一種高含量黃綠蜜環菌多糖的製備方法
2023-11-02 06:29:12 1
一種高含量黃綠蜜環菌多糖的製備方法
【專利摘要】本發明涉及一種高含量黃綠蜜環菌多糖的製備方法，該方法包括以下步驟：⑴將新鮮黃綠蜜環菌乾燥至恆重後，得到乾燥後的黃綠蜜環菌；⑵所述乾燥後的黃綠蜜環菌粉碎成乾粉；⑶在所述乾粉中加入水，然後採用微波提取法提取，得到提取液；⑷所述提取液經減壓濃縮或有機膜濃縮後脫水至浸膏狀，得到濃縮液；⑸所述濃縮液中加入無水乙醇進行沉澱，靜止24h後離心，收集沉澱物A，即得黃綠蜜環菌粗多糖；⑹將所述黃綠蜜環菌粗多糖用純水溶解，過濾後得到上清液，該上清液中加入無水乙醇進行沉澱，靜止24h後離心，收集沉澱物B，該沉澱物B乾燥至恆重，即得多糖含量>80%的黃綠蜜環菌多糖。本發明不但提取時間短、提取率高，而且多糖含量較高，同時節能環保。
【專利說明】一種高含量黃綠蜜環菌多糖的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種高含量多糖的製備方法，尤其涉及一種高含量黃綠蜜環菌多糖的製備方法。
【背景技術】
[0002]黃綠蜜環菌(Amillarialuteo-vriens)，又名黃蘑燕，屬擔子菌亞門，層菌綱，口蘑目，口蘑科，蜜環菌屬。黃綠蜜環菌含有豐富多糖、蛋白質、胺基酸等，具有增強機體免疫功能和抑制腫瘤生長等功效，有較高的營養價值和食療保健作用。
[0003]微波提取法是近年來發展的一種新型的提取技術，該技術具有提取時間短、提取效率高、節能環保等優點。當前，黃綠蜜環菌多糖的提取方法多為水煮提取，該方法較落後，能耗較大。專利「一種抗癌的黃綠蜜環菌多糖及提取工藝」採用超聲提取方法提取黃綠蜜環菌中多糖，其提取多糖並未指出多糖含量及多糖提取率，只是指出該多糖具有抗癌活性。文獻「黃綠蜜環菌菌絲體水提物多糖含量測定」中採用回流水提取方法對培養物黃綠蜜環菌菌絲體進行提取，但該菌絲體並非黃綠蜜環菌。專利「黃蘑菇標準化組分製法及其在肝癌治療中的應用」中的抗癌活性成分是黃蘑菇水提取後的殘渣再用丙酮進行提取得到的成分，從植物化學的方面考慮，抗癌活性成分為去除大分子化合物多糖、蛋白後的小分子化合物。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是提供一種提取率高的高含量黃綠蜜環菌多糖的製備方法。
[0005]為解決上述問題，本發明所述的一種高含量黃綠蜜環菌多糖的製備方法，包括以下步驟:
⑴將新鮮黃綠蜜環菌在3(T80°C乾燥至恆重後，得到乾燥後的黃綠蜜環菌；
⑵所述乾燥後的黃綠蜜環菌用超微粉碎機粉碎至粒徑為1(T200 um的乾粉；
⑶在所述乾粉中按KTlOOml:lg的液料比加入水，然後採用微波提取法提取，得到提取液；
⑷所述提取液經減壓濃縮或有機膜濃縮後脫水至浸膏狀，得到濃縮液；
(5)所述濃縮液中加入其體積3飛倍的無水乙醇進行沉澱，靜止24h後離心，收集沉澱物A，即得黃綠蜜環菌粗多糖；
(6)將所述黃綠蜜環菌粗多糖用其質量f10倍的純水溶解，過濾後得到上清液，該上清液中加入所述黃綠蜜環菌粗多糖溶解體積的質量3飛倍的無水乙醇進行沉澱，靜止24h後離心，收集沉澱物B，該沉澱物B乾燥至恆重，即得多糖含量>80%的黃綠蜜環菌多糖。
[0006]所述步驟⑶中微波提取條件是指微波功率為5(Tl000W，提取溫度為4(T90°C，提取時間為15?60min。
[0007]所述步驟⑷中減壓濃縮的條件是指真空度為0.0lMPa?0.09MPa，溫度為5(T90°C。
[0008]所述步驟⑷中有機膜為反滲透膜或納濾膜，膜分離操作壓力為0.2?20 MPa。
[0009]所述步驟(6)中的乾燥是指冷凍乾燥、噴霧乾燥、烘箱烘乾中的任意一種。
