快速無損傷性檢測肝腫瘤標誌物的方法以及採用的試紙條的製作方法
2023-11-05 05:48:22
專利名稱：快速無損傷性檢測肝腫瘤標誌物的方法以及採用的試紙條的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測肝腫瘤標誌物的方法及其採用的檢測工具。
背景技術：
原發性肝癌，尤其是肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)長時間居於世界最重要的癌症之一。其患病率在我國呈逐年上升趨勢，該病手術切除率低，5年生存率不到5%，現居我國癌症死因的第2位。肝癌通常進展緩慢，在早期階段無症狀。目前，結合血清甲胎蛋白(AFP)檢測和肝臟的超聲檢查是監測和篩查肝癌的標準方法。然而，這些方法的敏感性和特異性有限。許多研究表明，AFP檢測的敏感性較低(僅5(Γ60%)且其診斷準確性不能令人滿意。而肝臟的超聲檢測則對操作者依賴較高且當腫瘤直徑小於2cm時假陰性率較聞。蛋白質糖基化是一種重要的翻譯後修飾，在許多細胞過程如蛋白構象、摺疊、轉運與穩定中都起著重要作用。與此同時，細胞生長、分化，細胞-細胞間信號傳遞、免疫應答，病原微生物的發病機制及許多其他生物學過程也受糖基化的影響。更重要的是，現有研究已確定，在多種疾病中糖蛋白的糖基化發生了異常改變，可作為疾病診斷及預後的生物標誌物。高爾基體蛋白73 (Golgi Protein73，GP73)是存在於高爾基體主要在上皮細胞表達的一種跨膜蛋白。在正常肝臟中，GP73主要由膽管上皮細胞表達，在肝細胞中很少表達或幾乎不表達。但是，在病毒性和非病毒性肝病中，GP73的表達劇烈上調。一項近期的研究在人類血清中檢測到了 GP73，並且在肝癌土撥鼠模型中發現GP73表達量在肝癌土撥鼠模型的血清和組織中均上調。Marreo等的研究表明GP73可用於肝癌早期診斷的參考，且其診斷敏感性高於AFP，此研究包括352個樣本與肝硬化患者相比，肝癌患者的血清GP73水平顯著上升，若以10個相對單位為臨界值，則GP73在肝癌診斷中的特異性為75%，敏感性為69%。此外，作為早期肝癌的診斷參考，GP73的效果優於AFP。因此，GP73是對肝癌診斷非常有價值的生物標誌物，GP73聯合AFP檢測可提高肝癌的早期診斷率。癌胚抗原相關細胞粘附因8 (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesionmolecule8, CEA)是一種具有人類胚胎抗原特異性決定簇的富含多糖的酸性糖蛋白，1965年首次在正常胎兒消化道及結腸癌組織中被發現，屬於非器官特異性腫瘤相關抗原。現有研究顯示，CEA是一種廣泛的人類腫瘤相關抗原。在結腸癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、子宮癌等患者血清中，CEA濃度呈現不同程度的升高，這可能是因為分泌CEA的腫瘤多數位於空腔臟器(如胃腸道，呼吸道，泌尿道等)而正常情況下CEA直接經胃腸道得到代謝，只有在腫瘤狀態時CEA通過血液和淋巴循環使得血清CEA濃度上升。CEA是目前最常用的腫瘤標誌物之一，對於B超，CT等影像學方法難以診斷的惡性腫瘤，測定血清CEA濃度發揮了其潛在的優勢。CEA的閾值因不同方法而略有不同，但其含量無明顯性別差異，僅隨年齡增大略有升高。據報導，聯合使用AFP和CEA作為腫瘤標誌物進行血清濃度檢測有利於肝癌的早期診斷，也可用於原發性肝癌的鑑別。
