一種薑黃醇半抗原及完全抗原的合成方法與流程

2023-11-02 03:30:04 2

本發明屬於免疫學領域，具體涉及一種薑黃醇半抗原及完全抗原的合成方法。

背景技術：

薑黃醇又名薑黃環氧醇，目前薑黃醇的測定方法主要有比色法、紅外分光光度法、雙波長掃描法、氣相色譜法等方法，而上述方法在快速、批量檢測方面均存在一定的缺陷。免疫分析方法因其具有操作簡便、靈敏、穩定、快速和高通量檢測的特點，在中藥材的質量監測與評價方面具有較好的應用前景。具有與檢測成分對應的抗體是免疫分析的關鍵，薑黃醇為小分子天然化合物，相對分子量236.35，僅具有反應原性，而不具有免疫原性，小分子往往不直接與載體蛋白連接，通過偶聯劑與載體蛋白交聯。因此需要與大分子蛋白等偶聯形成複合物後才能成為完全抗原，但現有技術中完全抗原的產率僅有52％，需要進一步提高產率。

技術實現要素：

針對上述問題，本發明的主要目的在於提供一種薑黃醇半抗原及完全抗原的合成方法，從薑黃醇到最終偶聯產物產率得到完全抗原的產率可達90％。

為了達到上述目的，本發明採用如下技術方案：一種薑黃醇半抗原的合成方法，包括如下步驟：

提供第一溶液，其中所述第一溶液包含薑黃醇和丁二酸酐分散於第一溶劑中，所述第一溶劑為吡啶；

加熱所述第一溶液反應，反應後的所述第一溶液經旋轉蒸發以旋幹得到固體；

採用弱鹼性溶液溶解所述固體得到第二溶液，在所述第二溶液中加入酸性溶液，直至有沉澱析出，加入酯類物質進行萃取，合併有機相，旋轉蒸發以旋幹有機相，得固體薑黃醇-丁二酸單酯偶聯物。

作為進一步的優選，所述薑黃醇和丁二酸酐在第一溶液中的摩爾比為2:3。

作為進一步的優選，所述薑黃醇和丁二酸酐在第一溶液中的濃度分別為0.05M和0.075M。

作為進一步的優選，所述加熱溫度為50-80℃。

作為進一步的優選，所述加熱溫度為70℃。

作為進一步的優選，加熱所述第一溶液反應過夜。

作為進一步的優選，所述弱鹼性溶液為碳酸氫鈉的水溶液，所述碳酸氫鈉水溶液的濃度為1％-10％。

作為進一步的優選，所述碳酸氫鈉水溶液的濃度為5％。

作為進一步的優選，所述酸性溶液為鹽酸溶液。

作為進一步的優選，所述酯類物質選自乙酸乙酯、乙酸異戊酯和苯甲酸甲酯。

作為進一步的優選，所述酯類物質為乙酸乙酯。

一種薑黃醇完全抗原的合成方法，包括如下步驟：

提供第三溶液，其中所述第三溶液包含薑黃醇-丁二酸單酯偶聯物分散於第三溶劑中；

提供第四溶液，其中所述第四溶液包含EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺)和NHS(N-羥基琥珀醯亞胺)分散於水中；

將所述第四溶液加入到所述第三溶液中反應得到反應液；

將所述反應液加入到載體蛋白溶液中，反應後透析得到最終偶聯產物。

作為進一步的優選，所述第三溶劑為DMF。

作為進一步的優選，所述第三溶液中薑黃醇-丁二酸單酯偶聯物的濃度為0.143M。

作為進一步的優選，所述第四溶液中EDC的濃度為0.16-2.6M，所述第四溶液中NHS的濃度為0.087-0.261M。

作為進一步的優選，所述第四溶液中EDC的濃度為0.16M，所述第四溶液中NHS的濃度為0.16M。

作為進一步的優選，所述第四溶液和所述第三溶液的反應溫度為4-8℃。

作為進一步的優選，所述第四溶液和所述第三溶液的反應溫度為4℃。

作為進一步的優選，所述第四溶液和所述第三溶液反應過夜。

作為進一步的優選，所述載體蛋白溶液的濃度為0.03-0.22mM。

作為進一步的優選，所述載體蛋白溶液的濃度為0.13mM。

作為進一步的優選，所述透析步驟為：透析時間為3d，透析液為1×PBS(磷酸緩衝鹽溶液)，每天更換透析液三次。

本發明的有益效果是：

(1)本發明採用薑黃醇為原料可製備得到薑黃醇半抗原及完全抗原，根據薑黃醇結構中存在C6羥基的特點，本發明先將薑黃醇製備成薑黃醇琥珀酸單酯(薑黃醇-丁二酸單酯偶聯物)，然後再與BSA(牛血清白蛋白)或OVA(雞蛋清白蛋白)偶聯形成複合物，從而成為完全抗原，且從薑黃醇到最終偶聯產物，得到完全抗原的產率可達90％。

