鑑別對治療自身免疫疾病有效的化合物的方法

2023-12-03 20:20:06

專利名稱：：鑑別對治療自身免疫疾病有效的化合物的方法
背景技術：
：本發明與自身免疫疾病有關。主要組織相容性(MHC)II類分子表達於抗原遞呈細胞和B淋巴細胞表面。通過結合抗原並遞呈抗原給T細胞，MHCII類分子參與了免疫應答的啟動。於是，MHCII類分子表達的水平影響免疫應答的誘導。編碼MHCII類抗原α-和β-多肽的基因定位於染色體的HLA-D(組織相容性白細胞抗原-D)區域。II類基因的同型抗原包括HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP。這些基因中，存在基本的等位基因多態性；例如，HLA-DR的等位基因包括DR1、DR2、DR3和DR4。此外，存在這些等位基因的亞型；例如，DR4的亞型包括DW4、DW10、DW13、DW14和DW15。幾種自身免疫疾病與MHCII類基因特殊等位基因的表達相關。大約93％感染類風溼關節炎的病人表達HLA-DR1、HLA-DR4或二者均有表達(McDermott等，風溼疾病通報(BulletinontheReumaticDiseases)，381-10；見表1)。續表一其它自身免疫疾病也與特殊等位基因的表達相關。例如，Felty氏綜合症、Sjogren氏綜合症，系統紅斑狼瘡以及對金和青黴胺毒性的發作都與各種HLA-DR等位基因有關(McDermott等，風溼疾病通報(BulletinontheReumaticDiseases)，381-10；見表2作為另外一個例子，特殊的青少年類風溼關節炎與HLA-DPB2.1相關(Begovich等，1989，PNAS869489-9493)。大約70％患有胰島素依賴糖尿病的病人表達HLA-DQ3.2B、DQA1或DQB1，而且自身免疫皮膚病尋常天庖瘡與HLA-DQB1.3的表達相關(Scharf等，1989，PNAS866215-6219)。MHCII類基因的激活依賴於激活子CIITA(Steimle等，1993，細胞75135-146)。發明概述已經發現缺乏蛋白的其餘部分並且有其它完整的轉錄系統存在時，CIITA的一部分足以用來激活轉錄。這一結構域被稱為CIITA轉錄激活結構域，而且我們已經揭示出它對抑制CIITA依賴轉錄的化合物的鑑別能提供有用的信息。這些化合物因其抑制MHCII類基因轉錄的能力而成為潛在的自身免疫疾病治療藥物。我們還發現缺乏蛋白的其餘部分並且有其它完整的轉錄系統存在時，CIITA的第二部分足以用來介導細胞轉錄器中CIITA和其靶蛋白的相互作用而且激活所有的MHCII類啟動子。我們稱這一結構域為CIITA相互作用結構域，而且抑制這一結構域與其靶蛋白結合的化合物能夠抑制CIITA依賴的轉錄從而是潛在的自身免疫疾病治療藥物。同時發現CIITA的一種突變子(在此稱為克隆13CIITA)激活MHCII類基因一種亞類的轉錄。稱該突變子為同型特異突變子；同型特異CIITA蛋白的轉錄激活和相互作用結構域在鑑別轉錄的同型特異抑制劑的化合物中也是有用的。因此，本發明的特色在於其方法用CIITA激活結構域或相互作用結構域確定化合物是否是潛在自身免疫治療藥物。用以下說明的轉錄測定技術可形成有功能的CIITA激活結構域或有功能CIITA相互作用結構域的存在或缺失。某一方法中，測定化合物抑制報告基因轉錄的能力，轉錄的抑制指示該化合物為潛在的自身免疫疾病治療藥物。用另一種方法測定化合物抑制CIITA相互作用結構域與靶蛋白結合的能力，抑制結合指示該化合物為潛在的自身免疫疾病治療藥物。在又一種方法中，CIITA轉錄激活結構域缺失而另外一種蛋白的轉錄激活結構域存在時測定了CIITA介導轉錄的能力。抑制相互作用功能的化合物為潛在的自身免疫疾病治療藥物。在待試化合物存在時通過測定野生型CIITA相互作用構域介導轉錄的能力和監測每一同型抗原的表達，這種方法可用於鑑別同型特異性轉錄抑制劑的化合物。存在同型特異性轉錄抑制劑時，野生型CIITA相互作用結構域只介導MHCII類基因一種亞類的轉錄。此外本發明的特色方法即用同型特異性CIITA相互作用結構域和轉錄激活結構域鑑別同型特異性轉錄抑制劑的化合物。這些方法中，測定了化合物對野生型和同型特異CIITA相互作用和轉錄激活結構哉介導的轉錄的不同影響能力，這樣的同型特異抑制劑對選擇性影響免疫系統有效。轉錄抑制可在體內、體外或細胞基礎上分析。現有技術中有很多技術用以測定轉錄激活結構域的活力(例如，見Keegan等，1986，科學23699；Ma等，1987，細胞48847Lin等，1988，細胞54659；Sadowski等，1988，自然335563；Robert等，1993，自然363741和Ma等，1988，細胞55443)。這些以及其它轉錄分析可以鑑別抑制CIITA轉錄激活的化合物為目的進行改進這可通過用新鑑別出的轉錄激活結構域代替以前描述過的分析中所用的轉錄激活結構域來完成。給轉錄反應中加入化合物並確定化合物是否抑制轉錄，從而鑑別抑制CIITA轉錄激活的化合物。這些化合物為潛在的自身免疫疾病治療藥物。在優選的實施方案中，潛在的自身免疫疾病治療藥物通過如下方法鑑別a)提供一種融合蛋白，該蛋白包含與DNA結合蛋白(如，LexA的DNA結合/二聚化結構域或GAL4的DNA結合結構域)融合的CIITA轉錄激活結構域(不含有功能的CIITA相互作用結構域)；b)在一種轉錄系統(例如，體外或原核和真核細胞內如細菌細胞、酵母細胞、植物細胞或哺乳動物細胞)中提供融合蛋白，此轉錄系統具有與融合蛋白結合的調節序列(如，在質粒或染色體上)而且調節序列與報告基因(例如，編碼β-半乳糖苷酶、CAT、GUS、蟲螢光素酶、人生長激素或鹼性磷酸酶)可操作地相連；c)測定報告基因轉錄的水平(例如，通過標準方法測定報告基因RNA和蛋白產物的活力。舉例如下，在含X-gal的培養基裡或上培養細胞並且測定產生的藍色發色團的數量可測定lacZ基因的轉錄，)；以及d)在待試化合物存在時完成上述步驟a-c，轉錄水平的降低(相對於缺乏化合物時的水平)表明化合物抑制轉錄的CIITA激活從而是一種潛在的自身免疫疾病治療藥物。其它優選的方案中，CIITA相互作用結構域用以鑑別潛在的自身免疫疾病治療藥物。這些方法包括a)提供一種融合蛋白，該蛋白包括與一個非CIITA激活結構域融合的CIITA相互作用結構域(如，單純皰疹病毒α-誘導因子(α-TDF)的轉錄激活結構域)；b)提供一種CIITA相互作用的靶蛋白(如，人B細胞的CIITA相互作用靶蛋白)；c)在一種轉錄系統中提供融合蛋白和靶蛋白(如，體外或原核和真核細胞內如細菌細胞、酵母細胞、植物細胞或哺乳動物細胞比如人B細胞(例如，克隆13、Raji或RM3細胞))，轉錄系統中具有含MHCII類啟動子序列的調節序列(如，在質粒或染色體上)而且調節序列與報告基因(例如，MHCII類基因、編碼β-半乳糖苷酶、CAT、GUS、蟲螢光素酶、人生長激素或鹼性磷酸酶)可操作地地相連的DNA；以及d)測定報告基因轉錄的水平(例如，通過標準方法測定報告基因RNA和蛋白產物的活力。舉例如下，在人B細胞中用FACS分析細胞表面MHCII類分子表達的增加可測定MHCII類基因的轉錄)；以及e)完成步驟a-d，在被測試化合物存在時轉錄水平的降低(相對於缺乏化合物時的水平)表明化合物抑制CIITA相互作用結構域介導轉錄的能力從而是一種潛在的自身免疫疾病治療藥物。同型特異轉錄抑制劑化合物可通過其差異抑制MHCII類基因表達能力的特徵得以鑑別。例如，野生型CIITA相互作用結構域克隆13細胞的表達恢復了HLA-DR、-DQ和-DP同型抗原的轉錄。不以同型特異方式抑制轉錄的化合物會阻滯三個基因表達的恢復。相反，同型轉錄抑制劑只會干擾這些基因的亞類的表達恢復。另外的優選方案中，作為潛在自身免疫疾病治療藥物的化合物的鑑別如下a)提供的第一個融合蛋白包括與一個DNA結合蛋白(如，LexA的DNA結合/二聚化結構域或GAL4的DNA激活結構域)融合的CIITA相互作用結構域(不含有功能的CIITA相互作用結構域)；b)在一種轉錄系統(例如，體外或原核和真核細胞內如細菌細胞、酵母細胞、植物細胞或哺乳動物細胞)中提供融合蛋白，轉錄系統具有與第一個融合蛋白結合的調節序列(如，在質粒或染色體上)而且調節序列與報告基因(例如，編碼β-半乳糖苷酶、CAT、GUS、螢光素酶、人生長激素或鹼性磷酸酶)可操作地相連的DNA；c)提供第二個融合蛋白，其特徵在於它包含了一種與在此定義過的CIITA相互作用靶蛋白融合的轉錄激活結構域(如，B42的轉錄激活結構域)；d)測定報告基因轉錄的水平(例如，通過標準方法測定報告基因RNA和蛋白產物的水平和活力。