聚乙二醇修飾抗菌肽及用途的製作方法

2023-11-09 22:40:07

專利名稱：：聚乙二醇修飾抗菌肽及用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及多肽的修飾，具體地說是聚乙二醇修飾陽離子抗菌肽，聚乙二醇修飾的陽離子抗菌肽在水介質中自組裝形成抗菌肽為核、聚乙二醇為殼的的膠束，從而降低抗菌肽被蛋白酶的降解作用。
背景技術：
：近年來，陽離子抗菌肽及其類似物作為抗耐藥細菌的新一代抗菌素已引起人們的高度重視。特別是在隨著傳統抗菌素的廣泛使用，細菌逐漸對其產生了耐藥性，迫使人們不斷尋找新的抗菌素的背景下，陽離子抗菌肽由於獨特的抗菌機理細菌不易對其產生耐藥性(M.Zasloff，A^"w,2002,415,389-395)而得到廣泛關注和研究。研究證實各種生物(包括植物、動物和人類)體內存在抗菌肽，用來對付細菌、病毒和真菌等，這是一類最古老但至今仍很有效的廣譜抗菌素，說明細菌不易對其產生耐藥性。這類多肽因都含有較多的鹼性胺基酸，亦稱陽離子抗菌肽。天然陽離子抗菌肽種類繁多，已發現的超過800種；結構各異，大小從幾個胺基酸到近百個胺基酸，有線型肽也有含二硫健或不含二硫健的環肽。但抗菌肽都含有較多的鹼性胺基酸和疏水性胺基酸。作為抗耐藥細菌的抗菌素，一些抗菌肽已進入臨床試驗(M.Zasloff,7Vartwe,2002,415,389-395)。但抗菌肽在體內易被蛋白水解酶降解，體內循環半衰期短。即使在體外抗菌活性較高，在體內抗菌活性往往很低。此外一些天然抗菌肽除其抗菌活性外，還有很強的溶血等副作用。用聚乙二醇(PEG)修飾蛋白質和多肽藥物可大大增加蛋白質和多肽藥物的抗蛋白水解酶的降解作用，聚乙二醇的分子量愈大，則修飾的蛋白質和多肽藥物的抗蛋白水解酶的能力愈強。但聚乙二醇修飾後蛋白質和多肽藥物的體外藥效會降低。對蛋白質類藥物，由於PEG修飾後在體內的循環半衰期顯著增長，PEG修飾蛋白質藥物的體內的藥效是增大的。如已成功開發出聚乙二醇修飾的蛋白質藥物有醯苷脫氨酶(PEG-ADA)、幹擾素a-2b(peginterferonalfa-2b)、幹擾素a-2a(peginterferonalfa-2a)、重組人粒細胞集落刺激因子(pegfilgrastim)等。但多肽藥物用PEG修飾後往往使其體外藥效顯著降低，PEG的分子量愈大則藥效較低的愈多，修飾後在體內的循環半衰期的增加帶來的益處不足以抵消藥效的降低，修飾後的體內藥效增加得不多甚至有所降低。如在抗菌肽的PEG修飾方面，A.Guiotto和Y.Imura等用5kDaPEG分別修飾抗菌肽nisinA和tachyplesinI(參考文獻A.Guiotto，etal.,//Fanw腳2003，58，45-50和Y.Imura，etal.,爿"a2007，1768,1160~1169),結果抗菌肽經PEG修飾後活性急劇降低，甚至完全失去活性。根據如上所述的抗菌肽在體內易被蛋白酶降解、PEG的分子量對修^飾的多肽藥物的抗蛋白水解酶的作用和藥效的相互矛盾的影響、PEG修飾往往^使抗菌肽的抗菌活性顯著降低的問題，提出了本發明的
發明內容。
發明內容本發明公開了用低分子量聚乙二醇修飾疏水性抗菌肽的策略，用低分子量的聚乙二醇修飾疏水性較強的抗菌肽，由於PEG的分子量較低，修飾後的抗菌肽的體外活性降低得較小。由於抗菌肽的疏水性較強，PEG修飾的抗菌肽在水介質中自組裝形成以PEG為殼、抗菌肽為核的膠束，PEG殼保護核中的肽，使蛋白水解酶不易接近並降解抗菌肽，提高修飾後的抗菌肽抗蛋白水解酶的降解的能力。所用疏水性抗菌肽為蜂毒肽的有效片段(參考文獻H.S.Yan,etal,/W.