一種包被蛋白G的檸檬黃免疫親和柱及其製備方法與流程

2023-12-04 02:58:26 1

本發明屬於食品檢驗領域，具體涉及一種包被蛋白g的檸檬黃免疫親和柱及其製備方法。

背景技術：

檸檬黃是應用最廣泛的一種人工合成色素，用於食品、藥品、化妝品、醫療器具、菸草、飼料、食用包裝、玩具等，常需要對上述產品中的檸檬黃進行定量檢測，因為如果人體攝入量檸檬黃過大，會產生傷害。在飼料中違規添加檸檬黃也嚴重影響人們的身體健康，影響畜牧業的正常發展。

目前，國家標準規定的檸檬黃檢測方法是高效液相色譜法、薄層分析法、酶聯免疫吸附試驗(elisa)、及分光光度計法等理化方法。酶聯免疫吸附試驗(elisa)具有高效、靈敏、可採樣後經簡單處理直接進行檢測等優點，但該方法也存在假陽性率偏高的缺點。hplc、lc-ms/ms法是定量分析檸檬黃最常用的方法。使用液相或液質方法檢測時，為減少雜質幹擾，降低其對檢測效果的影響，需要先對各種不同基質的樣品進行淨化處理。目前常用的淨化處理方法就是固相萃取法，也叫柱層析法。是目前淨化使用最廣泛的方法。其中，免疫親和柱方法的分析速度快，靈敏度高，分離效率和回收率高，安全可靠，因而成為最常用的方法。

用於目前製備免疫親和純化柱的方法大概有：溴化氰活化直接偶聯法、環氧氯丙烷法、過碘酸鈉法等。這些方法的基本原理都是將載體基質進行化學活化後，將抗體偶聯到載體上；蛋白g(proteing)是從鏈球菌a、c和g群很多菌株的細胞壁及培養上清中提取的能與iggfc片段特異性結合的蛋白，該蛋白能特異性的與多種動物抗體的fc部位相結合，且具有很高的親和力。雖然使用蛋白g具有高親和力，但使用蛋白g處理的載體會降低親和層析柱的洗脫速度，從而降低抗體的利用率與檢測的效率。

技術實現要素：

有鑑於此，本發明的第一目的在於提供一種檸檬黃免疫親和柱，包括載體、蛋白g和檸檬黃抗體。

優選地，本發明所述的檸檬黃免疫親和柱中，所述蛋白g包括按照genbankcaa27638.1序列表達的蛋白g，以及經過序列優化的重組蛋白g。

優選地，本發明所述的檸檬黃免疫親和柱中，所述蛋白g為基於genbankcaa27638.1經過序列優化的重組蛋白g。

優選地，本發明所述的檸檬黃免疫親和柱中，所述蛋白g通過化學鍵偶聯在載體上，檸檬黃抗體與蛋白g結合後用交聯劑交聯。

優選地，本發明所述的檸檬黃免疫親和柱中，所述的序列優化的重組蛋白g，包括降低了載體-重組蛋白g空間位阻作用，增加了重組蛋白g與檸檬黃抗體igg的結合能力的優化。

優選地，本發明所述的檸檬黃免疫親和柱中，所述重組蛋白g優化位點為截除genbankcaa27638.1序列n端53個胺基酸。

優選地，本發明所述的檸檬黃免疫親和柱中，所述的載體是瓊脂糖凝膠；所述的瓊脂糖凝膠包括溴化氰活化的瓊脂糖凝膠、交聯的瓊脂糖凝膠、聚丙烯酸瓊脂糖凝膠、聚丙烯醯胺瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠以及纖維素的一種或幾種；更優選地，所述載體為瓊脂糖sepharose4b。

優選地，本發明所述的檸檬黃免疫親和柱中，所述的抗檸檬黃抗體包括單克隆igg抗體和多克隆抗體。

本發明的另一目的在於提供一種檸檬黃免疫親和柱的製備方法，包括以下步驟：

1)載體活化；

2)重組蛋白g與活化的載體進行偶聯；

3)處理載體-重組蛋白g，並與檸檬黃抗體偶聯；

4)洗滌檸檬黃抗體-重組蛋白g-載體，裝柱即獲得檸檬黃免疫親和柱。

優選地，本發明所述的檸檬黃免疫親和柱的製備方法中，包括以下步驟：

1)瓊脂糖sepharose4b，加入0.8m的naoh，30％的環氧氯丙烷，2mg/ml的硼氫化鈉nabh4,在25℃下搖床反應8h進行活化；

2)每克活化的sepharose4b加入30～200nmol的重組蛋白g，在0.1mnahco3，0.5mnaclph8.8的緩衝液中，室溫偶聯2h，或者4℃偶聯過夜；

