細胞毒t淋巴細胞應答的誘導的製作方法

2024-01-27 09:47:15 3

專利名稱：細胞毒t淋巴細胞應答的誘導的製作方法
背景技術：
本申請引入Syamal Raychaudhuri和William H.Rastetter的未決的美國序列08/919,787號(1992年7月24日提交)和美國序列07/735,069號(1991年7月25日提交)的全部內容(現在已放棄)作為參考，其題目均為「細胞毒T淋巴細胞應答的誘導」。本發明涉及在人、家養動物或農業動物中誘導細胞毒T細胞介導的應答的方法和組合物。
據信在對各種病毒感染和腫瘤或癌症生長應答的過程中，細胞毒T淋巴細胞(CTL)是宿主主要的防禦機制。這些細胞是通過識別與被感染或轉化的細胞上不同分子(稱作MHC I類分子)相關的抗原片段而清除掉被感染或轉化的細胞。利用特定細胞中載有某種可溶性抗原的細胞質可對CTL進行實驗性誘導。通常單獨應用可溶性抗原不足以誘導特異性的細胞毒T淋巴細胞。
一種可以誘導CTL應答的方法包括重組工程技術的應用，以把上述抗原的關鍵組分摻入到良性感染劑的基因組中。這一策略的目的是通過使宿主產生適度的、自限性感染而對所需的表位產生抗原特異性的細胞毒T淋巴細胞。可應用牛痘、脊髓灰質炎病毒、腺病毒和逆轉錄病毒以及細菌(如利斯特菌和BCG)作嵌合載體。例如，Takahashi等在美國國家科學院院刊85，3105，1988中指出用表達HIV gp160被膜基因的重組牛痘作為誘導細胞毒T淋巴細胞的有力手段。
可誘導細胞介導的應答的第二種方法涉及佐劑的應用。儘管本領域對佐劑的應用進行了充分的討論，但對應用佐劑是否誘導細胞介導的免疫及這種細胞介導的免疫是否包括細胞毒T淋巴細胞應答還不清楚。下面列出了本領域內的幾種代表性出版物。
Stover等在自然351，4561991(不作為本申請的現有技術)描述了用含有β-半乳糖苷酶基因的重組BCG誘導對β-半乳糖苷酶的CTL應答。用不完全弗氏佐劑和β-半乳糖苷酶不能誘導這種應答。
Mitchell等在臨床腫瘤學雜誌8,856，1990(不作為本申請的現有技術)描述了六周內五次施用一種叫做「DETOX」的佐劑和同種黑色素瘤裂解物治療轉移了的黑色素瘤患者，發現少量患者的細胞毒T淋巴細胞增加。作者指出需要提高細胞毒T淋巴細胞的生產水平，並且建議用佐劑和IL-2聯合治療並用環磷醯胺進行預處理以減少可能存在的腫瘤特異性T抑制細胞的水平。DETOX包括來源於明尼蘇沙門氏菌的減毒內毒素(單磷醯脂A)、草分枝桿菌的細胞壁骨架、角鯊烯油和乳化劑。
Allison和Gregoriadix在Immunology Today 11，427，1990(不作為本發明的現有技術)指出人類疫苗中「容許使用」的唯一佐劑是鋁鹽(礬)，它並不持續引發細胞介導的免疫。Allison和Gregoriadis指出「因此，需要開發一種佐劑，這種佐劑具有弗氏完全佐劑的效力但沒有它的各種副作用，如肉芽腫」。它們繼續指出，存在三種可能的方案，例如利用脂質體；利用被稱作免疫刺激複合物(ISCMs，包括皂角苷或Quil A(有兩個糖鏈的三萜類化合物)、膽固醇和磷脂醯膽鹼)的佐劑，這些佐劑被容許用於馬的流感疫苗(Morein等，ImmunologicalAdjuvants and Vaccines，Plenum Press，153)；利用角鯊烯或角鯊烷(有或無Pluronic劑)和胞壁醯二肽(MDP)乳劑(SAF)。儘管「長期以來認為抗原亞單位不能引發細胞毒T淋巴細胞(CTL)應答，但據說SAP可引發細胞免疫」。
Takahashi等在自然344，8731990中描述了用ISCOM對小鼠進行單次皮下免疫可誘導MHC II限制的輔助性T淋巴細胞和細胞毒性T淋巴細胞產生。他們指出弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑和磷酸鹽緩衝液對他們所感興趣的靶物不誘導細胞毒T淋巴細胞活性。與其它外源性可溶蛋白抗原的結果相反，用利用了ISCOM的完整外源性蛋白進行免疫，可以激發抗原特異性MHC I限制的CD8+CD4-CTL。他們也指出所描述的實驗表明了用含HIV蛋白的ISCOM可誘導人類的CTL，基於ISCOM的疫苗可通過純化蛋白達到既誘導CTL又誘導抗體產生這一長期尋求的目標。
Byars和Allison在疫苗5223，1987中描述了SAF-1的應用，包括吐溫80、PLURONIC L121和角鯊烯或角鯊烷，帶有或不帶有胞壁醯二肽，他們的數據顯示有胞壁醯二肽的製劑可用於人用和獸用疫苗。佐劑的加強注射(booster shot)中沒有胞壁醯二肽。據說胞壁醯二肽可明顯增強抗體的產生，所以佐劑中沒有它。通過皮膚試驗以遲髮型超敏反應測量細胞介導的免疫，以確定輔助性T細胞的產生。當佐劑中存在胞壁醯二肽時，這種超敏反應變得更強烈更持久。Allison等也用了同樣的佐劑，美國專利4770874(其中指出胞壁醯二肽和普盧龍尼克多聚醇是對白蛋白產生強大細胞免疫應答和體液免疫應答的本質)；Allison等，美國專利4772466；Murphy-Corb等科學2461293，1989(其中指出佐劑和胞壁醯二肽合用可同時增強免疫應答中的細胞免疫和體液免疫)；Allison和Byars等疫苗8756，1987(其中指出由SAF(包含有胞壁醯二肽)誘導的細胞免疫可通過這些顯示遲發超敏，T細胞對抗原的增殖反應，IL-2的產生，載有免疫抗原的靶細胞的特異性遺傳學限制性裂解)；Allison和Byars，傳染性疾病的免疫藥理學非特異性限制的疫苗佐劑和調節劑191-201，1987；Morgan等，醫學病毒學雜誌2974，1989；Kenney等，免疫學雜誌121157，1989、Allison和Byars，免疫學方法95157，1986(其中顯示鋁鹽和礦物油乳劑可增強抗體產生而不增強細胞免疫；胞壁醯二肽製劑誘導細胞免疫)；Byars等，疫苗8 49，1990(不作為本發明的現有技術，其中指出他們的佐劑可明顯增強對流感血膠精抗原的體液應答，低程度地增強細胞介導的反應)；AllisoH和Byars，分子免疫28279，1991(不作為本發明的現有技術，其中指出胞壁醯二肽的功能是誘導細胞因子的表達和增強主要組織相容性(MHC)基因的表達；與其它的佐劑相比，可獲得較好的抗體和細胞應答，希望確定同樣的方案是否對人有效)；Allison和Byars，疫苗研製中的先進技術401，1988(其中描述用SAF介導細胞免疫)；Epstein等，新藥評論(Advame drug deliveryReviews)4223，1990(其中對疫苗製備中應用的不同佐劑進行了評述)；Allison和Byars，免疫學方法雜誌95157，1986(其中指出佐劑中加入胞壁醯二肽可顯著增強對不同抗原產生的細胞免疫應答，抗原包括單克隆免疫球蛋白和病毒抗原)；Morgan等，醫學病毒學雜誌2974，1989(其中描述了用SAF-1為Epstein-Barr病毒製備疫苗)。
