使用3sr擴增法原位檢測核酸的製作方法

2023-12-03 22:29:31

專利名稱：使用3sr擴增法原位檢測核酸的製作方法
技術領域：
本發明涉及使用核酸探針檢測核酸。
可使用特異性核酸探針，以其中探針與待檢測RNA分子反應的雜交反應來檢測引起感染其他疾病和遺傳紊亂的細胞和病毒RNA。一個特別有用的方法是使用這樣的原位雜交反應方法，即其中可使被分析的細胞或病毒保持完整並在細胞內發生雜交反應。然而通常被檢測之RNA的拷貝數很小，甚至可能在給定的細胞中只存在單一拷貝。拷貝數目越小檢測感興趣的RNA分子就越困難。
解決小拷貝數問題的一種手段是使用擴增方法。已使用3SR擴增方法將在純化的無細胞核酸群體中的RNA分子進行擴增(D.Y.Kwoh et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.86，1173-1177，(1988)。該反應是將單股分析物RNA分子酶促轉化為具有擴增酶的結合區(即聚合酶的啟動子)和一股該分析物分子的等同物的雙股DNA分子。RNA聚合酶結合到啟動子上並進而產生DNA分子之一條鏈的多個RNA轉錄本。使用該多個RNA轉錄本作為起始材料進行新輪次的擴增。
已報導了使用3SR來擴增純化的已除去大部分或全部其他細胞材料的RNA分子。因此該報導尚待解決的問題是，是否3SR擴增可以在原位有效地完成，現實是3SR反應必須發生在基本上完整的細胞內，而且常常是為了保持細胞的形態學而已用交聯劑和/或沉澱固定液對細胞進行了處理。原位雜交所面臨的問題包括酶要進入細胞內，酶在細胞仍能發揮其功能，以及避免本不存在於純化之RNA群體中的非特異性本底來源。雖然已向PCR擴增方法提出了這類性質的問題(M.J.Embleton et al.，Nucleic Acids Research，vol 20，pp3831-3837，(1992))，但因為PCR擴增法所使用的酶和所檢測的靶分子均不同於3SR擴增，所以PCR所能解決的問題只是有限地預測3SR獲得成功的程度。
感興趣的RNA分子中，一種類型是哪些產生於已進行染色體易位的細胞中的RNA，特別是哪些轉錄原點處於或接近於由兩個正常分離的染色體片段連接所產生之接合點的RNA。已有人使用核酸技術來檢測由於染色體易位所產生的核酸(M.J.Embleton，et al，文獻同上;Fritsch et al.，US Patent 4，725，536;Stephenson et al.，US Patent 4，681，840)。
在一特別有用的實施方案中，使用3SR原位檢測只出現於已經進行染色體易位的細胞，特別是各種類型腫瘤細胞內的RNA分子。
為了提高原位3SR反應的總體速度和/或效率，本文公開了並與3SR結合使用的附加增強技術發明。這樣的一個發明是使用對分析物RNA分子的易位接合區域特異的3SR探針或引物。本發明的其他方案涉及使用通透和信號增強劑，使用本底降低劑，以及使用改良的探針。
本發明一部分涉及原位檢測RNA分子的3SR擴增方法。本發明還涉及使用下列的一種或多種發明以改善原位3SR方法的反應速度和/或敏感性在雜交期間使用的通透增強劑，增強螢光探針信號的信號增強劑，探針之螢光檢測期間的本底降低劑，用於降低本底螢光的游離基清除劑，每個探針上的多個報導基團，以及用以降低雜交本底的報導基團類似物。本發明還使用了只與跨越得自己進行染色體易位之細胞中的RNA分子上易位接合點的順序雜交的短探針。
「分析物RNA分子」是指所設計的檢測法要檢測的分子。
「擴增RNA分子」是指使用擴增方法產生的RNA分子。其具有互補於所有或部分RNA分析物分子的核苷酸順序或具有等同於全部或部分分析物RNA分子的核苷酸順序。
「探針」是指含有寡核苷酸並且通常還包含報導成分的分子，其中報導物是可檢測的，寡核苷酸可與擴增RNA分子雜交。報導物部分可以是放射活性物質、螢光材料、化學發光劑、酶(如鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶或其他催化顯色反應的酶)，或能與直接連接到可檢測部分如放射活性物質、螢光材料、化學發光劑或酶上的配體特異性結合分子(如鏈黴抗生物素蛋白)發生特異性反應的配體。
如果按「Watson-Crick」鹼基配對規則定義兩條順序的關係即一個順序中有鳥嘌呤(G)，另一個順序中便有胞嘧啶，而一個順序中有腺嘌呤(A)，另一個順序中便有胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)，此時即認為第一個核苷酸順序互補於第二個核苷酸順序。
「雜交體」是指由兩個核酸分子形成的雙股(或部分雙股)分子，其中一個分子具有互補於另一個分子中之順序的核苷酸順序。
如果兩個核苷酸順序完全相同，或者除了一個順序是DNA順序而另一個順序是其中由尿嘧啶代替胸腺嘧啶的RNA順序外兩順序完全相同時，則認為第一個核苷酸是第一個核苷酸順序的「等同物」。
當兩個染色體片段因易位而接合在一起形成一個新的染色體時，則兩片段接在一起的這一點即為「染色體易位接合點」。
「核苷酸順序」這一術語也包括其中在正常情況下存在核苷間磷的某些位置上有某些磷以外之原子(如硫)的順序。
「跨越易位接合點的RNA分子」是指包含從染色體易位接合點兩側上的部分染色體轉錄之核苷酸順序的RNA分子(如hnRNA或mRNA分子)。例如，可通過細胞加工跨越易位接合點的hnRNA分子在細胞內產生跨越易位接合點的mRNA分子。
「跨越易位接合點的RNA片段」是指任何包含從染色體易位接合點兩側上的部分染色體轉錄之核苷酸順序的RNA分子片段。
「跨越易位接合點的擴增RNA分子」是指其部分或全部核苷酸順序互補或等同於跨越接合點之RNA分子或RNA片段的擴增RNA分子。
「引物」是指在3SR方法中藉助反向轉錄酶延伸成較長分子的寡核苷酸。
「跨越易位接合點的引物」是指具有互補或等同於跨越接合點之RNA小片段的核苷酸順序的引物。
「原位」是一個用來描述發生於基本上完整的細胞或病毒內之過程(如雜交或3SR)的術語;細胞或病毒常常是已用許多但並非所有本文定名的交聯或沉澱固定劑處理的。
「跨越易位接合點的探針」本文所說的「生物實體」是細胞或病毒。
3SR方法是一種利用反向轉錄酶，DNA依賴性RNA聚合酶，RNaseH，寡核苷酸引物，三磷酸脫氧核糖核苷(5′-三磷酸脫氧腺苷、5′-三磷酸脫氧胞苷、5′-三磷酸鳥苷和脫氧胸苷;dATP、dCTP、dGTP和dTTP)、三磷酸核糖核苷(5′-三磷酸腺苷，5′-三磷酸胞苷，5′-三磷酸鳥苷，5′-三磷酸尿苷;ATP，CTP，GTP，UTP)和適當的試劑如緩衝液，鹽和二價陽離子，以便產生至少分析物RNA分子之一部分或全部分析物RNA之多個拷貝的方法。一個引物將是互補於有意義分析物RNA分子的一部分，而其他引物則將等同於有意義分析物RNA分子的一部分。至少引物之一具有一個不互補或等同於分析物RNA分子之一部分的部分，但更好的是DNA依賴性RNA聚合酶的雙股啟動子的一股。
該過程進行下去是由於引物之一與分析物RNA分子雜交，然後使用反向轉錄酶延伸該引物，從而形成至少一部分分析物RNA分子的cDNA拷貝。然後用RNaseH破壞分析物RNA分子。將第二個引物退火到cDNA分子上並用反向轉錄酶延伸引物以形成第二條互補於cDNA分子的DNA鏈。第二條DNA鏈將具有等同於原分析物RNA分子之一部分的核苷酸順序。經上述步驟後即得到雙股模板DNA分子。
經連續延伸兩引物而形成的雙股模板DNA分子將具有一個或兩個DNA依賴性RNA聚合酶的啟動子。如果第一個引物具有這樣一個啟動子的一條鏈，則當其延伸第二個引物時即可藉助反向轉錄酶產生該啟動子的經二條鏈。如果第二個引物具有這樣一個啟動子的一條鏈，則在其延伸第二個引物的同時反向轉錄酶進一步將cDNA分子延長直至得到完整的第二條啟動子鏈。
用DNA聚合酶繼續此3SR過程，即可使擴增RNA分子的每條鏈互補於模板DNA分子的鏈。藉助於正如擴增分析物分子時所用的酶和引物來自身擴增如此形成的擴增分子。
原位3SR方法在總的方面，本發明涉及用來檢測生物實體(特別是細胞且較好是真核細胞;尤其是人細胞)中分析物RNA分子的「原位3SR方法」，該方法包括以下步驟1)在反向轉錄酶DNA依賴性RNA聚合酶(較好是原核生物來源的)、RNaseH，各自由寡核苷酸組成的第一引物和第二引物(必要時也可以是三磷酸脫氧核糖核苷和三磷酸核糖核苷以及緩衝液、鹽、二價陽離子等反應溶液試劑)存在下，保溫生物實體，從而產生具有互補或完全相同於所說分析物RNA分子(擴增步驟)中核苷酸順序之核苷酸順序的擴增分子。
2)在所說的生物實體中形成探針分子和所說之擴增分子之間的雜交體(「雜交步驟」)，並3)檢測所說的雜交體中的探針分子(「檢測步驟」)，其中第一引物包括互補於分析物RNA分子之第一核苷酸順序的核苷酸順序，其中第二引物包括等同於分析物RNA分子之第二核苷酸順序的核苷酸順序，其中所說第一核苷酸順序位於定位在所說第二核苷酸順序和分析物分子之3′末端之間的分析物RNA分子中，其中所說的兩個引物中至少有一個包含所說聚合酶的啟動子核苷酸順序，而且其中探針包括核苷酸順序互補於所說擴增分子之一中的核苷酸順序的寡核苷酸。
前述方法特別適於檢測在已經進行染色體易位之細胞內跨越易位接合點的RNA分子。這是基於如果分析物分子含有互補於第一引物之核苷酸順序的核苷酸順序和等同於第二引物之核苷酸順序的核苷酸順序，則將發生分析物分子的擴增這一事實即如果選擇這樣兩個分析物分子的核苷酸順序，使得一個是在易位接合點的「3′側」上，而另一個是在「該接合點的5′側」上，正常細胞沒有可被擴增的分子，在正常細胞中確實會有某些具有第一分析物分子核苷酸順序的分子，以及具有第二分析物分子核苷酸順序的分子，但不會存在具有這兩種順序的分子。只有在發生了染色體易位的情況下才會存在帶有這兩種順序的分子。
在分析物分子具有易位接合點時，可通過選擇其中一個探針(或報導物-探針)以使其包括的核苷酸順序是跨越易位接合點的順序而且相當短，從而改善該方法的特異性。如果後一順序足夠短，它必將完全穩定地雜交只有已經歷染色體易位的細胞才會產生就核苷酸順序來說跨越易位接合點的探針與之完全互補的分析物分子。
也可使用跨越易位接合點的引物來擴展使用跨越接合點之探針的戰略。
在本發明的一個特定方案中，使報導物-探針雜交到經步驟(1)產生的擴增RNA分子上以完成步驟(2)，每個所說的報導物探針均包含可檢測的報導物基團和含有互補於所說的擴增RNA分子的鹼基順序之鹼基順序的寡核苷酸。
引物是作為反向轉錄酶的引物使用的。啟動子核苷酸順序的啟動子區，如果存在的話，將作為DNA依賴性RNA聚合酶啟動子的一半，而另一半則是鹼基順序互補於該啟動子區的DNA。引物也可以具有作為DNA依賴性RNA聚合酶啟動子之一半的啟動子區。
跨越接合點之探針或引物的設計在本發明中，當跨越接合點的引物或探針與細胞中跨越接合點的RNA分子雜交時，雜交是在其中探針不與非跨越接合點分子之分子雜交的條件(溫度、時間、離子強度等)下完成的。雜交的這種選擇性是通過適當地選擇引物或探針的長度，以及按下述原則適當地選擇雜交條件而實現的對於任何單股分子對來說，如果一個在其本身序列內具有互補於第二個分子中核苷酸順序的核苷酸順序，而且這兩個順序都有N個核苷酸長(每一分子的總長度可以大於N)，則這些分子將只在N大於某些臨界值時才能形成雜交體。該臨界值將部分地取決於雜交條件(溫度、溶劑的選擇等)，部分地取決於互補順序的核苷酸組成。
