用於治療小便失禁的含有來自蛻膜或脂肪的幹細胞的細胞治療劑的製作方法

2024-01-30 01:28:15

專利名稱：：用於治療小便失禁的含有來自蛻膜或脂肪的幹細胞的細胞治療劑的製作方法
技術領域：
：本發明涉及用於治療小便失禁的細胞治療劑，更具體地，涉及含有來自胎盤或者月經液的蛻膜的幹細胞或者來自脂肪組織的幹細胞的用於治療小便失禁的細胞治療劑。
背景技術：
：幹細胞指的是不僅具有自我複製能力而且具有分化成至少兩個細胞能力的細胞，它可以分為全能幹細胞、多功能性幹細胞和多潛能性幹細胞。全能幹細胞是具有能夠發育成一個完整個體的全能性質的細胞，並且在卵母細胞和精子受精之後直到8細胞階段時細胞都具有這些特性。當這些細胞被分離並移植到子宮中時，它們可發育成一個完整個體。多功能性幹細胞是來源於外胚層、中胚層和內胚層的能夠發育成不同細胞和組織的細胞，多功能性幹細胞來自於在受精4-5天之後產生的胚泡內的內細胞團。這些細胞被稱為「胚胎幹細胞」，並可分化成各種其他組織細胞，但不能形成新的生物體。多潛能性幹細胞是這樣的幹細胞，其僅僅能夠分化成針對含有這些細胞的組織和器官的細胞。多潛能性幹細胞首先從成人骨膜中分離(Y.Jiang等人，Nature,418:41，2002)，隨後也在其他各種成人組織中發現(C.M.Verfaillie，TrendsCellBiol.,12=502,2002)換言之，雖然骨膜是最廣為人知的幹細胞源，但是也在皮膚、血管、肌肉和大腦中發現了多潛能性幹細胞(J.G.Tomas等人，Nat.CellBiol.，3778,2001；M.Sampaolesi等人，Science,301487,2003；Y.Jiang等人，Exp.Hematol.,30:896，2002)。但是，在成人組織諸如骨膜中的幹細胞非常少，並且在不誘導分化時這些細胞很難培養，從而在缺少專一性篩選培養基的情況下同樣難以培養。也就是說，在體外保持分離的幹細胞非常困難。近來發現，脂肪組織成為多潛能性幹細胞的新來源(B.Cousin等人，BBRC.，3011016,2003；A.Miranville等人，Circulation,110349,2004；S.Gronthos等人，J.CellPhysiol.，18954,2001；M.J.Seo等人，BBRC.，328258,2005)。SP，據報導，通過抽脂術得到的人脂肪組織中含有一組未分化的細胞，其具有分化成脂肪細胞、成骨細胞、肌細胞和成軟骨細胞的能力(P.A.Zuk等人，TissueEng.，7211,2001；A.M.Rodriguez等人，BBRC.，315:255，2004)。脂肪組織具有的優點在於它可以大量提取，因此它作為克服現有技術缺陷的新的幹細胞源而引起注意。而且，近來使用動物模型實驗的研究表明，來自脂肪組織的細胞具有再生肌肉和刺激神經血管分化的能力。因此，這些來自脂肪組織的細胞作為新的幹細胞來源而受到關注。本發明的發明人以前在含有膠原酶和bFGF的培養基中培養過精細切割的胎盤組織，從培養液中分離胎盤幹細胞，然後使分離的幹細胞分化成肌細胞、成骨細胞、神經細胞、脂肪細胞、軟骨細胞和胰腺0細胞(韓國專利申請NO.2007-0101756A)。同時，女性的小便失禁是由尿道和膀胱的松垂引起的，這種鬆弛是由頻繁生育和老化導致的陰部神經損傷引起的盆底肌肉弱化所造成的。目前，韓國女性小便失禁患者的數目大約為4，000,000-5,000,000,並且隨著老齡婦女數目的迅速增加而逐年增加。因此，女性小便失禁正逐漸成為世界範圍內的一個嚴重的社會問題。為了治療小便失禁患者，使用了用於支持尿道和膀胱的注射治療或者外科手術治療。目前，作為侵入性方法的外科手術治療具有的一個問題是會出現併發症，注射治療具有的問題是由於其採用昂貴的物質，因此不容易應用於所有患者，並且其成功率僅為50-60%，從而再次需要注射和外科手術。幹細胞注射治療不需要麻醉，並且幹細胞可以很容易地注射到尿道括約肌中。因此，如果幹細胞注射治療能夠改善尿道括約肌的收縮性並提高漏尿點的壓力，則幹細胞治療可有利地用於治療小便失禁。但是，目前還沒有關於將幹細胞用於治療小便失禁的研究。因此，本發明的發明人付出了許多努力來開發含有幹細胞的用於治療小便失禁的試劑，結果發現，來自胎盤蛻膜的幹細胞或者來自脂肪的幹細胞對於小便失禁的治療是有效的，由此完成了本發明。
發明內容因此本發明的主要目的在於提供用於治療小便失禁的細胞治療劑，其含有作為活性成分的來自胎盤或者月經液的蛻膜的幹細胞或者來自脂肪的幹細胞。本發明的另一目的在於提供一種製備用於治療小便失禁的細胞治療劑的方法，所述細胞治療劑含有作為活性成分的來自胎盤或者月經液的蛻膜的幹細胞或者來自脂肪的幹細胞。本發明又一目的在於提供來自胎盤或者月經液的蛻膜的幹細胞或者來自脂肪的幹細胞在防止小便失禁上的用途。通過下列詳細描述和所附的權利要求書，本發明的其他特徵和實施方式將更加明顯。附圖簡要說明圖1示出了來自胎盤蛻膜的間葉幹細胞(MSC)的形態的顯微照片。圖2示出了作為來自蛻膜的幹細胞的傳代數的函數的累計群體倍增水平(cumulativepopulationdoublinglevel,CPDL)白勺圖表0圖3示出了形成球形的在SFM培養基中培養的第一代蛻膜細胞的照片。圖4示出了通過使用流式細胞儀(FACS)分析來自蛻膜的MSC表面抗原得到的結果的照片。圖5示出了使用標記抗體進行的免疫細胞化學分析結果的照片[A:0CT4；BSSEA4；以及C:CD44，CD54和對照]。圖6示出了0CT4的RT-PCR結果[1道標記物；2道RT_反應對照；3道羊膜幹細胞；4道來自蛻膜的幹細胞，以及5道PCR-反應對照]。圖7示出了在肌生成中，在MM-3160培養基(用於肌原分化的SKBM培養基)中的來自蛻膜的幹細胞誘導10天時的免疫細胞化學分析(aMyosin-FITC)結果的顯微照片。圖8示出了裸鼠的陰部神經被切斷的照片。圖9示出了使用傾斜臺測定漏尿點壓力的過程的照片(A和B)。