視神經脊髓炎的標記的製作方法

2023-11-05 05:03:42 2

專利名稱：視神經脊髓炎的標記的製作方法
技術領域：
本發明一般性地涉及神經系統疾病，更具體地，涉及用於視神經脊髓炎(neuromyelitis optica)、復發性脊髓炎(relapsing myelitis)或視神經炎(optic neuritis)、和亞洲視神經脊髓形式的(Asian opticospinal form ofmultiple sclerosis(MS))的自體抗體標記。
背景視神經脊髓炎(NMO)是一種神經系統疾病，在西方國家已知為Devic′s綜合症，在亞洲已知為視神經脊髓多發性硬化(opticospinal multiplesclerosis)。據認為NMO是多發性硬化(MS)的一種嚴重的變種，佔亞洲人MS病例的30％。在北美，非高加索人(non-Caucasians)表現出比典型MS患者頻率更高的NMO患者頻率。NMO的這種典型的炎症型神經脫髓鞘損害選擇性和重複性地影響視神經和脊髓，因此引起失明和癱瘓。
發明概述在視神經脊髓炎(NMO)和亞洲視神經脊髓形式的多發性硬化病患者的血清和腦脊髓液中鑑定出了一種特異標記。NMO-特異性抗體的存在可以用於區別NMO和MS，還可以在尚沒有滿足任何臨床標準的疾病早期用於診斷NMO，從而使得早開始對NMO進行適宜的免疫抑制或免疫調節治療。
一方面，本發明提供檢測個體的生物樣品中NMO-特異自體抗體的存在或不存在的方法。所述方法包括將生物樣品與NMO抗原性多肽或其片段相接觸，此處所述NMO抗原性多肽為水通道蛋白-4(aquaporin-4)或與星形膠質細胞肌營養蛋白複合體相互作用的蛋白；和檢測NMO抗原性多肽與生物樣品中NMO-特異性自體抗體的結合的存在或不存在。在一個實施方案中，所述NMO抗原性多肽是一種重組表達的NMO抗原性多肽。在另一個實施方案中，所述NMO特異性多肽是在一種固體組織中，所述固體組織選自於由下列組織組成的組腦、脊髓、視神經、腎、或胃。
例如，生物樣品中NMO-特異自體抗體的存在可以與個體的視力損害、衰弱、麻木、痙攣或異常或疼痛感覺、和/或膀胱和/或腸失控相關。另外，NMO-特異自體抗體的存在通常與個體的NMO相關。典型的生物樣品選自於由血液、血清、血漿、和腦脊髓液組成的組。
另一方面，本發明提供檢測個體的生物樣品中NMO抗原性多肽的存在或不存在的方法。所述方法包括將生物樣品與一種抗NMO抗原抗體相接觸，此處的NMO抗原為水通道蛋白-4；和檢測抗NMO抗原抗體與生物樣品的結合，其中的結合是生物樣品中存在NMO抗原性多肽的指示。一般地，生物樣品中NMO抗原性多肽的存在是個體中NMO的指示。所述個體可能部分或完全失明。典型的生物樣品包括血液、血清、血漿、和腦脊髓液、腦組織活檢、和脊髓組織活檢。
另一方面，本發明提供一種製品，其包括NMO抗原性多肽和應用所述NMO抗原性多肽檢測個體中抗NMO抗原自體抗體的用法說明。所述NMO抗原性多肽是水通道蛋白-4。所述製品可以用於在個體中診斷NMO。在一種實施方案，所述製品可以進一步包括一種單克隆抗體，其具有對NMO抗原性多肽特異接合的親和力。
另一方面，本發明提供對患有NMO的個體的治療方法。所述方法包括從個體抽出體液，其中的體液包含一種或多種與水通道蛋白-4結合的自體抗體；從體液中移出主要部分的所述自體抗體；和將所述體液返回受治療者。
另一方面，本發明提供通過給個體施用一種NMO抗原性多肽治療患有NMO的個體的治療方法。所述NMO抗原性多肽是水通道蛋白-4。一般地，施用是通過如口服、靜脈注射、和腸胃外施用的方法進行。
另一方面，本發明提供通過給個體施用一種編碼NMO抗原性多肽的核酸治療患有NMO的個體的治療方法。所述NMO抗原性多肽是水通道蛋白-4。
除非另外定義，本文所用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域內普通技術工人常規理解相同的意思。儘管方法和材料與此處所述的方法和材料相似或等同，可以用於實踐或測試本發明，下文仍對合適的方法和材料進行描述。另外，所述材料、方法和實例僅為舉例說明，不是有意限制。此處提到的所有出版物、專利申請、專利和其它參考在此全部加入作為參考。一旦出現衝突，以本發明的包括定義在內的說明書為準。
本發明一個或多個實施方案的詳情在下述附圖和描述中闡明。其它本發明的特徵、目的和優點將從附圖和發明詳述，以及權利要求中清楚地看出。
附圖簡述

圖1是一個評分表，其用於評估與個體血清接觸的組織密度和免疫組織化學染色模式。
圖2是人水通道蛋白-4核酸的限制性圖譜。
在各種附圖中的相同的參考符號表示相同的要素。
發明詳述從視神經脊髓炎(NMO)和亞洲視神經脊髓性多發性硬化病(Asianopticospinal MS)(本申請中用NMO同義地指NMO和亞洲視神經脊髓性多發性硬化病)患者的血清和腦脊髓液中鑑定出一種特異的IgG自體抗體標記。另外，這種自體抗體可以在患有廣譜炎症疾病的患者中發現，其中所述廣譜炎症疾病包括迄今不被認為與NMO有關的脊髓、視神經、和更罕見地，腦幹或腦的其它區域的炎症疾病。
NMO-特異性抗體的存在可以用於在尚沒有滿足任何臨床標準的疾病早期用於診斷NMO，從而使得早開始對NMO進行適當的免疫抑制或免疫調節治療，並且其還可以進一步用於區別NMO和MS。檢測NMO-特異性抗體還能提供一種可以計量的生物標記，用於監測疾病進展和對治療的反應。免疫染色的模式還能用於對與NMO相關的疾病進行分類，所述疾病包括各種多發性硬化病、分離的視神經炎、特定的脊髓病和全身性紅斑狼瘡和斯耶格倫症候群(Sjogren′s syndrome)的「視神經-脊髓」伴隨症。另外，與NMO相關的抗體的識別提供一種有價值的IgG工具，用於開發動物模型(例如，通過NMO-特異抗體的被動轉運，或者使用NMO抗原性多肽或編碼此類抗原性多肽的DNA疫苗的主動免疫)，以研究NMO損傷的發病機理和測試對NMO的潛在的新治療。