舉例如下，在含X-gal的培養基裡培養細胞並且測定產生的藍色發色團的數量可測定lacZ基因的轉錄，)；以及e)在待試化合物存在時完成步驟a-d，轉錄水平的降低(相對於缺乏化合物時的水平)表明化合物能抑制CIITA相互作用結構域與靶蛋白結合力從而是一種潛在的自身免疫疾病治療藥物。抑制結合的化合物可通過很多方法發生作用，其中包括空間幹擾結合或改變CIITA或靶蛋白的結構。儘管該化合物完全破壞轉錄的精確機理尚未明了。然而該化合物卻是一種有價值的藥物。另外一些測定蛋白質-蛋白質相互作用的方法也可用來鑑別抑制CIITA相互作用結構域與靶蛋白結合的化合物。應用標準的分子生物學技術，本領結構域的技術人員可使用ELISA、Southwestern雜交、濾紙或膜結合的蛋白或固定化蛋白來鑑別抑制CIITA相互作用結構域與其靶蛋白結合的化合物。本發明還包括一種基本純化的多肽，後者包括一個不具功能性CIITA相互作用結構域的CIITA轉錄激活結構域。優選地，該多肽包括一種與圖1中所示序列26-352的一個多於50個胺基酸序列基本相同的多於50個胺基酸的序列。相關的工作中，本發明記述了基本純化的編碼CIITA轉錄激活結構域而不編碼有功能的CIITA相互作用結構域的DNA(如，基因組DNA，cDNA或合成DNA)。本發明進一步記述了一種基本純化的多肽，它包括一種CIITA相互作用結構域而不包括一種有功能的CIITA轉錄激活結構域。優選地，該多肽包括與圖1所示序列301-1130胺基酸的多於50個胺基酸的序列基本相同的一個多於50個胺基酸的序列。相關的工作中，本發明記述了基本純化的編碼CIITA相互作用結構域而不編碼有功能的CIITA轉錄激活結構域的DNA(如，基因組DNA，cDNA或合成DNA)。此外，本發明記述了一種基本純化的多肽，它包括克隆13細胞系(細胞系的描述，參看Ono等，1991，J.Exp.Med.(實驗醫學雜誌)173629-637)CIITA多肽的相互作用結構域。克隆13CIITA激活MHCII類DQ基因的轉錄而不激活MHCII類DR和DP基因的轉錄。優選地，該多肽包括與圖1所示序列301-1077胺基酸的多於50個胺基酸序列基本相同的一種多於50個胺基酸的序列，但是缺失了圖1所示序列1-300和1078-1130的胺基酸。相關的工作中，本發明包括一種基本純化的編碼克隆13CIITA的DNA(如，基因組DNA，cDNA或合成DNA)。本發明還包括其它同型特異CIITA突變子，而且進一步描述的方法中使用CIITA同型特異突變子的激活和相互作用結構域來確定化合物是否為轉錄的同型特異抑制劑。同型特異抑制劑的化合物也是潛在的自身免疫疾病治療藥物。當這種化合物能夠抑制與自身免疫疾病有關的特殊基因而不影響其它MHCII類基因的表達時將會特別有用。於是，同型特異化合物作為自身免疫疾病治療藥物使用時，就可能避免引起普遍的免疫抑制。一種化合物它能通過這兒描述的一個採用同型特異性CIITA的抑制測試並與那些同野生型CIITA和CIITA突變子不同同型特異性相比較而得到的結果鑑定的，例如，抑制依賴於野生型而非克隆13CIITA轉錄的化合物在對抑制MHCII類DR和DP基因中是有效的。因為DR1和/或DR4的表達與類風溼關節炎93％的病例有關，所以特異性抑制DR基因轉錄的化合物是類風溼關節炎療法中一個有力的候選藥物。類似的，兩種CIITA的同型特異抑制劑能夠用來確定一個化合物是否是轉錄的同型特異抑制劑。例如，一種可比較的方法可用於第一個激活DR和DP轉錄的突變子，而第二個突變子只激活DP的轉錄。抑制第一個突變子活力而不抑制第二個突變子的化合物可用於選擇性抑制DR基因的表達。「II類轉錄激活基因(CIITA基因)」是指編碼轉錄激活子的基因，該基因80％或更多序列與圖1所示的CIITA序列相同(SEQIDNO1)。「CIITA轉錄激活結構域」指一種80％或更多序列與圖1所示CIITA多肽序列26-352胺基酸相同的多肽，不具有一個功能性CIITA相互作用結構域。「CIITA相互作用結構域」是指一種80％或更多序列與圖1所示CIITA多肽序列301-1130胺基酸相同的多肽，不具有功能性CIITA轉錄激活結構域。CIITA相互作用結構域一種突變子的例子是克隆13CIITA的相互作用結構域，該DNA序列至少部分特徵在於圖1所示野生型CIITA序列3211-3214核苷酸的缺失(這與以前描述過的(Steimle等，)cDNA序列3326-3329核苷酸相對應)從而產生一種相對於野生型為53個胺基酸截短的蛋白質。應該明白的是在此定義的CIITA轉錄激活結構域和相互作用結構域有51個胺基酸的重疊。然而重疊區域不足於形成一個有功能的轉錄激活或相互作用結構域。於是，含有圖1所示26-352胺基酸而缺失353-1130胺基酸序列的多肽具有有功能的轉錄激活結構域而缺失有功能的相互作用結構域。類似的，含有圖1所示301-1130胺基酸而缺失1-300胺基酸序列的多肽具有功能的相互作用結構域而缺失有功能的轉錄激活結構域。「多肽」是指任何胺基酸鏈，不用考慮長度或轉錄後修飾(例如，糖基化或磷酸化)。「可切割地相連」是指一種基因與調節序列如此相連以致在合適的分子(如，轉錄的激活子蛋白)與調節序列連接時可允許基因表達。「報告基因」指一種其表達可測試的基因；沒有限制，這類基因包括lacZ、氯黴素醯基轉移酶(CAT)、β-葡糖苷酸酶(GUS)和蟲螢光素酶基因。「基本相同」是指一種多肽或核酸表現出至少50％，優選為85％，更優選為90％而最優選為95％與參照胺基酸或核酸的同源性。對於多肽，對比序列的長度一般至少為16個胺基酸，優選至少為20個胺基酸。更優選地至少為25個胺基酸而最優選至少為35個胺基酸。對核酸，對比序列的長度一般至少為50核苷酸，優選為至少60個核苷酸，更優選為至少75個核苷酸而最優選為110個核苷酸。序列相同性典型地是用序列分析軟體測定(例如，WI53705，麥迪遜1770大學街道，威斯康星大學生物技術中心，遺傳計算研究組的序列分析軟體包)。該軟體通過各種替換、缺失、替換和其它修飾形成同源性的程度來匹配相似的序列。保守替換典型地包括在以下各組內替換甘氨酸，丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，穀氨酸，天冬氨醯，穀氨醯；絲氨酸，蘇氨酸；賴氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。「基本純化的多肽」指從天然伴隨成分中分離的多肽。典型地，多肽重量的60％不含與其天然相連的蛋白或天然存在的有機分子時該多肽基本純化。優選的製劑至少為按重量計75％、更優選為90％而最優選為99％所需的蛋白質。例如，從天然原料(如，人的細胞)中提取；表達編碼CIITA轉錄激活結構域或CIITA相互作用結構域的重組核酸；或化學合成多肽可獲得基本純化的CIITA轉錄激活結構域或CIITA相互作用結構域。純度可用合適的方法(例，柱層析、聚丙烯醯胺凝膠電泳和HPLC分析)測定。蛋白從其天然伴隨的汙染物中分離出來時基本不含天然伴隨的成分。於是，化學合成、體外合成或在不同於其天然產生細胞的細胞體系中產生的蛋白基本上不含其天然伴隨的成分。因此，基本純淨的多肽包括那些源於真核細胞但在大腸桿菌或其它原核細胞中表達的多肽。「基本純化的DNA」指不含在本發明DNA來源的有機體天然存在基因組中處於該基因側翼的基因。所以該術語包括比如，連接入載體的重組DNA、或連接入一種自我複製的質粒或病毒、或進入一種原核或真核細胞基因組DNA(如，酵母細胞)；或作為一個單獨的分子(cDNA或一個基因組或PCR或限制性酶切片段產生的cDNA片段)獨立於其它序列存在。該術語還包括作為編碼額外多肽序列雜交基因部分的重組DNA。詳述首先說明附圖。圖1為全長CIITA(見SEQIDNO1)的核酸和推測胺基酸序列。圖2是CIITA缺失突變子和用於鑑別CIITA轉錄激活或相互作用結構域的體內分析的圖解說明。轉錄分析的結果也總結於本圖。圖3是轉錄分析中用於鑑別CIITA轉錄激活或相互作用結構域的酵母細胞的照片。圖4組方圖中的數據來自比色分析，用於測定lazC基因的轉錄從而鑑別CIITA的轉錄激活結構域和相互作用結構域。圖5是質粒pCMV.ciita的圖解。圖6A-E是一系列FACS圖譜，表明α-TDF/CIITA任何蛋白在克隆13細胞和RM3中的表達恢復MHCII類基因的表達。