV族、或V族材衝+、右旋糖香、》茲性材料等)。在某些實施方式中，該納米新月體包括選自下列的金屬Ga、Au、Ag、Cu、Al、Ta、Ti、Ru、Ir、Pt、Pd、Os、Mn、Hf、Zr、V、Nb、La、Y、Gd、Sr、Ba、Cs、Cr、Co、Ni、Zn、Ga、In、Cd、Rh、Re、W、Mo,和它們的氧化物、和/或合金、和/或混合物、和/或氮化物、和/或燒結的基質。在某些實施方式中，該納米新月體具有約20-約800nm的外徑。在某些實施方式中，該納米新月體具有約10nm到約500nm的內徑。在某些實施方式中，該納米新月體通過內徑r、和外徑R、以及內徑r和外徑R限定的圓的圓心距來表徵，其中r為約10nm到約500nm;R為約20nm到約800nm;且d為約5nm到約300nm。在某些實施方式中，該納米新月體通過內徑r、和外徑R、以及內徑r和外徑R限定的圓的圓心距來表徵，其中r為約25nm到約500nm;R為約20nm到約800nm;且d為約5nm到約200nm。在各種實施方式中，該肽包括選自下列的蛋白酶的識別位點絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、和穀氨酸蛋白酶。在某些實施方式中，該肽包括在細胞凋亡路途徑中蛋白酶(例如，胱天氨酸蛋白酶)的識別位點。在某些實施方式中，該肽包括選自下列胱天氨酸蛋白酶的識別位點胱天氨酸蛋白酶-8、胱天氨酸蛋白酶-9、胱天氨酸蛋白酶-3、胱天氨酸蛋白酶-6、和胱天氨酸蛋白酶-7。在某些實施方式中該肽包括凝血酶的識別位點。在某些實施方式中，該肽包括絲氨酸蛋白酶的識別位點。在某些實施方式中，該肽包括PSA識別位點(例如，HSSKXQ,SEQIDN0:1)。在各種實施方式中，該肽的長度為2個胺基酸到10、20、或30個胺基酸。在某些實施方式中，該肽通過硫醇基團附接於納米新月體。在某些實施方式中，兩種不同的底物(例如，肽)附接於該納米新月體。在某些實施方式中，多於兩種不同的肽附接於該納米新月體。在某些實施方式中，該指示物為拉曼活性底物的組分。還提供用於檢測兩種或更多種活性蛋白酶的存在或活性的庫。該庫通常包括多種蛋白酶指示物，該指示物包括附接於例如如上所述的肽的納米新月體，其中該肽包括蛋白酶的識別位點；其中不同的納米新月體附接了不同的肽使得不同的納米新月體檢測不同的蛋白酶。在各種實施方式中，該庫進行空間編址使得對不同蛋白酶有特異性的蛋白酶指示物定位於底物上的不同位置。在各種實施方式中，該庫任進行光學編址使得對不同蛋白酶有特異性的蛋白酶指示物產生不同的信號。在某些實施方式中，該庫包括至少3種或更多、優選至少10種或更多、更優選至少20、40、80、或100或更多的不同的蛋白酶指示物。在某些實施方式中，該納米新月體包括磁性芯且指示物的空間隔離通過磁場提供。在某些實施方式中，該指示物以離子方式或化學方式耦聯和/或吸附到底物。還提供檢測活性蛋白酶的試劑盒。該試劑盒通常包括含有附接於肽(例如，本文描述的)的納米新月體的容器，其中該肽包括所述蛋白酶的識別位點。在某些實施方式中，該試劑盒還包括附接於所述肽的拉曼標籤。在某些實施方式中，該試劑盒還包括教導指示物的使用的指導材料，該指示物使用表面增強拉曼散射(SERS)用於檢測活性蛋白酶的存在、濃度或活性。在某些實施方式中，本發明提供用於檢測核酸酶的指示物。該指示物包括附接於單鏈或雙鏈寡核苷酸的納米新月體(例如，本文描述的)，其中該寡核香酸包括所述核酸酶的識別位點。在某些實施方式中，該指示物還包括附接於該寡核苷酸的拉曼標籤。還提供檢測分析物的存在或量的方法。該方法典型地包括使指示物與包含分析物的樣品接觸，該指示物包括附接於底物的納米新月體，該底物在拉曼標記的部分的存在下特異性地或優先地被分析物結合，該拉曼標記的部分與分析物為結合到該底物而竟爭；和檢測該指示物的拉曼光鐠，其中通過拉曼標籤部分從底物的解離產生的拉曼光譜中的變化提供了樣品中分析物的存在或量的測量。在某些實施方式中，該底物是肽或核酸。在某些實施方式中，附接於納米新月體的肽不是抗體或抗體片段。定義術語"多肽"、"肽"和"蛋白質，，在這裡可互換地使用以表示胺基酸殘基的聚合物。該術語適用於其中的一種或多種胺基酸殘基是相應的自然存在的胺基酸的人工化學類似物的胺基酸聚合物，並且該術語也適用於自然存在的胺基酸聚合物。術語"活性蛋白酶"是指處於以下形式的蛋白酶，即當該蛋白酶在支持該蛋白酶活性的條件下與底物接觸時，能夠剪切(水解)該蛋白酶的底物中的肽鍵的形式。術語"納米新月體"是指納米顆粒，其橫截面的輪廓類似具有銳邊的新月。這裡使用的"分析物"是利用本發明在測試樣品中待檢測的物質。該分析物可以是任何物質，例如，這樣的酶，存在對該酶來說特異性結合成員如底物，或這樣的酶，可以為該酶製備特異性結合成員，並且該分析物在測定中可以與一種或多種特異性結合成員結合。術語"分析物，'還包括任意的酶、抗原物質、半抗原、抗體、以及它們的組合。該分析物可以包括但不限於蛋白質、肽、胺基酸、碳水化合物、荷爾蒙、類固醇、維生素、包括為治療目的而給藥的那些以及為不正當目的而給藥的那些在內的藥物、細菌、病毒、和任意上述物質的代謝物或抗體。這裡使用的"輻射"是電磁輻射形式的能量，該能量當應用到測試混合物時，引起由其中的拉曼活性標籤產生的拉曼光譜，並且引起金屬表面通過拉曼活性標籤支持表面增強的拉曼光散射，所述拉曼標籤變得與微粒表面有關。"拉曼標籤"、"拉曼標記"、或"拉曼活性標籤"是當用合適波長的輻射照射時產生可檢測的拉曼光譜的物質，該拉曼光譜區別於存在的其它組分的拉曼光譜。用於拉曼活性標籤的其它術語可以包括染料和指示分子。這裡使用的"特異性結合成員"是特異性結合對的成員，該特異性結合對即兩個不同的分子，其中一個分子通過化學或物理方式特異性地結合到第二個分子。除了抗原和抗體特異性結合對之外，其它特異性結合對包括生物素和抗生素蛋白、碳水化合物和外源凝集素、互補核苷酸序列(包括檢測目標核酸序列的DNA雜化測定中使用的探針和捕獲的核酸序列)、互補肽序列、效應物和受體分子、輔酶因子和酶、酶抑制劑和酶等。而且，特異性結合對可以包括為原始特異性結合成員的類似物的成員。例如，可以使用分析物的衍生物或片段，即，分析物-類似物，只要其具有至少一個與分析物相同的表位。免疫反應性特異性結合成員包括抗原、半抗原、抗體、和包括通過重組DNA方法或肽合成形成的那些的它們的絡合物。術語"測試混合物"是指用於應用本發明以檢測測試樣品中分析物的測試樣品和其它物質的混合物。這些物質的實例包括特異性結合成員、輔助結合成員、分析物-類似物、拉曼活性標籤、緩衝液、稀釋劑、和具有能夠引起表面增強拉曼光語的表面的顆粒、以及其它。這裡使用的術語"測試樣品"是指含有待利用本發明進行檢測和測定的分析物的樣品。該測試樣品除了所述分析物之外還可以含有其它組分，可以具有液體或固體的物理性質，並且可以為任意尺寸或體積，包括例如，流動液體的流。該測試樣品除了分析物之外還可以含有任意的物質，只要其它物質不幹擾與特異性結合成員的特異性結合或不幹擾分析物或分析物-類似物。測試樣品的實例包括但不限於血清、血漿、唾液、精液、尿、其它體液、組織和細胞樣品(例如，胂瘤樣品、器官樣品等)和環境樣品例如地下水或廢水、土壤提取物和殺蟲劑殘留物。圖1A、1B、1C說明用於PSA檢測的肽綴合納米新月體、製造過程、和檢測。圖1A:製造過程。納米級Au層蒸鍍在聚苯乙烯納米顆粒上以形成TEM圖像中所示的Au納米新月體，其中該新月體頂端顯示出較小的密度。厶力iffl拉曼標記分15子、生物素或R19(未顯示)，和用於兩個版本的標記肽的半胱氨酸終止。肽通過Au-S鍵綴合到納米新月體的Au表面。圖1B:PSA檢測方案。在蛋白水解反應之前，肽綴合納米新月體的SERS譜含有拉曼標記分子、聚苯乙烯納米顆粒、和肽的特徵峰；在PSA的消化反應之後，肽在Q之後被剪切。含有拉曼標記分子的剪切片段從納米新月體表面擴散開，而其它片段保留在納米新月體的表面上。肽的SERS譜變得不同並且得自拉曼標記分子的特徵峰消失。圖1C:(l)通過納米新月體的模擬局部電場振幅增強。納米新月體的頂端區域具有100倍的電磁增強因子。(2)納米新月體上的極性電場能量分布。幾乎100%的能量集中在佔納米新月體總面積~1/6的頂端區域附近。圖2A、2B和2C說明具有銳邊的金納米新月體。圖2A:納米新月體SERS底物的概圖。金表面可用生物分子接頭功能化以識別特定生物分子。納米新月體的銳邊可增強拉曼散射強度使得可以檢測其上的生物分子。圖2B:納米新月體的幾何圖。具有銳邊的金納米新月集合了納米環和納米頂端的幾何特徵。圖2C:兩種納米新月體的透射電子顯微鏡圖像。顯示的納米新月體均有300nm的內徑、100nm的底部厚度，但具有不同的取向。比例尺為100nm。圖3說明納米新月體的製造過程。(a)將單層的球形聚苯乙烯膠體澆鑄在光刻膠塗布的玻璃基底上。(b)通過電子束蒸鍍將金層塗布在聚苯乙烯膠體的表面上。在沉積期間樣品以相對於金靶一定的角度保持旋轉。納米新月體的苯乙烯球從該基底剝離。