重組修飾的纖溶酶的製作方法

2023-12-01 12:16:06 2

專利名稱：重組修飾的纖溶酶的製作方法
重組修飾的纖溶酶相關申請的交叉引用本申請根據35 USC §119要求在2007年11月29日提交的美國臨時申請 60/991，148的優先權，通過引用將其併入本文。
背景技術：
人纖溶酶原是單鏈蛋白質，含有791個胺基酸殘基。酶原中Arg561_Val562肽鍵 的單一的切割引起纖溶酶原激活成為纖溶酶。產生的纖溶酶分子是具有胰蛋白酶樣特異性 (在Lys和Arg之後切割)的雙鏈的二硫鍵連接的絲氨酸蛋白酶。纖溶酶的氨基-末端重鏈(殘基1-561， 60kDa)由五個三環域(Kringle domain)組成，每個都含有大約80個胺基酸殘基。三環域負責纖溶酶原的調控特性，如與 激活抑制子(例如，Cr1離子)的相互作用；與激活刺激子(例如胺基酸)的相互作 用；與哺乳動物和細菌細胞的相互作用；以及與其他蛋白質(如纖溶酶生理底物纖維蛋白 和纖溶酶抑制子α 2-抗纖溶酶的相互作用)。所有五個三環中，三環1是最具多功能性 的一個已經顯示其賴氨酸結合活性負責纖溶酶與α 2-抗纖溶酶和纖維蛋白的相互作用。 β Wiman, B.，等人，Biochim. Biophys. Acta 579 142-154 (1979)；及 Lucas，Μ. Α.，等人， J. Biol. Chem. 258 :4249_4256 (1983)。纖溶酶的C-末端輕鏈(殘基562-791， 25kDa)是典型的絲氨酸蛋白酶，與胰蛋 白酶同源，並含有經典的絲氨酸蛋白酶催化三聯體HiS603、ASp646和Ser741。纖溶酶原含 有24個二硫鍵橋及位於Asn289和Thr346的2個糖基化位點。已顯示纖溶酶原被彈性蛋白酶有限蛋白水解產生三個主要片段 (Sottrup-Jensen, L.，等人，Prog. Chem. Fibrinol. Thrombo 1.，3 191-209 (1978))。第一 個片段K1-3包括前三個三環，可以分離為兩種形式，Tyr80-Val338和Tyr80_Val354。第 二個片段K4對應於第四個三環，包括殘基Val355-Ala440。最後一個，C-末端片段(所謂 的小_纖溶酶原)包括殘基Val443-ASn791，並由第五個三環及絲氨酸蛋白酶結構域構成。 小_纖溶酶原能以與纖溶酶原相同的方式被激活，形成小_纖溶酶。由於全長纖溶酶原分子的複雜結構，不能證明細菌表達系統可用於重組纖溶酶原 的生產。纖溶酶原以不溶性包涵體形式生產，不能從該狀態重摺疊。進一步地，纖溶酶原在 哺乳動物細胞中的表達由於細胞內纖溶酶原激活為纖溶酶並產生細胞毒性而變得複雜。使 用昆蟲細胞進行完全活性纖溶酶原的生產是可能的，然而，由於產量低該系統不適合於大 規模生產。進一步地，與任何重組蛋白的方案相同，接受治療性重組蛋白質的受試者中存在 遇到免疫原性問題的可能。免疫原性是有效和/或高效利用特定重組蛋白質治療方案的障礙。免疫原性是對 於被認為是外來的物質(例如，蛋白質的化學結構，包括胺基酸序列)的一系列複雜反應， 並且可能包括產生中和及非中和抗體、免疫複合體形成、補體激活、肥大細胞激活、炎症及 過敏性反應。免疫原性可以多重方式限制蛋白質治療劑的效力和安全性。效力可直接通過 形成中和抗體的形成被減少。效力還可以間接減少如結合於中和或非中和抗體一般導致 其從血清中被迅速清除。當引發免疫反應時會發生嚴重的副作用甚至死亡。當中和抗體與