然而，雖然血液中的一些因子能夠隨體液循環到達唾液腺，或隨唾液分泌進入口腔或導致唾液中的基因轉錄譜發生改變，引起某些蛋白質的豐度或種類改變，從而反映出血液中部分蛋白質水平的變化。但目前研究發現，人唾液中有1939種蛋白質，人血漿中有3020種蛋白質，僅有27%的唾液蛋白質組與血漿蛋白質組重合。血漿蛋白質組學發現的177個與心血管疾病相關的潛在生物標誌物的蛋白質中，也僅有40%的蛋白質出現在唾液蛋白質組中；在已列出的1058個潛在癌症相關生物標誌物的蛋白質中，僅有34%的蛋白質出現在唾液蛋白質組中。這表明許多血液循環中的生物標誌物並非能夠在唾液中得到鑑定。另外，即使是同一的蛋白，較之於血清，其在唾液中的含量通常明顯較低。因此在實踐中，兩者沒有必然的聯繫，往往需要研究人員經過大量的實驗和分析，並做針對性的檢測環節的調整改變，才能判斷是否有蛋白質組重合的可能性。綜上所述，可以預期，若採用檢測血清樣本中生物標誌物的方法，則取樣不便、檢
測過程複雜、存在感染一些疾病的風險。
發明內容
本發明提供一種快速無損傷性檢測肝腫瘤標誌物的方法，並設計了針對唾液樣本的免疫層析試紙條，從而真正實現無創，安全簡便地檢測肝腫瘤標誌物。本發明的試紙條的基本技術方案如下針對唾液樣本檢測肝腫瘤標誌物的免疫層析試紙條，包括沿層析方向依次設置的樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、以及用於吸收檢測樣品中多餘液體的吸水墊，樣品墊上粘附標有指示線的膠帶；其特殊之處在於所述金標墊是吸附有膠體金標記的單克隆抗體GP73-1的玻璃纖維；硝酸纖維素膜上依次標識有檢測帶Tl和質控線C ;其中，所述檢測帶Tl固化有單克隆抗體GP73-2，質控線C固化有兔抗鼠多克隆抗體Ig。基於以上基本技術方案，還可以對該試紙條進行以下優化改進作為金標墊的玻璃纖維，還吸附有膠體金標記的CEA-I ;在檢測帶Tl與質控線C之間還標識有檢測帶T2，檢測帶T2固化有單克隆抗體CEA-2。檢測帶Tl、檢測帶T2、質控線C依次相隔2毫米、4毫米。以質量計，膠體金標記的單克隆抗體CEA-I在金標墊上的含量與膠體金標記的單克隆抗體GP73-1的含量相同，固化於檢測帶Tl上的單克隆抗體GP73-2與固化於檢測帶T2上的單克隆抗體CEA-2的含量相同。對於上述基本形式和改進形式(檢測區增加了檢測帶T2)的試紙條，膠體金標記的單克隆抗體在金標墊上的含量均可以按照以下方式優化限定所述金標墊是將玻璃纖維充分浸泡於濃度為4 10倍濃縮度的膠體金標記單克隆抗體溶液所得；所述濃縮度的倍數按照以下方式確定120 μ g的單克隆抗體與膠體金溶液反應((對於GP73-1和CEA-I兩種共同作用的情況，可以各取60 μ g與膠體金溶液反應))，最終得到的膠體金標記的單克隆抗體溶於ImL的PBS溶液(PBS溶液的較佳選擇0. 01mol/L pH8. 0，並含O. 2%BSA)中，設其為10倍濃縮度的膠體金標記單克隆抗體溶液，較低濃縮度的膠體金標記單克隆抗體溶液是採用相同的PBS按照體積比對其稀釋得到；
