基於微流控晶片的基因治療乳腺癌的藥物的製備方法
2024-01-19 13:41:15 1
專利名稱：基於微流控晶片的基因治療乳腺癌的藥物的製備方法
技術領域：
本發明涉及計算機科學、分子生物學、醫學及微流控晶片技術。特別提供了一種基
於微流控晶片的基因治療乳腺癌的藥物的製備方法。
背景技術：
癌症是一種基因性疾病，在基因水平進行診斷和治療是最基本和最準確的方法。 細胞癌變是一個以多種原癌基因的激活和抑癌基因的失活為基礎的過程，因此，在進行基 因診斷時，往往需要對多種基因的表達水平進行綜合的判斷。目前，癌症的診斷往往是在 體外進行，通過對血液和組織檢驗結果等進行判斷，還遠遠沒有達到單細胞水平。並且， 體外診斷和體內治療是兩個相對獨立的環節，抗癌藥物對正常細胞往往也造成較大的損 傷。如何將抗癌藥物特異性的釋放到腫瘤細胞，提高治療的靶向性，是生物醫學工作者們 致力解決的難題。迄今為止，有多種方法和技術被應用於藥物的靶向釋放中，如利用病毒 (文獻Cancer Gene Ther即y， 2008， 15， 667-675)、納米顆粒(文獻Gene Ther即y， 2000， 7， 1896-1905)以及微流控晶片(文獻Lab On A Chip, 2006， 6， 1384-1386)等攜帶藥物，但由 於這些體系缺少了 "診斷"這一環節，因此還不能做到最為準確的靶向"治療"。
2004年，Sh即iro小組報導了 一種可控制基因表達的生物分子計算機(文獻 Nature, 2004， 429， 423-429)，在試管內模擬了微小的DNA計算機進入細胞後，通過多次的 雜交、酶連、酶切反應，對前列腺癌和肺癌多種相關基因的表達情況依次進行計算，並在診 斷成立時，釋放一條較短的單鏈核酸分子作為藥物進行治療。該計算機首次將診斷和治療 兩個相對獨立的環節聯繫起來，並將診斷和治療定位在單細胞水平，提高了藥物釋放的靶 向性，為解決癌症的靶向治療提供了新的研究方向。但這種DNA計算機如要進一步進行體 內試驗尚存在以下幾點不足1、該計算機所有的生化反應是在試管中進行的，DNA計算機 要進入體內行使功能，必然需要一種有效的載體攜帶著DNA分子和酶將其傳遞到相應的靶 點，防止DNA分子在計算前就被降解掉，顯然試管不能成為這種有效的載體；2、對多種癌症 相關基因表達情況採用依次進行(串聯)的計算方式，並且每計算一種基因需要引入多種 高濃度的外源性分子，有可能會影響到細胞的正常生理功能；3、該計算機必須要進入細胞 內才能行使功能，增強了操作難度；4、最為重要的一點，該計算機採用限制性內切酶(Fok I 酶)進行酶切反應，限制性內切酶僅存於低等生物內(如細菌、病毒等)，可在特定位點可將 雙鏈DNA分子切斷，因此有可能對高等生物的基因組產生影響。綜上所述，若要將DNA計算 機應用於基因診斷和治療中，必須要有更為合理的計算方法和更為理想的平臺。另外，上述 體系中所釋放的為預先已經存在的藥物，一種更為靈活的方法為根據需要合成治療藥物然 後釋放(文獻NatureBiotechnology，2003，21， 1184-1191)。 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，隨著經濟水平的提高和生活方式的改變，其發 病率逐年上升，並有年輕化趨勢，在一些大城市已躍居女性惡性腫瘤的首位。全世界每年約 有120萬婦女患乳腺癌，約50萬人死於此病，轉移和復發是患者常見的死亡原因。目前的 診斷手段主要有體格檢查、X線、B超、遠紅外線掃描、CT、組織穿剌活檢等，但多數人在檢
5查時已有病灶，甚至已經到了中晚期。目前的治療手段主要採取手術切除，輔以放療、化療、內分泌治療等，這些方法對病人生理、心理的傷害較大，且5年存活率不高。科學家早已知道，引發癌症的導火索是細胞內基因發生變化。乳腺癌也是一種基因性疾病，其發生和發展是一個多階段演進、多基因改變的漸進過程。其內在機制在於原癌基因與抑癌基因之間失去平衡，表現為多個原癌基因的異常激活和編碼蛋白過度表達以及抑癌的缺失、突變失活導致細胞增殖失控而惡性轉化。這些基因變化的相互作用，特別是其疊加作用，是乳腺發生癌變的重要分子基礎。因此，在基因水平進行乳腺癌的診斷和治療，是更為準確、有效、耙向性更強的方法。
乳腺癌等的基因診斷背景知識 1)與乳腺癌相關的原癌基因原癌基因為人體細胞固有的基因，其表達產物在正常狀態下為細胞增殖分化所必需，在突變、擴增、重排、過表達等特定條件下，被激活誘導細胞發生惡變，導致抑制細胞凋亡、細胞過度增殖和侵襲轉移等。與乳腺癌相關的原癌基因有C-erbB-2、EGFR、c-myc、ras、int-2、bcl-2、BAG-l、BCSG-2、survivin等。其中C-erbB-2已被公認為是乳腺癌腫瘤標誌物檢測中的一個金標準。它是一種細胞來源的原癌基因，翻譯的糖蛋白pl85可以促進細胞分裂和蛋白水解酶的分泌，使DNA合成增加，癌細胞生長加快，並增強細胞的運動能力，從而促進腫瘤侵襲和轉移。C-erbB-2在正常乳腺細胞中低表達，而在20X 30X的乳腺癌中有C-erbB-2的擴增和(或)過度表達。其高表達提示細胞增殖旺盛、侵襲力強，患者對化療、內分泌治療效果欠佳，預後差。 