轉基因作物的抗性治理策略的製作方法

2024-01-19 11:23:15

專利名稱：：轉基因作物的抗性治理策略的製作方法
技術領域：
：本發明涉及在抗害蟲作物的田地中治理抗性的方法。
背景技術：
：昆蟲、線蟲和相關的節肢動物每年在美國估計破壞15%的農作物，而在發展中國家破壞的比例更高。單單在美國，這些害蟲每年造成的作物損害就超過1000億美元。另外，與雜草及寄生性和腐生性植物的竟爭也造成更多的潛在產量損失。這種損害有些是當植物病原體、昆蟲和其他此類土傳害蟲(soilbornepest)在種子種植後攻擊種子時在土壤中發生的。例如在玉米的生產中，大部分的損害是由根蟲(rootworm)(啃食或以別的方式損害植物的根的害蟲)和由切根蟲(cutworm)、歐洲玉米螟和其他啃食或損害植物的地上部分的害蟲造成的。有關害蟲攻擊農作物的類型和機制的一4殳描述例如在以下文獻中4是供Metcalf(1962),Z)eWrwcrive朋d"e/w//""cte,4thed.(McGraw-HillBookCo"NY)和Agrios(1988)，屍/aw/屍涵o/oW,3ded.(AcademicPress,NY)。在與害蟲進行的季節性鬥爭中，農場主們必須施用幾十億加侖的合成殺蟲劑來抗擊這些害蟲。但是，合成殺蟲劑會造成許多問題。它們昂貴，單單美國農場主每年就差不多花掉80億美元。它們促使抗殺蟲劑害蟲的出現，而且它們會損害環境。由於關注到殺蟲劑對公眾健康和環境健全的影響，人們已作出了極大的努力來尋找減少化學殺蟲劑使用量的方法。最近，這個努力在很大程度上集中在開發經工程改造能表達衍自微生物的昆蟲毒物的轉基因作物。例如，Estruch等人的5,877,012號美國專利公開了將來自諸如芽孢桿菌屬(萬""'〃w》、假單胞桿菌屬CPsei^o/wowa力、棒形桿菌屬(C/aw力a"w)和根瘤菌屬(i/^o&'wm)的微生物的蛋白質克隆到植物中並在植物中表達，以獲得對諸如小地老虎(blackcutworm)、行軍蟲、幾種鑽心蟲(borer)的害蟲和其他昆蟲害蟲有抗性的轉基因植物。Privalle等人的PCT出版物WO/EP97/07089教導了用編碼過氧化物酶的重組DNA序列轉化單子葉植物如玉米，以保護植物免遭玉米螟、穗蟲(earworm)和切根蟲的啃食。Jansens等人(1997)O叩S"'.，37(5):1616-1624報導了含有編碼蘇雲金桿菌(Sac"/us//mn'wgz'e朋&,份)結晶蛋白的基因的轉基因玉米的產生，該玉米控制了兩代的歐洲玉米螟(ECB)。Koziel等人的5,625,136號和5，859，336號美國專利報導說，用來自Bt的5-內毒素編碼基因轉化玉米產生了ECB抗性得到改進的轉基因玉米。ArmstrongWa/.,inCrapScience,35(2):550-557(1995)提供了表達Bt殺昆蟲蛋白的轉基因玉米的田地試驗綜合報告。對環境友好的害蟲控制方法是使用衍自Bt這種土壤細菌的殺蟲晶體蛋白，這種蛋白常稱為"Cry蛋白"或"Cry肽"。Cry蛋白是球狀蛋白質分子，在Bt孢子形成階段的後期以結晶形式作為前毒素(protoxin)積累。晶體被害蟲吞食後，在幼蟲的鹼性中腸環境中溶解釋放出前毒素。前毒素(~130kDa)被腸道蛋白酶轉化成毒性片段(66kDaN末端區域)。許多這些蛋白質對特定的目標昆蟲毒性很大，但對植物和其他非目標生物無害。已使一些Cry蛋白在作物中進行重組表達，以提供抗害蟲轉基因植物。在這些植物當中，Bt轉基因棉花和玉米已得到廣泛種植。有很多Cry蛋白已得到分離、表徵和根據胺基酸序列同源性進4亍了分類(Crickmore"a/.,1998，i\^cro&o/.Afo/.歷o/.iev.，62:807-813)。這個分類方案為新發現的Cry蛋白的命名和歸類提供了系統性機制。Cryl分類法是已知最好的分類法，包含的cry基因數目最多，目前總數超過130個。西方玉米根蟲(WCRW)會在大豆中產卵，也可能會在其他的作物產地中產卵，其有一種生物型(biotype)目前能夠給第一年玉米(不計劃在其後種才直玉米(systematicallyfollowedcorn)的玉米)造成重大傷害。這個生物型常稱為第一年玉米根蟲或抗輪作(rotation-resistant)玉米根蟲。當根蟲卵保留在土壤中超過一年時，第一年玉米也可能易受根蟲傷害。在這個情況中，產在土地中的卵在隨後一年中保持休眠，然後在第二年孵化，此時玉米可能在兩年輪作周期中再被種才直。這種才艮蟲活動性^皮稱為長期滯育(extendeddiapause),通常涉及北方玉米根蟲(NCRW)，特別是美國玉米帶(ComBdt)的西北部地區的北方玉米才艮蟲。此外，包括美國在內的大多數國家在將轉基因作物商業化時要求執行昆蟲抗性治理(IRM)計劃，以使抗性害蟲的發展減至最低，從而延長已知的生物殺蟲劑的有用壽命。IRM計劃的一個最普通的組成是這樣的庇護區(refUge)，其中在給定的作物中，所種植的種子有80%可含有能殺死目標害蟲(如WCRW)的轉基因事件，但20%的種子必須不含對該目標害蟲有活性的轉基因事件。這種庇護區策略的目的是防止目標害蟲發展對轉基因作物產生的特定生物殺蟲劑的抗性。由於在80%轉基因區域中達到成熟的目標昆蟲很可能會攜帶針對該處所用的生物殺蟲劑的抗性基因，該庇護區能讓對轉基因種子中所用的生物殺蟲劑沒有抗性的成體WCRW昆蟲發育。結果，非抗性昆蟲與抗性昆蟲交配，並且由於抗性基因通常是隱性的，非抗性昆蟲使得下一代昆蟲中的大部分抗性被消除。這個庇護區策略的問題是，為了產生易感昆蟲，所種植的作物中有一些必須對害蟲易感，從而會降低產量。如上所述，一個關注的問題是會出現抗性ECB、WCRW或其他害蟲。對抗性的發展進行反擊的一個策略是，選擇表達高水平殺昆蟲蛋白的重組玉米事件，使得害蟲咬轉基因玉米植林一口或幾口就會造成該害蟲至少完全停止啃食，並隨後發生死亡，即使該害蟲對於抗性性狀是雜合的(即該害蟲是抗性害蟲與非抗性害蟲交配的結果)。另一個策略是，在同一植物中或在接近的植物中，以重組事件的形式併入第二ECB或WCRW特異性殺昆蟲蛋白，例如另一Cry蛋白或者別的殺昆蟲蛋白如重組醯基脂質水解酶或其殺昆蟲變體。參見例如WO01/49834。優選地，第二毒素或毒素複合物會具有與第一毒素不同的作用方式，且優選地，如果受體參與到昆蟲對重組蛋白的毒性的話，同一植物或接近的植物中的兩種或多種殺昆蟲蛋白的每一種的受體會互不相同，使得如果某個受體發生功能變化或某個受體發生功能損失而造成對特定殺昆蟲蛋白的抗性的話，那麼該功能變化或功能損失不應且可能不會影響其餘的毒素的殺昆蟲活性，所述其餘的毒素會被證實能結合與該造成克隆到植物中的兩種殺昆蟲蛋白之一的功能損失的受體不同的受體。因此，一個或多個第一轉基因和一個或多個第二轉基因優選對同一目標昆蟲有殺蟲作用，和無竟爭地結合目標昆蟲的腸膜中的不同結合位點。又一個策略是將化學殺蟲劑與在轉基因植物中表達的殺蟲蛋白結合。這可以想到的做法是，用化學殺蟲劑對重組種子進行處理，使得殺蟲控制量的化學殺蟲劑擴散到根部周圍的區域，從而保護根部組織免受目標害蟲侵擾，只要化學殺蟲劑持續或根組織保持在分散到土壤中的殺蟲劑的區域當中。殺蟲劑常規應用形式的另一替代方案是用殺蟲劑處理植物種子。使用殺真菌劑或殺線蟲劑來保護種子、幼根和苗在種植和發芽後免受攻擊，和使用低水平的殺蟲劑來保護例如玉米種子免受線蟲影響，這些用法已使用了相當長時間。用殺蟲劑處理種子的優點是，在提供對種子的保護的同時，又使所需的殺蟲劑量減至最低，和減少與殺蟲劑的接觸量和為達到在田地控制害蟲所需的不同田地應用的次數。通過將殺昆蟲劑直接應用到植物種子來控制害蟲的其他實例在例如5,696,144號美國專利中提供，該專利公開說，用1-芳基吡唑化合物以500g/公擔(quintal)種子的比例處理種子，從中生長的玉米植抹所遭受的ECB啃食損害比從未經處理的種子生長的對照植抹少。