可通過改變雜交條件和/或探針分子的鹼基順序來改變N的臨界值。可藉助常規實驗來確定任何一組雜交條件的臨界值，並從而完成本發明的方法。
N必須超過臨界值這一事實為檢測包括接合點的核酸順序提供了基礎。正常細胞的核酸將具有這兩部分順序，但這兩個部分不會連接在一起。因此，如果探針互補於接合點一側上不多於N-1個核苷酸的順序(或較好不超過N-3個核苷酸的順序)，並且互補於接合點另一側上不多於N-1個核苷酸的順序(或較好不多於N-3個核苷酸的順序)，則其將不與正常細胞核酸雜交。
更可取的是，跨越易位接合點的探針或引物具有互補於長度為20至50個核苷酸(更好是20至35個核苷酸)之跨越易位接合點片段的順序的核苷酸順序。與探針或引物互補的跨越接合點的片段的一半序列最好是在含該片段之易位接合點的一側上(這就意味著另一半將在該接合點的另一側上)。
3SR原位方法的增強在本發明原位3SR方法的優選實施方案中，本發明還使用下列屬於本發明內容的材料或方法來改善3SR原位方法的速度和/或敏感性雜交過程中的通透增強劑、增強螢光探針信號的信號增強劑、探針之螢光檢測期間的本底降低劑、降低本底螢光的游離基清除劑，每個探針的多個報導物基團，以及降低雜交本底的報導基團類似物。下面將分別對這些增強因子作更詳細描述。
通透增強劑的信號增強劑在3SR原位方法的另一個方案中，使用通透增強劑從而在含有選自二甲基亞碸(DMSO)，醇，脂族烷烴、烯烴，環糊精，脂肪酸酯、醯胺或內醯胺及有機矽烷這一組中的化合物的溶液內完成步驟(2)。
如將該組的化合物加入到檢測溶液中即可最終觀察到信號的增強這一事實，強有力地提示這樣一種化合物即是通透增強劑。這些基礎上，上述發明即在本文中稱為「通透增強劑修飾的」方法。該命名可用來將本發明的這一個方案同「下文所述的」信號增強劑修飾的」方法區分開，其中在從檢測溶液中除去細胞或病毒後加入增強化合物，特別是在作為該檢測法之最後步驟的螢光檢測期間存在增強化合物。
在通透增強劑修飾的方法的優選方案中，其中用於步驟(2)中的檢測溶液包含核酸探針和DMSO(2-20%)及一種或多種選自醇(2-20%)、脂族烷烴(2-20%)、烯烴(2-20%)、環糊精(2-20%)，式R1(COO)R2的脂肪酸酯(2-20%)，式R3(NH)(CO)R4的醯胺或內醯胺(2-15%)，式(SiR5R6R7)N(SiR8R9R10)，(SiR5R6R7)-(SiR8R9R10)，(SiR5R6R7)O(SiR8R9R10)或(SiR5R6O)(SiR7R8O)(SiR9R10)的有機矽烷(2-20%)這一組中的化合物，且DMSO和選自該組中之化合物的合併體積不超過檢測溶液的30%(v/v)。
在通透增強劑修飾的方法的組合方面，用於步驟(2)中的檢測溶液包含核酸探針和DMSO(2-20%)及一種或多種選自由醇(2-20%)、脂族烷烴(2-20%)、烯烴(2-20%)、環糊精(2-20%)，式R1(COO)R2脂肪酸酯(2-20%)，式R3(NH)(CO)R4的醯胺或內醯胺(2-15%)，式(SiR5R6R7)N(SiR8R9R10)、(SiR5R6R7)-(SiR8R9R10)，(SiR5R6R7)O(SiR8R9R10)或(SiR5R6O)(SiR7R8O)(SiR9R10O)的有機矽烷(2-20%)組成的組中的化合物，DMSO和選自該組中之化合物的合併體積不超過檢測溶液的30%(v/v)。
在通透增強劑修飾的方法的另一變化形式中，除了DMSO外，至少還使用選自該組中的烷烴或(較好)烯烴，以及另一種化合物。最好選自有上述優選結構的化合物。
在通透增強劑修飾的方法的一個特定實施方案中，檢測溶液含有約10%(v/v)Triton X-100。
在通透增強劑修飾的方法的特別優選的實施方案中，選自該組中的化合物只是DMSO且DMSO的體積佔檢測溶液的2-20%(v/v);DMSO的體積最好約佔檢測溶液的10%(v/v)。
化合物濃度最好足夠低，以使之不會從溶液中沉澱出來，而且溶液中的其他化合物也不致於形成沉澱。當加至10%或更高濃度時，烷烴特別是角鯊烷和結構上與之相似或大於角鯊烷的烷烴，以及醇特別是油醇和結構上與之相似或大於油醇的醇，可依賴所存在的其他成分，而從檢測溶液中沉澱出來。
優選的化合物包括角鯊烷、十二烷醇、β-環糊精、棕櫚酸異丙酯，1，2-丙二醇，六甲基二矽氧烷，以及油醇，吡咯烷酮(Pyr-rolidinone)和角鯊烷。優選的組合是使用大約10%DMSO加大約10%吡咯烷酮。另一優選的組合是大約10%DMSO加大約5%角鯊烷務5%吡咯烷酮。
在信號增強劑修飾的方法的另一個優選實施方案中，3SR原位方法的步驟(3)包括至少三個如下述的步驟3A、3B和3C，為此須在步驟3B之前完成3A，並在步驟3C之前或差不多同時完成步驟3B(3A)從檢測溶液中除去細胞，(3B)向懸浮有細胞的溶液中內加入信號增強化合物，(3C)檢測作為信號的直接或間接由靶結合的探針分子產生的光量子。
信號增強化合物選自醇、脂族烷烴、糖、脂肪酸酯、醯胺或內醯胺及有機矽烷。
由探針分子的螢光部分發射的光量子被看作是由靶結合的探針分子直接產生的光量子。由於裂解某化學發光基團中報導物基團(如異魯米諾)內的化學鍵而發射的光量也被認為是直接由報導基團發射的光子。作為放射活性報導基團發射放射能的結果而由閃爍液發射出的光量子被認為是由報告基團間接產生的量子。
最好在進行信號檢測，即步驟(4)期間將信號增強劑加到懸浮細胞的溶液(「檢測溶液」)中。
將該組中化合物加入到檢測溶液中可增強最終觀察到的信號這一事實有力地表明所說的化合物即是信號增強劑。
在信號增強劑修飾的方法的優選實施方案中，檢測溶液包含一種或多種選自醇(2-20%)、脂肪族烷烴(2-20%)、烯烴(2-20%)、環糊精(2-20%)、式R1(COO)R2的脂肪酸酯(2-20%)、式R3(NH)(CO)R4的醯胺或內醯胺(2-15%)，和式R5SiOSiR5的有機矽烷(2-20%)，其中DMSO和選自該組中的化合物的合併體積不超過檢測溶液的30%(v/v)。
優選的化合物包括角鯊烷、β-環糊精、六甲基二矽氧烷、以及油醇、吡咯烷酮、角鯊烷，特別是棕櫚酸異丙酯，1，2-丙二醇和十二烷醇。使用這些優選化合物，可使靶產生的信號對本底信號的比例增加達大約3至4倍。較好的組合是約10%DMSO加約10%吡咯烷酮。另一較好的組合是約10%DMSO加5%角鯊烷和5%吡咯烷酮。
使用的結構通式結構通式R1(COO)R2代表有下列結構的化合物。
R3(NH)(CO)R4代表有下列結構式的化合物
式(SiR5R6R7)N(SiR8R9R10)代表有下列結構式的化合物
式(SiR5R6R7)-(SiR8R9R10)代表有下列結構式的化合物
式(SiR5R6R7)O(SiR8R9R10)代表有下列結構式的化合物
式(SiR5R6O)(SiR7R8O)(SiR9R10O)代表有下列結構式的化合物
在本發明方法中使用這些化合物或合用如此規定的增強劑也是本發明的一部分。
因此，例如根據本發明的這一方面的藥盒應包含探針分子和選自二甲基亞碸(DMSO)、醇、脂族烷烴、環糊精、脂肪酸酯、醯胺或內醯胺以及有機矽烷這一組中的化合物。此外，例如另一藥盒包含探針分子和含有一種或多種選自DMSO、醇、脂族烷烴、環糊精、脂肪酸酯、醯胺或內醯胺，以及有機矽烷這一組中之化合物的溶液，其中化合物的總體積不超過溶液的20%(v/v)。
在前述方法，溶液和藥盒中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10是烷烴結構。
R1和R2可以共價結合形成環結構。
R3和R4可以共價結合形成環結構。
在前述方法中，在化合物後面的括號中指定的百分數是指作為檢測溶液的百分比(v/v)表示的化合物的濃度。
更優選的是，醇具有2至40個碳原子;脂族烷烴有10至60個碳原子;烯烴有10至60個碳原子;R1至2合在一起有3至20個碳原子，其中R1和R2不是共價結合以形成環時，R1和R2各有至少1個碳原子;R3加上R4一起有2至20個碳原子，且當R3和R4不是共價結合成環時，R3和R4各有至少1個碳原子;而且R5、R6、R7、R8、R9和R10各有至少1個碳原子，這樣烷基碳結構R5、R6、R7、R8、R9和R10一起共有不超過20個碳原子。
在更為優選的方法實施方案中，醇有3到30個碳原子，脂族烷烴有20至40個碳原子，R1加上R2一起有3至10個碳原子，且其中R1和R2不是共價結合成環時，R1和R2各有至少3個碳原子;
R3和R4加在一起有3至10個碳原子，如當R3和R4不是共價結合成環時，R3和R4各有至少1個碳原子;而且R5、R6、R7、R8、R9和R10各有至少1個碳原子，六個烷基碳結構，R5、R6、R7、R8、R9和R10一起共有不超過10個碳原子。
用作通透增強劑的優選烯烴是其中碳-碳雙鍵對碳-碳單鏈之比小於1比3的烯烴。最優選的比例是小於1比10。
降低本底化合物在3SR原位方法的特定實施方案中，步驟3至少包括如下述的3A、3B和3C這三個步驟，其中步驟3A發生在步驟3B之前，且步驟3B是在步驟3C之前或基本上是與步驟3C同時進行的，如下(3A)從完成步驟(2)的溶液中除去細胞(或病毒)，(3B)使細胞暴露於有螢光探針分子之吸收波長的光，並且(3C)檢測以螢光探針的發射波長發射的光的量;
其中在步驟(1)開始後和步驟(3C)終止前的時間，在懸浮有細胞的溶液中存在降低本底化合物;
降低本底化合物包括帶有結構不同於螢光探針之螢光染料部分的光吸收部分；降低本底化合物具有的吸收波長範圍(當該方法進行時它吸收此波長範圍的光)覆蓋了螢光探針的發射波長範圍部分波長(由探針發射之光的波長範圍)，步驟(3C)中在該範圍內檢測光量。
在步驟(3B)和(3C)中，降低本底化合物最好是在懸浮有細胞(或病毒)的溶液中。為使光吸收化合物就波長範圍來說成為有效的本底降低劑，其在該範圍中的平均摩爾消光係數較好是在範圍為520nm至560nm之錐蟲藍的平均摩爾消光係數的至少2%;更好是在該範圍內摩爾消光係數為範圍在520至560nm錐蟲藍之平均摩爾消光係數的至少10%。
因為許多細胞螢光檢測法是在可見光即約400nm至660nm範圍內進行的，所以在該波長範圍內有效的本底降低劑是特別有價值的。但有的細胞螢光檢測並不需要在可見光範圍內進行，因此在特定情況下也可使用在250到1000nm範圍內有吸收的本底降低劑。實際上本發明的原理可應用於能使用細胞螢光檢測器檢測的任何波長。
本文所說的「光」是指通過流式細胞計數器或使用螢光顯微鏡之觀測器或照相機檢測的光。為此，在正常情況下，應是可見光，但對於特殊檢測目的來說，細胞計數器或顯微鏡改為檢測能量大於或低於可見光的光子，為此目的該光子也被看作是所說的術語「光」。
因為降低本底化合物的光吸收部分具有與螢光探針的螢光染料部分不同的結構，所以正常情況下應有所需特性，即如果它確實發射光(即它是一種螢光化合物)，則將具有不同於螢光部分的發射光譜(即對於被吸收的給定波長光的給定量而言，作為波長之函數，發射光的強度將有所不同)。