圖7是一系列FACS圖譜，表明野生型CIITA在克隆13細胞中的表達修正了DR和DP同型表達的缺陷而且增加了DQ的表達。圖8A-F是本文描述過的質粒的圖解說明。CIITA轉錄激活結構域我們首次鑑別了CIITA的一個片段，該片段在CIITA蛋白區域部分缺失而存在另一種完整的轉錄系統時足以激活轉錄。我們稱該片段為CIITA的轉錄激活結構域。為了鑑別CIITA的這一結構域，構建一系列質粒(從載體pEG202)以產生融合蛋白，這些蛋白包含附著於大腸桿菌阻遏蛋白LexAN末端202胺基酸二聚化和DNA結合結構域的CIITA部分。構建這些質粒或本文描述過的其它質粒的方法見以下的「質粒的構建」。每一個lexA-CIITA獨立地與一種lacZ報告質粒(pSH18-34)共轉化入酵母細胞EGY48株(his3-和ura3-)。這些質粒在酵母中是由LexA-CIITA質粒中HIS3質粒的表達和pSH18-34中URA3的表達維持的。LexZ報告基因的調節序列在GAL1上遊激活序列包括8個LexA結合位點(圖2)。該實驗分析中，LexA多肽作為一種DNA結合蛋白，使CIITA多肽接近轉錄位點。缺乏LexA融合蛋白時，攜帶pSH18-34報告基因的酵母沒有從lacZ基因中產生可檢測的β-半乳糖苷酶而且在含X-gal培養基中呈現白色(圖3；pHRFM1，一個陰性對照)。此外，攜帶只表達LexAN末端202個胺基酸或一種已知沒有轉錄活性(pSH17-4)的融合蛋白的轉錄的酵母沒有產生可檢測的β-半乳糖苷酶。相反，含與CIITA轉錄激活結構域(大約N末端29％)融合的LexA多肽的酵母株誘導合成足量的β-半乳糖苷酶，宿主酵母細胞在含X-gal培養基上呈現藍色。此外，測定含融合蛋白和鄰硝基苯基-β-半乳糖苷酶培養基的光密度進行定量的比色分析(見圖4)(Ausubel等，In分子生物學動態(CurrentProtocolinMolecularBiology)，J.WileySons，1994)。我們的數據還表明包括CIITAN末端區域大約8％的多肽足以激活轉錄。CIITA的這一部分包含轉錄激活結構域的酸性部分；如果需要，用N末端29％所做的實驗可與用N末端8％所做的實驗對比。包括CIITAN末端區域大約29％的多肽至少與全長的CIITA一樣有效的激活轉錄。於是，CIITA全長的胺基酸26-352和核苷酸78-1,056表示轉錄激活結構域(這些數字涉及CIITA編碼序列，CIITAcDNA序列在核苷酸116處的起始(以下Steinle.等，))。用CIITA轉錄激活結構域鑑別自身免疫疾病治療藥物CIITA激活結構域可用以鑑別抑制CIITA依賴轉錄的化合物。因為CIITA為MHCII類基因激活所需，所以特異抑制CIITA依賴轉錄的化合物是有效的自身免疫疾病候選藥物。我們發現CIITA的一個片段(稱CIITA轉錄激活結構域)在CIITA蛋白其餘部分缺失而其它完整的轉錄系統存在時能夠激活轉錄，由此有利於鑑別抑制為CIITA激活的轉錄的化合物。有效的化合物因其抑制CIITA依賴轉錄的能力而可鑑別。因此，在任何使用CIITA激活結構域的轉錄分析系統中可測試化合物對轉錄的抑制。下面的例子可用以鑑別抑制CIITA依賴的轉錄；該實驗中鑑別出的化合物可作為自身免疫疾病候選藥物。其它的實驗分析(如，Keegan等1986科學23699；Ma等，1987細胞48847；Lin等，1988，細胞54659；Sadowski等，1988，自然335563；Robert等，1993自然363741；Maetal.，以及1998，細胞55443等所記述過的)可改進為用我們發現的CIITA轉錄激活域。CIITA轉錄激活域可簡單地克隆入合適的載體，這樣其它的轉錄分析也包含於本發明中，其適用和範圍由以下的權利要求確定。實施例1鑑別抑制CIITA轉錄激活結構域的化合物為了鑑別有效的化合物，宿主酵母株EGY48(his3-，ura3-和Leu-)用兩種質粒轉化。第一個質粒，pSH18-34攜帶GAL1TATA轉錄起始位點和與lacZ基因可切割相連的GAL1編碼序列的一個片段(Zervos等，1993，細胞72223-232和Gyuris等，1993，細胞75；791-803)。該質粒也為LexA在GAL1上遊激活序列處攜帶8個結合位點，而且它攜帶一個URA3選擇標記。第二個質粒，pEG.ciita.N29，源於質粒pEG202而且攜帶編碼CIITA轉錄激活結構域的序列。該質粒也攜帶選擇標記(HIS3)基因和LexA(胺基酸1-202)的DNA結合和二聚化結構域。對照酵母株中，第二質粒可以為pSH17-4(Gyuris等，1993，細胞75791-803)，它編碼與一個質粒激活結構域如pHRFM1或CDK2(Zervos等.，1993，細胞72223-232Gyuris等，1993，細胞75791-803)融合的LexA。雙重轉化酵母株的少量培養物與化合物混合用以在適宜的條件(如，30℃搖動過夜)下於合適的培養基(如，SGR、-his，-ura，+X-gal(80mg/L))中篩選和培養。然後測定產生的藍色發色團(例如，測定光密度或人工檢查培養基)。抑制測試質粒(pEG.ciita，N29)而不抑制對照質粒(pSH17-4)轉錄的激活的化合物可抑制MHCII類分子的表達，從而是自身免疫疾病有效的候選藥物。CIITA相互作用結構域以上的缺失分析也表明包括全長CIITA胺基酸1-26和301-1130(核苷酸1-78和903-3390)的多肽單獨不能激活轉錄(圖1、2、3)。由於該結構域在缺失轉錄激活結構域(源於CIITA或其它轉錄激活子)時不能激活轉錄，可作出結論該結構域通過結合細胞轉錄器(如，一種聚合酶或一種DNA結合蛋白)的其它成分介導轉錄。因此，CIITA胺基酸301-1130(C末端74％)稱為CIITA相互作用結構域。儘管CIITA相互作用結構域單獨不能激活轉錄，但是抑制相互作用結構域與其正常的細胞靶蛋白結合的化合物可有效的抑制CIITA的轉錄，因此也是潛在的自身免疫疾病治療藥物。CIITA相互作用結構域用於恢復MHCII類基因表達為了證實胺基酸301-1130包括了CIITA相互作用結構域，我們實驗分析了在不能表達這些基因的突變細胞系中CIITA的這一區域恢復MHCII類基因表達的能力。這些研究中，我們用質粒pCMV.ciita(圖5)構建了一個質粒pCMV.αTDF-CIITA.C70，它在CIITA相互作用結構域和單純皰疹病毒株F的α-誘導因子轉錄激活結構域之間產生一個融合蛋白。作為陰性對照，產生一個缺失CIITA轉錄激活結構域的質粒pCMV.CIITA.C74。第二個陰性對照使用在缺失相互作用結構域時編碼CIITA轉錄激活結構域的pCMV.ciitaHindIII。作為轉染效率的對照，用pCMV/Kb轉染細胞。作為陽性對照，用編碼全長CIITA的pCMV.ciita轉染細胞。這些細胞獨立地轉染入人B細胞。一個B細胞系RM3缺乏DR、DP和DQ的表達。第二個B細胞系克隆B、DR和DP的表達缺陷，但不包括DQ。第三個細胞系Raji表達三個MHCII類基因的野生型水平。以DR(LB3.1)、DQ(SPV.L3，相當於Genox.53)、DP(B7/21)、I類分子(W6/32)或Kb(Y-3)的抗體用標準技術對每個細胞系中細胞染色，然後用螢光激活細胞分選(圖6FACS)進行分析。這些數據表示哺乳類B細胞中α-TDF/CIITA相互作用結構域融合蛋白的表達恢復突變細胞系表面MHCII類基因的表達。於是，CIITA的胺基酸(301-1130)可發揮相互作用結構域的作用。實施例2相互作用抑制劑化合物的細胞實驗以上描述過的方法改進後可提供一個測定化合物是否抑制CIITA依賴的轉錄的方法。該方法中，待試化合物只是簡單地加入轉染細胞的培養基中。抑制α-TDF/CIITA融合蛋白恢復細胞表面MHCII類分子表達的化合物是潛在自身免疫疾病治療藥物。該方法也可鑑別轉錄的同型特異抑制劑。例如，導致α-TDF/CIITA融合蛋白只恢復MHCII類基因的一種亞類的化合物是同型特異抑制劑。因為這樣的化合物可選擇性地抑制MHCII類基因轉錄，所以是特別有價值的自身免疫疾病藥物。以上描述的細胞為基礎的測試可單獨使用或與以下描述的用兩種融合蛋白所做的測試聯合使用。CIITA相互作用靶蛋白其它的測定中，抑制CIITA依賴的轉錄的化合物也可因其在細胞轉錄機器中抑制CIITA相互作用結構域結合靶蛋白的能力而得以鑑別。