//Vo^wi仏1994,43,107)的部分取代之後多肽序列，根據疏水性對蜂毒肽片段的抗菌活性的影響(H.S.Yan,etal.,FEBSLetters,2003,554,100-104)，設計的抗菌肽的胺基酸序列為GLLALILWIKRKR-NH2，簡寫為MA。MA抗金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的最低抑菌濃度(MIC)分別為11.6pmol/L和2.9|amol/L。用分子量為500-2000的單曱氧基聚乙二醇(mPEG-OH)在MA的N端修飾。聚乙二醇修飾MA的具體過程為用Rink醯胺樹脂，以Fmoc策略合成MA，在從樹脂上裂解MA之前，用含單羧基的單曱氧基聚乙二醇與樹脂上的MA的N端氨基(已脫掉Fmoc保護基)縮合，然後採用Fmoc策略的裂解條件，將縮合了聚乙二醇的MA從樹脂上裂解下來，得到單甲氧基聚乙二醇修飾的MA,用mPEG-MA表示。向單曱氧基聚乙二醇中引入單羧基的方法可以採用任何現有的引入方法，單曱氧基聚乙二醇的分子量範圍為500-2000。mPEG-MA具有明顯的兩親性，在水溶液中能自組裝成為膠束。膠束直徑約為20~50nm,如用分子量1000的單曱氧基聚乙二醇修飾的MA(用mPEG1(XKrMA表示)的透射電鏡照片見圖1。圖2為mPEGuMKrMA膠束增溶芘的芘溶解度(水介質，用紫外吸收表示)與mPEG1000-MA濃度的關係。圖1和圖2說明mPEG-MA在水介質中形成了膠束。MA用單曱氧基聚乙二醇修飾後保留了較高的抗菌活性。由於採用了低分子量的PEG修飾抗菌肽，mPEG-MA的最4氐抑菌濃度較MA的沒有明顯提高，修飾後抗菌肽的體外抗菌活性仍比較高，甚至有部分修飾抗菌肽較原來多肽有了更高的抗菌活性，見表2。本發明合成的mPEG-MA抗糜蛋白酶降解能力以及在血清中的穩定性得到了明顯提高，在血清和糜蛋白酶溶液中的降解速度明顯延緩，見圖3和圖4。多肽和蛋白質藥物在人體內易受各種蛋白酶分解而降低藥效，糜蛋白酶為一種內切酶，對於MA有多個切割位點；而血清中有多種蛋白水解酶，能夠水解多肽MA。選用這兩種體系比較MA和mPEG-MA在其中的降解速度，發現mPEG-MA在血清和糜蛋白酶溶液中的降解速度較未修飾的MA明顯降低。本發明的另一個發現是在血清存在下mPEG-MA的抗菌活性明顯高於MA的抗菌活性。抗菌肽在血清中容易被其中的蛋白酶降解導致抗菌活性明顯降低，我們發現相比於體外營養肉湯培養基中的抗菌測試，MA在血清中的抗菌活性明顯降低，抗菌效果變差，而修飾後的抗菌肽活性基本不變，或只有很小的降低，修飾後的抗菌肽在血清中的抗菌活性明顯高於未修飾的MA。本發明的另一個發現是PEG化多肽對人體血紅細胞的溶血活性明顯降低。蜂毒肽等多肽具有很強的溶血副作用，我們選用的模板肽MA同樣具有較強的溶血活性。同等條件下比較PEG化的MA和模板肽MA對人血紅細胞的破壞作用，發現經修飾的MA明顯降低了溶血現象，減少了毒副作用。具體實施例方式下面，通過示例性的實施例具體說明本發明。應當理解，本發明的範圍不應局限於實施例的範圍。任何不偏離本發明主旨的變化或改變能夠為本領域的技術人員所理解。本發明的保護範圍由所附權利要求的範圍確定。mPEG5oo-MA,mPEG75(rMA，mPEG1000-MA,mPEG1500-MA,mPEG雄o-MA分別代表用平均分子量為500,750,1000，1500，2000的聚乙二醇"f'務飾的MA。實施例1帶側鏈保護基的多肽MA樹脂的合成在50mL反應瓶加入lgRinkamideMBHA樹脂(0.74mmol/g),力口15mL二曱基曱醯胺(DMF)溶脹10分鐘，抽濾去掉溶劑，然後加入15mL20。/。哌啶/DMF溶液，攪拌30分鐘，抽濾。用DMF洗滌樹脂6次，抽濾去掉溶劑。