假定本發明實施方案特別有效是部分因為降低本底化合物如探針一樣結合到至少某些相同的非特異性靶上，並且因為降低本底化合物和探針是處於十分靠近的位置，故降低本底化合物將吸收由探針發射的光。此外，降低本底化合物將吸收由細胞內非探針分子的自發螢光發射的光。在吸收由非特異結合的探針或自發螢光分子發射的光之後，本底化合物可在其自身發射光波長處發射光。由特異結合的探針分子發射的光被降低本底化合物吸收到較小程度;從而改善了該分析方法的總體敏感性。
最好在加入本底降低劑後的45分鐘內檢測螢光;但如果本底降低劑是在步驟(38)和(36)中使用的溶液中，則可等24小時再進行螢光檢測。
在本發明的一特別優選的方案中，該方法還包括在上述步驟(3A)和(3B)之間加入一個洗滌步驟。可將細胞或病毒從懸浮它們的溶液中離心出來，然後再將其懸浮於洗滌溶液中，並再次將細胞或病毒離心出來以完成洗滌步驟。洗滌溶液通常是無探針溶液，其中可以懸浮有或沒有降低本底化合物。
細胞應在含有降低本底化合物的無探針的溶液中保留足夠長時間，以使之吸收降低本底化合物。為此目的，一般是保留5分鐘，但這一時間可以有很寬的變動範圍。
探針將包含螢光染料。它也可包含共價結合到染料上的單股核酸(DNA或RNA)部分。所說的部分(moiety)是分子的一部分。例如，由核酸貢獻的探針部分即是核酸部分;由螢光染料貢獻的部分是螢光染料部分。可通過接頭進行共價連接，其中染料和核酸分子(或抗體)在不同位點連接到接頭分子上。
已公開了許多染料及其他光吸收化合物的最大發射或吸收波長數據(如參見Merck Index或Aldrich Chemical Company，Milwaukee，Wisconsin的商品目錄)。這些數據提示但沒有確定什麼化合物是適用的。掃描螢光儀給出完整的發射或吸收光譜。下面列出了適用於某些探針染料的某些降低本底化合物。就給定的探針染料來說，可以很容易地試驗降低本底化合物的效力。
常常被用作螢光探針染料螢光素的最大吸收波長約為488nm，且最大發射波長為大約525nm。可用作良好的本底降低劑的光吸收化合物包括偶氮染料衍生物，其具有一個多聚芳烴結合物部分，並且在該部分上有一個或多個極性基團如硝基(-NO2)、磺基(-SO3)或氨基(-NH2)基團。因為它們傾向結合於如非特異結合之探針所結合的同一蛋白質和膜上，所以可能是好的本底降低劑。
許多探針染料中，適用於本發明的少數幾個是螢光素，FITC、德克薩斯紅，香豆素，若丹明，藻紅素和Perci-P。
與探針染料螢光素(或異硫氰酸螢光素(FITC))一起使用的某些降低本底化合物是偶氮胭脂紅B、酸性紅114、伊凡斯氏藍、宮殿堅牢黑Wan，錐蟲藍，萘酚藍黑和硫代若丹明101(Sulforho-damine 101)。
與探針染料德克薩斯紅合用的某些降低本底化合物是萘酚藍黑和宮殿堅牢黑WAN。對於螢光素以外的探針染料，有用的降低本底化合物可不同於螢光素或FITC標記的探針合用的降低本底化合物。在用螢光檢測器、螢光顯微鏡或流式細胞計數器檢測的探針染料的發射波長範圍中，優選降低本底化合物具有平均摩爾消光係數在520nm至560nm範圍內之錐蟲藍的平均摩爾消光係數的至少2%(最好是10%)。
對於任何染料螢光探針來說，有許多化合物可用作本底降低劑。一般來說，所用本底降低的濃度可以在0.0002%和0.10%(w/v)之間。
游離基清除劑作為本底降低劑在3SR原位方法的另一個方面，特別是使用螢光報導物基團檢測步驟(3)期間形成的雜交體時，游離基清除劑存在於用來完成(1)、(2)和(3)中一個或多個步驟的反應混合物內。在這種情況下，步驟(3)包括使雜交的探針暴露於具有雜交之探針的螢光吸收波長的光，並檢測有雜交之探針的螢光發射波長的光。游離基清除劑最好存在於用來完成步驟(2)的反應混合物中。
在步驟(3)期間，最好選擇適當的游離基清除劑以符合使由清除劑發射的光量不超過清除劑引起的自發螢光的降低量這一條件要求。可通過一次不加清除劑，一次加清除劑這樣的兩次檢測過程(在兩種情況下，在檢測中可不用探針)來檢測某清除劑對給定的螢光吸收和螢光發射波長並存條件是否適宜。
游離基清除劑包括下列四類化合物1)氫供體化合物較好是有硫羥基團特別是連接到芳香基團上之硫羥基團的化合物，如苯硫酚。
2)不是供氫體組帶有能與其他游離基結合之游離基的化合物。例子包括N-羥基衍生物如染料Tempo、肼衍生物和偶氮衍生物，所說的偶氮衍生物中，通過雙鍵結合到另一個氮上，並通過單鍵連接到碳原子上的氮攜帶游離基。這些化合物最好有這樣一個結構，即可造成一種防止它們彼此相互反應的空間位阻，從而不必清除游離基。
3)對位羥基芳族化合物。維生素E(一種優選的清除劑)即是這一類中的化合物。
4)有不飽和碳原子(Koelch基團)的化合物。
其他人已鑑定了許多包括上述各類化合物的游離基清除劑。
可根據其在規定條件下作為游離基清除劑的能力來限定游離基基團清除劑。如果FRS代表作為游離基清除劑的待試化合物，則可利用下述三步驟檢測法證實FRS是游離基清除劑1)在5ml二甲基甲醯胺中混入FRS和10mg三氯乙醯過氧化物，以使FRS對三氯乙醯過氧化物的摩爾比例為2∶1。
2)將反應混合物加熱至80℃保持M分鐘。
3)用高效液相層板法(HPLC)(如果Cl3C-FSR不是揮發性的或氣相色譜法(如果Cl3C-FSR是揮發性的)分析反應混合物，並檢測Cl3C-FSR的量。根據所測得的Cl3C-FRS的量限定清除活性。
選擇適當時間M分鐘，以便如果用該方法試驗維生素E時，使轉化成Cl3C-維生素E之維生素E的百分比例小於100。一般說來，預期M小於10分鐘。
當在相同條件下試驗兩種化合物(如維生素E和另一種化合物)時，可經比較所形成的Cl3C-FRS的量來計算這兩種化合物的相對清除活性。如果某化合物所形成的Cl3C-FRS的量是當在檢測中加入維生素E時所形成之量的20%。則該化合物清除活性為維生素之清除活性的20%。
檢測清除活性的方法是基於一系列反應，其中包括在80℃下處理引起1分子三氯乙醯過氧化物分解，而產生兩分子游離基，Cl3C＊，再與游離基清除劑反應以產生Cl3C-FRS。
探針或化合物(如游離基清除劑)的螢光吸收波長是可被探針或化合物吸收的幅射波長(特別是紫外或可見光)，且如果被吸收，則可導致由該探針或化合物以長於螢光吸收波長的波長的發射光(特別是可見光)。上述較長波長是指「螢光發射波長」。螢光吸收波長最好是在大約420nm到460nm範圍內。螢光發射波長最好是在大約450nm至690nm範圍內。在實踐中，使探針群體暴露於吸收波長範圍，並在發射波長範圍內監測發射光。
螢光探針或化合物是具有螢光吸收波長和螢光發射波長的物質。
在本發明的螢光檢測法中，最好選用游離基清除活性至少為維生素E之該活性的1%的游離基清除劑(系每摩爾清除劑的清除活性，如果清除劑分子是其中各重複單元均有清除活性的聚合物，則重複單元的摩爾濃度可隨之改變);更優選的是游離基清除活性至少為維生素E之該活性的20%的清除劑，且最好選用至少與維生素E有同樣大清除活性的清除劑。
如果從實施例中看出的，一般該螢光檢測法可基本上同時用於大量細胞。
在該方法的一個優選方案中，步驟(5)包括檢測以大約520nm至560nm(特別是大約520nm)的波長發射的光，步驟(4)所檢測的吸收波長最好是小於520nm。
螢光檢測法的優選實施方案還包括在步驟(2)和(3)之間的洗滌步驟。可將細胞從懸浮它們的溶液中離心出來，然後重新懸浮於洗滌溶液中，其後再從中離心出來以完成洗滌步驟。洗滌溶液通常是無探針溶液。
游離基清除劑最好不是發射探針之螢光發射波長的光的螢光分子。具體地說，最好游離基清除劑既不吸收探針之螢光吸光波長的光，也不發射探針之螢光發射波長的光。
在該方法的特定實施方案中，步驟(3)中使用的溶液包含螢光探針，游離基清除劑和固定液。如在混合物中加入游離基清除劑，其濃度較好是0.1%至10%(v/v)。
多報導物標記的探針在本發明的優選實施方案中，探針包括一單股核酸部分和多個報導物部分，以使各報導物部分藉助接頭部分共價連接到中間原子上，該中間原子則連接到核酸部分的核酸間磷原子上。核苷間磷原子是位於核苷之間，而不是吸附在寡核苷酸的3′或5′端的一個核苷上，報導物部分較好是染料分子，且報導物部分最好是螢光染料部分。可用流式細胞計數器或在適於螢光檢測的顯微鏡下檢測螢光染料。
對於用來檢測細胞核內靶分子(如核DNA)的探針上的染料來說，探針的長度較好是小於約40個核苷酸。如果探針有7個染料分子，各分子的分子量約為500至600之間，並且有7個分子量與乙醯氨基部分分子量(約為60)相近的接頭部分和40個平均分子量約為345的核苷酸，則被標記之探針的分子量應約為20，000。為了進行特異性雜交，一般探針長度應至少有大約15個鹼基。
對於用來檢測細胞胞漿內核酸，特別是RNA的探針來說，較好選用長度不超過200個核苷酸(分子量不大於約100，000)的探針，但也可以使用例如1000個核苷酸長的較大寡核苷酸。
對於染料來說，最接近接頭部分的染料環至少要由兩個原子與磷分隔開(即「分隔長度」至少為兩個原子)。一般說來，優選的分隔長度為3至30個原子，更好是3至10個原子。
為了儘可能地減少潛在的抗雜交和驟冷影響，將結合染料的磷原子與寡核苷酸骨架上的下一個磷原子分開的平均核苷酸較好至少為4個原子。各磷原子最好由6個原子將其與寡核苷酸上的下個磷原子分隔開。
介於接頭部分和核苷間磷原子之間的原子例如可以是氧原子、硫原子或氮原子。如果中間介入原子是氧原子，即有一個核苷間磷酸三酯鍵;如果中間介入原子是硫原子，則有一個核苷間硫代磷酸三酯鍵;如果中間介入原子是氮原子，則有一個核苷間氨基磷酸三酯核苷間鍵(參見Agrawal and Jamecnik，Nucleic Acids Research，vol185419，(1990))，例如硫代磷酸三酯和氨基磷酸三酯鍵。三酯鍵包括見於天然核酸骨架上的二酯鍵加上位於磷原子和中介原子(介入磷原子和接頭部分之間的原子)之間的第三個酯鍵。
如果中介原子是硫原子，則接頭部分可以是乙醯氨基部分。在此情況下，如果染料是螢光素，則分隔染料分子環和核苷間磷原子的原子數目將是4(氮和乙醯氨基部分的兩個碳原子加上中間介入的硫原子)。
如果中介原子是氮原子，則接頭部分可以是氨己基部分。在此情況下，如果染料是螢光素，則分隔最接近接頭之染料分子環和核苷間磷原子的原子數目將是8，即包括氮和6個接頭部分的碳原子加上中間介入的氮原子。如果染料分子是異硫氰酸螢光素，則分隔最接近接頭之染料分子環和磷原子的原子將還包括另外兩個原子，即由異硫氰酸酯部分貢獻的氮和碳原子。
應明確的是，探針的核酸鏈與靶的核酸鏈雜交而形成雜交分子是因為這兩條鏈具有彼此互補的核苷順序(例如核苷的鹼基，腺嘌呤互補於另一核苷中的尿嘧啶或胸腺嘧啶，鳥嘌呤互補於胞嘧啶)，但並不一定是探針的整個核苷順序互補於靶的整個核苷順序。
可按需要選擇螢光染料。常用的螢光染料(注意帶有方便的接頭部分)是5-(2-碘乙醯)氨基)乙基)氨基)萘-1-磺酸，5-磺乙醯氨基螢光素、6-碘乙醯氨基螢光素、四甲基若丹明-5-碘乙醯胺、四甲基若丹明-6-碘乙醯胺、一溴二亞胺、赤蘚紅-5-碘乙醯胺、7-二乙氨基-3-((4′-碘乙醯氨基)苯基)-4-甲基香豆素、4′-((碘乙醯氨基)甲基)螢光素、赤蘚紅-5-碘乙醯胺、生物素碘乙醯胺、N-(1-芘)碘乙酸酯、生物素碘乙醯胺、N-(1-芘)碘乙酸酯、N-((2-(碘乙醯氧基)乙基)-N-甲基)氨基-7-硝基苯-2-並噁-1，3-二唑。