現在我們已經發現CIITA胺基酸301-1130的功能是通過其在細胞中結合其它的蛋白(在此指靶蛋白)來介導轉錄，用廣泛使用的相互作用捕獲克隆可方便快捷地克隆出CIITA靶蛋白。如以下所要說明的，相互作用捕獲克隆改進後可用以鑑別抑制CIITA相互作用結構域結合其靶蛋白的化合物；這種化合物為潛在的自身免疫疾病治療藥物。簡單地說，相互作用捕獲克隆是用一個蛋白的相互作用結構域和第二個蛋白激活結構域方便快捷地鑑別相互作用結構域所聯的一個靶蛋白。靶蛋白使相互作用結構域能夠介導報告基因的轉錄；轉錄可用以下的方法鑑定。用該系統以及我們發現的相互作用結構域可快捷地克隆出CIITA相互作用結構域的靶蛋白。下面是關於CIITA靶蛋白克隆和用CIITA相互作用結構域鑑別潛在自身免疫疾病治療藥物的說明。實施例3克隆CIITA相互作用靶蛋白為了克隆CIITA相互作用結構域的靶蛋白，用編碼第一個融合蛋白的第一個質粒轉化宿主細胞(例如，EGY48株酵母細胞)。第一個融合蛋白包括與一種沒有CIITA激活結構域的CIITA相互作用結構域融合的DNA結合蛋白(如，LexAN末端202個胺基酸)。酵母細胞還攜帶一個報告基因(lacZ、CAT、GUS、人生長激素、鹼性磷酸酶或蟲螢光素酶基因)，後者與第一個融合蛋白結合的調節序列可操作地相連。報告基因可能在一個質粒或染色體上。此外，用編碼第二個融合蛋白的質粒轉化酵母細胞。第二個融合蛋白包括與待試多肽融合的一個蛋白的轉錄激活結構域(如，B42酸性激活結構域(Ma等，1988，細胞55443-446))，該多肽按下述方法測試其介導報告基因轉錄的能力。允許報告基因轉錄的多肽為CIITA相互作用結構域的靶蛋白。編碼潛在靶蛋白的DNA分子可從文庫(例如從人Burkitt氏B淋巴細胞，Raji所獲的poly-A+RNA製備的cDNA文庫)中獲得。對照測試中，CIITA相互作用結構域可由其它蛋白(例如，pHRFM1或CDK2(以下的Zervos和Gyuris))的相互作用結構域代替。實施例4用CIITA相互作用結構域鑑別自身免疫疾病治療藥物通過幹擾CIITA相互作用結構域而抑制轉錄的化合物可通過測試其抑制CIITA相互作用結構域與靶蛋白結合的能力得以鑑別。任何測定蛋白質-蛋白質間相互作用的方法可用於鑑別加入後抑制蛋白質-蛋白質相互作用的化合物。例如，基於ELISA、Southwestern雜交，濾紙和膜結合蛋白以及固定化蛋白的鑑定均可用於測定對CIITA相互作用結構域和其靶蛋白結合的抑制。以下一種方法的詳例用於識別抑制CIITA相互作用結構域功能，從而是潛在自身免疫疾病治療藥物的化合物。一種優選的方法中，編碼第一個融合蛋白的第一個質粒轉化宿主細胞(例如，EGY48株的酵母細胞)。第一個融合蛋白包括與一個沒有CIITA激活結構域的CIITA相互作用結構域融合的DNA結合蛋白(如，LexAN末端202個胺基酸)。酵母細胞還攜帶一種報告基因(lacZ、CAT、GUS、人生長激素、鹼性磷酸酶或蟲螢光素酶基因)，後者與第一個融合蛋白結合的調節序列可操作地相連。報告基因可能在質粒或染色體上。此外，用編碼第二個融合蛋白的質粒轉化酵母細胞。第二個融合蛋白包括與CIITA相互作用結構域的靶蛋白融合的一種蛋白的轉錄激活結構域(如，B42)。有效的化合物可由其抑制報告基因轉錄的能力而鑑別。轉化細胞的培養物與待試化合物混合併在適宜的條件(如，30℃搖動過夜)下於維持質粒表達的培養基上生長。然後測定基因表達的水平。例如，如果LacZ用作報告基因可測定X-gal存在時藍色發色團產生的數量(例如測定光密度或人工檢查細胞培養基的顏色)。測試中用CIITA相互作用結構域而非對照相互作用結構域抑制轉錄激活的化合物能夠抑制MHCII類分子的表達，所以是自身免疫疾病有力的候選藥物。這種鑑定可獨立或與實施例2中基於細胞的測定聯合使用。CIITA克隆13突變子鑑別在改變蛋白激活某一MHCII類同型抗原轉錄能力的CIITA中我們鑑別了一種突變子。該突變子稱為克隆13CIITA，存在於人B細胞Jijoye(由麻省哈佛大學L.Glimcher惠贈)來源的克隆13細胞系中。克隆13CIITA在MHCII基因DR和DP同型抗原的轉錄中活力低下但在DQ中卻並非如此。我們已經發現野生型CIITA基因在克隆13中的表達能夠使細胞轉錄DR和DP同型抗原。這些研究中，CIITA基因克隆入載體pCMV，產生載體pCMV.ciita(圖5)，然後通過電穿孔轉染克隆13細胞。轉染細胞用FACS分析DR和DP同型的表達(圖7)。作為對照，以同樣的方法檢測Raji細胞(它表達DR、DP和DQ)和未轉化的克隆13細胞。用標準技術以抗體給細胞染色。除了用抗DR(LB3.1；自Becton-Dickinson的L243抗體亦可用)、抗DQ(Genox.53；ATCC#HB103)或抗DP(B7/21；Becton-Dickinson)抗體之外，也用抗I類抗體(W6/32；陽性對照，ATCC#HB95)和抗Kb抗體(Y-3；陰性對照。ATCC#HB95)給細胞染色。參看圖7，用抗DP、抗DR或抗DQ的抗體染色時CIITA在克隆13細胞中的表達增加了這些細胞的相對螢光。於是，野生型CIITA在克隆13細胞中的表達糾正了克隆13突變CIITA的缺陷。實施例5同型特異化合物的鑑別克隆13突變CIITA的相互作用結構域可用在實施例4描述的方法以鑑別為CIITA依賴性轉錄同型特異抑制劑的化合物。如果需要，克隆13CIITA轉錄激活結構域或全長多肽可用於其它方法中以鑑別有效的化合物。抑制野生型CIITA而非克隆13突變CIITA的CIITA依賴轉錄的化合物對抑制DR和DPMHCII類同型抗原的表達有效，但不抑制DQ的表達。這種化合物為同型特異性而且可用於參與抑制某一免疫應答的特殊基因的表達而不引起普遍的免疫抑制。因為很多自身免疫疾病如類風溼關節炎(參考表1和表2)與特定的同型相關，可抑制MHCII類基因的亞類表達的化合物對選擇性影響免疫系統特別有價值。其它的實施方案其它的實施方案在以下的權利要求中。例如，克隆13CIITA以外的同型特異性CIITA突變子激活和相互作用結構域也包含在本發明中。同型特異性CIITA突變子可用上面克隆13CIITA所描述過的方法鑑別。MHCII類基因的一種亞類表達缺陷的細胞系是同型特異CIITA蛋白的潛在來源。含同型特異CIITA的細胞系可由潛在細胞系中野生型CIITA的表達和CIITA的表達是否糾正MHCII類基因表達的缺陷來鑑別。突變CIITA基因可用克隆13中所用的技術克隆。於是，實施例5中提示的方法對分離其它同型特異CIITA突變子仍然有效，該突變子可用於確定化合物是否是轉錄的同型特異抑制劑。另外的測試CIITA依賴的轉錄的方法也包含在本發明中。例如，以前描述過的轉錄測試(例如，參看Keegan等，1986，科學23699；Ma等，1987細胞48847；Lin等，1988，細胞54659；Sadowski等，1988，自然335563；Roberts等，1993，自然363741；和Ma等，1988，細胞55443)用合適的CIITA轉錄激活結構域替代物，簡單地將化合物加入測定實驗中，可鑑定有效的化合物。此外，以上描述的測定的改進可用於本發明中。例如，其它的DNA結合蛋白如GAL4可代替LexA。報告基因，如氯黴素醯基轉移酶(CAT)、螢光素酶β-葡糖苷酸酶(GUS)、人生長激素、鹼性磷酸酶或任何其表達可鑑定的基因均可代替lacZ基因。非酵母的宿主細胞也可使用。例如可用原核或其它真核細胞(如細菌，哺乳動物和植物細胞)測定蛋白質-蛋白質相互作用的方法如基於ELISA、Southerstern雜交、濾紙和膜結合的蛋白和固定化蛋白的測試均可用於鑑別抑制CIITA相互作用結構域和其靶蛋白結合的化合物。顯而易見，標準分子生物學技術使人們能夠將CIITA相互作用結構域用於其它蛋白質相互作用的測定。質粒構建原始的CIITA模板是由HLAII類陽性B細胞系Raji提取的polyA+RNA通過RT-PCR獲得。然後將PCR產物直接克隆入PCRII(Invitrogen)。所獲的克隆中，三個(pCRII.ciita.b，pCRII.ciita.h和pCRII.ciita.p)用於產生一個完整的cDNA真核表達構建物(參看圖5和8)。pCRII.ciita.b用於該構建物的CIITA特異性PCR引物5』末端為5』-GGAAGCTGAGGGCACGAGGA-3』而3』末端為3』-CAGAAGAGACAGGGGACGGTAAC-5』。