固化於檢測帶上的單克隆抗體含量按照以下方式限定單克隆抗體用O. 01mol/LpH7. 2的PBS稀釋至濃度為I 4mg/mL，在硝酸纖維素膜上劃線形成檢測帶。上述金標墊最好是將玻璃纖維充分浸泡於濃度為5倍濃縮度的膠體金標記單克隆抗體溶液所得；單克隆抗體最好用O. 01mol/L pH7. 2的PBS稀釋至濃度為2mg/mL，在硝酸纖維素膜上劃線形成檢測帶。以上關於對膠體金標記的單克隆抗體在金標墊上的含量和固化於檢測帶上的單克隆抗體含量的限定，本申請採用了本領域慣常的描述方式，較之於其他限定方式，這種限定對於本領域技術人員(包括試紙條的使用者)不僅是清楚的，而且在明確該試紙條的成分和效果方面更有意義。製備上述一種免疫層析試紙條的方法，包括以下環節(I)膠體金製備採用氯金酸溶液製備得到膠體金溶液；(2)膠體金標記將膠體金溶液的pH值調節至8. 0，加入單克隆抗體GP73-1和CEA-I各60μ g混勻，兩種單克隆抗體的總濃度為12 μ g/mL ;反應後,2000rpm離心,去沉澱,對上清液12000rpm離心，然後棄上清，沉澱溶於ImL的含O. 2%BSA的O. 01mol/L pH8. O的PBS溶液中，即為10倍濃縮度的膠體金標記單克隆抗體溶液，然後用PBS將其稀釋為5倍濃縮度的膠體金標記單克隆抗體溶液，將玻璃纖維在此膠體金標記單克隆抗體溶液中充分浸泡後取出，冷凍乾燥，得到備用的金標墊；(3)抗體包被單克隆抗體GP73-2和CEA-2分別用0. 01mol/L pH7. 2的PBS稀釋至濃度為2mg/mL各5mL ;分別依次在NC膜上劃線，使單克隆抗體固化在硝酸纖維素膜上；膜乾燥後完全浸泡於含1%BSA的0. 01mol/L pH7. 2的PBS中；然後取出硝酸纖維素膜用PBS清洗，乾燥後得到備用的硝酸纖維素膜；(4)試紙條的組裝樣品墊採用吸水玻璃纖維，吸水墊採用吸水濾紙；將樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜以及吸水墊組裝構成試紙條，並將整個試紙條貼附於PVC板中央，裁切為適用寬度；然後密封乾燥保存備用。採用上述基本形式的試紙條(檢測區設置有檢測帶Tl和質控線C)，實現快速無損傷性檢測肝腫瘤標誌物的方法，是取唾液樣本，將該免疫層析試紙條的樣品墊一端插入唾液樣本中，1(Γ15分鐘後唾液樣本出現在NC膜上；將試紙條取出，觀察檢測帶以及質控線顯色狀態，得到以下三種檢測結果之一(I)檢測帶Tl以及質控線C均顯現，呈紫紅色；則表明唾液樣本中含有高爾基體蛋白73 ；(2)僅質控線C顯現，呈紫紅色；則表明唾液樣本中不含高爾基體蛋白73 ；(3)無紫紅色條帶顯現；則表明試紙條失效，該檢測過程無效。採用上述改進形式的試紙條(檢測區設置有檢測帶Tl、檢測帶Τ2和質控線C)，實現快速無損傷性檢測肝腫瘤標誌物的方法，是取唾液樣本，將該免疫層析試紙條的樣品墊一端插入唾液樣本中，1(Γ15分鐘後唾液樣本出現在NC膜上；將試紙條取出，觀察檢測帶以及質控線顯色狀態，得到以下四種檢測結果之一(I)檢測帶Tl和檢測帶T2以及質控線C均顯現，呈紫紅色；則表明唾液樣本中含有聞爾基體蛋白73和癌胚抗原相關細胞粘附因子8 ；(2)檢測帶T2以及質控線C均顯現，呈紫紅色；則表明唾液樣本中含有癌胚抗原相關細胞粘附因子8;(3)僅質控線C顯現，呈紫紅色；則表明唾液樣本中不含高爾基體蛋白73和癌胚抗原相關細胞粘附因子8;(4)無紫紅色條帶顯現或者檢測帶Tl顯現而檢測帶T2不顯現；則該次檢測無效。本發明具有以下優點本發明通過取唾液樣本作為檢測對象，具有科學性和可行性，並具有非損傷性檢測的優勢。較之於血清樣本以及其他可能的體液樣本(如腦脊液、尿液等)，本發明更易於採集樣本，無創，檢測準確(實際上更準確)、安全簡便、成本低且易於保存。檢測GP73得出的定性結論即可作為早期診斷的參考。
