用於體外和體內檢測細菌和/或真菌的螢光多分枝探針的製作方法
2023-12-03 10:09:31 1
發明領域
本發明涉及分子探針領域，更具體地涉及用於微生物諸如細菌和真菌檢測的分子探針。
發明背景
在世界各地存在日益增加的細菌感染負擔，且準確診斷仍然是提供準確治療的基礎。
醫院內和保健所的患者通常有細菌感染的風險。醫院獲得性感染(hai)變得更加普遍，並且迅速準確地應對此類感染的能力變得越來越重要。當患者具有活躍且健康的免疫系統時，hai所構成的危險被降低。然而，嚴重患病的患者的免疫系統往往至少部分受損，使患者特別容易受到hai的傷害。
重症監護的用呼吸機供氧的患者和特別是所有免疫受損的患者特別容易受到hai的傷害，並且最具破壞性的hai之一仍然是呼吸機相關性肺炎(vap)。眾所周知地，vap仍然難以準確診斷，並且已經證明了不恰當的治療對患者有害。因此，vap具有高死亡率、高發病率並且仍然是醫療資源的負擔。關於診斷，金標準仍然是肺活組織檢查，其是侵入性的並且由於測試的內在侵入性性質而很少被使用的檢查。其他方法諸如支氣管肺泡灌洗(bronchoalveolarlavage)仍然存在爭議，而非培養方法沒有任何顯著影響或穩健的驗證。發燒、增加的氧依賴性和心動過速的臨床徵象仍然是檢測炎症或急性肺損傷的非特異性手段，並且因此，需要允許準確且及時診斷vap的可選擇的方法，該方法將允許做出即時的醫療決定，並且以適當療法改善患者的結局。
目前，關於何時和是否開始抗生素治療、選擇使用的劑以及如果開始了治療，何時逐步降級治療，臨床醫師面對極大的不確定性。這些問題是有效的抗生素管理的障礙，因為延遲和不足的抗生素治療與不良臨床結果之間存在已被證明的關聯。
分子成像技術可以允許使用細菌特異性示蹤劑，並且當與成像模態(modalities)諸如正電子發射斷層掃描(pet)組合時，具有描繪無菌部位和感染部位的能力。然而，這種方法不適用於一些患者群體，諸如需要即時護理診斷測試的重症監護組，並且施用放射性劑可能造成困難或限制性的。這些還涉及輻射並且不容易應用於在醫院設置以外成像。
本領域中可選擇的方法是應用光學探針，以允許通過使用內鏡來使患者的靶區域直接可視化。屬於visenmedical,inc.的wo2003/079015公開了用於鑑定和表徵正常和關於改變的代謝活性的患病組織的光學成像探針。
屬於本申請人的wo2012/136958公開了當染料被特定細胞類型內化時，通過增加螢光來允許細胞在體內可視化的支化染料(brancheddye)。
然而，仍存在對於改善的光學探針和成像方法的需求，該光學探針和成像方法將允許在原位、護理現場確定患者的狀況是否由於感染引起，並且如果是，確定感染的病原體(causativeagent)。
此外，仍存在對於改善的光學探針的需求，該光學探針在例如挑戰性條件(challengingcondition)期間諸如在表面活性劑的存在下保留在靶細胞膜。
因此，本發明的目的是提供適於快速且準確的現場護理診斷的改善的探針和成像方法，和提供由其靶更好地保留的光學探針。
發明描述
根據本發明的第一方面，提供了一種探針，所述探針包含核心和多個探針元件，所述多個探針元件中的每個探針元件從所述核心延伸並且包含螢光團和結合部分。
在使用期間，本發明的探針通常被遞送到靶區域並結合靶區域內的任何細菌。優選地，多個探針元件的每個的結合部分可用於結合細菌，並且因此，如果靶區域中存在細菌，探針通過多個探針元件的結合部分的每個或至少大部分結合細菌。
本領域已知的光學探針通常在體內難以保留在靶區域中，其中挑戰性條件可以引起探針的降解或氧化和/或蛋白酶分解，並且結果是，探針不能保持與它們的靶結合以允許可靠地檢測靶。例如，用於肺內成像的光學探針，其中存在高表面活性劑濃度，通常不允許檢測它們的靶。肺內的另外的挑戰包括通過在其中的循環液體「洗去」探針。
令人驚訝的是，發明人已經發現，與本領域已知的探針相比，本發明的探針對氧化、降解和蛋白酶活性更穩定，並且此類探針允許在體內甚至在挑戰性條件諸如在肺中發現的條件下可靠地檢測細菌。
通過術語「核心」，我們指的是連接多個探針元件以形成單個單元的共同部分。因此，核心可以是單個原子或包含官能團，飽和的或不飽和的烴鏈或聚乙二醇(直鏈的、支鏈的或環狀的)、肽序列或聚合物。
優選地，多個探針元件包含至少兩個探針元件、至少三個探針元件、至少四個探針元件或至少五個探針元件。例如，多個探針元件可以包含三個探針元件。
結合部分可以選擇性地結合至少一些細菌，並且不結合或者微弱地結合動物細胞諸如例如哺乳動物細胞。因此，結合部分可以是細菌結合部分。細菌結合部分可以基本上結合所有細菌，但不結合或者微弱地結合動物細胞。細菌結合部分可以選擇性地基本上結合革蘭氏陰性細菌，但不結合或微弱地結合革蘭氏陽性細菌或動物細胞諸如哺乳動物細胞。
結合部分可以選擇性地結合真菌，並且不結合動物細胞諸如例如哺乳動物細胞。因此，結合部分可以是真菌結合部分並且可以結合真菌菌絲。
結合部分可以選擇性地結合至少一些細菌和至少一些真菌，並且不結合動物細胞諸如哺乳動物細胞。因此，探針可以允許檢測靶區域中的真菌和/或細菌。例如，結合部分可以適於結合煙麴黴(a.fumigatus)的真菌菌絲。
一個或更多個探針元件的結合部分可以是ubiquicidin部分，諸如全長ubiquicidin(seqidno.1)或其片段或變體。結合部分可以是包含ubiquicidin的至少10個連續胺基酸或至少12個連續胺基酸的ubiquicidin的片段。例如，結合部分可以是胺基酸29至41的ubiquicidin片段(ubi29-41，seqidno.2)。結合部分可以是包含一個或更多個取代的ubiquicidin部分。該取代或每個取代可以是保守取代，並且對ubiquicidin的細菌結合性質幾乎沒有影響或優選地沒有影響。該取代或每個取代可以向ubiquicidin部分提供抗降解或氧化的穩定性。例如，結合部分可以是包含正亮氨酸胺基酸取代原始的甲硫氨酸胺基酸的ubi29-41(ubi29-41nle，seqidno.3)。
ubiquicidin是存在於呼吸道上皮細胞、腸黏膜和巨噬細胞中的哺乳動物抗微生物肽。ubiquicidin特異性地結合原核生物如細菌的細胞膜並且不結合哺乳動物細胞。
一個或更多個探針元件的結合部分可以選擇性地結合革蘭氏陽性細菌並且可以基本上不結合革蘭氏陰性細菌。優選地，一個或更多個探針元件的結合部分選擇性地結合革蘭氏陰性細菌並且基本上不結合革蘭氏陽性細菌。因此，在其中一個或更多個探針元件的結合部分選擇性地結合革蘭氏陰性細菌的實施方案中，本發明的探針可以隨機分布在不包含革蘭氏陰性細菌的靶區域中，並且定位於存在於靶區域的任何革蘭氏陰性細菌的細胞膜中。因此，本發明的探針可以適於選擇性地指示靶區域中存在或不存在革蘭氏陰性細菌。
例如，一個或更多個探針元件的結合部分可以是多粘菌素部分，諸如全長多粘菌素(seqidno.4)或其片段或變體。多粘菌素選擇性地結合革蘭氏陰性細菌，並且因此，包含多粘菌素部分的細菌結合部分將選擇性地僅將相應探針部分結合至革蘭氏陰性細菌，並從而允許檢測靶區域內的任何革蘭氏陰性細菌。結合部分可以是包含多粘菌素的至少6個連續胺基酸或至少8個連續胺基酸的多粘菌素片段。結合部分可以是包含一個或更多個取代的多粘菌素部分。該取代或每個取代可以是保守取代，並且對多粘菌素部分的革蘭氏陰性細菌結合性質幾乎沒有影響或優選地沒有影響。該取代或每個取代可以向多粘菌素部分提供抗降解或氧化的增加的穩定性。
結合部分可以適於結合至少一些真菌。結合部分可以適於結合真菌菌絲。例如，結合部分可以適於結合煙麴黴的真菌菌絲。
因此，本發明的探針可以被用於標記真菌。例如，本發明的探針可以被遞送到靶區域，並且該探針可以結合靶區域中的任何細菌或真菌菌絲。在用適當波長的光照射靶區域以激發多個細菌結合探針的所述螢光團或每個螢光團時，靶區域內的任何細菌和/或真菌將被標記。例如，可以目視區分細菌和真菌菌絲。
因此，本發明的探針可以被用於確定例如細菌或真菌感染。
優選地，多個探針元件中的每個探針元件包含相同螢光團。
然而，本發明的可選擇的實施方案可以包含具有不同螢光團的探針元件。例如，本發明的探針可以包含三個探針元件，且第一探針元件可以包含第一螢光團，第二探針元件可以包含第二螢光團，且第三探針元件可以包含第三螢光團。
優選地，多個探針元件中的每個探針元件的螢光團是環境敏感性螢光團，使得螢光團的螢光的強度或量子收率取決於該螢光團的環境。例如，在游離水性環境中，螢光團的量子收率或強度可能與該螢光團在疏水環境(諸如在細胞膜)中時不同。優選地，螢光團的量子收率或強度在疏水性環境諸如在細胞膜內較高。因此，當螢光團至少部分在細胞膜內時，諸如例如當探針元件結合在細菌的細胞膜內時，由螢光團發射的光的強度增加。因此，螢光團可以被用於經由它們的細胞膜螢光標記細菌。
多個探針元件中的一個或更多個探針元件的螢光團可以是7-硝基苯-2-氧雜-1,3-二唑(nbd)、孔雀綠、苯乙烯基染料、瀑布黃(cascadeyellow)、prodan(也被稱為1-丙酮，1-(6-(二甲基氨基)-2-萘基)、丹磺醯(也被稱為5-(二甲基氨基)萘-1-磺醯基)、dapoxyl、pympo(也被稱為1-(3-(琥珀醯亞氨基氧基羰基)苄基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓)、芘和二乙基氨基香豆素或其衍生物或變體。
優選地，多個探針元件中的至少一個探針元件的螢光團是nbd部分。更優選地，多個探針元件中的每個探針元件的螢光團是nbd部分。發明人已經發現nbd是本發明探針的特別合適的螢光團，當探針結合細菌時提供強螢光和低背景螢光，與測試的其他螢光團相比，允許清晰且可靠地標記細菌。
多個探針元件中的一個或更多個探針元件的螢光團可以具有長螢光壽命，並且螢光團的長螢光壽命允許相對於背景自體螢光檢測探針。例如，在使用期間，螢光團的螢光可能具有比靶區域的背景的自體螢光顯著更長的壽命，使得來自螢光團的螢光容易地與背景的螢光區分開。
例如，螢光團是氮雜二氧雜三角烯(azadioxatriangulene，adota)染料或二氮雜氧雜三角烯(diazaoxatriangulene，daota)或其衍生物。
合適地，多個探針元件中的相鄰探針元件的一個或更多個螢光團可以猝滅該探針的一個或更多個其他螢光團的螢光。因此，探針的螢光團可以自猝滅。
優選地，在其中多個探針元件中的相鄰探針元件的一個或更多個螢光團自猝滅的實施方案中，當探針的環境改變時，自猝滅被阻止或減少。例如，發明人已經令人驚訝地發現，在其中多個探針元件的每個探針元件的螢光團是nbd的實施方案中，由於nbd部分自猝滅，探針在水性環境中發射低螢光或無顯著螢光，但令人驚訝的是，當探針在疏水環境中諸如在細胞膜中時，nbd部分不再能夠自猝滅而探針螢光高。因此，本發明的探針可以僅在其結合細菌時選擇性發出螢光，並因此提供相對低的背景螢光。有利地，探針中的螢光團的選擇性自猝滅提高了靶區域內的信噪比並且提供了更清晰和更可靠的細菌檢測。此外，由於探針上更高的螢光團濃度(多個螢光團比單個螢光團)，當結合時，由探針產生的螢光信號更高，進一步提高了信噪比。
結合部分可以在最遠離核心的探針元件的遠端。
結合部分可以在探針元件的近端並鄰近核心，並且探針元件的螢光團可以通過結合部分連接至核心。可選擇地，探針元件的結合部分和螢光團可以通過通用連接物(commmonconnector)連接到核心，並且結合部分和螢光團的每個可以遠離該連接物延伸。