圖10示出了根據實施例6中得到的結果的漏尿點壓力測定的結果的圖表(A:4周時的漏尿點壓力，B8周時的漏尿點壓力，N正常組，D對照組，PI:實驗組1，以及P2實驗組2)。圖11示出了根據實施例7中得到的結果的漏尿點壓力測定結果的圖表(A:4周時的漏尿點壓力，B8周時的漏尿點壓力，N正常組，D對照組，Al:實驗組1，以及A2實驗組2)。圖12示出了使用器官浴槽測定尿道括約肌收縮性的過程的照片(A和B)。圖13示出了根據實施例8中得到的結果的通過電場刺激測定的尿道括約肌收縮性的圖表(A4周時的尿道括約肌收縮性，B8周時的尿道括約肌收縮性，N正常組，D對照組，P1實驗組1，以及P2實驗組2)。圖14示出了根據實施例8中得到的結果的通過乙醯膽鹼給藥測定的尿道括約肌收縮性的圖表(A4周時的尿道括約肌收縮性，B8周時的尿道括約肌收縮性，N正常組，D對照組，P1實驗組1，以及P2實驗組2)。圖15示出了根據實施例9中得到的結果的通過電場刺激測定的尿道括約肌收縮性的圖表(A4周時的尿道括約肌收縮性，B8周時的尿道括約肌收縮性，N正常組，D對照組，P1實驗組1，以及P2實驗組2)。圖16示出了根據實施例9中得到的結果的通過乙醯膽鹼給藥測定的尿道括約肌收縮性的圖表(A4周時的尿道括約肌收縮性，B8周時的尿道括約肌收縮性，N正常組，D對照組，P1實驗組1，以及P2實驗組2)。圖17示出了實施例10中進行的雌性裸鼠尿道組織的H/E染色、SMA免疫染色和MyHC免疫染色的結果。圖18示出了根據實施例10中得到的結果的雄鼠尿道組織的H/E免疫染色結果。圖19示出了根據實施例11得到的結果的雌性裸鼠尿道組織的H/E染色、SMA免疫染色和MyHC免疫染色的結果。圖20示出了根據實施例11中得到的結果的雄鼠尿道組織的H/E免疫染色結果。具體實施例在一個方面，本發明涉及用於治療小便失禁的細胞治療劑，其含有作為活性成分的來自胎盤或者月經液的蛻膜的幹細胞或者來自脂肪的幹細胞。在本發明中，來自胎盤蛻膜的幹細胞具有以下特徵(a)對⑶29和⑶90顯示免疫表型陽性，但對CD31和CD45顯示免疫表型陰性；(b)對0ct4、SSEA-4和Cripto_l顯示免疫表型陽性；(c)附著在塑料上生長，形態特徵為圓形或紡錘形，並在SFM培養基中形成球形以便長期保持未分化狀態；以及(d)具有分化成肌細胞的能力。1、術語定義在本文中，術語「幹細胞」指的是可無限複製以形成組織和器官的專門細胞的主細胞，包括發育的多功能性幹細胞和多潛能性幹細胞。幹細胞可分化成兩個子體幹細胞，或者一個子體幹細胞和一個祖細胞(「過渡細胞」)，該祖細胞然後增殖形成組織的成熟的完全成形的細胞。在本文中，術語「分化」指的是在細胞分裂、增殖或生長過程中細胞的結構或功能專門化的現象，也就是說，有機體的細胞或組織的特徵或功能發生變化以便執行給定的工作。一般說來，該術語指的是相對簡單的系統被分成兩種或多種性質不同的分系統的現象。例如，其意味著在開始彼此相同的任何生物系統各部分之間的性質出現不同，例如，在個體發育中開始彼此性質相同的受精卵各部分之間出現差異，如頭或身體，或者在細胞之間出現諸如肌肉細胞或神經細胞的差異，或者生物系統由於該結果而被分成性質不同的部分或分系統。在本文中，術語「細胞治療劑」指的是用於治療、診斷和預防目的的藥物，其含有通過從人類、培養物和特定手術(由USFDA提供)中分離製備的細胞或組織。特別地，細胞治療劑是一種用於治療、診斷和預防目的的藥物，其通過一系列的體外增殖、分選活的自體、異體和異種細胞，或者通過其他方式改變細胞的生物學性質而用於恢復組織和細胞的功能。根據細胞的分化水平，細胞治療劑廣義上被分為體細胞治療劑和幹細胞治療劑。本發明特別涉及含有來自蛻膜的幹細胞或者來自脂肪的幹細胞的細胞治療劑。2、來自蛻膜的幹細胞的分離和純化胎盤是在懷孕過程中為了胚胎而形成的，一般來說為盤形，重大約500g、直徑大約15-20cm、厚度為2-3cm。胎盤的一側與母體接觸，另一側與胚胎接觸。胎盤的間隙含有母體血液以便為胚胎供應養分。胎盤包括三層羊膜、絨毛膜和蛻膜。羊膜是圍繞胚胎的薄的透明膜並含有羊水，胚胎幹細胞存在於羊膜中。蛻膜是在子宮的上皮細胞改性以使受精卵可移植到子宮壁上的過程中形成的一種膜。蛻膜含有母體幹細胞。在本發明中，幹細胞分離自蛻膜。根據本發明的從人胎盤分離的來自蛻膜的幹細胞被歸類為自體成體幹細胞，其不引起倫理問題，因為它們來自胎盤組織。幹細胞通常通過下列方法從胎盤蛻膜中分離並純化。哺乳動物的胎盤(優選人胎盤)從子宮排出之後，將蛻膜與胎盤分離，處理並培養以產生多潛能性幹細胞、胎盤蛻膜幹細胞和其他生物材料。來自胎盤蛻膜的幹細胞是從自子宮排出的胎盤中獲得的。在優選實施例中，在生長因子例如bFGF(鹼性成纖維細胞生長因子)的存在下對胎盤進行培養。在本發明中，通過下列方法從人胎盤蛻膜中分離並純化幹細胞。將蛻膜組織從人胎盤組織樣品中分離並使用PBS清洗，然後將蛻膜組織精細切割。將精細切割的蛻膜組織轉移到100-mm皿中，在含有膠原酶(lmg/ml)的DMEM(Dulbecco『sModifiedEagleMedium,Gibco)中37°C下化學降解一小時。將化學分解後的組織用100-ym篩過濾以除去未分解組織，然後1200rpm離心1-10分鐘。吸去上清，將保留在底部的微團用PBS清洗，然後1200rpm離心1-10分鐘。將保留在底部的微團作為單細胞進行懸浮，然後在含有bFGF的DMEM培養基中培養。此時，間葉幹細胞附著到底部，其他細胞被懸浮。這些來自胎盤蛻膜的幹細胞附著在塑料上並顯示圓形和紡錘形的形態特徵。兩天後，使用PBS清洗未附著到皿底的細胞並進行培養，同時以2-3天為間隔更換培養基，由此得到分離自人胎盤的來自蛻膜的幹細胞的溶液。測定分離的來自蛻膜的幹細胞的增殖率，從結果可以看出，這些細胞在CPDL中逐漸增加，直到傳代數達到12，結果表明這些細胞具有較高的增殖率(圖2)。從胎盤蛻膜中得到的幹細胞在SFM培養基中形成球形，由此可長期保持在未分化狀態(圖3)。