(d)金納米新月體的掃描電鏡照片。膠體顆粒的溶解將該納米新月體釋放到懸液中。然後收集該納米新月並放置在底物上。為方便在SEM中展示，顯示的納米新月體沒有和在我們的光學實驗中使用的納米新月體一樣在水中進行稀釋。比例尺為200nm。圖4說明納米新月體的幾何結構，其中如兩個部分重疊的圓所示，r是內徑、R是外徑、且d是圓心距。圖5說明SERS顯微光譜學系統和納米新月體的可視化。肽綴合納米新月體懸浮在封閉的透明微室中的反應緩衝液中。該納米新月體可使用暗場照明從斜角可視化，如插圖中所示的亮點。激發雷射通過顯微物鏡聚焦在納米新月體上。SERS信號通過相同的物鏡收集並通過分光計分析。圖6A和6B顯示分別用生物素(圖6A)和作為拉曼標記分子的R19(圖6B)進行PSA消化前後的肽綴合納米新月體的典型SERS光譜。圖7A、7B、7C和7D顯示在PSA消化反應中時間分辨SERS光譜。圖7A:以作為拉曼標記分子的生物素通過420nMPSA進行的肽消化中的SERS光譜。圖7B:以作為拉曼標記分子的R19通過420nMPSA進行的肽消化中的SERS光譜。圖7C:以作為拉曼標記分子的R19在抑制劑存在下通過420nMPSA進行的肽消化中的SERS光譜。圖7D:以作為拉曼標記分子的R19通過420nM粒酶B進行的肽消化中的SERS光譜。圖8A和8B顯示PSA消化反應中與時間有關的拉曼峰強度。圖8A:分別以OM(緩衝溶液)、4.2nM、42nM和420nM的PSA進行的消化反應中生物素在525cm"下的拉曼峰強度。圖8B:分別以420nMPSA、具有抑制劑的420nMPSA、和420nM的粒酶B進行的消化反應中R19在1183cm"下的拉曼峰強度。具體實施例方式在各種實施方式中，本發明涉及新的指示物，其提供對樣品中一種或多種蛋白酶的存在和/或量和/或活性的測量。在某些實施方式中，該指示物包括一種或多種附接於用於一種或多種蛋白酶分子的底物(例如，多肽)的納米新月體結構，參見例如圖1A。該指示物可任選地進一步包括一種或多種附接於底物的拉曼標記。該指示物起到對拉曼散射檢測體系來說非常靈敏的探針(例如，表面增強拉曼散射(SERS)探針)的作用。在某些實施方式中，本發明涉及使用肽綴合納米新月體表面增強拉曼散射(SERS)探針進行蛋白水解活性生物分子的體外、原位、或在某些情況下的體內的檢測。這裡描述的探針可以至少實現納摩的靈敏度，從而能夠以極低的濃度(例如，一或幾個分子)和/或以極小的體積(例如，飛升體積)檢測蛋白水解(或其它生物學的)活性。在各種實施方式中，指示物的納米級尺度和指示物高的局部電磁場增強(圖1C)能夠在其表面上進行生物分子反應的高靈敏度光學檢測。在某些優選的實施方式中，該指示物包括納米新月體表面增強拉曼散射(SERS)探針。該表面增強拉曼散射(SERS)探針可以包括綴合到納米新月體結構(例如，納米新月體芯和殼)的肽，其中該肽含有蛋白酶識別和剪切的特定胺基酸序列(蛋白酶識別位點)。在各種實施方式中，該肽附接於拉曼標記上。17該肽通過"目標"蛋白酶的剪切提供了拉曼光譜中容易檢測的強烈變化。因此，該肽綴合納米新月體可以用作特定篩選工具以提供一種或多種蛋白酶例如癌症的生物標誌物如生物樣品中的前列腺特異抗原(PSA)的存在、濃度和蛋白水解活性的信息。納米新月體組合物和製造本發明的指示物通常包括一種或多種耦聯到生物分子(優選肽)的納米新月體。在某些實施方式中，該納米新月體可以包括芯和殼。當存在時，該芯可以由具有基本上恆定拉曼光譜的塑料(例如，聚苯乙烯)、二氧化矽或其它礦物質、或其它III族、IV族、或v族材料、右旋糖酐、》茲性材料、或任意其它材料組成。該納米新月體"月球"結構具有允許局部電磁場增強的納米頂端和納米環兩個特徵(圖2A)。在橫截面圖中，納米新月體的形狀類似具有尖銳頂端的將該SERS"熱位點"從頂端擴展至環線(即，一組納米頂端)，如圖2B所示。從俯視圖看，納米新月體的形狀類似尖銳度比之前展示的納米環(Aizpurua等人(2003)屍—.丄飢90:057401)高的納米環，所以納米新月體的圓形銳邊可以具有較強的場發射或"天線，，效應。在各種實施方式中，該金納米新月體具有如圖2C所示的亞10nm的銳邊。在某些實施方式中，該納米新月體可通過如圖4所示的幾何結構表徵，其中如兩個部分重疊的圓所示，r是內徑、R是外徑、且d是圓心距。在各種實施方式中，R是約20nm到約800nm,優選約40nm到約600nm,更優選約50nm到約500或400nm,且最優選從約100nm到約200nm或300nm。在各種實施方式中，r是約10nm到約500nm，優選約20nm到約400nm，更優選約50nm到約300nm，且最優選約100nm到約200nm。在各種實施方式中，d是約IO到約400nm,優選約20nm到約200nm或300nm,更優選約30nm、40nm或50nm到約100或150nm。該納米新月體殼可以由金屬(例如，金、銀、鵠、柏、鈦、鐵、錳等，或它們的氧化物或合金)、半導體材料、多層金屬、金屬氧化物、合金、聚合物、碳納米材料等組成。在某些實施方式中，該納米新月體殼包括下列的一種或多種鴒、鉭、和鈮、Ga、Au、Cu、Al、Ta、Ti、Ru、Ir、Pt、Pd、Os、Mn、Hf、Zr、V、Nb、La、Y、Gd、Sr、Ba、Cs、Cr、Co、Ni、Zn、Ga、In、Cd、Rh、Re、W、Mo，和它們的氧化物、合金、混合物、和/或氮化物。在各種實施方式中，該芯的直徑為約30nm到約500nm,優選約50nm到約200nm、300nm、或400nm,更優選約50nm到約100nm或150nm，jt^^A^w^r8trmr^^t^3iini^W3Dlimnnj^步更優選約8nm到約20或30nm，且最優選約10nm到約20nm或約25nm。通過選擇不同的芯尺寸和殼厚度，可以調節等離子體共振波長和表面增強因子以與各種應用相配。圖1A示意地展示了本發明的納米新月體指示物的一個實施方式並且提供了其電子顯微照片。在某些實施方式中，該納米新月體優選通過在旋轉納米顆粒(例如，聚苯乙烯納米顆粒模板)上將納米新月體材料(例如，4艮、金等)成角度的沉積而製造，如Lu等人(2005)iVa"o丄eW5,119-124描述，其通過引用納入本申請。製造過程示意性地展示在圖3中。如圖3所示，該方法包括將單層的球形芯材料(例如，聚苯乙烯膠體)澆注在塗布有光刻膠的基底(例如，玻璃基底)上。該納米新月體殼材料(例如，金、銀等)通過電子束蒸鍍塗布在所述芯的表面上。該樣品在沉積期間在相對於所述金(或其它材料)靶某個角度下保持旋轉。該納米新月的形狀除了取決於所述芯結構(例如，聚苯乙烯球)的尺寸之外還取決於沉積的角度。該塗布的納米新月體可使用合適的溶劑(例如，丙S同)從該基底剝離。該芯可以任選地通過使用合適的溶劑(例如，曱苯)從該納米新月體移除。然後可以收集該納米新月體並置於基底上。在一個展示性的實施方式中，該納米新月體包括IOOnm的聚苯乙烯芯和1020nm的金新月體殼。該納米級Au層蒸鍍在聚苯乙烯納米顆粒上以形成圖1C中TEM圖像中所示的Au納米新月體，其中該新月體頂部顯示較小的密度。在某些實施方式中，該納米顆粒芯不被移除並起到SERS檢測中內部對照(internalcontrol)的作用。該製造過程是展示性的而不是限制性的。使用這裡提供的教導，本領域的技術人員將認識到本實驗方案和其它納米新月體製造方法的各種變型。蛋白酶底物這裡描述的納米新月體指示物可以利用多肽序列，該序列包括任意期望檢測的蛋白酶的一個或多個識別位點。蛋白酶(蛋白水解活性)不僅需要用於維持正常的細胞功能，而且對於各種人類疾病的發病機理也是重要的。寄生蟲病(例如血吸蟲病和瘧疾)、真菌(例如人白色念珠菌(C.ablicans))和病毒感染(例如HIV、皰瘮和肝炎)，以及癌症、炎症、呼吸性疾病、心臟血管疾病和神經變性疾病，包括阿爾海默症，需要蛋白水解活性用於發展。因此蛋白酶的存在、量或活性的檢測作為疾病的存在或可能性的診斷/預測標誌物是有用的。另外，蛋白酶活性(或其抑制)的檢測對於處理大量病理的蛋白酶抑制劑療法的篩查是有用的。可以根據本發明檢測和/或量化的"蛋白酶"典型地是使位於多肽鏈中胺基酸對之間肽鍵水解的酶，也稱作內切蛋白酶。蛋白酶典型地通過參照酶的催化中心中的親核體而定義。最常見的親核體來自絲氨酸、天冬氨酸、和半胱氨酸的側鏈，產生蛋白酶家族，例如絲氨酸蛋白酶(Paetzel等人(1997)7ewfe說0c/2e附.22;28-31)、天冬氨醯蛋白酶(Spinelli等人(1991)所oc/zem/e73:1391-1396)、和半胱氨酸蛋白酶(Altschuh等人(1994)屍ra/.五"g.7:769-75,1994)。金屬蛋白酶通常在催化位點含有鋅催化金屬(Klimpel等人(1994)Mo/.M/craWo/.13:1093-1100)。這些蛋白酶家族各成員的展示性實例提供在表1中。表1.展示性蛋白酶和蛋白酶識別位點(*是指被水解的肽鍵)。