NMO抗原性多肽和NMO-特異性抗體本發明提供使用NMO抗原性多肽檢測個體中NMO-特異性自體抗體的方法。本發明所述方法可能應用的個體典型地表現出視力損傷和/或麻刺感、麻木、衰弱、四肢痙攣、膀胱和/或腸失控、或其它不明原因的神經症狀。本發明的方法基於個體的異常神經症狀和NMO-特異性自體抗體的存在之間的聯繫。
NMO抗原性多肽包括一個或多個抗原表位位點。本發明還提供NMO抗原性多肽的抗原表位，其與T細胞的激活和抑制有關。計算機運算可以用於預測結合的抗原表位，例如，MHC-I和MHC-II結合的抗原表位。例如，參見World Wide Web上的bimas.dcrt.nih.gov80/molbio/hla bind/(Parker，J.Immunol.，152163(1994)；Southwood等，J.Immunol.，1603363(1998))。上下文中所述的術語「典型的(characteristic)」意為所述抗原表位位點允許對血清中NMO-特異性抗體進行合理可靠的免疫檢測。通常地，所述抗原表位位點需要具有與其它緊密相關的抗原(如其它多肽家族成員)截然不同的抗原性。一種典型的抗原片段可能包括，例如，膜結合蛋白的細胞外域。
所述NMO抗原性多肽可以從表達核酸的細胞(如轉染的宿主細胞)中獲得，或者，該多肽可以是合成的。一種編碼NMO抗原性多肽或其片段的DNA分子自身可以是天然的或用通過常規技術從人體組織中獲得的天然基因合成的。
所述NMO抗原性多肽可以以一種基本上純的形式獲得。關於多肽，「純化」是指多肽在混合成分中構成主要成分，例如，50重量％或更多，60重量％或更多，70重量％或更多，80重量％或更多，90重量％或更多，或95重量％或更多。純化的多肽典型地通過從產生多肽的生物體純化獲得，儘管化學合成也是可行的。多肽可以用常規蛋白純化方法純化，包括親和層析或免疫吸附親和層析柱。
本發明的NMO抗原性多肽可以以修飾或不修飾形式用於NMO-特異性自體抗體的檢測。多肽常常通過將所述多肽與提供可檢測信號的第二種物質共價或非共價地結合進行標記。多種標記和共軛連接技術在本領域內已知，並在科學和專利文獻中廣泛報導。一些標記包括放射性同位素、酶、底物、輔因子、抑制劑、螢光劑、化學發光劑、磁性粒子，等等。
按照上述製備的NMO抗原性多肽可以用在多種免疫學技術中以檢測如來自血清和腦脊髓液的生物樣品中的NMO-特異性自體抗體。依據樣品的本質，可以應用免疫測定和免疫細胞化學染色技術兩者之一或全部。酶聯免疫吸附測定(ELISA)、Western印跡、和放射性免疫測定是本領域的常規方法，可以用於檢測NMO-特異性自體抗體在血清中的存在。
本發明進一步提供包含一種或多種NMO抗原性多肽的試劑盒。所述試劑盒可以進一步包含提供可檢測信號第二種物質。典型地，一種試劑盒還包括對使用所述NMO抗原性多肽和/或實踐本發明所述方法(即，檢測生物樣品中的NMO-特異性自體抗體)的用法指導。
本發明還提供一種在來自個體的生物樣品中檢測NMO抗原性多肽的方法。所述方法描述NMO抗原性多肽異常表達水平或模式的存在，隨後產生的NMO-特異性自體抗體，和在個體中導致的NMO三者之間的關聯。所述檢測最廣泛地應用於那些表現出如失明的神經症狀的患者，和那些懷疑患有MS或NMO的患者。多肽的檢測典型地通過使用抗體進行，此處為抗NMO抗原抗體，以區別所述動物或重組產生的抗體和由個體免疫系統產生的NMO-特異性自體抗體。本發明還提供一種抗體，包括對NMO抗原性多肽具有特異結合親和力的單克隆抗體。
一旦獲得足夠量的NMO抗原性多肽，可以通過本領域普通技術人員已知的技術生產對NMO抗原性多肽具有特異結合親和力的單克隆或多克隆抗NMO抗原抗體。此處所用的對NMO抗原性多肽具有「特異結合親和力」的抗NMO抗原抗體定義為那些與NMO抗原性多肽結合但不與其它多肽結合的抗體，例如，多肽家族的其它成員。此處所用的「抗NMO抗原抗體」引用任意種類的全部抗體，即，IgG，IgA，IgM，IgE，或其它已知的種類，還包括具有必要的特異結合親和力的所有抗體的一部分或片段(如Fab或(Fab)2片段)，改造的單鏈Fv分子，或嵌合分子，如包含對一種抗體(如鼠源的)的結合特異性和另一種抗體(如人源的)保留部分的抗體。
本發明的抗NMO抗原抗體可以以修飾或無修飾形式用於NMO抗原性多肽的檢測。抗NMO抗原抗體可以直接或間接地標記，並且在科學和專利文獻中已知並廣泛報導過多種標記和共軛結合技術，其中標記包括放射性同位素、酶、底物、輔因子、抑制劑、螢光劑、化學發光劑和磁性粒子。
如上述製備的抗NMO抗原抗體可以在多種免疫技術中應用，以檢測樣品中的NMO抗原性多肽。此處所用的「生物樣品」通常為來自個體的樣品。生物樣品的非限制實例包括血液、血清、血漿、或腦脊髓液。另外，可以用固體組織，例如脊髓或腦組織活檢。抗體在蛋白結合檢驗中的應用已經被很好地確立。依據樣品的本質，可以應用免疫測定(如放射性免疫測定)和/或免疫組織化學/免疫細胞化學染色技術。液相免疫測定(如競爭抑制放射性免疫測定)或固相免疫測定(如抗原捕獲或Western印跡分析)也可以用於檢測生物樣品中的NMO抗原性多肽。另外，酶聯免疫吸附測定(ELISA)常在本領域實行，並且可以用於檢測生物樣品中NMO抗原性多肽的存在。
