一種特異性識別及靈敏檢測人血清蛋白的螢光試劑合成方法及應用與流程

2023-12-03 06:29:31

發明涉及到一種螢光探針法測定人血清蛋白濃度及識別其與牛血清蛋白的方法，屬於生物大分子含量及結構研究領域。

背景技術：

在臨床診斷中，尿液中人血清蛋白的識別鑑定是腎臟疾病的早期信號，並且人血清中蛋白含量的不足也能預示提示肝功能的衰竭。除此之外，在生物化學或藥理學應用領域，低成本的牛血清白蛋白(BSA)被廣泛用來替代人血清白蛋白(HSA)。然而，牛血清白蛋白只有75.8％的生物功能與人血清白蛋白相似，是不能代替人血清蛋白去替換流體並幫助手術患者修復血容量的。因此，在治療過程中區分人血清蛋白和牛血清蛋白，同時實現對蛋白含量的定量檢測就顯得尤為重要。目前，針對白蛋白檢測的免疫化學方法層出不窮，但多數由於程序較為複雜且試劑和儀器較昂貴，不利於日常檢測。而隨著科學技術的發展，操作簡單，靈敏度高且無破壞性的非共價螢光探針技術受到了廣泛關注。

本文報導了一個合成簡單，成本低廉的螢光探針，DB-15C5。DB-15C5具有典型的扭轉的分子內電荷轉移特徵，因此在生理緩衝體系(PBS緩衝液)中幾乎沒有螢光，若一旦進入到HSA或者BSA結構中，就會發出綠色螢光，而對比其他幾種蛋白並沒有明顯現象。DB-15C5與HSA結合後的螢光強度遠遠高於與BSA結合的螢光強度，紫外燈下照射就可以看出其區別，可以實現快速鑑別人血清蛋白和牛血清蛋白。螢光強度與HSA濃度之間存在很好的劑量關係，可以作為一種靈敏的HSA識別探針試劑，定量測定生理緩衝液以及人工尿液中血清蛋白的含量。探針試劑的濃度50μM，能對5μM的人血清蛋白進行識別。生理緩衝液中定量檢測人血清蛋白範圍0-5.6μM，最低檢測限0.112mg/L；人工尿液中範圍0.0-1.2μM，最低檢測限1.95mg/L。此類方法較為直觀，具有操作簡單，靈敏度高和成本低廉等特點，值得推廣。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種操作簡單，靈敏度高和成本低廉的螢光探針法測定人血清蛋白濃度及鑑別其與牛血清蛋白。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

(1)合成螢光探針試劑DB-15C5：稱量二苯氨基-4-苯甲醛0.27g(1mmol)，加入50毫升三頸瓶中，溫度設定為85℃，加入無水乙醇，加熱回流至剛好全溶。稱量4-氨基苯並-15-冠-5-醚0.28g(1mmol)，加入無水乙醇溶解，緩慢滴加到醛溶液中，冷凝回流4h，反應完成後靜置過夜，析出黃綠色晶體，過濾，真空乾燥得到產物DB-15C5。

(2)螢光識別HSA測定方法：取DB-15C5母液10μL於石英螢光比色皿中，再加入1mL磷酸鹽緩衝液(PBS，pH 7.2～7.4)，得到5.0×10-5mol/L的待測液。加入蛋白儲備液200μL，在螢光分光光度計上設置360nm為激發波長，磷酸鹽緩衝液體系激發和發射狹縫調為2.5，5nm，人工尿液體系均為2.5nm。得到DB-15C5在不同蛋白存在時的螢光光譜。

(3)定量測定HSA含量：通過DB-15C5在不同濃度HSA存在時的螢光光譜，固定發射波長500nm，讀取螢光強度，以螢光強度(I)對HSA濃度(CHSA)作圖，建立得到標準曲線。測定DB-15C5在未知樣品中的螢光強度，通過標準曲線得到HSA含量。

所述螢光試劑DB-15C5的結構以核磁共振(NMR)譜以及質譜(MS)鑑定：1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.637(s,1H),7.720(d,J＝8.8Hz,2H),7.319(m,4H),7.154(m,8H),6.890(m,3H),4.191(m,4H),3.937(t,J＝4.8Hz,4H),3.772(s,8H).13C NMR(CDCl3,100MHz):δ158.144,150.535,149.499,147.322,146.944,146.285,129.667,129.560,129.438,125.356,123.926,121.615,114.579,112.566,107.789,71.066,71.022,70.526,70.417,69.658,69.517,69.444,68.759.HRMScalcd for C33H34N2O5[M+Na]+561.2665,found 561.2665，產率33.4％，產品純度95％以上。