(2)本發明的合成步驟簡單，所需的實驗條件溫和，產物容易得到，且穩定性高。

(3)本發明可製備薑黃醇單克隆抗體，為利用酶聯免疫吸附方法對含薑黃醇的中草藥進行定性或定量分析提供了可能，可用於大規模生產的中藥質量控制、中草藥原料藥的鑑定、中藥活性成分的體內分析及中草藥有效成分的純化等諸多方面，同時為完善中藥的質量評價體系和方法起到積極的作用，具有快速、靈敏、精確和簡便等特點。

附圖說明

圖1為本發明實施例薑黃醇半抗原的合成方法的流程示意圖。

圖2為本發明實施例薑黃醇-HS-BSA的紫外鑑定結果示意圖。

圖3為本發明實施例薑黃醇-HS-OVA的紫外鑑定結果示意圖。

具體實施方式

本發明通過提供一種薑黃醇半抗原及完全抗原的合成方法，解決了現有技術中得到完全抗原產率低的問題。

為了解決上述問題，本發明實施例的主要思路是：

本發明實施例薑黃醇半抗原的合成方法，包括如下步驟：

提供第一溶液，其中所述第一溶液包含薑黃醇和丁二酸酐分散於第一溶劑中，所述第一溶劑為吡啶；

加熱所述第一溶液反應，反應後的所述第一溶液經過旋轉蒸發以旋幹得到固體；

採用弱鹼性溶液溶解所述固體得到第二溶液，在所述第二溶液中加入酸性溶液，直至有沉澱析出，加入酯類物質進行萃取，合併有機相，旋轉蒸發以旋幹有機相，得固體薑黃醇-丁二酸單酯偶聯物。

本發明實施例薑黃醇完全抗原的合成方法，包括如下步驟：

提供第三溶液，其中所述第三溶液包含薑黃醇-丁二酸單酯偶聯物分散於第三溶劑中；

提供第四溶液，其中所述第四溶液包含EDC和NHS分散於水中；

將所述第四溶液加入到所述第三溶液中反應得到反應液；

將所述反應液加入到載體蛋白溶液中，反應後透析得到最終偶聯產物。

本發明實施例所述術語「分散」可理解為溶質溶解在溶劑中，溶解薑黃醇和丁二酸酐的第一溶劑可選為吡啶，吡啶除了作為溶劑，亦有催化薑黃醇和丁二酸酐反應的作用。選擇薑黃醇和丁二酸酐物質的用量，使得兩者在第一溶劑中呈一定比例的濃度，以達到最佳的反應效果。

本發明實施例所述加熱所述第一溶液反應時，一般為加熱反應過夜，可採用水浴加熱，溫度為50-80℃，優選為70℃。反應後的所述第一溶液一般採用旋轉蒸發儀以旋幹。

所述酸性溶液加入到弱鹼性溶液時可採用滴加，並且兩者採用適當的濃度，以達到較好的沉澱效果；所述酯類物質為揮發性酯類物質，例如可採用乙酸乙酯、乙酸異戊酯和苯甲酸甲酯等安全且萃取效果好的揮發性物質。

本發明實施例採用的EDC/NHS水溶液可以將反應不穩定的中間產物變穩定，反應活性不變；將所述第四溶液加入到所述第三溶液中反應得到反應液時，其中的加入可採用滴加，控制一定的速度；其中的反應可為反應過夜。

為了讓本發明之上述和其它目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉數實施例，來說明本發明所述之薑黃醇半抗原及完全抗原的合成方法。