科學和專利文獻中已經描述了許多競爭性和非競爭性的蛋白-結合測定，並且大量的此類測定商購可獲得。一種所述的競爭性測定的實例，檢測在如血清的生物樣品中NMO抗原性多肽的存在，包括將NMO抗原性多肽(標記或未標記)與抗NMO抗原抗體(標記或未標記)和生物樣品相接觸。所述NMO抗原性多肽可以，例如，附著到固體表面上。使用已知量的NMO抗原性多肽和標記的抗NMO抗原抗體以產生標準結合曲線，就可以確定生物樣品中NMO抗原性多肽的相對量。
本發明進一步提供的是包含對NMO抗原性多肽或其片段具有結合親合力的抗NMO抗原抗體的試劑盒。所述試劑盒還可以包括NMO抗原性多肽或其片段，以用作結合對照或產生標準的定量曲線。試劑盒進一步包括提供可檢測標記的第二種物質。試劑盒典型地包含使用抗NMO抗原抗體和/或實行本發明方法(即檢測生物樣品中的NMO抗原性多肽)的操作說明。
本發明還提供的是對共軛結合到可檢測標記上的NMO抗原性多肽具有特異結合親和力的抗NMO抗原抗體。合適的可檢測標記包括，但不局限於，酶、放射性同位素、染料和生物素。本發明還提供共軛結合到成像劑上的NMO抗原性多肽具有特異結合親和力的抗NMO抗原抗體。合適的成像劑包括，但不局限於，放射性同位素，如32P、99Tc、111In和131I。
治療NMO的方法本發明進一步提供的治療患有NMO的個體的方法。NMO的治療需要調節個體因NMO-特異性免疫機制導致的神經症狀。治療患有NMO的個體的方法包括，但不限於，單採血液成分術和基於T細胞的免疫治療。
本領域已知單採血液成分術(即，從個體抽取血液，從血液中移除成分，然後將剩下的血液，或缺乏一種或多種成分的血液輸回個體)的方法和體外系統(參見，例如，U.S.專利Nos.4,708,713；5,258,503；5,386,734；和6,409,696)。本發明提供一種從個體的體液中分離NMO-特異性自體抗體的方法。所述方法包括抽取受試者體液；從所述液體中分離主要部分的NMO-特異性自體抗體；然後將體液輸回給受試者。分離的抗體可以是任何種類，如IgG(如IgGI、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgD、IgA、或IgE抗體。
如此處所用，「主要部分(subtantial portion)」意指將分離前體液中存在的NMO-特異性自體抗體分離出至少20％(如，至少20％；30％；40％；50％；60％；65％；70％；75％；80％；85％；90％；93％；95％；96％；97％；98％；99％；99.5％；99.8％；或甚至100％)。所述體液可以是血漿或其它體液，如，淋巴液或腦脊髓液。按照本發明的方法，耗盡患有NMO的個體的NMO-特異性自體抗體將導致症狀的減輕。
分離出NMO-特異性自體抗體通常通過將體液與NMO抗原性多肽接觸來實現。NMO抗原性多肽可以結合到固體支持物上。此類固體支持物可以是，但不限於，膜、纖維、圓珠、或細粒，並且可以用不溶解於水的，優選多孔的、生物相容的材料，例如，如瓊脂糖、糖苷的有機聚合體，和聚丙烯醯胺，或無機多孔材料，如多孔玻璃或多孔矽膠。此類材料適於或可以適合NMO抗原性多肽的附著。
當體液為血液時，血漿和/或白細胞可以與紅細胞分離(如紅血球)，並且可以將伴隨或不伴隨白細胞的紅細胞輸回個體。通常，將帶有人造血漿而非其最初的血漿的血細胞輸回給個體。「代替液體」(如生理鹽水)可以在分離出所述液體後施用給個體。可選地，NMO-特異性自體抗體可以在單採血液成分過程中選擇性地從血漿中分離出來，並且血細胞可以與耗盡NMO-特異性自體抗體的血漿相混合，然後作為混合物重新灌注回個體中。
所述系統可以是連續的系統，在其中，例如，將血液從經過衍生有NMO抗原性多肽的固體支持物的血管(如動脈或靜脈)中泵出，並直接泵回給個受試者。當在非連續系統中時，在血漿流經固體支持物之前，將血細胞從血漿中分離出來。
T細胞受體治療的方法在本領域內已知。參見，例如，U.S.專利No.5,614,192；Matsumoto等，2000，J.Immunol.，1642248-54；和Mackay，2000，British Med.J.，32193-6。具有對NMO抗原-受體表達的抗原的特異結合親合力的單克隆或多克隆抗體，或其它能夠減少並維持NMO-特異性自體抗體的生產的T細胞群標記，可以用於耗盡或抑制一種或多種病原T細胞。T細胞受體的CDR3光譜類型可以用於鑑定自體免疫疾病相關的T細胞受體(Matsumoto等，如前所述；Jambou等，2003，J.Clin.Invest.，112254-74)。另外，在個體中，T細胞的激活可以通過施用細胞素或具有對細胞素特異結合親和力的抗體進行抑制。例如，為減少Th1型免疫應答，可以給個體施用如白細胞介素(IL)-4、IL-10或IL-13的細胞素或對如IL-12或幹擾素(IFN)-γ的細胞素特異的抗體。相似地，為抑制Th2型免疫應答，可以給個體施用如IL-12或IFN-γ的細胞素或對IL-4、IL-10、或IL-13特異的抗體。
另外，本發明的治療方法包括給個體施用有效量的藥物組合物(如NMO抗原性多肽，或核酸如反義寡核苷酸，或編碼NMO抗原性多肽的核酸)。有效量是指能夠偏離個體的NMO抗原性多肽介導的免疫應答由此調節個體的神經疾病的NMO抗原性多肽的量。如此處所用，「調節」神經疾病可以是指減少一種或多種症狀的嚴重性，消除所有症狀，或其間任何水平的症狀。