圖I為針對唾液樣本檢測肝腫瘤標誌物的免疫層析試紙條的結構示意圖。
具體實施例方式唾液檢測的難度在於首先唾液中98%以上的組分都是水，蛋白質和鹽類及一些酶組分僅佔非常小的比例。因此對於唾液中蛋白質組尤其是糖蛋白質組的鑑定存在較大困難。其次，可用於檢測的生物標誌物蛋白往往屬於低豐度蛋白，即便在血漿中也存在一定鑑定難度。而利用唾液進行檢測進一步增加了該鑑定的難度。往往需要研究人員經過大量的實驗和分析，並做針對性的檢測環節的調整改變才能得到有效的鑑定結果。本發明通過進行以下檢測肝腫瘤標誌物的實驗方法(其中的濃縮換液、酶解和除鹽、富集唾液N-糖肽的環節尤其進行了針對性的設計)，也證實了相應的唾液樣本中存在肝腫瘤標誌物高爾基體蛋白73 (GP73)，另外，發現還存在癌胚抗原相關細胞粘附因子8(CEA)。( I)處理唾液樣本將採集到的唾液樣本在4°C條件下的離心12000rpmlh,收集上清並使用O. 45 μ m針頭式濾器進行過濾；向過濾後的唾液樣本中加入蛋白酶抑制劑(每IOmL加入IyL蛋白酶抑制劑)，使用BCA試劑盒進行蛋白定量，計算唾液樣本中的蛋白含量，並將唾液樣本儲存於-80°C冰箱備用。( 2 )唾液蛋白的濃縮換液取包含O. 5mg蛋白的唾液樣本，通過Amicon Ultra-lOK離心超濾器進行濃縮，採用變性緩衝液稀釋唾液樣品至蛋白終濃度4g/L得到唾液蛋白溶液；所述變性緩衝液的pH=8. 38，含有8M尿素或者O. 4M NH4HCO3或者O. 1% (體積分數)SDS。(3)唾液蛋白的Trypsin酶解和除鹽取O. 5mg唾液蛋白溶液，加入3. 125 μ L_DTT溶液(200mM，用O. IM NH4HCO3溶液配製)，於60°C孵育60min ;然後加入12. 5 μ L碘乙醯胺溶液(200mM，用O. IM NH4HCO3溶液配製)，20°C孵育60min並避光；再次加入3. 125 μ LDTT溶液(200mM，使用O. IM NH4HCO3溶液配製)，60°C孵育60min，去除未反應的碘乙醯胺；採用O. IM NH4HCO3溶液稀釋唾液蛋白溶液至尿素濃度小於2M，留存I μ g的蛋白用於SDS-PAGE的檢測；以50mM鹽酸溶液活化Trypsin，取10 μ g活化的Trypsin與蛋白樣本進行反應，37°C輕搖過夜；最後12，OOOg離心IOmin除掉未被消化的物質；用TFA調節酶解後多肽溶液pH至小於3 ;使用S印-Paklcc C18柱對多肽混合物進行除鹽。DTT即二硫蘇糖醇，該步驟中分步加入的二硫蘇糖醇碘乙醯胺二硫蘇糖醇=1:2:1 (摩爾比)。(4)富集唾液N-糖肽對經過酶解和除鹽後的樣品進行高碘酸氧化處理，再進行除鹽處理，即每個樣品中加入22. 5 μ LIOOmM高碘酸鈉儲液，在避光條件下於4 °C反應60min ;然後加入