tableseeoriginaldocumentpage21"蛋白酶識別位點，，是通過肽鍵連接的胺基酸的連續序列，其含有通過特定蛋白酶水解的肽鍵連接的胺基酸對。任選地，蛋白酶識別位點可以包括在待水解的肽鍵的任一側上的一種或多種胺基酸，該胺基酸也結合有蛋白酶的4崔4匕^f立點(Schecter和Berger，(1967)5/oc/zew.5/op/z;^Commww.27:157-62)，或者在蛋白酶底物上的識別位點和剪切位點可為通過一個或多個(例如，2-4個)胺基酸分開的兩個不同的位點。蛋白酶識別位點中胺基酸的特異性序列典型地取決於該蛋白酶的催化機理，其通過該蛋白酶活性位點處官能團的性質限定。例如，胰島素水解通過賴氨酸或精氨酸殘基賦予羰基官能的肽鍵，而於多肽《連的長度或胺基酸序列無關。然而，凝血因子Xa識別特異性序列Ile-Glu-Gly-Arg(SEQIDNO:19)並使Arg的C端側上的肽鍵水解。因此，在各種實施方式中，蛋白酶識別位點可以包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、或IO或更多個胺基酸。任選的，額外的胺基酸可以存在於識別位點的N端和/或C端。根據本發明的蛋白酶識別位點還可以為已知蛋白酶的識別位點的變體，只要其通過蛋白酶識別/剪切。各種優選的蛋白酶識別位點包括，但不限於下列酶的識別位點來自絲氨酸蛋白酶家族的蛋白酶、或金屬蛋白酶、或來自半胱氨酸蛋白酶家族的蛋白酶、和/或來自天冬氨酸蛋白酶家族的蛋白酶、和/或來自穀氨酸蛋白酶家族的蛋白酶。在某些實施方式中，優選的絲氨酸蛋白的識別位點包括但不限於下列酶的識別位點類胰凝乳蛋白酶、和/或類枯草桿菌蛋白酶、和/或a/卩水解酶、和/或信號肽酶。在某些實施方式中，優選的金屬蛋白酶識別位點包括但不限於金屬羧基肽酶或金屬肽內酶的識別位點。蛋白酶識別位點對本領域技術人員來說是熟知的。對於基本上每個已知的蛋白酶已經確定了其識別位點。因此，例如，胱天蛋白酶的識別位點(肽底物)由Earnshaw等人在(1999)^""".說oc/ze肌，68:383-424中描述，該文獻通過引用納入本文(也見表2)。表2.胱天蛋白酶的展示性肽底物(*是指被水解的肽鍵)名稱肽底物SEQIDNO胱天蛋白酶1YEVD*X20(ICE)WEHD*X21胱天蛋白酶2VDVAD*X22(lch-IL)DEHD*X23胱天蛋白酶3DMQD*X24(CPP32，Apopain)DEVD*X25胱天蛋白酶4LEVD*X26(Icere|IITx，Ich-2)(W/L)EHD*X27胱天蛋白酶5(W/L)EHD*X28(ICErelIII,Ty)胱天蛋白酶6VEID*N29(Mch2)VEHD*X30胱天蛋白酶7DEVD*X31(Mch3,CMH-l,ICE-LAP3)胱天蛋白酶8IETD*X32LED*X33胱天蛋白酶9LEHD*X34胱天蛋白酶10IEAD*X35在一個檢測PSA的展示性實施方式中，肽設計引入具有絲氨酸殘基的22PSA-特異性肽的活性位點的胺基酸序列和可以通過PSA識別的側翼序列。因此，例如，在一個實施方式中，肽含有已經顯示對蛋白水解活性PSA具有非常高的特異性的序列HSSKLQ-LAAAC(SEQIDNO:36)(參見，例如，Denmeade,等人(1997)C朋cer7^57:4924-4930)。已經顯示出在小鼠模型的體內HSSKLQ-L(SEQIDNO:37)由PSA剪切但不由任何其它的蛋白酶剪切(Denmeade，等人(2003)JA^/./"W.95:990-1000)。因此，在另一實施方式中，可產生多種肽，各自具有隨機或已知的序列部分，只要各自引序列。在一個展示性實施方式中，PSA消化位點在肽HSSKLQ-LAAAC(SEQIDNO:36)中穀氨酸(Q)和亮氨酸(L)殘基之間。該肽消化成2個片段，HSSKLQ(SEQIDNO:l)和LAAAC(SEQIDNO:38)。該肽優選地附接於納米新月體表面，使得該肽不受PSA酶的空間位阻，從而可最優地處理。預期在從而提高檢測靈敏度。但是這樣做拉曼標記分子的距離可能更遠離納米新月體的表面，導致較低的拉曼強度水平。然而，類線圈的短肽結構導致末梢的拉曼標記分子與納米新月體表面接觸的可能性大。在某些實施方式中，肽包含至少一個蛋白酶識別位點。在各種實施方式中，肽可以包含兩個、三個或更多個蛋白酶識別位點。所述位點可以是用於相同的蛋白酶的並具有都被該蛋白酶識別的不同的基序。在某些實施方式中，所述位點可以是相同的。在某些實施方式中，肽可以包括多個識別位點，各自用於不同的蛋白酶，從而允許檢測或量化多種蛋白酶中任意一種的存在或活性。通常，肽具有足夠的長度以引入期望的蛋白酶識別位點。在某些實施方式中，肽比蛋白酶識別位點長並含有額外的胺基酸殘基，例如，作為間隔區和/或有助於通過蛋白酶的識別。通常，肽的長度為約2、3、4、5、6、8、或10個胺基酸中的任一種情況至約20、30、50、80、或100個胺基酸中的任一種情況。在某些實施方式中，底物肽是長度為約3-12、或約4-12、或約6-12、或約8-12、或約10-12個胺基酸殘基的寡肽。然而，在某些實施方式中，肽可以短至4個胺基酸殘基，和長至100個胺基酸。23拉曼標記在各種實施方式中，可以將一種或多種拉曼標籤(拉曼標記)附接於附接到納米新月體上的底物(例如，多肽)。這種拉曼標記的存在可以增強由肽的剪切產生的拉曼信號的變化。現有技術(例如，美國專利5，306，403;6,002,471;6,174,677，這些通過引用納入本文)中已知多種拉曼標籤並且可以使用任何這些已知的拉曼標籤。標籤通常具有特徵性的(例如，獨特的)並高可視化的/可檢測的光學信號。標記分子的非限制性實例包括TRIT(四曱基羅丹明異硫醇)、NBC(7-硝基苯-2-氧雜-1,3-二唑)、德克薩斯紅染料、鄰苯二曱酸、對苯二曱酸、間苯二曱酸、曱苯基堅牢紫、曱苯基藍紫、亮曱苯基藍、對氨基苯曱酸、赤蘚紅、生物素、洋地黃毒苷、5-羧基-4，,5，-二氯-2，,7，-二曱氧基螢光素、5-羧基-2，，4，，5，，7，-四氯螢光素、5-羧基螢光素、5-羧基羅丹明、6-羧基羅丹明、6-羧基四曱基氨基酞菁、6-羧基-X-羅丹明、曱亞胺、花青、黃嘌呤、琥珀醯螢光素、氨基吖啶、和氰化物(CN)、硫醇(SH)、氯(C1)、溴(Br)、曱基、磷(P)、硫(S)、SN、Al、Cd、Eu、Te、和含有這種部分的化合物。在某些實施方式中，可以使用碳納米管、量子點(參見，例如，EvidentTechnologies,TroyN.Y.;Invitrogen/MolecularProbes,efc.)、或樣O求(例如，螢光樣U求(參見，例如，4尋自Invitrogen/MolecularProbes6勺Transfluosphres⑧)yf乍為才立曼才示"i己。多種拉曼標籤是可商購的(例如，得自Invitrogen/MolecularProbes)並且經常提供為附接於接頭上的和/或衍生有一種或多種官能團的，以促進與其它部分的耦聯。底物與納米新月體的耦聯肽(蛋白酶底物)和/或存在的拉曼標籤可以用本領域技術人員已知的多種方法中任一種彼此耦聯。肽(或其它底物)可以例如通過底物(肽)和/或納米新月體上的反應性基團直接耦聯到新月體。或者肽(或其它底物)可以通過接頭附接於新月體。類似的，當存在時，拉曼標籤可以直接地(例如，通過官能團)或也通過接頭附接於肽(或其它底物)。例如，在某些實施方式中，依靠形成共價鍵的金-硫醇反應，利用肽的羧基端處的半胱氨酸基團，將底物肽粘連到金納米新月體殼的表面上以將肽附接於金表面。在各種實施方式中，納米新月體(例如，金)表面和/或底物(例如，蛋白酶底物)可以衍生有，例如，胺、羧基、烷基、鏈烯基、羥基、或其它官能團使得肽(或其它底物)可以直接地連接到納米新月體表面和/或拉曼標籤或通過接頭耦聯。在另一實施方式中，納米顆粒可塗覆有，例如，具有胺、羧基、或其它官能團的二氧化矽殼以附接於肽(或其它底物)。合適的接頭包括但不限於含有兩個或更多個反應性位點的異雙功能團分子或同雙功能性分子，該反應性位點均可與分別的結合配偶體(即拉曼標記、肽(或其它底物)、納米新月體表面或其上的官能團等)形成共價鍵。適合用於連接這種部分的接頭是本領域技術人員熟知的。例如，蛋白質分子可容易地通過多種接頭中的任一種連接，該多種接頭包括但不限於肽接頭、直鏈或帶支鏈的碳連結頭、或通過雜環碳接頭連接。異雙功能團交聯劑例如N-乙基馬來醯亞胺的活性酯已經被廣泛用於將蛋白質連接到其它部分(參見，例如，Lerner等人(1981)屍rac.7VWJcW.(USA),78:3403陽3407;Kitagawa等人(1976)/5/oc/zem.,79:223-236;Birch和Lennox(1995)單克隆抗體原理和應用(MonoclonalAntibodies:PrinciplesandApplications)中的第四章，Wiley-Liss,N.Y.等)。在某些實施方式中，可利用生物素/抗生素蛋白的相互作用將納米新月體和/或拉曼標籤與肽(或其它底物)結合。