螢光團可以直接連接到結合部分。可選擇地，螢光團可以通過間隔物連接到結合部分。間隔物可以是飽和或不飽和的烴鏈、醚、聚合物、聚乙二醇(peg)、聚二醇(polyglycol)、聚醚或類似物。間隔物可以是肽。在其中間隔物是肽的實施方案中，肽可以為1-10個胺基酸的長度、1-20個胺基酸的長度或1-30個胺基酸的長度。
探針可包含通過可裂解接頭連接至核心的猝滅劑；當核心通過所述可裂解接頭連接所述猝滅劑時，多個探針元件中的一個或更多個所述探針元件的所述螢光團可以基本上被所述猝滅劑螢光猝滅；其中當所述可裂解接頭被裂解時，所述核心被從所述猝滅劑分離，且從而所述多個探針元件被從所述猝滅劑分離。
在其中探針的螢光團不自猝滅的實施方案中，通過接頭的裂解可以從螢光團分離的猝滅劑的提供允許螢光團被猝滅，除非存在裂解接頭的裂解劑。因此，探針可以允許通過探針的螢光團的顯著的螢光檢測裂解劑的存在。
優選地，使得接頭的尺寸為使猝滅劑足夠靠近多個探針元件的至少一個的螢光團以猝滅該螢光團。通常，猝滅劑距至少一個探針元件的螢光團小於10nm。優選地，猝滅劑距至少一個探針元件的螢光團小於5nm。
優選地，可裂解的接頭包含酶可裂解肽序列，並且當裂解酶裂解該酶可裂解肽序列時，接頭被裂解。
因此，酶可裂解肽序列的裂解通常對應於接頭的裂解，並從而對應於猝滅劑從探針元件的裂解。因此，除非另有說明，在其中可裂解接頭包含酶可裂解肽序列的實施方案中，術語「接頭的裂解」指酶可裂解肽序列的裂解。
裂解酶可以由靶區域中的固有細胞(indigenouscell)產生或表達。裂解酶可以由患者產生的、已經遷移到靶區域的另外的細胞產生或表達，諸如白細胞，例如中性粒細胞。裂解劑可以由靶區域中的感染劑產生或表達，諸如例如細菌或真菌細胞。
優選地，裂解酶是彈性蛋白酶，並且酶可裂解肽序列的裂解指示存在彈性蛋白酶。通常，彈性蛋白酶是中性粒細胞彈性蛋白酶並且彈性蛋白酶由中性粒細胞產生或表達。通常，彈性蛋白酶是能夠進行蛋白水解裂解的酶的活性形式。中性粒細胞通常靶向身體內正在經歷炎性反應(病理生理炎性反應或正常功能的一部分)的部位。因此，在患者內的靶區域中存在中性粒細胞指示靶區域內的組織或組織的一部分發炎。
因此，由接頭的裂解引起的猝滅劑和螢光團分離造成的至少一個探針元件的螢光團的螢光或螢光的增加指示存在中性粒細胞彈性蛋白酶。中性粒細胞彈性蛋白酶由中性粒細胞產生並因此存在中性粒細胞彈性蛋白酶指示存在中性粒細胞，並且因此指示靶區域中的組織的炎症。因此，本發明的探針可以適於指示靶區域中的組織的炎症。
人彈性蛋白酶，諸如人中性粒細胞彈性蛋白酶(hne)和其他彈性蛋白酶或其他酶諸如蛋白酶，通常具有它們結合併裂解的一個或更多個靶序列。因此，酶可裂解肽序列將通常包含待被檢測的裂解酶的靶肽序列或待被檢測的裂解酶的一個靶肽序列，並且本領域技術人員將能夠選擇給定裂解酶的適當的肽序列。
通常，酶可裂解的肽接頭是裂解酶的一個裂解位點的肽序列或是裂解酶的裂解位點的肽序列。優選地，裂解酶的所述或每個裂解位點包含多個胺基酸。在其中裂解酶是彈性蛋白酶的實施方案中，優選地，酶可裂解肽序列包含胺基酸序列aapv(即丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-纈氨酸，或ala-ala-pro-val)或eeinlerr。酶可裂解肽序列可以在序列aapv的任一側的位置x和/或y處包含一個或更多個另外的胺基酸，諸如例如xaapvy、xaapv或aapvy。
可選擇地，裂解酶可以是基質金屬蛋白酶(mmp)，諸如mmp-9，並且酶可裂解肽序列可以包含g-p-k-g-l-k-g。裂解酶可以是蛋白酶3並且酶可裂解肽序列可以包含v-a-d-c-a-d-y。裂解酶可以是組織蛋白酶g並且酶可裂解肽序列可以包含a-a-p-f或f-v-t-gnf-s-w(其中gnf＝4-胍-l-苯丙氨酸)。裂解酶可以是胱天蛋白酶(caspase)並且酶可裂解肽序列可以包含d-e-v-d。
在可選擇的實施方案中，可裂解接頭可以被細菌的存在或炎症過程諸如活化的中性粒細胞產生的活性氧諸如超氧化物(o2-)或過氧化氫(h2o2)裂解。因此，活性氧可以是裂解劑。例如，接頭可以是經修飾的硼酸基接頭，諸如j.am.chem.soc,2014,874,rogery.tsien中描述的。
本領域已知的光學探針通常是在任何時候都是螢光的(所謂的「始終開啟(alwayson)」螢光團)，並且這些探針的位置是確定的，或者當探針的環境改變時，例如去除猝滅劑或從猝滅劑分離(例如對於基於螢光共振能量轉移或fret的探針)或被細胞內化，它們改變其螢光。
然而，在其中多個探針元件的多個螢光團不自猝滅且探針包含可裂解接頭的實施方案中，本發明的探針由於該可裂解接頭是否已經被裂解劑裂解，有利地改變其螢光，並且當觀察時探針的位置可以指示存在細菌。因此，與本領域已知的光學探針相比，本發明的探針能夠提供具體的和更詳細的信息。例如，探針適於指示是否存在裂解劑(如果探針發出螢光，或螢光的顏色改變，則可裂解接頭已經被裂解劑裂解)，並且，如果存在裂解劑，是否存在細菌和/或真菌，由例如探針對細菌和/或真菌菌絲的定位和探針的螢光增加指示。
猝滅劑可以是暗猝滅劑(darkquencher)。暗猝滅劑是能夠接受來自被激發的螢光團的能量並例如通常以熱或聲能非輻射地耗散能量的部分。因此，當螢光團/猝滅劑對充分靠近在一起並用在螢光團的激發光譜內的波長的光輻照時，淬滅劑以非輻射方式耗散螢光團從光吸收的能量並且觀察不到螢光。以這種方式，暗猝滅劑抑制螢光團的螢光。
在其中猝滅劑是暗猝滅劑的實施方案中，猝滅劑可以是例如甲基紅、二甲氨基偶氮苯磺酸(dabsyl)、iowa黑fq或iowa黑rq(integrateddnatechnologies,inc.iowa,usa)、bhq1、bhq2或bhq3。
猝滅劑可以是螢光猝滅劑。螢光猝滅劑是能夠接受來自被激發的螢光團的能量並輻射該能量的部分。因此，螢光猝滅劑通常是螢光團並且發射不同於它們從其接受能量的螢光團發射的波長的光。以這種方式，螢光的顏色變化指示猝滅劑與螢光團相對接近。
在其中猝滅劑是螢光猝滅劑的實施方案中，猝滅劑可以是羅丹明、四甲基羅丹明或其衍生物諸如例如羧基四甲基羅丹明(tamra)、螢光素或其衍生物、花青螢光團或硼-二吡咯亞甲基(bodipy)螢光團。
在其中猝滅劑是螢光猝滅劑的實施方案中，猝滅劑可以適於標記中性粒細胞。因此，在其中可裂解接頭包含酶可裂解肽序列的實施方案中，本發明的探針可以適於指示裂解酶諸如彈性蛋白酶的存在，以標記產生該酶的中性粒細胞並標記可能存在的任何細菌。
例如，在其中裂解酶是中性粒細胞彈性蛋白酶的實施方案中，螢光猝滅劑可以被例如由細菌的存在或諸如鈣離子載體的刺激物活化的中性粒細胞攝取。因此，螢光猝滅劑可以選擇性地標記靶區域內的中性粒細胞。發明人已經觀察到，螢光猝滅劑諸如tamra被中性粒細胞選擇性地攝取，並且不被或以更低的程度被細菌和其他炎性細胞諸如單核細胞攝取，並且發明人推測，在螢光猝滅劑的攝取中觀察到的差異可能是由於高吞噬細胞諸如中性粒細胞的較高的胞吞和胞飲活性。
探針元件的螢光團可以與猝滅劑形成fret對。通常，螢光團和猝滅劑成對選擇，以確保它們具有用於將能量從螢光團轉移到猝滅劑的適當的激發和發射光譜(即它們形成fret對)。例如，典型的螢光團/猝滅劑對包括cy3/cy5、cy3/qsy21、螢光素/四甲基羅丹明、螢光素/甲基紅、青色螢光蛋白(cfp)/黃色螢光蛋白(yfp)等。fret對的另外的實例可以由技術人員容易地鑑定。
在其中多個探針元件中的至少一個探針元件的螢光團是nbd的實施方案中，猝滅劑優選為能夠接受來自nbd的能量以與nbd形成fret對的部分。優選地，猝滅劑是甲基紅或四甲基羅丹明或其衍生物。例如，猝滅劑可以是羧基四甲基羅丹明(tamra)。
在包含可裂解接頭的實施方案中，結合部分可以在可裂解接頭裂解之前結合細菌和/或真菌。可選擇地，結合部分可以在可裂解接頭裂解之後結合細菌和/或真菌。
例如，本發明的探針可以被遞送到靶區域，並且該探針可以結合靶區域中的任何細菌或真菌菌絲。在用適當波長的光照射靶區域以激發探針元件的螢光團時，靶區域中的任何細菌和/或真菌將被標記。例如，可以目視區分細菌和真菌菌絲。
通常，本發明的探針可操作地被用於檢測靶區域中的細菌和/或炎症。靶區域可以是患者內的組織的一部分，並且所述方法在體內進行。例如，靶區域可以是患者的肺的一部分，並且可以使用支氣管鏡(bronchoscope)來進行該方法，以將探針遞送到靶區域、將光傳送到靶區域以及以檢測來自靶區域的螢光。可選擇地，可以使用單個儀器將探針遞送到靶區域、將光傳送到靶區域以及檢測來自靶區域的螢光。
例如，可以使用光學發射顯微術(oem)諸如纖維共聚焦螢光顯微術(fcfm)檢測來自患者的組織的螢光。
靶區域可以在患者的皮膚上、關節中、循環系統中、消化系統或生殖系統中，並且可以通過例如內鏡遞送和/或觀察探針。
可選擇地，靶區域可以是細胞培養物的一部分、組織樣品諸如活組織檢查樣品或液體樣品諸如體液樣品，並且該方法可以在體外進行。
優選地，患者是人患者。然而，患者可以是非人動物，諸如例如馬、羊、牛或齧齒動物。
探針可以包含二級標籤。例如，探針的核心可以包含二級標籤，或多個探針元件的一個或更多個可以包含二級標籤。二級標籤可以是螢光團。二級標籤的螢光團可以不同於該探針元件或每個探針元件的螢光團。二級標籤可以是放射性標籤。放射性標籤可以包含放射性核苷酸。放射性標籤可以包括18f、64cu、68ga、99tc、111in、123i、124i、90y、177lu、11c、14c、3h、32p、33p、186re、188re或86zr中的一種或更多種。二級標籤可以是磁共振標籤或核心。磁共振標籤或核心可以是例如fe、mn或gd。
因此，探針可以具有雙模態或多模態，並且可以在光學成像、放射成像或磁共振成像中使用。
在另外的實施方案中，探針可以包含適於被靶物類(targetspecies)內化的靶向元件。靶向元件可以包含螢光團。靶向元件的螢光團可以適於被靶物類內化。例如，探針可以包含cy5，並且一旦接頭被裂解，包含cy5的探針或探針的一部分可以被靶區域中的任何中性粒細胞內化以標記中性粒細胞。通常，探針包含靶向元件的猝滅劑，並且靶向元件被接頭從猝滅劑隔開。在一些實施方案中，探針可以包含由接頭連接的第一部分和第二部分。第一部分可以包含探針元件和靶向元件的猝滅劑，且第二部分可以包含靶向元件和探針元件的猝滅劑。因此，當接頭被裂解時，探針元件和靶向元件都與它們各自的猝滅劑分離。
例如，探針元件可以包含nbd(螢光團)和qsy21、bhq3或bbq650(猝滅劑)，且靶向元件可以包含cy5或磺化的cy5(螢光團)和甲基紅或bhq1(猝滅劑)。
多個探針元件的每個探針元件可以從核心延伸，使得探針是支化的或多價探針，每個探針元件形成該探針的單獨的分支。例如，探針可以具有以下結構之一：
其中
l＝間隔物基團(例如c3-c10烷基、((ch2)2o)x其中x＝1-6)
f＝螢光團(例如nbd、螢光素)
b＝結合部分(例如ubiquicidin部分、多粘菌素部分)
c＝核心(例如碳、-c(ch2o(ch2)3)3、nh2conhc(ch2o(ch2)3)3)
例如，在優選實施方案中，探針包含與核心連接的三個探針元件並且具有通式nh2conhc(ch2o(ch2)3-nbd-(ch2)5-ubinle)3其中核心是nh2conhc(ch2o(ch2)3)3且每一個探針元件是：