碘乙醯胺的許多可替代物之一是馬來醯亞胺。
為本發明之目的，優選的染料是7-二乙氨基-3-((4′-碘乙醯氨基)苯基)-4-甲基香豆素，特別是5-碘乙醯氨基螢光素、6-碘乙醯氨基螢光素、四甲基若丹明-5-碘乙醯胺、四甲基若丹明-6-碘乙醯胺和N-((2-(碘乙醯氧基)乙基)-N-甲基)氨基-7-硝基苯-2-並噁-1，3-二唑。
對於真核細胞的原位雜交來說，一溴二亞胺的效率較差，這可能是因為它不能有效地通過細胞膜。
重要的是，在雜交試驗條件下，報導物部分能穩定地連接到核酸探針部分上，給出足夠的信號，而且如果它是一種螢光染料，還具有適用的激發和發射波長。
在檢測細胞內分析物RNA分子的3SR原位方法的再一個實施方案中，在步驟(2)期間芳族報導物基團是探針分子的一部分，並且在完成步驟(3)之前將細胞與報導物基團的結構類似物一起保溫。優選是，在步驟(2)期間，該類似物存在於用來使探針分子與細胞內擴增分子雜交的同一溶液中另外步驟(3)是以一種將檢測報導物基團但不檢測類似物的方式完成的(如使用有將導致檢測報導物基團但不檢測類似物之激發和/或吸收波長的螢光探針)。
在本發明的一個次要方面，報導物基團是環狀化合物。在本發明的另一個次要方面，環將基團包括有不飽和鍵。在本發明的一個較窄的次要方面，環狀基團是芳族化合物(一個或多個苯環)。
較好的是，以摩爾量計類似物超過報導物基團的量，更好是類似物相當於報導物基團的至少10倍。
可以假定本發明的方法是基於類似物與報導物基團競爭非特異性結合位點。在使用金精或其衍生物與核酸探針結合時，另一個機制可能包括金精結合到蛋白質中本應結合報導物基團的活性位點上。
較好是選擇適當的類似物，以使之保留大多數或所有報導物基團的結構特徵。類似物可以具有探針所沒有的其他結構特徵。
類似物應能夠穿透細胞或病毒。在類似物是金精衍生物(玫紅酸衍生物)的情況下，較好是類似物在其芳族基團上帶有-CO2、-NH2、-OH或-SO3基等極性功能基團;其例子是鉻精花青R(chromoxane cyanine R)和鉻天青S。優選類似物的亞基團是封閉賴氨酸上NH2基團的亞基團。使報導物基團吸收能量，然後發射某些吸收的能量，並檢測所發射的能量，從而得以檢測螢光報導物基團。
使化學發光報導物基團進入反應如酶促反應中，導致能量以光的形式發射出來，從而得以檢測化學發光報導物基團。
其他報導物基團如生物素，因為它們能與例如直接或間接結合到酶(如能催化可檢測之反應的鹼性磷酸酶或辣根過氧化物酶)上的鏈黴抗生物素蛋白結合而得以被檢測。
本發明可使用的螢光素基團包括螢光素(或FITC)、德克薩斯紅、香豆素、若丹明、若丹明衍生物、藻紅素和Perci-P。
本發明可使用的化學發光基團包括異魯米諾(或4-氨基鄰苯二甲醯;參見Aldrich Chemical Co.，1990-91目錄，或參見Molecular Probes，Inc.，目錄)。
在本發明的一個優選方案中，當報導物基團是螢光素時，步驟(4)包括檢測波長在大約520nm和560nm之間(特別是約520nm)的發射光，步驟(3)的吸收波長最好是小於520nm。
螢光檢測法的優選方案進一步包括步驟(2)和(3)之間的洗滌步驟。可將細胞從懸浮它們的溶液中離心出來，然後再懸浮在洗滌溶液中，並從洗滌溶液中離心出來從而完成洗滌步驟。洗滌溶液通常是無探針溶液。
在本方法的特定實施方案中，步驟(2)中使用的溶液包含探針(包括報導物基團)、報導物基團的類似物、以及固定劑。這樣的探針溶液本身也構成本發明的一部分。
如果在步驟(2)所用的溶液中加入類似物，則其濃度較好為0.01至0.5%(特別是大約0.05至0.01%)(w/v)。
優選組合方式是螢光素或若丹明衍生物與金精、其衍生物或Napa-chrome Green合用。
探針核酸探針可以是DNA、RNA或包括DNA或RNA的寡核苷酸或多核苷酸。DNA或RNA可由鹼基脲嘌呤，尿嘧啶，胸腺嘧啶，鳥嘌呤，胞嘧啶或其任何天然或人造化學衍生物組成。探針能夠通過一種或多種類型的化學鍵，通常是通過氫鍵形成結合到互補或鏡象靶細胞基因順序上。
在加入到雜交溶液中之前，可對核酸探針進行可檢測性標記。另外，可以選擇能結合到雜交產物上的可檢測標記。可將用任何適用於本發明的檢測基團來標記探針。這樣的可檢測基團可以是任何有可檢測之物理或化學特性的材料。特別有用的酶促活性基團，如酶(參見Clin.Chem.，221243，1976)，酶底物(考見英國專利說明書1，548，741)，合酶(參見美國專利Nos.4，230，797和4，238，565)和酶抑制物(參見美國專利No.4，134，792)、螢光物質(參見Clin.Chem.，25353，1979)、發色團、發光物質如化學發光物質和生物發光物質(參見Clin.Chem.，25512，1979)、特別是可結合的配體、近端相互作用對以及放射性同位素如3H、35S、32P、125I和14C。
可藉助缺口翻譯、酶學或化學方法將生物素標記的核苷酸摻入到DNA或RNA中。使用抗生物素蛋白/鏈黴抗生物蛋白、螢光、酶或膠體金結合物雜交後檢測生物素化的探針。也可以使用其他螢光化合物、可進行免疫檢測的螢光衍生物或生物素類似物標記核酸。也可藉助與蛋白質連接來標記核酸。也可使用與放射活性物質或螢光組蛋白HI、酶(鹼性磷酸酶和過氧化物酶)或單鏈結合(ssB)蛋白質交聯的核酸。為了增加檢測膠體金或過氧化物酶產物的敏感性，可使用多種利用銀溶液完成的增強或放大方法。
也可使用間接螢光免疫細胞化學方法(Rudkin and Stollar，Nature 265472，1977;Van Prooijen et al.，Exp.Cell Res.，141397，1982)。經給動物注射poly(rA)-poly(dT)而產生抗RNA-DNA雜交體的多克隆抗體。DNA探針與細胞原位雜交，並且用抗RNA-DNA雜交體的抗體進行保溫而檢測雜交體。
發光生物素TM(PhotobiotinTM)標記探針優於生物素標記。
細胞、組織和體液中的靶分析物RNA可定位於細胞或病毒生物實體中。可將細胞或病毒懸浮於溶液中而不固定在固相載體上。另一方面，也可將細胞或病毒固定在固相載體上。細胞或病毒可以是組織切片(組織學切片)的一部分。
在本方法的一個實施方案中，在雜交期間將靶細胞固定在固相表面上。在另一實施方案中，在整個操作過程中靶細胞均懸浮於液體內而不固定在固相表面上。本發明中特別適於使用常規流式細胞計數裝置。
含有分析物核酸分子的細胞可以是真核細胞(如人細胞)，原核細胞(如細菌)，植物細胞或其他類型的細胞。它們可以是簡單的真核細胞如酶母，或者是由複雜真核細胞生物如人體得到的細胞。
分析物RNA可以是在無被膜或有被膜(具有非包裹膜如脂蛋白膜)的病毒中。
分析物RNA可以是病毒RNA。對於某些病毒(如人免疫缺陷病毒)來說，在單一細胞內可同時存在互補的分析物RNA鏈。
病毒核酸靶可以是病毒的一部分，此時病毒可以在或不在細胞內。另外，病毒核酸靶也可能不是病毒的一部分，但可能是在細胞內。
可對存在於液態懸浮液中的生物實體、載玻片上或其他固相載體上的細胞內、組織培養細胞內及組織切片中之靶進行雜交分析。當生物實體是細胞時，其可來自實體組織(如神經、肌肉、心臟、皮膚、肺、腎、胰、脾、淋巴結、睪丸、子宮頸和腦)，或者是存在於各種襯膜管道、導管和腔(如胃腸道、尿道、輸精管、子宮腔、子宮管、陰道、呼吸道、鼻腔、口腔、咽、喉、氣管、支氣管和肺)或體液(如尿、胃液、脊髓液、血液和淋巴液)或糞便中的細胞。
雜交固定劑和溶液已在PCT申請WO90/02173和WO90/02204中討論了固定化細胞的固定劑和雜交方法。固定劑應能很好地保持細胞的形態學及雜交靶的可接近性和雜交能力(必要時還應保持抗原的可接近性和免疫反應性)。沉澱固定劑包括乙醇、乙酸、甲醇、丙酮和這些物質的組合。交聯固定劑包括多聚甲醛、戊二醛和甲醛。必須在不致於形成俘獲核酸的網絡或對其造成共價修飾以致破壞其可雜交性的條件下使用交聯固定劑。
固定劑可選自單獨或聯合使用的任何沉澱劑或交聯劑，並可以是含水或不含水的。固定劑可選自一組包括甲醛溶液、醇、鹽溶液、氯化汞、氯化鈉、硫酸鈉、重鉻酸鉀、磷酸鉀、溴化銨、氯化鈣、乙酸鈉、氯化鋰、乙酸銫、乙酸鈣或鎂、硝酸鉀、重鉻酸鉀、鉻酸鈉、碘化鉀、磺酸鈉、硫代硫酸鈉、苦味酸、乙酸、多聚甲醛、氫氧化鈉、丙酮、氯仿、甘油、百裡酚的物質。固定劑最好包含通過沉澱作用固定細胞成分並具有下列特徵的試劑作用是可逆的，可保持細胞(或病毒)形態、保留所需細胞成分的抗原性、使核酸在細胞中保留適當的定位、不會以一種使核酸不能形成雙或三股雜交體的方式修飾之，以及不以一種使核酸與所有已存在的靶順序雜交受到抑制的方式影響細胞成分。
所使用的交聯劑最好於10%(v/v)。用於檢測分析物核酸分子之方法的步驟(2)中的雜交溶液一般可含有高離液序列變性劑、緩衝液、微孔形成劑、雜交體穩定劑。高離液序列變性劑(Robinson，D.W.and Grant，M.E.(1966)，J.Biol.Chem.，2414030;Hama-guchi，K.and Geiduscheck，E.P.(1962)，J.Am.Chem.Soc.，841329)包括甲醯胺、尿素、硫氰酸胍、三氯乙酸鹽、四甲胺、高氯酸鹽和碘化鈉。可優選任何能使pH保持在至少7.0至8.0之間的緩衝液。微孔形成劑可以是去汙劑如Brij 35、Brij 58、十二烷基硫酸鈉、CHAPS或Triton X-100。似乎0.05% Brij 35或0.1% Triton X-100可以使探針通過胞漿膜但不能通過核膜。脫氧膽酸鈉將使探針穿過核膜，因此為了限制與胞漿生物多聚物靶雜交，應避免使用核膜微孔形成劑。當靶生物多聚物定位於胞漿內時，這種選擇性亞細胞定位可通過降低或阻止探針與互補核順序雜交從而提高該方法的特異性和敏感性。雜交體穩定劑如一或二價陽離子鹽包含於雜交溶液中，用於促進探針之互補順序與其靶生物多聚物之間的氫鍵形成。所用的氯化鈉濃度最好是0.15M至1M。為了防止核酸探針的非特異性結合，可在雜交溶液中加入與生物多聚物無關的核酸。
可利用的固相載體包括但不只限於玻璃、Scotch條(3M)、尼龍、Gene Screen Plus(Neu England Nuclear)和硝酸纖維素。最好使用顯微鏡載玻片。
為了構建用於完成本發明各種方法的藥盒，可將用於本發明的各種化合物和試劑放入包裝盒和/或瓶內，並裝進單一容器中，並最好附帶說明如何完成本發明方法的說明書。基本的藥盒應含有用於3SR的方法的試劑，如必須的酶並最好還含有脫氧核糖核苷和核糖核苷，其中應包括用於雜交的試劑，如含甲醯胺的緩衝液。雜交試劑最好包括下列的一種或多種本發明的通透增強劑，游離基清除劑及報導物基團類似物。較優選的藥盒應帶有本底降低劑如螢光檢測期間使用的伊凡斯氏藍。藥盒的另一實施方案則包括信號增強劑。特定的藥盒應含有用於特定診斷目的如診斷易位或病毒RNA感染的探針和引物。