向反應瓶中加入1.44gFmoc-Arg(Pbf)-OH(Pbf為2,2,4,6，7-五曱基二氬苯並呋喃-5-磺醯基)、0.46g(2.22mmo1)DIC(N，N-二異丙基碳二亞胺)和0.30g(2.22mmo1)HOBt(l-羥基苯並三氮唑)和15mLDMF,室溫下攪拌進行反應。反應2小時後取少量樹脂進行茚三酮顯色試驗，結果表明縮合反應已完全。抽濾，用DMF洗滌樹脂6次，抽濾去掉溶劑。C端的第一個(保護的)胺基酸已聯接於樹脂上。後面接著聯接由C端起的第二個至最後一個(保護的)胺基酸，反應步驟重複上面的操作，即從用20%咪。定/DMF溶液脫保護開始，到茚三酮顯色試驗後用DMF洗滌止。如果節三酮顯色試驗表明縮合未完全，則可延長縮合時間直至完全。所有胺基酸的a-氨基都用Fmoc保護，有側鏈保護基的胺基酸為Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH。最後一個胺基酸甘氨酸縮合完成之後洗滌樹脂，並加入15mL20%。底。^/DMF溶液，攪拌30分鐘，脫除末端的Fmoc保護基。最後樹脂用曱醇洗滌三次，真空乾燥，得到側鏈帶有Boc,Pbf保護基團的多肽MA樹脂。實施例2多肽MA的製備將實施例1得到的多肽MA樹脂0.5g加入到50mL圓底燒瓶中，加入10mLK試劑(三氟乙酸/水/苯酚/苯甲硫醚/l,2-二琉基乙二醇=82.5/5/5/5/2.5，體積比)，室溫下攪拌4小時。過濾，收集濾液。用三氟乙酸洗三次樹脂。合併濾液，旋蒸濾液除去大部分的三氟乙酸，加入體積為8-IO倍的乙醚沉澱出多肽MA,將乙瞇沉澱液放入水箱中過夜。離心，除去乙醚，真空乾燥，得到多肽MA粗品。將200mg多肽MA粗品溶於5mL純水中，用製備型反相HPLC純化，色譜柱為laBondapakC18(19x300mm，10|am),流動相為三氟乙酸/乙腈/水(0.1/32/68，體積比)，流速為12mL/min。收集液經旋轉蒸發濃縮，然後冷凍乾燥得純品多肽MA。實施例3聚乙二醇羧基衍生物(mPEGsoo-COOH)的製備將平均分子量為500的mPEG-OH3.2g與20g蒸餾水，0.4gKOH混合，用冰鹽浴冷卻到0.5°C,慢慢滴加0.4g丙烯腈。溶液在0-5。C下攪拌2小時。慢慢滴加30g濃疏酸，於95-100°C下加熱3小時。冷卻到室溫後，加200mL蒸餾水，用二氯甲烷萃取3次，每次30mL。二氯曱烷萃取液用無水Na2S04乾燥，減壓蒸去溶劑後得到mPEG5oo-COOH。實施例4聚乙二醇羧基衍生物(mPEG75(rCOOH)的製備將平均分子量為750的mPEG-OH5.0g與20g蒸餾水，0.4gKOH混合,用冰鹽浴冷卻到0.5°C,慢慢滴加0.4g丙烯腈。溶液在0-5°C下攪拌2小時。慢慢滴加30g濃硫酸，於95-100。C下加熱3小時。冷卻到室溫後，加200mL蒸餾水，用二氯曱烷萃取3次，每次30mL。二氯曱烷萃取液用無水Na2S04千燥，減壓蒸去-溶劑後得到mPEG75(rCOOH。實施例5聚乙二醇羧基衍生物(mPEG咖o-COOH)的製備將平均分子量為1000的mPEG-OH6.5g與20g蒸餾水，0.4gKOH混合，用冰鹽浴冷卻到0.5°C,慢慢滴加0.4g丙烯腈。溶液在0-5。C下攪拌2小時。慢慢滴加30g濃硫酸，於95-100°C下加熱3小時。冷卻到室溫後，力。200mL蒸餾水，用二氯曱烷萃取3次，每次30mL。二氯曱烷萃取液用無水Na2S04乾燥，減壓蒸去溶劑後得到mPEG1WxrCOOH。實施例6聚乙二醇羧基衍生物(mPEG,5oo-COOH)的製備將平均分子量為1500的mPEG-OH10.0g與20g蒸餾水，0.4gKOH混合，用冰鹽浴冷卻到0.5°C,慢慢滴加0.4g丙烯腈。溶液在0-5。C下攪拌2小時。慢慢滴加30g濃硫酸，於95-100°C下加熱3小時。冷卻到室溫後，力。200mL蒸餾水，用二氯甲烷萃取3次，每次30mL。