一種製備核酸晶片的方法及其在倏逝波檢測中的應用的製作方法
2023-11-10 10:36:22
一種製備核酸晶片的方法及其在倏逝波檢測中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種製備核酸晶片的方法及其在倏逝波檢測中的應用。本發明提供的製備核酸晶片的方法，依次包括如下步驟：（1）將表面具有SiO2膜的基片進行表面羥基活化；（2）將步驟（1）得到的基片浸泡於矽烷化劑溶液，室溫靜置30-120min後取出基片，洗滌並乾燥，然後130-200℃烘烤1-12小時；（3）通過偶聯劑將核酸分子固定到基片的表面，得到核酸晶片。在倏逝波激發下，可實時監測核酸晶片表面固定的核酸與互補核酸的雜交情況，同時該核酸晶片還可洗脫再生，實現重複使用（可重複使用50次以上）。
【專利說明】-種製備核酸晶片的方法及其在倏逝波檢測中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種製備核酸晶片的方法及其在倏逝波檢測中的應用。
【背景技術】
[0002] 倏逝波檢測技術是一種新型的檢測技術，它是利用光波在基質內以全反射方式傳 輸時在基質表面產生倏逝波，可以激發連接在基質表面標記有螢光分子的生物物質，從而 實現對待測目標物定量或定性的檢測。由於其具有不直接與待測物發生作用，穿透深度僅 有數百納米的特點，因而可有效降低噪音，消除體相中雜質的幹擾，特別適合複雜環境中待 測目標物的檢測。近年來，發明人所在課題組開發出多種基於倏逝波檢測技術的方法和儀 器（如：專利CN1873450A、CN101363870A、CN1966440A、CN101666747A等）並將其成功用於水 體中藻毒素、2、4-D等化合物的檢測之中，取得了較好的效果。
[0003] 現代分子生物學研究發現，在分子水平上某些小分子(如金屬離子、農藥等）可 與特異的基因序列發生作用，造成其空間結構發生改變，而這種結構和性能的關係為這類 小分子的快速、特異識別提供了一條便捷的途徑。上述能夠發生特異結構變化的DNA或 RNA鏈，被稱為功能核酸（FunctionalNucleicAcids，FNAs)。2008 年MA.Shannon等在 《Nature》上發表文章"Scienceandtechnologyforwaterpurificationinthecoming decades"指出未來二十年，功能核酸(如核酸酶、核酸適體等）為代表的檢測技術在環境汙 染物的分析上具有廣闊的應用前景。
[0004] 利用先前開發的修飾方法，很難消除由於功能核酸在表面的非特異吸附，造成的 固定效率差信號、背景噪音大、重複性不好等問題，因而急需開發功能核酸的固定化方法。 鑑於檢測的需要，該方法形成的修飾層應該滿足以下條件：（1)能與倏逝波檢測晶片共價 結合，不影響晶片的物化性質；（2)能與不同基團(氨基、巰基和羧基等）修飾的寡聚核苷酸 形成共價連接；（3)修飾的寡聚核苷酸數量可控；（4)非特異吸附小，背景信號低；（5)穩定 性好，可多次重複使用，降低使用成本。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種製備核酸晶片的方法及其在倏逝波檢測中的應用。
[0006] 本發明提供的製備核酸晶片的方法，依次包括如下步驟：
[0007] (1)將表面具有Si02膜的基片進行表面羥基活化；
[0008] (2)將步驟（1)得到的基片浸泡於矽烷化劑溶液，室溫靜置30_120min(如 90min-120min、90min或120min)後取出基片，洗滌並乾燥，然後130-200°C烘烤1-12小時 (具體可200°C烘烤12小或130°C烘烤1小時）；
[0009] (3)通過偶聯劑將核酸分子固定到基片的表面，得到核酸晶片。
[0010] 所述步驟（1)中，所述基片可為矽片、石英片、玻璃片或光纖。所述步驟（1)中，所 述Si02膜的厚度可為20nm以上(如50nm)。所述步驟（1)中，所述"進行表面羥基活化"的 方法如下：將表面具有Si02膜的基片浸泡於硫酸-過氧化氫溶液，70-1KTC靜置45-90分 鍾(具體可90°C靜置60分鐘)後取出基片，洗滌並乾燥，然後100-120°C靜置3-12h(具體可 110°C靜置8小時)。所述硫酸-過氧化氫溶液的製備方法可如下：將3體積份濃硫酸和1 體積份30%過氧化氫混合。所述硫酸-過氧化氫溶液的製備方法具體具體如下：將3體積 份濃硫酸（即質量分數為98. 3%的硫酸溶液）和1體積份30%過氧化氫（即質量分數為30% 的過氧化氫溶液）混合。
[0011] 所述步驟（2)中，所述矽烷化劑具有一個可與偶聯劑反應的活性基團和3個矽氧 基，優選為APTES或MTS。所述步驟（2)中，所述矽烷化劑溶液可由矽烷化劑和有機溶劑組 成；所述矽烷化劑與所述有機溶劑的體積配比為（0. 4-5) :100,優選為2 :100、0. 4 :100、5 : 100或4:100。所述有機溶劑可為甲苯或二甲苯。
