一種誘導劑及採用該誘導劑製備表皮幹細胞的方法與流程
2023-12-03 19:37:26 3
本發明涉及幹細胞誘導分化領域，特別涉及一種誘導劑及採用該誘導劑製備表皮幹細胞的方法。
背景技術：
隨著人們物質生活水平的逐漸提高，吃飽穿暖對人們來說不再是難題，生活的富裕使得人們開始追求更高層面的生活。愛美之心人皆有之，所有人都希望自己能夠永遠年輕、漂亮，很多人都將目光轉向了各種能提升自己的外表形象的方法。皮膚作為人體最大的組織器官，覆蓋於人體的外表，是美學美容研究的主要組織器官。研究表明，皮膚表皮細胞的自我更新、再生修復以及衰老退變是由來自毛囊或表皮基底層的成體幹細胞——表皮幹細胞的增殖分化所決定的。對於表皮幹細胞的深入研究，將對燒創傷創面修復機制、皮膚年輕醫學美容提供強有力的實驗依據及新技術、方法。由於幹細胞所具有的這種巨大前景，很快的得到了美容市場的關注，越來越多的專家和學者開始著手研究幹細胞美容。
目前，市場上關於表皮幹細胞的獲得和製備方法並沒有相關報導，因此如何製備表皮幹細胞用於研究和產業應用是亟待解決的問題。
技術實現要素：
本發明的第一目的是提供一種定向誘導幹細胞分化成表皮幹細胞的誘導劑。
本發明的上述技術目的是通過以下技術方案得以實現的：一種誘導劑，其中：包括幹細胞生長肽、抗壞血酸、維甲酸和亞硒酸鈉。
作為優選方案，所述幹細胞生長肽：抗壞血酸：維甲酸：亞硒酸鈉=1mg：0.8mol:0.2mol： 0.3mg。
作為優選方案，所述幹細胞生長肽為自體細胞生長肽。
作為優選方案，誘導劑還包括β-巰基乙醇。
作為優選方案，幹細胞生長肽：β-巰基乙醇=1mg：0.5～0.8mg。
自體細胞生長肽提取自生物本體的纖維細胞的生長因子，由於自體使用，排斥性低，使用安全性高。
維甲酸是體內維生素A的代謝中間產物，能夠促進表皮幹細胞的增長，對幹細胞定向誘導成為表皮幹細胞具有促進作用。
抗壞血酸具有抗癌的作用，能夠防止幹細胞癌變，保證產生的細胞為健康細胞，且能避免細胞由於缺少維生素C而病變，保證細胞的正常生長繁殖。
本發明的第二發明目的在於提供一種高效的製備表皮幹細胞的方法。
本發明的上述目的是通過如下技術方案實現的：一種採用權利要求1-5任一所述誘導劑製備表皮幹細胞的方法，包括如下步驟：
步驟一：將幹細胞製成單細胞懸液，將單細胞懸液計數後用培養基將其稀釋成細胞濃度為105～107cells/ml，在培養基內培育繁殖3-5h，培養基置於5%，37℃培養箱中培養;
步驟二：將誘導劑按10g/L的數量加入培養基，誘導分化繁殖12h;
步驟三：用PBS緩衝液衝洗掉除細胞外的物質，用DK-SFM培養基重懸細胞，計數並以1×106/ml細胞量接種於已包被IV型膠原的培養皿中，置於37℃的培養箱中10~15min，吸棄未貼壁細胞，再用PBS緩衝液衝洗，得到表皮幹細胞。
作為優選方案，所述培養基包括胎牛血清、L-穀氨醯胺、青黴素、鏈黴素和DMEM培養液。
作為優選方案，所述DMEM培養液為低糖型DMEM培養液。
作為優選方案，所述DMEM培養液：胎牛血清的體積比為4:1。
作為優選方案，所述幹細胞為胚胎幹細胞或iPS誘導幹細胞。
低糖型DMEM培養液有利於細胞在培養基中分散生長，避免細胞生長過快，保證了後續步驟分離的便利性，使表皮幹細胞能充分分離出來。
青黴素和鏈黴素具有較好的抗菌效果，從而保證可以殺滅大部分細菌，避免培養基被細菌汙染，危害幹細胞的分化增殖。
胎牛血清由於還未接觸外界，血清中所含的抗體、部體等對細胞有害的成分最少，能提供維持細胞指數增長的激素，並且胎牛血清中含有結合蛋白質能與有毒金屬和熱原質結合，具有解毒作用；同時DMEMK培養液中具有較多的胺基酸等營養成分，能夠促進細胞的快速生長。
具體實施方式
本申請中胚胎幹細胞，取自人類免疫缺陷病毒、A肝、B肝以及梅毒等血清學反映呈陰性的健康產婦，並經患者及家屬知情同意；DK-SFM培養基為上海信帆生物科技有限公司供應的Defined Keratinocyte-SFM（1X）培養液製成的培養基。