實施例1

本發明實施例1薑黃醇半抗原衍生物合成步驟如下：

(1)稱取薑黃醇118mg(0.5mmol)，75mg(0.75mmol)丁二酸酐溶解於10mL吡啶中，70℃水浴加熱反應過夜；

(2)取出反應液，用旋轉蒸發儀旋幹；

(3)用5％NaHCO3的水溶液20mL溶解步驟(2)中已烘乾的固體；

(4)用1M HCl滴加入上述步驟(3)溶液中，調pH至2，如有沉澱析出，則繼續以下步驟：

(5)加入適量的乙酸乙酯進行萃取，重複3次；

(6)合併有機相，用旋轉蒸發儀旋幹有機相，得固體，收集後備用；

本發明實施例薑黃醇-HS-BSA合成步驟：

(1)稱取薑黃醇-HS(薑黃醇-丁二酸單酯)24mg溶於0.5mL的DMF中，為A液；

(2)取EDC 30mg，NHS 18mg溶於1mL的水中，為B液；

(3)將B液滴入A液中，4℃反應過夜，為C液；

(4)稱取BSA 94mg溶於10mL PBS中，將C液加入至BSA溶液中，反應8h後透析3d，每天更換透析液3次(透析液為1×PBS)從薑黃醇到最終偶聯產物的產率達到75.6％。

實施例2

薑黃醇半抗原衍生物合成步驟如下：

(1)稱取薑黃醇118mg(0.5mmol)，75mg(0.75mmol)丁二酸酐溶解於10mL吡啶中，70℃水浴加熱反應過夜；

(2)取出反應液，用旋轉蒸發儀旋幹；

(3)用5％NaHCO3的水溶液20mL溶解已烘乾的固體；

(4)用1M HCl滴加入上述溶液中，調pH至2，如有沉澱析出，則繼續以下步驟：

(5)加入適量的乙酸乙酯進行萃取，重複3次；

(6)合併有機相，用旋轉蒸發儀旋幹有機相，得固體，收集後備用；

薑黃醇-HS-OVA合成步驟如下：

(1)稱取薑黃醇-HS 24mg溶於0.5mL的DMF中，為A液；

(2)取EDC 30mg，NHS 18mg溶於1mL的水中，為B液；

(3)將B液滴入A液中，4℃反應過夜，為C液；

(4)稱取OVA 63mg溶於10mL PBS中，將C液加入至BSA溶液中，反應8h後透析3d，每天更換透析液3次(透析液為1×PBS)從薑黃醇到最終偶聯產物的產率達到89.2％。

實施例3

薑黃醇半抗原衍生物合成步驟:

(1)稱取薑黃醇118mg(0.5mmol)，75mg(0.75mmol)丁二酸酐溶解於10mL吡啶中，80℃水浴加熱反應過夜；

(2)取出反應液，用旋轉蒸發儀旋幹；

(3)用1％NaHCO3 40mL溶解已烘乾的固體；

(4)用1M HCl滴加入上述溶液中，調pH至2，如有沉澱析出，則繼續以下步驟：

(5)加入適量的乙酸異戊酯進行萃取，重複3次；

(6)合併有機相，用旋轉蒸發儀旋幹有機相，得固體，收集後備用。

薑黃醇-HS-BSA合成步驟：

(1)稱取薑黃醇-HS 24mg溶於0.5mL的DMF中，為A液；

(2)取EDC 300mg，NHS 28mg溶於10mL的水中，為B液；

(3)將B液滴入A液中，4℃反應過夜，為C液；

(4)稱取BSA 94mg溶於10mL PBS中，將C液加入至BSA溶液中，反應8h後透析3d，每天更換透析液3次(透析液為1×PBS)從薑黃醇到最終偶聯產物的產率達到85.6％。

實施例4

1.薑黃醇半抗原衍生物合成步驟:

(1)稱取薑黃醇118mg(0.5mmol)，75mg(0.75mmol)丁二酸酐溶解於10mL吡啶中，50℃水浴加熱反應過夜；

(2)取出反應液，用旋轉蒸發儀旋幹；

(3)用10％NaHCO3 15mL溶解已烘乾的固體；

(4)用1M HCl滴加入上述溶液中，調pH至2，如有沉澱析出，則繼續以下步驟:

(5)加入適量的苯甲酸甲酯進行萃取，重複3次；

(6)合併有機相，用旋轉蒸發儀旋幹有機相，得固體，收集後備用。

2.薑黃醇-HS-OVA合成步驟:

(1)稱取薑黃醇-HS 24mg溶於0.5mL的DMF中，為A液；

(2)取EDC 100mg，NHS 20mg溶於5mL的水中，為B液；

(3)將B液滴入A液中，8℃反應過夜，為C液；

(4)稱取OVA63mg溶於10mL PBS中，將C液加入至BSA溶液中，反應8h後透析3d，每天更換透析液3次(透析液為1×PBS)從薑黃醇到最終偶聯產物的產率達到90.5％。