在本發明中使用的SFM培養基的一個例子是含有2%B27、500mM2-巰基乙醇、lyg/ml皮質醇、5iig/ml胰島素、20ng/mlEGF和20ng/mlbFGF的MEBM(哺乳動物上皮細胞基本培養基)。通過使用標準細胞測定技術測定形態和細胞表面標記物的變化，例如用流式細胞儀、細胞分選計、免疫細胞化學(諸如使用組織特異性或者細胞標記物特異性抗體染色)、螢光活化細胞分選(FACS)、磁活化細胞分選(MACS)，或通過使用光學顯微鏡或共焦顯微鏡測定細胞形態，或者通過使用本領域公知的技術諸如PCR和基因表達譜測定基因表達變化，由此可對增殖細胞的數目和類型輕鬆進行監測。在優選實施例中，來自胎盤或者月經液的蛻膜的幹細胞使用本領域已知的技術分選，例如密度梯度離心、磁細胞分離、流式細胞儀和其他細胞分離方法。從上面得到的來自胎盤或月經液的蛻膜的幹細胞培養液得到表達所需表面抗原的多潛能性幹細胞的方法，其包括使用具有分選功能的流式細胞儀的FACS方法(Int.Immunol.，10(3):275，1998)，使用磁珠的方法，以及使用專一性識別多潛能性幹細胞的抗體的淘選方法(J.Immunol.，141(8):2797，1998)。而且，用於從大量培養液中得到多潛能性幹細胞的方法包括一種方法，其中專一性識別在細胞表面上表達的分子的抗原(此後稱為「表面抗原」)被單獨使用或者作為柱而結合使用。流式細胞儀分選法可包括水滴電荷法和細胞捕獲法。在一個實施例中，用不同的螢光標記物標記細胞表面的標記物專一性的抗體或者配體。細胞經過細胞分選器被處理，允許細胞基於它們與使用的抗體結合的能力而分離。FACS-分選的微粒可直接沉積到96孔或384孔板的單個孔中以利於分離和克隆。在這些方法的任何一種中，專一性識別細胞表面上的抗原的抗體被螢光標記，與在細胞表面上表達的分子結合的抗體發出的螢光的強度被轉化成電信號，從而可對抗原的表達量進行定量。還能夠通過使用的螢光類型的組合來分離表達多種表面抗原的細胞。在這種情況下可使用的螢光的例子包括FITC(異硫氰酸螢光素)，PE(藻紅蛋白)，APC(藻藍蛋白)，TR(德克薩斯紅)，Cy3,CyChrome,Red613,Red670,,TRI-Color,QuantumRed等寸。使用流式細胞儀的FACS方法包括一種方法，其中收集上述幹細胞培養液，細胞通過離心從其中分離並使用抗體直接染色；和另一種方法，其中細胞在合適培養基中培養並生長，然後使用抗體染色。細胞的染色如下進行，將識別表面抗原的初級抗體與靶細胞樣品混合併在4°C下將混合物培養30分鐘到1小時。當初級抗體被螢光標記時，清洗後使用流式細胞儀分離細胞。當初級抗體沒有被螢光標記時，與初級抗體反應的細胞和具有與初級抗體結合活性的螢光標記的次級抗體在清洗後混合，混合物在4°C下培養30分鐘到1小時。清洗後，使用初級和次級抗體染色的細胞使用流式細胞儀分離。上述用於分離和純化來自蛻膜的幹細胞的方法也可以應用於本發明的來自脂肪的幹細胞。3、來自胎盤蛻膜的幹細胞的特性分離自胎盤蛻膜的幹細胞是同源且無菌的。此外，得到的幹細胞形式上適於給藥到人類，也就是說，它們是醫藥級的。在長期培養後，細胞可具有CD-系列表面抗原標記物的特徵，例如CD29(單核細胞標記物)、⑶31(內皮細胞和幹細胞標記物)、⑶45(造血細胞標記物)和⑶90(單核幹細胞標記物)，並可應用於FACS分析。通過本發明的方法得到的優選的來自胎盤蛻膜的幹細胞可通過具有下列特徵的細胞表面標記物的存在來識別對⑶29和⑶90顯示免疫表現型陽性，但對⑶31和⑶45顯示免疫表現型陰性。所述細胞表面標記物根據本領域公知的方法進行常規測定，例如通過流式細胞儀，接著清洗並使用抗細胞表面標記物抗體染色。而且，根據本發明的來自胎盤蛻膜的幹細胞可使用被認為是對於幹細胞的未分化標記物的0ct4、SSEA-4和Cripto-1標記物識別(圖4、5和6)。0ct4是公知的用於幹細胞的未分化標記物，並且其通常用於檢測0ct4表達能力以便識別出於未分化狀態的幹細胞，如同在題為「Monoclonalantibodyspecifictohumanembryonicstemcells」的韓國專利申請No.10-2004-0105716、題為"Double-strandedRNAforinhibitionofexpressionof0ct4genethatmaintainsundifferentiatedstateofmammalianembryonicstemcells」的韓國專利申請No.10-2004-0096780、題為「Humanumbilicalcordblood-derivedmultipotentstemcellshavingincreasedabilitytoproliferateduetoosteoblast-basedstructureandpreparationmethodthereof"的韓國專利申請No.10-2006-0092128以及類似專利申請中公開的那樣。而且，公知的是SSEA4(階段特異性胚胎抗原4)和Cripto-1存在於人胚胎幹細胞表面上。0ct4的表達使用RT-PCR(逆轉錄聚合酶鏈反應)與FACS—起確認。RT-PCR方法是本領域已知的技術。RT-PCR技術包括使用特定區域的RNA作為模板合成相應的cDNA並使用cDNA進行PCR擴增，並包括下列步驟(1)使用逆轉錄酶由RNA製備cDNA，以及⑵使用cDNA擴增特定區域，並且步驟(2)與由基因組DNA擴增特定基因區域的方法相同。與通過諸如Northern印跡雜交的方法進行RNA分析相比，該方法更為簡單，並且其可以測定基因的鹼基序列。因此，該方法主要在研究鹼基序列和mRNA轉錄水平方面非常有用。本發明的來自胎盤蛻膜的幹細胞在0ct4、SSEA4和Cripto-1的表達上呈陽性(圖4、5禾口6)。4、來自胎盤蛻膜的幹細胞的分化根據本發明的方法得到的來自胎盤蛻膜的幹細胞可被誘導分化成特定細胞系，包括分化成肌細胞。在特定實施方式中，根據本發明的方法得到的來自胎盤蛻膜的幹細胞被誘導分化，以便在移植和體外治療方案中使用。