「反義寡核苷酸」是一種可以特異性雜交到靶核酸上的寡核苷酸，並且通過反義寡核苷酸對靶核酸表達的調節通常稱為「反義技術」。此處所用的關於反義技術的術語「雜交」是指靶核酸與反義寡核苷酸的互補區域的氫鍵鍵合，其可以為Watson-Crick、Hoogsteen、或反Hoogsteen氫鍵鍵合。「特異性雜交」用來指互補或精確匹對的充分程度，以致在反義寡核苷酸和靶核酸之間發生穩定和特異的鍵合。在本領域內知道反義寡核苷酸的序列不必與其特異性雜交的靶核酸序列100％地互補。
所述反義寡核苷酸與其靶核酸的特異性雜交可以幹擾靶核酸的正常功能。對於靶DNA核酸，反義技術可能干擾複製和轉錄。對於靶RNA核酸，反義技術可能干擾如所述RNA到蛋白翻譯位點的轉運，剪切RNA以產生一種或多種mRNA，RNA的催化活性，和RNA的蛋白翻譯。在編碼NMO抗原性多肽的核酸的情況下，所述對靶核酸功能的幹擾的全面作用是對與NMO相關的疾病症狀的調節。在本發明的上下文中，反義技術可以用於減少編碼NMO抗原性多肽的基因的表達(如，由於對轉錄的抑制)和/或減少NMO抗原性多肽的細胞水平(如，由於對翻譯的抑制)。
反義寡核苷酸的優選的靶位點已經包含環繞所述靶基因的可譯框(ORF)的翻譯起始或終止密碼子的區域。另外，在反義技術中，所述可譯框已經被有效地靶向，5′和3′不翻譯區也一樣。並且，反義寡核苷酸已經被成功地導向內含子區域和內含子-外顯子連接區域。此外，可以應用多條反義寡核苷酸，其每一條特異地雜交到靶基因的不同區域。
本發明方法中應用的反義寡核苷酸(如siRNA)長度通常從約10到約50個核苷(如長度為12到40，14到30，或15到25個核苷)，但是只要所述反義寡核苷酸能夠調節與NMO相關的症狀，其也可以長些或者短些。如此處所用，反義寡核苷酸包括由天然發生的核苷鹼基、糖和共價核苷間(骨架)聯接組成的寡核苷酸，以及包含修飾的骨架(如取代糖部分)或非天然的核苷間聯接的寡核苷酸。反義寡核苷酸還包括如肽核酸(PNAs)的寡核苷酸類似物或嵌合寡核苷酸。並且，本發明的反義寡核苷酸可以通過化學聯接到一個或多個提高所述寡核苷酸的活性、細胞分配或細胞吸收的糖部分或共軛物上進行修飾。參見，例如，美國專利Nos.5,218,105和5,214,136。
可以評估反義寡核苷酸對NMO抗原性多肽的表達和/或生產的抑制能力，例如，通過測量治療前和治療後個體中mRNA或蛋白的水平。測量組織中或生物樣品中mRNA或蛋白水平的方法在本領域內廣為人知。
通過給個體施用一種適當的表達編碼NMO抗原性多肽的核酸的載體，NMO抗原性多肽還可以在體內運送。運送編碼生物有用蛋白(如NMO抗原性多肽)的核酸到個體的載體在本領域內已知。目前基於病毒的核酸運送載體典型地源於動物病毒，如腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、牛痘病毒、皰疹病毒、和牛乳頭瘤病毒。用於核酸運送的載體通常被進行遺傳修飾以便改變或移除所述病毒的天然向性和病原性。還可以對病毒的基因組進行修飾，以增加它的傳染性和適應核酸的包裝，例如編碼生物有用蛋白的核酸的包裝。另外，非病毒載體和應用所述載體進行核酸運送的方法為本領域的技術人員所知。
如此處所用，「施用」意指將本發明的組合物(如，NMO抗原性多肽，特異性雜交到編碼NMO抗原性多肽的核酸的一部分上的反義寡核苷酸，或編碼NMO抗原性多肽的核酸)運送到患者的方法。所述方法廣為本領域技術人員所知，其包括，但不限於，口服、鼻內、靜脈內、肌肉、腹膜內、皮下、鞘內、皮內、或局部施用。施用的途徑可能取決於各種因素，如治療目的。本發明的組合物可以連續或間歇地施用。配製和隨後施用治療組合物的方法廣為本領域的技術人員所知。參見，例如，Remington，2000，The Science and Practice of Pharmacy，20th Ed.，Gennaro和Gennaro，eds.，Lippincott，Williams和Wilkins。施用的劑量將取決與許多因素，包括施用和配製的模式。典型地，單劑量的數量是有效減少個體中NMO抗原性多肽或NMO-特異性自體抗體水平而沒有惡化疾病症狀的數量。
另外，本發明範圍內的NMO抗原性多肽可以包含用於體內施用給個體的藥用載體，其包括，但不限於，無菌水或非水溶液、懸浮液、和乳劑。非水溶劑的實例包括，但不限於，丙二醇、聚乙二醇、植物油、和可注射的有機酯。水相載體包括水、醇、鹽、和緩衝的溶液。藥用載體還可以包括生理學可用水載體(如，生理鹽水或人造腦脊髓液)或其它已知的適合於具體施用途徑的載體。其它的化合物可以與NMO抗原性多肽包含在一起，如類固醇、黏液溶解劑、消炎劑、免疫抑制劑、擴張劑、血管收縮藥、或其組合。防腐劑、調味劑、和其它添加劑，如，例如，抗細菌劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等也可以加入其中。
運送組合物到大腦的方法在本領域內已知。例如，可以通過附著一個識別腦特異性或神經特異性受體的配基(如抗體或抗體片段)對本發明的組合物進行修飾。另外，提高分子轉運通過血-腦屏障的方法已知，並且其利用被動擴散(如，應用電磁場、氧化一氮供體或癸酸鈉)或受體介導的細胞內吞作用(如將病毒顆粒附著到，例如，抗鐵傳遞蛋白抗體或腐胺上)。攜帶編碼NMO抗原性多肽的核酸的病毒載體的表達還可以通過腦特異性或神經特異性啟動子和/或轉錄調節元件(參見，例如，美國專利Nos.5,976,872或6,066,726)。一種用於編碼NMO抗原性多肽的核酸的星形膠質細胞成足過程特異表達的特別有用的啟動子是細胞原纖維酸性蛋白(GFAP)，其為星形膠質細胞分化的標記。