在某些實施方式中，可以將例如具有不耐光保護基團的生物素或抗生素蛋白附接於納米新月體上。在承載有相應抗生素蛋白或鏈黴抗生素蛋白、或生物素的期望部分的存在下照射納米新月體，導致該部分與納米新月體耦聯。對於一種或多種部分(例如，納米新月體，肽(或其它底物，和/或拉曼標籤))承載反應性基團或衍生以承載反應性基團來說，可容易提供多種耦聯方法。因此，例如，游離氨基進行醯化反應，所述醯化反應具有本領域技術人員熟知的多種羧基活化接頭擴展(linkerextension)。接頭擴展可以在該階段進行以產生末端活化基團例如活性酯、異氰酸酯、馬來醯亞胺等。例如，肽或氨基衍生的納米新月體與雙羧酸如對苯二曱酸的同雙功能性N-羥基琥珀醯亞胺酯的一端的反應將產生可用於綴合到胺的穩定的N-羥基琥珀醯亞胺酯封端的接頭加合物。接頭擴展還可以用異雙功能性試劑例如馬來醯亞胺鏈烷酸N-羥基琥珀醯亞胺酯完成以產生末端馬來醯亞胺基團用於後續的與硫醇基團的綴合。氨基封端的接頭可以用異雙功能性硫醇化試劑擴展，該硫醇化試劑進行反應以在一端形成醯胺鍵並在另一端形成游離的或受保護的硫醇。25現有技術中熟知的這種硫醇化試劑的一些實例有2-亞氨基四氫噻吩(2-iminothiolane)(2-IT)、琥珀醯亞氨基乙醯基硫代丙酸酯(SATP)和琥珀醯亞氨基-2-硫代吡咬基二硫代丙酸酯(SPDP)。然後在去保護之後可獲得初期硫醇基團，與馬來醯亞胺基部分或溴乙醯化部分形成硫醇醚或直接與金表面相互作用。在各種實施方式中，例如通過在酸的存在下與鹼金屬亞硝酸鹽反應，氨基例如氨基封端的接頭的氨基可以轉化為重氮基團，因此該物質轉化為重氮鹽，然後，該重氮鹽與合適的親核部分(例如，但不限於肽的酪氨酸殘基等)有反應性。用於向這種重氮鹽轉化的合適氨基封端的接頭的實例包括但不限於芳族胺(苯胺)，並且還可包括上述的氨基己酸酯和類似的物質。這種苯胺可容易地通過在如上所述的可獲得的羥基和N保護的胺基酸之間的耦聯反應中代入相應胺基酸而獲得，其中氨基由芳族胺(即苯胺)組成，其中胺作為例如N-乙醯基或N-三氟乙醯基而合適地被保護，然後使用本領域已知成重氮鹽的胺前體。異雙功能性接頭的其它有利類型是混合的活性酯/醯氯，例如琥珀醯亞氨基-氧羰基-丁醯氯。該接頭的反應性較強的醯氯端先使例如肽上的氨基或羥基醯化以直接提供N-羥基琥珀醯亞氨基酯接頭加成物。本發明中有用的另一種末端活化基團是醛基。醛基可以通過以下方式產生使游離羥基(例如在肽或衍生納米新月體上的)與烷基酸或芳基酸耦聯而產生，該烷基酸或芳基酸在co位(末端)取代有屏蔽的醛基如乙縮醛基，例如1,3-二氧雜環戊-2-基或1,3-二氧雜環己-2-基部分，隨後使用本領域熟知的方法進行該基團的去屏蔽。在各種實施方式中，在co位取代有保護的羥基(例如，乙酸基部分)的烷基或芳基羧酸可以用於耦聯反應中，隨後在合適的溶劑，優選二氯曱烷中用如重鉻酸吡啶錯鹽的試劑進行羥基的去保護和輕度氧化，從而提供相應的醛。產生醛封端的物質的其它方法對本領域的技術人員來說是明顯的。在某些實施方式中，相同或不同的多個肽綴合到相同或不同的納米新月體的表面。在多種實施方式中，約5-500，更優選約10-約400，進一步更優選約20、30、或40-約200、250、或300,且最優選約50-約150個底物分子(例如肽)附接於納米新月體。在一個實施方式中，約100個肽利用Au與肽上硫醇基團的直接反應綴合到納米新月體。26在各種實施方式中，底物，例如可以通過蛋白水解活性蛋白酶特異性剪切的肽，綴合或粘連到納米新月體的表面上。在優選實施方式中，底物肽是長度約10-12個胺基酸殘基的寡肽。然而，在多種實施方式中，肽可以短至4個胺基酸殘基，和長至100個胺基酸。在各種實施方式中，肽包括通過相應的蛋白酶特異性識別和剪切的底物。肽可以合成以及商業化地獲得，或者肽可以根據實施例1中描述的方法製備。在某些實施方式中，在肽的氨基末端，拉曼活性分子例如生物素(圖1A)或羅丹明6G(R19)(圖1A)優選地通過短的聚乙二醇或氨基戊酸接頭接枝。上述耦聯方法M示性的而不是限制性的。利用本文提供的教導，本領域的技術人員將認識到將底物耦聯到納米新月體的，以及任選地將拉曼標籤耦聯到底物的各種方法。拉曼指示物的檢測在拉曼光語中有潛在用途的多種檢測單元在現有技術中是已知的且可使用任意已知的拉曼檢測單元。拉曼檢測單元的一個非限制性實例公開於美國專利6,002,471中。在該實例中，激發束通過Nd:YAG雷射器在532nm(納米)波長下產生或者通過Ti:藍寶石雷射器在365nm波長下產生。可使用脈衝雷射束或連續雷射束。激發束穿過共焦光學系統(confocaloptics)和顯微鏡物鏡，並且可聚焦在含有附著的生物分子靶的基底上。拉曼發射光靶可以通過顯微鏡物鏡和共焦光學系統聚集，耦聯到用於光譜分離的單色器。該共焦光學系統可以包括二向色濾光片、阻擋濾光片、共焦孔、透鏡、和用於減少背景信號的鏡片的組合。還可以使用標準全場光學系統作為共焦光學系統。拉曼發射信號可以通過拉曼檢測器檢測。該檢測器可以包括與用於信號計數和數位化的計算機接口連接的的雪崩光電二極體。其中對靶陣列進行分析，光學檢測系統可設計為檢測拉曼信號和將拉曼信號定位於晶片或網格上的特定位置。例如，發射光可引導至CCD(電荷耦合器件)照相機或其它能夠在檢測區域內同時測量來自多個像素或多組像素的光發射的檢測器。拉曼檢測單元的其它實例公開於，例如，美國專利5,306,403,包括SpexModel1403雙光柵分光光度計，其配有以單光子計數模式操作的砷化鎵光電自SpectmPhysics的514.5nm線的氬離子雷射器Model166，和647.1nm線的氪離子雷射器(Innova70，Coherent)。27各種激發源包括但不限於337nm下的氮雷射器(LaserScienceInc.)和325nm下的氦-鎘雷射器(Uconox)(美國專利6,174,677)。該激發束可以用帶通濾光片(Corion)進行光譜純化並可使用6倍物鏡(Newport,ModelL6X)聚焦在基底140上。該物鏡可用於通過使用全息分束器(KaiserOpticalSystems,Inc.,ModelHB647-26N18)激發指示物和聚集拉曼信號，以產生對於激發束和發射拉曼信號來說的直角幾何結構。可以使用全息陷波濾波器(KaiserOpticalSystems,Inc.)以減少瑞利散射輻射。其它拉曼檢測器包括但不限於配備有紅色增強的強化電荷耦合器件(RE-ICCD)檢測系統的ISAHR-320攝譜儀(PrincetonInstruments)。可使用其它類型的檢測器，例如電荷注入器件、光導二極體陣列或光電電晶體陣列。使用如圖5所示的包括具有拉曼分光計的顯微鏡系統的一種典型實驗系統配置以從單個納米新月體獲得拉曼散射光譜。在一個實施方式中，該系統由配備有數位照相機和具有攝譜儀CCD照相機的單色儀的倒置顯微鏡例如CarlZeissAxiovert200(CarlZeiss,德國)、雷射源和光學透鏡組成。在各種實施方式中，雷射波長可以在可見光區和近紅外區。在一個優選的實施方式中，使用785nm的半導體雷射器作為拉曼散射的激發源，並且雷射束通過40X物鏡聚焦在納米新月體上。785nm或其它近紅外光源可以確保由樣品中生物組織的吸收較少和較低的螢光背景。然而，對於某些應用，較低的波長激發光可能是更有利的，且甚至UV光激發可以用於應用。激發功率也可通過光度計測量以確保在某些實施方式中~0.5到1.0mW的輸出。拉曼散射光可以通過相同的光路穿過長通濾波器聚集並通過分光計分析。在各種實施方式中，確定生物樣品中蛋白酶的存在、和/或濃度、和/或活性。生物樣品可以包括基本上任意期望測定的生物材料。這種生物材料包括但不限於生物流體例如血液和血液組分、淋巴、腦脊液、精液、尿、口腔液等、組織樣品、細胞樣品、組織或器官活檢或抽出物、組織學標本等。在各種實施方式中，優選在封閉的透明微室中，肽綴合的納米新月體用懷疑含有蛋白酶分子的樣品培養。該微室安置在具有用於納米顆粒可視化的暗場照明的倒置拉曼顯微鏡的熱板(例如，在37匸下的)上。該納米新月體利用暗場照明從傾斜的角度可視化，如插圖中的亮點所示。激發雷射通過顯微鏡物鏡聚焦在納米新月體上。SERS信號用相同的物鏡聚集並通過分光計分析。插圖顯示聚焦在單個納米新月體上的~0.8mW的激發雷射斑。消化反應的實時^r測可以在30分鐘內發生。然而，在某些實施方式中，培養可以短至1-5分鐘和長達24小時，或者，如果應用需要較長的培養時間則更長。在初始離心分級之後，粗細胞溶解產物、尿樣品、精液、腦脊液、血液、或其它樣品材料中的可溶物可以直接用探針培養。探針的濃度不是關鍵的，因為每次僅檢測一個或幾個探針。為了特異性地抑制綴合肽的蛋白酶介導的蛋白水解，可以在加入蛋白酶之前引入蛋白酶抑制劑。例如，在相同的實驗條件下，加入抑制劑之後抑制了超過90%的通過PSA進行的肽消化。蛋白酶的存在、濃度和活性的一個檢測方案如圖1B所示。在該方法中，將肽綴合SERS探針提供給溶液或樣品。