3)偶聯產物用1mtris·hclph8.0室溫反應2h；

4)偶聯好的sepharose-蛋白g，用20mmph7.4的pbs洗滌；

5)將檸檬黃抗體溶解在20mmph7.4的pbs中，每克蛋白g-sepharose加入200nmol～1.2umol抗體，室溫反應30分鐘；

6)將檸檬黃抗體-白g-sepharose載體用20mmpbsph7.4洗滌，然後加入終濃度0.2m的三乙醇胺和20mm的二甲基庚二酸酯(dmp)，ph8.3，室溫反應1h；

7)用20mmph7.4的乙醇胺終止反應，用含有0.01％硫柳汞的10mmpbsph7.4洗滌檸檬黃抗體-重組蛋白g-sepharose載體，裝柱，放於4℃保存；

其中，所述重組蛋白g為基於genbankcaa27638.1經過序列優化的重組蛋白g。

由上可知，本發明至少具有以下優點：

與現有技術相比，本發明具有如下優點：

1)我們克隆重組了蛋白g(genbankcaa27638.1)的基因序列，在大腸桿菌中表達出了與抗體有高親和力的基因重組蛋白g。利用了蛋白g與ig抗體特異性結合的特點，igg抗體由兩條重鏈和兩條輕鏈構成，抗體分為fab區和fc區，其中，fab區是抗原結合的區域。蛋白g是鏈球菌細胞壁上的一種特殊的蛋白，與抗體的fc區域有特異性的結合能力。蛋白g與抗體結合後，抗體的fab區域游離在外，不影響抗體的抗原結合能力。經過我們基因優化重組後的蛋白g，1個分子的蛋白g可以結合3個分子的igg抗體，具有很高的抗體親和力。並且只有抗體能與蛋白g結合，其餘蛋白均不能與蛋白g結合，特異性很高。以此蛋白g為基礎製備的免疫親和柱具有特異性好，檸檬黃結合量大，純化效率高的特點。

將基因重組的蛋白g偶聯到瓊脂糖載體上後，再進行檸檬黃抗體偶聯，與傳統的直接偶聯相比，以基因重組的蛋白g為中間間臂偶聯到載體上後，降低了空間位阻作用，增加了重組蛋白g與檸檬黃抗體igg的結合能力，使雜質能夠充分的流出，增強了淨化效果，從而使抗體的fab端朝向外側，空間位阻不對抗原結合區域構成幹擾，將載體先經蛋白g處理後，再進行抗體偶聯，不僅可提高不同淨化柱間的均一性，而且能提高抗體的利用率。

以本發明的重組蛋白g預處理瓊脂糖，基於proteing和igg的特殊親和力，proteing與抗體fc片段結合後，fab片段伸展在外，更容易抓取抗原。直接用抗體偶聯瓊脂糖，抗體在瓊脂糖上的結合方向和部分是隨機的，而抗體在經proteing預先處理的瓊脂糖上的抗體具有一致方向性，在一定的免疫親和柱柱容量的條件下，抗體的用量更少，從而抗體利用效率更高，而且通過這種方式製備得到的免疫親和柱批次內、批次間的重複性更好，柱間的差異更低。

因此，通過設計重組蛋白g使其與igg抗體特異性結合，使抗體通過蛋白g偶聯到載體上。並且使得igg抗體的fab片段充分的暴露在外，大幅度提高了檸檬黃的捕獲能力，檸檬黃的純化效率也得到有效提高。

2)本發明使用了基因改造後的蛋白g，通過對密碼子的優化和igg結合域基因的優化。使蛋白g的抗體結合能力大幅度提高，進而提高了檸檬黃的純化效率。

3)使用本發明純化檸檬黃操作簡便，幾步就可以得到純度較高的檸檬黃，更方便操作者使用。

4)使用本發明得到的檸檬黃純度很高，後續不用再做別的純化處理就可以直接用於高效液相色譜檢測，節省了操作者的時間和費用。

附圖說明

圖1為本發明的一個實施例中的檸檬黃免疫親和柱結構示意圖；

圖2為本發明的一個實施例瓊脂糖載體經重組蛋白g偶聯後進一步與檸檬黃抗體偶聯示意圖；

圖3為瓊脂糖載體直接與檸檬黃抗體偶聯示意圖；

圖4為瓊脂糖載體直接與檸檬黃抗體偶聯示意圖中圖標含義圖；

圖5為溶液中檸檬黃初始濃度對淨化柱的目標物吸附容量的影響示意圖；

圖6為檸檬黃免疫親和柱貯存穩定性示意圖。

具體實施方式

在本發明的一個實施例中，提供了檸檬黃免疫親和柱及其製備方法:

1.載體活化

選擇瓊脂糖載體sepharose4b，以環氧氯丙烷活化法進行活化。

取2％的預溶脹的瓊脂糖凝膠sepharose4b，用20倍體積的蒸餾水充分衝洗，洗去殘存的乙醇，用漏鬥過濾掉水分。

稱取濾去水份後的溼凝膠5克，加入7.5毫升0.8m的naoh，30％的環氧氯丙烷2毫升，2mg/ml的硼氫化鈉nabh4，5毫升，在25℃下搖床反應8小時。反應後，用大量的蒸餾水洗滌，去除凝膠中混雜的環氧氯丙烷。

2.將重組蛋白g與活化載體sepharose4b的偶聯

將活化好的瓊脂糖凝膠sepharose4b用偶聯緩衝液(0.1m的nahco3，0.8mnacl，ph8.9)洗滌3次。每克活化的sepharose4b加入30-200nmol的蛋白g，室溫偶聯2小時，或者4℃偶聯過夜。偶聯產物用1mtris·hclph8.030℃氮氣保護下反應2h。

將偶聯好的瓊脂糖載體用20mm，ph7.4的磷酸緩衝液pbs洗滌3次。偶聯有重組蛋白g的瓊脂糖載體sepharose命名為重組蛋白g-sepharose。

其中，重組蛋白g為將蛋白g序列(genbankcaa27638.1，seqidno：1)，截除n端53個胺基酸後得到重組蛋白g序列(seqidno2)交由吉爾生化(上海)有限公司合成。

3.檸檬黃抗體與重組蛋白g-sepharose載體上的重組蛋白g連接

重組蛋白g與抗體具有特異性的親和力，在一定的反應條件下，將偶聯有蛋白g的瓊脂糖凝膠與抗體進行連接，將抗體連接於瓊脂糖上。由於蛋白g與抗體的結合部位是抗體的fc區域，抗體的抗原結合區不受影響，充分保證了抗體的抗原結合能力。

將檸檬黃抗體溶解在20mmph7.4的pbs中，每克蛋白g-sepharose加入150nmol～1.0umol抗體，室溫反應30分鐘。結合後的載體用pbs洗滌。連接有抗體的載體命名為抗體-蛋白g-sepharose。

4.載體交聯

將抗體-蛋白g-sepharose用20mmpbsph7.4洗滌3次。然後加入終濃度0.2m的三乙醇胺和20mm的二甲基庚二酸酯(dmp)，ph8.3，30℃氮氣保護下反應1h。

加入20mm，ph9.0的乙醇胺終止反應，用含有0.01％硫柳汞的10mmpbsph7.4洗滌檸檬黃抗體-蛋白g-sepharose載體。

5.裝柱

將交聯後的檸檬黃抗體-蛋白g-sepharose根據需要裝入層析柱中，放於4℃保存，可根據實際需要製備不同容量目標物檸檬黃的檸檬黃親和純化柱。

以下通過具體實施例進一步對本發明的技術方案進行說明，應理解以下僅為本發明的示例性說明，並不用於限制本發明權利要求的保護範圍。

實施例1檸檬黃免疫親和純化柱的製備

1.瓊脂糖凝膠活化

取2％的瓊脂糖凝膠sepharose4b，用20倍體積的蒸餾水充分衝洗，洗去殘存的乙醇。用漏鬥過濾掉水分。稱取濾去水份後的溼凝膠5g，加入7.5ml0.8m的naoh，30％的環氧氯丙烷2ml，2mg/ml的硼氫化鈉nabh4，5ml，在25℃下搖床反應8h。反應後，用50ml蒸餾水洗滌，去除凝膠中混雜的環氧氯丙烷。