Kawk等，生物學和醫學中的個體型網絡，Elsevier科學出版社，p163，1990(不作為本發明的現有技術)指出，用不含胞壁醯二肽的SAF作為人類B細胞淋巴瘤基因型的佐劑，特別地，普盧龍尼克L121、角鯊烷和含0.4％吐溫80的磷酸鹽緩衝液的乳化劑與個體型一起應用。他們指出「佐劑的加入應進一步增強…體液應答，用樣也利於誘導細胞應答」。
其它的免疫製劑包含脂質體(Allison等，美國專利4053585和4117113)；環肽(Dressman等，美國專利4778784)；完全弗氏佐劑(Asherson等，免疫學22465，1972；Berman等，國際癌症雜誌2539，1967；Allison，免疫增強1873，1973；Allison影響宿主抗性的非特異性因素247，1973)；ISCOM(Letvin等，疫苗87209，1987)；含有礦物油，表面活性劑和吐溫80形成的非離子嵌段聚合物的佐劑(Hunter和Bennett，免疫學雜誌1333167，1984；Hunter等，免疫學雜誌1271244，1981)；由礦物油和乳化劑組成的佐劑，含有或不含有滅活的分支桿菌(Sanchez-Pescador等，免疫學雜誌1411720，1988)；及其它的佐劑，如胞壁醯二肽的親脂性衍生物，與重組蛋白質共價結合的胞壁醯二肽(同前)。
發明概述申請人發現了一種安全、便利的方法和組合物，這種方法和組合物可在人和家養動物或重要的農業動物中誘導CTL應答。該方法應用了對動物毒性小或無毒、缺乏免疫刺激性肽(如胞壁醯二肽)的抗原製劑，免疫刺激性肽的存在會降低所希望的細胞應答。此外，方法學應用簡便，不需要利用DNA重組技術對細胞進行改變使之更具抗原性這樣大量的體內工作。因為末料到象這樣不含免疫刺激性肽或其類似物的抗原製劑可誘導CTL應答，所以該發現是令人驚訝的。申請人發現這種抗原製劑所應用的疾病狀態很廣泛或可用作預防劑。例如，這種抗原製劑可用於治療象HIV感染或流感這樣的病毒性疾病，其中CTL應答非常重要；也可擴展應用於細菌性感染、癌症、寄生蟲感染等的治療。作為預防劑，該抗原製劑和合適的抗原聯合可用於預防引起上述病毒性疾病病毒的感染，尤其是HIV感染，也可用於象原發腫瘤切除後這樣易患腫瘤者的預防。
因此，本發明首先涉及一種誘導人、家養動物(例如貓和狗)或重要的農業動物(例如馬、牛或豬)對除B細胞淋巴瘤抗原或卵白蛋白之外的抗原產生CTL應答的方法。該方法包括的步驟是提供CTL應答所需的抗原，提供一種非毒性的抗原製劑，這種製劑包含穩定化去汙劑、膠束形成劑和生物可降解和可相容的油，或由它們所組成或基本上由它們所組成。該抗原製劑優選缺少任何免疫刺激性肽或含有肽的部分水平足夠低，從而不降低所需的細胞應答。這種製劑優選的是穩定的水包油乳化劑。也就是說，選擇每一不同的組分使乳劑保持在乳化狀態而沒有相分離的時間至少是一個月，優選超過一年。該方法中抗原和抗原製劑混合形成混合物(優選微流體化的)，以足以在動物體內誘導CTL應答的量施用給動物，只需施用1次。
「穩定化去汙劑」是指可使乳劑保持在穩定狀態的去汙劑。這種去汙劑包括多山梨醇酯(polysorbate)80(吐溫)(山梨聚糖-單-9-十八烷酸-聚(氧-1，2-乙二基)；ICI Americas製造，WilmingtonDE)，吐溫40、吐溫20、吐溫60，兩性洗滌劑(Zwittergent)3-12，替波爾HB7，Span 85。這些去汙劑通常的用量是約(0.05％～0.5％，優選0.2％。
「膠束形成劑」是指可使與其它組分形成的乳劑穩定，從而形成一種膠束結構的藥劑。這種藥劑優選在注射部位能引起刺激以聚集增強細胞應答的巨噬細胞。該種藥劑的例子包括BASF Wyandotte出版物中描述的聚合表面活性劑，例如Schmolka，J.Am.Oil.Chem.Soc.54110，1977和Hunter等，免疫學雜誌1291244，1981，在此引入作為參考，普盧龍尼克(PLURONIC)L62LF、普盧龍尼克L101、普盧龍尼克L64、聚乙二醇1000和季酮(TETRONIC)1501、季酮150R1、季酮701、季酮901、季酮1301、季酮130R1。本領域中已熟知這些藥劑的化學結構。正象Hunter和Bennett指出的，優選親水-親油(HLB)平衡值為0-2的藥劑，免疫學雜誌1333167，1984。藥劑的量優選在0.5％-10％，最優選的量為1.25-5％。
所選用的油用於保持水包油乳劑中的抗原，即為所需的抗原提供一種賦形劑，並且優選熔點低於65℃的，這樣無論在室溫(大約20℃-25℃)還是在低於室溫的情況下都能形成乳劑。這樣的油包括角鯊烯、角鯊烷、二十烷(EICOSANE)、四四十烷(tetratetracontans)、甘油、花生油和其它的植物油。油的量優選在1-10％，最優選2.5-5％。油的生物可降解性和生物相容性非常重要，這樣在一段時間內機體可把油降解，從而確保不引起象肉芽腫這樣的副作用。
上述製劑重要的一點是不含有肽組分尤其是不含胞壁醯二肽(MDP)。如果對每個人施用的普通製劑中所含的量超過20μg，這樣的肽就會干擾CTL應答的誘導。儘管它們對免疫系統中體液部分有明顯的刺激作用，但仍然優選這些肽在抗原製劑中完全缺如。也就是說，申請人發現儘管這些肽可提高體液應答，但是當需要細胞毒T淋巴細胞應答時它們是不利的。
其它相關的方面是，這種抗原製劑僅由上述三組分中的兩個組成，與任何一種卵白蛋白(或其它白蛋白，如HSA、BSA和卵清蛋白)外的所需抗原(包括蛋白質、多肽和它們的具有免疫原性的片段)一起應用可在動物和人中誘導CTL應答。
申請人確信上述製劑用於人時比先前的製劑(包括ISCOM、DEToX和SAF)有明顯的優勢。與其它製劑不同，該製劑既含有膠束形成劑又不含有肽，細胞壁骨架或細菌的細胞組分。該製劑可誘導先前製劑所不能誘導的CTL應答或與它們相比誘導的強度明顯增強。
「非毒性」指在動物和人的治療中發現該抗原製劑無毒或毒性很小。本領域的技術人員將會發現這一術語的意義很廣泛，例如，對於基本健康的動物或人只能耐受輕微的毒性，而對於患有免疫性疾病的人則基本上能耐受較大的毒性。