在蛋白水解反應之前，肽綴合的納米新月體的SERS光譜含有拉曼標記分子、聚苯乙烯納米顆粒、和肽的特徵峰。通過蛋白酶進行的消化反應應該在預定的剪切位點剪切肽。例如，在通過PSA進行的消化反應期間，在Q和L殘基之間剪切肽HSSKLQ-L(SEQIDNO:37)，這裡用點劃線表示。人工肽的SERS光譜在用蛋白酶的剪切之後改變，因為含有拉曼標記分子的剪切片段從納米新月體表面上擴散離開，同時其它片段保留在納米新月體表面上。具有拉曼活性標記的分子部分的特徵SERS峰消失，這是由於在肽消化之後標記分子從納米新月體表面擴散錯位到溶液中；因此溶液中有蛋白水解活性的PSA的存在和濃度可以通過監測肽綴合的納米新月體的SERS光譜進行探測。然後，附接肽的拉曼散射信號通過納米新月體放大且通過如上所述的含有拉曼分光計的顯微鏡系統檢測，以從單個納米新月體獲得拉曼散射光譜。優選將拉曼散射分光計連接到計算機，從而能夠控制分光計並且能夠獲得光譜，並且可觀察光譜圖。消化反應動力學可通過時間分辨的SERS光譜採集進行監測。例如，光語圖中見到的來自拉曼標記分子的峰，例如，圖6A中來自生物素的525cm-1處的峰和圖6B中來自R19的1183cm-1處的峰，這些峰在消化反應完成之後幾乎完全消失(圖6A和B)。如圖6A中時滯SERS光譜所示，用525cm"處的生物素峰的消失監測的各納米新月體上肽的消化，在420nM的PSA濃度下花費30分鐘。對於具有R19作為拉曼標記分子的肽，在通過420nM的PSA消化之後也可以觀察到1183cm"處R19峰的消失(圖6B)。因此，肽的消化可以通過拉曼標記分子的釋放和其拉曼峰的消失而確認。實時監測的時間解析度(tempomlresolution)可以為約幾秒且反應通常持續10~20分鐘。光譜檢測可以用普通的光譜多色計(spectralpolychrometer)和致冷CCD照相機進行。拉曼峰的監測波數為400cm"-2000cm"。在某些實施方式中，消化反應中納米新月體SERS探針中的拉曼活性標記的拉曼峰的時滯強度分別用蛋白酶、具有抑制劑的蛋白酶、和陰性對照物獲得。所有的峰強度值歸一化至內部對照峰(例如，測量聚苯乙烯芯的峰強度為1003cm")和陽性或陰性對照物的波數處的初始峰強度。陰性對照物可以為納米新月體-肽混雜物，其中該肽不是感興趣的蛋白酶的底物並且不被所研究的蛋白酶剪切。結果應該表明，通過拉曼活性標記的峰強度的逐漸消失，肽通過PSA有效地和特異性地剪切。納米新月體顆粒起到納米信號放大器的作用並且檢測到的拉曼信號來自粘連在納米新月體顆粒表面上的所有肽。在某些實施方式中，每個納米新月體最多附接IOO個肽分子，可能沒有完全利用具有最高SERS信號的納米新月體表面，並且僅有小百分比的肽附接於在電磁場中提供最大增強的區域(圖1C)。數值模擬(圖1C)表明局部電場的振幅可以增強近MdB(100倍)，特別在銳邊周圍。由於電場振幅和拉曼增強因子之間的四次方關係，肽拉曼信號可通過納米新月體放大108倍。而且，由於平均有幾十到幾百個肽用於對各納米新月體的綴合反應，來自標記分子的特徵拉曼峰的消失不是驟然的。由於大部分增強的區域集中在佔納米新月體總面積的~1/6的頂端區域周圍，即使假設綴合效率為100%，在該高的增強區域中貢獻於拉曼散射信號的實際分子數也小於20個。在某些實施方式中，作為對於各種蛋白酶(例如PSA)濃度的PSA消化時間的函數，用於陽性對照物的拉曼峰的強度在檢測樣品中蛋白酶(例如PSA)的存在或活性之前獲得。具有用於PSA綴合物的陽性對照生物素和R19拉曼標記分子的肽綴合的納米新月體的典型SERS光譜分別如圖6A和6B所示。通過對比肽消化實驗前和肽消化實驗2小時後的SERS光譜，得自納米新月體芯的拉曼峰(例如，聚苯乙烯芯，例如1003cm")保持恆定，並因此還可以起到內部對照物的作用。消化速率與PSA濃度有關，且對於lnM濃度PSA活性通常(生物素信號強度降低~50%,未顯示數據)在30分鐘內觀察到。某些來自在消化之後保留在納米新月體表面上的部分胺基酸鏈的拉曼峰可能仍在光譜中出現，雖然峰位置有輕微的變化並且由於肽剪切時可能的構象變化而使峰強度降低。在某些實施方式中，實施陰性對照物以顯示肽是通過樣品中存在的蛋白酶特異性地剪切的。實施例1使用其它絲氨酸蛋白酶例如粒酶B(其可以起到陰性對照物的作用)顯示了綴合肽對PSA的特異性。圖7C和7D顯示了具有R19標記分子的PSA綴合納米新月體在分別用PSA抑制劑和絲氨酸蛋白酶粒酶B的兩組對照實驗中的時滯SERS光譜，其中粒酶B具有與PSA的正交底物特異性。在用420nM粒酶B進行的肽消化的對照實驗中，反應速率沒有顯示出與抑制劑處理的反應有統計上的顯著差異。還預期粒酶B無能力剪切肽，因為PSA已經顯示是HSSKLQ-LAAAC(SEQIDNO:36)序列在體內唯一的蛋白酶。在各種實施方式中，肽綴合納米新月體可以用作特異性篩查工具以提供在臨床環境(clinicalsetting)中從病人獲得的生物樣品中的蛋白酶癌症生物標誌物例如PSA和其它物質的濃度和蛋白水解活性的信息。預計這裡描述的指示物的一種應用是將納米新月體顆粒結合到可以自動化和促進樣品傳輸和洗滌過程的微流體設備中。該納米新月體顆粒還可以實時傳輸或固定在該設備中。其它應用包括將納米新月體顆粒引入到活的細胞或組織中，使得可以在細胞或組織中實時測量蛋白酶活性。這些實例旨在展示且是非限制性的。利用這裡提供的教導，本領域技術人員將獲得其它用途和測定。其它指示物雖然上述討論涉及納米新月體-肽綴合物(指示物)的使用以檢測活性蛋白酶，將認識到相同的方法可以用於檢測其它水解性生物分子的存在。因此，例如，肽蛋白酶底物可以用單鏈或雙鏈核酸(RNA或DNA)替代，並且該指示物可以檢測和/或量化活性核酸酶的存在。在這種情況下，核酸底物通常包括用於核酸酶(例如，限制性內切酶)的一個或多個的識別位點。該核酸酶識別位點的長度通常在約3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp或10bp至約15bp、20bp、25bp或30bp的範圍內。在各種實施方式中，核酸長度的範圍可以在約3bp到約200bp，優選約4bp到約100bp，更優選約6、8、10、16、或20bp到約80、60、40、或30bp。本發明的指示物也不僅限於檢測水解/蛋白水解活性。指示物還可以用於檢測和/或量化結合相互作用(例如，蛋白質/蛋白質相互作用、蛋白質/DNA相互作用、抗體/抗原相互作用、受體/配體相互作用等)。31因此，例如，可提供耦聯到一種或多種納米新月體的蛋白質、和/或糖、和/或複合碳水化合物、和/或脂質、和/或核酸"底物"。當該底物被識別並通過同源結合配偶體結合時，拉曼光譜將改變並檢測到相互作用。因此，例如，可以提供附接於納米新月體的核酸底物，其中該核酸包括一個或多個用於例如DNA結合蛋白質的識別位點。通過DNA結合蛋白質進行的核酸結合改變了拉曼光譜從而產生了可檢測的信號。在某些實施方式中，該底物還承載有上述一種或多種拉曼標籤。雖然拉曼標籤可能不在簡單的結合相互作用中被切斷，但由結合部分引起的增加的空間位阻降低了拉曼標籤與納米新月體的締合，從而顯著地改變了拉曼光譜。其它實施方式利用"竟爭"測定形式用於結合測定。在這種測定中，分析物與承載拉曼標籤的類似部分為附接了納米新月體的底物上的結合位點竟爭。有拉曼標記的部分從其在底物上的結合位置被待測定的樣品中的靶分析物替代，提供了拉曼光譜中可檢測的變化，這是樣品中存在的分析物量的量度。這些測定旨在展示且是非限制性的。利用這裡提供的教導，本領域技術人員將獲得其它測定形式。試劑盒在另一實施方式中，本發明提供用於實施這裡描述的方法的試劑盒。該試劑盒通常包括含有這裡描述的納米新月體的容器。該試劑盒還可以含有一種或多種底物(例如，蛋白酶底物、核酸底物等)。該底物可以在單獨的容器中提供用於後續與納米新月體的綴合，或者它們可作為納米新月體綴合物提供。該試劑盒還可以包括一種或多種拉曼標籤。該標籤可以單獨提供或作為底物納米新月體綴合物的組分提供。在各種實施方式中，該試劑盒任選地包括一種或多種這裡描述的對照試劑(例如，綴合到不能剪切的底物的納米新月體)。在各種實施方式中，該試劑盒任選地包括用於收集和/或處理生物樣品的裝置(例如，注射器、藥籤等)和/或試劑(例如，稀釋劑和/或緩衝液)。另外，該試劑盒任選地包括對實施這裡描述方法提供指導(即協議)的標籤性和/或說明材料。在某些實施方式中，該說明材料描述了使用一種或多種本發明的指示物檢測和/或量化蛋白酶的存在或活性。在各種實施方式中，該說明材料教導了使用指示物和SERS檢測方案以檢測核酸水解和水解反應。32可以檢測各種酶例如核酸酶和水解酶的存在、濃度和活性。雖然該說明材料通常包括書面的或列印的材料，但它們不限於此。本發明預期能夠存儲這種說明並將它們與最終用戶溝通的任意介質。這種介質包括但不限於電子存儲介質(例如，磁碟、錄像帶(tape)、盒式磁帶、晶片)、光學介質(例如，CDROM)等。