2)與乳腺癌相關的抑癌基因抑癌基因在突變、缺失、甲基化、低表達等條件下，喪失維持細胞正常生理功能的作用，細胞易發生癌變。與乳腺癌相關的原癌基因有P53、nm23、PTEN、Rb、P16、P21、CHEK2、服CAl、服CA2等。P53是至今發現的與人類腫瘤相關性最為密切的基因。在人類乳腺癌的突變率為15% 60%。 p53基因分為野生型和突變型兩種。野生型p53能抑制多種原癌基因，為一種抑癌基因，它能夠誘導終末分化、維持基因穩定，觸發衰老和誘導細胞凋亡，是負生長調控因子，正常細胞內p53基因為野生型。突變型P53基因失去了野生型p53基因抑制細胞增殖的正常功能，並且具有了癌基因的特性。突變型p53高表達的乳腺癌具有強的侵襲力、轉移力，並與淋巴結轉移密切相關，預後不良，可作為判斷乳腺癌預後的一個重要指標。nm23，又稱為腫瘤轉移抑制基因，為人類正常基因，廣泛存在於機體細胞膜和細胞漿上。目前一般認為nm23是通過影響微管裝配、信號轉導、翻譯調節及細胞黏附而維持細胞的正常分裂狀態，從而抑制癌細胞的侵襲、轉移。其高表達與淋巴結轉移及遠處轉移呈負相關，與生存率呈正相關，對判斷乳腺癌淋巴結轉移和評估預後具有重要意義。BRCA1、BRCA2為腫瘤易感基因，這兩個基因發生變異的女性，有40X 80%的患乳腺癌的危險，且預後不好。可作為腫瘤預測基因，用於乳腺癌早期監控。
3)基因診斷採用的方法和平臺說明 基因診斷主要採用PCR、實時螢光定量PCR(RT-PCR) 、Southern印跡、斑點印跡、螢光原位雜交(FISH)等方法反映基因擴增情況。藉助的平臺主要為試管、基因晶片和微流控晶片等。 基因晶片又稱為生物晶片，採用微陣列的方式，將上萬種寡核苷酸或DNA樣品，密集排列在矽片、玻片、聚丙烯或尼龍膜等固相支持物上。通過雷射共聚焦螢光顯微鏡獲取信息，經電腦系統處理，分析所得資料。基因晶片具有大規模、高通量的優勢，能將腫瘤發展過
6程中多個基因作為一個"基因群"來研究。 微流控晶片，又稱為晶片實驗室，(lab-on-a-chip)，指的是在一塊幾平方釐米的晶片上構建的化學或生物實驗室。它可將單細胞捕獲、裂解、DNA固相萃取、PCR、電泳、雷射誘導螢光檢測等集成在一塊幾平方釐米的晶片上完成。它不僅具有高通量的優勢，更具有了上述基因晶片所不具備的集成化、自動化的優勢，在未來的基因診斷中具有廣泛的應用前景。 4)基因治療隨著分子生物學技術及免疫學技術的迅猛發展和人類對乳腺癌發病機制認識的不斷深入，基因治療逐漸成為腫瘤生物學治療中的重要組成部分。基因治療在乳腺癌的治療中顯示出良好的應用價值，並且取得了一定的效果，將日漸成為一項有前景的治療選擇。 乳腺癌的基因治療的方法有①抑制原癌基因的活性；②導入抑癌基因；③自殺基因療法治。自殺基因因為一些來自低等生物的基因編碼的酶類，能使一些藥物前體發生轉化而獲得對哺乳動物細胞的毒性。將這種外源性酶解前藥基因導入腫瘤細胞，再配伍用相應的藥物前體，可使腫瘤細胞表達其編碼產物將無毒的前藥成分酶解成為有毒性的物質而"自殺"，故稱為"自殺基因"(suicidegene)，即藥物敏感基因。這類基因包括單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-tK)基因，水痘-帶狀皰疹病毒胸苷激酶(VZV-tK)基因，胞嘧啶脫氨酶(cytosine deaminase,CD)基因等。其中研究最深入且與腫瘤基因治療關係最密切的是HSV-tK基因和CD基因。有報導，HSV-tK能特異性地將核苷類似物更昔洛韋(ganciclovir,GCV)代謝為毒性產物。用GCV治療已轉有HSV-tK基因的乳腺癌大鼠模型，可以觀察到腫瘤排斥現象。皰疹病毒的tk基因與哺乳動物細胞內的tk基因不同，它可以催化一些核苷類似物(nucleotide analogs, Nas)的磷酸化，如ACV， GCV等，終產物NasTP可幹擾、抑制宿主細胞DNA的合成，最終導致細胞死亡。自殺基因應用到腫瘤治療，主要由於其能引發有效的"旁觀者效應"，是指只要使部分腫瘤細胞導入外源自殺基因，其鄰近的即使未導入自殺基因的大部分腫瘤細胞也會被殺死，從而放大了自殺基因對腫瘤的治療作用。發生的機制比較複雜，目前認為以下因素與其有關(l)細胞間縫隙連接；(2)細胞凋亡與吞噬；(3)免疫炎症反應；(4)抗腫瘤血管生成等。其作用機理如圖21所示。 基因治療中常用的載體利用載體將外源基因轉入靶細胞是基因治療的基礎和關鍵步驟，用於轉染基因的載體包括病毒載體和非病毒載體。病毒載體由於具有高效、血清滴度高、容量大、低毒、易於分離等優點而成為基因治療中應用最為廣泛的載體。逆轉錄病毒載體是目前研究最多、最為成熟的載體，感染效率高，能持續表達，可以把外源基因以前病毒的形式轉移到靶細胞基因組中，但其攜帶外源基因的容量較小，且感染特異性不高，只能轉導分裂細胞，重組病毒的滴度較低，不造於治療大腫瘤。另外，它可被血漿中的補體滅活，也有引起異常突變和激活癌基因的可能。 腺病毒載體是近年來常用的載體。重組腺病毒可有效地將外源基因轉移並表達於多種細胞中，感染效率高，可攜帶的基因較大，致死性和致瘤性低，使用安全。腺病毒介導的基因轉染在乳腺癌中顯示出極高的基因轉染效率。但也有其缺點治療基因為隨機的非特異性轉染病毒抗原可誘導機體產生免疫反應，限制了重複使用；重組腺病毒可導致轉染細胞毒性及細胞死亡，使基因表達時間受限；對肝細胞有損傷作用。其他可用於基因轉導的載體還有腺相關病毒載體、脂質體等。