優選的實施方案是，抗原製劑基本上由去汙劑、藥劑和油中的兩或三種組成；方法基本上由混合物(抗原和抗原製劑)對人或動物施用一次構成；人或動物被病毒感染和患有病毒感染引起的一種或多種症狀(通常由相關領域的醫生確診)；抗原製劑對人或動物無毒。
其它優選的實施方案是，抗原選自下列抗原的抗原性部分HIV抗原gp160、gag、pol、Nef、Tat和Rev；瘧疾抗原CS蛋白和子孢子表面蛋白2；B型肝炎表面抗原Pre-S1、Pre-S2、HBc抗原和HBe抗原；流感抗原HA、NP和NA；A型肝炎表面抗原；皰疹病毒抗原EBV gp340、EBV gp85、HSV gB、HSV gD、HSV gH、HSV早期蛋白產物，人類乳頭瘤病毒抗原(例如，HPV抗原，如L1、E4、E6、E7抗原，尤其是從HPV16和18來源的E6和E7，它們是與宮頸癌相關的兩種最普通型HPV，從HPV6和11來源的E4和L1它們是與尖銳溼疣相關的兩種最普通型HPV；前列腺特異性抗原(PSA)，巨細胞病毒gB，巨細胞病毒gH和IE蛋白gp72；呼吸道合胞病毒；F蛋白、G蛋白和N蛋白；腫瘤抗原癌CEA、癌相關粘蛋白、癌P21、P53、黑色素瘤MPG、黑色素瘤p97和癌Neu癌基因產物、癌p53基因產物和叫做MAGE的黑色素瘤抗原及在不同的惡性腫瘤中存在的突變p21 ras蛋白。
在相關的方面，本發明涉及一種組合物，該組合物包括與上述抗原製劑混合的一種抗原，或由其或基本上由其組成，該抗原選自上面列出的抗原性部分。
在其它相關的方面，本發明涉及了一種通過施用組合物治療患者的方法，該組合物中含有與上述抗原製劑混合的合適抗原(例如選自上面列出的抗原)，患者被HIV病毒感染、患有瘧疾、流感、肝炎、癌症、被皰疹病毒感染、患有宮頸癌、尖銳溼疣(生殖器的疣)或感染了呼吸道合胞病毒。這些抗原和治療方法僅僅是在抗原製劑中可應用抗原的一些示例。
本發明的其它特徵和優點將在下面的優選實施方案和權利要求中進一步說明。
優選實施方案的描述首先對附圖進行簡要描述。
附1A-1C和4A-4C是對不同卵白蛋白製劑誘導CTL應答時進行比較的數據圖；在所有的圖中E∶T代表效靶比例。
圖2A和2B是對不同β-半乳糖苷酶製劑誘導CTI應答進行比較的數據圖；圖3是對脂質體中卵白蛋白和抗原製劑中卵白蛋白誘導CTL應答時進行比較的數據圖；圖5和6是觀察CD4、CD8細胞耗竭對誘導CTL應答的影響時的數據圖；圖7是gp120誘導CTL時的數據圖；圖8中抗原和吐溫、普盧龍尼克混合誘導CTL時的數據圖；圖9是抗原和角鯊烷、普盧龍尼克混合誘導CTL時的數據圖；

圖10是抗原和角鯊烷、普盧龍尼克混合誘導CTL時的數據圖；圖11表現了卵白蛋白和不同抗原製劑對CTL應答的影響；圖12是用不同的抗原製劑在猴子中誘導抗-gp120 IIIb抗體的圖；圖13表現了用佐劑中可溶性E7蛋白免疫一次後，第10天後對HOPE2細胞的抗腫瘤活性；
圖14表現了用佐劑中可溶性E7蛋白免疫2次後，第10天和第19天對HOPE 2細胞的抗腫瘤活性。
抗原製劑該發明中應用的抗原製劑已由前述。該領域中的普通人員將會認識到很易製備同樣的製劑，也可預料到在誘導CTL應答時具有同等的特性，應用下面例子中講述的相同技術很容易對這些製劑的特性進行檢測。
本發明的下列例子中應用的抗原製劑(AF)包括大約2.5％的角鯊烷，5％的環氧乙烷酸和吐溫80，它們用磷酸鹽緩衝液配製。特別地，AF乳化劑包括每1mL pH7.4的水中含15mg角鯊烷，37.5mgPoloxamer 401(普盧龍尼克L121)，6mg多山梨醇酯80(吐溫80)，0.184mg氯化鉀，0.552mg一代磷酸鉀，7.36mg氯化鈉，3.3mg二代磷酸鈉(脫水)。用常規的技術進行微流體化(微流體儀110F型)，背壓量為11-14,000psi，逐漸降到常壓，在冰浴中冷卻，包裹。
其它的例子中，抗原與微流體化的角鯊烷(S)，普盧龍尼克(P)和吐溫(T)的混合物混合，終濃度分別為吐溫80 0.2％，普盧龍尼克1.25％，角鯊烷5％。為了測定子組分在抗原特異性免疫應答誘導中的必要性，角鯊烷-吐溫80，普盧龍尼克-吐溫80或角鯊烷-普盧龍尼克以同樣的濃度配製。分別製備普盧龍尼克、角鯊烷或吐溫80以檢測單體組分在CTL應答中的作用。在卵白蛋白系統中用吐溫20、吐溫40或兩性去汙劑代替吐溫80，以檢測不同的吐溫衍生物在CTL誘導中的作用。同樣用Eicosore或Triacontone代替三組分製劑中的角鯊烷，用聚乙二醇1000，普盧龍尼克L62LF和Tetronics 1501和150R，代替複合環氧乙烷-環氧丙烷聚合物(普盧龍尼克)。作為兩個組分製劑不同的類似物進行多樣組合以測定其對ova特異性CTL的誘導。它們是膽固醇-吐溫80，角鯊烷-吐溫80，鯊肝油烷-吐溫80或橄欖油-吐溫80。為了進行穩定性研究，角鯊烷-吐溫80流體化的混合物與終濃度為5％的右旋糖混合。全過程中賦形劑在微流體儀中混合以形成穩定的乳劑。在一些實驗中，兩組分的製劑和不同濃度的MDP混合誘導CTL和體液應答。表1是對本研究中應用各種製劑的綜合概括。
表1三或兩組分系統中各種替代物的效果三組分製劑中的替代物在E∶T 100∶1下的殺傷率STP 84吐溫40(T) 66吐溫20(T) 48T1501(P)0T150R1(P) 0普盧龍尼克L62LF(P) 47二十烷(S) *聚乙二醇*Triacontane(S) *兩性去汙劑(T) *兩組分製劑中的替代物ST 76PT 45SP 26膽固醇+吐溫80 0角鯊烷+吐溫29(T)65鯊肝油烷+吐溫80 42橄欖油+吐溫80 69一組分製劑普盧龍尼克L121 0角鯊烷 0吐溫80 0角鯊烷+吐溫80+5％右旋糖 86*重複進行CTL分析Syntex佐劑製劑(微流體化；SAFm)作為佐劑對照，它包括兩部分。第一部分包括磷酸鹽緩衝液，其中含終濃度為5％的角鯊烷、1.25％的普盧龍尼克、0.2％的吐溫80(賦形劑或1-SAF)。第二部分包括一種分支桿菌的細胞壁成分N-2-醯胞壁醯-L蘇氨酸-D異亮氨酸胺。抗原和微流體化的賦形劑(第I部分)混合得到同源性的乳化劑以用於免疫。添加MDP配製成SAFm並進行簡單地旋渦攪拌。如果誘導CTL有最佳濃度的話，混合物中MDP的濃度依情況而定。作為佐劑對照，也要用按照廠家工藝與礬混合的可溶性抗原(Pierce Chemical，Rockford，IL)或用完全弗氏佐劑(CFA)對小鼠進行免疫。