試劑可從多個不同來源購買試劑，包括Aldrich Chemical Co.，Mil-waukee，Wisconsin;Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri;Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregon;Clontech，Palo Alto，California;Kodak，Rochester，NY和Spectrum Chemical Manu-facturing Corp.，Gardenea，California。
有關本文涉及的某些物質的其他信息可參見下示表1。
表1.化合物和染料的縮寫和通用名稱縮寫或通用名稱 化合物Tempo 2,2,6,6-四甲基哌啶-N-氧基{CAS#2564-83-2}EDTA 乙二胺四乙酸DMSO 二甲基亞碸DTT 二硫蘇糖醇
PVP 聚乙烯吡咯烷酮PEG4000 聚乙二醇(分子量約4000)PBS 磷酸鹽緩衝鹽水CHAPS 3-((3-膽醯氨基丙基)-二甲基氨)-1-丙烷-磺酸鹽{CAS#75621-03-3}發光生物素 N-(4-疊氮基-2-硝基苯基)-N'-(3-生物素基氨丙基)-N'-甲基-1,3-丙二胺{CAS#96087-37-5}Ficoll 非離子聚蔗糖(Pharmacia)Percoll 膠體PVP塗復的矽{CAS#65455-52-9}Triton X-100 辛苯氧基聚乙二醇(一種聚氧乙烯醚){CAS#9002·93-1;參見Aldrich Chem. Co.,1998-91目錄}Brij35 聚氧乙烯23十二基醚{CAS#9002-92-0}Brij58 聚氧乙烯20十六基醚{CAS#9004-95-9}Hoechst 33258 2'-[4-羥苯基]-5-[4-甲基-1-哌嗪基]-2,5'-雙-1H-苯甲醯氨吡咯三鹽酸化物{CAS#23491-52-3}
染料縮寫染料編號 染料實際名稱 縮寫12 萘酚藍黑 萘酚B1,B1K、13 宮殿堅牢黑WAN 宮殿F-B WAN20 磺基若丹明101水合物 磺基若丹明101螢光素異硫氰酸鹽 FITC溶液SSC具有下列組分0.15M NaCl、0.15M檸檬酸鈉，pH7.0。配成2X SSC以便在用水以1∶1稀釋後將得到SSC;配成10X SSC以便在用水以1∶10稀釋後得到SSC。0.1X SSC是用水以1∶10稀釋SSC得到的。
流式細胞計數中使用的固定溶液F含有下列成分4體積(vol)乙醇加5體積1X PBS溶液再加1體積冰醋酸。
1號洗滌溶液(＃1)具有下列組成0.4M異硫氰酸胍，0.1%Triton X-100，0.1X SSC，溶於去離子水中。2號洗滌溶液(＃2)具有下列組成0.1%Triton X-100，0.1% SSC，溶於去離子水中。
PBS是磷酸鹽緩衝鹽水，配方為0.136M NaCl，0.003M KCl，0.008M Na2HPO4·7H2O，0.001MKH2PO4。
用本發明方法檢測之疾病和轉位的例子表2舉例列示了可使用本發明方法檢測的多種類型的疾病，但它並不是用於限制可用本發明方法檢測之疾病或轉位的類型。
表2已知的轉位的例子t(2;8)(p11;q24) Burkitt淋巴瘤(Fujino et al.,Jpn.J.
Cancer Res.,vol77;pp24-77(1986);
t(11;14)(q13;q32) 慢性淋巴細胞白血病(Y.Tsujimoto et al.,Nature vol 315;pp340-343(1985));
t(7;9)(q34;q34.3) 急性T細胞成淋巴細胞淋巴瘤(T.C.Reynoldset al.,Cell vol 50,pp107-117(1987));
t(14;14)(q11;q32) T細胞慢性淋巴細胞白血病(M.P.Davey et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol85;pp9287-9291(1988));
t(8;14)(q24;q32) Burkitt淋巴瘤(F.G.Haluska et al.,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA,vol84,pp6835-6839(1987));
t(10;14)(q24;q11) T細胞急性成淋巴細胞白血病(M.Zutter etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol87pp3161:3165(1990));
t(9;14)(p13;q32) 彌散性大細胞淋巴瘤(H.Ohno et al.,Proc,Natl.Acad.Sci.USA,vol87,pp628-632(1990));
t(1;14)(p33;q11) 白血病細胞(8)(C.G.Begley et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol86;pp2031-2035(1989));
t(X;18)(p11.2;q11.2) 滑膜肉瘤
(X-Y轉位) X連鎖的隱性軟骨發育不良穿孔(47,XY,+del(5)(q12,q34),t(15;21)(q21;q22) 急性成髓細胞白血病(AML)47,XY,+del(5)(q12,q34) 急性非淋巴細胞白血病(ANLL)t(8;14)(q24;q11) 急性成淋巴細胞白血病(T-All)t(8;14)(q24;q11) 白血病/淋巴瘤13(q11) 其它急性成淋巴細胞白血病(proximal del15q) Prader-Willi綜合症t(1;15)(p36.2;p11.2) 普遍性肌肉張力減退(X;5)(p11.2;q35.2) 色素失調症(2q13) 橫紋肌肉瘤t(16;21)(q11;p11) 三體性16pt(1;19) 前B細胞急性成淋巴細胞白血病t(15;17) 急性前髓細胞白血病(APL)t(1;7)(p11;p11) 急性髓樣白血病或脊髓發育不良(8q24 14q32) Burkitt淋巴瘤Bcl-2t(11;14)(q13;q32) Bcl-1t(14;18)(q32;q21) Hodgkin淋巴瘤(NHL)t(8;14)(q24;q32) 濾泡組織型t(3;22)(q27;q11) Burkitt樣淋巴瘤t(11;14)(q13;q32) 彌散性大細胞淋巴瘤t(9;22)(q34;q11) 慢性髓性單核細胞白血病W/(Ph)t(4;6)(p15;p12) 慢性髓性單核細胞白血病W/(Ph)
inv(3)(q21 q26) 頑固性貧血t(3;3)(q21;q26) RAEB-Tinv(3)(q21 q26) 有髓樣化生的骨髓纖維變性(MMM)3p上的損傷 腎細胞肉瘤(RCC)(3;21)(q26;q22) 繼發性白血病t(3;21)(q26.3;q22) 急性骨髓樣白血病5q35 兒童的惡性組織細胞增多症t(5;6)(q35;p21)t(2;13)(q37;q14) 橫紋肌肉瘤(RMS)(Y;11)(q11.2;q24) Jacobsen氏症候群t(X;18)(p11;q11) 兩相和單相性滑膜肉瘤t(X;15;18)(p11;q15;q11) "t(X;7)(q11-12;q32) "14q32(28%)或14q11(14%) 成人T細胞白血病/淋巴瘤t(19;22)(q13.3;p11.2) 遠側19q染色體*11和22之間的轉位 神經上皮瘤tder(1q9p) 骨髓增殖紊亂Xp22和Xq28上的破壞點 平衡的X常染色體11q23 成人急性骨髓白血病13q或三體性137q和1q的畸變三體性11qt(8;14)(q24;q32) Burkitt型白血病t(9;22)(q34;q11) Philadelphia陽性All(Phl+All)
X;6 q15-16 先天性急性成淋巴細胞白血病(ALL)(8;21) 頑固性貧血46,XY,der(5)t(5;11)(p15.2;p14)[11p15] Beckwith-Wiedemann氏綜合症(BWS)11p15,fus(14p;21p),和fus(15p;21p) 骨的巨大細胞瘤(GCT)11q13 多發性I型內分泌腫瘤生成(MENI)t(7;22)(p22;q13) 與inv(16)(p13q22)急性非淋巴細胞白血症(M4)相關聯46,XY/46,XY,t(7;19)(q22;p13.3) 急性骨髓單核細胞白血病(FAB M4)46,XY/46,XY,t(7;19)(q11;q13) 兒童ALL46,XY,t(3q;11q),t(7q;19p),t(15;17)(q26;q22) ANLL(FAB M3)'2實施例1原位轉位3SR檢測計數3×107個生長於含10%胎牛血清之培養基中的K562人慢性骨髓源性成白血病極期細胞系細胞，以250xg離心5分鐘。室溫下放置3分鐘後吸去上清液並將細胞重新懸浮於磷酸鹽緩衝鹽水中。將細胞懸浮離心5分鐘後吸去上清液，並將細胞重新懸浮在4%多聚甲醛中。室溫下保溫3分鐘後使細胞通過分級醇脫水。
將細胞離心5分鐘，吸去4%多聚甲醛，並將細胞重新懸浮在1mlDEPC處理的30%乙醇中(DEPC是焦碳酸二乙酯)。室溫放置3分鐘後加入0.8ml 100%乙醇將乙醇濃度調到60%。再過3分鐘後，加入1.8ml 100%乙醇使乙醇濃度達到80%。最後，再放置3分鐘並加入11.4ml 100%乙醇使乙醇濃度為95%。然後將細胞離心5分鐘，吸去乙醇並將細胞重新懸浮在4.5ml 100%乙醇中。室溫放置3分鐘後，對細胞進行逐步再水化處理。
加入250μl DEPC處理的水使乙醇濃度達到95%;3分鐘後加1.15ml DEPC處理的水達到80%乙醇濃度。3分鐘後再加入1.9ml DEPC處理的水達到60%乙醇濃度。最後，加入7.5ml DEPC處理的水使乙醇濃度為30%。將細胞離心5分鐘，吸去上清液並將細胞重新懸浮在1ml DEPC處理的2XSCC溶液中。將細胞轉移到1.5ml微量離心管中並保溫3分鐘，然後用蛋白酶K消化並進行3SR反應。
在微量離心管中將細胞以1500rpm離心2分鐘，吸去上清液並將細胞重新懸浮在溶於DEPC處理的2mM CaCl2、20mM Tris-HCl，pH7中的蛋白酶K(ml)(10μg/ml)。於42℃消化15分鐘後，以1500rpm將細胞離心2分鐘並重新懸浮在1ml DEPC處理的PBS中。將細胞懸浮液以1500rpm離心2分鐘，吸去上清並再次懸浮在1ml DEPC處理的PBS中。以1500rpm離心2分鐘，吸去上清，向細胞內加入100μl含bcr-和abl-3SR引物(各250ng/100μl)和酶及3SR反應緩衝液的3SR溶液。
3SR反應溶液含有Tris-HCl(40mM，pH8.1)、MgCl2(30mM)、KCl(20mM)、DTT(10mM)、亞精胺(4mM)、ATP(7mM)、CTP(7mM)、GTP(7mM)、UTP(7mM)、dATP(1mM)、dCTP(1mM)、dGTP(1mM)、TTP(1mM)。