乳腺癌基因治療目前存在問題(l)缺乏高效、特異的導向性載體要求降低病毒載體的潛在致瘤性，不損傷正常的細胞。(2)基因表達的可控性問題現在的研究趨向於用組織和腫瘤特異性的基因啟動子控制靶基因表達。 人們期望獲得一種技術效果更佳的基於微流控晶片的基因治療乳腺癌的藥物的製備方法。
發明內容
本發明的目的是設計一種基於微流控晶片的基因治療乳腺癌的藥物的製備方法。所述基因治療乳腺癌的抗癌藥物具有自動檢測且能夠在條件滿足時自動合成並靶向釋放的能力。 我們使用DNA計算機(優選以微流控晶片為載體)，對與乳腺癌相關的多種基因表達情況同時進行計算，並於診斷成立時，自動合成完整的自殺基因作為有效的抗癌藥物釋放，而在診斷不成立時，釋放的僅為無效的片段化的藥物。 我們在一塊幾平方釐米的微流控晶片上，在體外驗證了該DNA計算機原理的可行性。模擬了更為微型化的微流控晶片DNA計算機進入體內後，無需進入細胞，可以通過微量的細胞質，即可進行基因診斷並治療的過程。計算中採用的分子種類和數量均較少，使用的酶為高等生物體內存在的DNA連接酶。隨著納米材料和微加工技術的發展，有望開展進一步的體內試驗。 DNA計算機是基於DNA分子生化反應的新型生物計算機。具體地說，就是代表一定信息的DNA分子作為"輸入"，經過雜交、變性、酶連、酶解等可控的生化反應進行"計算"，反應後生成的新的或符合某種要求的DNA分子作為"輸出"。計算過程中往往需要酶的參與，如限制性內切酶、DNA連接酶、外切核酸酶等。 按照DNA計算機的實現方式，DNA計算機經歷了試管(文獻Science, 1994,266，1021-1024)、表面(文獻Nature, 2000， 403， 175-179)和晶片(文獻Lab 0nAChip， 2005， 5，1033-1040)三個階段。將DNA分子固定在表面上的計算方式，可以克服試管中DNA分子易丟失和操作難、檢測難的特點，但多個計算步驟仍須在人工幹預下間斷進行。微流控晶片具有比表面更為明顯的優勢，不僅可將計算用的某種DNA分子以三維立體的方式固定在晶片的局部，並且具有高度集成化、自動化、小型化、微型化的特點，DNA計算所需的多個生化反應，均可在一塊微小的晶片上連續完成。因此晶片有可能取代試管和表面，成為DNA計算機一種理想的平臺。 與傳統的電子計算機相比，DNA計算機具有並行性高、運算速度快、信息存儲量大等優點，被用於研究解決複雜的數學難題(文獻ProceedingsOf The National Academy OfSciences Of The United Stated States OfAmerica，2004， 101，9960-9965)。此夕卜，由於其具有生物相容性，科學家們力圖將其應用到生命科學領域中，用於癌症的診斷和治療(文獻ScientificAmerican， 2006， 294， 44-51)。 本發明具體提供了一種基於微流控晶片的基因治療乳腺癌的藥物的製備方法，其特徵在於所述基因治療乳腺癌的抗癌藥物具有自動檢測且能夠在條件滿足時自動合成並靶向釋放的能力； 所述基因治療乳腺癌的藥物的製備方法具體是使用作為運算介質的生物分子，
8通過生化反應，對與癌症相關的所有原癌基因和抑癌基因中的至少一種或其組合的表達情 況進行計算；當計算結果符合要求時自動合成並靶向釋放有效的抗癌藥物完整的自殺基 因； 在其所述的計算過程中，所述作為運算介質的生物分子具體是DNA分子和/或 酶； 與乳腺癌相關的原癌基因包含有C-erbB-2、 EGFR、 c-myc、 ras、 int_2、 bcl-2、 BAG-l、BCSG-2、survivin ;與乳腺癌相關的抑癌基因包含有P53、nm23、PTEN、Rb、P16、P21、 CHEK2、BRCA1、BRCA2。 所述基於微流控晶片的基因治療乳腺癌的藥物的製備方法中，作為運算介質的 DNA分子具體為與每種癌症相關基因相對應的計算分子和藥物片段分子，以及帶有多個 缺口的不完整的自殺基因分子；所述自殺基因分子上缺口的序列和數量與藥物片段分子的 序列和數量相對應。所述作為運算介質的DNA分子中，與每種癌症相關基因相對應的計算 分子和藥物片段分子為單鏈DNA分子，帶有缺口的不完整的自殺基因分子為雙鏈DNA分子。
所述基於微流控晶片的基因治療乳腺癌的藥物的製備方法中，當被檢測對象中對 應的癌症相關基因表達超出正常範圍(升高或降低都會超出正常範圍)時，超出部分的癌 症相關基因可將全部或部分的藥物片段分子從其與計算分子的匹配關係中置換取代下來， 使原有的計算分子與癌症相關基因雜交的結構變為新的更為穩定的結構；