這種抗原製劑用於誘導小鼠的細胞毒T淋巴細胞應答。本領域的普通技術人員將認識到，這種小鼠模型可表明在人、家養動物或農業動物中應用同等的實驗或治療也同樣能誘導細胞毒T淋巴細胞應答。誘導所需細胞應答時，抗原製劑的量和抗原的量可不經預實驗而由本領域一般技術人員所熟知的常規方法，憑經驗確定。因此如果希望這種混合物治療時副作用最小，技術人員就會確定出給人、家養動物或農業動物應用時能誘導細胞毒T淋巴細胞應答的最低水平，因此對所希望的抗原產生免疫力。通常情況下，混合物可用任何一種常規的方法注射應用，但特別優選在局部進行肌肉注射，這樣乳劑可在幾天或幾周內保持在穩定狀態。
方法若無其它注釋，下面列出的例子中應用以下材料和方法小鼠C57BL/6(H-2b)和BALB/c(H-2d)雌性小鼠，購於HarlenSpragne(San Diego，California)。
抗原卵白蛋白(ova，VII級，西格瑪(Sigma)化學試劑公司，St.Lonis，Mo)以天然狀態應用。β-半乳糖苷酶(β-gal，VIII級；BRL)在1M NaOH中煮2分鐘進行鹼消化後以天然狀態應用。重組gp120購自美國生物工程公司。
腫瘤細胞和轉染子應用的腫瘤細胞系是Ia-系EL4(C57BL/6，H-2b胸腺瘤)和P815(DBA/2，H-2d肥大細胞瘤)。先前Moore等於細胞54，7771988描述了ova-表達EL4轉染子的衍生物EG7-ova。β-gal表達轉染子P13.1是107P815細胞與10mgPst I線性化了的PCH 110(PharmaciaLKB生物工程技術公司，Piscataway，NJ)和1mgPvu I線性化了的PSV2neo(Southern等，J.Mol.Appl.Genes.l327，1982)在1ml的磷酸鹽緩衝液(PBS)中進行電穿孔，隨後在400μg/ml的抗生素G418中進行篩選的產物。C3-4轉染子是通過轉化編碼與IgM重鏈的第3、4個外顯子融合的β-gal基因的質粒而從BALB/c雜交瘤IgM662誘導的。(Rammensee等，免疫遺傳學30，2961989)。表達gp160 IIIb的3T3成纖維細胞15-12由NIH的Dr.Germain提供(Bethesda MD)。Kb轉染的L細胞系由澳大利亞，Monash大學的Dr.Carbone提供。Dd和Ld轉染的L細胞系由St.Louis華盛頓大學的Dr.Ted Hensen提供。
免疫如Moore等同上和Carbone等(實驗醫學雜誌169603，1989)所述，在胞漿負載後用200μl 25×106的脾細胞懸液靜脈內對小鼠進行免疫。ova-抗原製劑或β-gal抗原製劑免疫時，每隻鼠足墊或尾根部皮下注射時每種蛋白抗原30μg。每次注射包括67μl的微流體化的抗原製劑(按常規程序製備)和30μg的蛋白抗原，終體積為200μl。終體積與HBSS一起配製，參照Whittaker手冊(Welkerstille，MD)。MDP的濃度為0-300μg。需要指出的是用溶於CFA或礬中，終體積為200μl的可溶於抗原對小鼠進行免疫。
效應物的體外刺激從正常鼠或至少14天前已接觸過抗原的免疫鼠中獲取的脾細胞(30×106)與1.5×106的EG7-ova(用2000rad，放射性照射)或1.5×106C3-4細胞(用2000rad放射線照射)在24孔板中，37℃，7％CO2/空氣的條件下培養，以進行ova應答或β-gal應答。所有的組織培養均在含IMDM培養基的完全培養基中進行，參照Whittaker手冊(Welkersville，MD)補充10％的胎牛血清(FCS)，2mM穀氨醯胺、慶大黴素和2×10-5M2-巰基乙醇。體外進行耗竭實驗時，體內啟動或體外刺激的脾細胞用單克隆抗體(mAbs)RL.172(抗CD4)或mAbs 3.168(抗-CD8)處理，以去除CD4+或CD8+細胞(Sarmiena等，免疫學雜誌1252665，1980和Cereding等，自然3498，1985)，mAb RL.172和mAb 3.168由CA.LaJoua，Scripps臨床和基礎研究所的Dr.Joanthan Sprent贈送。
細胞毒性分析靶細胞(1×106)用100μCi[51Cr]鉻酸鹽標記60分鐘。為了讓肽與靶細胞結合，在靶細胞標記51Cr的時候，加入50μl 1mg/ml溶在HBSS中的肽。洗滌以後，104標記的靶細胞和系列稀釋的效應細胞在200μlRP10中37℃培養4h。吸取100μl的上清液，按下面公式計算特異性殺傷特異性殺傷的百分率＝100×{(CTL釋放-自然釋放)/(最大釋放-自然釋放)}。在所有的實驗中，在無細胞毒T淋巴細胞(CTL)時由去汙劑所引起的自然釋放＜最大釋放的25％。
小鼠和猴子中抗體應答的檢測96孔板的每一孔在U形板底(Costar，Cambridge，MA)覆蓋著50μl溶於HBSS的ova或gp120 150ng，培養過夜。為了檢測小鼠中抗-gp120和抗-ova抗體的應答，用1％BSA封閉板1h。每孔加入25μl系列稀釋的血清，培養2hrs。洗板，每孔加入50μl在1％BSA中1∶1000稀釋的聯有HRPO的羊抗鼠IgG。培養1h後，洗板，每孔加入100μl的底物，10到15分鐘後測OD450值。用於檢測猴抗gp120抗體的應答時，除用Hank’s平衡鹽溶液配製的5％普通羊血清封板和稀釋血清外，所有的步驟均相同。
肽的合成按照卵白蛋白(ova 253-276)的胺基酸序列253-276(SEQ IDNo.1EQLESIINFEKLTEWTSSNVMEER；這裡所應用的一個標準字母代表每一胺基酸)，鞘磷脂基質蛋白(MBP 84-102)的胺基酸序列84-102(SEQ ID No.2DENPWHFFKNIVTPRTPP)合成的肽，和按照gp 120 IIIb的胺基酸序列308-322(18IIIb序列)合成的肽用實用生物系統430A合成儀，通過固相肽合成進行裝配。通過預先形成的對稱酐與額外的天門冬醯胺、穀氨醯胺和精氨酸連結形成羥基苯三唑酯。聯結效率參照Kaister等的方法(生化年刊34595，1970)由茚三酮反應控制。隨著Tam等在美國化學協會雜誌216442，1983所描述的「低-高」過程，肽與HF從支持物中釋放，用10％乙酸乙酯從樹脂中提取肽。冷凍乾燥後在Sephadex G-25柱上對肽進行脫鹽，接著樣品肽經Vydame製備C-18柱，通過反相色譜進行HPLC純化。純化的肽(98％)溶於HBSS中，終濃度為1mg/ml，在完全培養基中稀釋到所需的濃度。