本發明還提供的是在患者中表達NMO抗原性多肽的細胞成像的方法。所述方法包括給患者施用有效量的對NMO抗原性多肽具有特異性結合親合力的抗NMO抗原抗體，以結合到釋放自細胞或細胞中可及的NMO抗原性多肽上，其中NMO抗原性多肽用成像劑標記，例如，32P、99Tc、111In或131I，並且檢測形成的任何複合體。如廣為本領域的普通技術人員所知，合適量的抗NMO抗原抗體是有效使細胞成像的任意量，例如，約0.1mCi到約50.0mCi。另外，所述抗NMO抗原抗體的有效量可以是約0.01mg到約100mg。合適的施用成像劑的方法如上所述，並且可以按上述被靶向(如到大腦)。成像的方法取決於所應用的試劑，並且廣為本領域的技術人員所知。
本發明還提供的是一種計數或分離個體中NMO抗原性多肽-特異的T淋巴細胞的方法。所述方法可以用於，例如，監控個體的免疫應答或用於使用NMO抗原性多肽特異的細胞毒T細胞的免疫治療。所述方法包括將包含淋巴細胞的生物樣品與可溶性四聚體I類或II類主要組織相容性複合體(MHC)相接觸，所述要組織相容性複合體(MHC)具有同樣的NMO抗原性多肽片段。如抗生物素蛋白和生物素的連接分子用於生產NMO抗原性多肽-MHC四聚體複合物，其隨後可以用指示分子標記，以便將那些識別NMO抗原性多肽-MHC四聚體複合物的T細胞進行計數或分離出來(如，應用FACS分析)。參見，例如，Schwartz，1998，New England J Med.，3391076-8，及其參考文獻。
核酸和構建體此處公開的實驗證據表明NMO抗原性多肽是水通道蛋白-4。術語「水通道蛋白-4」指水通道蛋白家族的一個成員。水通道蛋白家族具有10個已知成員。水通道蛋白-4在與中樞神經系統的毛細管接觸的星型膠質細胞成足化過程膜上表達，還在腎末梢收集小管和胃上皮細胞的基底外側膜上表達。編碼人水通道蛋白-4多肽的核苷酸序列的實例在GenBank入藏登記號U63622和U63623中顯示。典型的人水通道蛋白-4多肽的預測的胺基酸序列在GenBank入藏登記號Nos.AAG17964，AAB26957，AAB26958，和I39178中顯示。其它生物體(如Mus musculus，Bos Taurus，Rattusnorvegicus，和Ovis aries)編碼水通道蛋白-4的核酸和胺基酸序列可以通過使用「水通道蛋白-4」為搜索詞搜索GenBank資料庫(在環球網上網址為ncbi.nlm.nih.gov)找到。
如此處所用，核酸是指RNA或DNA。關於核酸，此處所用的「分離的(isolated)」是指(i)編碼部分或全部的人水通道蛋白-4的核酸序列，但是沒有通常位於人類基因組中編碼水通道蛋白-4的核酸序列一側或兩側的編碼序列；或(ii)整合到載體中或生物體基因組DNA中的核酸，其使得獲得的分子與任何天然發生的載體或基因組DNA沒有同一性。
另一方面，本發明包括人水通道蛋白-4核酸和多肽的片段。如此處所用，片段是指與相應於小於全部的水通道蛋白-4序列的核酸或多肽。核酸片段可以包括那些長度約100個核苷酸的片段，和GenBank入藏登記號為U63622或U63623的長度為幾百個核苷酸的片段；或GenBank入藏登記號為U63622或U63623的長度為約10-50個核苷酸的片段。本發明提供的片段包括，例如，GenBank入藏登記號為U63622或U63623的核苷酸166-266，283-306，404-1104，575-925，648-698，712-747，和891-906。所述片段可以，例如，編碼水通道蛋白-4抗原性多肽片段，或具有作為雜交探針和擴增引物的用途。
圖2顯示人水通道蛋白-4核酸序列中的各種限制性內切酶酶切位點的相對位置，其通過實例的方式定義位點，所述位點通過各種連接可以用於產生有用的核酸片段。給出人水通道蛋白-4多肽的核苷酸序列，基本上任意核酸片段可以通過已知方法產生(如，限制性內切酶消化，聚合酶鏈式反應)並且，如果需要，可以表達以產生對應的多肽片段。可選地，人水通道蛋白-4多肽可以被剪切(如蛋白水解酶水解地)以直接產生多肽片段。
人水通道蛋白-4核酸或核酸片段可以具有GenBank入藏登記號為U63622或U63623顯示的序列衍生來的序列。例如，一種核酸序列具有與GenBank入藏登記號為U63622或U63623顯示的核苷酸序列至少80％的序列同一性。在一些實施方案中，所述核酸序列具有與GenBank入藏登記號為U63622或U63623顯示的核苷酸序列至少85％的序列同一性，90％的序列同一性，95％的序列同一性，或至少99％的序列同一性。參見，例如，GenBank入藏登記號BC022286，NM004028，和NM-001650的水通道蛋白-4不同核酸序列。
序列同一性百分數通過下述方法計算確定比對核酸或多肽序列中匹配的位點數目，用匹配的位點數目分別除以比對的核苷酸或胺基酸總數，然後乘以100。匹配的位點是指相同的核苷酸或胺基酸發生在比對序列中的相同位點的位點。比對核苷酸或胺基酸的總數是指與第二序列比對必需的水通道蛋白-4核苷酸或胺基酸的最小數目，並且其不包括與如那些融合到水通道蛋白-4上的非水通道蛋白-4序列的比對(如強迫的比對)。比對核苷酸或胺基酸的總數可以對應全部水通道蛋白-4序列或可以對應此處定義的水通道蛋白-4序列全長的片段。