當癌症相關基因的表達不符合診斷標準時，亦即藥物片段分子中的部分或者全部 沒有從其與計算分子的匹配關係中被置換取代下來時，就不能與帶有缺口的不完整的自殺 基因分子結合形成完整的自殺基因分子從而具有抗癌作用。 所述基於微流控晶片的基因治療乳腺癌的藥物的製備方法中所述作為運算介質 的酶為T4DNA連接酶；所述基因治療乳腺癌的抗癌藥物中的藥物片段分子與計算分子在結 構上互補，其二者能夠實現雜交；具體而言，所述藥物片段分子與不完整的自殺基因分子上 的缺口序列相同；藥物片段分子在T4DNA連接酶的作用下能夠將不完整的自殺基因上的缺 口填補，使其形成完整的自殺基因； 相對於藥物片段分子而言，癌症相關基因與計算分子互補序列較長，癌症相關基 因更易於與計算分子雜交而將藥物片段分子取代下來。 當癌症相關基因將相應的藥物片段分子從其與計算分子的匹配對應關係中取代 下來後，被取代下來的藥物片段分子在電場作用下靶向釋放到對應的目的區域(其後的輸 出單元)；從而與不完整的自殺基因在T4DNA連接酶體系中合成具有抗癌作用的完整藥物。
當癌症相關基因將相應的藥物片段分子從其與計算分子的匹配對應關係中取代 下來後，從計算單元傳遞來的藥物片段分子被輸送到特定的目標區域和不完整的自殺基因 雜交並在T4DNA連接酶的作用下進行酶連反應，將相應的缺口填補；所述的特定目標區域 中包含有不完整的自殺基因； 當癌症相關基因的表達符合要求(即原癌基因表達升高高於正常限制值並且抑 癌基因表達降低低於正常限制值)時，相應的藥物片段將不完整的自殺基因上的缺口全部 填補，此時即有完整的自殺基因被合成並作為抗癌藥物釋放； 只要有一種基因表達不符合診斷標準，缺口就不會被完全填補，對應地就不能有 完整的自殺基因被合成，釋放的僅為沒有抗癌作用的不完整的自殺基因。
所述基於微流控晶片的基因治療乳腺癌的藥物的製備方法依據載體微流控晶片 實施，所述微流控晶片在結構上具體分為三個功能單元輸入單元、計算單元和輸出單元； 其中，計算單元布置在輸入單元和輸出單元之間，這三個單元之間液體流路順序聯接，並在 電場作用下可以形成藥物片段分子的定向移動控制；如前所述並可參照附圖2理解。作為 載體的微流控晶片，材料可為石英、玻璃、P匿A、PC聚合物等； 所述基於微流控晶片的基因治療乳腺癌的藥物的製備方法中，計算分子固定在作 為載體的微流控晶片的計算單元上；藥物片段分子預先雜交在計算分子上；不完整的自殺 基因和T4DNA連接酶體系預先放置在輸出單元中。 當原癌基因分子活抑癌基因分子這兩類癌症相關基因將相應的藥物片段分子從 其與計算分子的匹配對應關係中取代下來時，被取代下來的藥物片段分子在電場的作用下 靶向釋放到對應的目的區域(其後的輸出單元)；從而與不完整的自殺基因在T4DNA連接 酶體系中合成具有抗癌作用的完整藥物(當然前提是所有的被取代下來的藥物片段分子 能填補不完整的自殺基因的所有缺口使其能形成真正具有抗癌作用的完整藥物)。
在微流控晶片的輸出單元，從計算單元傳遞來的藥物片段分子和不完整的自殺基 因雜交並在T4DNA連接酶的作用下進行酶連反應，將相應的缺口填補； 當癌症相關基因的表達符合要求(即原癌基因表達升高並且抑癌基因表達降低) 時，相應的藥物片段將不完整的自殺基因上的缺口全部填補，此時即有完整的自殺基因被 合成並作為抗癌藥物釋放； 只要有一種基因表達不符合診斷標準，缺口就不會被完全填補，對應地就不能有 完整的自殺基因被合成，釋放的僅為沒有抗癌作用的不完整的自殺基因。
藥物片段分子與不完整的自殺基因上的缺口序列相同，可在T4DNA連接酶的作用 下將缺口填補。分子之間的關係詳見圖l。 所述基於微流控晶片的基因治療乳腺癌的藥物的製備方法中，將計算分子固定在 作為載體的微流控晶片的計算單元的具體過程是將末端修飾有丙烯醯胺基團或氨基基團 的計算分子溶解於丙烯醯胺溶液中，終濃度為5 20ym ;經紫外曝光後，固定在丙烯醯胺 水凝膠中。(固定在水凝膠中的計算分子可保持活性，可進行雜交、變性等反應。丙烯醯胺 水凝膠為一種透明的基質，在沒有電場作用下，可起到閥的作用；在低壓電場作用下，可允 許DNA分子通過。) 所述作為載體的微流控晶片中，輸入單元含有多個(根據實際需要確定可用範 圍，通常的可用範圍是1 300)樣品池，樣品池的數目依據診斷的需要而定，不同的癌症相 關基因通常分別由不同的樣品池輸入。 所述微流控晶片中的計算單元具體為分別與各個樣品池相連的同等數量的並行 通道；每個通道裡含有與癌症相關基因相對應的計算分子和藥物片段分子，分別對不同基 因的表達情況進行計算並傳遞相應藥物片段，不同通道的計算是同時獨立進行的，互不幹 擾； 所述微流控晶片中的輸出單元含有一條通道和一個酶連池，酶連池中含有不完整 的自殺基因分子和T4DNA連接酶反應體系；從計算單元不同通道傳遞來的藥物片段分子通 過輸出單元的通道匯集到酶連池中進行酶連反應； 在輸出單元的通道中固定了一段空白水凝膠，它不僅可以起到閥的作用，並且由
10於水凝膠有濃縮DNA分子的作用，從計算單元傳遞來的藥物片段分子在此處檢測要比在酶 連池中檢測更為靈敏，參見圖2。 所述基於微流控晶片的基因治療乳腺癌的藥物的製備方法還滿足下述兩種要求 之一 其一，在計算原癌基因表達是否升高並在其升高時能以對應的量取代相應藥物片 段的微流控晶片的計算單元的通道中，固定有兩塊水凝膠；第一段水凝膠中僅固定相應的 計算分子；第二段水凝膠中所固定的計算分子上，還預先雜交有相應的藥物片段分子；