所述的螢光測定時溶液配製緩衝液所用水均為二次蒸餾水或更高純度的水。

所述的緩衝液為由NaCl 8g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.24g，Na2HPO4 1.44g(如果是Na2HPO4·12H2O，則3.63g)溶於1000mL水中配製而成。

所述的人工尿液由尿素1.02068g,乳酸0.0099088g,檸檬酸0.042028g,碳酸氫鈉0.210025g,氯化鈣0.027745g,氯化鈉0.52596g,七水硫酸鎂0.049294g,硫酸鈉0.14204g,磷酸二氫鉀0.095263g,磷酸氫二鉀0.159754g,氯化銨0.133725g溶於100ml蒸餾水並調節pH為6.0配製而成。

根據權利要求1所述的DB-15C5溶液配製採用1％(v％)乙醇助溶。

所述的螢光光譜需要在螢光分光光度計上測試得到。

本發明將用於螢光鑑別HSA與其他蛋白，尤其是HSA與BSA，並可以定量檢測HSA。

DB-15C5在生理緩衝液中的螢光強度非常微弱，一旦進入到HSA結構中，就會發出綠色螢光，而對比其他幾種蛋白並沒有明顯現象。DB-15C5與HSA結合後的螢光強度遠遠高於與BSA結合的螢光強度，紫外燈下照射就可以看出其區別，可以實現快速鑑別人血清蛋白和牛血清蛋白。螢光強度與HSA濃度之間存在很好的劑量關係，可以作為一種靈敏的HSA識別探針試劑，定量檢測HSA含量。此類鑑別方法較為直觀，具有操作簡單，靈敏度高和成本低廉等特點，值得推廣。

附圖說明

圖1為檢測試劑DB-15C5的合成路線。

圖2為螢光試劑DB-15C5(50μM)在人工尿液中(左)、加入HSA(10μM)(中)、加入BSA(10μM)(右)體系中的螢光圖。

圖3為螢光試劑在PBS體系中對不同蛋白的螢光響應圖譜(A)及在不同蛋白中的螢光強度(B)。

圖4為PBS體系中DB-15C5在不同濃度HSA存在時的螢光光譜及標準曲線。

圖5為螢光試劑在人工尿液中對不同蛋白的螢光響應圖譜(A)及在不同蛋白中的螢光強度(B)。

圖6為人工尿液體系中DB-15C5在不同濃度HSA存在時的螢光光譜及標準曲線。

圖7為不同pH中，DB-15C5(50μM)和DB-15C5+HSA(5μM)的螢光強度。

圖8為分子對接計算得到的DB-15C5與HSA結合能最低時的結合模式。

具體實施方式

下述試驗和實例用於進一步說明但不限於本發明。

(1)在PBS介質中，DB-15C5用於鑑別HSA和BSA，方法如下：

稱量DB-15C5 0.01345g，準確加入無水乙醇5mL，得到5.0×10-3mol/L的母液。用乙醇將母液稀釋為1.0×10-4mol/L溶液備用，用保鮮膜和錫箔紙包裹好，密封，避光，置於冰箱中保存。同時，將人血清蛋白(HSA)以磷酸鹽緩衝液配製成1.0×10-4mol/L溶液備用。

取DB-15C5母液10μL於石英螢光比色皿中，再加入1mL磷酸鹽緩衝液(PBS，pH 7.2～7.4)，得到5.0×10-5mol/L的待測液。加入蛋白儲備液200μL，在螢光分光光度計上設置360nm為激發波長。激發和發射狹縫調為2.5，5nm。在370～700nm範圍進行掃描，得到DB-15C5在不同蛋白存在時的螢光光譜(圖3)。

DB-15C5由於TICT性質，在PBS體系中幾乎沒有螢光，但是5μM的HSA的加入，可以迅速點亮化合物螢光，螢光強度增加了接近32倍，靈敏度較高。相比之下，DB-15C5在BSA體系中，螢光強度僅為前者的1/6，可以明顯區分HSA與BSA。

(2)PBS介質中DB-15C5定量測定HSA含量，其方法如下：

稱量DB-15C5 0.01345g，準確加入無水乙醇5mL，得到5.0×10-3mol/L的母液。用乙醇將母液稀釋為1.0×10-4mol/L溶液備用，用保鮮膜和錫箔紙包裹好，密封，避光，置於冰箱中保存。同時，將人血清蛋白(HSA)以磷酸鹽緩衝液配製成1.0×10-4mol/L溶液備用。