序列可以應用Altschul等(1997，Nucleic Acids Res.，253389-3402)所述的併入到BLAST(基本的局部比對搜索工具)程序的運算法則進行比對，其中BLAST程序在環球網上可用，網址為ncbi.nlm.nih.gov。BLAST搜索或比對可以通過應用Altschul等的運算法則進行，以確定水通道蛋白-4核酸分子和任意其它序列或其部分序列之間的序列同一性百分比。BLASTN是用於比對和比較核酸序列之間的同一性的程序，而BLASTP是用於比對和比較胺基酸序列之間的同一性的程序。當應用BLAST程序來計算水通道蛋白-4與其它序列之間的同一性百分數時，應用每一程序的預設參數。
編碼人水通道蛋白-4多肽的核酸可以獲得於，例如，從人細胞系製備的cDNA文庫，或通過其它方法獲得，包括，但不限於，聚合酶鏈式反應(PCR)。PCR是指一種擴增靶核酸的程序或技術。PCR可以用於從DNA和RNA擴增特異的序列，包括來自全基因組的DNA或全細胞的RNA。各種PCR方法例如在PCR PrimerA Laboratory Manual，Dieffenbach和Dveksler，Eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995.中有描述。一般地，應用目的區域的兩端或之外的序列信息來設計寡核苷酸引物，其在序列上與要擴增模板的對應鏈相同或相似。
人水通道蛋白-4核酸可以通過如各種雜交技術進行檢測。核酸分子間的雜交在Sambrook等(1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，2ndEd.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，紐約；7.37-7.57，9.47-9.57，11.7-11.8，和11.45-11.57節)中有詳細討論。
對於少於約100個核苷酸的寡核苷酸探針，Sambrook等在11.45-11.46節公開適宜的Southern印跡條件。在長度少於100個核苷酸的序列和第二序列之間的Tm可以應用Sambrook等在11.46節提供的公式計算。Sambrook等還討論了應用多於約100個核苷酸的寡核苷酸探針的Southern印跡的預雜交和雜交條件(參見9.47-9.52節)。使用多於100個核苷酸的寡核苷酸的雜交通常在低於Tm 15-25℃的溫度進行。在長度長於100個核苷酸的序列和第二序列之間的Tm可以應用Sambrook等在9.50-9.51節提供的公式計算。另外，Sambrook等推薦應用9.54節指示的條件來洗滌已用長於約100個核苷酸的寡核苷酸探測了的Southern印跡。
預雜交和雜交含有核酸的膜的條件，以及洗滌含有核酸的膜以去除剩餘的和非特異性結合的探針的條件，在雜交的嚴謹性中起著重要作用。所述雜交可以在合適的中等的或高度嚴謹的條件下進行。例如，所述條件在Sambrook等的11.45-11.46節中描述。例如，洗滌條件可以通過減少洗滌溶液的鹽濃度和/或提高洗滌進行的溫度而更加嚴謹。另外，對雜交數量的解釋可能受到下列因素的影響，例如，標記的寡核苷酸探針的特異活性、在探針雜交的模板核酸上探針結合位點的數目、和放射自顯影或其它檢測介質的曝光量。
本領域的普通技術人員應該認識到，儘管任意數目的雜交和洗滌條件可以用於檢查探針核酸分子與固定的靶核酸的雜交，更重要的是檢查在同樣的雜交、洗滌、和曝光條件下探針與靶核酸的雜交。優選地，所述靶核酸位於同一張膜上。
如果與第一個靶核酸的雜交比與第二個靶核酸的雜交至少強5倍(如，至少6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，20倍，50倍，或100倍)，就認為核酸分子雜交到第一個靶核酸上，而不雜交到第二個靶核酸上。雜交的數量可以直接在膜上或從放射自顯影上進行定量，通過應用如感光成像儀(PhosphorImager)或顯像密度計(Densitometer)(Molecular Dynamics，Sunnyvale，加州)進行。
本發明還包括這樣的載體，其包含人水通道蛋白-4核酸(參見，例如，GenBank入藏登記號U63622和U63623)或其補體，水通道蛋白-4核酸片段或其補體，和那些與水通道蛋白-4核酸或其產生的片段(或其補體)具有至少80％序列同一性的核酸。
適於用於本發明的克隆載體可以商購，並被那些普通技術人員常規應用。本發明的載體還包括表達必需的元件，其有效地與人水通道蛋白-4核酸序列連接。「表達必需的元件」包括啟動子序列，並且還可能包括如增強子序列的調控元件，調節人水通道蛋白-4核酸序列表達的響應元件或可誘導元件。如此處所用，「有效地連接」指在人水通道蛋白-4核酸序列相關的構建體中布置啟動子和/或其它調控元件，通過這種方式來引導或調控水通道蛋白-4核酸的表達。所述構建體可以商購(如表達載體)和/或用本領域常規的重組DNA技術生產。表達系統的選擇取決於幾個因素，包括但不限於，複製效率、選擇性、可誘導性、靶向性、必要的表達水平、回收容易度和宿主進行翻譯後修飾的能力。
如此處所用，術語「宿主」或「宿主細胞」意指不但包括如大腸桿菌(E.coli)的原核生物，還包括如酵母、昆蟲、植物和動物細胞的真核生物。動物細胞包括，例如，COS細胞和HeLa細胞。宿主細胞可以被轉化或轉染DNA分子(如載體)，通過應用本領域普通技術人員常規所知的任何技術，如磷酸鈣或醋酸鋰沉澱，電穿孔，脂質轉染和粒子轟擊。包含本發明載體的宿主細胞可以用於下述目的如繁殖載體、生產人水通道蛋白-4核酸(如DNA、RNA、反義RNA)、或者表達人水通道蛋白-4多肽或其片段。