5′bcr引物具有下列核苷酸順序AATTTAATACGACTCACTATAGGGATCAGGTGCACAGCCGCAACGGC3′abl引物具有下列核苷酸順序AATTTAATACGACTCACTATAGGGATCGGCTTCACTCAGACCCTGAGG3SR反應混合物中的酶是AMV反向轉錄酶(30單位/100μl)和T7 RNA聚合酶(100單位/100μl)，以及E.coliRNase H(3單位/100μl)。42℃反應2小時後，加入1.4mlDEPC處理的PBS，並將各0.5ml等分的反應溶液分別轉移到3個微量離心管內。將細胞以1500rpm離心2分鐘，吸除溶液並加入雜交探針。
定名為NR的陰性探針是由存在於細菌中的氮還原酶基因衍生來的，並已知不與真核細胞內的核酸雜交。
L6-26探針具有順序CGCTGAAGGGCTTCTTCCTTATTGATK28-26探針具有順序CGCTGAAGGGCTTTTGAACTCTGCTT合成寡核苷酸應用Biosystems 380B型DNA合成儀;其推薦使用A.B.I.試劑)，並在最後的步驟中將磷酸氨基己基接頭連接到5′末端上。然後將5′-氨基己基寡核苷酸偶聯到本文所述的螢光素染料(FITC)上，並以使用基線810層析工作位置的Waters HPCL純化之。
為完成雜交步驟，向離心的細胞沉澱團塊中加入50μl雜交混合物，該混合物由30%甲醯胺、5X SSC、0.16M磷酸鈉緩衝液(pH7.4)、1μg/μl剪切的DNA、3%(v/v)Triton X-100、5%PEG4000，25mM DTT、4M異硫氰酸鈲、15X Ficoll/PVP及以2.5μg/ml濃度加入的探針(NR，28S，或合用K28-26和L6-26，即本文中所說的K28+L6探針)組成的。將細胞於95℃保溫1分鐘以使3SR產物變性並於42℃使探針退火30分鐘。雜交反應後適當的洗滌對於消除因探針的非特異性結合所造成的本底是很必要的。在1ml由0.1X SSC.0.4異硫氰酸鈲和0.1% Triton X-100組成的洗滌溶液A中於42℃下保溫細胞。在渦旋混合器上混合各管內容物，並在微量離心機中以1500rpm離心2分鐘。除去上清，並在細胞沉澱物中加入1ml由0.1X SSC、0.2%Triton X-100組成的洗滌溶液B(42℃)。在渦旋混合器上混勻並以1500rpm離心2分鐘。吸除洗滌溶液B後，將細胞懸浮在250μl溶於PBS的0.0025%依文斯籃(作為本底降低劑加入)中，在渦旋混合器上混合併在Coulter Profile流式細胞計數器上分析之。
用Coulter裝置在Profile ⅡTM上分析細胞。該裝置使用488nm氬雷射，對於FL1有252nm帶通過濾光片且對於復染劑則有635nm帶通過濾光片。對於各被分析樣品，首先分析含有陰性探針的樣品並設定四分象限狀態，以使小百分比例的細胞落入右上四分之一範圍內。然後在與分析含陰性探針之樣品完全相同的參數下分析含陽性探針的待分析樣品。因為準確地設定了四分象限並且對兩樣品均作相同的處理，所以在右上四分之一記錄的任何細胞數目(對照水平以上)都是作為陽性記錄的。
在使用包括所有細胞並排除大部分細胞碎片的2號散射光柵的情況下，88%顆粒是在左下直方圖的區域之中。用NR探針時log螢光1(FITC)的平均螢光波道是0.899，而用K28+L6探針時在36526個中100%的顆粒是8.7這就代表了大約10倍信噪比。這一比例要比沒有進行3SR擴散時高得多。
此外，後來又使用LISTVIEW軟體和調整到包括100%細胞顆粒的散射光柵重新對所列典型數據進行分析。選擇遊標以使93.5%比使用NR探針時所選擇的水平低，且使99%比使用K28+L6探針時所選擇的水平高。
實施例2證明本實施例在雜交條件下25鹼基寡聚體雜交而6至12鹼基寡聚體不雜交。
下述實驗中使用H9細胞。用無核酸酶磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗培養的細胞，放入一定濃度的單細胞懸液中得到清楚分離的細胞。離心細胞得到細胞沉澱團塊，並吸除上清液。將細胞重新懸浮在40%乙醇、50%PBS和10%冰醋酸中並於4℃下放置12-16小時。固定後，離心細胞以除去固定劑，然後在1X PBS洗細胞並懸浮於2X SSC中。細胞應立即被使用。
對於陽性對照探針，設計並利用真核細胞28S rRNA的保守片段;將其定名為28s-25-AL並用作進行上述實驗的陽性探針。定名為NR25-AL的陰性探針衍生於見於細菌中的氮還原酶基因並已知不與真核細胞內的核酸雜交。下列表4中列出了所使用的這兩種探針的DNA順序。還用下列表4中示出的順序製備衍生於25鹼基寡聚體的12鹼基、10鹼基、8鹼基和6鹼基寡聚體。實施例中展示的所有順序均具有作為各順序之左側末端的5′末端。
表4探針 順序28S-25-AL ATCAGAGTAGTGGTATTTCACCGGC28S-21-AL ATCAGAGTAGTGGTATTTCAC28S-18-AL ATCAGAGTAGTGGTATTT28S-15-AL ATCAGAGTAGTGGTA28S-12-AL ATCAGAGTAGTG28S-10-AL ATCAGAGTAG28S-8-AL ATCAGAGT28S-6-AL ATCAGANR25-AL TACGCTCGATCCAGCTATCAGCCGTNR 12-AL TACGCTCGATCCNR 10-AL TACGCTCGATNR 8-AL TACGCTCGNR 6-AL ATCGCT(在本文所述的所有順序中，5′末端都在左側)，合成寡核脫氧核苷酸(Applied Biosystems DNA合成儀，380B型，A.B.I.試劑)，並在最後階段將氨己基接頭加到5′末端磷酸上。然後純化5′-氨基己基寡脫氧核苷酸，將其偶聯到來自Molecular Probes的若丹明衍生物上並使用基線810層析工作裝置以Waters HPLC純化之。
為了進行雜交過程，將由30%甲醯胺、5X SSC、0.16M磷酸鈉緩衝液(pH7.4)、1μg/μl剪切的DNA、3%(v/v)Triton X-100(聚氧乙烯醚的醇衍生物，參見Aldrich ChemicalCo.1990-91目錄)、5%PEG4000(聚乙二醇)、25mMDTT(二硫蘇糖醇)、0.4M異硫氰酸鈲、15X Ficoll/PVP和以2.5μg/ml濃度加入的探針組成的50μl雜交混合物加到細胞沉澱餅上。雜交於42℃下進行30分鐘。上文所說的500X Ficoll/PVP是5g Ficoll 400型(分子量為400，000的聚蔗糖)加5g PVP(聚乙烯吡咯烷酮)溶於水中至終體積為100ml;15X Ficoll/PVP是用水以15/500稀釋比例稀釋的500X Ficoll/PVP。
雜交反應後，適當的洗滌對消除因探針的非特異性結合造成的本底汙染是十分必要的。雜交後將細胞放在已加有10ml預加熱至42℃由0.1X SSC、0.4M異硫氰酸鈲和0.1%Triton組成之洗滌溶液的15ml錐形試管內。攪拌溶液直到細胞成為單細胞懸液，然後以250xg離心5分鐘。除去上清液，向細胞團塊中加入預加熱到42℃由0.1X SSC和0.1% Triton組成的10ml洗滌溶液。攪拌溶液直到細胞成為單細胞懸液。然後以250xg離心5分鐘。去掉上清液並將細胞團塊再次懸浮在0.2ml由溶在1X PBS中的0.0025%伊凡斯氏藍組成的溶液中。
用Coulter Instruments製造的Profile ⅡTM分析細胞。該裝置使用488nm氬雷射，針對FL1的525nm帶通過濾光片，且針對復染劑的635nm帶通過濾光片。各被檢測樣品中，首先分析含陰性探針的樣品，並設定四分狀態以使落入右上四分之一範圍內的細胞少於0.01%。然後在分析帶陰性探針樣品的完全相同參數下分析含陽性探針的樣品。因為已準確地設定了四分狀態，並且對兩樣品均已作了完全相同的處理，所以在右上四分之一記錄的細胞數目(0.01%以上)是作為陽性記錄的。
將大約500，000個H9細胞等分到兩個試管中並按上述方法固定。向其中一份等分樣品中加入含有陽性探針(28S)的雜交溶液。並向另一份中加入含相當於上表4中所列陽性探針同樣大小之陰性探針(NR)的雜交溶液。然後進行雜交，洗滌和流式細胞計數。
使用流式細胞計數法測得的下列結果是當使用28S-25-AL探針時，99%以上的細胞為陽性；當使用28S-21-AL探針時，0.01-99%的細胞為陽性當使用其他探針時，不到0.01%的細胞為陽性。此外，為檢測平均LFL1，則得到如表5所示的結果。
表5信號(平均)長度 NR 28S Fold Diff.
6 .322 .370 1.18 6.4 .441 Neg10 .422 .3 .7012 .321 .231 .7215 .327 .373 1.118 .407 .339 .8321 .281 .616 2.225 .3 50.0 168實施例3通透增強劑和信號增強劑流式細胞計數使用Coulter Profile Ⅱ流式細胞儀進行流式細胞分析。用FIFC作探針染料時，LFL3的濾光片是635nm長通過濾光片且LFL1的濾光片是540bp濾光片，激發波長是488nm，根據需要設定PMT1和PMT3的校正參數。當螢光素是染料部分時典型的有用校正參數是PMT1設在1100，PMT3設在900，且顏色補償(PMT1，PMT3)為15%。
雜交混合物「HC」是含有下列組成的溶液5X SSC、15X Ficoll/PVP、0.16M磷酸鈉緩衝液(pH6)、1mg/ml剪切的鮭精子DNA、10% Triton X-100、0.4M異硫氰酸鈲、30%(v/v)甲醯胺、10mM乙二胺四乙酸(「EDTA」)、1.5%聚乙二醇(「PEG」)、25mM DTT(二硫蘇糖醇)和5-10μg/ml(微克/毫升)探針。
雜交混合物「HC-DMSO」是含有下列組分的溶液5X SSC、15X Ficoll/PVP、0.16M磷酸鈉緩衝液(pH6)、1mg/ml剪切的鮭精子DNA、10% Triton X-100、0.4M異硫氰酸鈲、30%(v/v)甲醯胺、10mM乙二胺四乙酸「EDTA」、1.5%聚乙二醇「PEG」、25mM DTT(二硫蘇糖醇)10%(v/v)DMSO、以及5-10μg/ml探針。上文中，500X Ficoll/PVP是5g Ficoll 400型(分子量為400，000的聚蔗糖)加5g PVP用水稀釋到總體積100ml;15X Ficol/PVP是500X Ficoll/PVP用水進行15/500稀釋得到的。
為在流式細胞儀中進行流式細胞檢測，將細胞懸浮在1X PBS溶液中。
28S RNA探針是對核糖體RNA特異的，並具有本文所述的28S-25-AL的核苷酸順序。NR探針是對見於細菌(而不是真核細胞)中的氮還原酶基因特異的，其具有本文所述NR-25-AL的核苷酸順序。
「載玻片原位製備和雜交程序」1)將細胞懸浮在固定液(3體積乙醇加1體積甲醇)中並使用Cytospin裝置離心轉移到載玻片上。
2)將含DNA探針的檢測溶液(25μl)(只含雜交混和物HC或與一種或多種作為增強劑的被試化合物混合)加到細胞上並蓋上蓋玻片。
3)將載玻片於90℃下加熱5分鐘以使DNA變性，然後於46℃保溫30分鐘進行雜交。
4)用已在42℃下平衡的1號洗滌溶液洗細胞1次，並用在42℃下平衡的2號洗滌溶液洗細胞10次。