[0012] 所述步驟（3)中，所述偶聯劑為如下（a)或（b)或（c)或（d) :(a)戊二醛；（b) GBMS;(c)EDC和NHS;(d)PIDTC。所述步驟（3)中，所述"通過偶聯劑將核酸分子固定到基 片的表面"的方法如下：將步驟（2)得到的基片浸泡於偶聯劑溶液，室溫靜置30-120min(如 60-90min、90-120min、60min、90min或120min)後取出基片，洗滌並乾燥，然後在表面滴加 核酸分子溶液，室溫靜置(具體可為48小時)，洗滌後用蛋白（如牛血清蛋白)進行封閉。所述 偶聯劑溶液中，每種偶聯劑的體積百分濃度可為〇. 4%-5%，如0. 4%-2%，2%-2. 5%、2. 5%-4%、 4%-5%。所述偶聯劑溶液的溶劑可為PBS緩衝液(如pH7. 4的PBS緩衝液)、乙醇、MES緩衝 液(如PH4-6的MES緩衝液，優選為pH5的MES緩衝液）或DMF。所述偶聯劑溶液具體可為 含5% (體積比）戊二醛的PBS緩衝液。所述偶聯劑溶液具體可為含0. 4% (體積比）GBMS的 乙醇溶液。所述偶聯劑溶液具體可為含4% (體積比)EDC和4% (體積比)NHS的pH5、0. 1M 的MES緩衝液。所述偶聯劑溶液具體可為含2. 5%PIDTC的DMF。所述偶聯劑溶液具體可為 含2% (體積比）戊二醛的PBS緩衝液。
[0013] 所述核酸可為脫氧核糖核酸、核糖核酸或肽核酸。
[0014] 以上任一所述方法製備得到的核酸晶片也屬於本發明的保護範圍。
[0015] 本發明還保護所述核酸晶片在倏逝波檢測中的應用。
[0016] 本發明中通過預處理一矽烷化一高溫烘烤一偶聯化一固定寡聚核苷酸的工藝流 程，在Si02晶片表面有效的固定了核酸，得到了核酸晶片，固定密度可達108-10 13個/cm2。 在倏逝波激發下，可實時監測核酸晶片表面固定的核酸與互補核酸的雜交情況，同時該核 酸晶片還可洗脫再生，實現重複使用（可重複使用50次以上)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017] 圖1為實施例1的結果。
[0018] 圖2為實施例2的結果。
[0019] 圖3為實施例3的結果。
[0020] 圖4為對比例的結果。
[0021] 圖5為實施例4的結果。
[0022] 圖6為實施例5的結果。
【具體實施方式】
[0023] 以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平 均值。
[0024]APTES:購自sigma-aldrich;中文名稱為"3-氨丙基三乙氧基矽烷"，分子式為 "H2NCH2CH2CH2Si(0C2H5)3"，CAS號為 "919-30-2"，結構式如下：
[0025]
【權利要求】
1. 一種製備核酸晶片的方法，依次包括如下步驟： (1) 將表面具有Si02膜的基片進行表面羥基活化； (2) 將步驟（1)得到的基片浸泡於矽烷化劑溶液，室溫靜置30-120min後取出基片，洗 滌並乾燥，然後130-200°C烘烤1-12小時； (3) 通過偶聯劑將核酸分子固定到基片的表面，得到核酸晶片。
2. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於：所述步驟（1)中，所述基片為矽片、石英片、 玻璃片或光纖。
3. 如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於：所述步驟（1)中，所述"進行表面羥基 活化"的方法如下：將表面具有Si02膜的基片浸泡於硫酸-過氧化氫溶液，70-1KTC靜置 45-90分鐘後取出基片，洗滌並乾燥，然後100-120°C靜置3-12h。
4. 如權利要求1至3中任一所述的方法，其特徵在於：所述步驟（2)中，所述矽烷化劑 具有一個可與偶聯劑反應的活性基團和3個矽氧基，優選為APTES或MTS。
5. 如權利要求1至4中任一所述的方法，其特徵在於：所述步驟（2)中，所述矽烷化 劑溶液由矽烷化劑和有機溶劑組成；所述矽烷化劑與所述有機溶劑的體積配比為（〇. 4-5): 100。
6. 如權利要求1至5中任一所述的方法，其特徵在於：所述步驟（3)中，所述偶聯劑為 如下（a)或（b)或（c)或（d) :(a)戊二醛；（b)GBMS ;(c)EDC 和 NHS ;(d)PIDTC。
7. 如權利要求1至6中任一所述的方法，其特徵在於：所述"通過偶聯劑將核酸分 子固定到基片的表面"的方法如下：將步驟（2)得到的基片浸泡於偶聯劑溶液，室溫靜置 30-120min，後取出基片，洗滌並乾燥，然後在表面滴加核酸分子溶液，室溫靜置，洗滌後用 蛋白進行封閉。
8. 如權利要求7所述的方法，其特徵在於：所述步驟（3)中，所述偶聯劑溶液中，每種偶 聯劑的體積百分濃度為〇. 4-5%。
9. 權利要求1至8中任一所述方法製備得到的核酸晶片。
10. 權利要求9所述核酸晶片在倏逝波檢測中的應用。
【文檔編號】C40B40/06GK104342760SQ201310336822
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年8月5日 優先權日:2013年8月5日
【發明者】何苗, 韓世同, 施漢昌, 周小紅, 龍峰, 劉蘭華 申請人:清華大學