[0010]所述冷凍乾燥的條件是指冷肼溫度為-5(T-20°C，真空度為20Pa?50 Pa。
[0011]所述噴霧乾燥的條件是指入料流量為200?1000 mL/h,入料溫度為3(T70°C，進風溫度為17(T210°C，進風量為16?28 m3/h。
[0012]所述烘箱乾燥的溫度為4(T70°C。
[0013]本發明與現有技術相比具有以下優點:
1、本發明採用黃綠蜜環菌的超微粉碎物作為提取物，採用微波提取方法提取其多糖，與現有技術相比，不但提取時間短、提取率高(多糖提取率>10%)、而且多糖含量較高，同時汙染少、節能環保，為黃綠蜜環菌多糖的開發提供了依據(參見圖1)。
[0014]2、由於本發明提取多糖含量高、且多糖對肺癌細胞(NC1-H446)具有抗肺癌活性，可廣泛運用於食品、保健品等行業中。
[0015]實驗:
⑴配藥:藥物均由培養基配製，適當超聲溶解，0.22微米濾器過濾，-20°c冰箱保存備用。
[0016]⑵收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度3X104/ml，每孔加入10ul (邊緣孔用無菌PBS填充)。待細胞貼壁後，分別加入8個濃度梯度的藥物(0.02，0.04, 0.08, 0.16,
0.31, 0.63, 1.25，2.50 mg/ml )，設3個復孔，5%C02，37°C孵育48小時，倒置顯微鏡下觀察。
[0017]⑶每孔加入20ul MTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，繼續培養4h。
[0018]⑷終止培養，小心吸去孔內培養液。每孔加入150ul 二甲基亞碸，在酶聯免疫檢測儀0D492nm處測量各孔的吸光值。
[0019](5)同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞碸)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞碸)。
[0020](6)實驗數據通過GraphPad Prism 5進行分析計算。
[0021]實驗結果:黃綠蜜環菌對肺癌細胞(NC1-H446)的IC50為1.03mg/ml。說明黃綠蜜環菌具有良好的抗肺癌活性。
[0022]3、本發明所得的黃綠蜜環菌多糖使用安全，無毒副作用，且製備工藝簡單、質量穩定、適合於規模化生產，具有廣闊的應用前景和市場價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0024]圖1為本發明黃綠蜜環菌多糖的紅外光譜圖。
【具體實施方式】
[0025]實施例1 一種高含量黃綠蜜環菌多糖的製備方法，包括以下步驟:
⑴將新鮮黃綠蜜環菌在30 V乾燥至恆重後，得到乾燥後的黃綠蜜環菌。
[0026]⑵乾燥後的黃綠蜜環菌用超微粉碎機粉碎至粒徑為10 um的乾粉。
[0027]⑶在乾粉中按1ml:lg的液料比加入水，然後採用微波提取法在微波功率為50W、提取溫度為40°C的條件下提取15min，得到提取液。
[0028]⑷提取液在真空度為0.0lMPa、溫度為50°C的條件下經減壓濃縮後脫水至浸膏狀，得到濃縮液。
[0029](5)濃縮液中加入其體積3倍的無水乙醇進行沉澱，靜止24h後離心，收集沉澱物A，即得黃綠蜜環菌粗多糖。
[0030](6)將黃綠蜜環菌粗多糖用其質量I倍的純水溶解，過濾後得到上清液，該上清液中加入黃綠蜜環菌粗多糖溶解體積的質量3倍的無水乙醇進行沉澱，靜止24h後離心，收集沉澱物B，該沉澱物B在冷肼溫度為-20°C、真空度為20Pa的條件下冷凍乾燥至恆重，即得多糖含量>80%的黃綠蜜環菌多糖。