nbd-(ch2)5co-ubinle；
在可選擇的實施方案中，三個探針元件的每一個是nbd-(ch2)2o(ch2)2och2-pmx；
探針可以具有結構：
探針的優選實施方案具有結構：
根據本發明的第二方面，提供了在靶區域中檢測細菌和/或真菌的方法，所述方法包括步驟：
(1)提供根據本發明的第一方面的第一探針；
(2)遞送所述第一探針到所述靶區域；
(3)用適當波長的光照射所述靶區域以激發所述第一探針的螢光團；和
(4)確定所述第一探針是否已經標記了所述靶區域內的細菌和/或真菌。
通過第一探針標記靶區域中的細菌和/或真菌指示靶區域中存在細菌和/或真菌。
靶區域可以是患者內的組織，並且所述方法可以在體內進行。例如，靶區域可以是患者的肺組織，並且可以使用支氣管鏡來進行該方法，以將探針遞送到靶區域、將光傳送到靶區域以及以檢測來自靶區域的螢光。可選擇地，可以使用單個儀器將第一探針遞送到靶區域、將光傳送到靶區域以及檢測來自靶區域的螢光。
靶區域可以是細胞培養物、組織樣品諸如活組織檢查樣品或液體樣品諸如體液樣品，並且該方法可以在體外進行。
優選地，患者是人患者。然而，患者可以是非人動物，諸如例如馬、羊、牛或齧齒動物。
在其中根據第一方面的探針包含可裂解接頭的本發明的實施方案中，裂解劑可以是裂解酶。裂解酶可以是彈性蛋白酶，並且第一探針的探針元件的螢光團的顯著螢光可以指示存在裂解接頭的裂解酶。在其中患者是人患者的實施方案中，裂解酶優選地是人中性粒細胞彈性蛋白酶(hne)。hne通常由處於組織炎症部位的中性粒細胞產生或表達。因此，hne的存在指示周圍組織的炎症。因此，在其中裂解酶是hne的實施方案中，第一探針的多個探針元件的螢光團的顯著螢光指示靶區域中的炎症。例如，當靶區域在患者的肺組織內時，螢光團的顯著螢光指示肺組織的炎症。
本方法可以允許檢測無菌炎症(即不由感染引起的炎症)和感染炎症(即由外來體諸如例如細菌或真菌引起的炎症)。通常，不標記細菌或真菌的第一探針的顯著螢光指示無菌炎症，而標記細菌的探針的顯著螢光指示細菌炎症。標記真菌菌絲的探針的顯著螢光指示真菌炎症。
通過術語「顯著螢光」，我們指的是可以由螢光團從第一探針的猝滅劑充分分離以防止猝滅劑猝滅該螢光團的螢光而產生的螢光團的螢光，其高於背景，或當存在時，高於靶區域中的自體螢光。靶區域內的固有細胞或組織的自體螢光可以具有比第一探針的螢光團更短的螢光壽命。與探針的螢光團相比，靶區域內的固有細胞或組織的自體螢光可以以更快的速度隨時間降低。因此，在靶區域中觀察到的隨時間更慢地降低的螢光可以指示第一探針，且在靶區域中觀察到的隨時間更快地降低的螢光可以指示自體螢光。
在醫療保健的許多領域中，諸如重症監護或特別護理，通常不可能使用標準方法諸如pet掃描來鑑定例如肺的感染是無菌的或感染性的，因為患者不能被安全地移動，特別是當患者使用呼吸機供氧時。因此，臨床醫師沒有足夠的信息來自信地診斷炎症並開出合適的矯正措施。例如，如果炎症是無菌的，給予患者的抗生素就不會有幫助，並且可能會有不良的副作用。
本發明的方法可以由臨床醫師在護理現場原位進行，並確定細菌和/或真菌是否存在於患者的靶區域內，諸如肺或肺的一部分內。因此，本發明的方法為臨床醫師提供了他們所需要的信息，以便自信地確定任何炎症的原因和確定最佳的行動步驟，諸如例如向患者給予抗生素。
如果在靶區域中檢測到細菌並向患者給予合適的抗生素，則可以進行該方法以確定抗生素的功效。例如，細菌數量的減少或靶區域中不存在細菌通常指示治療過程有效地清除細菌感染。類似地，如果在靶區域中檢測到真菌並向患者給予合適的抗真菌劑，則可以進行該方法以確定抗真菌劑的功效。
本發明還包括提供根據第一方面的第二探針的步驟，該第二探針包含特異性地結合一個細菌亞群的結合部分。例如，第二探針的結合部分可以特異性地結合革蘭氏陰性細菌或可以特異性地結合革蘭氏陽性細菌。
該方法可以包括步驟(5)遞送第二探針到靶區域。該發明還可以包括步驟(6)用適當波長的光照射靶區域以激發第二探針的所述或每個螢光團。步驟(5)和步驟(6)可以在步驟(4)之後進行，並且可以允許第一探針在步驟(4)和步驟(5)之間耗散或以其他方式從靶區域除去。以此方式，當靶在步驟(6)中被照射時，靶區域中基本上只有第二探針，並且因此，觀察到的任何螢光可以歸因於第二探針。因此，第二探針的所述或每一個螢光團可以是與第一探針的螢光團相同或不同的螢光團。
可選擇地，步驟(5)可以在步驟(2)和步驟(3)之間進行，並且步驟(3)對應於步驟(6)。因此，當照射靶區域時，第一探針和第二探針都存在於靶區域中。因此優選地，第二探針的一個或每個螢光團不同於第一探針的螢光團，使得來自第一探針的螢光和來自第二探針的螢光在不同的波長，並因此可以彼此區分。對於第一探針和第二探針的每個的不同螢光團的提供允許確定靶區域中任何細菌和/或真菌的存在(由第一探針在細菌或真菌菌絲的細胞壁的定位示出)和任何細菌是革蘭氏陰性的或革蘭氏陽性的(由第二探針是否定位於細菌的細胞壁示出)。在其中探針包含連接猝滅劑和探針的核心的酶可裂解肽接頭的實施方案中，本發明的方法允許確定炎症的存在(由第一探針和/或第二探針的顯著螢光示出)、靶區域中任何細菌和/或真菌的存在(由第一探針對細菌或真菌菌絲的定位示出)和確定細菌是革蘭氏陰性的或革蘭氏陽性的(由第二探針是否標記細菌示出)。
因此，本發明的本方面的方法可以有利地允許在單次測試中鑑定炎症的原因，並且在一些實施方案中，確定無菌炎症的存在，從而向醫療保健專業人員提供他們所需的信息以決定針對該患者的正確的行動步驟。
該方法可以包括在白光或螢光下觀察靶區域，以確定在靶區域中鑑定的任何感染劑(細菌或真菌)的形態的步驟。該方法可以包括在白光或螢光下觀察靶區域，以鑑定靶區域內的微生物的步驟，並且第一探針和第二探針可以被用於確定這些微生物的身份。
來自第一螢光團和/或第二螢光團的螢光可以通過由第一螢光團和/或第二螢光團發射的被引導到檢測設備(諸如電荷耦合器件(ccd)或互補金屬氧化物-半導體(cmos)設備)的螢光被直接成像。來自第一螢光團和/或第二螢光團的螢光可以被間接地成像。例如，通過使用光聲成像可以將螢光轉換成聲波。光聲成像可以允許產生靶區域的高解析度圖像。在其中第一螢光團和/或第二螢光團發射近紅外或紅外波長範圍(～700nm至1mm)的光的實施方案中，患者的整個身體或基本上整個身體可以被成像。可選擇地，在其中第一螢光團和/或第二螢光團發射在可見波長範圍(～390nm至700nm)內的光的實施方案中，可以對患者的特定靶區域進行成像，並且通過例如光纖可以將光傳送到靶區域或從靶區域接收光。
該方法可以包括使用光聲超聲觀察靶區域以確定在靶區域中檢測到的感染劑(細菌或真菌)的身份的步驟。該方法可以包括使用光聲儀器觀察靶區域以鑑定靶區域內的微生物的步驟，並且可以利用直接螢光檢測使用第一探針和第二探針來確定那些微生物的身份。
第一探針可以包含ubiquicidin部分，諸如全長ubiquicidin或其片段或變體作為結合部分。
第二探針可以包含多粘菌素部分，諸如全長多粘菌素或其片段或變體作為結合部分，並且所述第二探針可以選擇性地結合革蘭氏陰性細菌。
因此，該方法可以允許鑑定無菌炎症、細菌和/或真菌炎症，以及革蘭氏陰性細菌感染(並且通過推斷，鑑定革蘭氏陽性細菌感染)。
本發明在第三方面延伸至第一方面的探針鑑定或標記靶區域中的細菌和/或真菌的用途。
探針可以在體內使用以鑑定或標記靶區域中的細菌和/或真菌。例如，在其中靶區域是患者內的組織的一部分，諸如患者的肺組織的實施方案中，探針可以在體內使用。
在其中探針在體內使用的實施方案中，可以使用支氣管鏡或內鏡來遞送探針到靶區域、傳送光到靶區域和檢測靶區域內的探針的螢光。可選擇地，可以使用單個儀器將探針遞送到靶區域、將光傳送到靶區域以及檢測來自靶區域的螢光。
探針可以在體外使用以鑑定或標記靶區域中的細菌和/或真菌。例如，在其中靶區域是細胞培養物的一部分、組織樣品諸如活組織檢查樣品、或液體樣品諸如體液樣品的實施方案中，探針可以在體外使用。
在其中探針在體外使用的實施方案中，可以使用顯微術諸如例如共聚焦顯微術檢測來自探針的螢光。
第一方面的第一探針可以被用於鑑定或標記靶區域中的細菌和/或真菌，並且根據第一方面的第二探針可以被用於確定所鑑定或標記的細菌是革蘭氏陰性細菌或革蘭氏陽性細菌，其中第一探針的至少一個結合部分特異性地結合細菌和/或真菌，且第二探針的至少一個結合部分特異性地結合革蘭氏陰性細菌或革蘭氏陽性細菌。例如，第一探針的至少一個結合部分可以是ubiquicidin部分，而第二探針的至少一個結合部分可以是多粘菌素部分。
根據本發明的第四方面，提供了一種部件試劑盒，所述部件試劑盒包括一個或更多個本發明的第一方面的探針和探針可以在其中分散的合適的緩衝液。
部件試劑盒可以包括根據第一方面的第一探針和第一方面的第二探針，第一探針包含特異性地結合細菌和/或真菌的至少一個結合部分，第二探針包含特異性地結合革蘭氏陰性細菌或革蘭氏陽性細菌的至少一個結合部分。
例如，部件試劑盒可以包括第一探針和第二探針，第一探針包含至少一個ubiquicidin部分，第二探針包含至少一個多粘菌素部分。
第一方面的任選的和優選的特徵是第二、第三和第四方面的任選的和優選的特徵。
現在將通過非限制性實例的方式，參考附圖來描述本發明的實施方案。
附圖簡述
圖1：螢光團選擇影響以nbd構建體對螢光素(fam)的改善的信噪比對標記的細菌成像的能力。a)用fm-464復染並與fam-ubi或nbd-ubi孵育的細菌(甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌，mssa)(以紅色示出)證明了nbd的改善的信噪比，其允許檢測大部分細菌(以綠色示出)。將其與檢測聚集細菌的一個小子集的fam-ubi進行比較。b)nbd-ubi還顯示出相對於哺乳動物細胞(白色箭頭)對細菌(銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa))的特異性。
圖2：fam-pmx不允許在體外檢測細菌的足夠的信噪比。a)用fm-464復染並與a549細胞(紫色的人肺上皮細胞)一起孵育的銅綠假單胞菌(pa)(紅色)證明了沒有在背景上觀察到細菌標記，並且也不存在上皮細胞的標記。b)nbd-pmx(綠色)與核復染劑syto82(紅色)允許細菌標記，並保持對哺乳動物細胞(紫色)的標記的選擇性。
圖3：探針的發射光譜證實了在疏水環境中的螢光增加。a)當在488nm波長下激發時，在pbs或dmso(疏水環境)的存在下，nbd-ubi樹突(5μm)和nbd-ubinle(15μm)顯示的發射光譜。b)當在488nm波長下激發時，在pbs或dmso(疏水環境)的存在下，nbd-pmx(10μm)顯示的發射光譜。在與靶細菌結合時存在的疏水條件下，兩種探針的螢光顯著增加。
圖4：nbd-ubi樹突在體外相對於哺乳動物細胞選擇性標記細菌：a)通過雷射掃描共聚焦顯微鏡成像的用產生螢光的細胞dna染料syto-82(紅色)復染的具有nbd-ubi樹突(5μm；綠色)的臨床相關細菌組的示例圖像。b)標記nbd-ubi樹突5μm(最佳濃度)的細菌組的定量，其中與mssa和nbd-ubinle10μm(最佳濃度)相比，組中的每種細菌更亮。c)未染色的細菌(紅色)、nbd-ubinle15μm(藍色)和nbd-ubi樹突5μm標記的細菌(橙色)的流式細胞數據。d)用syto-82復染的mssa和nbd-ubi樹突(5μm；綠色)和示出了人中性粒細胞(紅色箭頭)的融合，和e)a549細胞(紅色箭頭)證明了哺乳動物細胞未被標記。示出的代表性圖像，對於所有實驗n≥3。