4內源蛋白質交叉反應並阻斷其功能時，產生一類特殊的副作用。因此，需要經修飾的重組蛋白質，其具有纖溶酶/纖溶酶原的理想特徵(例如，具 有天然樣的化學結構的區域)而同時缺少特定負面特徵，且能夠在重組蛋白質表達系統 (包括細菌細胞)中大量產生。發明概述在一方面，本發明提供包含編碼多肽的核苷酸序列的多聚核苷酸，所述多肽具有a)與天然人纖溶酶原的三環域同源的單個N-末端三環域，其中三環域內最後四 個胺基酸殘基為V、P、Q和C;和b)與人纖溶酶原中對應結構域同源的C-末端結構域激活位點和絲氨酸蛋白酶結 構域；其中多肽結合於固定化的賴氨酸。在另一方面，本發明提供多肽，其包含a)與天然人纖溶酶原的三環域同源的單個N-末端三環域，其中三環域內最後四 個胺基酸殘基為V、P、Q和C;和b)與人纖溶酶原中對應結構域同源的C-末端結構域激活位點和絲氨酸蛋白酶結 構域；其中多肽結合於固定化的賴氨酸。在另一方面，本發明提供包含本發明多聚核苷酸的表達載體。在一個實施方式中， 多聚核苷酸包含如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。在一些方面，本發明提供培養的細胞，其包含具有本發明的多聚核苷酸的表達載 體。在一個實施方式中，所述多聚核苷酸包含如SEQID NO :1所示的核苷酸序列。在另一個 實施方式中，培養的細胞為原核生物。在一個實施方式中，原核生物為大腸桿菌(E.coli)。在一方面，本發明提供用於製備一種或多種重組纖溶酶多肽的方法。該方法包 括a)提供多肽，其具有與天然人纖溶酶原的三環域同源的單個N-末端三環域，其中 三環域內最後四個胺基酸殘基為V、P、Q和C ；以及與人纖溶酶原中對應結構域同源的C-末 端結構域激活位點和絲氨酸蛋白酶結構域；其中多肽結合於固定化的賴氨酸；和b)將步驟a)中提供的多肽在足以切割一個或多個肽鍵的條件下與蛋白酶接觸， 從而形成一種或多種重組纖溶酶多肽。在一個實施方式中，提供包括在合適宿主中表達具 有對應於如SEQ ID NO :1所示序列的序列的開放閱讀框，或其簡併變體。在另一個實施方 式中，多肽具有如SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列。圖像簡述

圖1為天然纖溶酶被蛋白水解切割而激活後的示意圖。K1-K5為三環區域1-5 ；SP 為絲氨酸蛋白酶結構域。「0 24 」為三環1上的Ci2-抗纖溶酶結合位點。圖2為本發明的纖溶酶原缺失突變體的示意圖，使用了與圖1相同的命名，顯示了 K2-5的缺失。圖3顯示了人纖溶酶原的胺基酸序列，顯示了 19-殘基的先導序列，編號為-19 至-1，纖溶酶原序列顯示為殘基1-791 (見SEQ IDNO :3，人纖溶酶原的cDNA序列；及SEQ ID NO :4，所編碼的胺基酸序列，如圖3所示)。顯示了許多特徵，包括以下(TAL6003)-纖 溶酶原序列(陰影部分)的一個實施方式；三環域1-5 (雙下劃線)；糖基化位點Ash289和 Thr346(加粗)；Arg-Val激活位點(R561V562,加粗)；及三環1中的賴氨酸結合位點(下劃線
5並具有特異性位置編號)。圖4顯示天然人纖溶酶(原)的五個三環域(1-5)之間的多肽序列比較(即，缺 口比對)。與三環1中同一個相對位置上的相同的胺基酸殘基以下劃線顯示。圖5顯示血漿衍生的纖溶酶製備物(泳道1 =非還原(NR)；泳道2 =還原(R)) 及(TAL6003)-纖溶酶(泳道3 =非還原(NR)；泳道4 =還原(R))製備物的8-25%梯度 SDS-PAGE。鏈激酶分別將血漿衍生纖溶酶原和(TAL6003)-纖溶酶原激活為天然纖溶酶和 重組(TAL6003)-纖溶酶，使得形成對應於三環和絲氨酸蛋白酶結構域的兩條帶。這樣，在 電泳前與還原性試劑二硫蘇糖醇(DTT) —起溫育後，血漿衍生纖溶酶和(TAL6003)-纖溶酶 (其在非還原膠上是單個條帶)被還原成在同一個非還原膠上對應於三環1(下方條帶)和 絲氨酸蛋白酶結構域(上方條帶)的兩條帶。