I.8ml0. 1%TFA溶液稀釋乙腈濃度並調節pH ;使用S印_PakC18柱去除未反應的NaI04，最終經O. 2mL80%ACN/0. 1%TFA洗脫兩次，獲得樣品溶液；採用以下兩種方法之一進行富集唾液N-糖肽(4. I)醯肼化學方法富集唾液N-糖肽每Img樣品溶液使用50 μ L50%的醯肼樹脂懸液。首先將樹脂於3000rpm離心30s除去溶液；然後用去離子水清洗樹脂2 3次，每次lmL，完成樹脂的預處理。接著將氧化後的多肽樣品溶液與醯肼樹脂混合，室溫輕搖反應4h或過夜，使糖肽與樹脂偶聯得到富集。最後用50%ACN/0. 1%TFA, I. 5M NaCl,水和O. IM NH4HCO3溶液各清洗樹脂3次，共清洗12次以去除非共價粘附於樹脂的非糖肽，而糖肽在醯肼樹脂表面得到特異性富集；以50 μ L25mM NH4HCO3緩衝溶液重懸醯肼樹脂，加入3 μ L500U/ μ L的PNGase F(每I毫克樣品使用50 μ L50%的醯肼樹脂懸液，6 μ LPNGase F)，37°C輕搖過夜。3000rpm離心收集上清，然後用100 μ L超純水清洗樹脂兩次,合併清洗液和上清,使用Speed Vac凍幹，然後用20 μ L0. 1%甲酸溶液重溶樣品，_20°C保存或直接進行LC-MS/MS分析；或者(4. 2)親水親和方法富集唾液N-糖肽每Img樣品溶液使用150 μ L50%的凝膠粒子(Sepharose CL-4B樹脂)。首先將凝膠粒子8000rpm離心5min，去除溶液；然後分別用ImL的去離子水和平衡液(正丁醇乙醇水=5:1:1)各清洗樹脂2遍，完成樹脂預處理。將除鹽後多肽凍幹，以平衡液重新溶解多肽，將其與S^harose CL-4B粒子混合，室溫下輕搖反應I. 5h，使糖肽偶聯於樹脂上；使用平衡液清洗凝膠粒子3次，IOmin/次。最後用200 μ L洗脫液(乙醇水=1 1)洗脫兩次，每次30min。合併洗脫液,使用Speed Vac凍幹，用PNGase F進行酶解，再次凍幹；然後用20 μ L0. 1%甲酸溶液重溶後，_20°C保存或直接進行下一步的LC-MS/MS分析。(6) LC-MS/MS 鑑定每次取8 μ I樣品進行LC-MS/MS分析。對於步驟(5)的兩種富集唾液N-糖肽的方式，也可以綜合兩種方式得到的樣品進行LC-MS/MS分析，從而更加準確。本實驗中使用安捷倫Q-TOF質譜儀(Agilent6530)進行LC-MS/MS分析。(7)資料庫檢索和糖基化位點分析經LC-MS/MS分析得到的LC-MS/MS質譜數據通過Mascot V2. 3. 02軟體在IPI_human_v3. 74資料庫中進行檢索，從而檢測出唾液樣本中是否含有高爾基體蛋白73。多肽鑑定結果篩選標準單個多肽得分高於25，P值小於O. 01。將每個去糖基化樣品的三次LC-MS/MS結果合併為該次鑑定的總糖肽，三次重複糖肽富集試驗中鑑定到2次以上的多肽可認為是該組樣本(肝癌/正常)中鑑定到得多肽。為降低假陽性率，僅將鑑定到含有(N-X-S/T)保守序列且其天冬醯胺(N)轉變為天冬氨酸(D)的多肽認定為N-糖肽，脫氨基的天冬醯胺為N-糖基化位點。對於以上實驗過程，我們按照對比實驗的一般操作規程進行全唾液的採集樣本選取樣本分為肝癌患者和健康志願者兩組。由於肝癌患者中老年人居多，故選取老年健康志願者作為對照組。