另外，Tumblad等人的5,876,739號美國專利(及其母專利5，849，320號美國專利)公開了控制土傳昆蟲的方法，所述方法涉及用含有一種或多種多聚體粘合劑和某種殺昆蟲劑的塗料處理種子。這個參考文獻提供了它確認為可用於這個塗料的候選殺昆蟲劑的殺昆蟲劑列表，還有多種潛在目標昆蟲的名稱。雖然植物遺傳工程的最新進展已改進了不用化學殺蟲劑就能保護植物免受害蟲侵擾的能力，而且雖然諸如用殺蟲劑處理種子的技術已減少了殺蟲劑對環境的有害影響，但仍有很多問題限制著這些方法在實際田地條件下的成功應用。昆蟲^L'I"生治J裡(insectresistancemanagement,IRM)這個術i吾用來描述旨在減少昆蟲害蟲變成對殺蟲劑有抗性的潛在可能的各種措施。BtIRM的保持是非常重要的，因為昆蟲抗性會對摻入植物的Bt保護劑(Btpant-incorporatedprotectant)和作為一個整體的Bt4支術的未來使用造成威脅。特定的IRM策略如高劑量/結構化(highdose/structured)庇護區策略，能減輕昆蟲對玉米、棉花和馬鈴薯中產生的特定Bt蛋白的抗性。但是，這些策略會導致要讓一部分作物保持對一種或多種害蟲易感，以確保有非抗性昆蟲發育而可供與在受保護作物中產生的任何抗性害蟲交配。因此，從農場主/生產商的觀點出發，非常需要的是，具有儘可能小的庇護區，而又能治理昆蟲抗性，使得在獲得最大產量的同時，仍保持所用的害蟲控制方法的功效，無論所用的方法是Bt、化學殺蟲劑、某種其他方法或者它們的組合。目前最常用的IRM策略是高劑量和庇護區的種植(庇護區是總種植面積中用非Bt種子種植的那部分面積)，因為通常認為這會通過保持昆蟲易感性而延遲昆蟲發展對Bt作物的抗性。高劑量/庇護區策略假定認為，對Bt的抗性是隱性的，且由具有導致以下三個基因型的兩個等位基因的單一基因座賦予易感純合體(SS)、雜合體(RS)和抗性純合體(RR)。它還假定認為，會有低的初始抗性等位基因頻率，和抗性成蟲和易感成蟲之間會有廣泛的隨機交配。在理想的情形下，只有稀少的RR個體能倖免於Bt作物所產生的高劑量。SS個體和RS個體都將易感Bt毒素。結構化庇護區是種植者田地中的非Bt區域，或者允許產生易感(SS)昆蟲的一批田地，該易感昆蟲可與倖免於Bt作物的稀少抗性(RR)昆蟲進行隨機交配，產生會被Bt作物殺死的易感RS雜合體。這會將抗性(R)等位基因從昆蟲群體清除，延遲抗性的進展。MON810、BT11和TC1507是目前可供使用的據認為是對ECB"高劑量"的產品。高劑量/庇護區策略是目前優選的IRM策略。非高劑量策略目前是通過增加庇護區面積在IRM策略中使用。增加庇護區是因為高劑量的缺乏會讓部分抗性的昆蟲(即具有一個抗性等位基因的雜合昆蟲)存活，從而增加抗性基因在昆蟲群體中的頻率。由於這個原因，許多IRM研究者和專家小組已一致認為，非高劑量Bt表達與高劑量表達相比會呈現很大的抗性風險(Roush1994,Gould1998,Onstad&Gould1998,SAP1998，ILSI1998，UCS1998,SAP2001)。但是，這種非高劑量策略通常對於農場主是不可接受的，因為庇護區面積越大，導致的產量損失越多。目前認為，庇護區的面積、位置和治理對於高劑量/結構化庇護區策略成功減少昆蟲對玉米、棉花和馬鈴薯中產生的Bt蛋白的抗性是至關重要。通常要求結構化庇護區包括目標害蟲的所有合適的非Bt宿主植物，這些植物由人進行種植和治理。可種植這些庇護區，以在害蟲可接觸到Bt作物的同時提供庇護區，或者在害蟲不可接觸到Bt作物的時候提供庇護區。這些類型的庇護區存在的問題包括要確保每個農場主都遵守要求。由於庇護區種植區域中的產量下降，一些農場主選擇迴避庇護區要求，其他人也不遵守面積和/或位置要求。這些不守要求的問題導致沒有庇護區或者庇護區不夠有效，相應地抗性害蟲的發展增加。歐洲玉米螟(ECB)ECB是美國大部分地區的主要玉米害蟲。這個害蟲每年有l-4代，其中一化(即每年一代)群體出現在遠北(即北達科他州全州、南達科他州北部、明尼蘇達州北部和威斯康星州北部)、二化(即每年兩代)群體遍布美國玉米帶的大部分地區，多化(3-4代)群體出現在南部(Mason等人1996)。以下概述與IRM有關的ECB生物學關鍵方面幼蟲移動ECB幼蟲能夠在玉米田地中進行明顯的植林間移動。在非轉基因玉米中進行的研究表明，絕大部分的幼蟲的移動不會超過一行植株當中的兩抹植抹(Ross&Ostlie1990)。但是，在轉基因玉米中，RGould(在Onstad&Gould1998中引用)的未發表數據(用於建模工作)表明，大約98。/。的易感ECB新生幼蟲離開含有Bt的植株。Hellmich最近進行的多年研究(1996、1997、1998年)試圖定量幼蟲植林間移動的程度。觀察到，第四齡幼蟲能夠在一行玉米植抹當中移動越過最多達六株植株，和從釋放點跨行移動越過六抹植抹。行內移動的可能性比跨行移動高的多(這並不奇怪，因為與跨行植抹相比，行內植抹更可能"互相接觸，，)。事實上，絕大部分的跨行移動局限於一個植株。這類信息對於最佳庇護區設計具有明顯的意義。移動越過Bt行和非Bt行的幼蟲可被暴露於亞致死劑量的蛋白質，從而增加抗性的可能性(Mallet&Porter1992)。鑑於ECB幼蟲在植林之間的移動程度，佔優勢的意見是，種子混合區(seedmixes)是較次的庇護區選擇(Mallet&Porter1992,SAP1998,Onstad&Gould1998)。成蟲移動需要有關成蟲ECB(化蛹後羽化)的移動的信息，來確定庇護區的適當接近度的指導方針。庇護區必須設立在新羽化成蟲的飛行範圍內，以有助於確保隨機交配的潛在可能。美國內布拉斯加州大學進行了詳盡的多年期項目，以研究ECB成蟲擴散情況(Hunt等人1997,1998a)。在這些標記和再捕捉研究(用新羽化的交配前成蟲進行)獲得的結果表明，大部分ECB成蟲擴散所到之處離它們的羽化地點並不遠。再捕捉的成蟲的百分數非常低(<1%)，且再捕捉的成蟲中大部分是在離釋放地點1500英尺以內被捉到。在2000英尺以外捕捉到的蛾極少。這些結果已明確地導致得出了對庇護區接近度和布置的建議和指導方針。交配行為除了成蟲移動的模式外，ECB交配行為也是確保易感蛾和潛在抗性蛾之間的隨機交配的一個重要考慮因素。具體的說，重要的是確定新羽化的雌蟲在哪裡交配(即在羽化地點附近還是在一定的擴散之後)。已確知許多ECB利用玉米田地附近的群集地點(通常是雜草叢或草叢)進行交配。雌蟲通常在蛹羽化後的第二天晚上交配(Mason等人1996)。一項最近的研究提示，可以假造群集地點，以增加易感ECB和潛在抗性ECB之間隨機交配的可能性(Hellmich等人1998)。另一項由內布拉斯加州大學進行的最近研究(用新羽化ECB進行的標記/再捕捉研究)表明，移動出其羽化成為成蟲的玉米田地的未交配雌蟲相對較少(Hunt等人1998b)。這在灌溉的(即有吸引力的)玉米田地尤為如此。另外，在靠近釋》支地點(10英尺以內)捕捉到的雌蟲有相對較高的比例是交配過的。這個研究提示，雌蟲交配地點非常靠近羽化地點，庇護區可能需要布置在非常靠近Bt田地的地方(或者作為田地內庇護區進行布置)，以使隨機交配的可能性最大化。在雄蟲交配行為方面，Showers等人(2001)進行的研究觀察了雄蟲擴散以探尋配偶的情況。該研究是採用標記-捕捉技術，在釋放地點200、800、3200和6400m處放置以信息素為鉀的誘捕器來進行。結果顯示，探尋配偶的雄蟲在離釋放地點200m處放置的誘捕器被誘捕的頻率更高。但是，在離釋放地點800m處或更遠處也有很多雄蟲被誘捕(Showers等人2001)。與Hunt等人的研究相似，這個研究提示庇護區可能需要布置在相對靠近Bt田地的地方，以使隨才幾交配最大化。