當所述原癌基因分子(即含有癌症相關基因的待檢測分子中的一類，另一類待檢 測分子是抑癌基因)在低壓電場作用下，進入第一段水凝膠，和相應的計算分子雜交而被 其捕獲；捕獲的速度與原癌基因分子的濃度呈相關性； 當基因表達在正常範圍的上限時，經過一定時間的電泳，原癌基因恰好走到第一
段水凝膠的另一側邊緣；而當基因表達升高時，由於雜交的速度更快，經過相同時間的電
泳，升高部分的原癌基因可穿過第一段水凝膠，到達其下遊，並在電場作用下，進入第二段
水凝膠和計算分子雜交，而將相應的藥物片段分子取代下來，取代的量與基因表達升高的
量相對應，取代下來的藥物片段分子在電場的作用下進一步傳遞到輸出單元。 其二，在計算抑癌基因表達是否降低並取代相應藥物片段的微流控晶片的計算單
元的通道中，固定有兩段水凝膠第一段水凝膠中固定相應的計算分子，並預先雜交有相應
的藥物片段分子；第二段水凝膠為空白水凝膠，僅起到閥的作用，不參與計算； 所述抑癌基因分子在低壓電場作用下，首先進入第一段水凝膠，將相應的藥物片
段分子取代下來(取代的速度與抑癌基因分子的濃度呈相關性)； 當抑癌基因表達在正常範圍下限時，經過一定時間的電泳，抑癌基因恰好走到第 一段水凝膠的另一側邊緣，將所有的藥物片段分子全部取代下來，被取代下來的藥物片段 分子隨後被棄除；當抑癌基因表達降低時，由於取代速度變慢，經過相同時間的電泳，仍有 一部分藥物片段不會被取代下來而保留在水凝膠中，取代下來的部分被棄除。保留在水凝 膠中的部分在改變電泳條件時衝洗下來，這部分的量和基因表達降低的量相對應，在電場 的作用下進一步傳遞到輸出單元。 在作為載體的微流控晶片的輸出單元中，當原癌基因表達升高，抑癌基因表達降 低時被傳遞來的相應的藥物片段，可在不完整的自殺基因分子相應的缺口的位置與之雜 交，並在T4DNA連接酶的作用下將藥物片段分子與不完整的自殺基因之間的縫隙連接上， 將相應的缺口填補。當所有的缺口都被填補時，沒有抗癌活性的不完整的自殺基因分子就 成為完整的自殺基因分子，具有了抗癌活性。 總之，本發明首次採用微流控晶片作為載體將DNA計算機應用於基因治療乳腺 癌的抗癌藥物中，利用微流控晶片高通量的特點，同時計算多種癌症相關基因的表達情況 (原癌基因是否升高、抑癌基因是否降低)，在診斷成立時合成並釋放功能性的藥物——完 整的自殺基因，在診斷不成立時，釋放的僅為無功能的藥物片段。該方法與納米技術和微加 工技術相結合，有助於提高癌症的靶向治療。 本發明具體使用自殺基因療法治療乳腺癌。乳腺癌是多基因改變的結果，今後可 採用不同的基因聯合治療的方法。目前還沒有一種基因治療可代替常規療法，基因治療與 常規療法相結合，是乳腺癌治療的發展趨勢。雖然乳腺癌基因診斷和治療已經取得了初步的成功，但要根本上應用於臨床治療，還需要(1)繼續尋找乳腺癌相關基因；(2)繼續開發 靶向性、安全性更高的載體。
下面結合附圖及實施方式對本發明作進一步詳細的說明 圖1為該DNA計算機的分子之間關係示意圖； 圖2為該DNA計算機的載體——微流控晶片結構示意圖(含一條計算原癌基因表
達是否升高的通道和一條計算抑癌基因表達是否降低的通道)； 圖3為計算原癌基因表達是否升高的原理示意圖之一 ； 圖4為計算原癌基因表達是否升高的原理示意圖之二 ； 圖5為計算原癌基因表達是否升高的原理示意圖之三； 圖6為計算抑癌基因表達是否降低的原理示意圖之一 ； 圖7為計算抑癌基因表達是否降低的原理示意圖之二 ； 圖8為計算抑癌基因表達是否降低的原理示意圖之三； 圖9為功能性藥物連接示意圖； 圖10為正常範圍上限的原癌基因C-erbB-2在第一段水凝膠中的電泳螢光圖； 圖11為五種不同濃度的原癌基因C-erbB-2的計算結果圖； 圖12改變電泳條件時藥物片段B被洗脫的電泳螢光圖； 圖13為五種不同濃度的抑癌基因nm23的計算結果圖； 圖14為不同診斷情況下的藥物合成的結果電泳譜圖之一 ； 圖15為不同診斷情況下的藥物合成的結果電泳譜圖之二 ； 圖16為不同診斷情況下的藥物合成的結果電泳譜圖制三； 圖17為不同診斷情況下的藥物合成的結果電泳譜圖之四； 圖18為不同診斷情況下的藥物合成的結果電泳譜圖之五； 圖19為RNA幹擾——抑制原癌基因活性的作用機制示意圖； 圖20為將治療基因導入靶細胞的兩種途徑示意圖； 圖21為自殺基因的作用機理示意圖。
具體實施方式
實施例1 基於微流控晶片的基因治療乳腺癌的藥物的製備方法我們計算了與乳腺癌關係 最為密切的兩種基因，即原癌基因C-erbB-2和抑癌基因nm23，表達升高和降低的情況，並 在兩者表達均符合診斷標準時，合成完整的自殺基因HSV-tk作為抗癌藥物並將其釋放。
在體外實驗中，我們採用合成的較短的DNA分子來代替較長的原癌基因和抑癌基 因。與原癌基因相對應的為計算分子1和藥物片段A，與抑癌基因相對應的為計算分子2和 藥物片段B。用與藥物片段A和B互補的模板鏈來代替不完整的自殺基因分子。藥物片段 A和B可與模板鏈相結合，形成雜交雙鏈，並在T4DNA連接酶的作用下連接成完整的雙鏈， 這個完整的雙鍊表示功能性的藥物，如圖9所示。為了便於檢測，在基因分子和藥物片段分 子的末端用螢光基團標記，FAM基團在494nm波長激發，522nm波長檢測時發出綠色螢光，TAMRA基團在560nm波長激發，582nm波長檢測時發出紅色螢光。藥物片段A和B連接時需 要有磷酸根基團(P04-)的參與。計算分子標記有丙烯醯胺基團(acrylamide-)，可通過共 價鍵固定在丙烯醯胺水凝膠中。分子的序列和修飾的情況詳見表1。