這種介質可包括提供這種說明材料的英特網網站的地址。實施例提供下列實施例以展示，但不限於要求保護的本發明。實施例1用於蛋白酶的光學檢測的肽-納米新月體混雜SERS探針蛋白酶的實時原位檢測對於早期癌症篩查和細胞信號傳導研究是關鍵的。然而，在小體積(例如，低於lnL)下用螢光或放射探針是難以實現這種檢測的。在該實施例中，我們展示了將人工標記分子結合到納米新月體顆粒肽的混雜光學探針的用途。我們使用PSA(—種最顯著的前列腺癌標誌物)和病人精液和血清中存在的絲氨酸蛋白酶進行概念驗證(proof-of-concept)研究。來自標記分子的拉曼光譜信號通過納米新月體增強並且該信號在接近於單個蛋白水解活性PSA分子的水平下以飛升反應體積作為肽剪切的指示物而監測。該肽的高的反應特異性和監測的拉曼信號也最小化了其它絲氨酸蛋白酶的錯誤檢測和背景拉曼信號，這導致高保真度和高信噪比的可以容易地引入到納米/微流體設備中的癌症納米探針。這裡，我們介紹一種PSA蛋白水解活性的光學分光檢測方法，該方法基於PSA特異性底物肽(Robert等人(1997)所oc/ze脂:^y36:3811-3819;Wu等人(2004)C7/".C/^m.'50:125-129;Brillard畫Bourdet等人(2002)￡wk/歷oc/zem.,269:390-395;Rehault等人(2002)AocWm.歷op/y^.」cto1596:55-62;Malm等人(2000)/mtote45:132-139)綴合的新月體形狀拉曼納米探針，該方法可用在結合到微流體中或細胞內引入的微小的樣品體積(飛升)上，並且可用於實時光學監測PSA蛋白水解反應。該納米新月體可以起到單獨的表面增強拉曼散射(SERS)底物的作用(Lu等人(2005)5:119-124)。拉曼是一種具有豐富的原子水平信息而無需螢光團進行標籤的用於探測生物化學組成的分光檢測方法(Raman(1928)A^wre121:619-619)，然而拉曼信號強度(散射橫截面)比螢光低得多。已經開發了各種SERS底物將底物表面上化學和生物分子檢測中弱的拉曼散射信號增強了幾個數量級(Lu等人(2005)iVa"o5:119-124;Lu等人(2005)iV朋o5:119-124;Lu等人(2005)丄幼.5:5-9;Haes等人(2005)J爿w,C7zew.127:2264-2271;Jackson和Halas(2004)屍rac.iVa//.Jcad5W.,USA，101:17930-17935;Nie和Emory919975Wewce275:1102-1106;Liu和Lee(2005)p/.屍一￡飢87:074101)。納米新月體由100nm的聚苯乙烯芯和10~20nm的金新月體殼組成。圖1A顯示該納米新月體的示意圖和透射電子顯微照片。該納米新月體通過在旋轉的聚苯乙烯納米顆粒模版上成角度的Au沉積而製造(Lu等人(2005)A^w丄e".5:119-124)。製造細節如前所述(同前)。在該實施例中，不移除聚苯乙烯納米顆粒芯，並且其起到SERS檢測中內部對照物的作用。然後我們將可以通過有蛋白水解活性的PSA特異性地剪切的底物肽粘連在Au納米新月體的表面上。該肽含有HSSKLQ序列(SEQIDNO:37)，該序列已經顯示出對有蛋白水解活性的PSA具有非常高的特異性(Denmeade等人(1997)Ca"cer57,4924-4930)。在小鼠體內模型中，已經顯示出HSSKLQ(SEQIDNO:37)只通過PSA剪切而不通過任何其它蛋白酶剪切(Denmeade等人(2003)JAto/.C，cw/m.95:990-1000)。肽的羧基末端處的半胱氨酸基團用於將肽附接於Au表面，依靠Au-硫醇反應以形成共價鍵。在肽的氨基末端，將拉曼活性分子例如生物素(圖1A)或羅丹明6G(R19)(圖IB)通過短的聚乙二醇或氨基戊酸接頭接枝。檢測方案如圖IB所示。人工肽的SERS光譜在通過PSA剪切後改變，並且具有生物素或R19標記的分子部分的特徵SERS峰由於在肽消化後標記分子從納米新月體表面的擴散位移進入溶液中而消失；因此，溶液中有蛋白水解活性的PSA的存在和濃度可以通過監測肽綴合納米新月體的SERS光譜進行探測。附接的肽的拉曼散射信號通過納米新月體放大。我們的數字模擬(圖IC)表明局部電場的振幅可以增強到接近於20dB(100倍)，特別在銳邊周圍。由於電場振幅和拉曼增強因子之間的四次方關係，肽拉曼信號可通過納米新月體放大108倍。圖5顯示實驗系統配置。將肽綴合納米新月體和PSA分子在密閉的透明微室中培養。該微室安置在具有用於納米顆粒可視化的暗場照明的倒置拉曼顯微鏡上的37。C的熱板上。插入圖顯示聚焦在單個納米新月體上的~340.8mW的激發雷射斑。具有生物素和R19拉曼標記分子的肽綴合納米新月體的典型SERS光譜分別如圖6A和圖6B所示。通過對比肽消化實驗前和實驗2小時後的SERS光譜，來自聚苯乙烯芯的拉曼峰(例如1003cm")保持恆定，其起到內部對照物的作用。一些拉曼峰來自在消化之後保留在納米新月體表面上的部分胺基酸鏈，並且它們仍出現在光譜中，但峰位置已輕微變化並且峰強度降低，這是由於肽剪切時可能的構象變化。來自拉曼標記分子的那些峰，例如圖6A中來自生物素的525cm"處的峰和圖6B來自R19的1183cm"處的峰，在完成消化反應之後幾乎完全消失(圖6A和B)。消化反應動力學可以通過實時分辨的SERS光譜採集進行監測。由於在綴合反應中對於各納米新月體平均使用~100個肽，來自標記分子的特徵拉曼峰的消失不是驟然的。由於大部分增強場集中在佔納米新月體總面積的~1/6的頂端區域周圍，即使假設綴合效率為100%,在該高的增強區域中貢獻於拉曼散射信號的實際分子數量小於20(圖1C)。如圖6A中時滯SERS光譜所示，通過在525cm"處的生物素峰的消失所監測的各納米新月體上肽的消化，在420nM的PSA濃度下花費~30分鐘。對於具有作為拉曼標記分子的R19的肽，在420nM的PSA進行消化之後也可觀察到1183cm-1處R19峰的消失(圖6B)。為了特異性地抑制綴合肽的PSA介導的蛋白水解，在加入420nMPSA之前引入蛋白酶抑制劑。我們還使用其它絲氨酸蛋白酶例如粒酶B(其在這裡起到陰性對照物的作用)測試綴合肽對PSA的特異性。圖7C和7D顯示了具有R19標記分子的納米新月體在上述兩組分別用PSA抑制劑和絲氨酸蛋白酶粒酶B的對照實驗中的時滯SERS光譜，其中粒酶B具有與PSA的正交底物特異性。在相同的實驗條件下，加入抑制劑之後通過PSA進行的肽消化被抑制了超過90%。在用420nM粒酶B進行的肽消化的對照實驗中，反應速率沒有顯示出與抑制劑處理反應在統計上的顯著差異。還預期粒酶B無法剪切肽，因為PSA已經顯示是對於HSSKLQ(SEQIDN0:1)序列來說在體內唯一的蛋白酶(Denmeade等人(2003)J!A^/.Owcer/wW.95:990-1000)。消化速率與PSA濃度有關，並且我們觀察了在30分鐘內對於lnM濃度的(生物素信號強度降低~50%,未顯示數據)PSA的活性。由於每個納米新月體最多附接IOO個肽分子，可能沒有完全利用具有最高SERS信號的納米35新月體表面，並且僅有小的百分比的肽附接於在電磁場中提供最大增強的區域(圖1C)。圖8A顯示對於OM(緩衝溶液)、4.2nM、42nM和420nM的PSA濃度，作為PSA消化時間函數的525cm"處生物素拉曼峰的強度。圖8B分別顯示與420nMPSA、具有抑制劑的420nMPSA、和420nM粒酶B的消化反應中1183cm"處R19拉曼峰的時滯強度。所有的峰強度值歸一化到1003cm"處的內部對照物峰和525或1183cm"處的初始峰強度。結果表明肽有效地和特異性地通過PSA剪切，因此該肽綴合納米新月體可以用作特異篩選查工具以提供癌症生物標誌物PSA的濃度和蛋白水解活性的信息。總而言之，我們已經展示了使用具有至少納摩靈敏度的單個肽綴合納米新月體SERS探針進行蛋白水解活性PSA的體外檢測。由於我們使用高度聚焦的雷射束作為我們的激發源，檢測體積僅為約10飛升。納摩樣品的實際PSA分子數目接近於單分子水平。與其它癌症生物標誌物檢測測定相比，我們的生物綴合納米新月體允許以飛升體積檢測中蛋白水解活性PSA分子的納摩濃度，這對於單個癌細胞水平的癌症篩查是關鍵的。小體積的要求和靈敏度水平使其可檢測用於轉移的指示的捕獲的循環前列腺癌細胞中PSA活性，而這對於常規技術是不可行的。在精液中，PSA濃度為10-150pM，其中大約三分之二的PSA有酶活性(Malm等人(2000)45:132-139)。用納米新月體PSA探針(納摩範圍)實現的靈敏度水平足以進行基於精液的測定，因此這裡的納米新月體SERS平臺可以具有潛在的臨床應用。在當前階段設計中，PSA消化位點在穀氨酸(Q)和亮氨酸(L)殘基之間，並且非常接近Au表面，因此PSA肽可以受PSA酶的空間位阻並且不是最佳可接近的。