圖6為鏈激酶激活(TAL6003)-纖溶酶原的示意圖。圖7為色譜圖，顯示了(TAL6003)-纖溶酶原結合於賴氨酸-SEPHAROSE 4B 將0. 5mg純化的(TAL6003)-纖溶酶原應用到用pH7. 4的Tri s緩衝鹽水平衡的賴氨 酸-SEPHAROSE 4B柱子(1x3cm)上。用0_20mM梯度的ε -氨基己酸(ε -ACA)將結合的蛋 白質從柱子上洗脫，作為單一的峰。280nm處的吸光度與ε-ACA濃度作為洗脫劑體積的函 數顯示於圖像中。 圖8顯示(TAL6003)-纖溶酶原與纖維蛋白的結合，通過其隨後被tPA激活的情況 及所得的凝塊溶解進行評估。圖9顯示(TAL6003)-纖溶酶與血漿衍生纖溶酶的溶解血栓效力的體外比較。圖10示例顯示了(TAL6003)-纖溶酶(SEQ ID NO 2)的二硫鍵模式。在圖中，(X) 代表胺基酸序列RDVVLFEK。發明詳述本發明人已經發現新型重組纖溶酶原多肽或其變體，本文稱為(TAL6003)-纖溶 酶原，其具有天然纖溶酶原樣特徵，雖然從其結構中刪除了 4個三環。這些(TAL6003)-纖 溶酶原或其變體為能夠在激活事件(至少涉及位於酶原的三環域和絲氨酸蛋白酶結構域 之間的Arg-Val肽鍵的蛋白水解切割)之後被激活成為功能性纖溶酶酶類(本文稱為 (TAL6003)-纖溶酶)的酶原。本發明的(TAL6003)-纖溶酶原或其變體具有纖維蛋白全長天然人纖溶酶原的結 合纖維蛋白、結合抗纖溶酶，以及激活屬性。此外，(TAL6003)-纖溶酶原具有許多新型的和 理想的特徵，包括在重組生產中高水平表達以及與天然發生的人血漿衍生纖溶酶原相同的 或非常類似的特定的蛋白質化學結構。根據本發明的(TAL6003)-纖溶酶(原)能夠至少依據以下幾點定性i) (TAL6003)-纖溶酶原激活後產生的(TAL6003)-纖溶酶分子量較低(例如，在一 個實施方式中為大約36，911-大約37，039Da)，由此引起特異性活性(每mg蛋白質)的增 加；ii)缺少至少兩個在天然蛋白質中發現的糖基化位點(見圖3，S卩，N289和T346)，這 與相對低的分子量一起促進了使用相對廉價的細菌和酵母表達系統進行此蛋白的重組生 產；iii) (TAL6003)-纖溶酶原能夠被纖溶酶原激活子tPA、尿激酶和鏈激酶激活；
iv)與天然人纖溶酶的原三環域同源的單個N-末端三環域的存在保留了纖溶酶 與纖維蛋白結合的屬性，這對於溶解血栓效力是重要的；ν)與天然人纖溶酶的原三環域同源的單個N-末端三環域中α 2_抗纖溶酶-結合 位點的存在使得(TAL6003)-纖溶酶被此纖溶酶生理學抑制子迅速抑制(能夠阻止流血的 一個特徵)；vi) (TAL6003)-纖溶酶較小的大小能夠促進其被α 2-巨球蛋白抑制，相對於天然 纖溶酶進一步減少發生流血併發症的機會。在具體實施方式
中，三環5的缺乏(保留了完 整的、未消化的纖維蛋白(原)的主要結合位點)使得能夠利用具有減少的循環纖維蛋白 原缺失的(TAL6003)-纖溶酶；vii)與天然人纖溶酶的原三環域同源的單個N-末端三環域(其中三環域內最後 四個胺基酸為V、P、Q和C)的存在提供了與絲氨酸蛋白酶結構域的天然樣連接(即，與人纖 溶酶原三環5結構域和絲氨酸蛋白酶結構域之間天然發生的結構域連接處類似的連接)； 及viii)表達重組(TAL6003)-纖溶酶原後，其N-末端可向後切割(即，在激活過程 中向後切割)以提供天然樣N-末端。通常，本發明提供重組(TAL6003)-纖溶酶(原)多肽，其具有激活位點N-末端的 單個三環區域和絲氨酸蛋白酶結構域，相比小-纖溶酶(原)有特定優勢。儘管本發明的 (TAL6003)-纖溶酶原只有一個例如激活位點N-末端的三環域，一些實施方式包括激活位 點N-末端的其他序列。其它N-末端序列可以衍生自纖溶酶原的天然三環區域的序列。本發明N-末端三環域包括天然纖溶酶(原)三環1和4的三環域序列及其功能 等價物。具體而言，見以下討論，其中提供了關於多肽變體中功能保留的指導，包括參與或 影響賴氨酸_結合的殘基的保留。進一步地，本發明多肽的具體實施方式