溴化氰消化用100倍克分子的溶在100mM三氟乙酸中的過量溴化氰處理蛋白質樣品(例如β-半乳糖苷酶)。在室溫(大約20℃)，攪動的情況下，反應可超過18小時。前述反應時間作用完之後，用SEP-PAK C-18儀(Waters)從反應物中分離肽片段，用95％的乙腈洗脫，冷凍乾燥。
鹼消化蛋白樣品(例如β-半乳糖苷酶)用1N NaOH處理，煮2分鐘，用C-18 CEP-PAK儀(Wasters)分離所得的肽片段，用95％的乙腈洗脫並進行冷凍乾燥。
實施例1受MHCI類分子限制的CTL的啟動Moone等在UCLA Symp.Mol.Cell.Biol.113，1989和Carbone與Bevam於實驗醫學雜誌171377，1990。指出用胞漿中載有可溶性ova的脾細胞免疫小鼠，可誘導ova-特異性I類分子限制的CTL應答。用表達ova的EL4轉染子EG7-ova體外刺激體內已與抗原接觸了的脾淋巴細胞並且用作ova-特異性CTL介導殺傷作用的靶物。該研究也證明，由EG7-ova轉染子或胞漿中載有ova的脾細胞誘導的CD8+效應物識別遺傳背景為H-2Kb的肽ova-258-276定位的抗原決定簇，分解EG7-ova並且殺傷被有ova-258-276的EL4細胞。因此，為了確定可溶性抗原是否可誘導內源性I類分子限制的CD8+T細胞途徑，應用上述系統以檢測某種抗原製劑是否可把可溶性抗原帶入I類分子限制的途徑。
a)ova用含有或不含有抗原製劑的不同量ova(每隻小鼠30μg-1mg)，皮下或尾根部注射一次免疫C57BL/c小鼠。至少免疫2周以後，取免疫小鼠的脾細胞，用EG7-ova轉染子進行體外刺激。ova在30μg的低濃度與1mg時同樣有效。因此，CTL的研究中常用30μg ova所免疫鼠的脾細胞，與EG7-ova體外培養5天後通過能裂解EG7-ova的ova-特異性效應物的存在來評價其誘導能力。
用高達1mg溶於HBSS的可溶性抗原給小鼠注射，並沒有CTL啟動。(圖1A)。但是用30μg溶在上述抗原製劑(圖中以AF表示)中的ova免疫小鼠則產生顯著的轉染子特異性CTL應答(圖1C)。並且，ova-AF免疫的脾細胞對EG7-ova的殺傷程度與用載有ova的脾細胞免疫小鼠的脾細胞的殺傷程度進行了比較(圖1B)。
當用EG7-ova體外刺激的時候，β-半乳糖苷酶免疫小鼠脾淋巴細胞沒有顯示第二次CTL應答，說明體內CTL啟動的特異性是Ag特異的。沒有發現ova誘導ova特異性CTL。
b)β-半乳糖苷酶用另外一種可溶性抗原β-gal也得到相似的結果。為了測定β-gal特異性CTL的應答，用來源於BALB/c的表達β-gal的C3-4轉染子作靶物。用可溶性β-gal免疫BALB/c產生輕微的CTL應答。因此為了檢測特異性的CTL應答，至少要達到8周才能收集脾淋巴細胞，在受照射的C3-4轉染子的存在下培養5天。
圖2B表明，溶於AF的30μg β-半乳糖苷酶可對轉染子誘導強烈的特異性CTL應答。效靶比(E∶T)為3∶1時，β-gal-AF免疫的小鼠顯示出大約80％的特異性C3-4殺傷。但是從溶於HBSS中的β-gal免疫的小鼠分離到的效應物，以同樣的效靶比對相同靶物的殺傷僅達20％。因為EL4和P815均不表達MHC II類基因產物，並且裂解具有同系限制性，所以ova和β-gal的特異性效應物是MHC I類分子限制的。
為了檢測抗原製劑的效用，用包埋在2型脂質體中的可溶性抗原免疫小鼠，其中一種是pH敏感性脂質體。一周以後，按前述的方法體外刺激脾細胞，並且用51Cr標記的EG7-ova或EL4進行檢測。圖3給出的代表性結果表明脂質體中的ova不能啟動小鼠進行基本的CTL誘導。當ova溶在礬中進行免疫時可得到類似的結果。
實施例2CTL對表位的識別Carbone和Bevan，同上證實，用EG7-ova轉染子和胞漿載有ova的脾細胞免疫C57BL/6小鼠，誘導的CTL可識別被有ova 258-276表位的EL4細胞。為了檢測是否AF中的可溶性卵白蛋白也誘導同樣的CTL應答，從免疫鼠製備脾細胞，體外用EG7-ova刺激效應物對被有ova 258-276肽或被有從髓磷脂鹼性蛋白(MBP 84-102)分離出的對照肽的EL4細胞的作用進行檢測。結果證明，ova-AF啟動的CTL和由轉染子或胞漿載有ova啟動的CTL具有相似的效果。(圖1A、1B和1C)。ova-AF啟動的效應細胞有效的裂解EG7-ova和每108細胞被有50μgova肽的未轉染的EL4細胞，但並不裂解包被有10μg MBP肽/108細胞的EL4細胞。
Carbone和Beran同上指出在β-半乳糖苷酶系統表達β-gal的轉染子和胞漿有可溶性β-gal的脾細胞誘導的CTL，可裂解表達β-gal的轉染子和被有鹼消化β-gal未轉染的P815細胞。當可溶性β-gal在AF中進行免疫時所誘導的CTL具有同等的特異性。(圖2)。
實施例3CTL效應物為CD8+T細胞下面顯示了在AF中的可溶性抗原誘導CD8+效應性T細胞。從免疫鼠獲得的脾細胞與放射線照射的轉染子體外培養5天。此後，收集細胞用抗CD4或抗CD8的單克隆抗體和補體來耗竭CD4+或CD8+T細胞。然後耗竭群體在ova系統中對51Cr-EG7-ova進行檢測或在β-gal系統中對51Cr-P13.1進行檢測。圖4的結果顯示，在ova系統中整個效應細胞群證實CD8+T細胞的耗竭終止了細胞裂解活性，但是，CD4+T細胞的耗竭對EG7-ova的裂解沒有任何影響。
同樣在β-gal系統中，CD8+T細胞的耗竭終止了β-gal-抗原製劑免疫脾細胞的細胞裂解活性。
實施例4AF中的可溶性ova啟動CD8+T細胞為了證明ova-AF體內啟動CD8+T細胞群，且在體外的第二次應答中具有限制性，把CD4+或CD8+細胞群從ova-AF免疫鼠和正常小鼠的脾細胞中耗盡。接著，經這樣處理的群體體外單獨與EG7-ova或與ova-AF免疫鼠的CD4+和CD8+T細胞一起或與ova-AF免疫鼠的CD4+或CD8+T細胞與正常鼠的CD4+或CD8+細胞的不同組合一起進行激活。圖5顯示啟動CD8+細胞對於證實體外的第2次CTL應答是必要的。這些數據同樣顯示體外有效的第2次CTL應答需要CD4+T細胞，啟動不需要CD4+T細胞。同樣，體外β-gal特異性第2次CTL應答也需要CD8+T細胞。