2.重組蛋白g與活化的瓊脂糖凝膠的偶聯

取1克活化後的瓊脂糖凝膠，用偶聯緩衝液(0.1m的nahco3，0.8mnacl，ph8.9)洗滌3次。加入2mg/ml的蛋白g20ml，室溫偶聯4h。

將偶聯好的瓊脂糖載體用20mm，ph7.4的磷酸緩衝液pbs洗滌3次。偶聯有重組蛋白g的瓊脂糖載體sepharose命名為重組蛋白g-sepharose。

3.抗檸檬黃igg單抗與蛋白g-sepharose結合

將抗檸檬黃抗體溶於20mm、ph7.4的pbs中，終濃度2mg/ml，總體積10ml。

將蛋白g-sepharose用20mmph7.4的pbs緩衝液洗滌三次，每次30ml。將溶解於pbs中的檸檬黃抗體加入洗滌過的蛋白g-sepharose中，室溫結合30min。

結合後的載體用20mmph7.4的pbs洗滌三次，每次30ml。連接有抗體的載體命名為抗體-蛋白g-sepharose。

4.結合igg的瓊脂糖sepharose交聯

將抗體—蛋白g-sepharose用0.1mph9.0的硼酸緩衝液洗滌3次，每次30ml。

將溼凝膠固體，加入0.1mph9.0的硼酸緩衝液20ml，在緩衝液中加入交聯劑庚二亞氨酸二甲酯(dmp)至終濃度20mm。室溫交聯1h。

加入100mm，ph9.0的乙醇胺20ml終止反應。並用50mm的乙醇胺20ml封閉10分鐘。

交聯後的抗體-蛋白g-sepharose載體用20mm，ph7.4的pbs洗滌3次，每次30ml。

5.裝柱

將交聯後的sepharose重懸於10ml20mmpbsph7.4，然後裝入空的親和純化柱柱體中。

實施例2：利用檸檬黃免疫親和柱純化和檢測玉米蛋白粉中的檸檬黃

1、樣品處理

1)稱取2.0玉米蛋白粉樣品至50ml離心管中；

2)加入18ml乙腈水溶液(v/v50:50)，用渦旋儀或均質器振蕩混勻，超聲振蕩提取2min，1500r/min振蕩提取3min；

3)室溫下4000g離心3min，小心取出5ml上層液到一新離心管，50℃氮氣吹乾(幹後立即取出)；

4)用10mlpbs(0.01mph7.4)緩衝液復溶後全部上樣。

2、將檸檬黃免疫親和純化柱室溫平衡30min；

3、取出免疫親和柱，進樣口與注射器針筒連接，注射器接入到氣控操作架上；

4、用去離子水洗滌親和柱3次，每次10ml，調節氣孔操作架氣泵壓力，使液體以3滴/秒的流速流出；

5、將樣品加入純化柱中，調節流量至1～2滴/秒。直至樣品全部流出純化柱。

6、用蒸餾水洗滌純化柱3次，每次5ml。

7、加入1ml甲醇，收集洗脫產物。

8、洗脫產物用高效液相色譜hplc檢測。

1)、檸檬黃標準品的配製

1.1)取檸檬黃標準品，用0.01mph7.4的pbs緩衝液溶解，並稀釋到3ppb；

1.2)取稀釋好的檸檬黃標準品10ml，全部上樣檢測；

2)、將檸檬黃免疫親和純化柱室溫平衡30min；

3)、取出免疫親和柱，進樣口與注射器針筒連接，注射器接入到氣控操作架上；

4)、用去離子水洗滌親和柱3次，每次10ml，調節氣孔操作架氣泵壓力，使液體以3滴/秒的流速流出；

5)、將樣品加入純化柱中，調節流量至1～2滴/秒。直至樣品全部流出純化柱；

6)、用蒸餾水洗滌純化柱3次，每次5ml；

7)、加入1ml甲醇，收集洗脫產物；

8)、洗脫產物用高效液相色譜hplc檢測。

液相條件：

色譜柱：kromasilc18250mm×4.6mm5μm

流動相a：甲醇；流動相b：5mmol/l乙酸銨

流動相梯度程序

柱溫：35℃；進樣量：10μl；檢測波長254nm；流速：1.0ml/min。

實施例3：檸檬黃免疫親和柱柱容量的測定兩種方法製備的淨化柱性能比較

先經蛋白g處理的淨化柱的製備

按實施例2進行製備

未經蛋白g處理的淨化柱的製備

直接偶聯法製備親和柱

1、載體活化

選擇瓊脂糖載體，sepharose4b，以環氧氯丙烷活化法進行活化。