二氯曱烷萃取液用無水Na2S04乾燥，減壓蒸去溶劑後得到mPEG15oo-COOH。實施例7聚乙二醇羧基衍生物(mPEG2ooo-COOH)的製備將平均分子量為2000的mPEG-OH12,0g與20g蒸餾水，0.4gKOH混合,用冰鹽浴冷卻到0.5°C，慢慢滴加0.4g丙烯腈。溶液在0-5°C下攪拌2小時。慢慢滴加30g濃硫酸，於95-100°C下加熱3小時。冷卻到室溫後，加200mL蒸餾水，用二氯曱烷萃取3次，每次30mL。二氯曱烷萃取液用無水Na2S04乾燥，減壓蒸去溶劑後得到mPEG2ooo-COOH。實施例8mPEG5(K)-MA的製備將實施例1中得到的多肽MA樹脂0.5g加入到反應瓶中，用lOmLDMF/DCM(二氯曱烷)(體積比9/1)溶漲15分鐘。加入0.2gmPEG50(rCOOH,混合溶液，攪拌15分鐘後加入0.4gHOBt和0.4mLDIC,催化劑量的4-二曱氨基吡咬(DMAP),於室溫在氮氣保護下攪拌反應3天。過濾溶液，用大量的DCM和DMF洗滌樹脂。轉移樹脂到50mL圓底燒瓶中，真空乾燥後加入10mLK試劑(三氟乙酸/水/苯酚/苯曱硫醚/1,2-二巰基乙二醇=82.5/5/5/5/2.5,體積比)，室溫下攪拌反應4小時。過濾，收集濾液。用三氟乙酸洗三次樹脂。合併濾液，將濾液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入體積為8-10倍的乙醚沉澱。收集的沉澱放入冰箱中過夜，離心，除去乙醚，真空乾燥，得到平均分子量為500的聚乙二醇修飾的MA(mPEGsoo-MA)粗品。將200mgmPEG鄉-MA粗品溶於5mL純水中，用製備型反相HPLC純化，色譜柱為I^BondapakC18(19x300mm,10jam)，流動相為三氟乙酸/乙腈/水(0.1/32/68,體積比),流速為12mL/min。收集液經旋轉蒸發濃縮，然後冷凍千燥得到純品mPEG5(X)-MA。實施例9mPEG750-MA的製備將實施例1中得到的多肽MA樹脂0.5g加入到反應瓶中,用10mLDMF/DCM(體積比9/1)溶漲15分鐘.加入0.3g的mPEG75o-COOH，混合溶液機械攪拌15分鐘之後加入0.4gHOBt和0.4M1DIC,催化劑量的DMAP,混合物於室溫在氮氣保護下攪拌反應3天.過濾溶液，用大量的DCM和DMF洗塗樹脂.轉移樹脂到50mL圓底燒瓶中，真空乾燥後加入lOmLK試劑(三氟乙酸/水/苯酚/苯甲硫醚/l,2-二巰基乙二醇=82.5/5/5/5/2.5,體積比)，室溫下攪拌反應4小時。過濾，收集濾液。用三氟乙酸洗三次樹脂。合併濾液，將濾液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入體積為8-10倍的乙醚沉澱。收集的沉澱放入冰箱中過夜，離心，除去乙醚，真空乾燥，得到平均分子量為750的聚乙二醇修飾的MA(mPEG75o-MA)粗品。將200mgmPEG500-MA粗品溶於5mL純水中，用製備型反相HPLC純化，色傳柱為^BondapakC18(19x300mm,10|am),流動相為三氟乙酸/乙腈/水(0.1/32/68,體積比)，流速為12mL/min。收集液經旋轉蒸發濃縮，然後冷凍乾燥得純品mPEG75(rMA。實施例10mPEG100(rMA的製備將實施例1中得到的多肽MA樹脂0.5g加入到反應瓶中，用1OmLDMF/DCM(體積比9/1)溶漲l5分鐘.加入0.3g的ixiPEGkhxtCOOH,混合溶液機械攪拌15分鐘之後加入0.4gHOBt和0.4mlDIC,催化劑量的DMAP,混合物於室溫在氮氣保護下攪拌反應3天.過濾溶液，用大量的DCM和DMF洗滌樹脂.轉移樹脂到50mL圓底燒瓶中，真空乾燥後加入10mLK試劑(三氟乙酸/水/苯酚/笨曱硫醚/l，2-二巰基乙二醇-82.5/5/5/5/2.5,體積比)，室溫下攪拌反應4小時。