在特定實施方式中，根據本發明的方法得到的來自胎盤蛻膜的幹細胞被誘導分化成特定細胞類型，並且被基因工程化以提供治療性基因廣品。來自胎盤蛻膜的幹細胞分化成特定肌細胞可根據本領域已知的任何方法測定，通過使用氮雜胞苷對胎盤蛻膜幹細胞進行一天的預處理，然後在SKBM培養基(Cambrex，Co.)中培養預處理的細胞，來自胎盤蛻膜的幹細胞可被誘導分化成肌細胞。可通過本領域公知的方法來確定已經幹細胞是否已分化成肌細胞，例如使用諸如流式細胞儀或者免疫細胞化學等技術測定形態變化和細胞表面標記物(例如使用組織特異性或者細胞標記物特異性抗體對細胞進行染色)，或者通過使用光學顯微鏡或者共聚焦顯微鏡檢查細胞的形態，或者通過使用本領域公知的技術諸如PCR和基因表達譜測定基因表達的變化。5、來自胎盤蛻膜的幹細胞的用途以及由其分化的細胞根據本發明的來自胎盤蛻膜的幹細胞可用於眾多的治療方案中，其中身體組織或器官通過所需細胞群諸如來自胎盤蛻膜的幹細胞群的移入、移植或注入而擴增、修復或者替換。本發明的來自胎盤蛻膜的幹細胞可被用於替換或擴增現有組織以生長新的或者替代的組織，或者將組織與生物組織或結構結合。在本發明的優選實施例中，來自胎盤蛻膜的幹細胞可在自體或異體移植中使用，包括HLA-匹配和HLA-不匹配的造血移植。本發明的來自胎盤蛻膜的幹細胞可在典型地使用祖細胞的治療或研究方案中代替特定種類的祖細胞使用(例如軟骨細胞、幹細胞、造血細胞、胰腺薄壁細胞、成神經細胞、肌肉祖細胞等)。另外，本發明的來自胎盤蛻膜的幹細胞可被製成注射製劑(例如W096/39101，其全部內容通過引用而結合到本文中)。在替代實施例中，本發明的細胞和組織可使用可聚合或交聯水凝膠來製備，如在US5709854,5516532和5654381中描述的那樣，這些專利的全部內容都通引用而結合到本文中。6、來自脂肪的幹細胞及其用途本發明的來自脂肪的幹細胞從通過抽脂術獲得的脂肪組織中而得到，其附著在塑料培養皿上生長。特別地，本發明的來自脂肪的幹細胞是根據由本申請的申請人遞交的韓國專利申請No.10-2007-0050624、韓國專利申請No.10-2007-0042645、韓國專利註冊No.10-0679642或者韓國專利註冊No.10-0788632公開的內容分離並培養的來自脂肪組織的幹細胞。來自脂肪的幹細胞具有如下特徵(a)對⑶73、⑶90、⑶29、⑶44和⑶105全部都顯示陽性免疫應答，並對⑶133、⑶34、⑶45、⑶4、⑶31、⑶62p、⑶14和HLA-DR全部都顯示陰性免疫應答；並且(b)附著在塑料材料上生長，顯示紡錘形形態特徵，並在含有C0RM-2的培養基中形成球形以便長期保持未分化狀態。在本發明中，為了本發明的幹細胞的球形培養，分離的來自脂肪的多潛能性幹細胞在含有C0RM-2的MEBM培養基中培養，結果它們在接種後3天開始形成球形。這表明來自脂肪的幹細胞保持未分化狀態，因此具有高增殖率。而且，為了根據(但不限於)在上述專利文獻中描述的免疫學性質分析而檢查來自脂肪的幹細胞的免疫學特性，使用PBS清洗來自脂肪的幹細胞並用胰蛋白酶處理。收集處理後的細胞並以lOOOrpm離心5分鐘。棄去上清之後，使用2%FBSP和PBS混合物清洗細胞，接著以lOOOrpm離心5分鐘。此後，棄去上清，然後將細胞懸浮在PBS中並以1x10s個細胞的密度將每種樣品分散到孔板中。將抗體(R-共軛藻紅蛋白鼠抗-人單克隆抗體)放置到每個孔中，並且在冰上培養40分鐘以誘導其結合。培養後，將細胞懸浮液以lOOOrpm離心5分鐘。棄去上清之後，使用PBS清洗細胞兩次。然後，使用多聚甲醛固定細胞，得到的多潛能性幹細胞的表面抗原通過FACS進行分析。結果，本發明的來自脂肪的多潛能性幹細胞對於CD73(91%),CD90(97%),CD29(96%),CD44(83%)和CD105(80%)呈陽性。而且，分析了用於其它抗原的多潛能性幹細胞的免疫表現型，結果，這些細胞對於⑶133、CD34、CD45、CD4、CD31、CD62p、CD14和HLA-DR呈陰性。將來自脂肪的多潛能性幹細胞分別儲存在生理鹽水、生理鹽水+蔗糖、生理鹽水+蔗糖+5%白蛋白以及PBS+蔗糖中，然後分析其形成球形的能力。為此，將來自脂肪的多潛能性幹細胞以5xl04-lxl05個細胞/mL的濃度接種到含有無血清MEBM培養基(含有10yMC0RM-2、5ml抗生素-抗真菌素溶液(100X)、1yg/ml皮質醇、5yg/mL胰島素、20ng/mLEGF、40ng/mLFGF、B27和巰基乙醇)的6孔培養板的每個孔中並進行培養。結果，接種後3_7天幹細胞開始形成球形，並且甚至在接種後7-10天幹細胞也增殖形成球形。在本發明的一個實施例中，來自脂肪的幹細胞通過如下方式得到製備原材料，該原材料含有通過抽脂術或者具有連接的導管的一次性注射器得到的腫脹液和脂肪組織，將原材料進行支原體試驗和無菌試驗，從原材料中選擇滿足質量標準的樣品，將所選樣品離心成脂肪層和水層，使用膠原酶溶液對水層樣品進行預處理，然後在上述專利文獻公開的培養基中培養得到的細胞。根據本發明得到的來自脂肪的幹細胞可用於各種各樣的治療方案，其中身體的組織或器官通過所需細胞群如來自脂肪的幹細胞或者來自脂肪組織的幹細胞群的移入、移植或注入而擴增、修復或者替換。本發明的來自脂肪的幹細胞可用於替換或擴增現有組織以生長新的或者替代組織，或者將組織與生物組織或結構結合。根據本發明的方法得到的來自脂肪的幹細胞可被誘導分化成特定細胞譜系，包括分化成肌細胞。在一特定實施方式中，根據本發明的方法得到的來自脂肪的幹細胞被誘導分化以便在移植和體外治療方案中使用。在特定實施方式中，根據本發明的方法得到的來自脂肪的幹細胞被誘導分化成特定細胞類型，並且被基因工程化以提供治療性基因產品。來自脂肪的幹細胞分化成特定肌細胞可根據本領域已知的任何方法測定。