由於天然樣結構所以能夠顯示出減少的免 疫原性。例如，在一些實施方式中，本發明的重組纖溶酶原具有與天然發生的人血漿衍生纖 溶酶原形式之一相同的N-末端，其在被鏈激酶激活後產生包含天然樣N-末端的纖溶酶多 肽。此外，本發明的新型多肽在三環和絲氨酸蛋白酶結構域之間具有一個序列，其類似於天 然發生人纖溶酶三環5和SP結構域之間的連接點。定義如本文使用的，術語多肽的「結構域」和「區域」 一般是同義的，除非另外指出是相 反的情況。當與公認的結構或功能名稱如「三環」或「絲氨酸蛋白酶」等一同提到時，這些 術語介紹的是多肽特徵，其與至少一些通常認可並理解為與對應於這些名稱的多肽結構相 關的特性是相關的。如本文使用的，「培養的宿主細胞」指的是含有已經通過任何方式引入細胞的異源 DNA的原核或真核細胞，所述方式例如，電穿孔、磷酸鈣沉澱、顯微注射、轉化、病毒感染等寸。如本文使用的，「異源的」意思是「不同於天然來源的」或代表非天然狀態。例如， 如果培養的宿主細胞用衍生自另一種生物(特別是來自另一個物種)的DNA或基因轉化， 該基因對於所培養的宿主細胞以及對於攜帶此基因的培養的宿主細胞的後代是異源的。類 似地，「異源的」指衍生自並插入到相同天然、原始細胞類型的核苷酸序列，但其以非天然狀
7態存在，例如，有不同拷貝數或受到不同調節元件的控制。進一步地，當用於核酸或胺基酸 序列的情況時，術語「異源的」還可以指此序列上的與同一序列的另一區域具有不同天然來 源的任意區域。例如，如果重組蛋白質包含衍生自載脂蛋白(a)的三環域及衍生自纖溶酶 原的絲氨酸蛋白酶結構域，此三環域和絲氨酸蛋白酶結構域相對彼此為「異源的」，尤其是 當每個結構域衍生自不同物種或生物時。「載體」分子是其中可以插入異源核酸的核酸分子，其然後能引入恰當的培養的宿 主細胞中。載體優選地具有一個或多個複製起點以及一個或多個其中可以插入重組DNA的 位點。載體經常有方便的方法將具有載體的細胞從那些不具有載體的細胞中挑選出來，例 如，其編碼藥物抗性基因。常見載體包括質粒、病毒基因組和(主要在酵母和細菌中)「人 工染色體」。如本文使用的，術語「轉錄控制序列」指的是這樣的核酸序列，如起始子序列、增強 子序列和啟動子序列，其誘導、抑制或控制可操作地連接於其上的編碼蛋白質的核酸序列 的轉錄。術語「多肽」在本文與術語「肽」和「蛋白質」交換使用。術語「多聚核苷酸」和「核酸」在本文交換使用，可以指任何含有上下文指出的目 的所需信息的核酸。即，核酸可以是DNA或RNA，單鏈或雙鏈的，或其他核酸，只要多聚體能 夠代表恰當的信息，例如，關於編碼的肽，且包括互補序列，例如，核酸多聚體的正義鏈和反 義鏈。術語多肽的「變體」指的是一個或多個胺基酸發生改變的胺基酸序列。變體可以 有「保守」變化，其中被取代的胺基酸具有類似結構或化學屬性，例如，以異亮氨酸代替亮氨 酸。備選地，變體可以具有「非保守」變化，例如，以色氨酸代替甘氨酸。類似的微小變化還 可以包括胺基酸缺失或插入，或二者。「變體」多肽的特定形式是「功能上等價的」多肽，即， 顯示出與本發明多肽的實例基本類似的體內或體外活性的多肽，如下文更詳細描述的。可 以使用本領域熟知的電腦程式找到關於確定哪些胺基酸殘基能夠被取代、插入或缺失而 不消除生物學或免疫學活性的指導，例如DNASTAR軟體(DNASTAR，Inc.