本法明的另一方面，提供生產水通道蛋白-4多肽的方法。生產水通道蛋白-4多肽的方法包括，但不限於，在允許水通道蛋白-4表達的條件下培養包含水通道蛋白-4表達載體的宿主細胞，和回收水通道蛋白-4多肽。培養細菌和回收表達的多肽的方法廣為本領域的普通技術人員所知。
另外，本發明的核酸可以通過如Southern或Northern印跡(即雜交)、PCR、或原位雜交分析進行檢測。水通道蛋白-4蛋白典型地通過轉染細胞系中的免疫細胞化學檢測，或通過十二烷基磺酸鈉(SDS)聚丙烯醯胺凝膠電泳，緊接著進行考馬斯蘭染色或應用具有對人水通道蛋白-4多肽特異結合親合力的抗體(單克隆或多克隆)的Western印跡分析，進行檢測。
本發明還在下述實例中描述，其沒有限制權利要求所述的本發明的範圍。
實施例實施例1-血漿預吸收為將非特異性染色減到最少，每一個患者的血漿用肝抗原進行預吸收，通過將40mg商業豚鼠組織粉(Sigma Chemical Co.，St.Louis，密蘇裡州)與10μL稀釋在590μL的含有1％牛血清蛋白的磷酸緩衝鹽(PBS)中的血清混合以實現。室溫下溫和地混合1小時後，不溶的殘渣通過離心(20,800xg，10分鐘)去除。然後立即加入新鮮的肝粉(40mg)到血清的上層清液中，並且重複本步驟2次，一共3次連貫的吸收。
實施例2-底物製備將3種常規哺乳動物組織(如鼠腦(小腦和中腦)、胃和腎)的冷凍複合塊在8孔顯微鏡載玻片的單孔上進行冷凍切片(4μ厚度)。這些載玻片作為常規產品購買(購於MeDiCa，Encinitas，加州)，並在含有乾燥劑的密封袋中保存於-70℃。在打開使用前，在室溫下平衡每一個密封袋。將冷卻的去垢劑(含1％CHAPS的PBS)塗在每一張切片上並在4分鐘後吸走。在冷凍的PBS(每一次洗滌在搖床上持續5分鐘)中洗滌3次後，塗上冷凍的10％磷酸緩衝的福馬林，並在4分鐘後吸走。3次在冷凍的PBS中多於5分鐘的洗滌後，塗上含有10％的正常山羊血清的PBS(室溫)，並在60分鐘後吸走。
實施例3-免疫染色將吸收的、稀釋的患者和對照血清(40μL體積)分別塗到含有上述處理的組織切片的孔上。室溫下40分鐘後，每一個孔用冷卻的PBS徹底地洗滌。然後在合適的稀釋應用一種商業螢光染料-共軛的對人IgG特異的IgG(如，螢光標記的山羊抗人IgG，Southern Biotechnology Assoc.，Inc.，伯明罕，阿拉巴馬州)。室溫下35分鐘後，用冷卻的PBS徹底洗滌孔，並用玻璃條狀蓋板(#1厚度)在含有抗褪色劑的封固劑作用下將每一塊載玻片蓋好。通過螢光顯微鏡(20X目鏡)評估與IgG結合的組織的典型的NMO模式。
在中樞神經系統(CNS)中，NMO抗原定位在小腦皮層、中腦和脊髓的毛細管的管腔壁上；在視神經中，NMO抗原與軸突柱間的毛細管區的軟膜和星型膠質細胞進程相關。在CNS組織的最佳治療切片中，免疫螢光共焦顯微鏡表明NMO抗原是血腦屏障的組成部分。在延伸到白質和灰質中微脈管的魏爾嘯-羅賓隙(Virchow-Robin space)的星型膠質細胞-軟膜連接處的神經膠質界膜中，免疫反應性是固有的。使用親和純化的具有確定特異性的抗體的雙免疫染色顯示出NMO抗原與水通道蛋白4共定位，其中水通道蛋白4是血腦屏障的一種汞不敏感的水通道蛋白組分。在脾或肝實質切片中檢測不出NMO抗原，但是，同水通道蛋白4一樣，它明顯地與腎遠曲收集小管的基底外側膜和胃深黏膜上皮相關。
通過在競爭性抑制免疫螢光檢測中應用限制稀釋的NMO-IgG，演示了粗製膜級分(crude membrane fraction)的免疫反應性，其中粗製膜級分從通過差速離心移除組織碎片和核團後的勻漿的大鼠腦中製備。所述級分有效地終止NMO-IgG免疫螢光模式。胞質級分不吸收NMO-IgG的反應性。粗製膜級分的免疫反應性抵抗非離子去汙劑CHAPS 2％的溶液的萃取。這一觀察結果導致了這樣的發現在磷酸緩衝的10％的福馬林固定4分鐘之前或之後，用1％CHAPS處理組織切片4分鐘，保持了組織形態學並且在70％的臨床診斷的NMO患者血清中增強了NMO表位對IgG的可接近性。
儘管不受任何具體理論的限制，NMO抗原對去汙劑萃取的抵抗力是與水通道蛋白4的細胞質C末端到支架銜接蛋白α-肌養蛋白結合蛋白的PDZ區域的預定範圍一致的，其中α-肌養蛋白結合蛋白是肌養蛋白複合體的組分(Neely等，PNAS 9814108，2001)。血腦屏障的肌養蛋白複合體的其它組分還可以是NMO自體抗體的相關靶點(Neely等，如前所述)。
實施例4-解釋免疫組織化學染色結果表1顯示在每一種指示組織中評估的典型特徵。
表1

每一特徵的染色強度在正式的記分表中(圖1)用下述記分體系進行分級陰性-或±/-弱陽性，可能是不確定的(equivocal)±確定的陽性，強±/+，+或2+陽性結果要求最少賦值一個『±』給腎的遠曲收集小管和小腦或中腦軟膜或微脈管。
記錄任何核、細胞質、膜的或細胞外基質染色的存在和強度，其中所述染色可能潛在地幹擾NMO-IgG解釋。特別是，對每一個檢查的組織切片，記錄表2所示的任何組織的染色。
表2

實施例5-臨床應用對來自於分類為「確定的(definite)」NMO，MS的亞洲視神經形式，或通過臨床、成像和脊髓液標準的診斷的典型MS的患者，和對照患者的血清進行自體抗體分析，其中自體抗體可以選擇性地與CNS組織結合。此處所述式樣表明血清陽性分析結果對於區分NMO和多發性硬化病(MS)的典型形式的價值。血清(在測試中編號)來自於用嚴謹度的各種等級診斷標準確定的NMO患者(n＝45)，典型的MS患者(n＝19)，認為高風險患MNO的患者(縱向延伸的脊髓炎的雙邊視神經炎或單邊或復發性發作；與陰性腦相關的核磁共振成像(MRI)，即，沒有達到「確定的」NMO分類的嚴謹標準)(n＝35)，和最終診斷為MS而最初表現為視神經炎或脊髓炎的患者(n＝22)。用鼠腦、胃和腎的標準組合底物進行間接的免疫螢光；血清用如上述實施例1所述的肝提取物進行預吸收。