我們預想到，在底物肽序列HSSKLQ(SEQIDNO:l)和半胱氨酸殘基之間合成額外的隔離體，我們可以改善PSA底物肽HSSKLQ(SEQIDN0:1)在表面上的存在，從而提高檢測靈敏度。實時反應監測不僅只測量蛋白質的存在，還提供PSA活性的關鍵信息。這裡成功利用了兩種不同拉曼標記分子，表明多重化肽綴合納米新月體以檢測兩種或多種癌症相關的蛋白酶的潛力。該芯可以由磁性材料製成以允許單獨納米顆粒進行空間編址(Liu等人(2005)爿dv.Mafer.17:2683-2688)。該納米新月體也可以通過雷射操作以在高的精確性下進行空間編址(Liu等人(2006)A^M^er5:27-32),由此其可作為高密度陣(具有亞微升體積)多重化。微米陣列或納米陣列形式中多種蛋白酶的額外空間多重化是可能的。而36且，磁的或雷射的可操作性允許在期望的位置進行生物傳感(Liu等人(2005)A/v.17:2683-2688)，這對於獲得細胞內原位測量是有利的。材料和方法PSA的製備PSA購自Ca舊iochem(SanDiego,CA)。固定在Au納米新月體上的底物肽的剪切在50mMTris-HCl、pH8.0、100mMNaCl和0.1mMEDTA的緩衝液中進行，並且該反應在37。C下實時監測。PSA抑制劑從CalBiochem獲得並根據製造商的說明加入反應溶液中，使得最終反應溶液含有5|iMAEBSF、4.2nM抑肽酶、200nM彈性酶抑制劑和10nM的GGACK。肽合成生物素-Ttds-HSSKLOLAAAC-NH2(1)〖SEOIDNO:36).將200mg(0.140mmol)的RinkAmideAM聚苯乙烯樹脂(負載0.69mmol/g)加入6mL的燒結注射器並用DMF(4mL)溶脹。除去芴基曱氧羰基(Fmoc)保護基團[用DMF(2mL)中20%的哌啶處理25分鐘]，並過濾該樹脂並用DMF洗滌(3x3mL)。為加載a-胺基酸殘基，該樹脂經受反覆循環的耦聯條件，隨後進行洗滌(3x3mL的DMF)和Fmoc去保護[用DMF(2mL)中20%的旅咬處理25分鐘]，並再次洗滌(3x3mL的DMF)。用於將a-胺基酸耦聯到該樹脂的條件如下在適當保護的酸[Fmoc-Cyl(Trt，三苯曱基)-OH(375mg)、Fmoc-Ala-OH(199mg)、Fmoc畫Leu-OH(226mg)、Fmoc-Gln(Trt)-OH(391mg)、Fmoc-Lys(Boc,叔丁氧羰基)-OH(300mg)、Fmoc-Ser(0+Bu)-OH(245mg)、或Fmoc-His(Trt)-OH(397mg)]的0.4M溶液(0.640mmol)中處理該樹脂，所述溶液已通過與DIC(100^L，0.640mmol)和HOBt(98mg，0.64mmol)在DMF(1.5mL)中一起溫浴10分鐘而預活化。每次耦聯允許進行4小時。在最終oc-胺基酸殘基的耦聯和去保護之後，通過使樹脂在Fmoc-Ttds-OH(303mg,0.560mmol)的0.4M溶液中進行處理來加入Ttds接頭，所述溶液已通過與DIC(88jiL,0.56mmol)和HOBt(86mg，0.56mmol)在DMF(1.2mL)中一起培養10分鐘而預活化。該耦聯允許進行過夜。該樹脂用DMF(3x3mL)洗滌，除去Fmoc保護基團，並且再次用DMF(3x3mL)洗滌該樹脂。通過將生物素(137mg，0.560mmol)、PyBOP(281mg，0.540mmol)、和/-Pr2NEt(94|_iL，0.54mmol)在無水DMF(1.5mL)中的漿料加入到該樹脂而引入生物素基團。在過夜攪拌該樹脂之後，該樹脂用DMF(lx4mL)中的20%哌啶、DMF(3x4mL)、THF(3x4mL)、MeOH(3x4mL)、THF(3x4mL)、和CH2C12(3x4mL)充分地洗滌。通過用94:2:2:2的TFA/三異丙基矽烷/水/乙二硫醇(3mL)培養1小時底物從樹脂剪切，使用預備的C18反相HPLC(CH3CN/H2O-0.1%TFA，5-60%進行50分鐘，8mL/min，210/220/254nm檢測100分鐘，tR=31.8分鐘)純化，並凍幹。純度通過HPLC-MS分析(CH3CN/H2O-0.1%TFA，5-95%進行14分鐘，0.4mL/min,220nm檢測22分鐘，tR-6.5分鐘)來檢查。MS(ESI),對於(:711112^1902282來說計算的w/z:1655.8。實測丫直m/z828.2(M+2H)2+。R19-Ava-HSSKLOLAAAC-NH2(2)(SEOIDNO:36).將40lmg(0.277mmol)的RinkAmideAM聚苯乙烯樹脂(負載0.69mmol/g)加入12mL的燒結注射器並用N-曱基吡咯烷S同(NMP)(4mL)溶脹。通過用1:2:2哌咬/NMP/CH2Cl2溶液(3mL)處理30分鐘而除去Fmoc保護基團，和過濾該樹脂並用NMP(3x3mL)和CH2C12(3x3mL)洗滌。為加載a-胺基酸殘基，該樹脂經受反覆循環的耦聯條件(方法A或方法B)，隨後進行洗滌(5x3mLNMP，5x3mLCH2Cl2),Fmoc去保護[用1:2:2哌咬/NMP/CH2Cl2溶液(3mL)處理30分鐘]，並用NMP(5x3mL)和CH2C12(5x3mL)再次洗滌。第一種ot-胺基酸殘基通過將預先形成的Fmoc陽Cys(Trt)-OH(117g,2.00mmo1)、PyBOP(1.04g，2.00mmo1)、和HOBt(270mg,2.00mmo1)在1:1的NMP/CH2Cl2(2mL)t的溶液加入到該樹脂上而加載，並將所得漿料在機械腕搖擺器(wrist-actionshaker)上攪拌5分鐘，隨後加入/-Pr2EtN(0.55mL，4.0mmol)。該反應允許進行5小時。然後將該樹脂過濾、洗滌(5x3mLNMP，5x3mLCH2C12)、並在高真空下乾燥。確定Cys的加載為0,60mmol/g(78%的產率)。連續的耦聯通過方法A或方法B實現。方法A由以下步驟組成加入預先形成的Fmoc-保護的胺基酸[Fmoc-Cyl(Trt)-OH(U7g,2.00mmol)、Fmoc-Ala-OH(622mg，2.00mmo1)、Fmoc-Leu-OH(707mg,2.00mmo1)、Fmoc-Gln(Trt)-OH(1.22g,2.00mmol)、Fmoc-Ser(>Bu)-OH(767mg，2.00mmol)、和Fmoc畫His(Trt)-OH(1.24g,2.00mmo1)]、PyBOP(1.04g，2.00mmo1)、和HOBt(270mg,2.00mmol)在NMP/CH2C12(1:1，2mL)中的溶液，隨後加入/-Pr2EtN(0.55mL，4.0mmol)。該反應允許進行至少4小時。方法B由下列步驟組成使該樹脂在適當保護的酸[Fmoc-Lys(Boc)-OH(375mg)]的0.4M溶液中處理，該溶液已通過與DIC(130|uL,0.84mmol)和HOBt(108mg，0.800mmol)在DMF(1.2mL)中一起溫浴10分鐘而預活化。耦聯允許進行4小時。在各次耦聯之後，過濾樹脂並洗滌(NMP:5x3mL,CH2C12:5x3mL)，隨後除去Fmoc保護基團。在最終ot-胺基酸殘基的耦聯和去保護之後，接頭通過使樹脂在Fmoc-S-Ava-OH(272mg，0.800mmol)的0.4M溶液中處理而加入氨基戊酸接頭，所述溶液已通過與DIC(120iaL，0.80mmol)和HOBt(108mg,0.800mmol)在NMP(lmL)中一起溫浴10分鐘而預活化。耦聯允許進行過夜。過濾該樹脂並洗滌(NMP:5x3mL,CH2C12:5x3mL)，除去Fmoc保護基團，且再次洗滌樹脂。羅丹明基團通過加入羅丹明19的0.4M溶液摻入，所述溶液已與DIC(130iliL，0.84mmol)和HOBt(108mg,0.800mmol)在NMP(2mL)中一起溫浴10分鐘而預活化。該反應允許進行6小時，再次重複耦聯步驟並該反應允許進行過夜。通過用TFA/三異丙基矽烷/H20/乙二硫醇的94:2:2:2的溶液(3mL)培養2小時而從樹脂剪切底物，使用預備的C18反相HPLC(CH3CN/H2O-0.1%TFA，5-95%進行50分鐘，20mL/min，220/254/280nm檢測100分鐘，tR=24.3min)純化，並凍幹。MS(MALDI),對於C78H116N19017S來說計算的m/z:1622.85。實測值w/z1623.90。SERS光鐠使用具有拉曼分光計的顯微系統從單個納米新月體採集拉曼散射光譜。該系統由CarlZeissAxiovert200倒置顯微鏡(CarlZeiss,德國)組成，該顯微鏡配置有數位照相機和具有1024x265像素的致冷攝譜CCD照相機(RoperScientific,NJ)的300mm焦距的單色儀(ActonResearch,MA)。我們的實驗中使用785nm半導體雷射器作為拉曼散射的激發源，並且雷射束通過40X物鏡聚焦在納米新月體上。