過濾，收集濾液。用三氟乙酸洗三次樹脂。合併濾液，將濾液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入體積為8-10倍的乙醚沉澱。收集的沉澱放入冰箱中過夜，離心，除去乙醚，真空乾燥，得到平均分子量為1000的聚乙二醇修飾的MA(mPEG1(KKrMA)粗品。將200mgmPEG1000-MA粗品溶於5mL純水中，用製備型反相HPLC純化，色語柱為liBondapakC18(19x300mm，10pm),流動相為三氟乙酸/乙腈/水(0.1/32/68,體積比)，流速為12mL/min。收集液經旋轉蒸發濃縮，然後冷凍乾燥得純品mPEG畫-COOH。實施例11mPEG1500-MA的製備將實施例1中得到的多肽MA樹脂0.5g加入到反應瓶中，用10mLDMF/DCM(體積比9/1)溶漲15分鐘.加入0.35g的mPEG，-COOH,混合溶液機械攪拌15分鐘之後加入0.4gHOBt和0.4mlDIC,催化劑量的DMAP,混合物於室溫在氮氣保護下攪拌反應3天.過濾溶液，用大量的DCM和DMF洗滌樹脂.轉移樹脂到50mL圓底燒瓶中，真空乾燥後加入10mLK試劑(三氟乙酸/水/苯酚/苯甲硫醚/l,2-二巰基乙二S孚=82.5/5/5/5/2.5,體積比)，室溫下攪拌反應4小時。過濾，收集濾液。用三氟乙酸洗三次樹脂。合併濾液，將濾液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入體積為8-IO倍的乙醚沉澱。收集的沉澱放入水箱中過夜，離心，除去乙醚，真空乾燥，得到平均分子量為1500的聚乙二醇修飾的MA(mPEG15oo-MA)粗品。將200mgmPEG1500-MA粗品溶於5mL純水中，用製備型反相HPLC純化，色譜柱為pBondapakC18(19x300mm,10pm),流動相為三氟乙酸/乙腈/水(0.1/32/68,體積比)，流速為12mL/min。收集液經旋轉蒸發濃縮，然後冷凍乾燥得純品mPEGcMA。實施例12mPEG2o0-MA的製備將實施例1中得到的多肽MA樹脂0.5g加入到反應瓶中,用10mLDMF/DCM(體積比9/1)溶漲15分鐘.加入0.4g的mPEG2(X)。-COOH,混合溶液機械攪拌15分鐘之後加入0.4gHOBt和0.4mlDIC,催化劑量的DMAP,混合物於室溫在氮氣保護下攪拌反應3天.過濾溶液，用大量的DCM和DMF洗滌樹脂.轉移樹脂到50mL圓底燒瓶中，真空乾燥後加入lOmLK試劑(三氟乙酸/水/笨酚/苯曱碌醚/l，2-二巰基乙二S享-82.5/5/5/5/2.5,體積比)，室溫下攪拌反應4小時。過濾，收集濾液。用三氟乙酸洗三次樹脂。合併濾液，將濾液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入體積為8-10倍的乙醚沉澱。收集的沉澱放入冰箱中過夜，離心，除去乙醚，真空乾燥，得到多肽mPEG2oo-MA粗品。將200mgmPEG2000-MA粗品溶於5mL純水中，用製備型反相HPLC純化，色譜柱為fiBondapakC18(19x300mm,lO(im),流動相為三氟乙酸/乙腈/水(0.1/32/68,體積比)，流速為12mL/min。收集液經旋轉蒸發濃縮，然後冷凍乾燥得純品mPEG2,-MA。實施例13聚乙二醇修飾MA膠束的製備及臨界膠束濃度的測定將1.0mg的mPEG1000-MA溶解於lmL水中，靜置24h後將溶液塗於鍍碳膜的銅網上，觀察透射電鏡下的照片，如圖1所示。電鏡照片表明有膠束形成。同樣條件下觀察mPEG50(rMA、mPEG75(rMA、mPEGl50(rMA和mPEG2000-MA的透射電鏡照片，這些電鏡照片表明這些樣品都有膠束的形成，電4免照片顯示的月交束的直徑見表1。