5)在細胞上放置襯底溶液(溶於1X PBS中的50%甘油(v/v)以及核染色劑Hoechst(＃33258；1μg/ml)並蓋上蓋玻片。
6)在使用若丹明衍生物濾光片(激發波長567nm，發射波長為584nm)有螢光檢測能力的Olympus BH 10顯微鏡下觀察雜交信號。
「液體原位細胞製備和雜交程序」(步驟1-6)1.在溶液F中固定細胞，然後將細胞重新懸浮在2X SSC中。
2.從溶液中離心分離出細胞並重新懸浮在檢測溶液(只含雜交混合物HC或與作為增強劑的一種或多種被試化合物合併)中。
還加入其他附加化合物時，測定其對探針信號強度的影響。用流式細胞計數法分析數據。
液體原位細胞製備和雜交方案如下所述。所用的細胞是Hela細胞。所用探針是28S RNA探針和NR探針。各探針均有藉助Aminolink交聯接頭分子(氨己基，購自Applied Biosystems，Inc.)連接到其5′末端上的FITC部分。
28S RNA探針是對核糖體RNA特異的靶特異性探針;用其測得的螢光代表來自靶結合之探針、非特異性結合之探針的螢光以及來自細胞分子之自發螢光的總和。NR探針是對植物核酸順序特異的，並且在本實施例中，用其測得的螢光代表來自特異性結合之探針的螢光和自發螢光的總和。在本實施例中，雜交混合物由9體積HC-DMSO加上體積附加化合物組成。在對照樣品中，以1體積水代替1體積水代替1體積附加化合物。結果，所有樣品中DMSO的濃度都是9%(v/v)。
表6雜交混合物中的附加化合物 28SRNA探針 NR探針 28SRNA/NR之比水 6.070 0.137 4410%吡咯烷酮 10.19 0.133 7710%β-環糊精 9.593 0.135 7110%六甲基二矽氧烷 7.426 0.126 5910%棕櫚酸異丙酯 8.057 0.140 5810%丙二醇 8.227 0.148 5610%十二醇 4.804 0.142 34
3.42℃下放置30分鐘後，從試驗溶液中離心分離出細胞，在預加熱至42℃的洗滌液中洗細胞。
4.然後在預加熱至42℃的2號洗滌液中洗細胞。
5.將細胞重新懸浮在含有作為復染劑之0.002%錐蟲藍的1X PBS溶液中。
6.使細胞通過流式細胞儀並製作「計數對LFL1」的直方圖(「計數」是指細胞計數)。以該直方圖作為確定平均LEL1的基礎。
可使用實施例1的探針和細胞(RNA擴增和雜交後)，或任何對具有足夠待檢RNA的細胞有相似分辨能力的探針進行本實施例的下述四個次要方面(a)、(b)、(c)、(d)的分析(如果在未經擴增時細胞有足夠RNA，那麼也可以進行這些分析(如參見(b))。
(a)按下述方法證明加入鹼(角鯊烷)和其他化合物的影響原位製備細胞載玻片然後雜交。雜交混合物由8體積HC-DMSO、1體積角鯊烷，和1體積角鯊烷及1體積其他化合物組成。其他化合物是下列化合物之一十二醇(醇)、β-環糊精(糖)、棕櫚酸異丙酯(脂肪酸酯)、1，2-丙二醇(醇)、吡咯烷酮(內醯胺)、六甲基二矽氧烷(有機矽烷)或油醇(醇)。對照樣品中，用1體積水代替1體積其他化合物。結果是所有樣品中DMSO和角鯊烷的濃度分別是8%和10%(v/v)。就對照樣品來說，觀察到載玻片上信號強度為2。與對照載玻片相比，依據強度是否分別為對照樣品載玻片的0.5、1.0、1.5和2倍而估測所有其他載玻片的分級值為1、2、3或4。
(b)在原位液體雜交試驗中，除向檢測溶液中加入DMSO外
10%油酸 3.643 0.142 2610%油醇 0.731 0.136 -10%異三十醇 0.611 0.123 -28S/NR的比例是用28S RNA探針和NR探針觀察到的平均LFLI的比例。「28S RNA探針」和「NR探針」欄中所示結果分別是用28S RNA和NR探針觀察到的平均LEL1。
這些結果是四次獨立實驗的平均值。表6中的結果顯示與單用9%DMSO所測得之結果相比，將吡咯烷酮、β-環糊精、六甲基二矽氧烷、棕櫚酸異丙酯和丙二醇與9%DMSO合用時增加了信號亮度。如果單用DMSO，就信號亮度來說，9%是最佳或接近最佳的DMSO濃度。
使用10%角鯊烷或10%油醇可使其從溶液中沉澱出來，並在兩種情況下都產生雙相混合物。結果兩種情況下都明顯地降低了信號強度。
(c)進行液體原位細胞製備並完成雜交步驟如下在檢測合用DMSO和角鯊烷對螢光探針信號的影響的基礎上，檢測再與第三種化合物合用後進一步提高增強效果。
幾乎在兩種情況下雜交混合物都由9體積HC-DMSO，半體積角鯊烷和半體積附加化合物組成。附加化合物是下列化合物之一十二醇(醇)、β-環糊精(糖)、棕櫚酸異丙酯(脂肪酸酯)、1，2-丙二醇(醇)、吡咯烷酮(內醯胺)、六甲基二矽氧烷(有機矽)或油醇(醇)。一種情況是用水代替附加化合物從而雜交混合物便由9體積HC-DMSO、0.5體積角鯊烷和0.5體積水組成。在對照樣品中，混合物由9體積HC-DMSO和1體積水組成。結果在所有樣品中都有9%DMSO(v/v)。當存在角鯊烷時，其比例為5%;如有附加化合物亦為5%。
測量使用分析物RNA分子特異性探針測得之信號的平均LFL1對使用NR探針測得之信號的平均LFL1的比例。
(d)當將作為信號增強劑的各種化合物包含在固定液中，而不是包含在將其懸浮於固定液中之前將其懸浮溶液內，藉以證明這些化合物的有效性。在原位雜交步驟後，洗細胞然後加入改動的固定溶液並於顯微鏡下觀察細胞的螢光信號。改動的固定溶液包含9體積固定溶液和1體積附加化合物，其中附加化合物是被檢測是否具有作為信號增強劑之能力的化合物。附加化合物選自水(對照)，1，2-丙二醇、羥丙基環糊精，六甲基二矽氧烷、十二醇、吡咯烷酮、棕櫚酸異丙酯、油醇、角鯊烷和角鯊烯(烯烴)。固定溶液由加在50%甘油中的0.1%1，4-二苯胺(抗衰劑)和核著色劑Hoechst(＃35258;1μg/ml)組成。
實施例4本底降低劑的實例本實施例的目的是確定某化合物是否具有本底降低劑功能，即它是否可降低由非特異性結合之探針分子和自發螢光分子發射的光量，而不同樣降低由特異性結合之探針分子發射的光量。
表1.所用的染料縮寫名稱染料號 染料實際名稱 縮寫名稱12 萘酚藍黑 萘酚B1,B1K.
13 宮殿堅牢黑WAN 宮殿F-B WAN20 磺基若丹明101水合物 磺基若丹明101異硫氰酸螢光素 FITC
NR探針是與細菌氮還原酶基因的一部分結合的DNA25聚體;其核酸部分具有本文所述探針NR-25-AL的核苷酸順序。28S RNA探針是與28S核糖體RNA結合的DNA25聚體，其核酸部分具有本文所述探針28S-25-AL的核苷酸順序。合成探針並在最後階段將一氨己基接頭連接到5′末端磷酸上。然後將5′氨己基寡脫氧核苷酸偶聯到FITC染料分子(得自Molecular Probes)上並用HPLC純化之。
按實施例3中所述方法使用Coulter Profile Ⅱ流式細胞計數儀。
雜交混合物HC的組成同實施例3中所述，但其中改用3%TritonX-100(v/v)和5%PEG。
著色染料溶液含有下列組成在1X PBS中的0.002%(W/V)著色染料。一般說來，如果使用著色染料並將其用作本底降低劑，則其濃度為0.0002%和0.10%(w/v)之間。最好將細胞與降低本底化合物於20℃至46℃下保溫2分鐘至8小時。某些著色染料也是降低本底化合物。其中大多數也用作復染劑。
著色染料溶液具有與FAScan的流動緩衝液相同的組成。
H9細胞是得自人體的淋巴瘤細胞系(ATCC No.CRL 8543)。
為進行非特異性結合試驗，使用「NR」探針。
為進行特異性結合試驗，使用「28S」探針。
當使用NR探針時，發射光的量將是由兩個光源發射之光的總量非特異結合的探針分子和自發螢光的分子。換句話說，該發射光的量即是本底光。
當使用28S探針時，發射光的量是三個光源發射的光的總和特異結合的探針、非特異結合的探針和自發螢光的分子。換句話說，該發射光的量是靶特異性光加上本底光。
因此，要找到一種能夠降低本底光的化合物，就要找到有最大A/B比值的化合物，這裡所說的A是當使用28S探針時所發射的光量，B是當使用NR探針時發射的光量。作為一個衡量標準，在不加入作為本底降低劑的化合物時測定A/B比例。
然而，有最大A/B比例是不夠的，除此之外，還必須有足夠高的探針特異性光量。探針特異光的量即是(A-B)。可以看出，當使用降低本底化合物時，探針特異性光的量仍是可達到相當的水平。
按下述方法進行實驗。
1.在溶液F中固定未被感染的H9細胞，然後重新懸浮在2X SSC中。
2.將細胞從溶液中離心出來，並再次懸浮在雜交混合物HC中。就所使用的探針來說，HC混合物僅隨樣品的不同而異。所用三種類型的探針是NR探針、HIV 探針和28S RNA探針。各探針均帶有連接到探針寡核苷酸上的螢光素。
3.42℃下雜交30分鐘後，以250xg離心5分鐘，將細胞從雜交混合物中分離出來，並在預加熱到42℃的1號洗滌溶液各洗細胞。
4.然後在預加熱到42℃的2號洗滌溶液中洗細胞。
5.將細胞重新懸浮在1X PBS溶液或含有待檢測其作為本底降低劑之有效性之待試化合物(該化合物在本實施例中也被看作是著色染料)的PBS溶液中。
6.用流式細胞計數儀計數細胞，並得到一個軸表示著色染料螢光(LFL2和LFL3)而另一軸表示探針螢光(LFL1)的直方圖。
步驟(6)中製得的是「合計數對LFL1」直方圖(「合計數」是指細胞數)。以此直方圖為基礎，確定待試化合物是否可用作有效的本底降低劑。還製作其他直方圖和FS/SS曲線圖，但不用作確定本底降低作用的基礎;本文中沒有給出或概括這些圖。
使用磺基若丹明101水合物(作為著色染料)和NR探針或28S探針製得一系列合計數對LFT1直方圖的實例。其結果總結於表8和9中。
表8

圖1中所示計數對LFL1直方圖之結果的總結組 細胞計數 細胞Pct 平均LFL11 4917 100.0 0.15602 4587 93.3 0.1263 309 6.3 2.9664 4 0.1 41.66表9:計數對LFL1直方圖之結果的總結組 細胞計數 細胞Pct 平均LFL11 5034 100.0 101.02 2 0 0.2183 31 0.6 6.5354 4999 99.3 103.0表8和9中，「Pct細胞數」欄給出佔總細胞計數的百分比;「LFL」代表「Log螢光」。
下表中總結了對各被試著色顏料的檢測結果。
表10.結果的總結各探針的平均值 28S/NR染料號 著色染料 NR HIV 28S 平均值比例12 萘酚B1.B1K. 1.159 1.301 73.43 63.6613 宮殿F-B WA. 0.726 1.030 63.76 87.8214 錐蟲藍 0.266 0.259 77.56 291.620 磺基若丹明101 0.156 0.143 101.0 647.4PBS 磷酸鹽緩衝鹽水 64.5 38.73 246.1 3.82「平均值比例，28S/NR」是NR探針之平均值對28S探針之平均值的比例。
從表10的右手欄(其中給出上述A/B比例的度量)可以看出，所有四種被試染料都增加了A/B比例。另外，探針特異性光的量(A-B)仍是顯著的。因此表4中列出的所有染料均可用作本底降低劑。
實施例5游離基清除劑表11.化合物的縮寫化合物 縮寫維生素E(α-生育酚) Vit.E.