可通過本領域公知的方法來確定幹細胞是否已經分化成肌細胞，例如使用諸如流式細胞儀或者免疫細胞化學等技術測定形態變化和細胞表面標記物(例如使用組織特異性或者細胞標記物特異性抗體對細胞進行染色)，或者通過使用光學顯微鏡或者共聚焦顯微鏡檢查細胞的形態，或者通過使用本領域公知的技術諸如PCR和基因表達譜測定基因表達變化。7、用於治療小便失禁的含有來自胎盤蛻膜或脂肪的幹細胞的試劑的開發本發明的用於治療小便失禁的含有來自胎盤蛻膜或脂肪的幹細胞的細胞治療劑基於以下原理來自胎盤蛻膜的幹細胞或者來自脂肪的幹細胞可增加漏尿點壓力，表現為內部尿道括約肌功能的改善，同時增加尿道括約肌的收縮性，表現為外部尿道括約肌功能的改善。在本文中，術語「漏尿點壓力」指的是尿液洩露時的膀胱內壓或者Valsalva漏尿點壓力，並且漏尿點壓力的降低是小便失禁的主要原因。在本發明中，為了測定來自胎盤蛻膜的幹細胞或者來自脂肪的幹細胞對小便失禁特別是漏尿點壓力的治療效果，將雌性裸鼠分成正常組、對照組和實驗組。然後，增加正常組、對照組(其中陰部神經被切除)和實驗組(其中陰部神經被切除，然後注射來自胎盤蛻膜的幹細胞或者來自脂肪的幹細胞)每組的膀胱內壓，並且測定每組中的漏尿點壓力。結果證明，根據本發明的來自胎盤蛻膜的幹細胞增加了漏尿點壓力，因此可被用作治療小便失禁的試劑。尿道括約肌由於自身的收縮性而起到調節排尿的作用，尿道括約肌收縮性減弱也是小便失禁的主要原因。在本發明中，為了測定來自胎盤蛻膜的幹細胞或者來自脂肪的幹細胞對小便失禁特別是尿道括約肌收縮性的治療效果，將雄鼠分成正常組、對照組和實驗組。然後，對每組的尿道組織部分施加電場刺激或者乙醯膽鹼藥物，測定每組中尿道括約肌的收縮性。結果證明，根據本發明的來自胎盤蛻膜的幹細胞或者來自脂肪的幹細胞增加了尿道括約肌的收縮性，因此可被用作治療小便失禁的細胞治療劑。8、用於治療小便失禁的含有來自胎盤蛻膜的幹細胞、來自月經液的蛻膜的幹細胞或者來自脂肪的幹細胞的細胞治療劑在本文中，術語「胎盤蛻膜」指的是在子宮的上皮細胞改性過程中形成的一種膜，使受精卵可移植到子宮壁上。在本文中，月經液含有宮頸粘液、陰道分泌物、子宮細胞、子宮上皮細胞和毛細血管血液，主要由形成細胞的蛋白質及類似物組成。這裡，從子宮流出並包含在月經液中的子宮上皮細胞被稱為「月經液蛻膜」。來自脂肪的幹細胞從通過抽脂術收集的脂肪組織中獲得，並附著到塑料上生長。如上所述，胎盤蛻膜和月經液蛻膜主要由子宮上皮細胞組成。在本發明的實施例中，僅僅專門證明了來自胎盤蛻膜的幹細胞對小便失禁的治療效果，但可以很容易推斷來自月經液蛻膜的幹細胞也具有治療小便失禁的效果。此外，來自脂肪的幹細胞也具有多潛能性，因此可以很容易推斷來自脂肪的幹細胞也可用於治療小便失禁。因此，對本領域技術人員來說顯而易見的是，本發明不僅能夠實現將含有胎盤蛻膜的幹細胞的用於治療小便失禁的細胞治療劑，而且還能夠實現將含有月經液蛻膜的幹細胞或者來自脂肪的幹細胞的用於治療小便失禁的細胞治療劑。實施例隨後，將參照實施例進一步對本發明進行描述。但是，應當理解的是，這些實施例僅用於說明的目的，而非對本發明的範圍的限制。實施例1根據本發明的幹細胞的分離和培養(1)來自胎盤蛻膜的幹細胞的分離和培養根據以本申請的申請人的名義提交的韓國專利公開No.10-2007-0101756A中描述的方法從胎盤中分離蛻膜。特別地，根據韓國大學醫學中心的機構審查委員會的指導，在韓國大學醫學中心Guro醫院裡，在正常分娩和早產的過程中收集胎盤並將其用於研究目的。將胎盤組織放入含有抗生素的生理鹽水中，在此狀態下將其轉移到實驗室。使用PBS清洗轉移到實驗室的胎盤組織以除去血細胞和各種其他組織，或者使用溶血緩衝液處理組織以除去血細胞，或者使用鑷子小心地分離構成胎盤的羊膜、絨毛膜、蛻膜和胎盤床組織。將分離的蛻膜組織置於100-mm皿中並使用消毒剪刀精細切割成l-2mm的尺寸。然後，將切割的組織置於含膠原酶的培養基中並在恆溫箱中在37°C培養1-4小時，此後將用膠原酶處理過的組織經過100-目金屬絲網過濾。將由此分離的細胞置於75-燒瓶中並在含有bFGF的DMEM中在5%C02條件下於37°C培養(圖1)。(2)來自脂肪的幹細胞的分離和培養在該實施例中使用的來自脂肪的幹細胞根據以本申請的申請人的名義提交的韓國專利註冊No.10-0679642中描述的方法進行分離。特別地，通過抽脂術從腹部區域分離11脂肪組織，並使用PBS清洗然後精細切割。切割的組織在含有1型膠原酶(lmg/ml)的DMEM中於37°C下消化2小時。消化的組織使用PBS清洗然後以lOOOrpm離心5分鐘。吸去上清，使用PBS清洗保留在底部的微團然後以lOOOrpm離心5分鐘。得到的微團經過100um篩過濾以去除雜質，接著使用PBS清洗。將得到的細胞在DMEM培養基(10%FBS，2mMNAC，0.2mM抗壞血酸)中培養。過夜後，使用PBS清洗未附著的細胞，並在角化細胞-SFM培養基(含有2mMNAC，0.2mM抗壞血酸，0.09mM鈣，5ng/mlrEGF,50ug/mlBPE，5iig/ml胰島素禾口74ng/ml皮質醇)中培養，同時以兩天為間隔更換培養基，由此分離出多潛能性幹細胞。實施例2來自胎盤蛻膜的幹細胞的增殖率檢查檢查了根據上述來自人胎盤蛻膜組織的多潛能性幹細胞的增殖方法得到的幹細胞的增殖率。通過在實施例1中描述的分離方法，從不同的人類個體的胎盤蛻膜組織樣品獲得了來自胎盤蛻膜的幹細胞，然後將其以2xl05個細胞的密度接種到75-燒瓶中。CPDL是表示細胞增殖率的指數，並以下列方程表示CPDL=In(Nf/Ni)/ln2其中，M初始接種細胞數；Nf最終細胞數來自蛻膜的幹細胞的CPDL根據傳代數進行觀察，結果，細胞在第12代顯示大約30的CPDL值。該CPDL值與來自人脂肪組織的幹細胞的CPDL值類似(Lin等人，stemcellsanddevelopment,1492,2005；Zuk等人，Tissueeng.，7211,2001)。這些結果表明，根據本發明的來自胎盤蛻膜的幹細胞具有非常高的增殖率(圖2)。實施例3來自胎盤蛻膜的多潛能性幹細胞的免疫學性質將在實施例1中得到的來自胎盤蛻膜的多潛能性幹細胞使用PBS清洗並用胰蛋白酶處理。