圖5：nbd-pmx在體外選擇性標記革蘭氏陰性細菌。通過雷射掃描共焦顯微術成像的具有nbd-pmx的細菌組的示例圖像。a)具有nbd-pmx1μm(綠色)並用syto-82(紅色)復染的細菌板。與革蘭氏陰性細菌相比，革蘭氏陽性細菌(由紅色方框框出)示出了最少/無標記。b)用nbd-pmx1μm定量細菌板，白色條中是革蘭氏陽性細菌，黑色條中是革蘭氏陰性細菌，示出了與革蘭氏陽性細菌相比對革蘭氏陰性細菌的高強度選擇性標記。所有革蘭氏陰性細菌顯示出相對於所有革蘭氏陽性細菌的統計學上顯著的增加。c)用nbd-pmx標記的細菌的流式細胞術評估顯示了未染色的細菌(紅色)和nbd-pmx(藍色)標記的細菌。沒有明顯的革蘭氏陽性細菌標記(由紅色方框框出)。d)用syto-82復染的mssa和nbd-pmx1μm(綠色)和示出了人中性粒細胞(紅色箭頭)的融合，和e)a549細胞(紅色箭頭)證明了哺乳動物細胞未被標記(從圖2複製)。代表性圖像顯示了對於所有實驗n≥3。
圖6：細菌感染的離體模型。a)收穫羊肺、用呼吸機供氧並將其置於環境溫度為37℃的新生兒培養箱中。經支氣管鏡向肺段注入pbs(對照)或細菌。然後注入探針並使用488nm雷射掃描單元(lsu)用纖維共聚焦螢光顯微鏡(fcfm)使段成像。b)離體羊模型展示了注入後5小時的活細菌。將細菌(mssa)注入羊肺段並在1、3和5小時灌洗(n＝3)、鋪平板用於cfu/ml並在孵育16小時後計數。
圖7：nbd-ubinle無法在羊肺中標記細菌。通過復染細菌和在光譜不同的成像系統上成像證實在羊肺中不存在細菌的持續標記。a：在注入後1小時含pkh660標記的mssa的肺段。b：在660nm處成像的對照段(用pbs注入且無細菌)。c)在注入10μmnbd-ubinle後，在488nm成像地相同段。然而，用復染的phk660標記的克氏肺炎桿菌(k.pneumonia)(革蘭氏陰性)的相同實驗在圖d中以紫色顯示，添加nbd-pmx證明了相同的點狀信號。
圖8：在遠端肺的細菌的代表性fcfm圖像展示了獨特的點狀圖案。a)當使用fcfm對段成像時，注入pkh標記的金黃色葡萄球菌(s.aureus)、鈣黃綠素標記的金黃色葡萄球菌或表達gfp的金黃色葡萄球菌菌株，產生螢光的點狀圖案。圖像被用於產生陽性對照，用於隨後的原位標記實驗。代表性圖像顯示了對於所有實驗n＝3。b)pkh染料不染色旁觀者細胞(by-standercells)。共焦圖像顯示與用syto-82(紅色)以及pkh660(紫色)復染的細菌(金黃色葡萄球菌)共培養的上皮細胞。旁觀者哺乳動物細胞(紅色箭頭)被從標記的細菌洩露的syto-82標記，但不存在pkh660的轉移。
圖9：nbd-ubi樹突在遠端羊肺中原位檢測細菌。nbd-ubi樹突的代表性fcfm圖像示出了在對照區段中沒有觀察到點狀信號，而在注入細菌的段的背景螢光上觀察到上述圖8中描述的獨特的點狀信號。此外，單獨的瓊脂糖珠不顯示螢光(對照珠)，但是當珠被細菌包被時，在羊肺中原位標記時觀察到信號。代表性圖像顯示了對於所有實驗n≥3。
圖10：nbd-pmx在羊肺中原位地選擇性標記革蘭氏陰性細菌。a)對照段和革蘭氏陽性段不顯示點狀信號，而注入革蘭氏陰性的段顯示與陽性對照相同的信號。b)來自段的灌洗計數證明了段之間的計數無顯著差異，確認了細菌的存在。c)單獨的瓊脂糖珠不顯示螢光，但當珠被細菌包被時，當在羊肺中原位標記時觀察到信號。代表性圖像顯示了對於所有實驗n≥3。
圖11：nbd-ubi樹突和nbd-pmx抗「洗脫」，允許檢測羊肺中的細菌。當灌注到羊肺中時，用nbf-ubi樹突或nbd-pmx預先標記的細菌通過fcfm容易地被可視化。然而，當注入用線性nbd-ubinle預先標記的細菌時，沒有觀察到點狀信號。通過在注入肺前使細菌懸液成像(左圖)並通過fcfm成像(右圖)確認標記。注意對於懸浮液中的nbd-ubinle標記的細菌，信噪比較低。代表性圖像顯示了對於每個實驗n＝3。
圖12：nbd-ubi樹突在進行洗滌時保持螢光。a)通過雷射掃描共焦顯微術在nbd-ubi樹突(黑色)的持續存在下和pbs洗滌之後(白色)對細菌組進行成像。定量證明了在持續存在探針(紅線)時，高於具有mssa的線性nbd-ubi的螢光保留。n≥3，每個實驗評估三個隨機視野。b)在持續存在探針(黑色)或pbs洗滌之後(白色)的情況下用nbd-pmx成像的細菌組證明了在持續存在探針的情況下，所有革蘭氏陰性細菌的螢光保留高於具有革蘭氏陽性的nbd-pmx。n≥3，每個實驗評估三個隨機視野。
圖13：nbd-ubi樹突在急性肺損傷支氣管肺泡灌洗液(alibalf)中穩定。基質輔助雷射解吸/電離飛行時間質譜(maldi-tofms)分析證明了共孵育30分鐘時，nbd-ubinle在鹽水存在下的穩定性(箭頭表示在1949的質量時觀察到正確的峰)，但在ali灌洗的存在下降解(在1949的質量未觀察到峰，但箭頭顯示可預測的降解化合物)。相比之下，通過傅立葉變換質譜(ftms)評估，nbd-ubi樹突保持穩定(顯示的數據表示理論圖和試驗圖，它們展示了峰是對應的，峰的對應表明化合物的存在)。nbd-pmx在alibalf中穩定。maldi-tof分析證明了當共孵育30分鐘時，nbd-pmx在生理鹽水或ali灌洗的存在下的穩定性(箭頭表示在1291-1293的質量觀察到的正確峰)。
圖14：nbd-ubi樹突在羊灌洗中的細菌上保留比等摩爾量的線性等價物更高的螢光。a)在存在或不存在含nbd-ubinle(15μm)和nbd-ubi樹突(5μm)的羊灌洗液通過雷射掃描共聚焦顯微鏡成像的mssa。兩種nbd-ubi化合物在羊灌洗中具有降低的螢光，但是nbd-ubi樹突保留更高的螢光強度。b)相比之下，在存在或不存在用nbd-pmx(1μm)進行羊灌洗時成像的pa3284不顯示螢光強度的顯著降低。代表性圖像顯示了n＝3。
圖15：nbd-ubi樹突和nbd-pmx成功地在富含表面活性劑的環境中使細菌成像。從共聚焦顯微鏡圖像定量的細菌螢光強度：表面活性劑螢光強度的比。對於等摩爾nbd濃度，nbd-ubi樹突和nbd-pmx具有比nbd-ubinle顯著更高的細菌:表面活性劑強度。
圖16a：彈性蛋白酶依賴性細菌標記方案。細菌結合組分上的螢光團由暗猝滅劑猝滅，意味著在結合細菌時沒有觀察到螢光。彈性蛋白酶特異性序列aapv的裂解從暗猝滅劑甲基紅(mr)釋放細菌結合組分(pv-nbd-ubi)。
圖16b：體外的彈性蛋白酶依賴性細菌標記。用fm-464復染並與分離的人中性粒細胞共孵育的mssa(紅色)證明了在中性粒細胞(綠色)的存在下的細菌標記，其在彈性蛋白酶抑制劑的存在下被抑制。
圖17a：彈性蛋白酶依賴性細菌標記方案。細菌結合組分上的螢光團被較長波長的不同螢光團猝滅，意味著在結合細菌時沒有觀察到螢光。彈性蛋白酶特異性序列aapv的裂解從猝滅劑(tamra)釋放細菌結合組分(pv-nbd-ubi)。tamra通過胞吞攝取報告活化的中性粒細胞的存在。
圖17b：體外的彈性蛋白依賴性細菌標記。將用pkh660(紫色)復染的銅綠假單胞菌(pa)與tamra-aapv-nbd-pmx孵育，並證明在未被激活的中性粒細胞的存在下無標記(上圖)、以彈性蛋白酶依賴性方式標記細菌(以綠色示出)和以不依賴彈性蛋白酶的方式標記活化的中性粒細胞(以紅色示出)。
圖17c：裂解後tamra的彈性蛋白酶依賴性螢光增加。分光光度計數據證明了出乎意料的觀察結果：與tamra-aapv-nbd-pmx相比，tamra-aa(裂解的化合物)螢光以彈性蛋白酶依賴性方式增加，並被彈性蛋白酶抑制劑(ex525nm，em580nm)抑制。
圖18：圖像處理算法描繪來自fcfm數據的「陽性」和「陰性」幀。(a)被認為是陽性或陰性的幀的原始數據。(b)無預處理，點檢無效。估計背景噪聲(c)、高通濾波(d)和適當的閾值分割(thresholding)(e)後，當前算法檢測陰性幀(f)中的最小點狀信號。
圖19：整個fcfm視頻(最高達3500幀)的自動圖像處理證明了細菌的檢測。a)用80點/幀的閾值分割和10％的任意截止值分析nbd-ubi樹突視頻使得能夠使用高斯拉普拉斯(thelaplacianofgaussian)(log)和高斯差分(differenceofgaussians)(dog)陽性幀的組合客觀檢測細菌。b)用80點/幀的閾值處理和10％的任意截止值分析nbd-pmx視頻使得能夠使用log和dog陽性幀的組合來客觀檢測革蘭氏狀態。對於所有分析n＝4，除了肺炎鏈球菌，其中n＝3。與對照組比較的統計學分析。
圖20：在人肺組織自體螢光的存在下檢測細菌。a)用pa3284的人肺組織的fcfm圖像顯示彈性蛋白自體螢光並且沒有細菌信號(左)，且用pa3284的人肺組織與nbd-pmx共孵育(右)顯示細菌信號。b)實時共聚焦顯微術圖像(融合)顯示無nbd-pmx標記的核酸復染(紅色)的融合圖像。可以清楚地看到右圖的細菌，其被用nbd-pmx標記並且在背景螢光以上。c)nbd的螢光壽命顯著長於肺的固有細胞的自體螢光壽命，由在488nm雷射激發和時間分辨單光子計數光譜儀測量，並且這可以被用於在體內鑑定探針和提高感測和成像的信噪比。
圖21：由共聚焦顯微術成像，nbd-ubi樹突標記細菌並可變地標記煙麴黴而非白色念珠菌(c.albicans)。nbd-ubi樹突5μm的代表性圖像證明了a：標記細菌(銅綠假單胞菌)和煙麴黴的真菌菌絲(藍色箭頭)，但不標記白色念珠菌(紅色箭頭)。圖b證明了在真菌菌絲上的標記的可變性。
圖22：由共聚焦顯微術成像，nbd-pmx標記細菌並可變地標記煙麴黴而非白色念珠菌。nbd-pmx5μm的代表性圖像證明了a：標記細菌(銅綠假單胞菌)和煙麴黴的真菌菌絲(藍色箭頭)，但不標記白色念珠菌(紅色箭頭)。圖b證明了在真菌菌絲上的標記的可變性。示出了5μm的數據，但對於1μm觀察到相似的結果。
圖23：當用fcfm成像時，白色念珠菌的懸液不顯示增加的螢光。圖像示出了用syto綠標記但未用探針nbd-ubi樹突或nbd-pmx標記並在懸液中採用fcfm成像的白色念珠菌的陽性對照。
圖24：當用fcfm成像時，煙麴黴表現出獨特且特徵方式的螢光。上圖是無探針的，證明了無固有的自體螢光，下圖用nbd-ubi樹突和nbd-pmx示出了獨特的模式。
圖25：煙麴黴證明了在羊肺組織的存在下，與細菌信號不同的線性螢光模式。上圖示出了具有探針的細菌溶液的螢光模式，下圖示出了具有nbd-ubi樹突和nbd-pmx的羊肺上的煙麴黴菌絲。
圖26：nbd-ubi樹突或nbd-pmx達到100μm時未觀察到溶血現象。溶血測定(n＝3)證明了在最高達100μm的濃度時不溶血。陽性對照為0.2％triton-x且校正值表示對於triton-x100％溶血。
圖27：a：nbd-pmx在小鼠的2周單次注入模型中不顯示器官毒性。在48小時和14天與pbs對照動物相比的nbd-pmx的代表性的組織學圖像(x100)。在任何組中沒有觀察到與對照組的差異(由顧問組織病理學家盲法評分)。b：nbd-ubi樹突在小鼠的2周單次注入模型中不顯示器官毒性。在48小時和14天，與pbs對照動物相比的nbd-ubi樹突的代表性的組織學圖像(x100)。在任何組中沒有觀察到與對照組的差異(由顧問組織病理學家盲法評分)。