產卵行為ECB產卵行為對於庇護區設計也是重要的。例如，如果在玉米田地當中進行的產卵不是隨機的話，某些類型的庇護區(即田地內地帶)可能不會有效。在交配後(主要在群集地點進行)，雌蟲會移動尋找合適的玉米宿主進行產卵。大部分的雌蟲會在靠近群集地點的玉米田地產卵，假如那裡有可接受的玉米宿主的話。產卵在交配後就開始，主要在晚上進行。卵是以最多六十個卵的卵群形式產下(每晚產下一個或多個卵群)(Mason等人1996)。已知雌蟲通常更喜歡長勢較高和較旺盛的玉米田地來產卵(Beck1987)。這對庇護區設計具有意義。為避免產卵雌蟲潛在地區分宿主，選用於庇護區的非Bt玉米雜交體應在生長、成熟、產量和治理措施(即種植日期、雜草治理和灌溉)方面與Bt雜交體相似。應指出的是，研究已證實當物候學特徵和治理特徵相似時，在Bt玉米和非Bt玉米(衍自同一近交系)之間的產卵偏好沒有顯著差異(Orr&Landis1997,Hellmich等人1999)。在適合產卵的玉米田地當中，認為產卵是隨機的，並不限定於靠近群集地點的邊界各行玉米(Shelton等人1986,Calvin1998)。宿主範圍ECB是一種雜食性害蟲，已知侵擾200多種植物。ECB植物宿主包括多種普通雜草，這使一些人想到雜草可以充當Bt玉米的ECB庇護區，這個概念常稱為"非結構化庇護區"。與此相應，有很多最近的研究項目已研究了雜草作為庇護區的可能性。Hdlmich進行的研究(1996、1997、1998年)已證實，雜草能夠產生ECB，不過產生的數量不定而且太不一致，因而不能作為ECB庇護區的可靠來源。美國科學顧問小組1998年IRM分小組(1998SAPSubpanelonIRM)也得出這個結論。除了雜草外，還研究了多種糧食作物(例如小麥、高粱、燕麥)作為Bt玉米ECB庇護區的潛在可能(Hellmich1996,1997,1998,Mason等人1998)。在這些研究中，小的糧食作物所產生的ECB通常比玉米(爆花玉米(popcorn)或飼料玉米(fieldcorn))少，因此認為不太可能產生足夠的易感成蟲昆蟲而成為可接受的庇護區。因此，根據目前的技術現狀，需要針對ECB的改進的IRM。玉米穗蟲(CEW)和ECB—樣，1998SAP確定了多個需要對CEW進行額外研究的研究區域。除了對幼蟲/成蟲移動、交配行為和產卵行為有更多的認識外，還需要對玉米/棉花之間的移動和長距離遷飛有更好的了解(SAP1998)。自從1998年以來，出現了有關CEW生物學的額外研究。這些資料已作為研究年報的一部分進行提交，是這種Bt作物得到商業使用許可之前所必需的註冊條件。該機構已審查了這些資料並斷定，額外的信息對於長期有效改進IRM策略以減輕CEW抗性將是有用的。宿主範圍和玉米間移動CEW是一種雜食性昆蟲(每年3-4代)，除了雜草和其他野生宿主外，還啃食多種糧食和蔬菜作物。通常認為，CEW有兩代啃食野生宿主和/或玉米(第一代啃食輪生期玉米，第二代啃食抽穗期玉米)。玉米衰老後，CEW移動到其他宿主，主要是棉花，再繁殖2-3代。由於CEW在同一生長季節中利用多個宿主，它給Bt抗性治理帶來了挑戰，因為對Bt玉米和Bt棉花中的Bt蛋白都有兩次暴露的可能(在一些地區中潛在地最多達五代暴露)。越冬行為已知CEW在蛹期過冬。雖然已知CEW在生長季節往北遷飛到玉米生長地區(即美國玉米帶和加拿大)，但CEW通常不能夠在這些地區越冬。相反，已知CEW在南方過冬，往往是棉花田地過冬。溫度、水分和耕作措施據認為都在CEW的過冬存活中起到一定的作用(Caprio&Benedict19%)。過冬是一個重要的因素，因為IRM抗性昆蟲必須熬過冬天才能將他們的抗性基因傳遞到後代。例如在美國玉米帶，不能夠過冬的CEW應該不會造成抗性威脅。鑑於可根據在哪裡CEW是一個抗性威脅來開發不同的庇護區策略，準確的採樣數據將有助於精確預測合適的CEW過冬地區。成蟲移動和遷飛已知CEW是流動性非常高的害蟲，能夠進行很長距離的移動。標記/再捕捉研究已證實，CEW蛾能夠擴散到0，5km(0.3英裡)到160km(99英裡)的距離；還記錄到有些遷飛遠達750km(466英裡)(Caprio&Benedict1996)。遷飛的一般模式是隨著盛行風型向北移動，從南方過冬地點發源的蛾移動到美國北部和加拿大的玉米生長地區。已假定認為，CEW遷飛是隨著生長季節過程逐漸地向北進行。但是，FredGould博士(美國北卡羅來那州立大學)進行的觀察表明，CEW還可從玉米生長地區向南移動回南方的棉花地區(在1999EPA/USDAWorkshopon說CropResistanceManagementinCotton,Memphis,TN8/26/99所作的評論中有描述)。如果這是真實的話，結果可能會是CEW再次暴露於Bt作物。另外，可能需要再回到關於CEW過冬的假定——椐認為不能夠熬過冬天(從而不構成抗性威脅)的蛾可能確實向南移動到合適的過冬地點。大部分的CEW飛行移動是局部性的而不是遷飛性的。玉米夜蛾(Heliothinemoth)主要在晚上移動，羽化後的蛾飛行距離通常是不到200m的短距離(Caprio&Benedict1996)。但是，如1998SAP所指出，額外的研究將是有用的，特別是與CEW和最佳庇護區設計有關的研究。另一方面，鑑於CEW通常能進行長距離移動和Bt玉米雜交體中沒有高劑量，2000SAP指出這種害蟲與其他害蟲(例如ECB)相比，庇護區布置顯得沒那麼重要(SAP2001)。交配/產卵行為MichaelCaprio博士(美國密西西比州立大學昆蟲學家)已指出，雌蟲的交配地點明顯局部化(即離蛹羽化地點600m(1969英尺)之內)，通常是與在附近羽化的雄蟲或在雌蟲羽化前移動進來的雄蟲交配(Caprio1999)。CEW雌蟲通常將卵一個一個地產在宿主上。最近的研究(在棉花田地進行)發現，從被釋放的CEW雌蟲找到的卵中有20%是在釋放地點的50-100m(164-328英尺)之內，這表明產卵有一定的局部化。但是，雄蟲被證實能夠移動超過350m(1148英尺)來與雌蟲交配(Caprio2000)。這些數據表明，就CEW而言，庇護區可能不必布置在Bt田地當中或者僅靠Bt田地才能有效(不過數據並不排除這些選擇方案)。在交配和產卵行為方面進行的額外研究會給CEWIRM提供有用的信息。幼蟲移動CEW幼蟲特別是晚齡幼蟲能夠進行植株間移動。在SAP(1998)的推薦下，美國環保署(EPA)已取消了種子混合區作為CEW的可行Bt棉花庇護區選擇方案。因此，也需要針對CEW的改進的IRM策略。西南玉米螟(SWCB)一些SWCB害蟲生物學數據已作為研究年報的一部分提供給EPA,是必需的註冊條件。但是，可利用的信息仍相對有限。1998SAP指出有關SWCB的信息相對缺乏，斷定需要對SWCB進行必要的研究，包括短期移動、長距離遷飛、相對於移動的交配行為(即交配是在遷飛前進行還是在遷飛後進行)。由於這一點，在目前的技術現狀下，不知道針對ECB(另一種玉米螟害蟲)設計的IRM策略是否也會最佳地對SWCB起作用。SWCB是一些地區(即堪薩斯州西南、科羅拉多州東南部、德克薩斯州北部和俄克拉何馬州西部)的玉米經濟害蟲，可能要求定期治理。和ECB—樣，SWCB有2-4代和有相似的啃食行為。第一代幼蟲啃食輪生組織(whorltissue),然後鑽入莖稈後化蛹，而後面各代啃食抽穗組織(eartissue)後鑽入莖稈。雌蟲通常在羽化當晚交配，能產250-350個卯(Davis2000)。已啟動了對SWCB移動模式的研究(Buschman等人1999)。在這個標記/再捕捉研究中，從1999年數據作出了以下關於SWCB的觀察結論l)離釋放地點較遠的地方捕捉到的雄蟲比雌蟲多(與ECB相似)；2)SWCB大部分是在離釋放地點100英尺以內被再次捕捉，不過也有一些在1200英尺外再次捕捉到；3)ECB和SWCB的蛾移動模式似乎在大部分方面是相似的。