唾液樣本共採自58名志願者，經放射免疫分析法確診的肝癌患者共27人，從西安市某醫院肝癌患者中隨機抽取；老年健康志願者31人，從西安市某敬老院健康老人中隨機抽取。唾液採集所有唾液均在非刺激狀態下採集。志願者在早飯至少2小時以後，首先用生理鹽水漱口，然後以舌抵上顎，使唾液自然分泌並收集於滅菌後的離心管中。每位志願者至少採集2mL唾液，採集後的唾液立即置於冰上保存，並將同組(肝癌或健康)樣本的唾液進行等體積混合，以降低個體差異對實驗的影響；並且在2小時內，將收集到的唾液進行步驟(I)的初步處理。檢測結果統計如下表I所示。表I
權利要求
1.針對唾液樣本檢測肝腫瘤標誌物的免疫層析試紙條，包括沿層析方向依次設置的樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、以及用於吸收檢測樣品中多餘液體的吸水墊，樣品墊上粘附標有指示線的膠帶；其特徵在於 所述金標墊是吸附有膠體金標記的單克隆抗體GP73-1的玻璃纖維；硝酸纖維素膜上依次標識有檢測帶Tl和質控線C ;其中，所述檢測帶Tl固化有單克隆抗體GP73-2，質控線C固化有兔抗鼠多克隆抗體Ig。
2.根據權利要求I所述的免疫層析試紙條，其特徵在於作為金標墊的玻璃纖維，還吸附有膠體金標記的CEA-I ;在檢測帶Tl與質控線C之間還標識有檢測帶T2，檢測帶T2固化有單克隆抗體CEA-2。
3.根據權利要求2所述的免疫層析試紙條，其特徵在於檢測帶Tl、檢測帶T2、質控線C依次相隔2暈米、4暈米。
4.根據權利要求3所述的免疫層析試紙條，其特徵在於以質量計，膠體金標記的單克隆抗體CEA-I在金標墊上的含量與膠體金標記的單克隆抗體GP73-1的含量相同，固化於檢測帶Tl上的單克隆抗體GP73-2與固化於檢測帶T2上的單克隆抗體CEA-2的含量相同。
5.根據權利要求I或2所述的免疫層析試紙條，其特徵在於 膠體金標記的單克隆抗體在金標墊上的含量按照以下方式限定所述金標墊是將玻璃纖維充分浸泡於濃度為4 10倍濃縮度的膠體金標記單克隆抗體溶液所得； 所述濃縮度的倍數按照以下方式確定120ii g的單克隆抗體與膠體金溶液反應，最終得到的膠體金標記的單克隆抗體溶於ImL的PBS溶液中，設其為10倍濃縮度的膠體金標記單克隆抗體溶液，較低濃縮度的膠體金標記單克隆抗體溶液是採用相同的PBS按照體積比對其稀釋得到； 固化於檢測帶上的單克隆抗體含量按照以下方式限定單克隆抗體用O.Olmol/LPH7. 2的PBS稀釋至濃度為I 4mg/mL，在硝酸纖維素膜上劃線形成檢測帶。
6.根據權利要求5所述的免疫層析試紙條，其特徵在於所述金標墊是將玻璃纖維充分浸泡於濃度為5倍濃縮度的膠體金標記單克隆抗體溶液所得；單克隆抗體用0. 01mol/LPH7. 2的PBS稀釋至濃度為2mg/mL，在硝酸纖維素膜上劃線形成檢測帶。