圖28：螢光壽命成像容易地區分肺組織與細菌。左圖示出了488nm激發的肺和肺組織中的細菌(點)的共聚焦。flim(右圖)示出了肺組織(綠色)和細菌(藍色)成像的明顯差異。使用nbd-ubi樹突和金黃色葡萄球菌在人肺組織上進行成像。
發明的實施方案的詳細描述
儘管在下文詳細討論了製作和使用本發明的各種實施方案，但是應當理解，本發明提供了可以在各種具體背景中實現的許多可應用的發明構思。本文討論的具體實施方案僅僅是製造和使用本發明的具體方式的說明，而不限制本發明的範圍。
為了便於理解本發明，以下定義了許多術語。本文定義的術語具有本發明的相關領域的普通技術人員通常理解的含義。諸如「一(a)」、「一個(an)」和「所述(the)」的術語並不旨在僅指單個實體，而是包括可以被用於說明的特定實例的一般類別。本文中的術語被用於描述本發明的具體實施方案，但是除了權利要求中所概述的以外，其用法不限定本發明的範圍。
在本發明的示例性實施方案的以下描述中，包含多粘菌素部分的結合部分被給予代碼「pmx」，且包含ubiquicidin部分的結合部分被給予代碼「ubi」。例如，包括包含nbd和經修飾的ubiquicidin片段ubinle(「樹突探針」)的多個探針元件的本發明的實施方案被稱為nbd-ubi樹突。
探針元件螢光團的選擇
為了報告細菌，我們合成了僅包含探針元件並用正亮氨酸取代ubiquicidin片段ubi29-41的甲硫氨酸的探針「nbd-ubinle」。將該探針與用另一種「始終開啟」的螢光團，螢光素(fam)，「fam-ubinle」，的相同的細菌檢測部分進行比較，並在報告的nbd的實時臺式共聚焦顯微鏡上顯示改善的信噪比(圖1)。此外，證實了標記通常對細菌而非細胞膜是特異性的。例如，圖1示出的分離的人中性粒細胞未被nbd-ubinle探針標記，而細菌被nbd-ubinle探針標記。
為了證實對於pmx細菌檢測部分將觀察到相同結果，我們構建了nbd-pmx和fam-pmx，證明了用nbd-pmx相對於fam-pmx的改進的信噪比並確認此構建體還對哺乳動物細胞特異性(圖2)。
「分支/樹枝」或「多價」探針
製備了包含核心和連接到核心的三個探針元件(「三分支」探針)的探針(nbd-ubi樹突)，每個探針元件包含nbd-ubinle部分。
為了確認螢光報告子nbd在與我們的肽部分偶聯時保持其特性，我們測量了在模擬疏水環境的條件下(dmso)化合物的螢光。在488nm激發線性nbd-ubinle、nbd-ubi樹突和nbd-pmx(biotek螢光板讀數器)，並且當與磷酸鹽緩衝的鹽水(pbs)(圖3)比較時，當探針處於二甲基亞碸(dmso)(疏水環境)存在下時螢光的顯著增加證實了環境敏感性螢光報告。nbd-ubi樹突證明了當使用等摩爾濃度的nbd時，與線性相同的螢光增加。
用nbd-ubi樹突標記代表＞70％的引起vap的病原體的一組細菌(chastrej等人.amjrespircritcaremed.2002apr1；165(7):867-903)(革蘭氏陰性的：銅綠假單胞菌(兩個菌株)、鮑曼不動桿菌、嗜麥糖寡養食單胞菌、克氏肺炎桿菌、大腸桿菌和流感嗜血桿菌。革蘭氏陽性的：耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(mrsa)、甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌(mssa)和肺炎鏈球菌)(在下文表3中列出的菌株)用可變強度觀察標記(圖4a和b)。然而，所有細菌比用線性nbd-ubinle標記的mssa更亮(圖4b)，並且在流式細胞術上nbd-ubi樹突顯示比線性nbd-ubinle上增加的標記(圖4c)。此外，nbd-ubi樹突不標記人中性粒細胞或支持原核選擇性的a549細胞。(圖4d和e)。
在共聚焦分析上(圖5a和b)，與細菌孵育的nbd-pmx在革蘭氏陰性細菌(銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥糖寡養食單胞菌、克氏肺炎桿菌、大腸桿菌和流感嗜血桿菌)顯示與革蘭氏陽性細菌(mrsa、mssa和肺炎鏈球菌)相比顯著更高的螢光(p＜0.05)，其通過流式細胞術證實(圖5c)。此外，不存在人中性粒細胞或a549細胞的標記。(圖5d和e)。
在細菌感染的離體羊模型中評估nbd-ubi樹突和nbd-pmx的原位特異性和靈敏度(圖6)。在此模型中，將pkh螢光染料標記的細菌注入遠端羊肺並用fcfm成像顯示出每個視野中點狀螢光的特性和獨特模式(圖8)。我們用被注入到肺並用fcfm成像的鈣黃綠素標記的細菌和表達綠色螢光蛋白的金黃色葡萄球菌觀察到相同模式(圖8)。通過將用nbd-ubi樹突和nbd-pmx「預先標記」的細菌注入肺段，相同地再現了此模式。
在模型和陽性對照的這種徹底表徵之後，我們將pbs或vap相關細菌注入到離體肺模型的不同段，隨後是根據本發明的探針的微劑量遞送。我們證明了線性nbd-ubinle不能原位標記細菌，儘管它具有在體外標記細菌的能力(圖7)。對於這些實驗，用復染的革蘭氏陰性細菌(克氏肺炎桿菌)重複測定，其證明了被nbd-pmx標記(圖7)。然而，在注入了細菌的段中，當注入nbd-ubi樹突時，我們展示了與用「陽性對照」觀察的相同的信號(銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和克氏肺炎桿菌)，但用pbs對照觀察到最小/無信號，確認了原位標記細菌和用fcfm系統成像的能力(圖9)。
在注入了革蘭氏陰性細菌銅綠假單胞菌(實驗室菌株pa01和臨床vap分離株j3284)、克氏肺炎桿菌和大腸桿菌的段中，我們展示了當注入nbd-pmx時，與在「陽性對照」中觀察的相同的信號，但用pbs或革蘭氏陽性細菌mssa、mrsa和肺炎鏈球菌的段沒有信號(圖10)。在這些實驗中，我們通過支氣管肺泡灌洗和在lsu上在660nm成像的復染的細菌，證實了在用nbd-ubi樹突和nbd-pms成像的所有段中革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的等密度(證明了在段之間的cfu/ml中無差異)。
為了進一步證明原位細菌檢測和評估探針成像細菌聚集的能力，我們將細菌包埋在瓊脂糖珠中，然後將其注入肺中。微劑量探針滴注和fcfm成像表明，細菌珠被清楚和單獨地檢測，而對照珠(無細菌的珠)沒有(圖9和10)。
在遠端肺部，在遞送後可能立即出現探針的明顯和快速地耗散。因此，更迫切的是探針-細菌標記在這些條件下保持持久。nbd-ubi樹突-標記的細菌在探針「洗脫」時保持標記，如對於nbd-pmx所見的。當注入到羊肺中時，用nbd-ubinle預先標記的細菌不能被fcfm檢測，而用nbd-ubi樹突或nbd-pmx預先標記的細菌容易地被可視化(圖11)。因此，此類對「洗脫」的抵抗力代表探針-細菌親和力的替代指示物，這表現為遠端肺原位標記的絕對要求。目前，nbd-ubi樹突和nbd-pmx都耐受洗脫，而大多數其他結構變體不耐受洗脫。因此，用nbd-ubi樹突和nbd-pmx標記的細菌在遠端肺中發生的探針耗散時保持足夠的螢光強度(圖12)。
其次，我們通過ftms和maldi-tofms分析評估了探針在來自患ali的患者的balf中的穩定性。將nbd-ubinle、nbd-ubi樹突和nbd-pmx與balf孵育30分鐘(圖13)。nbd-ubi樹突和nbd-pmx表現出穩定性，其峰值準確地對應於在生理鹽水和balf孵育的樣品中容易地鑑定的完整探針的預測的理論光譜。也未觀察到分解產物的預測光譜。相比之下，觀察到nbd-ubinle的分解產物，表明在灌洗液中的不穩定性。因此，在「發炎」的高酶活性的遠端肺環境的背景下探針穩定性和功能保留是體內效用的關鍵決定因素。這通過在羊灌洗的存在下成像證實，其顯示nbd-ubi樹突比線性化合物的更高的螢光強度，並且當在羊灌洗中成像時nbd-pmx的強度沒有降低(圖14)。
使用肺表面活性劑成分進行體外實驗，以研究在大量表面活性劑存在下探針優先檢測細菌的能力。摻入到nbd-ubi樹突和nbd-pmx的螢光報告子(nbd)的性質表明在疏水性「豐富」表面活性劑環境中螢光激活的可能性。製備表面活性劑成分於緩衝鹽水中的懸液(20mg/ml，65％二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、30％磷脂醯甘油、5％棕櫚酸和1mg/ml泰洛沙泊(tyloxapol)作為擴散劑)，並與或不與a549上皮細胞單層孵育。被觀察到包被上皮細胞表面的表面活性劑成分的顆粒是螢光的，表明在此疏水溶液中nbd螢光增加。我們清楚地證明了，nbd-ubi樹突和nbd-pmx都相對於肺表面活性成分對細菌標記具有選擇性。在相等的摩爾濃度下，在表面活性劑成分的存在下，nbd-ubi樹突具有比線性nbd-ubinle顯著提高的細菌選擇性(圖15)。儘管依賴於nbd在疏水環境中的螢光增加的機制，nbd-ubi樹突和nbd-pmx相對於純化的表面活性劑成分優先增加細菌上的螢光，保持它們對遠端肺部中的細菌成像的能力。儘管肺中表面活性劑成分的比較分布和相對豐度是未知的，但完全可能的是，這有助於在探針注入時觀察到的背景螢光，並且需要在表面活性劑的存在下保持體外標記用於探針成功地成像，條件是它對降解充分耐受並在洗脫時保持標記。
彈性蛋白酶(hne)敏感性探針
實施例1
彈性蛋白酶敏感性探針的第一個實例(在圖16a中示意性示出)包含通過肽序列aapv(充當可裂解的接頭的酶可裂解肽序列)連接到7-硝基苯-2-氧雜-1,3-二唑(nbd)的甲基紅(作為暗猝滅劑)和ubiquicidin片段ubi29-41(一起充當探針元件)。因此，nbd螢光被甲基紅猝滅並且不會觀察到螢光信號(即甲基紅和nbd充當fret對)，並因此無論探針是否與可能存在於靶區域的任何細菌通過ubi29-41結合，使用共焦顯微鏡觀察不到信號。
當探針處於人中性粒細胞彈性蛋白酶(hne)存在下時，諸如在發炎的組織中，hne裂解接頭的肽序列從而將探針元件從甲基紅猝滅劑釋放出來。因此，nbd螢光團不再被猝滅並產生螢光信號。此外，由於nbd的環境敏感性，如果nbd處於疏水環境(諸如在細胞膜內)，則產生的信號被極大放大。
圖16b示出了與細菌和中性粒細胞的共培養物一起孵育的包含探針的樣品的共聚焦圖像。這些圖像證實了探針被中性粒細胞衍生的hne裂解並標記細菌的能力。當彈性蛋白酶抑制劑西維來司(sivelestat)被添加到培養基中時，沒有觀察到標記，因為探針保持未裂解(並因此nbd被甲基紅猝滅)。
實施例2
在第二個實例中，探針包含通過肽序列aapv(充當可裂解接頭的酶可裂解肽序列)與nbd和多粘菌素(充當探針元件)連接的羧基四甲基羅丹明(tamra，充當螢光猝滅劑)。因此，nbd螢光被tamra猝滅以產生來自tamra的螢光信號(即tamra接受由nbd吸收的能量且本身是螢光的，tamra和nbd充當fret對)。因此，無論多粘菌素是否與可能存在的任何細菌結合，僅觀察到來自tamra的信號。