鑑於這些結果，很可能IRM策略的這個部分(為ECB確立的庇護區接近度指導方針)也將適用於SWCB。但是，由於可供測試的SWCB數目少，1999年的結果受到了妨礙，作者已指出該項工作將在2000年的季節繼續進行。有關其他次要害蟲(例如BCW、FAW、SCSB等)的研究也缺乏，這類研究對於其中這些害蟲可能令人格外關注的特定區域會是有用的。但是，1998SAP指出，在次要玉米害蟲當中，CEW和SWCB應最優先進行生物學研究。根據農業害蟲的這些特徵和行為，最常用的庇護區策略稱為"地塊(block)，，庇護區或"地帶(strip)，，庇護區。NC-205小組推薦了對於Bt玉米的三個庇護區布置選擇方案靠近田地種植的地塊、在田地當中種植的地塊或者在田地當中種植的地帶(Ostlie等人1997)。一般來說，庇護區可設置為田地邊緣或畦頭上的外部地塊，或者為Bt玉米田地當中的地帶。研究已證實，ECB幼蟲能夠在行中或行間移動越過最多六抹玉米，大部分的移動出現在單行中。晚齡(第四齡和第五齡)ECB更有可能在行中移動而不是在行間移動(Hdlmich1998)。這是備受關注的原因所在，因為雜合的(部分抗性的)ECB幼蟲可能開始啃食Bt植抹，然後移動到非Bt植林(如果在附近種植的話)以完成發育，從而挫敗高劑量策略和增加抗性的風險。由於這個原因，種子混合區(通過在播種機(hopper)中將種子混合而產生的庇護區)通常不是推薦的庇護區(Mallet&Porter1992,Buschman等人1997)。Buschman等人(1997)建議田地內庇護區是IRM計劃的理想策略。由於ECB幼蟲趨向於在行內移動，作者建議完整的玉米行作為可接受的庇護區。窄的地帶(用非Bt玉米種子裝播種機的一個或兩個播種箱)或寬的地帶(用非Bt玉米種子裝整個播種機)可用作田地內庇護區。數據表明，田地內地帶可為Bt玉米中產生的ECB提供最好的機會來與非Bt玉米的ECB交配。由於初步的數據提示庇護區離Bt玉米應該在100行以內，Buschman等人(1997)推薦交替種植96行非Bt玉米地帶和192行Bt玉米地帶。這會導致33%的庇護區離Bt玉米在100行以內。目前，田地內地帶(作為完整的行種植)應延伸田地的整體長度，包括最少六行交替種植的非Bt玉米與Bt玉米雜交體。NC-205推薦當執行田地內地帶庇護區策略時種植6-12行非Bt玉米(NC205Supplement1998)。2000SAP還一致同意，由於幼蟲移動的緣故，較寬的保護區地帶優於較窄的地帶，儘管對於一些規模較小的種植者來說，播種機大小可能會限制地帶大小(SAP2001)。田地內地帶可提供最大的潛在可能以確保易感成蟲和抗性成蟲之間的交配，因為這種地帶能使成蟲遺傳混合(geneticmixing)最大化。建模表明，當使用20%庇護區時，至少6行寬的地帶對於ECBIRM來說與鄰近地塊一樣有效(Onstad&Guse1999)。但是，僅有兩行寬的地帶可以與地塊一樣有效，但危險性可能比地塊或更寬地帶高，因為我們對易感鑽心蟲和雜合鑽心蟲之間的存活差異了解不完全(01^&01&Gould1998)。鑑於目前關注的幼蟲移動和隨機交配需求的問題，外部地塊或者田地內地帶(橫跨整個田地，至少6行寬)是可以使抗性發展的風險減至最低的庇護區設計。研究表明隨機交配極有可能在田地內地帶發生。但是如前所述，從作物損害和農場主是否遵守的角度，這個IRM策略會有問題。此外，根據現有的科學信念，目前必須設置庇護區，使得易感蛾(來自庇護區)和可能的抗性倖存者(來自Bt田地)之間的隨機交配的潛在可能最大化。因此，當討論庇護區接近度時，害蟲飛行行為是一個關鍵的考慮因素。作為外部地塊種植的庇護區應靠近或非常接近Bt玉米田地(Onstad&Gould1998，Ostlie等人1997b)。NC-205最初推薦庇護區應種植在％地段(section)(320英畝)當中(NC-205Supplement1998)。隨後，該推薦經^"改^見定非Bt玉米庇護區應布置在離Bt田地V2英裡0英裡將更好)以內(Ortman1999)。Hunt等人(1997)完成的研究提示，大部分ECB不會擴散到離它們的蛹羽化地點很遠的地方。根據這個標記-再捕捉研究，大部分ECB擴散可能不超過1500-2000英尺。大部分的(70-98%)被再次捕捉的ECB在離釋放地點1500英尺以內被誘捕。但是，在1997年的研究的補遺中，作者告誡說1500英尺距離未必代表ECB的最大擴散距離(Hunt等人1998a)。另一個標記-再捕捉ECB項目專注研究羽化ECB(特別是未交配雌蟲)的田地內移動(Hunt等人1998b)。再捕捉到的未交配雌蟲相對較少(整個試驗中有10隻)，不過它們大部分是在離釋放地點85英尺以內找到。這提示未交配雌蟲可能不會擴散到離蛹羽化地點很遠的地方(這在灌溉田地中尤為如此)。另外，在灌溉田地中有相對4交高比例的已交配雌蟲(31%)在離釋放地點10英尺以內的地方被誘捕，這提示交配發生在非常靠近羽化地點的地方。這兩個觀察結論都表明，許多羽化的ECB雌蟲可能不擴散到它們發源田地以外的地方。就抗性治理和庇護區接近度而言，這些結果提示庇護區應布置在非常靠近Bt玉米田地的地方(或者作為田地內庇護區布置)，以增加隨機交配的機會(特別是對於灌溉田地)。在雄蟲ECB擴散方面，Showers等人(2001)進行的另一標記-再捕捉研究顯示，為尋找配偶而擴散的雄蟲可移動很長的距離(>800m)。但是，更大比例的雄蟲是在離釋放地點較近的距離(200m)被誘捕。根據這項研究，作者提出就雄蟲移動而言，目前的^英裡的庇護區接近度指導方針應當足以確保易感蛾和來自Bt田地的任何抗性倖存者之間的交配。雖然清楚知道ECB擴散隨著遠離蛹羽化地點而降低，但還沒有完全確知ECB的定量擴散行為。但是，就最佳庇護區布置而言，在目前接受的標準下，庇護區接近度選定成使得隨機交配的潛在可能最大化被認為是關鍵的。根據Himt等人的數據，庇護區離Bt玉米越近，抗性的風險越低。由於最大數量的ECB是在離田地1500英尺以內的地方4皮捕4足，且大部分的雌蟲可在離田地10英尺以內的地方交配，將庇護區布置在儘可能靠近Bt田地的地方應當能增加隨機交配的機會和減少抗性的風險。目前，Bt玉米的接近度要求是Y2英裡(在過去用過殺昆蟲劑處理ECB和SWCB的地區是W英裡)(EPA致Bt玉米註冊人的信函，2000年1月31日)。2000SAP同意這個指導方針，指出庇護區應設置在離Bt玉米田地不超過半英裡的地方(如果可能的話乂英裡以內)(SAP2001)。當然，這些庇護區選擇方案的每一個(地塊、地帶等)在其執行中會帶來另外的難題。如前所述，這些方法要讓農場主的田地的一些部分對昆蟲侵擾易感，以確保有易感昆蟲發展並可供與田地中的任何抗性害蟲交配。這導致很大的產量損失，因為目前這種庇護區必須佔至少20%的田地。由於庇護區部分的轉基因抗害蟲作物導致產量下降，如前所述還存在農場主是否遵守庇護區要求的問題。時間和空間f匕護區採用時間和空間鑲嵌方案(temporalandspatialmosaics)作為結構化庇護區的替代策略來延遲抗性，已得到了一定的關注。時間庇護區在理論上將是通過使Bt部分的作物在這種作物最會吸引ECB的時間裡得到種植，來操縱ECB的生活周期。例如，會在種植常規玉米幾個星期前種植Bt玉米田地。由於ECB據認為優先在長勢較高的玉米植抹上產卵，希望是被侵擾的會是Bt玉米而不是長勢較低吸引力較差的常規玉米。但是，田地專家們指出，時間庇護區是結構化庇護區的劣等替代方案(SAP1998)。研究已證實，不能用種植曰期來準確預測和操縱ECB產卵率(Calvin等人1997，Rice等人1997，Ostlie等人1997b,Calvin1998)。當地氣候對玉米物候現象的影響使得種植日期成為操縱治理ECB的一個困難因素。