，Madison, WI)。進 一步地，下面提供了具體指導，包括引用的參考文獻中提供的指導，其全部通過引用併入本 文。術語「N-末端」和「C-末端」用在本文以指應用這些術語的任何胺基酸序列或多 肽結構域或結構的相對位置。相對定位將從上下文變得清楚。也就是，「N-末端」特徵比相 同上下文討論的另一特徵(其他特徵可能被稱作相對於第一個特徵位於「C-末端」)將位 於距離多肽分子N-末端至少更近的地方。類似地，術語「5』 -」和「3』 _」可以用於本文以 指多聚核苷酸特徵的相對位置。本文所指的具有「與天然人纖溶酶原的三環域同源的」N-末端結構域的多肽顯 示出類似於天然纖溶酶原三環域的結構和功能特徵。進一步地，本文所指的具有「與三 環1同源的」的N-末端結構域的多肽顯示出類似於天然三環1的特徵，類似的程度至少 達到多肽能夠比三環5具有更高的對於ω-氨基羧酸(及功能同源物如反式-4-氨甲基 環己烷-1-羧酸，一種環酸)的親和力。對於比較分離的三環域多肽結合5-氨基戊酸 (5-ΑΡηΑ) ；6-氨基己酸(6_ΑΗχΑ)，也稱為ε -氨基己酸(ε ACA) ；7_氨基庚酸(7-ΑΗρΑ)；和 反式-4-氨甲基環己烷-1-羧酸(t-AMCHA)的條件和操作流程參見，例如，Chang, Y.，等人，Biochemistry37 :3258_3271 (1998)，通過引用併入本文。「與三環4同源的」三環域的提法的定義類似於上文關於「與三環1同源的」詞語。 也就是，其顯示出類似於上文討論的天然人纖溶酶原的三環4的功能特徵。如上文所述，這 些多肽也與固定化賴氨酸結合。本發明的多肽與固定化的賴氨酸結合。如本文使用的，詞語「與固定化的賴氨酸 結合」指當使用賴氨酸-SEPHAR0SE作為色譜媒介進行柱色譜時，如此表徵的多肽相對於 小-纖溶酶原前進較為遲滯。一般地，可以使用含有特定配體(例如eACA，作為洗脫劑) 的溶液將本發明的多肽從這種色譜媒介(賴氨酸親和樹脂)上洗脫下來。進一步地，除了 Chang等人，見上文，本領域技術人員還可以參考其他文獻以 確定何種殘基可以通過保守或非保守取代、缺失或添加而變化以產生本發明範圍內的 缺失突變體。例如，以下參考文獻提供了關於對於結合ω氨基羧酸可能具有重要意義 的天然三環域上特定殘基的信息Ji等人的美國專利6，538，103 ；Suzuki的美國專利 6，218，517 ；Douglas, J. Τ.，等人，Biochemistry 41(10) :3302_10 (2002) ；Zajicek, J.，等 人，J. Mol. Biol. ,301 (2) :333_47 (2000) ；Lee, H.，等人，Arch BiochemBiophys. ,375(2) 359-63(2000) ；Castellino, F.and S. McCance, CibaFound Symp. 212 46-60(1997)； McCance, S.，等)κ, J. Biol. Chem. ，269 32405-32410 (1994) ；Rejante, Μ. R. and Μ. Llinas, Eur. J. Biochem. ,221 (3) :939_49 (1994) ；ffu, Τ· P.，等人，Blood Coagul. Fibrinolysis, 5(2) 157-66(1994) ；Hoover, C. J.，等人，Biochemistry, 32 (41) 10936-43 (1993)； Menhart, N.，等)κ, Biochemistry, 32 8799-8806 (1993) ；Thewes, Τ.，等)κ, J. Biol. Chem.