一旦探針被彈性蛋白酶裂解，由於nbd的螢光(圖17a)細菌被探針元件標記，而中性粒細胞一旦被激活則被tamra部分標記(圖17b)。此外，我們證明了裂解的tamra化合物的螢光以彈性蛋白酶依賴的方式增加，並被彈性蛋白酶抑制劑如西維來司(「s」，圖17c)抑制。
數據分析
我們已經開始開發定製的圖像分析/處理策略，以對由探針/fcfm平臺生成的大型數據集進行快速實時的客觀分析。通過使用這些實時圖像處理算法將實現對細菌的明確檢測及其革蘭氏狀態的描繪。基於單幀分析的處理算法已經應用於整個視頻序列(最高達3500幀)，並且即使在此早期階段，我們能夠明確地描繪細菌的存在和革蘭氏狀態。這些信號和圖像處理算法將在準備臨床應用中迅速迭代，並且我們期望將機器學習的重要組件納入到nbd-ubi樹突和nbd-pmx數據集的進一步優化中。
圖18示出了基於通常用於以目標計算方式在螢光顯微鏡圖像中檢測亮點的兩個圖像處理算法(高斯拉普拉斯(log)和高斯差分(dog))的，最初被選擇來開發模型的單個陽性和陰性幀的分步處理。通過用log或dog濾波進行卷積增強圖像中的斑點。需要進行預處理以通過消除圖像中的噪聲的影響以提高精度。首先，通過將圖像劃分成小窗口(每幀100個)，然後計算像素強度的標準差來估計背景噪聲。高通濾波用於降低低頻噪聲。以3倍標準差對生成的圖片進行的閾值分割(thresholding)去除了背景噪聲並且僅保留更高像素強度值。最後，用log或dog檢測到點。
我們已經採用上述方法分析整個fcfm圖像視頻(最多達3500幀)。採用每幀80個點的初始閾值限制來指示正幀，我們確定了每個視頻的陽性幀數百分比，並將任意「截止」為20％作為是/否的二進位結果的閾值。這顯示了分別使用nbd-ubi樹突和nbd-pmx的細菌和革蘭氏狀態的明確檢測(圖19)。
為了確保化合物可以在正常人肺自體螢光以上標記細菌，將細菌與人肺組織一起孵育並使用fcfm和臺式共聚焦成像(圖20)，證明了一旦被高於自體螢光的水平標記則可以檢測細菌。
我們已經用探針鑑定了遠端肺原位標記的一些決定因素。這些解釋了為什麼線性nbd-ubinle探針的有希望的體外數據沒有轉化為在羊肺中可重現的原位標記。合成和評估結構變體，探索結構-活性關係。最初的目標是提高對降解的耐受力和改善信噪比。極大改善單個功能方面諸如穩定性(諸如插入d-胺基酸/n-甲基或僅包括d-胺基酸變體的變體)或標記強度的某些修飾不允許遠端肺中細菌的可重現的可視化。使用37℃下實時臺式共聚焦成像的體外細菌標記和羊肺中的原位標記，我們綜合評估了ubi類似物在alibalf中的穩定性。
已經進行了一些結構修飾，這些結構修飾大致分為兩組：
(a)通過檢查不同的環境敏感性螢光團或增加nbd-ubinle載量來提高信噪比。
我們評估了對於每個ubi片段包括兩個nbd螢光團的效用，並且還用被設計為增強穩定性的n-甲基化胺基酸變體進行了評估。我們已經評估了一系列可選擇的環境敏感性螢光團，包括孔雀綠和苯乙烯基染料，目的是產生更高的信噪比，這可以使得能夠檢測較低水平的細菌或在更低的有效探針濃度下進行檢測。
(b)提高對蛋白水解降解的抗性。
我們已經評估了許多化合物，包括由母體nbd-ubi化合物的maldi分析被鑑定為易於蛋白水解降解的位點的選定位置處摻入d-胺基酸和n-甲基化胺基酸的變體。為了降低降解而不改變胺基酸組成，我們合成了變體，所述變體在氨基和/或羧基末端包括peg單元以阻斷從肽序列的末端開始的降解。我們還合成並評估完全由d-胺基酸組成和具有或不具有封閉peg單元的順序反轉的d-胺基酸組成的變體。此外，還評估了nbd-ubinle的環狀變體以及此化合物在通過對nbd-ubinle的環狀變體的maldi分析鑑定為保持對蛋白水解裂解敏感的選定位置處摻入n-甲基化胺基酸的其它變體。
nbd-ubinle的環狀變體
所有化合物均經過生物學評估。對於穩定性，我們在0.9％nacl(生理鹽水)或來自急性肺損傷患者的合併灌洗液的存在下評估每種化合物並通過基質輔助雷射解吸/電離(maldi)或傅立葉變換質譜(ftms)進行分析。在具有細菌的化合物存在下，在臺式共聚焦上評估體外標記，並將標記與充當細菌標記的參考對照的nbd-ubinle進行比較。在適當時，我們還評估了分離的人中性粒細胞和原代人細胞系(a549人肺腺癌細胞系)上化合物的標記。對於離體和體內羊肺實驗，在對照肺段(注入2mlpbs)或細菌段(注入2ml的2光密度的細菌)中評估每種化合物。細菌注入後，將化合物施用於感興趣的段並通過基於探針的fcfm成像。
不同nbd-ubinle變體的評估使我們更清楚地了解影響探針在肺環境中的功能的不同機制因素，並明確說明了為什麼在所有ubi變體中只有nbd-ubi樹突能夠對肺中的細菌成像。
對於本申請而言，可選擇的螢光團比不上nbd。孔雀綠變體給出了低得多的細菌上的標記強度，並且儘管苯乙烯-染料化合物表現出細菌上的標記強度增加，但這些化合物對哺乳動物細胞的選擇性降低，最有可能是由於染料本身進入親脂性膜的傾向克服了對ubiquicidin部分的靶向。因此，苯乙烯-染料變體在離體肺中表現出大大增加的脫靶標記並且沒有觀察到細菌信號。
d-胺基酸變體以及在肽序列末端具有peg封閉基團的變體在體外表現出降低的標記而在離體無標記。儘管在體外保留功能的線性ubi變體具體改善的穩定性，這些都不能在肺中對細菌成像。我們已經獲得了證據，最有可能與親和力和/或隨後插入細菌膜的性質有關的探針的洗脫性質影響它們是否可以被用於在肺內成功成像。通過共聚焦在體外研究移除探針溶液時的標記保留。所有線性ubi變體標記在洗脫時完全失去。這表明，在肺中，一旦細菌周圍的探針濃度由於流體耗散而降低，標記就會迅速消失。用這些線性nbd-ubinle化合物預先標記細菌，並通過對預注入的細菌懸液成像確認成功的標記。將這些懸液注入離體肺中，當隨後使用fcfm使段成像時，未檢測到細菌信號(從注入導管轉變為通過fcfm纖維進入相同段存在固有的時間延遲)。然而，當注入通過體外共聚焦評價的在洗脫時不失去標記的用nbd-pmx預先標記的細菌時，檢測到細菌信號。nbd-ubi樹突構建體以及以等摩爾濃度提供的增加的細菌信號在洗脫時保留標記。如預測的，當向離體肺注入用這些化合物預先標記的細菌時，細菌成功地成像。
我們測試了化合物標記非細菌-肺的病原體(包括真菌)的能力。在免疫活性患者中，繼發於真核真菌而發生vap是不常見的，並且佔vap病例的＜2％。最常分離的病原體是白色念珠菌(candida.albicans,c.albicans)和煙麴黴(aspergillusfumigatus,a.fumigatus)。白色念珠菌定殖於icu中最高達50％的患者並且定殖隨著抗生素的使用增加。然而，侵入性念珠菌病的發展作為vap的起因是少見的並且仍然有爭論。的確，一些大型臨床試驗已經在它們的vap診斷算法中排除了念珠菌分離株，並且驗屍研究已經證明了從bal培養念珠菌不是免疫活性患者中念珠菌感染的可靠標誌物。煙麴黴也是在危重病人的1-2％的呼吸樣品中偶爾分離的。然而，在此1-2％中，只有20％被認為是病原性的，且剩餘的80％被認為是定殖。
nbd-ubi樹突證明了無白色念珠菌標記，然而，在成像時存在可變的煙麴黴菌絲標記(圖21)。此外，成像證明了真菌菌絲比細菌顯著更大，並且示出了獨特的形態學外觀。當在共聚焦上成像時，nbd-pmx展示了與nbd-ubi樹突相同的模式，保留革蘭氏陰性細菌的標記、煙麴黴菌絲的可變標記和無白色念珠菌標記(圖22)。
最後，為了檢測此模式是否將在肺組織中被鑑定，將煙麴黴與羊肺和探針共培養並用fcfm成像。這再次證明了真菌菌絲的尺寸和模式與細菌信號不同(圖24)。用煙麴黴的懸液進行相似的試驗並且證明了與細菌信號不同的獨特的特徵性的線性螢光模式(圖25)。
通過溶血測定評估nbd-pmx和nbd-ubi樹突的直接紅細胞毒性，並顯示在高達100μm無紅細胞溶血(圖26)。在齧齒動物單劑量、氣管內毒性評估中評估化合物的毒性。小鼠接受100μg/25g小鼠(3000倍人劑量，假設向75kg慢性遞送100μg)的nbd-ubi樹突或nbd-pmx或pbs對照的單次氣管內施用。在48小時和14天使小鼠安樂死(每組n＝3)。數據顯示nbd-pmx(表2和圖27a)或nbd-ubi樹突無毒性(表1和圖27b)。
表1
表2
探針的合成方法
基於ubiquicidin的彈性蛋白酶探針的合成(「甲基紅(mr)-aapv-nbd-ubi29-41」和「tamra-aapv-nbd-ubi29-41」)
用標準胺基酸偶聯循環(在室溫下2×30分鐘)，用～0.1mm試劑濃度的肽級dmf中的dic和oxyma、使用fmoc-策略在固相上合成mr-aapv-k(nbd)-peg-oh(al3-74)片段。在於dmf的20％哌啶中進行fmoc脫保護步驟(2×30分鐘)。在每個步驟之間，用dmf、dcm和meoh洗滌樹脂。
用於無水dcm(2ml)中的fmoc-peg-oh(3當量)和dipea(6當量)處理2g氯三苯甲基聚苯乙烯樹脂(載量～0.3mmol/g)持續3小時。洗滌和fmoc脫保護後，使用fmoc-lys(dde)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-pro-oh和fmoc-ala-oh如上所述地合成fmoc-aapvk(dde)序列。序列完成後，用一半的樹脂(0.3mmol規模)繼續合成，並使用於nmp/dcm中的nh2oh/咪唑(2×90分鐘)正交地除去dde保護基團。使用於dmf中的ndb-cl(3當量)和dipea(6當量)處理樹脂(2×45分鐘)。在fmoc脫保護後，以0.15mmol規模繼續合成，並如上所述地將甲基紅偶聯至n-末端。洗滌後，用tfa-tis-h2o(95:2.5:2.5)從樹脂上裂解片段(30分鐘)並用冷乙醚沉澱以得到al3-74(esi-ms1044.4和1066.4)。
方案1甲基紅-aapv-nbd-ubi29-41的合成
如下文所述，在rink-醯胺chemmatrix樹脂(載量1mmol/g)上合成ubi29-41序列。接下來，將於無水dmf(0.6ml)的al3-74(0.055mmol)加至chemmatrix樹脂al3-68上的ubi29-41(0.03mmol)，隨後加入hbtu(0.055mmol)和dipea(0.22mmol)。將反應混合物避光振蕩過夜。過濾後，用dmf、dcm和meoh洗滌樹脂。將樹脂用dcm溶脹、使探針脫保護並用tfa/茴香硫醚/edt/茴香醚(90:5:3:2)從樹脂上裂解(3小時)。將粗品用冷乙醚沉澱並通過離心收集。通過製備型hplc純化產物al3-79，在490nm檢測並用h2o-含0.1％甲酸的acn的梯度作為洗脫劑。maldi-tofms2719.4，＞95％hplc純度。
以相似的方式合成tamra-aapv-nbd-ubi29–41al3-88(maldi-tofms2881.5，＞95％hplc純度)，除了將片段tamra-aapv-k(nbd)-peg-oh(al3-75)偶聯至在樹脂al3-68上的ubi基的肽的n-末端。
方案2tamra-aapv-nbd-ubi29-41的合成
基於多粘菌素的nebac-探針的合成
方案3tamra-aapv-nbd-pmx的合成