將不得不在多種多樣的條件下進行另外的研究，以完全回答這個問題。另外，時間鑲嵌方案可導致類聚交配(assortivemating),其中來自Bt玉米的抗性蛾會互相交配，因為它們的發育時間與乂人庇護區羽化的易感蛾不同(Gould1994)。空間鑲嵌方案涉及到種植具有不同作用模式的兩個單獨的Bt玉米事件。想法是，昆蟲群體會暴露於多種蛋白質，從而減少對任何一種蛋白質的抗性的可能性。但是，目前註冊的產品僅表達一種蛋白質，而玉米的主要害蟲(ECB、CEW、SWCB)在整個幼蟲啃食期通常保持在同一植林上，昆蟲個體只會暴露於其中一種蛋白質。在產生易感昆蟲的結構化庇護區不存在下，抗性仍可能具有在這種系統中發展的潛在可能，就像它會在單一蛋白單作區(monoculture)中發展那樣。因此，目前接受的觀點與本文公開的庇護區策略的類型相背離。已知在生長季節中，CEW從南方越冬地點向北遷移到美國玉米帶的玉米生長地區。但是，已記錄到CEW從北到南遷飛(從玉米生長區到棉花生長區)的觀測結果。雖然需要更多的研究來確證，但這個現象會導致對Bt作物有額外暴露和對CEW抗性的選擇壓力增加。以下事實還使這個影響複雜化Bt棉花或任何註冊的Bt玉米事件對CEW而言都不含高劑量。由此，可能有必要考慮額外的針對CEW的減輕措施。考慮到這個問題，2000SAP指出CEW庇護區最好在地區規模上加以考慮(而不是單個農場規模上的結構化庇護區)，因為這種害蟲通常能夠進行長距離遷移(即庇護區接近度對於CEW來說沒那麼重要)。根據SAP,20。/o庇護區(每個農場)對於CEW將是足夠的，如果該地區中的Bt玉米的數量不超過總玉米作物的50%的話。但是如果地區性價玉米作物超過50%,可能需要額外的結構化庇護區(SAP2001)。但是，SAP沒有定義"地區"應是怎樣的地區(即國家、州還是其他區域)。根據最近可獲得的Bt玉米英畝面積數據，應指出的是美國玉米帶中的許多縣超過2000SAP所確認的50。/。閾值。因為這一點，可能有CEW抗性的額外風險。在Bt玉米超過50%的地區中額外增加結構化庇護區，可減輕這個風險。但是，可能需要進行額外的研究，來完全確定CEW從北到南遷移的風險和適當的減輕措施。目前公認的庇護區選擇方案高劑量事件；MON810、BT11和TC1507(飼料玉米)不定期噴灑殺昆蟲劑的非棉花地區這個地區涵蓋高地平原(HighPlains)東部的玉米帶的大部分區域。最初的USDANC-205庇護區推薦意見包括20-30。/。不經處理的結構化庇護區或者可用非Bt殺昆蟲劑處理的40%庇護區(Ostlie等人1997a)。在ECB(美國大部分地區的主要玉米害蟲)的情況中，已知平均不到10%的種植者使用殺昆蟲劑處理來控制這種害蟲(美國食品與農業政策中心,NationalCenterforFoodandAgriculturePolicy1999)。由於許多種植者沒有定期處理ECB,NC-205在1999年5月24日致JanetAndersen博士(BPPD主任)的信函中修正了他們的立場。在這個信函中，NC-205將他們的推薦修訂為，20。/。非Bt玉米庇護區可用殺昆蟲劑處理，且應布置在離Bt玉米乂2英裡以內(y4英裡更好)。信函中具體的推薦意見如下l)對庇護區的殺昆蟲劑處理應基於偵察研究和公認的經濟閾值，2)處理應在不含Bt或Cry毒素的產品上進行，3)應對受處理的庇護區進行記錄並與EPA共享，4)應緊密監測被噴灑的庇護區的潛在影響並每年進行評估，和5)在較高風險區域例如用殺昆蟲劑處理的庇護區應最頻繁地監測抗性(Ortman1999)。由於大部分的種植者通常不用殺昆蟲劑處理飼料玉米以控制ECB，如果ECB密度超過經濟閾值的話可用非Bt殺昆蟲劑噴灑的20%非Bt玉米的庇護區，對於美國玉米帶應當是可行的。庇護區可按需用非Bt殺昆蟲劑或其他適當的IPM措施進行處理，以控制鱗翅目莖稈鑽心昆蟲。殺昆蟲劑的使用應基於使用經濟閾值作為IPM計劃的一部分的偵察工作。一些實驗室研究證明，在BollgardII中表達的單獨Cry2Ab蛋白和Cry2Ab+CrylAc蛋白在BollgardII棉花中產生功能性"高劑量"以供控制CBW、TBW和PBW。這些研究將在下文討論。EPA之前斷定，在目前的Bollgard株系中有中等非高劑量的CrylAc產生以控制CBW,有功能性高劑量的CrylAc產生以控制TBW和PBW(USEPA1998，2001)。下表將幫助讀者認識昆蟲害蟲的首字母縮略詞。注意，表中列出的是作為轉基因害蟲抗性策略的目標的最常見害蟲，但本發明並不僅限於這些害蟲。表ltableseeoriginaldocumentpage22tableseeoriginaldocumentpage23因此，仍需要治理抗害蟲作物的田地中的害蟲抗性的方法。要是能提供保護植物特別是玉米植物免受害蟲的啃食損害的改進方法，將是有益的。如果這種方法會減少常規化學殺蟲劑的所需施用頻率的話，還有如果它會減少作物種植和栽培所需的單獨田地操作數量的話，將是特別有益的。另外，要是有在轉基因作物的田地中而不是在轉基因作物的田地的周圍布置管理機關所要求的轉基因庇護區的方法，將是有益的。發明概述提供了治理抗害蟲作物的田地中的害蟲抗'l"生的方法。所述方法包括在一個種植周期在田地中種植第一抗害蟲作物，接著在下一種植周期在同一田地中種植第二抗害蟲作物，其中所述第一和第二抗害蟲作物對同一目標害蟲具有殺蟲作用，但通過不同的殺蟲作用模式起作用。使用本發明的方法，種植者現在可以在某田地中種植玉米之後的種植周期在同一田地種植玉米作物。在本發明之前，這樣做是不明智的，因為存在根蟲對作物的損害的風險。此外，由於最近在其他的作物中已有根蟲活動，所述方法提供了控制根蟲擴散的方法和針對根蟲的抗性治理策略。本發明的玉米才艮蟲包J舌例濁口"Za6raric(2vz'rg7/eravz>gz/era(LeConte)、D勵ra"'ca6arZen'(SmithandLawrence)、_D/"6ra"catmcfec/m戶wctatoAo而W(Barber)和Z)/"Zra〃c"Wrg^ra(KrysanandSmith)。本發明採用到不同的殺蟲作用模式。對根蟲的抗性可通過任何本領域公知的方法引入到作物中。在一些實施方案中，不同的殺蟲作用模式包括毒素與玉米根蟲腸膜中的不同結合位點的結合。本發明的可用於抵抗根蟲的轉基因包括但不限於編碼Bt蛋白Cry3A、Cry3Bb和Cry34AM/Cry35Abl蛋白的轉基因。其他的適合其他害蟲的轉基因在本文中討論。在一些實施方案中，將一種或兩種抗害蟲作物進一步用選自以下的殺蟲劑處理除蟲菊酯類和合成的除蟲菊酯類、噁二溱類、氯煙醯類、硝基胍類、三唑類、有機磷酸酯、吡咯類、吡唑類、酚吡唑類、雙醯肼類、生物/發酵產物、氨基曱酸酯類和它們的組合。在其他的實施方案中，一種或兩種抗害蟲作物還含有選自以下的除草劑抗性基因草甘磷N-乙醯轉移酶(GAT)、5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、草丁膦(phosphinothricin)N-乙醯轉移酶(PAT)和它們的組合。雖然本發明是在根蟲情形中描述的，但本文所公開的根本概念也可應用於在其他害蟲的情形中需要抗性治理的田地，所述其他害蟲包括歐洲玉米鑽心蟲(ECB)(Os,n'm'aww&7afo)、西南玉米鑽心蟲(SWCB)(Z),"^e"gra"d/ose〃fl)、玉米穗蟲(CEW)(//Wcovew"zea)、西部豆切才艮蟲(WBCW)"/Z)icos/fl)、一大4亍軍蟲(FAW)(6^oc/optera/n^^enia)或小地老虎(BCW)(jgra/^Zfw7ow)。本發明還可進行組合使用，使得多種害蟲在應用所述方法的過程中得到控制，無論是通過轉基因手段還是其他手段。