表1DNA計算機所需分子的核苷酸序列及標記
序列(5 ' -3 ')
原癌基因(C-erbB-2)FAM-GGGCATGGTCCACCACAGGCACCGCAGCTCAT
計算分子1acrylamide-ATGAGCTGCGGTGCCTGTGGTGGACCATGCCC
藥物片段ATAMRA-GGGCAGGGTCCAC
抑癌基因(nm23)TAMRA-CTGTGATACAGGAACCATGGCCAACTGTGAGC
計算分子2acrylamide- GCTCACAGTTGGCCATGGTTCCTGTATCACAG
藥物片段BP04國AGGAACCATGGCCAAC-FAM
藥物模板GTTGGCCATGGTTCCTGTGGACCCTGCCC 本實施例所用載體為微流控晶片，具體如圖2所示是含有兩條並行通道的玻璃 晶片，通道寬200 ii m，深80 ii m，全長(從樣品池1或6到酶連池13)約50mrn，通道中固定的 每段水凝膠長度均為lmm，液池的直徑為2mm。 將含有10 m計算分子的丙烯醯胺溶液注入通道中，待通道中充滿該溶液時，用 黑色不透明膠布將晶片的其他部分遮蓋住，僅將需要形成水凝膠的通道部分露出，在紫外 燈下曝光5分鐘，暴露的部分就形成了固定有計算分子的水凝膠。將其他部位未形成水凝 膠的丙烯醯胺溶液，通過真空泵從水凝膠兩側的液池吸走。通過此方法，可在計算原癌基因 是否升高的通道中形成兩段含有計算分子1的水凝膠，在計算抑癌基因是否降低的通道中 形成一段含有計算分子2的水凝膠和一段空白水凝膠(不含任何計算分子)，在輸出單元的 通道內形成一段空白水凝膠(不含任何計算分子)。將藥物片段A加入液池4中，在液池4 和5之間施加48v電壓，藥物片段A進入水凝膠中和計算分子1雜交，經5分鐘電泳後，雜 交達到飽和，將液池4和5中的剩餘液體棄除，同樣可將藥物片段B預先雜交在計算分子2 上，各個緩衝液池中均充入高鹽的緩衝液1 XTE和0. 5M NaCl。計算的過程在螢光顯微鏡下 檢測。 我們設定l 2ym為基因表達的正常範圍。在計算原癌基因是否升高的通道中， 首先考察正常範圍上限即2ym的原癌基因C-erbB-2到達第一段水凝膠右側邊緣的時間， 實驗證明為3分鐘，結果如圖IO所示。因此我們將第一步電泳的時間定為3分鐘。考察5 種不同濃度的C-erbB-2的計算結果。不同濃度的C-erbB-2分別從液池1中輸入，在液池1 和3之間施加48v的電壓，電泳時間為3分鐘，然後在液池3和5之間施加48v電壓4分鐘， 再在液池5和13之間施加48v電壓5分鐘，結果如圖11所示經3分鐘電泳，C-erbB-2表 達升高時(5和lOiim)，穿過第一段水凝膠，經第二步電泳，進入第二塊水凝膠，取代了藥物
13片段A，被取代下來的藥物片段A經第三步電泳，經過空白水凝膠到達液池13。當C-erbB-2 表達不升高時(l和O. 2iim)，經第一步電泳尚未到達第一段水凝膠的右側邊緣，液池5中不 會出現C-erbB-2，應此不能取代藥物片段A。以上結果驗證了 ，只有原癌基因表達升高時才 會有相應的藥物片段被傳遞到輸出單元。 如圖12所示，改變電泳條件時，將電壓方向切換，緩衝液由高鹽(IXTE和O. 5M NaCl)改為低鹽(1XTE)後，經6分鐘電泳，藥物片段B可全部被衝洗下來。
在計算抑癌基因是否降低的通道中，首先考察正常範圍下限即1 y m的抑癌基因 nm23到達第一段水凝膠右側邊緣的時間，也就是將藥物片段B全部取代下來的時間，實驗 證明為4分鐘。考察5種不同濃度nm23的計算結果。不同濃度的nm23分別從樣品池6中 輸入，在液池6和8之間施加48v的電壓，電泳時間為4分鐘，然後將液池8中的液體棄去， 重新加入緩衝液1 X TE和0. 5M NaCl ，將樣品池6中的液體改為1 X TE，切換液池6和8之 間的電壓方向，電泳6分鐘，然後再經第三步電泳(液池8和13之間)，時間為8分鐘。結 果如圖13所示經4分鐘電泳，nm23表達降低時(0. 2和0. 02 y m)，尚未到達第一段水凝膠 的右側邊緣，不能將藥物片段B完全取代，保留的藥物片段B在改變電泳條件時，經第二步 電泳，被衝洗下來，被衝洗下來的藥物片段B經過第三步電泳，經過兩段空白水凝膠到達液 池13。當nm23表達不降低時(1和0. 2 y m)，經第一步電泳藥物片段B被完全取代下來後 並棄除，因此，即使改變電泳條件，也不會有藥物片段B被衝洗下來。以上結果驗證了，只有 抑癌基因表達降低時才會有相應的藥物片段被傳遞到輸出單元。 在液池13中預先存放有藥物模板和T4DNA連接酶反應體系，在經過上下兩條通道 均完成三步電泳後，於室溫下(25t:左右)，在酶連池中進行30分鐘的酶連反應。由於藥物 片段分子是否連接成完整的雙鏈，僅依靠螢光無法證明，需要通過長度來驗證。