上述例子證實了抗原製劑對可溶性蛋白抗原誘導產生I類分子限制的CTL應答的效果。抗原製劑介導可溶性抗原誘發CTL啟動，並且與轉染子和胞漿載有可溶性ova或β-gal脾細胞誘導的具有相似的活性。在卵白蛋白系統中，EG7-ova，胞漿載有ova的脾細胞和ova-AF包括(a)I類分子限制的CD8+CTL；(b)CTL識別經ova 253-276合成肽敏感化了的靶物；(c)僅一次免疫後，有長時間存活的CTL。在β-半乳糖苷酶系統中，β-gal-AF誘導的CTL識別β-gal表達的轉染子C3-4，也識別經鹼消化β-gal敏感化了的未轉染P815細胞。這與用胞漿載有β-半乳糖苷酶的脾細胞進行免疫誘導的CTL相似。AF所誘導的ova-特異性CTL是獨一無二的，因為包在pH敏感的脂質體中或在礬中的ova均不能在體內誘發CTL啟動。
這些實施例表明，上面應用的AF和它的等同物在人類治療和在各種癌症，病毒性疾病誘導CTL疫苗的研製中是有益的。
實施例5這是一展示上述AF在HIV可溶性gp 120誘導I類分子限制性CTL啟動的特殊實施例。
gp 160 IIIB表達細胞系(15-12)是Balb/c成纖維細胞分化的3T3細胞系產生的。它是從Bethesda，M.D.國家健康研究所的Ron Germain和Jay Berzofsky博士得到的。gp 160 IIIB表達細胞系用於體外激活已在體內接觸抗原的脾淋巴細胞並在gp 160特異性CTL的誘導中作靶物。用10μg含或不含有AF的gp 160 1次免疫Balb/c小鼠，在足底和尾根部注射。免疫2周後取免疫鼠的脾細胞，體外用放射線照射過的gp 160轉染子刺激，培養5天後，通過具有裂解gp 160轉染子而不裂解未轉染細胞系這樣的異效應物的存在來評價啟動效應。圖7列出了結果，AF和gp 120促進了CTL應答。
下面的實施例展現了僅用該發明一或二部分抗原製劑的應用。這些實施例證明僅用上述三組分中的兩組分就可誘導CTL應答。
實施例6誘導CTL所必需的關鍵組分的確定為了檢測上述提到的所有組分是否都是抗原特異性CTL的誘導所必需，用上述AF三組分中不同2組分組合的微流體化製劑的卵白蛋白免疫小鼠。應用的2組分組合如下角鯊烷/吐溫溶於PBS，角鯊烷/普盧龍尼克溶於PBS或普盧龍尼克/吐溫溶於PBS。另一套組別包括用在一部分系統中配製的ova免疫小鼠，也就是說PBS中僅有用鯊烷、普盧龍尼克或吐溫。調整上述三組分抗原製劑，每次排除一組分，用PBS代替之。
上述的所述抗原製劑包含0.300g吐溫80(Aldrich，WI)，1.875g普盧龍尼克L121(BASF，NJ)和7.5g角鯊烷(Aldrich，WI)，用PBS配成50ml。
2組分製劑為角鯊烷/吐溫0.300g吐溫80和7.5g角鯊烷，PBS配成50ml。
普盧龍尼克/吐溫1.875g普盧龍尼克L121和0.300g吐溫80，PBS配到50ml。
普盧龍尼克/角鯊烷1.875g普盧龍尼克L121和7.5g角鯊烷，PBS配到50ml。
接著通過微流體儀110T型，Microfluids公司，對樣品進行處理，分裝貯存在4℃備用。
稱取卵白蛋白(Sigma，MO)用PBSS配成0.3mg/ml的溶液。該貯存液按下列數量與2組分製劑合併5份0.3mg/ml的卵白蛋白溶液，3.3份2組分製劑和1.7份PBSS。
製劑在冰上進行旋轉攪拌直到注射，所有的溶液在注射前即刻合併。
每隻鼠在雙側後足底注射含ova 30μl的製劑200μl，餘留的溶液在尾根部皮下注射。2-4周後收集脾細胞。
免疫2周後製備脾細胞，用照射了的EG7-ova體外刺激。培養5天後通過測定4h內51Cr-EG7-ova或51Cr-EL4的釋放來檢測ova-特異性CTL的存在。圖8-10列出的數據證明，微流體化的2組分系統中的卵白蛋白製劑可在體內啟動ova特異性CTL。
我們又進一步評價了當與蛋白抗原合用時每一組分在它們誘導CTL能力中的相對作用。在免疫過程中，可溶性抗原與微流體化的賦形劑混合以得到顆粒大小長圍為250～300μm的穩定同類乳劑。為了進一步確定角鯊烷-吐溫80-普盧龍尼克(STP)製劑組分在誘導CTL中起到的作用，我們用角鯊烷-吐溫80(ST)混合物，普盧龍尼克-吐溫80(PT)混合物或角鯊烷-普盧龍尼克(SP)混合物中的ova免疫小鼠，用角鯊烷(S)，吐溫80(T)或普盧龍尼克(P)中的ova作為對照(未免疫小鼠)。也用ova-SAFm(含70μg MDP)或ova-礬作為佐劑對照未免疫小鼠。作為陽性對照，用胞漿載有可溶性ova的脾細胞免疫小鼠。也可用其它結合和替代，結果見表1。
為了查明CTL啟動過程，免疫小鼠1次。免疫2周後，脾細胞與放射線照射了的EG7-ova(ova表達的EL4細胞)混合5天，測驗其對51Cr-EG7-ova或51Cr EL4細胞的作用。結果(圖11)表明，30μg的ova與STP或ST聯合應用，在小鼠體內啟動I類分子限制的CTL應答。由STP中ova或ST中ova所啟動的ova特異性CTL比胞漿載有可溶性ova的脾細胞誘導的要好。PT中或SP中的ova可在小鼠體內誘導ova-特異性CTL應答，但微弱且不持久，與SAFm不同，ST製劑中加入MDP在小鼠體內並不破壞ova-特異性CTL的誘導(表2)。當ova與單獨組分S、P或T混合對小鼠進行免疫或用ova-SAFm或ova-礬免疫小鼠時，不誘導ova-特異性CTL。用高達1mg溶在(a)HBSS，(b)SAFm或(c)被礬吸收的ova免疫小鼠，不啟動ova-特異性CTL。
表 2ST+MDP不阻斷誘導ova- 特異性CTL應答免疫小鼠的細胞毒百分率*ova-ST-MDP ova-ST-MDP刺激物靶物**E-Tova-STova-ST300μg小鼠72μg小鼠EG7-ova EG7-ova 100∶10 100 82 7633∶1 0 86 67 6211∶100 33 39 253∶10 0 613 31∶1 0 00 03∶1 0 00 0*用30μg不同製劑中的ova免疫小鼠**減去對抗原非表達細胞系的殺傷率來計算細胞毒百分率。
實施例7產生ova特異性抗體的必要組分每間隔2周用30μg溶在HBSS、STP、ST、PT或SP中的ova免疫小鼠3次。因為已知SAFm能誘導強烈的抗體應答所以也用ova-SAFm作為陽性對照來免疫小鼠。第2次和第3次免疫以後7天，放血處死小鼠，血清用於ova特異性抗體應答的測驗。結果如表3所示，結果表明用溶於STP、ST或SAFm中的ova免疫小鼠2次後，顯現出相同的抗-ova應答。