優選實施方案的詳細描述本發明提供旨在治理抗害蟲作物的田地中的抗性的方法。具體的說，所述方法包括在一個種植周期在田地中種植第一抗害蟲作物，接著在下一種植周期在同一田地中種植第二抗害蟲作物，其中所述第一和第二抗害蟲作物對玉米根蟲具有殺蟲作用，但通過不同的殺蟲作用模式起作用。應認識到，抗性性狀可通過轉化方法(即轉基因方法)或傳統育種方法引入到作物中。所謂"殺蟲(的)"是指針對害蟲(例如CRW)的毒性作用，包括外部供應的殺蟲劑和/或作物產生的殺蟲劑的之一或兩者的活性。本文所用的術語"不同的殺蟲作用模式"包括一種或多種抗性性狀的殺蟲作物中，所述殺蟲作用例如該作物產生的殺蟲毒素與玉米根蟲腸膜中的不同結合位點(即不同的毒素受體和/或同一毒素受體上的不同位點)的結合。本文所用的術語"轉基因抗害蟲作物"是指衍自被轉化的植物細胞或原生質體的植抹或其後代(包括種子)，其中該植株DNA含有引入的異源DNA分子，該DNA分子原先不存在於相同林系的天然、非轉基因植抹中，能賦予對一種或多種玉米根蟲的抗性。該術語指包含異源DNA的原始轉化抹和該轉化抹的後代。該術語還指通過該轉化林和另一包含該異源DNA的品種之間的有性遠交產生的後代。還要認識到，兩抹不同的轉基因植抹還可進行交配，產生含有兩個或多個獨立分離、加入的異源基因的後代。適當的後代的自交可產生該兩個所加入的異源基因的純合植林。還設想到與親本植抹的回交和與非轉基因植株的遠交，還有無性繁殖。有關其他常用於不同性狀和作物的育種方法的描述，可在幾個參考文獻之一找到，例如Fehr(1987)，5reec/wgAfe^O(is/orCw/WvflrDeve/o;meW,ed.J.Wilcox(AmericanSocietyofAgronomy,Madison,WI),每個文獻通過引用併入本文。育種方法還可用來將任何天然抗性基因轉移到作物中。所謂"植物，，意指主要的食物作物和纖維作物，包括例如玉米、高粱、小麥、向日葵、棉花、水稻、大豆、大米、油菜和馬鈴薯。本文所用的術語"玉米，，是指學名為玉米(Zeawa>^)，包括可與玉米交配的所有植物品種，包括野生玉米品種在內。在一個實施方案中，所公開的方法可用於治理抗害蟲玉米的田地中的抗性問題，該田地在玉米種植後有計劃地種植玉米(即連作玉米)。在另一個實施方案中，所述方法可用於治理第一年抗害蟲玉米的田地中的抗性問題，即該田地在兩年輪作周期中第一年種植玉米後跟著種植另一作物(例如大豆)。在本發明中還設想到了其他的輪作周期，例如種植玉米後接著多年種植一種或多種其他作物，以防止在其他滯育期長的害蟲中可能隨時間推移而發展的抗性。將核苷酸序列穩定引入到植物中並表達其中所編碼的蛋白質的方法，是本領域公知的。"引入"意指將核苷酸序列以使得該序列能進入植物的細胞的內部的方式呈遞給該植物。本發明方法並沒有依賴於具體的將核苷酸序列^1入植物中的方法，只要該核普酸序列能進入該植物的細胞的內部即可。轉化方案以及將核苷酸序列引入到植物中的方案，可根據要進行轉化的植物或植物細胞(即單子葉植物或雙子葉植物)的類型而變。例如，將核苷酸引入到植物中的合適方法包括微注射(CrosswayW(1986)4:320-334)、電穿孔(Riggs"(1986)7Va,/.^cac/.5W."61483:5602-5606)、農桿菌介導的轉化(5，563，055號和5,981,840號美國專利，兩專利都通過引用併入本文)、直接基因轉移(PaszkowskiWa/.(1984)五MS(93:2717-2722)、彈道顆粒加速(ballisticparticleacceleration)(參見例如4,945,050號、5,879,918號、5,886,244號和5,932,782號美國專利(每個專利都通過引用併入本文)；和TomesWa/,(1995)"DirectDNATransferintoIntactPlantCellsviaMicroprojectileBombardment,"P/滅CW/'71ww,aw<iCw/似wFwwc/amewto/MeAotfe,ed.GamborgandPhillips(Springer-Verlag,Berlin);McCabe"a/.(1988)說otec/mo/ogy6:923-926)和Lecl轉化(參見例如WO00/28058)。另參見Weissinger"a/.(1988)^"w.Aev.Gew"22:421-477;Sanford"a/.(1987)屍ar"cw/ateSdewce7k;/mo/ogy5:27-37(洋蔥)；Christou"a/.(1988)屍te屍A戸'o/.87:671-674(大豆)；McCabe"a/.(1988)歷o/7fec/mo/ogy6:923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)松raCe〃Z)ev.歷o/.27P:175畫182(大豆)；Singh"a/.(1998)^;/.G^"^96:319-324(大豆)；DattaW(1990)說'otec/mo/ogy8:736-740(水稻)；Klein"(1988)屍rac.A^/.^c"《85:4305-4309(玉米)；Klein"a/.(1988)萬z'otec/mo/ogy6:559-563(玉米)；5,240,855號、5,322,783號和5,324,646號美國專利(每個專利都通過引用併入本文)；Klein"a/.(1988)屍/awf屍/yw'o/.91:440-444(玉米);Fromm"a/.(1990)胸ec/mo/ogy8:833-839(玉米)；Hooykaas-VanSlogteren"a/.(1984)(Xo油w」311:763-764;5,736,369號美國專利(穀類)；Bytebier"a/.(1987)屍rac.淑/.爿cat/,84:5345-5349(百合)；DeWetwa/.(1985)in77^5"xpen'mento/AfflmJ!7M/a"owo/(9vw/e7ilwwas'ed.Chapmana/.(Longman,NewYork),pp.197-209(pollen);Kaeppler"a/.(1990)屍/a^CW/Wepor&9:415-418和Kaeppler(1992)T7^c^J/;/.GWze/.84:560-566(頸鬚介導的專爭4b，whisker-mediatedtransformation);D'Halluin"a/,(1992)屍/歸'Ce//4:M95-1505(電穿孔);Lie/"/,(1993)屍/a^Ce〃鄉om12:250-255;Christou和Ford(1995)X朋油o/萬otowy75:407-413(7jc牙舀)；和OsjodaWa/.(1996)iV"似re"&&c/wo/og>>14:745-750(玉米，通過才艮瘤農桿菌(XgraZacten'i/m似we/ac,ew力)。在其他實施方案中，可通過將植物與病毒或病毒核酸接觸，使核苷酸序列引入到植物中。一般來說，這種方法涉及將核苷酸序列摻入到病毒DNA或RNA分子當中。應i人識到，核苷酸序列可以最初作為病毒聚蛋白的一部分合成，病毒聚蛋白然後可通過體內或體外蛋白水解進行加工，產生期望的重組蛋白。涉及病毒DNA或RNA分子的將核苷酸序列引入到植物中並表達其中所編碼的蛋白質的方法，是本領域公知的。參見例如5,889,191號、5,889,190號、5,866,785號、5,589,367號和5,316,931號美國專利(每個專利都通過引用併入本文)；牙口Porta"a/.(1996)Mo/ecw/arS/otec/mo/ogy5:209-221。本領域已知有將核苷酸定向插入到植物基因組中的特定位置的方法。在一個實施方案中，核苷酸序列在期望的基因組位置的插入是用位點特異性重組系統實現的。