pCRII.ciita.h用於該構建物的CIITA特異性PCR引物5』末端為5』-CTCCAACAAGCTTCCAAAATG-3』而3』末端為3』-GTACAAGAGACTCCTGTGATTG-5』。pCRII.ciita.p用於該構建物的CIITA特異性PCR引物5』末端的為5』-GTCCCTGAAGGATGTGGAAGAC-3』而3』末端為3』-GTCTGACCTTCGTGTCGAAG-5』。pCMV.ciita該構建物以pLB-1為載體以pCRII.ciita.b、pCRII.ciita.和pCRII.ciita.p為插入片段通過多步亞克隆而得。首先，由HindII酶切pLB-1和T4聚合酶處理製備載體DNA，然後NotI活化消化；5』CIITADNA插入片段由pCRII構建物中PCR插入片段側翼的EcoRI位點酶切pCRII.ciita.b，凝膠純化較小的片段，T4聚合酶處理後NotI活化消化(NotI在CIIT序列的核苷酸1340處)。這兩個片段由T4連接酶連接，所產生的pCMV.ciita亞構建物稱為pCMV.ciita.b。BamHI消化pCMV.ciita.b，凝膠純化較小的片段，T4聚合酶鈍化，然後為NotI消化活化；類似的，pCRII.ciita.p為EcoRI酶切、T4聚合酶鈍化、然後NotI活化消化。較小的片段凝膠純化後使用。載體和插入片段以T4連接酶連接，由此產生的pCMV.ciita的第二個亞構建物稱pCMV.ciita.bp。pCMV.ciita.bp進一步用BamHI和NotI消化；pCRII.citta.h也用BamHI和NotI消化，凝膠純化較小的片段。T4連接酶連接兩個較小的片段，所得的含CIITAcDNA序列(核苷酸48-4471)的構建物稱為pCMV.ciita.bp。pCMV.CIITApCMV.ciita構建後並確證其恢復HLAII類一般表達(通過轉染HLAII類陰性細胞系(RM3和克隆13)和FACS分析)的生物學功能之後製備了該構建物。CIITAcDNA構建物pKS/CIITA(+)(自瑞士日內瓦，日內瓦大學B.Mach博士)也在這些實驗中使用。該質粒中，載體為pBluescriptKS(+)(Stratagene)，cDNA插入多克隆位點的SalI位點。為了構建pCMV.CIITA，pCMV用XhoI和NheI消化，用酶切位點在cDNA插入片段側翼的XhoI和SpeI酶切pKS/CIITA獲得CIITAcDNA酶切片段。兩個片段用T4連接酶連接，所得的構建物稱為pCMV.CIITA(大寫字母表示DNA來源為原始cDNA文庫)。pEG.CIITA用pED.CIITA.SalI和pTrc.CIITA製備該質粒。BamHI消化pED.CIITA.SalI而且凝膠純化大片段；BamHI消化pTrc.CIITA獲得CIITA序列，載體和插入片段應T4連接酶連接。pED.CIITA.SalIpEG202首先用SalI線性化並用CIP脫磷酸化；SalI消化pCMV.CIITA獲得CIITAcDNA；載體和插入片段連接，所得的帶CIITAcDNA插入片段的中間pEG構建物稱為pED.CIITA.SalI.pTrc.ciita該構建物最初產生於重組CIITA蛋白的過表達。首先將5』CIITA序列克隆(用PCR，如以下pEG.ciita.N29構建的途徑)入pTrcHisC(Invitrogen)的BamHI的位點和XhoI位點。所得的質粒pTrc5或pTrc/ciita5用XhoI線性化、T4聚合酶鈍化並且用DraIII活化；CIITA下遊3790bp由ScaI和DraIII消化pCMV.ciita、並且連接兩個片段而得。pEG.ciita.N29設計一對引物用以在LexAN末端第202個密碼子處將CIITAN末端29％按閱讀框融合入pEG202。5』反向引物的序列為AATGGATCcgttgcctggctcca(大寫字母表示標記的序列包括一個以閱讀框克隆的BamHI位點)3』正向引物為CCGCTCGAGcggcaccatacgtgt(標記的序列包括一個XhoI位點)。這些引物在聚合酶鏈式反應(PCR)中以全長的CIITAcDNA模板產生一個1060bp片段。PCR反應為95℃5分鐘、55℃5分鐘72℃3分鐘循環三次，隨後95℃1分鐘、60℃2分鐘、72℃1分鐘循環30次。產生的DNA片段用BamHI和XhoI循環後，克隆入pEG202載體相應的BamHI和XhoI的位點。終止密碼子由pEG202XhoI位點後的載體序列提供。pCMV和pLB-1pCMV是由pREP7(InVitrogen)產生的一個EBV過表達載體；過程為用SalI部分消化Klenow酶鈍化後將以後BglII連接子插入第二個SalI位點(nt.1091)；HindIII和BglII雙酶切消化；最後與pCDM8(Invitrogen)SpeI消化Klenow酶鈍化；BglII連接子插入；以及HinlIII和BglI消化並凝膠純化而。製備的CMV啟動子片段連接。用於製備第一個ciita(小寫字母表示構建物為PCR衍生產物)亞構建物的載體為pLB-1，它是通過在HindIII和NotI位點之間插入約1kb填充DNA以助於HindIII/NotI的雙重消化而從pCMV中衍生而來。pEG.CIITA.C74用BamIII使pEG202線性化，T4聚合酶鈍化、SalI活化；插入片段通過SphI消化pCMV.CIITA，T4聚合酶鈍化，SalI活化製備；然後連接兩個片段。pEG.CIITA.C50用EcoRI使pEG202線性化，T4聚合酶鈍化、SalI活化；插入片段通過NcoI消化pCMV.CIITA，T4聚合酶鈍化，SalI活化製備；然後連接兩個片段.pEG.CIITa.C30用BamHI使pEG202線性化，T4聚合酶鈍化、SalI活化；插入片段通過kpnI消化pCMV.CIITA，T4聚合酶鈍化，SalI活化製備；然後連接兩個片段.pEG.CIITA.C14用BamHI完全酶切、稀釋和連接pEG.ciita。用標準技術分離含ORFN-14％的重環化缺失構建物。pEG.ciita.N70用XhoI使pEG202線性化，T4聚合酶鈍化、BamHI活化；插入片段通過KpnI消化pET.ciiTA，T4聚合酶鈍化，BamHII活化製備；然後連接兩個片段。CIITA的過表達構建物pET.ciiTA如pEG.ciiTA(以上)的構建一樣，將CIITA的開放閱讀框克隆入pET28c(Novagen)。pEG.ciita.N56用XhoI使pEG202線性化，T4聚合酶鈍化、BamHI活化；插入片段通過SfiI消化pET.ciiTATA，T4聚合酶鈍化，BamHI活化製備；然後連接兩個片段。pEG.ciita.N22用BanI消化pTrc5的含ciita的NheI/XhoI片段、T4聚合酶鈍化、用BamHI酶切獲得插入片段。用XhoI線性化pEG202、T4聚合酶鈍化、最後用BamHI酶切獲得載體。然後連接製備的插入片段和載體。pEG.ciita.N17用EaeI消化pTrc5的小NheI/XhoI片段、T4聚合酶鈍化、用BamHI酶切獲得插入片段。用XhoI線性化pEG202、T4聚合酶鈍化、最後用BamHI酶切獲得載體。然後連接製備的插入片段和載體。pEG.ciita.N12用MspI消化pTrc5的小NheI/XhoI片段、T4聚合酶鈍化、用BamHI酶切而獲得插入片段。用SalI線性化pEG202、T4聚合酶鈍化、最後用BamHI酶切獲得載體。然後按閱讀框連接製備的插入片段和載體。pEG.ciita.N7.6用EcoNI消化pTrc5的小NheI/XhoI片段、T4聚合酶鈍化、用BamHI酶切獲得插入片段。用XhoI線性化pEG202、T4聚合酶鈍化、最後用BamHI酶切獲得載體。然後連接製備的插入片段和載體。pEG.C-αTDF插入HSV-1F株α-轉導因子(transducingfactor)C未端16％Pelltt等，1985，PNAS825870-5874；登記號k033501到pEG202。pEG.C』-αTDF插入HSV-1F株α誘導因子C末端16％(除了最C末端的3個密碼子)。這一構建物的插入片段後來用於構建pCMV.αTDF-CIITA.C70。pCMV.ciita＾HindIII該構建物包括CIITAN末端的29％的ORF，由HindIII消化pCMV.ciita、純化主要譜帶和重環化製得。pCMV.CIITA.C74該構建物包括N末端25個密碼子和CIITA大約74％的C末端ORF，由多步亞克隆產生。