向一系列不同濃度的mPEGl000-MA樣品水溶液中分別加入過量的芘固體粉末，超聲8h以後4000r/min離心lh,測量上清液在336nrn處紫外吸收，作芘的溶解度(以紫外吸光度表示)對mPEGKKK)-MA濃度的關係曲線，見圖2。由芘溶解度隨mPEG1{K)(rMA濃度變化曲線的拐點得到的臨界膠束濃度為2.1pmol/L(參考M.Kastantin,etal.,Macromo/.2007,7,189-194)。同衝羊方法測得mPEG500-MA、mPEG750-MA、mPEG,5oo-MA和mPEG，o-MA的臨界膠束濃度分別為1.8、1.8、2.3和2.4|amol/L。實施例14MA和mPEG1500-MA在糜蛋白酶溶液中的衰減比較測試將MA或mPEG1500-MA樣品溶於pH=7.5的HEPES緩沖溶液中，把此溶液與含O.IM的HCl的100嗎/mL的糜蛋白酶溶液混合，糜蛋白酶與抗菌肽的最終濃度分別為3.64,330嗎/mL。分別在不同時刻取出溶液進行HPLC分析，得到其在糜蛋白酶溶液中的衰減曲線，見圖3。結果表明mPEG1500-MA41MA抗蛋白酶降解的能力明顯增加。同樣條件下分別測試mPEG500-MA、mPEG750-MA、mPEGi500-MA和mPEG2000-MA在糜蛋白酶中的衰減曲線，1小時後未被分解的修飾物濃度分別為初始濃度的40.3%、41.9%、45.8%和52.6%。實施例15MA和mPEG5(MrMA在血清中的衰減速度比較將500|aL血清加入到2mLlmg/mL的MA或mPEG，-MA溶液中，置於37°C恆溫搖床，分別在Omin、lOmin、30min......等不同時刻取出100)aL反應液，加入200pL的無水乙醇沉澱出血清中的蛋白，混合液低溫靜置lOmin後離心，用HPLC測試血清中MA或mPEG500-MA的濃度。結果見圖4。mPEG500-MA較MA明顯提高了在血清中的穩定性。同樣條件下分別測試mPEG500-MA、mPEG750-MA、mPEG1000-MA、mPEGl500-MA和mPEG20(K)-MA五小時後未被分解的修飾物濃度分別為初始濃度的75%、76%,、79%、81%、和84%。實施例16MA和mPEG75o-MA抗菌活性的測定用滅菌生理鹽水配製濃度為lmg/mL的MA或mPEG75(rMA樣品溶液。試驗用菌種分別接種於營養肉湯，於37°C培養18-24小時，臨用前用生理鹽水作1:105稀釋，取12支細菌培養管並編號，於第一管中加入營養肉湯1.8mL，其餘11管中均加入l.OmL肉湯。於第1管加入0.2mL多肽溶液，混勻，從中取出1.OmL加入到第2管中，混勻後從第2管中取出1.OmL加入到第3管中，如此反覆，依次稀釋到第12管，最後從第12管中取出的lmL棄去。每管各加備妥菌液0.2mL,輕輕振搖均勻，置37。C培養18-24小時，觀察。培養後培養管呈現澄清，振搖後仍澄清，認為該管無菌生長；培養管呈現渾濁狀態表明有菌生長。從無菌生長的各管中找出最低MA或mPEG75Q-MA濃度的培養管，該管的濃度即為抑制細菌生長的最低抑菌濃度(MIC)。測定的結果為MA抗金黃色葡萄球菌和枯草菌的MIC分別為11.6pmol/L和2.9(amol/L;mPEG75o-MA抗金黃色葡萄球菌和枯草菌的MIC分別為12.6|ttmol/L和6.3|amol/L。同樣方法測得其他修飾MA的抗菌結果見表2。實施例17MA及mPEG75-MA在血清中抗菌活性的測定分別配置不同濃度的多肽MA及mPEG75-MA溶液，加入終體積佔20%的血清，在37°C下培養lh後加入菌液，並恆溫培養30h,依據實例16的方法確定MA及mPEG75G-MA在血清存在下的MIC。