一種用酶標法測定海馬幼苗組織消化酶活力的方法
2023-11-02 04:12:12
專利名稱：一種用酶標法測定海馬幼苗組織消化酶活力的方法
技術領域：
本發明屬於消化酶活力的測定領域，特別涉及一種用酶標法測定海馬幼苗組織消化酶活力的方法。
背景技術：
海馬是傳統的名貴中藥，具有很高的經濟價值。近年來，海馬被當作高級觀賞動物，使其價值大漲。但由於自然資源破壞嚴重，供應滿足不了需求，人工養殖成了唯一選擇。 在海馬幼苗養殖中，餌料營養是否足夠，環境條件是否適宜均成為影響海馬育苗成功與否的重要因素。消化酶活力在水產研究中是反映魚類對不同營養物質利用能力的重要指標。 除餌料營養外，環境因子等也可影響機體的消化酶活力，因此消化酶活力也可以作為反應環境好壞的指標之一。在實際生產中，海馬與其他魚類的死亡往往發生在初孵幼苗階段。而此時，人們往往通過對大量幼苗組織進行生化分析，來判斷其營養狀況和對環境的適應程度。而傳統的消化酶分析方法存在以下問題1)往往需要重量達數百毫克的幼體組織，這就需要消耗數十甚至成百上千隻幼體。2)需要自行配置分析試劑或購買商用試劑盒。而試劑盒的價格也往往達到數百乃至上千元。幻實驗測試前的組織勻漿，往往採用手動玻璃勻漿器或高速勻漿機，但一般每次只能勻漿一個樣品。4)吸光度讀取時，一般採用光程為Icm的比色杯在分光光度計下讀取。而在一些科學研究中，有時一次就需要分析數百份樣本。這不但需要高昂的分析費用，同時也需要消耗大量的人力物力。且由於大量樣本的測試過程需要花費十幾甚至數十天，這極大增加了測試過程跨越時間長所造成的偏差。而需要一種高效，且對研究材料和研究試劑需求量大大減少的方法，對消化酶活力進行分析。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種用酶標法測定海馬幼苗組織消化酶活力的方法，該方法操作簡單，成本低廉，效率高，且環保無汙染。本發明的一種用酶標法測定海馬幼苗組織消化酶活力的方法，包括1)將冰凍海馬幼苗10_20mg加入到容器中，冰浴下再加入90_180μ 1 2_4°C 的0. 7 % g/mlNaCl的生理鹽水或勻漿介質後，勻漿成勻漿液，然後再於冷凍離心機中 0-40C 9000-10000rpm下離心lOmin，取上清液備用；2)取上述上清液，採用考馬斯亮藍G250法測定組織總蛋白濃度，其中牛血清白蛋白為標準蛋白；3)取兩個乾淨的容器A、B,分別加入等體積的試劑盒中的「底物澱粉緩衝液」(南京建成生物工程研究所)50ul，再向B中加入步驟1)所得上清液IOul，並震蕩B ；然後將A、 B於37°C恆溫水浴中加熱7. 5min後再各加入等體積濃度為0. Olmol/L的碘反應液50ul，最後在A、B中各加入蒸餾水300-310ul，使得A、B中溶液的體積相等，再同時震蕩A、B ；4)從上述A、B中各吸取等體積的溶液，分別滴入酶標板的兩個孔中；將酶標儀波長調至660nm，隨後將上述的酶標板放入酶標儀中，同時檢測兩孔中溶液的吸光度；5)最後根據公式計算樣品的澱粉酶活力.
A-R η 4-χ O HcI由
AMS活力(UMsprot) = ^x X+ (取樣量X組織總蛋白濃度)
AIU 7.5分鐘AMS表示酶活力，U/mgprot為酶活力單位；A表示A的吸光度，B表示B的吸光度；0. 4和0. 05分別表示「底物澱粉緩衝液」的濃度0. 4mg/ml和用量的毫升數(50ul = 0. 05ml) ；30分鐘和10表示反應30分鐘消耗IOmg澱粉作為一個酶活力單位；7. 5分鐘是本實驗於37°C恆溫水浴中實際加熱7. 5分鐘；取樣量為步驟3)中取用的上清液的體積(ml)， 組織總蛋白濃度為步驟2、中測試所得的組織總蛋白濃度。上述步驟1)中所述的勻漿介質為pH值為7.4，且含有0.0111101/1 Tris (三羥甲基氨基甲烷)-HC1，0. 0001mol/L EDTA_2Na(乙二胺四乙酸二鈉)，0. 01mol/L 蔗糖，0. 8 % g/ mlNaCl的水溶液。上述步驟1)中所述的勻漿成勻漿液過程中，使用的是多功能樣品均質器 (BertinPrecellys-M，法國白金公司)。上述步驟1)中所得的上清液中IOul準備用於澱粉酶活力測定，剩餘可用作組織總蛋白含量測定、脂肪酶活力測定、蛋白酶活力測定。上述步驟2~)中所取上清液的體積為80-160ul。上述步驟3)中所述的容器A、B，其中A為空白對照，B用於樣品的測定。上述步驟3)中所述的震蕩均為用旋窩振蕩器震蕩。本發明的方法簡便易學，實驗材料用量和實驗試劑成本均減少到普通檢測時的 0. 1倍，組織勻漿效率最多可提高M倍，吸光度讀取效率最多可提高96倍。在測吸光度的溶液為270ul，約為普通分光光度法檢測時的0. 1倍(光程為Icm比色杯容積為3000ul)。 因此，步驟1中幼體組織用量也可按比例降為普通檢查時的0. 1倍；化學反應中試劑盒試劑的用量，也按比例縮小到了普通情況的0. 1倍；選用 BertinPrecellys-24多功能樣品均質器，可以同時勻漿M個樣品，且每次勻漿時間約為 aiiin。而普通手動勻漿每人每次只能勻漿一個樣品，每個樣品需要aiiin。據此推算該步驟的效率將提高M倍。本發明選用了 96孔酶標版和酶標儀(酶標法)進行吸光度的測試，本發明在 3-5min內可以一次性最多檢測96個樣品，其效率是普通普通檢測(分光光度法)時的96 倍。而且96孔板為無汙染一次性耗材，且價格低廉。有益效果本發明的方法操作簡單，成本低廉，效率高，且環保無汙染。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