用標準胺基酸偶聯循環(室溫下2×30分鐘)用於～0.1mm試劑濃度的肽級dmf中的dic和oxyma，使用fmoc-策略在固相上合成tamra-aapv-k(nbd)-peg-oh片段3a。在於dmf中的20％哌啶中進行fmoc脫保護步驟(2×30分鐘)。在每個步驟之間，用dmf、dcm和meoh洗滌樹脂。
用於無水dcm(2ml)中的fmoc-peg-oh(3當量)和dipea(6當量)處理500mg氯三苯甲基聚苯乙烯樹脂(載量～0.3mmol/g)3小時。洗滌和fmoc脫保護後，使用fmoc-lys(dde)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-pro-oh和fmoc-ala-oh如上所述地合成fmoc-aapvk(dde)序列。序列完成後，用於nmp/dcm中的nh2oh/咪唑(2×90分鐘)正交地除去dde保護基團。用於dmf中的ndb-cl(3當量)和dipea(6當量)處理樹脂(2×45分鐘)。如上所述，在fmoc脫保護後，將5個(6)-羧基tamra偶聯至n末端。洗滌後，用tfa-tis-h2o(95:2.5:2.5)(30分鐘)將該片段從樹脂上裂解並用乙醚沉澱。3aesi-ms1044.4和1066.4。
接著，向於無水dmf(0.5ml)中的3a(0.011mmol)加入hspyu(0.011mmol)和dipea(0.033mmol)，並在室溫攪拌反應1小時。加入boc-保護的多粘菌素(15mg，0.012mmol，於0.5mldmf中)和dipea(0.033mmol)，並將反應混合物避光攪拌過夜。將dmf蒸發，將粗品溶解於1mltfa-dcm(1:1)中並攪拌90分鐘。蒸發tfa-dcm，將粗品用冷乙醚沉澱並通過離心收集。通過製備型hplc純化產物，在490nm檢測並用h2o-含0.1％甲酸的acn的梯度作為洗脫劑。
maldi-tofms2151.6和2173.6，100％hplc純度。
nbd-ubi樹突的合成
單體(5)的合成
合成要求製備單體(5)，其如方案1所示以六個步驟1合成。通過將1,1,1-三(羥基甲基)氨基甲烷的羥基基團1,4-加成到丙烯腈上，然後進行氨基保護(boc)製備單體(5)。用pto2/h2使氰基氫解得到(3)，將其用ddeoh處理得到三-dde保護的胺(4)。除去boc保護基後，按照的方法製備異氰酸酯(5)。2
方案4單體(5)的合成
fmoc-rink醯胺chemmatrix樹脂(6)
將4-[(2,4-二甲氧基苯基)-(fmoc-氨基)甲基]苯氧基乙酸(rink醯胺接頭)附接到chemmatrix樹脂(lv＝1mmol/g)。因此，將fmoc-rink-醯胺接頭(0.2mmol，1當量)溶於dmf(4ml)並加入肟基氰乙酸乙酯(oxyma)(0.2mmol，1當量)，並將混合物攪拌5分鐘。然後加入n,n'-二異丙基碳二亞胺(dic)(0.2mmol，1當量)並將所得混合物再攪拌2分鐘。將溶液加至chemmatrix樹脂(0.1mmol，1.0mmol/g，1當量)並振蕩0.5小時。所得樹脂用dmf(3×5ml)、dcm(3×5ml)和meoh(3×5ml)洗滌。通過定量茚三酮測試3監測偶聯反應。
方案5nbd-ubi樹突的合成
在用fmoc-rink醯胺型接頭衍生的chemmatrix樹脂上合成探針(方案2)。用單體(5)裝載接頭(6)，得到三分支的支架(7)。除去dde基團(於dmf中的2％肼)後，依序偶聯合適的fmoc-胺基酸，然後附接4-peg-7-硝基苯並呋咱n-羥基琥珀醯亞胺酯(nbd-peg-nhs)，並使用tfa/tis/dcm(90/5/5)從樹脂裂解。
fmoc脫保護的一般程序
向樹脂(在dcm中預溶脹)中加入於dmf中的20％哌啶(5ml)並將反應混合物振蕩10分鐘。將溶液排乾並用dmf(3×10ml)、dcm(3×10ml)和meoh(3×10ml)洗滌樹脂。重複此程序兩次。通過定量茚三酮測試3監測偶聯反應。
異氰酸酯偶聯以得到(7)
向在dcm(10ml)中預溶脹的樹脂(0.30mmol)中加入異氰酸酯(6)(920g，0.93mmol)、dipea(0.2ml，0.93mmol)和dmap(22mg，0.17mmol)於dcm/dmf的混合物(1:1，5ml)中的溶液並將混合物振蕩過夜，並通過定量茚三酮測試監測反應。將溶液排乾並用dmf(3×20ml)、dcm(3×20ml)和meoh(3×20ml)和乙醚(3×20ml)洗滌樹脂。(3×20ml).通過定量茚三酮測試3監測偶聯反應。
peg偶聯-8-(9-芴基甲氧基羰基-氨基)-3,6-二氧雜辛酸(fmoc-peg-oh)偶聯
加入fmoc-peg-oh(3.0mmol，10當量)於dmf(3ml)中的溶液和oxyma(3.0mmol，10當量)並將混合物攪拌5分鐘。然後加入dic(3.0mmol，10當量)並將所得混合物再攪拌2分鐘。將溶液加至在dcm中預溶脹的樹脂(7)中並將反應混合物振蕩0.5小時。將溶液排乾並用dmf(3×10ml)、dcm(3×10ml)和meoh(3×10ml)洗滌樹脂。通過定量茚三酮測試3監測偶聯反應。
肽合成
肽序列：thr-gly-arg-ala-lys-arg-arg-nle-gln-tyr-asn-arg-arg
加入適當的fmoc-胺基酸(3.0mmol，10當量)(fmoc-arg(boc)-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-nle-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-thr(tbu)-oh)和oxyma(3.0mmol，10當量)的溶液並將混合物攪拌5分鐘。然後加入dic(3.0mmol，10當量)並將所得混合物再攪拌2分鐘。將溶液加至在dcm中預溶脹的樹脂並將反應混合物振蕩0.5小時。將溶液排乾，用dmf(3×20ml)、dcm(3×20ml)和meoh(3×20ml)洗滌樹脂。通過定量茚三酮測試3監測偶聯反應。
7-硝基苯並呋咱(nbd)偶聯
向nbd-peg-nhs(3.0mmol，10當量)於dmf(3ml)中的溶液中加入dipea(3.0mmol，10當量)。將所得溶液加至在dcm中預溶脹的樹脂(1當量)中，並將反應混合物振蕩0.5小時。將溶液排乾並用dmf(×3)、dcm(×3)和meoh(×3)洗滌樹脂。通過定量茚三酮測試3監測偶聯反應。
tfa裂解和報告子nbd-ubi樹突的純化
用tfa/tis/dcm(90/5/5，300μl)的裂解混合物處理在dcm中預溶脹的樹脂(45mg)2.5小時。將溶液排乾並用裂解混合物洗滌樹脂，並將溶液在真空下除去。將粗製材料溶解於最小量的裂解混合物(50μl)並加至冰冷的乙醚(7.5ml)中。通過離心收集沉澱的固體(22mg)並通過傾析除去溶劑，用冷乙醚(3×5ml)洗滌沉澱。然後通過製備型反相hplc純化沉澱物並將所需級分合併並凍幹，以得到nbd-ubi樹突。
nbd-ubi樹突
nbd-pmx的合成
nbd-pmx探針由其前體多粘菌素b硫酸鹽在四步中合成(方案6)。探針及其中間體是用適度修飾的報導方法1合成的。螢光團以nbd-peg的nhs酯和四-boc多粘菌素c之間的醯胺偶聯結合。在tfa裂解和hplc純化後獲得nbd-pmx探針。
方案6nbd-pmx探針的合成路線。
化合物b的製備
將多粘菌素b硫酸酯(10g，7.7mmol，1當量)溶解於ph6.5的去離子水(200ml)(使用hcl水溶液調節ph)。將木瓜蛋白酶(1.5g)溶解於水(25ml)(相同ph)。合併溶液並加入甲苯(0.5ml)並將混合物在65℃下緩慢攪拌過夜。然後將混合物在沸水中攪拌5分鐘，通過離心和過濾除去形成的沉澱物(變性的木瓜蛋白酶)。將濾液在真空下濃縮並冷凍乾燥，以定量產率得到粗產物b。該步驟不需進一步純化直接進行下一步驟。msm/z963.2(100％，[m+h]+)。
化合物c的製備：
將粗品b(5.5g，5.7mmol，1當量)溶解於h2o:二氧雜環已烷:et3n(150ml，1:1:1)的混合物中並加入boc-on(4.52g，17.1mmol，3當量)。在室溫下將溶液攪拌20分鐘，然後用甲醇氨(20ml，meoh中2m氨)猝滅。反應後，進行elsd。蒸發溶劑並將所得混合物進行矽膠色譜柱(meoh:dcm，15:85)以得到白色固體b(1.7g，22％)。msm/z1363.7(100％，[m+h]+)。
n-(4-硝基苯-2-氧雜-1,3-二唑-7-基)氨基-3,6-二氧雜辛酸(nbd-peg-oh)：2
在0℃，在一小時內，將diea(850μl，5.00mmol)和固體8-氨基-3,6-二氧雜辛酸(nh2-peg-oh)(392mg，2.40mmol，1當量)緩慢加入到nbd-cl(401mg，2.01mmol)於甲醇(20ml)中的溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌過夜。蒸發溶劑並剩餘的物質通過矽膠上的色譜法純化，用dcm/meoh(8:2)作為洗脫劑，得到nbd-peg-oh(400mg，1.23mmol，51％)的深紅色油狀物。1hnmr(500mhz,dmso):δ10.9(s,1h；cooh),8.49(d,j＝8.5hz,1h；chnbd),7.1(s,1h,nh),6.23(d,j＝8.5hz,1h；chnbd),4.25(s,2h),3.93(t,j＝5.3hz,2h；ch2),3.80(s,4h),3.72(t,j＝6.8hz,2h；ch2)ppm；ms(esi-)：對於c12h14n4o7[m-h]計算的m/z：325.1；實測：325.2。
n-(4-硝基苯-2-氧雜-1,3-二唑-7-基)氨基-3,6-二氧雜辛酸，琥珀醯亞胺酯(nbd-peg-nhs)：
向nbd-peg-oh(2.4g，7.4mmol，1當量)於無水dcm(500ml)的溶液中加入edc.hcl(1.56g,8.18mmol,1.1當量)和dipea(1.36ml,10mmol)。攪拌混合物10分鐘後，加入n-羥基琥珀醯亞胺(0.94g，8.18mmol)並允許攪拌16小時。將反應混合物用dcm(250ml)稀釋並用5％含水檸檬酸(2×200ml)、飽和的含水nahco3和鹽水處理。將有機層用na2so4乾燥、過濾並在真空下濃縮以獲得為暗棕色固體產物(1.0g，定量)。該粗品不經進一步純化被用於下一步驟。
f的製備：
將nbd-peg-nhs(466mg，1.1mmol，1當量)、dipea(384μl，2.2mmol，2當量)和胺c(1.5g，1.1mmol，1當量)於dmf(150ml)中的溶液在室溫下避光攪拌1小時。反應完成後(tlc)，在真空下除去揮發物。將粗混合物通過快速色譜法純化(dcm:meoh，90:10)以得到深橙色/棕色固體(1.2g，65％)。hplc(254nm&495nm)rt＝7.80min；m/z1671.7(25％,[m+h]+)；1693.9(65％,[m+na]+)。
nbd-pmx探針的製備：
將boc-保護的多粘菌素f(150mg，0.09mmol)於含20％tfa的dcm(2ml)的溶液在室溫下避光劇烈攪拌45分鐘。將反應混合物在真空下蒸發並將所得物溶於乙醚。離心後將乙醚層傾析(3×2ml)。將所得黃色/棕色固體(40mg，定量)在真空下乾燥。通過製備型hplc純化粗製產物，以meoh/h2o作為梯度溶劑系統，以0.1％甲酸作為添加劑。將從製備型hplc收集的級分冷凍乾燥，得到紅/橙色固體(30mg，從hplc中回收26％)。