因此，酶連 結果在另一塊十字晶片上，進行晶片電泳，將酶連反應後的不同組分分離後，雷射誘導螢光 檢測，電泳譜圖如圖14 18所示。圖中B表示藥物片段B，AB表示藥物片段A和B連接後 的完整的功能性藥物，藥物片段A標記的螢光在本實驗檢測條件下被濾掉，因此檢測不到 藥物片段A的峰。圖14為標準樣品的電泳譜圖；圖15為原癌基因升高、並且抑癌基因降低 時藥物合成結果的電泳譜圖；圖16為只有原癌基因升高、抑癌基因表達不降低時藥物合成 結果的電泳譜圖；圖17為只有抑癌基因表達降低、原癌基因不升高時藥物合成結果的電泳 譜圖；圖18為原癌基因不升高、並且抑癌基因也不降低時藥物合成結果的電泳譜圖。從圖 中可以看出，只有原癌基因和抑癌基因表達均符合診斷標準，即診斷成立時，才會有功能性 的藥物合成並釋放，只要有一種不符合診斷標準，即診斷不成立時，沒有功能性的藥物合成 並釋放，釋放的僅為無功能的藥物片段。這說明該DNA計算機有助於癌症的靶向治療。
實施例2 本實施例與實施例1內容基本相同，其不同之處主要在於 1)我們針對下述與乳腺癌相關的原癌基因(C-erbB-2、 EGFR、 c-myc、 ras、 int-2、 bcl-2、 BAG-1、 BCSG-2、 survivin)中的至少一種和與乳腺癌相關的抑癌基因(P53、 nm23、 PTEN、 Rb、 P16、 P21、 CHEK2、 BRCA1、 BRCA2)中的至少一種作為設計依據，進行藥物片段分子 的設計工作。 2)我們針對1)中所選的藥物片段分子設計帶有缺口的不完整的自殺基因分子， 具體為帶有與其所選定的藥物片段分子相對應的同等序列的缺口的雙鏈DNA分子。
3)作為載體的微流控晶片的計算單元以及計算通道根據上述1) 、2)過程的具體 情況選用，試驗參數等也與之匹配。
權利要求
基於微流控晶片的基因治療乳腺癌的藥物的製備方法，其特徵在於所述基因治療乳腺癌的藥物的製備方法是使用作為運算介質的生物分子，通過生化反應，對與癌症相關的所有原癌基因和抑癌基因中的至少一種或其組合的表達情況進行計算；當計算結果符合要求時自動合成並靶向釋放有效的抗癌藥物完整的自殺基因；在其所述的計算過程中，所述作為運算介質的生物分子具體是DNA分子和/或酶；與乳腺癌相關的原癌基因包含有C-erbB-2、EGFR、c-myc、ras、int-2、bcl-2、BAG-1、BCSG-2、survivin；與乳腺癌相關的抑癌基因包含有P53、nm23、PTEN、Rb、P16、P21、CHEK2、BRCA1、BRCA2。
2. 按照權利要求1所述基於微流控晶片的基因治療乳腺癌的藥物的製備方法，其特徵 在於所述基因治療乳腺癌的抗癌藥物的製備方法中，作為運算介質的DNA分子具體為與 每種癌症相關基因相對應的計算分子和藥物片段分子，以及帶有多個缺口的不完整的自殺 基因分子；所述自殺基因分子上缺口的序列和數量與藥物片段分子的序列和數量相對應。
3. 按照權利要求2所述基於微流控晶片的基因治療乳腺癌的藥物的製備方法，其特徵 在於所述作為運算介質的DNA分子中，與每種癌症相關基因相對應的計算分子和藥物片 段分子為單鏈DNA分子，帶有缺口的不完整的自殺基因分子為雙鏈DNA分子。
4. 按照權利要求3所述基於微流控晶片的基因治療乳腺癌的藥物的製備方法，其特徵 在於所述基因治療乳腺癌的抗癌藥物的製備過程中，當被檢測對象中對應的癌症相關基 因表達超出正常範圍時，超出部分的癌症相關基因可將全部或部分的藥物片段分子從其與 計算分子的匹配關係中置換取代下來，使原有的計算分子與癌症相關基因雜交的結構變為 新的更為穩定的結構；當癌症相關基因的表達不符合診斷標準時，亦即藥物片段分子中的部分或者全部沒有 從其與計算分子的匹配關係中被置換取代下來時，就不能與帶有缺口的不完整的自殺基因 分子結合形成完整的自殺基因分子從而具有抗癌作用。
5. 按照權利要求4所述基於微流控晶片的基因治療乳腺癌的藥物的製備方法，其特徵 在於所述基因治療乳腺癌的抗癌藥物製備方法中所使用的作為運算介質的酶為T4DNA連 接酶；所述藥物片段分子與計算分子在結構上互補，其二者能夠實現雜交；具體而言，所述藥 物片段分子與不完整的自殺基因分子上的缺口序列相同；藥物片段分子在T4DNA連接酶的 作用下能夠將不完整的自殺基因上的缺口填補，使其形成完整的自殺基因；相對於藥物片段分子而言，癌症相關基因與計算分子互補序列較長，癌症相關基因更 易於與計算分子雜交而將藥物片段分子取代下來。
6. 按照權利要求5所述基於微流控晶片的基因治療乳腺癌的藥物的製備方法，其特徵 在於當癌症相關基因將相應的藥物片段分子從其與計算分子的匹配對應關係中取代下來 後，被取代下來的藥物片段分子在電場作用下靶向釋放到對應的目的區域；從而與不完整 的自殺基因在T4DNA連接酶體系中合成具有抗癌作用的完整藥物。
7. 按照權利要求6所述基於微流控晶片的基因治療乳腺癌的藥物的製備方法，其特徵 在於當癌症相關基因將相應的藥物片段分子從其與計算分子的匹配對應關係中取代下來 後，藥物片段分子被輸送到特定的目標區域和不完整的自殺基因雜交並在T4DNA連接酶的 作用下進行酶連反應，將相應的缺口填補；所述的特定目標區域中包含有不完整的自殺基因；當癌症相關基因的表達符合要求時，相應的藥物片段將不完整的自殺基因上的缺口全 部填補，此時即有完整的自殺基因被合成並作為抗癌藥物釋放；只要有一種基因表達不符合診斷標準，缺口就不會被完全填補，對應地就不能有完整 的自殺基因被合成，釋放的僅為沒有抗癌作用的不完整的自殺基因。