取1.0×10-4mol/L DB-15C5溶液40μL加入石英螢光比色皿中，加入960μL磷酸鹽緩衝液混合均勻，依次加入HSA溶液(0～8.0μM)，在螢光分光光度計上設置360nm為激發波長，激發和發射狹縫調為5nm，10nm，在370～700nm範圍進行掃描，得到DB-15C5在不同濃度HSA存在時的螢光光譜(圖4)。

讀取DB-15C5在不同濃度HSA存在時、發射波長500nm的螢光強度，以螢光強度(I)對HSA濃度(CHSA)作圖，建立得到標準曲線(I＝191.6047+1152.3207CHSA,R2＝0.9955)。線性範圍0.0to 5.6μM，檢測限1.7nM(0.112mg/L)。測定DB-15C5在樣品中的螢光強度，通過標準曲線得到HSA含量。

(4)人工尿液介質中DB-15C5定量測定HSA含量，其方法如下：

稱量DB-15C5 0.01345g，準確加入無水乙醇5mL，得到5.0×10-3mol/L的母液。用乙醇將母液稀釋為1.0×10-4mol/L溶液備用，用保鮮膜和錫箔紙包裹好，密封，避光，置於冰箱中保存。同時，將人血清蛋白(HSA)以磷酸鹽緩衝液配製成1.0×10-4mol/L溶液備用。

取DB-15C5母液10μL於石英螢光比色皿中，再加入1mL人工尿液(pH 6.0)，得到5.0×10-5mol/L的待測液。加入蛋白儲備液200μL，在螢光分光光度計上設置360nm為激發波長。激發和發射狹縫調均為2.5nm。在370～700nm範圍進行掃描，得到DB-15C5在不同蛋白存在時的螢光光譜(圖5)。

DB-15C5由於TICT性質，在尿液中幾乎沒有螢光，但是5μM的HSA的加入，可以迅速點亮化合物螢光，螢光強度增加了接近32倍，靈敏度較高。除此之外，DB-15C5也有較好的選擇性，我們一共測試了八種蛋白的螢光響應圖譜，發現HSA，BSA，酪蛋白能夠點亮化合物螢光，但是在HSA中螢光明顯比後兩者強。說明DB-15C5可以實現人工尿液中的HSA識別。

(5)人工尿液中DB-15C5定量測定HSA含量，其方法如下：

稱量DB-15C5 0.01345g，準確加入無水乙醇5mL，得到5.0×10-3mol/L的母液。用乙醇將母液稀釋為1.0×10-4mol/L溶液備用，用保鮮膜和錫箔紙包裹好，密封，避光，置於冰箱中保存。同時，將人血清蛋白(HSA)以磷酸鹽緩衝液配製成1.0×10-4mol/L溶液備用。

取1.0×10-4mol/L DB-15C5溶液40μL加入石英螢光比色皿中，加入960μL人工尿液混合均勻，依次加入HSA溶液(0.0–1.2μM)，在螢光分光光度計上設置360nm為激發波長，激發和發射狹縫調為5，10nm，在370～700nm範圍進行掃描，得到DB-15C5在不同濃度HSA存在時的螢光光譜(圖6)。

讀取DB-15C5在不同濃度HSA存在時、發射波長500nm的螢光強度，以螢光強度(I)對HSA濃度(CHSA)作圖，建立得到標準曲線(I＝1166.0110+1845.8791CHSA,R2＝0.9954)，檢測限：29.5nM(1.95mg L-1)。測定DB-15C5在樣品中的螢光強度，通過標準曲線得到HSA含量，將計算得到的含量值與實際加入值相比較，得到回收率(表1)，判斷方法可行。

表1.標準加入法測定結果

(4)pH對檢測體系影響小

檢測體系較為穩定。由圖7看出，在不同pH條件下，體系的螢光強度值變化不大，尤其是在pH 6-10之間，體系螢光強度穩定，因此，在生理環境及產生異樣的情況下，HSA含量檢測不受影響。

(5)DB-15C5對HSA產生特異性識別的工作原理

藉助分子對接理論模擬，得出DB-15C5與HSA產生結合的位點。如圖8所示，DB-15C5可以進入到HSA位於subdomains IIA(Sudlow site I)和IIIA(Sudlow site II)的α-螺旋區域，結合自由能達到-10.47kcal/mol。結合中冠醚基團與組氨酸His242殘基之間有氫鍵作用力表明冠醚基團在識別過程中發揮重要作用。