在45名NMO患者中，33名患者(73％)的IgG產生與眾不同的染色模式(″NMO-IgG″)，其與貫穿小腦皮層和中腦的微脈管相關，與軟膜和軟膜下「篩孔」(在中腦中顯著)相關。在腸黏膜、腎、或肝中看不到所述微血管模式，並且在任何對照疾病組中沒有記錄到NMO-IgG。來自35名具有得NMO高風險的患者中的16名患者(46％)的血清產生與眾不同的NMO-IgG染色模式。診斷為典型的MS的19名患者沒有人具有可檢測到的NMO-IgG染色模式，但是表現出視神經炎/脊髓炎的22名患者中有2名(9％)具有所述NMO-IgG。
另外，在遞交到Mayo Clinic′s Neuroimmunology Laboratory進行基於服務性的不知情副腫瘤性自體抗體測試的85,000名患者的血清中，偶然地從14名患者中鑑定出了NMO-IgG。他們的後續病史記錄表明3人達到了NMO診斷的臨床標準，9人分類為高風險性得NMO(7人具有縱向延伸脊髓炎和2人具有復發性視神經炎)，1人具有新脊髓病發作，和1人具有未分類的類固醇-應答的CNS炎症疾病。
所述結果表明NMO-IgG自體抗體是NMO的第一特異的生物標記，並能夠區分NMO和MS。
實施例6-Western印跡一種包含重組大鼠水通道蛋白4(C末端殘基249-323；Alamone Labs，Jerusalem，以色列)的GST融合蛋白在10％的聚丙烯醯胺凝膠中電泳，電泳緩衝液是含有巰基乙醇的標準Laemmli SDS緩衝液，並且使用NMO患者的和作為陽性對照的免疫兔的血清進行Western印跡，以確定患者的IgG是否將與38kDa的GST-水通道蛋白4融合蛋白結合。所述印跡與人血清接觸(1∶50稀釋)，其中包括4名NMO患者，3名正常人，1名對照脊髓病患者，2名典型的MS患者，和3名具有混合的神經精神病的患者。來自4名NMO患者的血清和免疫兔的血清結合到8kDa的水通道蛋白4融合蛋白，然而來自對照患者或表現出其它疾病的患者的血清中沒有一例與之結合。
其它實施方案應該明白儘管本發明與其詳細表述結合進行描述，在前描述是用來例證但不限制本發明的範圍，其由附加權利要求的範圍所確定。其它方面、優點、和修飾在下述權利要求的範圍中。
權利要求
1.一種檢測來自個體的生物樣品中NMO-特異性自體抗體的存在或不存在的方法，其包括步驟將所述生物樣品與NMO抗原性多肽或其片段接觸，其中所述NMO抗原性多肽是水通道蛋白4；和檢測所述NMO抗原性多肽與所述生物樣品中的所述NMO-特異性自體抗體結合的存在或不存在。
2.權利要求1的方法，其中所述NMO-特異性自體抗體在所述生物樣品中的存在是與所述個體中的視力損傷、衰弱、麻木、痙攣或異常或疼痛感、和/或膀胱和/或腸失控相關的。
3.權利要求1的方法，其中所述NMO-特異性自體抗體的存在與所述個體中的NMO相關。
4.權利要求1的方法，其中所述NMO抗原性多肽是重組表達的NMO抗原性多肽。
5.權利要求1的方法，其中所述NMO-特異性多肽是在選自於由腦、脊髓、視神經、腎、或胃組成的組的固體組織中。
6.權利要求1的方法，其中所述生物樣品選自於由血液、血清、血漿、和腦脊髓液組成的組。
7.一種檢測來自個體的生物樣品中NMO抗原性多肽的存在或不存在的方法，其包括步驟將所述生物樣品與抗NMO抗原抗體接觸，其中所述NMO抗原是水通道蛋白4；和檢測所述抗NMO抗原抗體與所述生物樣品的結合，其中結合是所述生物樣品中存在所述NMO抗原性多肽的指示。
8.權利要求7的方法，其中NMO抗原性多肽在所述生物樣品中的存在是所述個體中NMO的指示。
9.權利要求7的方法，其中所述個體部分或完全失明。
10.權利要求7的方法，其中所述生物樣品選自於由血液、血清、血漿、腦脊髓液、腦組織活檢和脊髓組織活檢組成的組。
11.一種製品，其包括NMO抗原性多肽和應用所述NMO抗原性多肽以檢測個體中抗NMO抗原自體抗體的用法說明，其中所述NMO抗原性多肽是水通道蛋白4。
12.權利要求11的製品，其中所述的製品用於在所述個體中診斷NMO。
13.權利要求11的製品，進一步包括對NMO抗原性多肽具有特異性結合親和力的單克隆抗體。
14.一種治療患有NMO的個體的方法，所述方法包括從個體中抽取體液，其中的體液包含一種或多種與水通道蛋白4結合的自體抗體；從體液中去除主要部分的自體抗體；和將所述體液輸回受測試者。
15.一種治療患有NMO的個體的方法，所述方法包括給所述個體施用NMO抗原性多肽，其中所述NMO抗原性多肽是水通道蛋白4。
16.權利要求15的方法，其中所述施用是通過選自於由下列方法組成的組的方法口服、靜脈注射、和經腸胃外。
17.一種治療患有NMO的個體的方法，所述方法包括給所述個體施用一種編碼NMO抗原性多肽的核酸，其中所述NMO抗原性多肽是水通道蛋白4。
全文摘要
本發明提供用於診斷和治療視神經脊髓炎及相關疾病的方法和材料。
文檔編號C07K16/28GK1910456SQ200480040851
公開日2007年2月7日 申請日期2004年11月24日 優先權日2003年11月25日
發明者V·A·列農, T·J·克裡澤爾 申請人:馬約醫學教育與研究基金會