[0031]實施例2 —種高含量黃綠蜜環菌多糖的製備方法，包括以下步驟:
⑴將新鮮黃綠蜜環菌在70 V乾燥至恆重後，得到乾燥後的黃綠蜜環菌。
[0032]⑵乾燥後的黃綠蜜環菌用超微粉碎機粉碎至粒徑為200 um的乾粉。
[0033]⑶在乾粉中按100ml:lg的液料比加入水，然後採用微波提取法在微波功率為1000W、提取溫度為90°C的條件下提取60min，得到提取液。
[0034]⑷提取液在真空度為0.09MPa、溫度為90°C的條件下經減壓濃縮脫水至浸膏狀，得到濃縮液。
[0035](5)濃縮液中加入其體積6倍的無水乙醇進行沉澱，靜止24h後離心，收集沉澱物A，即得黃綠蜜環菌粗多糖。
[0036](6)將黃綠蜜環菌粗多糖用其質量10倍的純水溶解，過濾後得到上清液，該上清液中加入黃綠蜜環菌粗多糖溶解體積的質量6倍的無水乙醇進行沉澱，靜止24h後離心，收集沉澱物B，該沉澱物B在冷肼溫度為_50°C、真空度為50 Pa的條件下乾燥至恆重，即得多糖含量>80%的黃綠蜜環菌多糖。
[0037]實施例3 —種高含量黃綠蜜環菌多糖的製備方法，包括以下步驟:
⑴將新鮮黃綠蜜環菌在40 V乾燥至恆重後，得到乾燥後的黃綠蜜環菌。
[0038]⑵乾燥後的黃綠蜜環菌用超微粉碎機粉碎至粒徑為100 um的乾粉。
[0039]⑶在乾粉中按50ml:1g的液料比加入水，然後採用微波提取法在微波功率為500W、提取溫度為60°C的條件下提取30min，得到提取液。
[0040]⑷提取液經納濾膜濃縮後脫水至浸膏狀，得到濃縮液。
[0041]其中:膜分離操作壓力為20 MPa。
[0042](5)濃縮液中加入其體積4倍的無水乙醇進行沉澱，靜止24h後離心，收集沉澱物A，即得黃綠蜜環菌粗多糖。
[0043](6)將黃綠蜜環菌粗多糖用其質量5倍的純水溶解，過濾後得到上清液，該上清液中加入黃綠蜜環菌粗多糖溶解體積的質量5倍的無水乙醇進行沉澱，靜止24h後離心，收集沉澱物B，該沉澱物B在入料流量為200 mL/h、入料溫度為30°C、進風溫度為170°C、進風量為16 m3/h的條件下噴霧乾燥至恆重，即得多糖含量>80%的黃綠蜜環菌多糖。
[0044]實施例4 一種高含量黃綠蜜環菌多糖的製備方法，包括以下步驟:
⑴將新鮮黃綠蜜環菌在60 V乾燥至恆重後，得到乾燥後的黃綠蜜環菌。
[0045]⑵乾燥後的黃綠蜜環菌用超微粉碎機粉碎至粒徑為80 um的乾粉。
[0046]⑶在乾粉中按70ml:1g的液料比加入水，然後採用微波提取法在微波功率為100W、提取溫度為45°C的條件下提取20min，得到提取液。
[0047]⑷提取液經納濾膜濃縮後脫水至浸膏狀，得到濃縮液。
[0048]其中:膜分離操作壓力為10 MPa。
[0049](5)濃縮液中加入其體積5倍的無水乙醇進行沉澱，靜止24h後離心，收集沉澱物A，即得黃綠蜜環菌粗多糖。
[0050](6)將黃綠蜜環菌粗多糖用其質量8倍的純水溶解，過濾後得到上清液，該上清液中加入黃綠蜜環菌粗多糖溶解體積的質量4倍的無水乙醇進行沉澱，靜止24h後離心，收集沉澱物B，該沉澱物B在入料流量為1000 mL/h、入料溫度為70°C、進風溫度為210°C、進風量為28 m3/h的條件下噴霧乾燥至恆重，即得多糖含量>80%的黃綠蜜環菌多糖。
[0051]實施例5 —種高含量黃綠蜜環菌多糖的製備方法，包括以下步驟:
⑴將新鮮黃綠蜜環菌在55 °C乾燥至恆重後，得到乾燥後的黃綠蜜環菌。
[0052]⑵乾燥後的黃綠蜜環菌用超微粉碎機粉碎至粒徑為150 um的乾粉。
[0053]⑶在乾粉中按20ml:1g的液料比加入水，然後採用微波提取法在微波功率為300W、提取溫度為70°C的條件下提取25min，得到提取液。