取2％的預溶脹的瓊脂糖凝膠sepharose4b，用20倍體積的蒸餾水充分衝洗，洗去殘存的乙醇，用漏鬥過濾掉水分。

稱取濾去水分後的溼凝膠5g，加入7.5ml0.8m的naoh，30％的環氧氯丙烷2ml，2mg/ml的硼氫化鈉nabh4，5ml，在25℃下搖床反應8h。

反應後，用大量的蒸餾水洗滌，去除凝膠中混雜的環氧氯丙烷。

2、抗檸檬黃抗體與sepharose載體連接

在一定的反應條件下，將瓊脂糖凝膠與抗體進行連接，將抗體連接於瓊脂糖上。

將檸檬黃抗體溶解在20mmph7.4的pbs中，每克sepharose加入200nmol～1.2μmol抗體，室溫反應30min。

結合後的載體用pbs洗滌。連接有抗體的載體命名為抗體-sepharose。

3、載體交聯

將抗體-sepharose用20mmpbsph7.4洗滌3次。然後加入終濃度0.2m的三乙醇胺和20mm的二甲基庚二酸酯(dmp)，ph8.3，室溫反應1小時。

加入20mm，ph9.0的乙醇胺終止反應，用含有0.01％硫柳汞的10mmpbsph7.4洗滌檸檬黃抗體-sepharose載體。

4.裝柱

將交聯後的抗體-瓊脂糖載體根據需要裝入層析柱中，放於4℃保存可根據需要製備不同容量的檸檬黃親和純化柱。

柱容量

2ml濃度為100ng/ml的檸檬黃pbs溶液上樣，然後用淋洗柱子最後用5ml洗脫液100％甲醇將目標物洗脫，hplc檢測，按照下列公式，計算柱容量。

取按如附圖1填充好的淨化柱，將1ml一定濃度的檸檬黃目標物pbs溶液以1ml/min流速過柱，用10ml超純水洗柱，以洗去非特異性吸附在柱子上的雜質，用1ml甲醇洗脫，上hplc進行定量檢測，測定淨化柱對目標物的「捕獲」容量的測定。

圖2示出了瓊脂糖載體經重組蛋白g偶聯後進一步與檸檬黃抗體偶聯示意圖，圖3示出了瓊脂糖載體直接與檸檬黃抗體偶聯示意圖，其中，圖4中示出了圖2、圖3中各個圖示分別代表瓊脂糖、檸檬黃抗體與重組蛋白g。

在淨化過程中，在過柱體積一定的情況下，隨著待淨化溶液中目標物濃度的增加，淨化柱中被「捕獲」的目標物的吸附量會隨之增加，但其吸附量不會隨著目標物濃度的增加而無限增加，淨化柱中抗體有一定的吸附容量——飽和吸附容量。本實驗首先考察了淨化柱中抗體對目標物的吸附量與溶液中目標物初始濃度的關係。圖5是目標物初始濃度對淨化柱中抗體吸附量的影響曲線。由圖5可知，總體上淨化柱中抗體對目標物的吸附量隨著待淨化液中目標物濃度的增加而增加。但此曲線還可分為二個區域，區域1：待淨化液中目標物初始濃度低於180ng/ml時，隨著待淨化液中目標物初始濃度的增加，吸附量增加很快；區域2：被吸附物質初始濃度高於180ng/ml時，隨著待淨化液中目標物初始濃度的增加，淨化柱中抗體對目標物的吸附量基本不變。由於預先經proteing處理後的蛋白的構象，使抗體能有效與抗原目標物有效的結合，導致在同樣數量的淨化載體條件下，經proteing處理後的吸附載體對抗原目標物的吸附量(吸附容量約為260ng/ml)高於未經proteing處理的吸附載體(吸附容量約為180ng/ml)。

實施例4檸檬黃免疫親和柱穩定性

將製備好的免疫親和柱分別經4℃冰箱保存，分別選取0、20、40、60、90d等不同時間點，將免疫親和柱及各種緩衝液平衡至室溫，按測定柱容量的操作方法，對其進行添加回收實驗，hplc檢測洗脫液中檸檬黃含量，重複操作5次，通過計算平均回收率評價親和柱的穩定性。結果見圖6，隨著貯存時間的增長，淨化柱的淨化性能有一定程度的下降，由96％降低到80％，基本可滿足測試的要求。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。

sequencelisting

中國農業科學院飼料研究所

一種包被蛋白g的檸檬黃免疫親和柱及其製備方法

2

patentinversion3.5

1

480

prt

蛋白g

1

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