實施例11)將冰凍海馬幼苗IOmg加入到1. 5ml容器中，冰浴下再加入90 ill 4°C左右的 勻菜介質(pH 7. 4,0. Olmol/L Tris-HCl,0. OOOlmol/L EDTA-2Na，0. Olmol/L 蔴糖，0. 8 % g/mlNaCl溶液)，勻菜成勻菜液，然後再於TGL-16G型冷凍離心機中4°C，9000rpm下離心 IOmin，取上清液80ul，其中20ul用作以下檢測，另60ul可留作他用；2)取上述上清液IOul採用考馬斯亮藍G250法測定組織總蛋白濃度為0. 34mg/ ml，其中牛血清白蛋白為標準蛋白；3)取兩個乾淨的容器A、B,分別加入50ul試劑盒中的「底物澱粉緩衝液」，再向B 中加入IOul步驟1)所得上清液，並用旋窩振蕩器震蕩B，使試劑充分混勻；然後將A、B於 37°C恆溫水浴中加熱7. 5min，取出後分別在A、B中各加入50ul濃度為0. Olmol/L的碘反 應液，在A中加入蒸溜水310ul，B中加入蒸溜水300ul，再用旋窩振蕩器同時震蕩A、B ；4)用移液器從A、B中各吸取溶液270ul，分別滴入孔容積為405ul酶標板的兩個 孔中；將酶標儀波長調至660nm，隨後將上述的酶標板放入酶標儀中，同時檢測兩孔中溶液 的吸光度為0. 38.0. 29 ；5)根據公式計算出樣品的酶活力為0. 56U/mgprot。
權利要求
1.一種用酶標法測定海馬幼苗組織消化酶活力的方法，包括1)將冰凍海馬幼苗10-20mg加入到容器中，冰浴下再加入90-180μ1 2_4°C左右的0. 7 % g/mlNaCl的生理鹽水或勻漿介質後，勻漿成勻漿液，然後再於冷凍離心機中 0-40C 9000-10000rpm下離心lOmin，取上清液備用；2)取上述上清液，採用考馬斯亮藍法測定組織總蛋白濃度，其中牛血清白蛋白為標準蛋白；3)取兩個乾淨的容器A、B，分別加入等體積的試劑盒中的「底物澱粉緩衝液」50ul，再向B中加入步驟1)所得上清液lOul，並震蕩B ；然後將A、B於37°C恆溫水浴中加熱7. 5min 後再各加入濃度為0. Olmol/L的碘反應液50ul，最後在A、B中各加入蒸餾水300-3IOul，使得A、B中溶液的體積相等，再同時震蕩A、B ；4)從上述A、B中各吸取等體積的溶液，分別滴入酶標板的兩個孔中；將酶標儀波長調至660nm，隨後將上述的酶標板放入酶標儀中，同時檢測兩孔中溶液的吸光度；5)最後計算樣品的澱粉酶活力。
2.根據權利要求1所述的一種用酶標法測定海馬幼苗組織消化酶活力的方法，其特徵在於步驟1)中所述的勻漿介質為pH值為7. 4，且含有0. Olmol/L Tris-HCl、0· OOOlmol/ LEDTA-2Na、0. Olmol/L 蔗糖、0. 8% g/mlNaCl 的水溶液。
3.根據權利要求1所述的一種用酶標法測定海馬幼苗組織消化酶活力的方法，其特徵在於步驟1)中所述的勻漿成勻漿液過程中，使用的是Bertin ft~ecellyS-M多功能樣品均質器。
4.根據權利要求1所述的一種用酶標法測定海馬幼苗組織消化酶活力的方法，其特徵在於步驟3)中所述的震蕩均為用旋窩振蕩器震蕩。
全文摘要
本發明涉及一種用酶標法測定海馬幼苗組織消化酶活力的方法，包括1)將冰凍海馬幼苗加入到容器中，冰浴下再加入0.7％NaCl的生理鹽水或勻漿介質後，用多功能樣品均質器勻漿，離心機離心，取上清液備用；2)取部分上述上清液測定組織總蛋白濃度；3)取容器A、B，分別加入底物澱粉緩衝液，再向B中加入步驟1)所得上清液，然後分別在A、B中各加入碘反應液和蒸餾水；4)吸取A、B中溶液分別滴入酶標板的兩個孔中；隨後將上述的酶標板放入酶標儀中，同時檢測兩孔中溶液的吸光度；5)最後計算樣品的澱粉酶活力。本發明的方法操作簡單，成本低廉，效率高，且環保無汙染。
文檔編號G01N1/38GK102213716SQ20111008692
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月7日 優先權日2011年4月7日
發明者孫鵬, 尹飛, 彭士明, 施兆鴻 申請人:中國水產科學研究院東海水產研究所