表徵：對於分析型hplc，使用poroshell120sb-c18，2.7μm，4.6×50mm柱與二極體陣列檢測器。對於製備型hplc方法：discoveryc18反相柱(5cm×4.6mm，5μm)，流速為1ml/min，用h2o/meoh/hcooh(95/5/0.05)至h2o/meoh/hcooh(5/95/0.05)在6分鐘內洗脫，在95％meoh保持4分鐘，檢測通過elsd在254nm和495nm進行。hplc(495nm)：rt＝4.1分鐘；msm/z1271.7(95％，[m+h]+)；1293.7(100％，[m+na]+)；ftms計算值636.3282([m+2h]/2)+，實測值636.3344。
吸收/發射：467nm/539nm。
溶解性：完全溶於水。
穩定性：在室溫下穩定持續＞1周。
存儲：在惰性氣氛下儲存於-20℃。避光。
生物學方法
細菌生長：測定中使用的細菌包括銅綠假單胞菌(pa01參考菌株和來自vap患者的j3284臨床分離株)、鮑曼不動桿菌、嗜麥糖寡養食單胞菌、金黃色葡萄球菌(包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa)、甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌(mssa))、克氏肺炎桿菌、大腸桿菌、流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌。
在瓊脂肉湯、巧克力瓊脂或血瓊脂板上培養所有細菌，儲存在4℃。對於測定，使用接種環採集單菌落的細菌，並加入到50mlfalcon管中的10ml液體肉湯中。將其轉移到37℃的培養箱中，持續16小時(對於肺炎鏈球菌補充5％co2)。將培養物用作過夜培養物(穩定期)或從這些培養物中取出傳代培養物(1:100)，並培養樣品直到它們進入中對數期(在分光光度計上在595nm的讀數為0.5-0.6光密度(od))。然後將培養物在4000rpm離心5分鐘並將沉澱重懸於磷酸鹽緩衝鹽水(pbs)中。洗滌三次後，將其重構為0.5od595nm用於共聚焦測定、0.1od595nm用於流式細胞術或2od595nm用於羊離體肺實驗(除非另有說明)。
細菌計數：將樣品(製備的細菌或來自羊肺段的灌洗液)短暫渦旋，然後進行連續稀釋(1:10)稀釋至第8稀釋。將肉湯/血瓊脂板分成象限，每象限5×20ul滴。將它們在37℃下培養16小時(對於肺炎鏈球菌，補充5％co2)，並且計數板，以菌落形成單位/毫升(cfu/ml)報告數據。
表面活性劑組分合成：將表面活性劑5μg1,2-二棕櫚醯-sn-甘油醯-3-磷酸膽鹼(dppc)和2.5μgl-α-磷脂醯基-l-甘油鈉鹽(來自蛋黃卵磷脂；pg)溶於500μl氯仿中，並在圓底燒瓶中在氮氣下蒸發至薄脂質膜。將脂質膜在48℃用pbs邊攪拌(750rpm)邊再水合1小時以產生多層囊泡(multilammelarvesicles,mlv)。將它們1:4稀釋用於共聚焦實驗。
瓊脂糖細菌珠：將細菌在400mltsb中培養至中對數期，通過離心沉澱並重懸於2mlpbs中。將其與18ml熔融的胰蛋白酶-大豆瓊脂(50℃)混合併快速注入預溫至50℃的渦旋的礦物油+0.01％span80。然後將其快速冷卻至4℃同時繼續渦旋以允許珠凝固(set)。通過離心(20分鐘，3000g)將細菌瓊脂珠沉澱並用pbs中的0.5％脫氧膽酸鈉(sdc)洗滌(20分鐘，3000g)，然後用pbs中的0.25％sdc(20分鐘，3000g)洗滌、在pbs10分鐘，3000g)和3xpbs(5分鐘，200g)中洗滌。將珠以50％v/v重懸於pbs用於注入。
中性粒細胞提取：通過葡聚糖沉澱然後通過不連續血漿-percoll梯度離心從健康人志願者的外周血中分離中性粒細胞。
a549培養物：將a549細胞在補充有10％胎牛血清(fbs)、2mml-穀氨醯胺、100單位/ml青黴素g和100μg/ml鏈黴素的dulbecco改良的eagle培養基(dmem)中生長至80％融合。用胰蛋白酶-edta分散細胞並將其接種到玻璃蓋玻片或8孔共聚焦成像室上，並在dmem存在下培養至融合。
共聚焦分析：製備細菌並使用syto82核酸染料劑(invitrogen，ca，usa)在37℃和350rpm振蕩加熱塊中復染20分鐘。將它們與所需濃度的探針在密封的poc微室或8孔共聚焦室中共孵育。當需要時，將用於poc室的玻璃蓋玻片在纖連蛋白(用於中性粒細胞實驗)或聚-d-賴氨酸(用於細菌和細胞系)中包被，並在37℃與細胞孵育1小時以允許在細菌接種之前進行粘附。用imagej分析。簡而言之，syto通道被自動閾值分割(huang)，並從其產生一個roi。量化該roi內探針通道的平均螢光強度。提供的數據代表三個獨立視野的平均值。
流式細胞術：製備細菌並使用syto82核酸染料劑(invitrogen，ca，usa)在37℃和350rpm振蕩加熱塊中復染20分鐘。用pbs×3洗滌細菌並將探針(50μl)加入到50ulod5951od細菌中。將其稀釋至500ul，並使用fl-1和fl-2通道用bdfacscalibur分析10,000次事件。在fl-2通道上門控後，使用flowjo軟體分析。
肺收集和pcle程序：從註定被屠宰的剩餘庫存母羊的群組中，一隻母羊被確定並最終用過量的麻醉劑安樂死。確認死亡，確定氣管並將其原位夾住。然後進入胸腔，將肺從周圍組織和器官中釋放並整個取出心臟/肺。確定右肺動脈、插管並灌注1000ml0.9％nacl。一旦確認了左心室被填充就進行切口以允許自由引流，並繼續灌注直到來自左心房的引流澄清。釋放夾子後立即將8.0氣管內導管插入氣管。將肺置於新生兒培養箱中，環境溫度為37℃，溼度為65％，並使用壓力控制呼吸機(breasvivopv403)通氣。調整呼吸機設置以幫助最大實質細胞(parenchymal)招募，並旨在實現＞1升的潮氣容量。1小時的最佳通氣後，進行支氣管鏡檢查並鑑定各段，並注入2ml細菌或pbs對照。注入後，引入單獨的鞘(erbe)並注入探針。然後使基於探針的共聚焦雷射顯微內鏡(pcle)纖維向下通過工作通道，並將該段成像。對於balf，將支氣管鏡楔入並注入20ml0.9％nacl、小心地取出，灌洗收率為40-50％。對照段在解剖學上不同和/或在對側肺。在每個段成像之間對支氣管鏡進行消毒。
溶血測定：從新鮮採集的抗凝血的人血液分離紅細胞並在pbs(ph7.4)中重懸至20體積％。在陰性對照的情況下，在96孔微量滴定板中，將100μl紅細胞懸液加至100μl於pbs中的nllp溶液(由1:2系列稀釋製備)或100μlpbs中。百分之一百的溶血孔含有100μl的紅細胞懸液和100μl的0.2體積％tritonx-100。將板在37℃下孵育1小時，然後用150μlpbs稀釋各孔。然後將板在1,200g下離心15分鐘，將每孔的100μl上清液轉移到新鮮的微量滴定板中，測量a350。溶血百分比被確定為(a-a0)/(a總計-a0)x100，其中a為測試孔的吸光度，a0為陰性對照的吸光度，a總計為100％溶血孔的吸光度，全部在biotek讀板器上以350nm進行。
maldi-tof：將探針加至用ali孵育30分鐘的生理鹽水或來自患者的合併的balf。用5μlmecn(0.1％tfa作為添加劑)然後用20μlh2o洗滌ziptip(c-18，0.2μl)。用樣品裝載ziptip，洗滌並洗脫至5μl的80％mecn水溶液中(0.1％tfa作為添加劑)。用maldi-tof(perseptivebiosystemsvoyagerdetmstrmaldi-tof質譜儀(appliedbiosystems，fostercity，ca))分析樣品。
統計學分析：除非另有說明，所有實驗進行至少三次且結果表示為平均值±sem。通過非配對t檢驗或anova分析數據，顯著性被確定為p＜0.05(graphpadprism)。
參考文獻
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3.e.kaiser,r.l.colescott,c.d.bossingerandp.i.cook,analyticalbiochemistry,1970,34,595-598.
相關序列的列表
seqidno.1
ubiquicidin(全長)
kvhgslaragkvrgqtpkvakqekkkkktgrakrrmqynrrfvnvvptfgkkkgpnans
seqidno.2
ubiquicidin(ubi29-41)
tgrakrrmqynrr
seqidno.3
ubiquicidin(ubinle)
tgrakrrnieqynrr
seqidno.4
多粘菌素
dab＝l-α-γ-二氨基丁酸
seqidno.5
多粘菌素b1
seqidno.6
多粘菌素b2
序列表
愛丁堡大學董事會
分子探針及其使用方法
p220285wo
gb1420221.2
2014-11-13
6
patentinversion3.5
1
59
prt
智人（homosapiens）
1
lysvalhisglyserleualaargalaglylysvalargglyglnthr
151015
prolysvalalalysglnglulyslyslyslyslysthrglyargala
202530
lysargargmetglntyrasnargargphevalasnvalvalprothr
354045
pheglylyslyslysglyproasnalaasnser
5055
2
13
prt
人工序列
ubiquicidin片段
2
thrglyargalalysargargmetglntyrasnargarg
1510
3
13
prt
人工序列
具有甲硫氨酸到正亮氨酸取代的ubiquicidin片段
3
thrglyargalalysargargnleglntyrasnargarg
1510
4
10
prt
多粘芽孢桿菌（bacilluspolymyxa）
ubiquicidin
(6)..(6)
phe經歷翻譯後異構化成為d-phe
misc_binding
(10)..(10)
通過thr與第四胺基酸殘基（dbu）的結合形成的環
4
dbuthrdbudbudbupheleudbudbuthr
1510
5
10
prt
多粘芽孢桿菌
misc_binding
(1)..(1)
結合6-甲基辛酸
misc_feature
(6)..(6)
phe經歷翻譯後異構化成為d-phe
misc_binding
(10)..(10)
通過thr與第四胺基酸殘基（dbu）的結合形成的環
5
dbuthrdbudbudbupheleudbudbuthr
1510
6
10
prt
多粘芽孢桿菌
misc_binding
(1)..(1)
結合6-甲基庚酸
misc_feature
(6)..(6)
phe經歷翻譯後異構化成為d-phe
misc_binding
(10)..(10)
通過thr與第四胺基酸殘基（dbu）的結合形成的環
6
dbuthrdbudbudbupheleudbudbuthr
1510