[0054]⑷提取液經反滲透膜濃縮後脫水至浸膏狀，得到濃縮液。
[0055]其中:膜分離操作壓力為0.2 MPa。
[0056](5)濃縮液中加入其體積3倍的無水乙醇進行沉澱，靜止24h後離心，收集沉澱物A，即得黃綠蜜環菌粗多糖。
[0057](6)將黃綠蜜環菌粗多糖用其質量4倍的純水溶解，過濾後得到上清液，該上清液中加入黃綠蜜環菌粗多糖溶解體積的質量4倍的無水乙醇進行沉澱，靜止24h後離心，收集沉澱物B，該沉澱物B在溫度為40°C的條件下烘箱乾燥至恆重，即得多糖含量>80%的黃綠蜜環菌多糖。
[0058]實施例6 —種高含量黃綠蜜環菌多糖的製備方法，包括以下步驟:
⑴將新鮮黃綠蜜環菌在65 °C乾燥至恆重後，得到乾燥後的黃綠蜜環菌。
[0059]⑵乾燥後的黃綠蜜環菌用超微粉碎機粉碎至粒徑為120 um的乾粉。
[0060]⑶在乾粉中按25ml:1g的液料比加入水，然後採用微波提取法在微波功率為450W、提取溫度為55°C的條件下提取25min，得到提取液。
[0061]⑷提取液經反滲透膜濃縮後脫水至浸膏狀，得到濃縮液。
[0062]其中:膜分離操作壓力為20 MPa。
[0063](5)濃縮液中加入其體積3倍的無水乙醇進行沉澱，靜止24h後離心，收集沉澱物A，即得黃綠蜜環菌粗多糖。
[0064](6)將黃綠蜜環菌粗多糖用其質量2倍的純水溶解，過濾後得到上清液，該上清液中加入黃綠蜜環菌粗多糖溶解體積的質量4倍的無水乙醇進行沉澱，靜止24h後離心，收集沉澱物B，該沉澱物B在溫度為70°C的條件下烘箱乾燥至恆重，即得多糖含量>80%的黃綠蜜環菌多糖。
[0065]實施例7 —種高含量黃綠蜜環菌多糖的製備方法，包括以下步驟:
⑴將新鮮黃綠蜜環菌在60 V乾燥至恆重後，得到乾燥後的黃綠蜜環菌。
[0066]⑵乾燥後的黃綠蜜環菌用超微粉碎機粉碎至粒徑為50 um的乾粉。
[0067]⑶在乾粉中按30ml:1g的液料比加入水，然後採用微波提取法在微波功率為200W、提取溫度為55°C的條件下提取40min，得到提取液。
[0068]⑷提取液在真空度為0.05MPa、溫度為70°C的條件下經減壓濃縮脫水至浸膏狀，得到濃縮液。
[0069](5)濃縮液中加入其體積4倍的無水乙醇進行沉澱，靜止24h後離心，收集沉澱物A，即得黃綠蜜環菌粗多糖。
[0070](6)將黃綠蜜環菌粗多糖用其質量6倍的純水溶解，過濾後得到上清液，該上清液中加入黃綠蜜環菌粗多糖溶解體積的質量4倍的無水乙醇進行沉澱，靜止24h後離心，收集沉澱物B，該沉澱物B在冷肼溫度為_35°C、真空度為35 Pa的條件下冷凍乾燥至恆重，即得多糖含量>80%的黃綠蜜環菌多糖。
[0071]實施例8 一種高含量黃綠蜜環菌多糖的製備方法，包括以下步驟:
⑴將新鮮黃綠蜜環菌在80 V乾燥至恆重後，得到乾燥後的黃綠蜜環菌。
[0072]⑵乾燥後的黃綠蜜環菌用超微粉碎機粉碎至粒徑為30 um的乾粉。
[0073]⑶在乾粉中按60ml:1g的液料比加入水，然後採用微波提取法在微波功率為600W、提取溫度為75°C的條件下提取50min，得到提取液。
[0074]⑷提取液經納濾膜濃縮後脫水至浸膏狀，得到濃縮液。
[0075]其中:膜分離操作壓力為5 MPa。
[0076](5)濃縮液中加入其體積5倍的無水乙醇進行沉澱，靜止24h後離心，收集沉澱物A，即得黃綠蜜環菌粗多糖。
[0077](6)將黃綠蜜環菌粗多糖用其質量5.5倍的純水溶解，過濾後得到上清液，該上清液中加入黃綠蜜環菌粗多糖溶解體積的質量5倍的無水乙醇進行沉澱，靜止24h後離心，收集沉澱物B，該沉澱物B在入料流量為600 mL/h、入料溫度為50°C、進風溫度為190°C、進風量為22 m3/h的條件下噴霧乾燥至恆重，即得多糖含量>80%的黃綠蜜環菌多糖。