7.製備如權利要求6所述免疫層析試紙條的方法，包括以下環節 (1)膠體金製備 採用氯金酸溶液製備得到膠體金溶液； (2)膠體金標記 將膠體金溶液的PH值調節至8. 0，加入單克隆抗體GP73-1和CEA-I各60 y g混勻，兩種單克隆抗體的總濃度為12 ii g/mL ;反應後，2000rpm離心,去沉澱,對上清液12000rpm離心，然後棄上清，沉澱溶於ImL的含0. 2%BSA的0. 01mol/L pH8. 0的PBS溶液中，即為10倍濃縮度的膠體金標記單克隆抗體溶液，然後用PBS將其稀釋為5倍濃縮度的膠體金標記單克隆抗體溶液，將玻璃纖維在此膠體金標記單克隆抗體溶液中充分浸泡後取出，冷凍乾燥，得到備用的金標墊； (3)抗體包被 單克隆抗體GP73-2和CEA-2分別用0. 01mol/L pH7. 2的PBS稀釋至濃度為2mg/mL各5mL ;分別依次在NC膜上劃線，使單克隆抗體固化在硝酸纖維素膜上；膜乾燥後完全浸泡於含1%BSA的0. 01mol/L pH7. 2的PBS中；然後取出硝酸纖維素膜用PBS清洗，乾燥後得到備用的硝酸纖維素膜； (4)試紙條的組裝 樣品墊採用吸水玻璃纖維，吸水墊採用吸水濾紙；將樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜以及吸水墊組裝構成試紙條，並將整個試紙條貼附於PVC板中央，裁切為適用寬度；然後密封乾燥保存備用。
8.快速無損傷性檢測肝腫瘤標誌物的方法，是取唾液樣本，將權利要求I所述的免疫層析試紙條的樣品墊一端插入唾液樣本中，1(T15分鐘後唾液樣本出現在NC膜上；將試紙條取出，觀察檢測帶以及質控線顯色狀態，得到以下三種檢測結果之一 (1)檢測帶Tl以及質控線C均顯現，呈紫紅色；則表明唾液樣本中含有高爾基體蛋白73 ； (2)僅質控線C顯現，呈紫紅色；則表明唾液樣本中不含高爾基體蛋白73； (3)無紫紅色條帶顯現；則表明試紙條失效，該檢測過程無效。
9.快速無損傷性檢測肝腫瘤標誌物的方法，是取唾液樣本，將權利要求2所述的免疫層析試紙條的樣品墊一端插入唾液樣本中，1(T15分鐘後唾液樣本出現在NC膜上；將試紙條取出，觀察檢測帶以及質控線顯色狀態，得到以下四種檢測結果之一 (1)檢測帶Tl和檢測帶T2以及質控線C均顯現，呈紫紅色；則表明唾液樣本中含有高爾基體蛋白73和癌胚抗原相關細胞粘附因子8 ； (2)檢測帶T2以及質控線C均顯現，呈紫紅色；則表明唾液樣本中含有癌胚抗原相關細胞粘附因子8; (3)僅質控線C顯現，呈紫紅色；則表明唾液樣本中不含高爾基體蛋白73和癌胚抗原相關細胞粘附因子8; (4)無紫紅色條帶顯現或者檢測帶Tl顯現而檢測帶T2不顯現；則該次檢測無效。
全文摘要
本發明提供了一種快速無損傷性檢測肝腫瘤標誌物的方法以及採用的試紙條。採用的試紙條的金標墊是吸附有膠體金標記的單克隆抗體GP73-1的玻璃纖維；硝酸纖維素膜上依次標識有檢測帶T1和質控線C；其中，所述檢測帶T1固化有單克隆抗體GP73-2，質控線C固化有兔抗鼠多克隆抗體Ig。檢測方法為取唾液樣本，將該免疫層析試紙條的樣品墊一端插入唾液樣本中，10~15分鐘後唾液樣本出現在NC膜上；將試紙條取出，觀察檢測帶以及質控線顯色狀態，即得到檢測結果。本發明通過取唾液樣本作為檢測對象，較之於血清樣本以及其他可能的體液樣本，本發明更易於採集樣本，無創，檢測準確、安全簡便、成本低且易於保存。
文檔編號G01N33/577GK102854324SQ201210294440
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月17日 優先權日2012年8月17日
發明者李錚, 趙菲, 王秦哲, 於漢傑, 張華 , 孫士生 申請人:西北大學