激發功率通過光度計(Newport,CA)測量為-0.8mW。然後，拉曼散射光通過穿過長通濾光片的相同光路聚集並通過分光計分析。應理解，本文描述的實施例和實施方式僅用於展示性目的，並且根據它們的各種調整和改變將啟示本領域技術人員並包括在本申請的精神和範圍內以及所附權利要求的範圍內。為了各種目的，將本文引用的所有出版物、專利、和專利申請的全部內容通過引用納入本申請，並且各文件也是通過引用以相同的程度特定地和單獨地納入。39權利要求1.一種用於檢測活性蛋白酶的指示物，所述指示物包括附接於肽的納米新月體，其中所述肽包括所述蛋白酶的識別位點。2.權利要求1的指示物，其中所示指示物進一步包括附接於所述肽的拉曼標籤。3.權利要求2的指示物，其中所述拉曼標籤選自螢光團、生色團、量子點、焚光微球、和生物素。4.權利要求2的指示物，其中所述拉曼標籤包括羅丹明、螢光素、或外源化學分子。5.權利要求2的指示物，其中所述拉曼標籤包括選自下列的部分TRIT(四曱基羅丹明異硫醇)、NBC(7-硝基苯-2-氧雜-l,3-二唑)、德克薩斯紅染料、鄰苯二曱酸、對苯二曱酸、間苯二曱酸、曱苯基堅牢紫、甲苯基藍紫、亮曱苯基藍、對氨基苯曱酸、赤蘚紅、生物素、洋地黃毒苷、5-羧基-4，,5，-二氯-2，,7，-二曱氧基螢光素、5-羧基-2，，4，,5，,7，-四氯螢光素、5-羧基螢光素、5-羧基羅丹明、6-羧基羅丹明、6-羧基四曱基氨基酞菁、6-羧基-X-羅丹明、曱亞胺、花青、黃噪呤、琥珀醯螢光素、氨基吖啶、和氰化物(CN)、硫醇(SH)、氯(C1)、溴(Br)、曱基、磷(P)、硫(S)、SN、Al、Cd、Eu、和Te。6.權利要求2的指示物，其中所述拉曼標籤直接附接於所述肽。7.權利要求2的指示物，其中所述拉曼標籤通過接頭附接於所述肽。8.權利要求1-7中任一項的指示物，其中所述納米新月體包括殼而沒有芯。9.權利要求1-7中任一項的指示物，其中所述納米新月體包括芯和殼。10.權利要求9的指示物，其中所述芯包括提供恆定拉曼光譜的材料。11.權利要求10的指示物，其中所述芯包括選自下列的材料塑料、二氧化矽或其它in族、IV族、或V族材料、右旋糖苷、和磁性材料。12.權利要求ll的指示物，其中所述芯包括聚苯乙烯。13.權利要求9的指示物，其中所述納米新月體包括選自下列的金屬Ga、Au、Ag、Cu、Al、Ta、Ti、Ru、Ir、Pt、Pd、Os、Mn、Hf、Zr、V、Nb、La、Y、Gd、Sr、Ba、Cs、Cr、Co、Ni、Zn、Ga、In、Cd、Rh、Re、W、Mo，和它們的氧化物、合金、混合物、和/或氮化物。14.權利要求9的指示物，其中所述納米新月體具有約20-約800nm的外徑。15.權利要求9的指示物，其中所述納米新月體具有約10nm-約500nm的內徑。16.權利要求9的指示物，其中所述納米新月體通過內徑r、和外徑R、以及所述內徑r和所述外徑R限定的所述圓的圓心之間的圓心到圓心的距離來表徵，其中r為約10nm到約500nm;R為約20nm到約800nm;且d為約5nm到約300nm。17.權利要求9的指示物，其中所述納米新月體通過內徑r、和外徑R、以及所述內徑r和所述外徑R限定的所述圓的圓心之間的圓心到圓心的距離來表徵，其中r為約25nm到約500nm;R為約20nm到約800nm;且d為約5nm到約200nm。18.權利要求9的指示物，其中所述肽包括蛋白酶的識別位點，所述蛋白酶選自絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、和穀氨酸蛋白酶。19.權利要求9的指示物，其中所述肽包括細胞凋亡路途徑中蛋白酶的識別位點。20.權利要求19的指示物，其中所述肽包括胱天蛋白酶的識別位點。21.權利要求19的指示物，其中所述肽包括胱天蛋白酶的識別位點，所述胱天蛋白酶選自胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-6、和胱天蛋白酶-7。22.權利要求18的指示物，其中所述肽包括凝血酶的識別位點。23.權利要求18的指示物，其中所述肽包括絲氨酸蛋白酶的識別位點。24.權利要求23的指示物，其中所述肽包括PSA識別位點。25.權利要求23的指示物，其中所述肽包括包含胺基酸序列HSSKLQ(SEQIDN0:1)的識別位點。26.權利要求9的指示物，其中所述肽的長度為2個胺基酸到30個胺基酸。27.權利要求26的指示物，其中所述肽的長度為2個胺基酸到10個氨28.權利要求9的指示物，其中所述肽直接地附接於所述納米新月體。29.權利要求9的指示物，其中所述肽通過接頭附接於所述納米新月體。30.權利要求9的指示物，其中所述肽通過硫醇基團附接於所述納米新月體。31.權利要求2的指示物，其中兩種不同的肽附接於所述納米新月體。32.權利要求2的指示物，其中多於兩種的不同的肽附接於所述納米新月體。33.權利要求l的部分，其中所述指示物是拉曼活性底物的組分。34.—種檢測或量化樣品中至少一種蛋白酶的存在、量、或活性的方法，所述方法包括使所述樣品與包括附接於肽的納米新月體的指示物接觸，其中所述肽包括所述蛋白酶的識別位點；和監測檢測的表面拉曼散射光譜的光譜特徵中的差別，所述差別是存在於該樣品中的蛋白酶的存在、量或活性的指示物。35.權利要求34的方法，其中所述指示物進一步包括附接於所述肽的拉曼標籤。36.權利要求34或35中任一項的方法，其中所述監測包括監測表面增強拉曼散射(SERS)。37.權利要求34或35中任一項的方法，其中所述樣品包括選自下列樣品的材料，所述下列樣品選自全血、血漿、血清、滑液、腦脊液、支氣管灌洗液、腹水液、精液、骨髓抽出物、胸膜流出物、尿、和腫瘤細胞或組織。38.權利要求34或35中任一項的方法，其中所述肽包括蛋白酶的識別位點，所述蛋白酶是癌症存在或發展的標誌物。39.權利要求38的方法，其中所述肽包括PSA的識別位點。40.權利要求38的方法，其中所述肽包括包含胺基酸序列HSSKLQ(SEQIDNO:l)的識別位點。41.權利要求34的方法，其中所述樣品包括選自下列的材料全血、血級分、淋巴、腦脊液、口腔液、粘液、尿、糞便、和精液。42.用於檢測兩種或更多種活性蛋白酶的存在或活性的庫，所述庫包括多種蛋白酶指示物，所述指示物包括附接於肽的納米新月體，其中所述肽包括所述蛋白酶的識別位點；其中不同的納米新月體附接於不同的肽使不同的納米新月體檢測不同的蛋白酶。43.權利要求42的庫，其中所述庫進行空間編址使得對不同蛋白酶有特異性的蛋白酶指示物定位於底物上的不同位置。44.權利要求42的庫，其中所述庫進行光學編址使得對不同蛋白酶有特異性的蛋白酶指示物產生不同的信號。45.權利要求42或43中任一項的庫，其中所述庫包括至少3種或更多種不同的蛋白酶指示物。46.權利要求42或43中任一項的庫，其中所述庫包括至少IO種或更多不同的蛋白酶指示物。47.權利要求42或43中任一項的庫，其中所述納米新月體包括磁性芯，並且指示物的空間隔離通過-茲場提供。48.權利要求42或43中任一項的庫，其中所述指示物以離子方式或化學方式耦聯到底物。49.權利要求42或43中任一項的庫，其中所述指示物吸附到底物上。50.用於檢測活性蛋白酶的試劑盒，所述指示物包括含有附接於肽的納米新月體的容器，其中所述肽包括所述蛋白酶的識別位點。51.權利要求50的試劑盒，其中所述試劑盒進一步包括附接於所述肽的拉曼標籤。52.權利要求50的試劑盒，其中所述試劑盒進一步包括說明材料，所述說明材料教導所述指示物用於利用表面增強拉曼散射(SERS)檢測活性蛋白酶的存在、濃度或活性的用途。53.用於檢測核酸酶的指示物，所述指示物包括附接於單鏈或雙鏈寡核香酸的納米新月體，其中所述寡核香酸包括所述核酸酶的識別位點。54.權利要求1的指示物，其中所述指示物進一步包括附接於所述寡核苷酸的拉曼標籤。55.—種用於檢測分析物的存在或量的方法，所述方法包括使包含所述分析物的樣品與指示物接觸，所述指示物包括附接於底物的納米新月體，所述底物在拉曼標記的部分的存在下特異性地或優先地被所述分析物結合，所述拉曼標記的部分與所述分析物為結合到所述底物而竟爭；和檢測所述指示物的拉曼光譜，其中通過所述拉曼標記的部分從所述底物的解離而產生的拉曼光譜的變化提供所述樣品中所述分析物的存在或量的測量。56.權利要求55的方法，其中所述底物是肽或核酸。全文摘要本發明涉及使用單個的肽綴合納米新月體表面增強拉曼散射(SERS)探針以至少納摩的靈敏度進行蛋白酶的體外檢測。所述探針能夠以極小的體積和低濃度下檢測蛋白水解活性。在某些實施方式中，所述探針包括用於檢測活性蛋白酶的指示物，其中所述指示物包括附接於肽的納米新月體，其中所述肽包括蛋白酶的識別位點和附接於所述肽的拉曼標記。文檔編號A01N37/18GK101484002SQ200780024900公開日2009年7月15日申請日期2007年5月2日優先權日2006年5月3日發明者喬納森·A·埃爾曼,剛劉,盧克·P·李,陳帆青申請人:加利福尼亞大學董事會