表3抗-ova抗體應答的誘導30μg ova製劑/動物反應小鼠數/注射小鼠數1/血清稀釋度HBSS0/3 ＜1/20，＜1/20，＜1/20STP 3/3 ＜1/4860，＞1/4860，＜1/4860ST 3/3 ＞1/4860，＞1/4860，＞1/4860PT NANA NANASP NANA NANASAF-M 3/3 1/4860， 1/4860， 1/4860*NA未得到實施例8HIV gp120特異性CTL的誘導用HIV gp120 IIIB作為第二個抗原系統以檢測其在STP、ST或MP-T中時對CTL的誘導能力。用1μg溶於HBSS、STP、PT或ST中的gp 120 IIIb免疫小鼠。用1μg SAFm或CFA(完全弗氏佐劑)或含MPL(單磷酸脂A)和TDM(海藻糖二黴菌酸酯)的RIBI佐劑系統中的gp120 IIIb免疫小鼠作為對照。三周後，製備脾細胞，用絲裂黴素處理的轉染子細胞15-12或用18 IIIb肽體外刺激。培養5天後，測驗所獲效應細胞對靶物牛痘gp160 IIIB或胃腸外牛痘感染的P815細胞的作用。結果表明是gp120-角鯊烷-吐溫80製劑在小鼠體內誘導特異性CTL應答而並非gp120-角鯊烷-吐溫80-普盧龍尼克或gp120-HBSS製劑。
表4 小鼠內gp120特異性CTL應答的誘導免疫小鼠的細胞毒百分率(％)*刺激物靶物**E-Tgp120-HBSSgp120-STgp120-STP18IIIb/IL2 vac∶gp120 100∶1 23 42 NA***33∶123 38 NA11∶10 0NA3∶1 0 35 NA18IIIb/IL2 15-12 100∶1 0 50 033∶10 35 011∶10 27 03∶1 0 18 018IIIb/IL2 3T3+18IIIb 100∶1 0 59 1333∶10 59 211∶10 57 03∶1 0 29 015-12 vac∶gp120 100∶1 35 84 NA33∶119 65 NA11∶112 37 NA3∶1 0 22 NA1∶1 0 0NA*用1μg不同製劑中的gp120 III免疫小鼠**通過減去對抗原非表達細胞系的殺傷率來計算細胞毒百分率(％)***NA；未得到。
實施例9小鼠體內gp120特異性體液應答的誘導為了誘導gp120特異性的體液應答，每2周間隔用1μg的gp120 IIIb免疫小鼠3次。放血處死小鼠，用固相ELISA法檢測gp120 IIIb以驗證IgG抗體的存在。結果表明gp120-ST的抗原性強於gp120-HBSS，gp120 SAFm(表5)或gp120-STP。
表5抗-gp120抗體應答的誘導1μggp120製劑/動物反應小鼠數目/注射小鼠數目1/血清稀釋度HBSS0/3 ＜1/20， ＜1/20， ＜1/20STP 1/3 ＜1/20， ＞1/4860，＜1/20ST 3/3 ＞1/4860，＞1/4860，＞1/4860PT 3/3 ＞1/4860，＞1/4860，＞1/4860SP 2/3 ＜1/20，1/540， 1/540Saf-M 2/31/180， ＞1/4860， 1/540實施例10猴子體內gp120特異性抗體應答的誘導用gp120-SAFm，gp120-STP，gp120-ST或gp120-HBSS免疫猴子(每組2隻)。用含gp160 IIIb的重組牛痘免疫一組猴子作對照，間隔2周對猴子進行免疫，在第2次免疫2周和3周後放血。對從每個猴子得到的原血清和免疫血清進行一系列稀釋，如材料和方法中描述的用ELISA方法測定抗gp120活性。數據(圖12)顯示用gp120-STP或gp120-SAFm免疫小鼠能誘導相似的應答。用gp120-ST免疫組中的1隻猴子與用gp120-SAFm或gp120-免疫組誘導的應答相似。1隻用gp120-ST免疫的猴子在免疫2周後也沒有誘導強的抗-gp120應答。
實施例11AF與HPV 16 E7體內聯合應用時的活性1.免疫用重組HPV 16 E7蛋白質的產生a)E7基因的克隆和PCRHPV 16 E7基因在由Dr Karen Vousden提供(Ladwing研究所)的質粒中克隆，它能編碼來源於癌細胞系Caski的E7基因。用PCR擴增編碼區域，應用的引物可編碼側翼有Bam HI和Sal I克隆位點基因的5′和3′末端。把E7的PCR產物結合到PGEX-4T1表達載體(Pharmacia生物工程)從而形成PGEX·E7表達質粒。用該質粒轉染E.coli系XL1-blue(Stratagene)。從克隆質粒中得到的E7序列與Caski細胞中獲得的E7序列一致。
b)細菌表達的E7的產生和純化
PGEX·E7這一細菌的表達質粒編碼一種在氨基末端包含有GST，在羧基末端有E7蛋白和纖維蛋白酶裂解位點的谷醯甘肽-S-轉移酶(GST)融合蛋白。按PGEX-4T-1載體(Pharmacia Biotech)廠家說明書製備純化E7蛋白質。首先在培養基加入異丙基-b-D-硫代半乳糖苷酶誘導含PGEX·E7表達質粒的細菌表達融合蛋白。用緩和的聲波裂解細胞並收穫它，裂解物經谷光甘肽瓊脂糖4B柱(Pharmacia生物工程)，融合蛋白與基體結合以後，衝洗樹脂移去非特異性結合蛋白，用凝血酶消化結合的融合蛋白以使GST融合部分釋放出E7蛋白。
用SDS-PAGE分析E7蛋白製劑並且用Bradford方法(BioRad)來確定E7蛋白的濃度，每1L細菌培養物中獲得9mg可溶性E7蛋白。
2.X21 E7轉染子的形成HPV 16 E7蛋白質的編碼序列插入到IDEL適宜的真核表達質粒INPEP4中。該載體中E7的表達由細胞巨大病毒啟動子/增強子轉錄元件控制。此外，E7編碼序列的前3個核苷酸被移去且由免疫球蛋白輕鏈引導序列所代替，放置在直接上遊，E7編碼區域的框架內，轉染小鼠細胞系X21之後，用Northern印跡法檢測單體的G418抵抗克隆用於E7信使產物。每一克隆顯示出可檢測的E7信使。接著對4E7和1C7 2克隆的細胞裂解物進行Nestern印跡法檢測，證明了E7蛋白的產生。
3.E7/AF可溶性抗原的體內活性本研究中應用C3H雌性小鼠(H2k/k，Harlan Spnague Dawley)。依照「實驗動物護理和應用指南」(DHHS出版社No.NIH 86-23，Bethesda，MDNIH，1985)一書飼養動物，隨意給食物和水。本研究中應用E7轉染子細胞系HOPE2(H2k/k)。腫瘤細胞系通過體外連續傳代進行培養。
Western印跡法檢測及隨後的體外傳代重複顯示出該細胞系能維持E7胞漿抗原的表達。給同源C3H小鼠皮下注射15000個體外傳代細胞引發腫瘤。
2周內在兩個垂直方向測量腫瘤。腫瘤體積可按下列公式計算V(mm3)＝(L×W2)/2L＝最長的軸線，以毫米計算W＝垂直軸線(mm)