在血清存在條件下MA抗金黃色葡萄球菌和枯草菌的MIC分別為163.2pmol/L和77.4(amol/L;mPEG75o-MA抗金黃色葡萄球菌和枯草菌的MIC分別為22.3pmol/L和16.6Hmol/L。同樣條件測得其他修飾MA的抗菌結果見表2。實施例18MA和mPEG20(x)-MA溶血活性的測定將人血紅細胞懸浮在磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)中，得到血紅細胞懸浮液(5%v/v)。將MA或mPEG2,-MA溶解在磷酸鹽緩沖液中，配成lmg/mL儲備液，取14支1.5mL離心管，於第l支離心管中力口lmL多肽儲備液，其餘各管中加0.5mL磷酸鹽緩沖液，從第l管中取出0.5mL多肽儲備液加至第2管中，用微量混合儀混合均勻，再從第2管中取出0.5mL溶液加至第3管中混合均勻，以此類推，即以倍半稀釋法依次稀釋到第14管，棄去0.5mL，各管補加0.5mL配好的5。/。血紅細胞懸浮液至終體積1.0mL,輕輕搖勻，37。C恆溫箱中保溫60分鐘後於4000r/min離心10分鐘，取上清液在414nm下測定其吸光值。以血紅細胞懸浮在磷酸鹽緩衝液中為空白，以血紅細胞懸浮在1%TritonX-100中為100%溶血。溶血百分率用下式計算樣品的吸光值溶血百分率-X100%100%溶血樣品的吸光值AiUU°表3為MA和mPEG2ooo-MA的溶血活性比較，結果表明mPEG2ooo-MA明顯地降低了對人血紅細胞的溶血活性。同才羊分別測4尋MA、mPEG500-MA、mPEG750-MA、mPEGi000-MA、mPEG150o-MA和mPEG2ooo-MA在濃度為40pnol/L時的溶血百分率為95%、36%、33%、29%、25%和16%。表l.聚乙二醇修飾抗菌肽形成膠束的粒徑範圍tableseeoriginaldocumentpage12圖1.mPEGK)oo-MA的透射電鏡照片圖2.芘在mPEG,畫-MA水溶液中的溶解度(紫外吸收表示)隨mPEG1000-MA濃度的變化圖3.MA和mPEG15oo-MA在糜蛋白酶溶液中的衰減曲線圖4.MA和mPEG500-MA在血清中被蛋白酶降解的衰減曲線權利要求1.一系列聚乙二醇修飾的抗菌肽，結構特徵為mPEG-GLLALILWIKRKR-NH2，其中聚乙二醇的平均分子量為500～2000。2.根據權利要求1所述的聚乙二醇修飾的抗菌肽的製備方法，其特徵在於釆用固相多肽合成的方法，用Rink醯胺樹脂經Fmoc保護策略合成，在固相載體上通過脫保護、縮合逐個連接所需的胺基酸，縮合完最後一個胺基酸後，脫掉N末端的Fmoc基團，然後與單曱氧基單羧基聚乙二醇縮合，縮合方法同上述的固相多肽合成方法中的縮合方法，最後由三氟乙酸切割而得到。3.根據權利要求1和權利要求2所述的聚乙二醇修飾的抗菌肽，其特徵在於聚乙二醇修飾的抗菌肽在水介質中自組裝成為納米膠束，膠束的直徑範圍為20~50nm。4.根據權利要求1、權利要求2和權利要求3所述的聚乙二醇修飾的抗菌肽的用途，其特徵在於聚乙二醇修飾的抗菌肽與未修飾的原抗菌肽相比，能顯著提高抗菌肽在血清中的穩定性，提高在血清中的抗菌活性，並降低溶血的毒副作用，作為抗菌素使用。全文摘要本發明涉及一系列不同分子量的聚乙二醇修飾陽離子抗菌肽，修飾的抗菌肽在水介質中自組裝成為納米膠束，膠束的形成能起到保護抗菌肽，減弱蛋白酶對抗菌肽的降解的作用，同時提高了多肽在血清中的穩定性和抗菌活性。聚乙二醇的修飾還明顯降低了抗菌肽的溶血毒副作用。文檔編號C07K1/107GK101429233SQ200810151979公開日2009年5月13日申請日期2008年10月6日優先權日2008年10月6日發明者張更輝,林小燕,閻虎生,韓寶中申請人:南開大學