然後，收集細胞並以lOOOrpm離心5分鐘。棄去上清之後，將細胞懸浮在PBS中並以lxlO5個細胞的密度分散到多孔板的每個孔中。將抗體(R-共軛藻紅蛋白鼠抗-人單克隆抗體)放置到每個孔中，並且將細胞在4°C下培養40分鐘。培養後，將細胞培養液以lOOOrpm離心5分鐘。棄去上清之後，使用PBS清洗細胞並以lOOOrpm離心5分鐘。然後，棄去上清之後，使用PBS清洗細胞並以1500rpm離心5分鐘。棄去上清之後，使用多聚甲醛固定細胞，並使用流式細胞儀進行分析。分析的結果為，根據本發明的來自胎盤蛻膜的幹細胞的免疫學性質可如下表1所示，細胞對CD29、CD90、Oct-4、SSEA-4和Cripto_l呈免疫表現型陽性，但對⑶31和⑶45呈陰性(圖4)。表1來自胎盤蛻膜的幹細胞的表面抗原分析(FACS分析)tableseeoriginaldocumentpage12抗原蛻膜-MSCsformulaseeoriginaldocumentpage13實施例4來自胎盤蛻膜的多潛能性幹細胞的0ct4和SSEA-4表達的分析將在實施例1中得到的來自胎盤蛻膜的幹細胞用PBS清洗三次並使用含有4%多聚甲醛的PBS固定30分鐘。使用PBS清洗3次後，將細胞用含有0.l%Triton-X100的PBS滲透10分鐘。使用PBS清洗3次後，使用封閉緩衝液(5%羊血清)處理細胞並在4°C下培養1小時，然後使細胞與含有初級抗體的封閉緩衝液反應過夜。在使用PBS清洗3次後，細胞與次級抗體在暗房裡反應1小時。在使用PBS清洗3次後，將細胞固定。結果，如圖5所示，根據本發明的多潛能性幹細胞對作為人胚胎幹細胞標記物的0ct4和SSEA-4呈陽性。而且，使用RT-PCR分析0ct4的表達。RT反應在37°C進行50分鐘，在70°C進行10分鐘；PCR反應在95°C進行10分鐘，40個循環，每個循環包括95°C30秒，58°C40秒以及72°C1分鐘，然後72°C10分鐘。結果，如圖6所示，可以看出來自蛻膜的幹細胞在800bp處表達。實施例5來自胎盤蛻膜的多潛能性幹細胞分化成肌細胞將在實施例1中得到的來自胎盤蛻膜的幹細胞分散到塗覆lOng/ml纖粘蛋白的燒瓶中，然後使用IOpM5'-氮雜胞苷預處理24小時。預處理之後，將細胞在SKBM(Cambrex,Co.)培養基中培養10天，接著進行免疫染色。結果，根據本發明的來自胎盤組織的多潛能性幹細胞對作為肌細胞特異性抗原的肌球蛋白呈陽性。該結果表明，根據本發明的來自人胎盤組織的多潛能性幹細胞分化成肌細胞(圖7)。實施例6注射了來自胎盤蛻膜的幹細胞的雌性裸鼠的漏尿點壓力測定(1)實驗動物模型的製備為了測定來自胎盤蛻膜的幹細胞對漏尿點壓力的效果，使用了56隻雌性裸鼠。將雌性裸鼠分成正常組(n=14)，對照組(n=14;其中陰部神經被切除)，實驗組l(n=14;在陰部神經切除2周後注射105個來自胎盤蛻膜的幹細胞)，和實驗組2(n=14；在陰部神經切除2周後注射107個來自胎盤蛻膜的幹細胞)。將每組再分成4周組(n=7)和8周組(n=7)，並在4周和8周時測定漏尿點壓力。對照組的製備使用三氟溴氯乙烷將14隻雌性裸鼠麻醉，並且將坐骨直腸窩雙向解剖以切除陰部神經。然後，將陰部神經電灼大約2cm，然後縫合皮膚。實驗組1和2的製備使用三氟溴氯乙烷將28隻雌性裸鼠麻醉，通過低中線切口打開腹部，然後剝離膀胱和尿道(圖8)。在陰部神經切除2周後出現小便失禁時，使用顯微鏡通過10-mlHamilton注射器將在實施例1中得到的105個來自胎盤蛻膜的幹細胞注射到14隻鼠中(實驗組1)，並將另外14隻注射107個細胞(實驗組2)。(2)漏尿點壓力測定使用氨基甲酸乙酯將雌性裸鼠麻醉(1.2g/kg)，並在T9-T10的水平下切除脊髓。然後，通過低中線切口打開腹部以剝離膀胱，隨後使用PE-90導管對膀胱進行恥骨上膀胱造口術。為了測定漏尿點壓力，將正常組、對照組和實驗組的每組雌性裸鼠置於垂直傾斜/膀胱壓力加緊模型中(圖9)。將150ml生理鹽水連接到PE-90管中，生理鹽水的高度每次都略微增加以便增大實驗鼠的膀胱壓力。在尿液洩露開始時記錄的壓力被定義為LPP(漏尿點壓力)。如圖10所示，正常組(N)，對照組(D)，實驗組1(P1)和實驗組2(P2)在4周時的漏尿點壓力分別為22.8士0.9,11.6士0.6,20.4士0.8和21.5士0.9cmH20(圖10A)，在8周時的漏尿點壓力分別為22.6士0.8,11.5士0.7,20.6士0.6禾口22.5士0.8cmH20(圖10B)。因此，從統計學上講，在4周和8周時，正常組和實驗組1和2的漏尿點壓力都高於對照組的漏尿點壓力，並且對照組的漏尿點壓力低於正常組的漏尿點壓力。因此，在以實施例1中製備的來自胎盤蛻膜的幹細胞給藥的實驗組1和2中，漏尿點壓力增加到與正常組類似的水平，表明來自胎盤蛻膜的幹細胞起到增加漏尿點壓力的作用。實施例7注射了來自脂肪的幹細胞的雌性裸鼠的漏尿點壓力的測定(1)實驗動物模型的製備為了測定來自脂肪的幹細胞對漏尿點壓力的效果，使用56隻雌性裸鼠。將雌性裸鼠分成正常組(n=14)，對照組(n=14；其中陰部神經被切除)，實驗組1(n=14；在陰部神經切除2周後注射105個來自脂肪的幹細胞)，和實驗組2(n=14；在陰部神經切除2周後注射107個來自脂肪的幹細胞)。將每組再分成4周組(n=7)和8周組(n=7)，並在4周和8周時測定漏尿點壓力。對照組的製備使用三氟溴氯乙烷將14隻雌性裸鼠麻醉，並且將坐骨直腸窩雙向解剖以切除陰部神經。然後，將陰部神經電灼大約2cm，然後縫合皮膚。實驗組1和2的製備使用三氟溴氯乙烷將28隻雌性裸鼠麻醉，通過低中線切口打開腹部，然後剝離膀胱和尿道(圖8)。在陰部神經切除後2周出現小便失禁時，用顯微鏡通過10-mlHamilton注射器將在實施例1中得到的105個來自脂肪的幹細胞注射到14隻鼠中(實驗組1)，並將另外14隻注射107個細胞(實驗組2)。