8. 按照權利要求1 7其中之一所述基於微流控晶片的基因治療乳腺癌的藥物的製備 方法，其特徵在於所述基因治療乳腺癌的抗癌藥物製備過程中要求依據載體實施，所述載體具體是微流 控晶片；微流控晶片在結構上具體分為三個功能單元輸入單元、計算單元和輸出單元；其 中，計算單元布置在輸入單元和輸出單元之間，這三個單元之間液體流路順序聯接，並在電 場作用下可以形成藥物片段分子的定向移動控制；所述基於微流控晶片的基因治療乳腺癌的藥物的製備方法中，計算分子固定在作為載 體的微流控晶片的計算單元上；藥物片段分子預先雜交在計算分子上；不完整的自殺基因 和T4DNA連接酶體系預先放置在輸出單元中。
9. 按照權利要求8所述基於微流控晶片的基因治療乳腺癌的藥物的製備方法，其特徵 在於將計算分子固定在作為載體的微流控晶片的計算單元的具體過程是將末端修飾有丙 烯醯胺基團或氨基基團的計算分子溶解於丙烯醯胺溶液中，終濃度為5 20 ii m ;經紫外曝 光後，固定在丙烯醯胺水凝膠中；所述作為載體的微流控晶片中，輸入單元含有1 300個樣品池，不同的癌症相關基因 分別由不同的樣品池輸入；所述微流控晶片中的計算單元具體為分別與各個樣品池相連的同等數量的並行通道； 每個通道裡含有與癌症相關基因相對應的計算分子和藥物片段分子，分別對不同基因的表 達情況進行計算並傳遞相應藥物片段，不同通道的計算是同時獨立進行的，互不幹擾；所述微流控晶片中的輸出單元含有一條通道和一個酶連池，酶連池中含有不完整的自 殺基因分子和T4DNA連接酶反應體系；從計算單元不同通道傳遞來的藥物片段分子通過輸 出單元的通道匯集到酶連池中進行酶連反應；在輸出單元的通道中固定了一段空白水凝膠，它不僅可以起到閥的作用，並且由於水 凝膠有濃縮DNA分子的作用，從計算單元傳遞來的藥物片段分子在此處檢測要比在酶連池 中檢測更為靈敏。
10. 按照權利要求9所述基於微流控晶片的基因治療乳腺癌的藥物的製備方法，其特 徵在於所述基因治療乳腺癌的抗癌藥物的製備方法還滿足下述兩種要求之一 其一，在計算原癌基因表達是否升高並在其升高時能以對應的量取代相應藥物片段的 微流控晶片的計算單元的通道中，固定有兩塊水凝膠；第一段水凝膠中僅固定相應的計算 分子；第二段水凝膠中所固定的計算分子上，還預先雜交有相應的藥物片段分子；當原癌基因分子在低壓電場作用下，進入第一段水凝膠，和相應的計算分子雜交而被 其捕獲；捕獲的速度與原癌基因分子的濃度呈相關性；當基因表達在正常範圍的上限時，經過一定時間的電泳，原癌基因恰好走到第一段水 凝膠的另一側邊緣；而當基因表達升高時，由於雜交的速度更快，經過相同時間的電泳，升高部分的原癌基因可穿過第一段水凝膠，到達其下遊，並在電場作用下，進入第二段水凝膠 和計算分子雜交，而將相應的藥物片段分子取代下來，取代的量與基因表達升高的量相對 應，取代下來的藥物片段分子在電場的作用下進一步傳遞到輸出單元。其二，在計算抑癌基因表達是否降低並取代相應藥物片段的微流控晶片的計算單元的 通道中，固定有兩段水凝膠第一段水凝膠中固定相應的計算分子，並預先雜交有相應的藥 物片段分子；第二段水凝膠為空白水凝膠，僅起到閥的作用，不參與計算；抑癌基因分子在低壓電場作用下，首先進入第一段水凝膠，將相應的藥物片段分子取 代下來；當抑癌基因表達在正常範圍下限時，經過一定時間的電泳，抑癌基因恰好走到第一段 水凝膠的另一側邊緣，將所有的藥物片段分子全部取代下來，被取代下來的藥物片段分子 隨後被棄除；當抑癌基因表達降低時，由於取代速度變慢，經過相同時間的電泳，仍有一部 分藥物片段不會被取代下來而保留在水凝膠中，取代下來的部分被棄除。保留在水凝膠中 的部分在改變電泳條件時被衝洗下來，這部分的量和基因表達降低的量相對應，在電場的 作用下進一步傳遞到輸出單元。
全文摘要
基於微流控晶片的基因治療乳腺癌的藥物的製備方法其使用作為運算介質的生物分子，通過生化反應，對與癌症相關基因表達情況進行計算；結果符合要求時自動合成並靶向釋放抗癌藥物完整的自殺基因；所述作為運算介質的生物分子具體是DNA分子和/或酶；與乳腺癌相關的原癌基因為C-erbB-2、EGFR、c-myc、ras、int-2、bcl-2、BAG-1、BCSG-2、survivin；與乳腺癌相關的抑癌基因為P53、nm23、PTEN、Rb、P16、P21、CHEK2、BRCA1、BRCA2。本發明在條件成立時合成並釋放治療乳腺癌的抗癌藥物完整的自殺基因。該方法與納米技術和微加工技術相結合，有助於提高治療效果。
文檔編號G06N3/12GK101745121SQ20081022939
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月8日 優先權日2008年12月8日
發明者於浩, 張宇, 林炳承, 秦建華 申請人:中國科學院大連化學物理研究所