首先，NcoI酶切pKS/CIITA(+)、T4聚合酶鈍化、然後XhoI酶切作為載體。類似的，它為SphI酶切，T4聚合酶鈍化然後用XhoI酶切作為插入片段。兩個片段以T4聚合酶連接，產生所構建物稱為pKS.CIITA＾N/S。為了產生pCMV.CIITA.C74，pKS.CIITA＾N/S用SpeI和XhoI酶切，然後將含CIITA片段插入NheI/XhoI酶切的pCMV載體中。pCMV.αTDF-CIITA.C70這是由多步亞克隆產生的。首先，pKS/CIITA(+)用Tth111I酶切、T4聚合酶鈍化、然後用T4連接酶連接。該中間構建物稱pKS/CIITA.＾Tth。然後以NcoI和AatII酶切之、T4聚合酶鈍化、與編碼HSV1(F株)α誘導因子C末端(除了最C端3個密碼子)按閱讀框連接。第二個中間載體稱pKS/αTDF-CIITA.＾Tth。含NotI片段的5』αTDF-CIITA用於置換pKS/CIITA(+)相應的5』NotI片段。該第三中間構建物稱為pKS/αTDF-CIITA.70。為了產生pCMV.αTDF-CIITA，pKS/αTDF-CIITA用SpeI和XhoI酶切。然後將含αTDF-CIITA片段插入NheI/XhoI酶切的pCMV片段。序列表(1)概況(i)申請人Glimcher，LaurieH.Zhou，HongDouhanIII，John(ii)發明標題鑑別對治療自身免疫疾病有效的化合物的方法(iii)序列數1(iv)聯繫地址(A)地址FishRichardson(B)街道225FranklinStreet(C)城市波士頓(D)州麻薩諸塞(E)國家美國(F)區號02110-2804(v)計算機可讀方式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentInRelease#1.0，版本#1.30B(vi)當前申請材料(A)申請號(B)提交日期(C)分類(viii)委託/代理人信息(A)姓名Freeman，JohnW.(B)註冊號29,066(C)參考/存檔號00264/188001(2)SEQIDNo1的信息(i)序列特徵(A)長度3393鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸學線性(ii)分子類型DNA(基因組的)(ix)特徵(A)名稱/鍵CDS(B)定位1..3393(xi)序列描述SEQIDNo1ATGCGTTGCCTGGCTCCACGCCCTGCTGGGTCCTACCTGTCAGAGCCC48MetArgCysLeuAlaProArgProAlaGlySerTyrLeuSerGluPro151015CAAGGCAGCTCACAGTGTGCCACCATGGAGTTGGGGCCCCTAGAAGGT96GlnGlySerSerGlnCysAlaThrMetGluLeuGlyProLeuGluGly202530GGCTACCTGGAGCTTCTTAACAGCGATGCTGACCCCCTGTGCCTCTAC144GlyTyrLeuGluLeuLeuAsnSerAspAlaAspProLeuCysLeuTyr354045CACTTCTATGACCAGATGGACCTGGCTGGAGAAGAAGAGATTGAGCTC192HisPheTyrAspGlnMetAspLeuAlaGlyGluGluGluIleGluLeu505560TACTCAGAACCCGACACAGACACCATCAACTGCGACCAGTTCAGCAGG240TyrSerGluProAspThrAspThrIleAsnCysAspGlnPheSerArg65707580CTGTTGTGTGACATGGAAGGTGATGAAGAGACCAGGGAGGCTTATGCC288LeuLeuCysAspMetGluGlyAspGluGluThrArgGluAlaTyrAla859095AATATCGCGGAACTGGACCAGTATGTCTTCCAGGACTCCCAGCTGGAG336AsnIleAlaGluLeuAspGlnTyrValPheGlnAspSerGlnLeuGlu100105110GGCCTGAGCAAGGACATTTTCAAGCACATAGGACCAGATGAAGTGATC384GlyLeuSerLysAspIlePheLysHisIleGlyProAspGluValIle115120125GGTGAGAGTATGGAGATGCCAGCAGAAGTTGGGCAGAAAAGTCAGAAA432GlyGluSerMetGluMetProAlaGluValGlyGlnLysSerGlnLys130135140AGACCCTTCCCAGAGGAGCTTCCGGCAGACCTGAAGCACTGGAAGCCA480ArgProPheProGluGluLeuProAlaAspLeuLysHisTrpLysPro145150155160GCTGAGCCCCCCACTGTGGTGACTGGCAGTCTCCTAGTGGGACCAGTG528AlaGluProProThrValValThrGlySerLeuLeuValGlyProVal165170175AGCGACTGCTCCACCCTGCCCTGCCTGCCACTGCCTGCGCTGTTCAAC576SerAspCysSerThrLeuProCysLeuProLeuProAlaLeuPheAsn180185190CAGGAGCCAGCCTCCGGCCAGATGCGCCTGGAGAAAACCGACCAGATT624GlnGluProAlaSerGlyGlnMetArgLeuGluLysThrAspGlnIle195200205CCCATGCCTTTCTCCAGTTCCTCGTTGAGCTGCCTGAATCTCCCTGAG672ProMetProPheSerSerSerSerLeuSerCysLeuAsnLeuProGlu210215220GGACCCATCCAGTTTGTCCCCACCATCTCCACTCTGCCCCATGGGCTC720GlyProIleGlnPheValProThrIleSerThrLeuProHisGlyLeu225230235240TGGCAAATCTCTGAGGCTGGAACAGGGGTCTCCAGTATATTCATCTAC768TrpGlnIleSerGluAlaGlyThrGlyValSerSerIlePheIleTyr245250255CATGGTGAGGTGCCCCAGGCCAGCCAAGTACCCCCTCCCAGTGGATTC816HisGlyGluValProGlnAlaSerGlnValProProProSerGlyPhe260265270ACTGTCCACGGCCTCCCAACATCTCCAGACCGGCCAGGCTCCACCAGC864ThrValHisGlyLeuProThrSerProAspArgProGlySerThrSer275280285CCCTTCGCTCCATCAGCCACTGACCTGCCCAGCATGCCTGAACCTGCC912ProPheAlaProSerAlaThrAspLeuProSerMetProGluProAla290295300CTGACCTCCCGAGCAAACATGACAGAGCACAAGACGTCCCCCACCCAA960LeuThrSerArgAlaAsnMetThrGluHisLysThrSerProThrGln305310315320TGCCCGGCAGCTGGAGAGGTCTCCAACAAGCTTCCAAAATGGCCTGAG1008CysProAlaAlaGlyGluValSerAsnLysLeuProLysTrpProGlu325330335CCGGTGGAGCAGTTCTACCGCTCACTGCAGGACACGTATGGTGCCGAG1056ProValGluGlnPheTyrArgSerLeuGlnAspThrTyrGlyAlaGlu340345350CCCGCAGGCCCGGATGGCATCCTAGTGGAGGTGGATCTGGTGCAGGCC1104ProAlaGlyProAspGlyIleLeuValGluValAspLeuValGlnAla355360365AGGCTGGAGAGGAGCAGCAGCAAGAGCCTGGAGCGGGAACTGGCCACC1152ArgLeuGluArgSerSerSerLysSerLeuGluArgGluLeuAlaThr370375380CCGGACTGGGCAGAACGGCAGCTGGCCCAAGGAGGCCTGGCTGAGGTG1200ProAspTrpAlaGluArgGlnLeuAlaGlnGlyGlyLeuAlaGluVal385390395400CTGTTGGCTGCCAAGGAGCACCGGCGGCCGCGTGAGACACGAGTGATT1248LeuLeuAlaAlaLysGluHisArgArgProArgGluThrArgValIle405410415GCTGTGCTGGGCAAAGCTGGTCAGGGCAAGAGCTATTGGGCTGGGGCA1296AlaValLeuGlyLysAlaGlyGlnGlyLysSerTyrTrpAlaGlyAla420425430GTGAGCCGGGCCTGGGCTTGTGGCCGGCTTCCCCAGTACGACTTTGTC1344ValSerArgAlaTrpAlaCysGlyArgLeuProGlnTyrAspPheVal435440445TTCTCTGTCCCCTGCCATTGCTTGAACCGTCCGGGGGATGCCTATGGC1392PheSerValProCysHisCysLeuAsnArgProGlyAspAlaTyrGly450455460CTGCAGGATCTGCTCTTCTCCCTGGGCCCACAGCCACTCGTGGCGGCC1440LeuGlnAspLeuLeuPheSerLeuGlyProGlnProLeuValAlaAla465470475480GATGAGGTTTTCAGCCACATCTTGAAGAGACCTGACCGCGTTCTGCTC1488AspGluValPheSerHisIleLeuLysArgProAspArgValLeuLeu485490495ATCCTAGACGCCTTCGAGGAGCTGGAAGCGCAAGATGGCTTCCTGCAC1536IleLeuAspAlaPheGluGluLeuGluAlaGlnAspGlyPheLeuHis500505510AGCACGTGCGGACCGGCACCGGCGGAGCCCTGCTCCCTCCGGGGGCTG1584SerThrCysGlyProAlaProAlaGluProCysSerLeuArgGlyLeu515520525CTGGCCGGCCTTTTCCAGAAGAAGCTGCTCCGAGGTTGCACCCTCCTC1632LeuAlaGlyLeuPheGlnLysLysLeuLeuArgGlyCysThrLeuLeu530535540CTCACAGCCCGGCCCCGGGGCCGCCTGGTCCAGAGCCTGAGCAAGGCC1680LeuThrAlaArgProArgGlyArgLeuValGlnSerLeuSerLysAla545550555560GACGCCCTATTTGAGCTGTCCGGCTTCTCCATGGAGCAGGCCCAGGCA1728AspAlaLeuPheGluLeuSerGlyPheSerMetGluGlnAlaGlnAla565570575TACGTGATGCGCTACTTTGAGAGCTCAGGGATGACAGAGCACCAAGAC1776TyrValMetArgTyrPheGluSerSerGlyMetThrGluHisGlnAsp580585590AGAGCCCTGACGCTCCTCCGGGACCGGCCACTTCTTCTCAGTCACAGC1824ArgAlaLeuThrLeuLeuArgAspArgProLeuLeuLeuSerHisSer595600605CACAGCCCTACTTTGTGCCGGGCAGTGTGCCAGCTCTCAGAGGCCCTG1872HisSerProThrLeuCysArgAlaValCysGlnLeuSerGluAlaLeu610615620CTGGAGCTTGGGGAGGACGCCAAGCTGCCCTCCACGCTCACGGGACTC1920LeuGluLeuGlyGluAspAlaLysLeuProSerThrLeuThrGlyLeu625630635640TATGTCGGCCTGCTGGGCCGTGCAGCCCTCGACAGCCCCCCCGGGGCC1968TyrValGlyLeuLeuGlyArgAlaAlaLeuAspSerProProGlyAla645650655CTGGCAGAGCTGGCCAAGCTGGCCTGGGAGCTGGGCCGCAGACATCAA2016LeuAlaGluLeuAlaLysLeuAlaTrpGluLeuGlyArgArgHisGln660665670AGTACCCTACAGGAGGACCAGTTCCCATCCGCAGACGTGAGGACCTGG2064SerThrLeuGlnGluAspGlnPheProSerAlaAspValArgThrTrp675680685GCGATGGCCAAAGGCTTAGTCCAACACCCACCGCGGGCCGCAGAGTCC2112AlaMetAlaLysGlyLeuValGlnHisProProArgAlaAlaGluSer690695700GAGCTGGCCTTCCCCAGCTTCCTCCTGCAATGCTTCCTGGGGGCCCTG2160GluLeuAlaPheProSerPheLeuLeuGlnCysPheLeuGlyAlaLeu705710715720TGGCTGGCTCTGAGTGGCGAAATCAAGGACAAGGAGCTCCCGCAGTAC2208TrpLeuAlaLeuSerGlyGluIleLysAspLysGluLeuProGlnTyr725730735CTAGCATTGACCCCAAGGAAGAAGAGGCCCTATGACAACTGGCTGGAG2256LeuAlaLeuThrProArgLysLysArgProTyrAspAsnTrpLeuGlu740745750GGCGTGCCACGCTTTCTGGCTGGGCTGATCTTCCAGCCTCCCGCCCGC2304GlyValProArgPheLeuAlaGlyLeuIlePheGlnProProAlaArg755760765TGCCTGGGAGCCCTACTCGGGCCATCGGCGGCTGCCTCGGTGGACAGG2352CysLeuGlyAlaLeuLeuGlyProSerAlaAlaAlaSerValAspArg770775780AAGCAGAAGGTGCTTGCGAGGTACCTGAAGCGGCTGCAGCCGGGGACA2400LysGlnLysValLeuAlaArgTyrLeuLysArgLeuGlnProGlyThr785790795800CTGCGGGCGCGGCAGCTGCTTGAGCTGCTGCACTGCGCCCACGAGGCC2448LeuArgAlaArgGlnLeuLeuGluLeuLeuHisCysAlaHisGluAla805810815GAGGAGGCTGGAATTTGGCAGCACGTGGTACAGGAGCTCCCCGGCCGC2496GluGluAlaGlyIleTrpGlnHisValValGlnGluLeuProGlyArg820825830CTCTCTTTTCTGGGCACCCGCCTCACGCCTCCTGATGCACATGTACTG2544LeuSerPheLeuGlyThrArgLeuThrProProAspAlaHisValLeu835840845GGCAAGGCCTTGGAGGCGGCGGGCCAAGACTTCTCCCTGGACCTCCGC2592GlyLysAlaLeuGluAlaAlaGlyGlnAspPheSerLeuAspLeuArg850855860AGCACTGGCATTTGCCCCTCTGGATTGGGGAGCCTCGTGGGACTCAGC2640SerThrGlyIleCysProSerGlyLeuGlySerLeuValGlyLeuSer865870875880TGTGTCACCCGTTTCAGGGCTGCCTTGAGCGACACGGTGGCGCTGTGG2688CysValThrArgPheArgAlaAlaLeuSerAspThrValAlaLeuTrp885890895GAGTCCCTGCGGCAGCATGGGGAGACCAAGCTACTTCAGGCAGCAGAG2736GluSerLeuArgGlnHisGlyGluThrLysLeuLeuGlnAlaAlaGlu900905910GAGAAGTTCACCATCGAGCCTTTCAAAGCCAAGTCCCTGAAGGATGTG2784GluLysPheThrIleGluProPheLysAlaLysSerLeuLysAspVal915920925GAAGACCTGGGAAAGCTTGTGCAGACTCAGAGGACGAGAAGTTCCTCG2832GluAspLeuGlyLysLeuValGlnThrGlnArgThrArgSerSerSer930935940GAAGACACAGCTGGGGAGCTCCCTGCTGTTCGGGACCTAAAGAAACTG2880GluAspThrAlaGlyGluLeuProAlaValArgAspLeuLysLysLeu945950955960GAGTTTGCGCTGGGCCCTGTCTCAGGCCCCCAGGCTTTCCCCAAACTG2928GluPheAlaLeuGlyProValSerGlyProGlnAlaPheProLysLeu965970975GTGCGGATCCTCACGGCCTTTTCCTCCCTGCAGCATCTGGACCTGGAT2976ValArgIleLeuThrAlaPheSerSerLeuGlnHisLeuAspLeuAsp980985990GCGCTGAGTGAGAACAAGATCGGGGACGAGGGTGTCTCGCAGCTCTCA3024AlaLeuSerGluAsnLysIleGlyAspGluGlyValSerGlnLeuSer99510001005GCCACCTTCCCCCAGCTGAAGTCCTTGGAAACCCTCAATCTGTCCCAG3072AlaThrPheProGlnLeuLysSerLeuGluThrLeuAsnLeuSerGln101010151020AACAACATCACTGACCTGGGTGCCTACAAACTCGCCGAGGCCCTGCCT3120AsnAsnIleThrAspLeuGlyAlaTyrLysLeuAlaGluAlaLeuPro1025103010351040TCGCTCGCTGCATCCCTGCTCAGGCTAAGCTTGTACAATAACTGCATC3168SerLeuAlaAlaSerLeuLeuArgLeuSerLeuTyrAsnAsnCysIle104510501055TGCGACGTGGGAGCCGAGAGCTTGGCTCGTGTGCTTCCGGACATGGTG3216CysAspValGlyAlaGluSerLeuAlaArgValLeuProAspMetVal106010651070TCCCTCCGGGTGATGGACGTCCAGTACAACAAGTTCACGGCTGCCGGG3264SerLeuArgValMetAspValGlnTyrAsnLysPheThrAlaAlaGly107510801085GCCCAGCAGCTCGCTGCCAGCCTTCGGAGGTGTCCTCATGTGGAGACG3312AlaGlnGlnLeuAlaAlaSerLeuArgArgCysProHisValGluThr109010951100CTGGCGATGTGGACGCCCACCATCCCATTCAGTGTCCAGGAACACCTG3360LeuAlaMetTrpThrProThrIleProPheSerValGlnGluHisLeu1105111011151120CAACAACAGGATTCACGGATCAGCCTGAGATGA3393GlnGlnGlnAspSerArgIleSerLeuArg*11251130權利要求1.一種測定化合物是否抑制多肽激活轉錄能力的方法，該多肽其特徵在於它包括一個CIITA轉錄激活結構域而缺失一個有功能的CIITA相互作用結構域，其中轉錄的抑制表示該化合物是一種潛在的自身免疫疾病治療藥物。2.權利要求1中的方法，其中轉錄激活的抑制如下測定a)提供一種所述多肽與一種DNA結合蛋白的融合蛋白。b)提供一種在系統中與報告基因可操作地連接的轉錄調節DNA序列，該系統在融合蛋白與調節序列連接時適於轉錄報告基因。c)在所述系統中提供所述融合蛋白和所述化合物；以及d)測定所述化合物抑制報告基因轉錄的能力。3.權利要求1中的方法，它進一步包括測定化合物抑制第二個多肽激活轉錄的能力，第二個多肽其特徵在於包括一個同型特異CIITA轉錄激活結構域而缺失一個有功能的CIITA相互作用結構域，其中所述的方法鑑別了同型特異化合物。4.一種基本純化的DNA，它編碼CIITA轉錄激活結構域而不編碼有功能的CIITA相互作用結構域。5.權利要求4中的DNA，其中DNA有圖1核苷酸192-1142的核苷酸序列，或其簡併的變異序列。6.權利要求4中的DNA，其中DNA80％或更多的序列與圖1DNA序列的核苷酸192-1149相同。7.權利要求4中的DNA，其中CIITA是同型特異的。8.一種基本純化的包括一個CIITA轉錄激活結構域而缺失一個有功能的CIITA相互作用結構域的多肽。9.權利要求8中的多肽，它包括與圖1胺基酸序列胺基酸26-352基本相同的胺基酸序列。10.權利要求8中的多肽，其中CIITA是同型特異的。11.一種測定化合物是否抑制多肽與其靶蛋白結合能力的方法，該多肽其特徵在於它包括一個CIITA相互作用結構域而缺失一個有功能的CIITA激活結構域，其中結合的抑制表示化合物是潛在的自身免疫疾病治療藥物。12.權利要求11中的方法，該方法包括測定所述化合物是否抑制上述多肽介導的轉錄能力，轉錄的抑制表示化合物為潛在的自身免疫疾病治療藥物。13.權利要求12的方法，其中所說的抑制如下測定a)提供第一個包括所述多肽與一種DNA結合蛋白的融合蛋白；b)為DNA序列提供一種轉錄調節序列，它在適於轉錄報告基因的系統中可操作地與報告基因連接；c)提供第二個融合蛋白，所述第二個融合蛋白其特徵在於它包含與CIITA相互作用結構域的靶蛋白融合的轉錄激活結構域；d)在系統中提供所述第一個和所述第二個融合蛋白以及所述化合物；以及e)測定所述化合物抑制報告基因轉錄的能力。14.權利要求11中的方法，進一步包括測定所述化合物抑制第二個多肽結合其靶蛋白的能力，上述第二個多肽特徵在於它包含一個同型特異CIITA相互作用結構域而缺失一個有功能的CIITA激活結構域，其中所說的方法鑑別同型特異化合物。15.權利要求14中的方法，其中所述第二多肽包含克隆13CIITA的相互作用結構域。16.一種基本純化的DNA，它編碼CIITA相互作用結構域而不編碼有功能的CIITA轉錄激活結構域。17.權利要求16中的方法，其中所DNA具有圖1核苷酸1016-3509的核苷酸序列或其簡併的變異序列。18.權利要求16中的方法，其中所述DNA有80％或更多的序列與圖1DNA序列的核苷酸1016-3509的序列相同。19.權利要求16中的方法，其中CIITA是同型特異的。20.權利要求19中的方法，其中CIITA為克隆13CIITA。21.一種基本純淨的多肽，它包括CIITA相互作用結構域而缺失有功能的CIITA轉錄激活結構域。22.權利要求21中的多肽，它包含與圖1胺基酸序列中胺基酸301-1130基本相同的胺基酸序列。23.權利要求21中的多肽，其中所述CIITA是同型特異的。24.權利要求23中的多肽，CIITA為克隆13CIITA。25.測定一個化合物是否抑制多肽介導轉錄能力的方法，該多肽其特徵在於它包含一個與轉錄激活結構域融合的CIITA相互作用結構域而缺失有功能的CIITA相互作用結構域，其中轉錄的抑制表示所述化合物是潛在的自身免疫疾病治療藥物。26.權利要求25中的方法，它進一步包含在B淋巴細胞中提供上述多肽而且測定MHCII類基因的表達。27.權利要求26中的方法，其中所述細胞是選自克隆13細胞和RM3細胞的人B淋巴細胞。全文摘要本發明公開了鑑別化合物的方法，該化合物抑制CIITA的轉錄激活從而抑制MHCII類基因的表達。這樣的化合物能夠影響免疫應答的誘導。這些方法分別應用CIITA的激活和相互作用結構域。方法中也同時應用同型特異性CIITA蛋白激活和相互作用結構域，以用於鑑別這類化合物它們是轉錄的同型特異抑制劑和選擇性影響免疫系統中有效的化合物。文檔編號C12N15/12GK1164236SQ95195840公開日1997年11月5日申請日期1995年8月22日優先權日1995年8月22日發明者L·H·格利姆徹,周虹,J·杜漢三世申請人:哈佛大學校長及研究員協會