表6的數據代表腫瘤小鼠(荷瘤鼠數量/所有接受注射小鼠的數量)。圖13和14的數據代表每一治療組或對照組腫瘤大小的均值(mm3)。每一治療組與未接受治療的對照組進行比較。注射HOPE2細胞10天後，當大部分腫瘤可觸及的時候(大約50～75mm3)進行治療。治療以用AF或礬佐劑中的可溶性E7蛋白免疫小鼠而開始(皮下，總體積為0.2ml)。免疫前即刻，AF與E7蛋白在Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)中混合60秒，這樣每隻小鼠可接受0.2ml的E7蛋白30μg或90μg。按照廠家說明書A1(Pieme化學藥劑公司)與E7蛋白混合，這樣每隻小鼠可接受0.2ml的E7蛋白90μg。在第2次治療組中的動物9天後接受第2次免疫(接種腫瘤19天後)。如前所述，在接種之前立即準備加強免疫。
本實施例中(表6Xp#233)，接種腫瘤細胞41天後，接受溶於AF中的可溶性E71次注射的小鼠(每隻30μg或90μg)僅4/8和5/8有可測量的腫瘤。與此相對，所有用礬中可溶性E7蛋白免疫的小鼠(8/8)均發生活動性。進行性的腫瘤。另外，如圖13所示，與對照組(未治療)或礬治療組相比，僅僅在用溶於AF中的E7蛋白進行免疫的治療組可觀察到顯著的腫瘤生長抑制作用。接受1次溶於礬中E7注射的小鼠中沒有發現腫瘤生長的抑制(圖13)或抑瘤率的增加(表6)。
儘管在接受2次礬中E7注射的小鼠中可觀察到一些腫瘤生長受阻，但用腫瘤攻擊後第10天和第19天接受2次免疫的治療組觀察可得到相似的結果(圖14和表6)。
結果顯示，以荷瘤鼠數量的減少和腫瘤 的抑制作用計算，隨著AF中可溶性E7的免疫，可觀察到明顯的抗腫瘤活性。與此相對，所有用礬中可溶性E7蛋白免疫1次或2次的動物均有進行性生長的腫瘤。總而言之，用溶於AF中的可溶性E7蛋白免疫小鼠可明顯抑制腫瘤細胞的生長而用溶在礬中的可溶性E7免疫則觀測不到。
權利要求
1.一種組合物，其包含與微流體化的抗原製劑的混合的抗原，該抗原製劑包括(a)穩定化的去汙劑，(b)微膠粒形成劑，和(c)生物可分解和生物相容性油，所說的抗原製劑以穩定的水包油乳劑形式配製，基本上不含免疫刺激性肽並且應用給動物的組合物能夠對組合物中包含的抗原誘導特異性細胞毒T淋巴細胞應答，所用的動物選自人、家養動物和農業動物。
2.一種在選自人、家養動物和農業動物的動物體內誘導細胞毒T淋巴細胞應答的方法，其包括給動物施用一種包括抗原和微流體化的抗原製劑的混合物，該抗原製劑包括(a)穩定化的去汙劑，(b)微膠粒形成劑，和(c)生物可分解和生物相容性油，所說的抗原製劑不含免疫刺激性的肽組分，以穩定的水包油乳劑形式製備；所說的混合物以有效量施用給動物，可在動物體內誘導對混合物中所含抗原特異的細胞毒T淋巴細胞應答。
3.一種治療感染有HIV病毒病人的方法，其包括施用一種組合物，該組合物包括與微流體化抗原製劑混合的HIV抗原，抗原製劑包括(a)穩定化的去汙劑，(b)微膠粒形成劑，和(c)生物可分解和可相容的油，該抗原製劑不含免疫刺激性肽組分，以穩定性水包油乳劑的形式製備；該混合物以足以在病人體內誘導細胞毒T淋巴細胞應答的量施用給病人。
4.一種治療瘧疾患者的方法，其包括給病人施用一種微流體化的組合物，該組合物包括與抗原製劑混合的瘧疾相關抗原，抗原製劑包括(a)穩定化的去汙劑，(b)微膠粒形成劑，和(c)生物可分解和可相容的油，該抗原製劑不含有免疫刺激性肽組分，以穩定性水包油乳劑的形式製備；該混合物以足以在病人體內誘導細胞毒T淋巴細胞應答的量施用給病人。
5.一種治療流感患者的方法，其包括給病人施用一種組合物，該組合物包括與微流體化抗原製劑混合的流感相關抗原，抗原製劑包括(a)穩定化的去汙劑，(b)微膠粒形成劑，和(c)生物可分解和可相容的油，該抗原製劑不含有免疫刺激肽組分，以穩定性水包油乳劑形式製備；該組合物以足以在病人體內誘導細胞毒T淋巴細胞應答的量施用給病人。
6.一種治療肝炎病人的方法，其包括施用一種組合物，該組合物包括與微流體化抗原製劑相混合的肝炎相關抗原，抗原製劑包括(a)穩定化的去汙劑，(b)微膠粒形成劑，和(c)生物可分解和可相容的油，該抗原製劑不含有免疫刺激性肽組分，以穩定的水包油乳劑形式製備；該組合物以足以在病人體內誘導細胞毒T淋巴細胞應答的量施用給病人。
7.一種治療癌症患者的方法，該方法包括施用一種組合物，該組合物包括與微流體化抗原製劑相混合的癌症相關抗原，抗原製劑包括(a)穩定化的去汙劑，(b)微膠粒形成劑，和(c)生物可分解和可相容的油，該抗原製劑不含有免疫刺激性肽組分，以穩定的水包油乳劑形式製備；該組合物以足以在病人體內誘導細胞毒T淋巴細胞應答的量施用給病人。
8.一種治療皰疹病毒患者的方法，其包括施用一種組合物，該組合物包括與微流體化抗原製劑相混合的皰疹抗原，抗原製劑包括(a)穩定化的去汙劑，(b)微膠粒形成劑，和(c)生物可分解和可相容的油，該抗原製劑不含有免疫刺激性肽組分，以穩定的水包油乳劑的形式製備；該組合物以足以在病人體內誘導細胞毒T淋巴細胞應答的量施用給病人。
9.一種治療感染呼吸合胞體病毒的患者的方法，包括施用一種組合物，該組合物包括與微流體化抗原製劑相混合的呼吸合胞體抗原，抗原製劑包括(a)穩定化的去汙劑，(b)微膠粒形成劑，和(c)生物可分解和可相容的油，該抗原製劑不含有免疫刺激性肽組分，以穩定的水包油乳劑的形式製備；該組合物以足以在病人體內誘導細胞毒T淋巴細胞應答的量施用給病人。
10.一種在人或家養動物或農業動物體內誘導細胞毒T淋巴細胞的方法，其包括如下步驟施用一種抗原與微流體化抗原製劑相混合的混合物，抗原製劑基本上由下面三種物質中的兩種組成(a)穩定化的去汙劑，(b)微膠粒形成劑，和(c)生物可分解和可相容的油，該抗原製劑以穩定的水包油乳劑形式製備，該混合物以足以在人或動物體內誘導細胞毒T淋巴細胞應答的量施用給人或動物。
全文摘要
在人、家養動物或主要的農業動物中誘導細胞毒T淋巴細胞(CTL)應答的方法和組合物。該方法包括這樣的步驟提供希望引起CTL應答的抗原並且提供抗原製劑，抗原製劑中包含穩定化去汙劑、膠束形成劑和油中的2種或更多種，或由其或基本上由其組成。抗原製劑優選不含有免疫刺激性肽組分，或含有該組分的水平足夠低，不致於減弱所希望的CTL應答。該製劑以穩定的水包油乳劑的形式提供。
文檔編號A61K47/00GK1515319SQ0310884
公開日2004年7月28日 申請日期1995年11月29日 優先權日1994年12月7日
發明者S·雷查德胡列, W·H·拉斯泰特, S 雷查德胡列, 拉斯泰特 申請人:艾德藥品公司