參見例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853。簡單地說，核苷酸序列可含在轉移盒(transfercassette)中，該轉移盒兩側接有兩個非重組發生的(non-recombinogenic)重組位點。將轉移盒？1入到其基因組中穩定摻入了這樣的目標位點的植物中，該目標位點兩側接有兩個對應於轉移盒的位點的非重組發生的重組位點。提供適當的重組酶，轉移盒被整合在目標位點。目的核香酸序列因此被整合在植物基因組中的特定染色體位置。本文所用的術語"不同的殺蟲作用模式"包括一種或多種抗性性狀的殺蟲作用，不管這些抗性性狀是通過轉化還是通過傳統育種方法引入到作物中，所述殺蟲作用例如該作物產生的殺蟲毒素與玉米根蟲腸膜中的不同結合位點(即不同的毒素受體和/或同一毒素受體上的不同位點)的結合。就殺蟲作用模式而言，各殺蟲化合物如果它們在害蟲中具有相同的結合位點，而沒有一種化合物會結合而另一種化合物不會結合的結合位點，則它們"竟爭地"進行結合。例如，如果化合物A4又使用結合位點1和2,而化合物B也僅使用結合位點1和2,則化合物A和B"竟爭地，，進行結合。各殺蟲化合物如果它們在害蟲中具有至少一個共同的結合位點，但也有至少一個不共同的結合位點，則它們"半竟爭地"進行結合。例如，如果化合物C使用結合位點3和4,而化合物D僅使用結合位點3，則化合物C和D"半竟爭地，，進行結合。各殺蟲化合物如果它們在害蟲中沒有共同的結合位點，則它們"非竟爭地，，進行結合。例如，如果化合物E使用結合位點5和6，而化合物F使用結合位點7，則化合物E和F"非竟爭地"進行結合。在一些實施方案中，所述不同的殺蟲作用模式是通過衍自某蘇雲金桿菌(Bt)菌林的異源基因的表達提供的，所述異源基因例如編碼衍自Bt的殺蟲S-內毒素的異源基因，其中該基因已被穩定引入到轉基因植物中。這種S-內毒素描述於例如Crickmore"(1998)M/cra.Mo/.腸.iev.62:807-813;5,691,308號、5，188,960號、6,180,774號和5,689,052號美國專利(每個專利都通過引用併入本文);WO2899/24581和WO99/31248,包括例如編碼Cry蛋白CrylA、CrylA(a)、CrylA(b)、CrylA(c)、CrylC、CrylD、CryIE、CrylF、Cry2A、Cry3Bb、Cry9C及它們的變體的基因。應認識到，可使用這些核苷酸序列的變體和片段，只要它們編碼具有殺蟲活性的Cry多肽。價5-內毒素作為前毒素合成，作為類芽孢內含體結晶。當被昆蟲害蟲攝食時，微晶結構被昆蟲中腸的鹼性pH溶解，前毒素被昆蟲腸蛋白酶切割產生活性毒素。激活的Bt毒素結合昆蟲腸上皮中的受體，造成膜損傷和伴隨的昆蟲腸膨脹和裂解。昆蟲因飢餓和敗血症而死亡。參見例如Lie,a/.(1991)A/fl似re353:815-821;Aronson(2002)Ce〃Mo/.h/eSc/,59(3):417-425;Schnepf"a/.(1998)Mz'cro.Mo/.祝o/.紐62:775-806。在其他實施方案中，異源基因衍自Bt變體(例如Avar.^ae/ew^s),其中毒素於Cry家族不相關，其殺蟲作用模式不同於S-內毒素。示例性的毒素包括CytA毒素和植物殺蟲蛋白(VIPs)。VIPs(例如VIP1類、VIP2類或VIP3類的成員)是分泌性蛋白質，通過昆蟲中腸液進行蛋白水解加工。它們具有抗廣譜的鱗翅目昆蟲的殺蟲活性。參見例如5,877,012號美國專利(通過引用併入本文)。在另外的實施方案中，所述不同的殺蟲作用模式是通過編碼殺蟲脂肪酶的異源基因的表達來提供，其中該基因已被穩定引入到轉基因植物中。任何編碼具有殺蟲活性的脂肪酶多肽的核苷酸序列都可用來實施本發明方法。術語"殺蟲脂肪酶"包括對昆蟲害蟲具有毒性或抑制作用的脂質醯基水解酶的家族的任何成員。脂肪酶是本領域公知的。脂肪酶中有一類是脂質醯基水解酶類，也稱三醯基甘油醯基水解酶或三醯基甘油脂肪酶(在IUBMB命名體系中稱為EC3.1.1.3酶)。這些酶催化水解反應三醯基甘油+H20=二醯基甘油+羧酸。脂質醯基水解酶都共享共同的稱為催化三元體(catalytictriad)的保守易分割結構區域。催化三元體由甘氨酸-X胺基酸-絲氨酸-X胺基酸-甘氨酸模體(GxSxG)組成。已證實這個區域中的胺基酸置換會消除酶促活性。這些脂質醯基水解酶的酶促作用也與顯著的殺昆蟲活性相關。參見例如6,657,046號和5,743,477號美國專利中公開的殺昆蟲脂肪酶(兩個專利都通過引用併入本文)。可用於實施本發明方法的其他殺蟲蛋白包括但不限於二元毒素，如Cry34類和Cry35類的Bt結晶蛋白(參見例如Schnepf"a/.(2005)^//.￡>m>o".MZcraZnW.71:1765-1774)，以及鏈黴菌屬(5Vre/7tom少c&y)的月旦固醇氧化酶，和書亍自Zewor/^Z^w屬和屍AotoWa^dws屬各種糹田菌、J5ac/〃ws/"/ercw/on^和5"c/〃wss/Aaehcws等的殺蟲蛋白。還設想到使用嵌合(雜合)毒素(參見例如Bosch等人(1994)歷o/Tec/mo/ogy12:915-918)。本發明還包括具有超過一種異源基因的轉基因植物(即各異源基因的組合被穩定引入到植物中)。這種轉化體可含有衍自同一類別毒素(例如超過一種S-內毒素、超過一種殺蟲脂肪酶、超過一種二元毒素等)的轉基因，或者可衍自不同類別的毒素(例如S-內毒素與殺蟲脂肪酶或二元毒素的組合)的轉基因。例如，具有表達衍自Bt的殺昆蟲S-內毒素(如CrylF)的能力的植物，也具有表達至少一種不同於CrylF蛋白的其他S-內毒素如CrylA(b)蛋白的能力。類似地，具有表達衍自Bt的殺昆蟲5-內毒素(如CrylF)的能力的植物，也具有表達殺蟲脂肪酶如脂質醯基水解酶的能力。同樣，具有表達二元毒素(如Cry34/35蛋白)的能力的植物，也具有表達至少一種不同於Cry34/35蛋白的其他殺蟲蛋白如5-內毒素(例如Cry3Bb蛋白)的能力。Bt毒素和殺蟲脂肪酶的毒性和抑制作用包括但不限於阻礙幼蟲生長，殺滅卵或幼蟲，減少成蟲或幼蟲啃食轉基因植物(相對於在野生型植物上觀察到的啃食情況)和誘導昆蟲的與啃食、築巢或繁殖相關的躲避行為。在某些實施方案中，用於本發明方法的核苷酸序列可與各目的核苷酸序列的任何組合進行堆積(stack),以產生具有期望的性狀的植物。本文所用的"性狀"指衍自特定序列或序列群組的表型。單一表達盒可含有編碼目的殺蟲蛋白的核普酸和至少一個另外的基因，如用來增加或改進轉基因植物的期望性質的基因。或者，另外的基因可在多個表達盒上提供。這些堆積組合可通過任何方法產生，包括但不限於通過任何常規方法或頂交(TopCross)方法進行的雜交育種，或者遺傳轉化。如果各序列是通過遺傳轉化植物來堆積的，各個目的多核苷酸序列可在任何時間和以任何順序進行組合。例如，可將包含一個或多個期望的性狀(例如殺蟲毒素的產生)的轉基因植物用作目標，以通過隨後的轉化引入更多的性狀。可用通過轉化盒(transformationcassette)的任何組合提供的各目的核苷酸序列，按共轉化方案同時引入各性狀。例如，如果要引入兩個序列，該兩個序列可各自含在單獨的轉化盒(反式(trans))中，或者可含在同一個轉化盒動Z還認識到，可使用位點特異性5重組;、統，3將各二:因;積在期望的基因組位置。參見例如WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853。在實踐中，根據殺蟲作用的性質和某些害蟲對某些毒素的易感性，之前描迷的不同Bt基因和其他基因的某些堆積組合(stackedcombinations)最適合於某些害蟲。