(2)漏尿點壓力測定使用氨基甲酸乙酯將雌性裸鼠麻醉(1.2g/kg)，並在T9-T10的水平下切除脊髓。然後，通過低中線切口打開腹部以剝離膀胱，隨後使用PE-90導管對膀胱進行恥骨上膀胱造口術。為了測定漏尿點壓力，將正常組、對照組和實驗組的每組雌性裸鼠置於垂直傾斜/膀胱壓力加緊模型中(圖9)。將150ml生理鹽水連接到PE-90管，生理鹽水的高度每次都略微增加以便增大實驗鼠的膀胱壓力。在尿液洩露開始時記錄的壓力被定義為LPP(漏尿點壓力)。如圖11所示，正常組(N)，對照組(D)，實驗組1(P1)和實驗組2(P2)在4周時的漏尿點壓力分別為22.8士0.9,11.6士0.7,18.7士0.9和19.2士0.7cmH20(圖10A)，在8周時的漏尿點壓力分別為22.6士0.9,11.5士0.7,20.4士0.7和21.5士0.8cmH20(圖11B)。因此，可以確認，在以本發明的來自脂肪的幹細胞給藥的實驗組A1和A2中，漏尿點壓力在144周和8周時都增加了。而且，A2組漏尿點壓力高於A1組的漏尿點壓力，但二者之間沒有統計學上的差異(圖11)。實施例8注射了來自胎盤蛻膜的幹細胞的雄鼠的尿道括約肌收縮性的測定(1)實驗動物模型的製備為了測定來自胎盤蛻膜的幹細胞對尿道括約肌收縮性的影響，使用56隻雄鼠。將雄鼠分成正常組(n=14)，對照組(n=14；其中陰部神經被切除)，實驗組1(n=14；在陰部神經切除2周後注射105個來自胎盤蛻膜的幹細胞)，和實驗組2(n=14；在陰部神經切除2周後注射107個來自胎盤蛻膜的幹細胞)。將每組再分成4周組(n=7)和8周組(n=7)，並在4周和8周時測定尿道括約肌收縮性。對照組的製備使用三氟溴氯乙烷將14隻雄鼠麻醉，並且將坐骨直腸窩雙向解剖以切除陰部神經。然後，將陰部神經電灼大約2cm，然後縫合皮膚。實驗組1和2的製備使用三氟溴氯乙烷將28隻雄鼠麻醉，通過低中線切口打開腹部，然後剝離膀胱和尿道(圖8)。在陰部神經切除後2周出現小便失禁時，用顯微鏡通過10-mlHamilton注射器將在實施例2中得到的105個來自胎盤蛻膜的幹細胞注射到14隻鼠中(實驗組1)，並將另外14隻注射107個細胞(實驗組2)。(2)尿道括約肌收縮性的測量獲得每隻雄鼠的尿道後，將尿道螺旋切割，由此製備尿道組織切片(10X2mm)。在器官浴槽實驗中，使用C02/重碳酸鹽緩衝的Tyrode溶液對垂直室(verticalchamber)(20-ml體積)進行灌注，然後將尿道組織切片固定在室中。然後，使用乙醯膽鹼檢查尿道組織切片中尿道括約肌收縮性(圖12)。結果，如圖13所示，當在雄鼠實驗中進行現有技術中常規使用的電場刺激(EFS，60V)時，正常組(N)，對照組(D)，實驗組1(P1)和實驗組2(P2)的尿道括約肌收縮值在4周時分別為0.45士0.06,0.34士0.02,0.39士0.02和0.45士0.05g/張力，在8周時分別為0.44士0.06,0.35士0.02,0.41士0.04和0.46士0.03g/張力。因此，在電場刺激實驗中，實驗組在4周和8周時都顯示出比對照組更高的尿道括約肌收縮性，並顯示與正常組類似或更高的尿道括約肌收縮性。另外，實驗組2顯示出比實驗組1更高的尿道括約肌收縮性。同時，如圖14所示，將測試樣品使用乙醯膽鹼(Ach)處理時，正常組(N)，對照組(D)，實驗組1(P1)和實驗組2(P2)的尿道括約肌收縮值在4周時分別為0.54士0.04、0.28士0.03,0.52士0.02和0.54士0.03g/張力(圖14A)，在8周時分別為0.56士0.03、0.3士0.02、0.56士0.04和0.59士0.04§/張力(圖14B)。因此，當以乙醯膽鹼給藥時，正常組和實驗組1和2中尿道括約肌收縮性都高於D組，並且實驗組2顯示了比實驗組1更高的尿道括約肌收縮性，但二者之間不存在統計學上的差別。換言之，不能得出實驗組2顯示比實驗組1更高的尿道括約肌收縮性的結論。實施例9使用來自脂肪幹細胞給藥的雄鼠尿道括約肌收縮性的測定(1)實驗動物模型的製備為了測定來自脂肪的幹細胞對尿道括約肌收縮性的影響，使用56隻雄鼠。將雄鼠分成正常組(n=14)，對照組(n=14；其中陰部神經被切除)，實驗組1(n=14；在陰部神經切除2周後注射105個來自脂肪的幹細胞)，和實驗組2(n=14；在陰部神經切除2周後注射107個來自脂肪的幹細胞)。將每組再分成4周組(n=7)和8周組(n=7)，並在4周和8周時測定尿道括約肌收縮性。對照組的製備使用三氟溴氯乙烷將14隻雄鼠麻醉，並且將坐骨直腸窩雙向解剖以切除陰部神經。然後，將陰部神經電灼大約2cm，然後縫合皮膚。實驗組1和2的製備使用三氟溴氯乙烷將28隻雄鼠麻醉，通過低中線切口打開腹部，然後剝離膀胱和尿道(圖8)。在陰部神經切除後2周出現小便失禁時，用顯微鏡通過10-mlHamilton注射器將在實施例1中得到的105個來自脂肪的幹細胞注射到14隻鼠中(實驗組1)，並將另外14隻注射107個細胞(實驗組2)。(2)尿道括約肌收縮性的測定獲得每隻雄鼠的尿道後，將尿道螺旋切割，由此製備尿道組織切片10X2mm)。在器官浴槽實驗中，使用C02/重碳酸鹽緩衝的Tyrode溶液對垂直室(verticalchamber)(20-ml體積)進行灌注，然後將尿道組織切片固定在室中。然後，使用乙醯膽鹼檢查尿道組織切片中尿道括約肌的收縮性(圖12)。結果，如圖15所示，當在雄鼠實驗中進行現有技術中常規使用的電場刺激(EFS，60V)時，正常組(N)，對照組⑶，實驗組1(A1)和實驗組2(A2)的尿道括約肌收縮值在4周時分別為0.46士0.08,0.32士0.03,0.35士0.03和0.38士0.03g/張力，在8周時分別為0.44士0.06,0.31士0.02,0.39士0.02和0.44士0.05g/張力。因此，在電場刺激實驗中，N組和A組的尿道括約肌收縮性在4周和8周時都高於D組，並且A2與A1之間沒有差別。