實施例一：
一種誘導劑，包括1mg/L的幹細胞生長肽、0.8mol/L的抗壞血酸、0.2mol/L的維甲酸、0.3mg/L的亞硒酸鈉和0.5mg/L的β-巰基乙醇。
採用上述誘導劑從胚胎幹細胞誘導分化表皮幹細胞包括如下步驟：
步驟一：將幹細胞製成單細胞懸液，將單細胞懸液計數後用培養基將其稀釋成細胞濃度為107cells/ml，在培養基內培育繁殖5h，培養基置於5%，37℃培養箱中培養;
步驟二：將誘導劑按10g/L的數量加入培養基，誘導分化繁殖12h;
步驟三：用PBS緩衝液衝洗掉除細胞外的物質，用DK-SFM培養基重懸細胞，計數並以1×106/ml細胞量接種於已包被IV型膠原的培養皿中，置於37℃的培養箱中10min，吸棄未貼壁細胞，再用PBS緩衝液衝洗，得到表皮幹細胞。
其中培養基內包括濃度為1000mg/L的低糖型DMEM培養液800ml、胎牛血清200ml以及適量的L-穀氨醯胺、青黴素和鏈黴素。
所得到的細胞呈集落生長，排列緊密，呈圓形或者橢圓形，邊界清晰，免疫組織化學顯示呈現有表皮幹細胞特異性標識：β1整合素，同時細胞角蛋白15和細胞角蛋白19呈強陽性，可見成功誘導分化出表皮幹細胞。
實施例二：
一種誘導劑，包括1mg/L的幹細胞生長肽、0.8mol/L的抗壞血酸、0.2mol/L的維甲酸、0.3mg/L的亞硒酸鈉和0.5mg/L的β-巰基乙醇，其中幹細胞生長肽選用人體表皮細胞生長肽。
採用上述誘導劑從iPS誘導幹細胞誘導分化表皮幹細胞包括如下步驟：
步驟一：將幹細胞製成單細胞懸液，將單細胞懸液計數後用培養基將其稀釋成細胞濃度為105cells/ml，在培養基內培育繁殖3h，培養基置於5%，37℃培養箱中培養;
步驟二：將誘導劑按10g/L的數量加入培養基，誘導分化繁殖12h;
步驟三：用PBS緩衝液衝洗掉除細胞外的物質，用DK-SFM培養基重懸細胞，計數並以1×106/ml細胞量接種於已包被IV型膠原的培養皿中，置於37℃的培養箱中15min，吸棄未貼壁細胞，再用PBS緩衝液衝洗，得到表皮幹細胞。
其中培養基內包括濃度為1000mg/L的低糖型DMEM培養液800ml、胎牛血清200ml以及適量的L-穀氨醯胺、青黴素和鏈黴素。
所得到的細胞呈集落生長，排列緊密，呈圓形或者橢圓形，邊界清晰，免疫組織化學顯示呈現有表皮幹細胞特異性標識：β1整合素，同時細胞角蛋白15和細胞角蛋白19呈強陽性，可見成功誘導分化出表皮幹細胞。
實施例三：
一種誘導劑，包括1mg/L的幹細胞生長肽、0.8mol/L的抗壞血酸、0.2mol/L的維甲酸和0.3mg/L的亞硒酸鈉。
採用上述誘導劑從胚胎幹細胞誘導分化表皮幹細胞包括如下步驟：
步驟一：將幹細胞製成單細胞懸液，將單細胞懸液計數後用培養基將其稀釋成細胞濃度為107cells/ml，在培養基內培育繁殖5h，培養基置於5%，37℃培養箱中培養;
步驟二：將誘導劑按10g/L的數量加入培養基，誘導分化繁殖12h;
步驟三：用PBS緩衝液衝洗掉除細胞外的物質，用DK-SFM培養基重懸細胞，計數並以1×106/ml細胞量接種於已包被IV型膠原的培養皿中，置於37℃的培養箱中10min，吸棄未貼壁細胞，再用PBS緩衝液衝洗，得到表皮幹細胞。
其中培養基內包括濃度為1000mg/L的低糖型DMEM培養液800ml、胎牛血清200ml以及適量的L-穀氨醯胺、青黴素和鏈黴素。
所得到的細胞呈集落生長，排列緊密，呈圓形或者橢圓形，邊界清晰，免疫組織化學顯示呈現有表皮幹細胞特異性標識：β1整合素，同時細胞角蛋白15和細胞角蛋白19呈強陽性，可見成功誘導分化出表皮幹細胞。
本具體實施例僅僅是對本發明的解釋，其並不是對本發明的限制，本領域技術人員在閱讀完本說明書後可以根據需要對本實施例做出沒有創造性貢獻的修改，但只要在本發明的權利要求範圍內都受到專利法的保護。