2,2-二苯基-1-苦基偕腙肼水合物 2,2,DIPH2,2,6,6-四甲基哌啶-N-氧基 Tempo異硫氰酸螢光素 FITC二乙胺四乙酸 EDTA二甲基亞碸 DMSO
二硫蘇糖醇 DTT聚乙烯吡咯烷酮 PVP聚乙二醇(分子量約4000) PEG4000按本文所述方法使用Coulter Profile Ⅱ流式細胞計數儀，但應注意的是，進行LFL1檢測時使用540bp(40)濾光片，即只允許波長520nm至560nm的光通過的濾光片。LFL3的濾光片是635nm波長能通過的濾光片，即允許所有635nm波長以上的光通過。
本實施例中使用下述溶液雜交混合物HC具有本文已述及的成分，並作了下列改動使用3%Triton X-100(v/v;Tviton X-100是聚氧乙烯醚的醇衍生物，參見Aldrich Chemical Co.的1990-91目錄)和5%PEG 4000。
如果在混合物中加入游離基清除劑，其優選濃度為0.1%至10%(v/v)。
在使用加有核酸探針的雜交混合物時，優選雜交反應溫度為30°至46℃;優選反應時間為5分鐘至16小時。
ALEX細胞是人細胞系。
NR探針是本文已述及的螢光素標記的NR-25-AL探針。28S RNA探針是本文已述及的對人28S RNA核苷酸順序特異的螢光素標記DNA寡聚體。兩種探針均有連接到5′末端磷酸上的氨己基接頭，然後該接頭又偶聯到FITC分子上。
按下述方法進行第一次實驗1.在溶液F中固定細胞，然後將細胞再懸浮於2X SSC中。
2.從溶液中離心分離出細胞並將其重新懸浮在雜交混合物HC中。僅就所存在的游離基清除劑(如果確實加入的話)而言，該HC混合物將隨樣品的改變而改變。
3.42℃下雜交30分鐘後，以250xg離心5分鐘，從雜交混合物中分離出細胞並在預加熱到42℃的1號洗滌溶液中洗細胞。
4.再在預加熱到42℃的2號洗滌溶液中洗細胞。
5.將細胞重新懸浮在1X PBS溶液中。
6.在流式細胞計數儀上計數細胞，並得到一個軸代表自發螢光(LFL3)而另一個軸表示探針螢光(LFL1)的直方圖。
步驟(6)中得到的是「合計數對LFL1」直方圖(「合計數」是指細胞計數)。以此直方圖作為確定待檢化合物是否為有效的自發螢光降低劑的基礎。還產生了其他的直方圖和FS/SS曲線圖，但不將它們作為確定自發螢光降低作用的基礎;本文沒有顯示這些圖。
表11.使用游離基清除劑的平均LFL1和LFL3加入的化合物 平均LFL1 平均LFL3無 7.92 0.22Vit.E 0.501 0.1192,2,DIPH 17.27 0.863Tempo 3.23 0.181苯硫酚 1.69 0.138表11中，「加入的化合物」是加入(如維生素E之類液體為5%(v/v)濃度;固體為5克/100ml)到試驗混合物中的化合物。
因加入游離基清除劑引起之自發螢光降低作用的指標是使用前述混合物測得的平均LFL1強度和使用混合物加游離清除劑測得的LFL1強度間的差異。另一項指標是使用該混合物測得的平均LFL3強度和使用混合物加游離基清除劑測得的平均LFL3強度間的差異。結果顯示，Tempo、苯硫酚和維生素E是游離基清除劑，結合本實施例所用螢光吸收一發射波長時也是有效的自發螢光降低劑。另一方面，結果顯示2，2DIPH在這些條件下則不能用作自發螢光吸收劑。2，2，DIPH無效可能不是由於它不降低自發螢光，而是由於它是發射處於本實施例所監測之波長處的光的螢光化合物。用游離基清除劑Vit.K也觀察到相似的情況。
在第二項實驗中，實驗程序基本上與第一項實驗相同，但用未被感染的H9細胞代替ALEX細胞，並且加在HC混合物中的NR探針或28S RNA探針的濃度為10μg/ml。NR探針是對不存在於人細胞中的細菌氮還原酶基因特異的。該探針被用作陰性對照。
28S RNA探針是對人28S RNA序列特異的。
結果示於表13中。
表13探針 HC混合物中有無Vit.E LEL1NR 無 13.27NR 有 8.8628S 無 25128S 有 231結果顯示，雜交混合物中存在維生素E可使不希望有的本底水平(NR造成的)降低約33%，而只導致用靶特異性探針(28S RNA)測得的信號水平降低8%。
可對本文所述實施例的方法進行下述一點或多點改變在100μl混合物中加入5μl 1M(即1摩爾濃度)DTT和5μl蛋白酶K(1mg/ml)溶液，並例如在42℃下雜交反應5分鐘，然後於95℃下雜交5分鐘，再於42℃下雜交2分鐘。
權利要求
1.檢測生物實體中分析物RNA分子的方法，該方法包括以下步驟1)在反向轉錄酶、DNA依賴性RNA聚合酶、RNaseH和各自都是DNA寡核苷酸的第一引物和第二引物存在下保溫生物實體，從而產生具有互補或相同於所說的分析物RNA分子中核苷酸順序之核苷酸順序的擴增分子，2)在所說的生物實體中探針分子和所說的擴增分子之間形成雜交體，以及3)檢測所說雜交體中的探針分子，其中第一引物包括互補於分析物RNA分子的第一核苷酸順序的核苷酸順序，其中第二引物包括等同於分析物RNA分子的第二核苷酸順序的核苷酸順序，其中所說的第一核苷酸順序位在分析物RNA分子中所說的第二核苷酸順序和分析物分子之3′末端之間的位置上，其中所說的兩引物中至少一個包含所說聚合酶的啟動子核苷酸順序，而且其中探針包括有互補於所說擴增分子之一中核苷酸順序之核苷酸順序的寡核苷酸，所說的生物實體是細胞或病毒。
2.權利要求1的方法，其中生物實體是細胞。
3.權利要求2的方法，其中細胞是帶有由在接合點處連接的第一染色體片段和第二染色體片段組成的異常染色體的細胞，所說的第一和第二片段在正常細胞中並不連接在一起，且其中的分析物RNA分子是跨越轉位接合點的RNA分子。
4.權利要求2的方法，其中第一引物包含啟動子核苷酸順序且第二引物包含一啟動子核苷酸順序。
5.權利要求3的方法，其中引物或探針，或它們兩者就細胞RNA分子或擴增RNA分子來說是跨越接合點的分子。
6.權利要求5的方法，其中跨越轉位接合點的引物或探針長度在20和50個核苷酸之間。
7.權利要求6的方法，其中探針或引物與之互補的跨越接合點的片段的一半是在含該片段的轉位接合點的一側上，且其中所說片段的另一半是在該接合點的另一側上。
8.權利要求6的方法，其中探針是跨越轉位接合點的探針。
9.權利要求7的方法，其中探針是跨越轉位接合點的探針。
10.權利要求3的方法，其中分析物RNA分子的轉位接合點是在所說的分析物分子內，互補於部分或全部第一引物的核苷酸順序和等同於部分或全部第二引物的核苷酸順序之間。
11.權利要求2的方法，其中探針包含報導物基團，該報導物基團是螢光部分並且是基於由所說的部分發射的能量光而可以檢測的。
12.權利要求11的方法，其中步驟(3)用在溶液中而不在載玻片上的細胞完成的。
13.權利要求2的方法，其中步驟(2)是在包含選自二甲基亞碸(DMSO)、醇、脂族烷烴、烯烴、環糊精、脂肪酸酯、醯胺或內醯胺以及有機矽烷這一組中的混合物的溶液中進行的。
14.權利要求13的方法，其中用於步驟(2)中的檢測溶液包含核酸探針和DMSO(2-20%和一種或多種選自醇(2-20%)、脂族烷烴(2-20%)、烯烴(2-20%)、環糊精(2-20%)、式R1(COO)R2的脂肪酸酯(2-20%)以及式(SiR5R6R7)N(SiR8R9R10)、(SiR5R6R7)-(SiR8R9R10)、(SiR5R6R7)O(SiR8R9R10)或(SiR5R6O)(SiR7R8O)(SiR9R10O)這一組中的化合物，且其中DMSO和選自這一組中的化合物的合併的體積不超於檢測溶液的30%(v/v)。
15.權利要求13的方法，其中用於步驟(2)中的檢測溶液包含核酸探針和DMSO(2-20%)和一種或多種選自醇(2-20%)、脂族烷烴(2-20%)、烯烴(2-20%)、環糊精(2-20%)、式R1(COO)R2的脂肪酸酯(2-20%)、式R3(NH)(CO)R4的醯胺或內醯胺(2-15%)以及式(SiR5R6R7)N(SiR8R9R10)、(SiR5R6R7)-(SiR8R9R10)、(SiR5R6R7)O(SiR8R9R10)或(SiR5R6O)(SiR7R8O)(SiR9R10O)的有機矽烷(2-20%)這一組中的化合物，且其中DMSO和選自這一組中的化合物的合併的體積不超過檢測溶液的30%(v/v)。
16.權利要求13的方法，除DMSO外其中還含有一種烯烴或一種烷烴以及至少一種選自該組中的其他化合物。/
17.權利要求2的方法，其中步驟(3)包括如下所述的3A、3B和3C這三個步驟，以及在步驟3B之前完成3A，且在步驟3C之前或與步驟3C同時完成3B(3A)從檢測溶液中除去細胞，(3B)向懸浮細胞的溶液內加入信號增強化合物，(3C)檢測作為信號的由與靶結合的探針分子直接或同接產生的光量子，信號增強劑選自醇、脂族烷烴、糖、脂肪酸酯、醯胺或內醯胺以及有機矽烷這一組化合物中。
18.權利要求3的方法，其中步驟3至少包括如下所述的3A、3B和3C這三個步驟，其中3A是在3B之前進行的，且步驟3B是在步驟3C之前或基本上與步驟3C同時完成的(3A)從完成步驟(2)的溶液中除去細胞，(3B)使細胞暴露於有螢光探針分子這吸收波長的光，以及(3C)測定以螢光探針的發射波長發射的光量;其中在開始步驟(1)之後和終止步驟(3C)之前的時間，降低本底化合物存在於其中懸浮有細胞的溶液中;降低本底化合物包含與螢光探針的螢光染料部分有不同結構的光吸收部分;降低本底化合物具有與螢光探針的發射波長範圍(探針發射的光的波長範圍)的該部分重疊的吸收波長範圍(當該方法進行時它吸收該波長範圍的光)，其中在步驟(3C)中檢測螢光探針之該部分發射波長範圍的光量。
19.權利要求18的方法，其中步驟(3B)和(3C)降低本底化合物是在其中懸浮有細胞的溶液中。
20.權利要求2的方法，其中螢光報導物基團用於檢測步驟(3)期間形成的雜交體中的探針分子，且游離基清除劑存在於用來完成步驟(1)、(2)和(3)中一個或多個步驟的反應混合物中。
21.權利要求20的方法，其中游離基清除劑存在於用來完成步驟(2)的反應混合物中。
22.權利要求2的方法，其中游離基清除劑選自維生素E、苯硫酚和2，2，6，6-四甲基哌啶-N-氧基這一組中。
23.權利要求2的方法，其中在步驟(2)期間芳族報導物基團是探針分子的一部分，並且在完成步驟(3)之前將細胞與報導物基團的結構類似物一起保溫。
24.權利要求23的方法，其中在步驟(2)期間類似物存在於用來使探針分子與細胞內擴增分子雜交的同一溶液中，此外步驟(3)是以一種將檢測報導物基團但不檢測類似物化合物的方法完成的。
25.權利要求2的方法，其中探針包括單股核酸部分和大多數報導物部分，這樣各個報導物部分藉助一個接頭部分共價連接到中介原子上，後者則連接到核苷部分的核苷間磷原子上。
26.包含反向轉錄酶、RNA聚合酶和RNAse H以及用於完成3SR原位反應之工具的藥盒。
27.權利要求1的方法，其中探針包括報導物基團，該報導物基團是螢光部分並且是可基於由所說的部分發射之能量光而得以檢測的，且其中步驟(3)包括用溶液中的而不是在載玻片上的細胞進行螢光檢測。
28.權利要求8的方法，其中探針包括是為螢光部分並且可基於由所說的部分發射的能量光得以檢測的報導物基團，且其中步驟(3)包括用溶液中而不是在載玻片上的細胞進行螢光檢測。
29.權利要求9的方法，其中探針包括是為螢光部分並且可基於由所說的部分發光的能量光得以檢測的報導物基團，且其中步驟(3)包括用溶液中而不是在載玻片上的細胞進行螢光檢測。
全文摘要
本文公開了使用3SR擴增技術檢測原位RNA分子的方法，其中所說的分子例如是已經受染色體易位的細胞內的跨越易位連接點的分子。還公開了提高該方法效果的改進方面。
文檔編號G01N33/53GK1088261SQ93116878
公開日1994年6月22日 申請日期1993年7月17日 優先權日1992年7月17日
發明者C·L·裡丁, M·L·庫比治, P·V·海多克, J·布雷澤, N·普拉沙, M·布裡克, W·D·韋伯, S·-C·祝, M·阿斯加裡, D·科爾文, R·祖爾蘇克 申請人:阿普羅精內斯有限公司