同時，如圖16所示，將測試樣品使用乙醯膽鹼(Ach)給藥時，正常組(N)，對照組(D)，實驗組1(A1)和實驗組2(A2)的尿道括約肌收縮值在4周時分別為0.54士0.05、0.29士0.04、0.48士0.03和0.51士0.05g/張力，在8周時分另ij為0.55士0.05、0.29士0.03,0.55士0.02和0.54士0.05g/張力。因此，當以乙醯膽鹼給藥時，正常組和實驗組1和2中尿道括約肌的收縮性都高於D組，並且實驗組1與實驗組2之間沒有差別。實施例10注射了來自胎盤蛻膜的幹細胞的鼠組織的免疫染色根據上述實施例6-8在4周和8周測定了漏尿點壓力和尿道括約肌收縮性之後，收集每種尿道組織並使用已經在液氮中冷卻的2-甲基丁烷無損傷冷凍。將尿道組織冷卻並切片，然後進行H/E染色。同樣，為了觀察幹細胞分化成平滑肌和骨骼肌，使用DAPI、肌動蛋白(a-SMA)和肌球蛋白重鏈(MyHC)對組織進行免疫染色，並在螢光顯微鏡下進行觀察。結果，如圖17所示，在根據實施例6的雌性裸鼠的正常尿道括約肌中，平滑肌豐富，並且骨骼肌被微弱染色(圖17的「A」、「B」和「C」)。在陰部神經切除後，可觀察到平滑肌的數量減少(圖17的「D」，「E」和「F「)。當在4周(圖17的「G」、「H」「I」)和8周(圖17的「J「、」K「和」L「)注射來自胎盤蛻膜的幹細胞時，平滑肌被染成淺綠色，表明平滑肌的數量增加。而且，在平滑肌之間，觀察到被紅色和綠色共染的黃細胞。在MyHC染色中，骨骼肌被染成非常微弱的綠色，並且在平滑肌細胞之間注射的細胞顯示紅色。而且，如圖18所示，如上所述，因為雄鼠的尿道在實施例8中被螺旋切割，所以不能觀察到最初的尿道形狀；但是，在尿道括約肌收縮性實驗之後可以觀察到PKH在組織中表達(圖18的「A「和"B「)，表明注射的來自胎盤蛻膜的幹細胞有助於尿道括約肌的收縮。作為參考，PKH是用於活細胞螢光染色的物質，並且在該實施例中，來自胎盤蛻膜的幹細胞在注射之前被PKH(紅色)標記。總之，在其中構建了與小便失禁患者類似的強迫性小便失禁的動物模型的實施例6到8中，來自胎盤蛻膜的幹細胞的注射增加了小便失禁裸鼠模型的漏尿點壓力，並增加了小便失禁鼠模型的尿道括約肌收縮性。漏尿點壓力沒有根據注射的幹細胞數目發生極大改變，但是尿道括約肌的收縮性隨著注射的幹細胞的數目增加而增加。這表明根據本發明的來自胎盤蛻膜的幹細胞也可被用作小便失禁患者的極佳的細胞治療劑。如上所述，胎盤蛻膜和月經液蛻膜主要由子宮上皮細胞構成。在本發明的實施例中，僅特別證明了來自胎盤蛻膜的幹細胞的小便失禁的治療效果，但可以很容易推斷，來自月經液蛻膜的幹細胞也具有治療小便失禁的效果。實施例11注射了來自脂肪的幹細胞的鼠組織的免疫染色根據上述的實施例7-9在4周和8周測定了漏尿點壓力和尿道括約肌收縮性後，收集每種尿道組織並使用已經在液氮中冷卻的2-甲基丁烷無損傷冷凍。將尿道組織冷凍並切片，然後進行H/E染色。同樣，為了觀察幹細胞分化成平滑肌和骨骼肌，使用DAPI、肌動蛋白(a-SMA)和肌球蛋白重鏈(MyHC)對組織進行免疫染色，並在螢光顯微鏡下進行觀察。結果，如圖19所示，在實施例7中製備的裸鼠的正常尿道括約肌中，平滑肌豐富，並且骨骼肌被微弱染色(圖19的「A」、「B」和「C」)。在陰部神經切除之後，可觀察到平滑肌的數量減少(圖19的「D」，「E」和「F「)。當注射(8周時)來自脂肪的幹細胞時，平滑肌被染成綠色，表明平滑肌的數量增加。而且，在平滑肌之間，觀察到被紅色和綠色共染的黃細胞。在MyHC染色中，骨骼肌被染成非常微弱的綠色，並且在平滑肌細胞之間注射的細胞顯示紅色。而且，如圖20所示，如上所述，因為雄鼠的尿道在實施例9中被螺旋切割，所以不能觀察到最初的尿道形狀；但是，在尿道括約肌收縮性實驗之後可以觀察到PKH在組織中表達(8周；圖20的「A「和"B「)，表明注射的來自脂肪的幹細胞有助於尿道括約肌的收縮。作為參考，PKH是用於活細胞螢光染色的物質，並且在該實施例中，來自脂肪的幹細胞在注射之前被PKH(紅色)標記。工業實用性如上所述，根據本發明的來自胎盤或月經液的蛻膜的幹細胞或者來自脂肪的幹細胞具有極好地分化成肌細胞的能力，因此顯示出了使漏尿點壓力增加和提高尿道括約肌收縮性的效果。所以，幹細胞可用作治療小便失禁的試劑。雖然已經根據特定特徵對本發明進行了詳細描述，但對本領域技術人員來說顯而易見的是，該描述僅用於優選實施例，而不是限制本發明的範圍。因此，本發明的實際範圍將由所附的權利要求書及其等同物來限定。權利要求一種用於治療小便失禁的細胞治療劑，其含有作為活性成分的來自胎盤或者月經液的蛻膜的幹細胞或者來自脂肪的幹細胞。2.根據權利要求1的用於治療小便失禁的細胞治療劑，其特徵在於，來自胎盤蛻膜的幹細胞具有如下特徵(a)對⑶29和⑶90顯示免疫表現型陽性，但對⑶31和⑶45顯示免疫表現型陰性；(b)對0ct4、SSEA-4和Cripto_l顯示免疫表現型陽性；(c)附著在塑料上生長，具有圓形或者紡錘形的形態特徵，並在SFM培養基中形成球形以便長期保持未分化狀態；以及(d)具有分化成肌細胞的能力。3.根據權利要求1的用於治療小便失禁的細胞治療劑，其特徵在於，來自脂肪的幹細胞具有如下特徵(a)對CD73、CD90、CD29、CD44和CD105都顯示陽性免疫應答，並對CD133、CD34、CD45、⑶4、⑶31、⑶62p、⑶14和HLA-DR都顯示陰性免疫應答；(b)附著在塑料上生長，具有紡錘形形態特徵，並在含有C0RM-2的培養基中形成球形以便長期保持未分化狀態。全文摘要本發明涉及用於治療小便失禁的細胞治療劑，具體涉及用於治療小便失禁的含有來自胎盤或月經液的蛻膜的幹細胞或者來自脂肪組織的幹細胞的細胞治療劑。來自蛻膜的幹細胞或者來自脂肪組織的幹細胞顯示出了使漏尿點壓力增加和提高尿道括約肌收縮性的作用，因此作為治療小便失禁的試劑十分有用。文檔編號A61K9/26GK101801352SQ200880024249公開日2010年8月11日申請日期2008年12月1日優先權日2007年11月30日發明者曹政允,李恆永,羅正燦,金允正申請人:Rnl生物技術株式會社