[0078]實施例9 一種高含量黃綠蜜環菌多糖的製備方法，包括以下步驟:
⑴將新鮮黃綠蜜環菌在50 V乾燥至恆重後，得到乾燥後的黃綠蜜環菌。
[0079]⑵乾燥後的黃綠蜜環菌用超微粉碎機粉碎至粒徑為180 um的乾粉。
[0080]⑶在乾粉中按90ml:lg的液料比加入水，然後採用微波提取法在微波功率為800W、提取溫度為85°C的條件下提取55min，得到提取液。
[0081]⑷提取液經反滲透膜濃縮後脫水至浸膏狀，得到濃縮液。
[0082]其中:膜分離操作壓力為0.5 MPa。
[0083](5)濃縮液中加入其體積3倍的無水乙醇進行沉澱，靜止24h後離心，收集沉澱物A，即得黃綠蜜環菌粗多糖。
[0084](6)將黃綠蜜環菌粗多糖用其質量9倍的純水溶解，過濾後得到上清液，該上清液中加入黃綠蜜環菌粗多糖溶解體積的質量3倍的無水乙醇進行沉澱，靜止24h後離心，收集沉澱物B，該沉澱物B在溫度為55°C的條件下烘箱乾燥至恆重，即得多糖含量>80%的黃綠蜜環菌多糖。
【權利要求】
1.一種高含量黃綠蜜環菌多糖的製備方法，包括以下步驟: ⑴將新鮮黃綠蜜環菌在3(T80°C乾燥至恆重後，得到乾燥後的黃綠蜜環菌； ⑵所述乾燥後的黃綠蜜環菌用超微粉碎機粉碎至粒徑為1(T200 um的乾粉； ⑶在所述乾粉中按l(TlOOml:lg的液料比加入水，然後採用微波提取法提取，得到提取液； ⑷所述提取液經減壓濃縮或有機膜濃縮後脫水至浸膏狀，得到濃縮液； (5)所述濃縮液中加入其體積3飛倍的無水乙醇進行沉澱，靜止24h後離心，收集沉澱物A，即得黃綠蜜環菌粗多糖； (6)將所述黃綠蜜環菌粗多糖用其質量f10倍的純水溶解，過濾後得到上清液，該上清液中加入所述黃綠蜜環菌粗多糖溶解體積的質量3飛倍的無水乙醇進行沉澱，靜止24h後離心，收集沉澱物B，該沉澱物B乾燥至恆重，即得多糖含量>80%的黃綠蜜環菌多糖。
2.如權利要求1所述的一種高含量黃綠蜜環菌多糖的製備方法，其特徵在於:所述步驟⑶中微波提取條件是指微波功率為5(Tl000W，提取溫度為4(T90°C，提取時間為15?60mino
3.如權利要求1所述的一種高含量黃綠蜜環菌多糖的製備方法，其特徵在於:所述步驟⑷中減壓濃縮的條件是指真空度為0.0lMPa?0.09MPa，溫度為5(T90°C。
4.如權利要求1所述的一種高含量黃綠蜜環菌多糖的製備方法，其特徵在於:所述步驟⑷中有機膜為反滲透膜或納濾膜，膜分離操作壓力為0.2?20 MPa。
5.如權利要求1所述的一種高含量黃綠蜜環菌多糖的製備方法，其特徵在於:所述步驟(6)中的乾燥是指冷凍乾燥、噴霧乾燥、烘箱烘乾中的任意一種。
6.如權利要求5所述的一種高含量黃綠蜜環菌多糖的製備方法，其特徵在於:所述冷凍乾燥的條件是指冷肼溫度為-5(T-20°C，真空度為20Pa?50 Pa。
7.如權利要求5所述的一種高含量黃綠蜜環菌多糖的製備方法，其特徵在於:所述噴霧乾燥的條件是指入料流量為20(Tl000 mL/h，入料溫度為3(T70°C，進風溫度為170?210°C，進風量為16?28 m3/h。
8.如權利要求5所述的一種高含量黃綠蜜環菌多糖的製備方法，其特徵在於:所述烘箱乾燥的溫度為4(T70°C。
【文檔編號】C08B37/00GK104448024SQ201410801646
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月22日 優先權日:2014年12月22日
【發明者】陳晨, 邵贇, 陶燕鐸, 文懷秀 申請人:中國科學院西北高原生物研究所