例如，一些轉基因組合特別適用於對抗不同類型的CRW(包括WCRW、NCRW、MCRW和NCRW)。這些組合包括Cry34/35和Cry3A及Cry34/35和Cry3B。如前所述，基因堆積也可在這個情形使用。對於其他的害蟲，也已知有其他的組合。例如，適合用於抵抗ECB和/或SWCB的組合包括CrylAb和CrylF、CrylAb和Cry2、CrylAb和Cry9、CrylAb和Cry2/Vip3A堆積、CrylAb和CrylF/Vip3A堆積、CrylF和Cry2、CrylF和Cry9以及CrylF和Cry2/Vip3A堆積。適合用於抵抗CEW的組合包括CrylAb和Cry2、CrylF和Cry2、CrylAb和Cry2/Vip3A堆積、CrylAb和CrylF/Vip3A堆積以及CrylF和Cry2/Vip3A堆積。適合用於抵抗FAW、BCW和/或WBCW的組合包括CrylAb和Cry2/Vip3A堆積、這些不同的組合還可互相組合，以提供對多種害蟲的抗性治理。在其他的實施方案中，第一和/或第二抗害蟲作物任選用殺蟲劑或殺昆蟲劑進行處理。所謂"殺蟲劑"是指在外部供應到作物或作物種子的化學殺蟲劑。術語"殺昆蟲劑"具有與殺蟲劑相同的含義，例外的是它的使用是針對害蟲屬昆蟲的那些情況。適用於本發明的殺蟲劑包括除蟲菊酯和合成的擬除蟲菊酯；嗯二。泰書f生物；氯煙醯類(chloronicotinyls);硝基胍衍生物；三唑類；有機磷酸酯類；吡咯類；吡唑類；苯基吡唑類；雙醯肼類；生物/發酵產物和氨基曱酸酯類。這些類另'J當中的已知殺蟲劑歹寸舉在例如7Tze屍&s"c^eAfawwa/，llthed.,(1997)ed.C.D.S.Tomlin(BritishCropProtectionCouncil,Farnham,Surrey,UK)中。屬嗯二溱衍生物的殺昆蟲劑可用於本發明方法。可用於本發明的示例性嚼二。秦^"生物包括在5,852,012號美國專利中指出的那些螺二嗪衍生物(該專利通過引用併入本文)。氯煙醯類殺昆蟲劑也可用於本發明方法。可用於本發明方法的示例性氯煙醯類在5,952,358號美國專利中有描述(該專利通過引用併入本文)。硝基胍殺昆蟲劑也可用於本發明方法。這種硝基胍類可包括5,633,375號、5,034,404號和5,245,040號美國專利中描述的那些硝基胍類(每個專利都通過引用併入本文)。可用於本發明方法的吡咯、吡唑和苯基吡哇殺昆蟲劑包括在5,952,358號美國專利中描述的那些吡咯、吡唑和苯基吡唑殺昆蟲劑(該專利通過引用併入本文)。在本文中當描述某種殺昆蟲劑時，應理解的是，該描述意在包括能顯示與所描述的殺昆蟲劑形式相同的殺昆蟲活性的該殺昆蟲劑的鹽形式以及該殺昆蟲劑的任何異構形式和/或互變異構形式。可用於本發明方法的殺昆蟲劑可以為任何在商業交易中被批准用作這種殺昆蟲劑的等級或純度。在還其他的實施方案中，第一和/或第二抗害蟲作物任選用殺蟎劑、殺線蟲劑、殺真菌劑、殺細菌劑、除草劑和它們的組合進行處理。在更多的實施方案中，第一和/或第二抗害蟲作物還含有能提供除草劑耐受性的除草劑抗性基因，例如抗草甘磷-N-(膦醯基曱基)甘氨酸(包括這種除草劑的異丙胺鹽形式)的基因。示例性的除草劑抗性基因包括草甘磷N-乙醯轉移酶(GAT)基因和5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因。除草劑抗性基因通常編碼對除蟲劑不敏感的經修飾目標蛋白，或者編碼能在除草劑起作用之前將植物中的該除草劑降解或解毒的酶。參見DeBlock"(1987)嵐卵J.6:2513;DeBlockw"/.(1989)i^>wo/.91:691;Fromm"(1990)歷o7k^"o/ogy8:833;Gordon-Kamm"a/.(1990)Ce〃2:603;和Frische/a/.(1995)P/aWMo/.歷o/.27:405-9。例如，《吏用編碼突變的目標酶5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶和乙醯乳酸合酶(ALS)的基因，已獲得了對草甘磷或磺醯脲除草劑的抗性。通過使用編碼草丁膦乙醯轉移酶、腈水解酶或2,4-二氯苯氧基乙酸單加氧酶的細菌基因，已獲得了對草銨膦、溴苯腈和2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性，所述三種酶分別解毒這三種除草劑。本說明書中提到的所有出版物和專利申請是表示本發明所屬的
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的技術人員的水平。所有出版物和專利申請都通過引用併入本文，就像每個單獨的出版物或專利申請都明確地和單獨地被指出通過引用併入本文。雖然已出於清楚理解的目的通過舉例說明和實例的方式，對前述的各個實施方案進行了一定程度的詳細描述，但顯而易見的是可在所附權利要求書的範圍內實施某些變化和修改方案。3權利要求1.一種治理抗害蟲作物的田地中的抗性的方法，所述方法包括以下步驟a)在一個種植周期在田地中種植第一抗害蟲作物；和b)在第二種植周期在同一田地中種植第二抗害蟲作物，其中所述第一和所述第二抗害蟲作物對同種害蟲具有殺蟲作用，但殺蟲作用的模式不同。2.權利要求1的方法，其中所迷第一和所述第二抗害蟲作物是相同物種。3.權利要求2的方法，其中所述物種是玉米。4.權利要求1的方法，其中所述害蟲選自西部玉米根蟲、北部玉米根蟲、墨西哥玉米根蟲、南部玉米根蟲和它們的組合。5.權利要求l的方法，其中所述害蟲是西部玉米根蟲。6.權利要求1的方法，其中所迷第一和所述第二抗害蟲作物是轉基因抗害蟲作物。7.權利要求6的方法，其中所述不同的殺蟲作用模式包括產生能半竟爭性或非竟爭性結合所述害蟲腸膜中的不同結合位點的蛋白質。8.權利要求6的方法，其中所述第一轉基因抗害蟲作物產生Cry34/35蛋白，所述第二轉基因抗害蟲作物產生Cry3A蛋白。9.權利要求6的方法，其中所述第一轉基因抗害蟲作物產生Cry34/35蛋白，所述第二轉基因抗害蟲作物產生Cry3B蛋白。10.權利要求6的方法，其中所述第一轉基因抗害蟲作物產生CrylA(b)蛋白，所述第二轉基因抗害蟲作物產生CrylF蛋白。11.權利要求6的方法，其中所述第一轉基因抗害蟲作物產生Cry1A(b)蛋白，所述第二轉基因抗害蟲作物產生Cry9蛋白。12.權利要求1的方法，所述方法進一步包括用殺蟲劑處理所述第一抗害蟲作物和/或所述第二抗害蟲作物。13.權利要求12的方法，其中所述殺蟲劑選自殺昆蟲劑、殺蟎劑、殺線蟲劑、殺真菌劑、殺細菌劑、除草劑和它們的組合。14.權利要求13的方法，其中所述殺蟲劑是殺昆蟲劑。15.權利要求14的方法，其中所述殺昆蟲劑選自除蟲菊酯類和合成的除蟲菊酯類、噁二溱類、氯煙醯類、硝基胍類、三唑類、有機磷酸酯、吡咯類、吡唑類、酚吡唑類、雙醯肼類、生物/發酵產物、氨基曱酸酯類和它們的組合。16.權利要求6的方法，其中所述第一轉基因抗害蟲作物或所述第二轉基因抗害蟲作物還含有選自以下的除草劑抗性基因草甘磷N-乙醯轉移酶(GAT)、5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、草丁膦N-乙醯轉移酶(PAT)和它們的組合。全文摘要提供了一種治理抗害蟲作物的田地中的抗性的方法。所述方法包括在一個種植周期在田地中種植第一抗害蟲作物，接著在第二種植周期在同一田地中種植第二抗害蟲作物，其中所述第一和第二抗害蟲作物對玉米根蟲具有殺蟲作用，但通過不同的殺蟲作用模式起作用。文檔編號C12N15/82GK101568642SQ200780047849公開日2009年10月28日申請日期2007年12月26日優先權日2006年12月22日發明者D·J·科斯格羅夫申請人:先鋒高級育種國際公司