實施例5

薑黃醇半抗原衍生物合成步驟:

(1)稱取薑黃醇118mg(0.5mmol)，75mg(0.75mmol)丁二酸酐溶解於10mL吡啶中，60℃水浴加熱反應過夜；

(2)取出反應液，用旋轉蒸發儀旋幹；

(3)用3％NaHCO3 18mL溶解已烘乾的固體；

(4)用1M HCl滴加入上述溶液中，調pH至2，如有沉澱析出，則繼續以下步驟:

(5)加入適量的乙酸乙酯進行萃取，重複3次；

(6)合併有機相，用旋轉蒸發儀旋幹有機相，得固體，收集後備用。

薑黃醇-HS-BSA合成步驟:

(1)稱取薑黃醇-HS 24mg溶於0.5mL的DMF中，為A液；

(2)取EDC 200mg，NHS 20mg溶於8mL的水中，為B液；

(3)將B液滴入A液中，6℃反應過夜，為C液；

(4)稱取BSA 150mg溶於10mL PBS中，將C液加入至BSA溶液中，反應8h後透析3d，每天更換透析液3次(透析液為1×PBS)從薑黃醇到最終偶聯產物的產率達到83.5％。

實施例6

薑黃醇半抗原衍生物合成步驟:

(1)稱取薑黃醇118mg(0.5mmol)，75mg(0.75mmol)丁二酸酐溶解於10mL吡啶中，70℃水浴加熱反應過夜；

(2)取出反應液，用旋轉蒸發儀旋幹；

(3)用5％NaHCO3 20mL溶解已烘乾的固體；

(4)用1M HCl滴加入上述溶液中，調pH至2，如有沉澱析出，則繼續以下步驟：

(5)加入適量的乙酸乙酯進行萃取，重複3次；

(6)合併有機相，用旋轉蒸發儀旋幹有機相，得固體，收集後備用。

薑黃醇-HS-OVA合成步驟：

(1)稱取薑黃醇-HS 24mg溶於0.5mL的DMF中，為A液；

(2)取EDC 50mg，NHS 10mg溶於3mL的水中，為B液；

(3)將B液滴入A液中，5℃反應過夜，為C液；

(4)稱取OVA 30mg溶於10mLPBS中，將C液加入至BSA溶液中，反應8h後透析3d，每天更換透析液3次(透析液為1×PBS)從薑黃醇到最終偶聯產物的產率達到72.6％。

實驗例 本實施例1和2中薑黃醇的兩種偶聯物鑑定：

以紫外分光光度計測定薑黃醇、薑黃醇-HS-BSA和BSA最大吸收峰。如下圖2所示：薑黃醇、薑黃醇-HS-BSA和BSA最大吸收波長分別為238nm、274nm和280nm；如下圖3所示：薑黃醇、薑黃醇-HS-OVA和OVA最大吸收波長分別為273nm、263nm和275nm。載體偶聯本發明實施例半抗原後最大吸收波長發生改變，證明偶聯物合成成功。

上述本申請實施例中的技術方案，至少具有如下的技術效果或優點：

(1)本發明採用薑黃醇為原料可製備得到薑黃醇半抗原及完全抗原，根據薑黃醇結構中存在C6羥基的特點，本發明先將薑黃醇製備成薑黃醇琥珀酸單酯，然後再與BSA或OVA偶聯形成複合物，從而成為完全抗原，且從薑黃醇到最終偶聯產物，得到完全抗原的產率可達90％。

(2)本發明的合成步驟簡單，所需的實驗條件溫和，產物容易得到，且穩定性高。

(3)本發明可製備薑黃醇單克隆抗體，為利用酶聯免疫吸附方法對含薑黃醇的中草藥進行定性或定量分析提供了可能，可用於大規模生產的中藥質量控制、中草藥原料藥的鑑定、中藥活性成分的體內分析及中草藥有效成分的純化等諸多方面，同時為完善中藥的質量評價體系和方法起到積極的作用，具有快速、靈敏、精確和簡便等特點。

儘管已描述了本發明的優選實施例，但本領域內的技術人員一旦得知了基本創造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權利要求意欲解釋為包括優選實施例以及落入本發明範圍的所有變更和修改。顯然，本領域的技術人員可以對本發明進行各種改動和變型而不脫離本發明的精神和範圍。這樣，倘若本發明的這些修改和變型屬於本發明權利要求及其等同技術的範圍之內，則本發明也意圖包含這些改動和變型在內。