， 265(7) 3906-3915(1990) ；Novokhatny，V.，等人，Thromb Res. ,53(3) :243_52 (1989)； Motta, A.，等人，Biochemistry, 26 (13) :3827_36 (1987) ；Novokhatny, V.，等人，J. Mol. Biol.，179 215-232 (1984) ；Lerch, P. G.，等人，Eur. J. Biochem.，107 (1) :7_13 (1980)； Sottrup-Jensen, L.,等人，Prog. Chem. Fibrinol. Thrombol. ,3 191-209 (1978)；及 Wiman, B.和D. CoIlen，Nature 272，549-545 (1978)，皆通過引用全文併入本文。因為本發明人已經認識到可以製備一種有價值的、簡單化的纖溶酶(原)分子，其 具有單個具有有益的功能性特徵(可以通過測試與固定化賴氨酸的結合而進行部分評估， 如本文所述)的N-末端三環域，所以本發明能包括其他激活位點N-末端的纖維蛋白-結 合結構域或區域。例如，本發明可以包括這樣的多肽其中纖溶酶的絲氨酸蛋白酶結構域 連接於纖維蛋白結合三環域，所述三環域選自一組，包括但不限於人纖溶酶原的三環4、tPA 的三環2或載脂蛋白(a)的三環。此外，本發明可以包括這樣的多肽其中纖溶酶的絲氨酸 蛋白酶結構域連接於任何其他已知的纖維蛋白結合分子，如tPA或纖連蛋白「指狀」結構域 或纖維蛋白特異性IgG的FAB片段。在一些方面，本發明的多肽具有與在人血漿衍生纖溶酶(原)的天然發生的形式 中發現的化學結構相同的蛋白質化學結構(例如，天然樣N-末端，三環與絲氨酸蛋白酶結 構域之間的天然樣連接)。不被具體的理論所限，人們相信蛋白質的特定特徵(包括但不限 於胺基酸序列)可以對免疫原性產生作用。因此，本發明提供了基於重組(TAL6003)-纖溶 酶原的有效的蛋白質治療劑，通過引入與天然人纖溶酶原序列相似的胺基酸序列而預先減 少(TAL6003)-纖溶酶原潛在的免疫原性。在一個方面，本發明的重組(TAL6003)-纖溶酶原多肽包含a)與天然人纖溶酶原
9的三環域同源的單個N-末端三環域，其中三環域內最後四個胺基酸殘基為V、P、Q和C ；和 b)與人纖溶酶原中對應結構域同源的C-末端結構域激活位點和絲氨酸蛋白酶結構域；其 中多肽結合於固定化的賴氨酸。在一個實施方式中，單個N-末端三環域與天然人纖溶酶原 的三環1或三環4同源。在一些實施方式中，固定化的賴氨酸是結合於固體支持基質，所述 基質選自賴氨酸_瓊脂糖、賴氨酸水凝膠、賴氨酸_交聯瓊脂糖。在另一個實施方式中，固 定化的賴氨酸為賴氨酸_交聯瓊脂糖。本發明的重組(TAL6003)-纖溶酶原多肽可以被本領域普通技術人員激活以提供 (TAL6003)-纖溶酶多肽。在一個實施方式中，(TAL6003)-纖溶酶多肽顯示出纖維蛋白溶解 活性，其被α 2-抗纖溶酶抑制，抑制速率是至少5倍快於Ci2-抗纖溶酶對小-纖溶酶的纖 維蛋白溶解活性的速率抑制。在另一個實施方式中，抑制速率是至少大約10-倍、20-倍、 30-倍或40-倍快於小-纖溶酶的抑制速率。在一個實施方式中，重組(TAL6003)-纖溶酶原多肽與SEQ ID NO :2所示的序列有 至少90 %或95 %，或98 %的同一性。在另一個實施方式中，單個N-末端三環域與天然人 纖溶酶原的三環1或三環4結構域具有至少90%的同一性；且C-末端結構域與人纖溶酶 原的激活位點和絲氨酸蛋白酶結構域具有至少90%的同一性。在一些實施方式中，多肽具 有如SEQ ID NO :2所示的胺基酸序列及其保守取代物。在其他實施方式中，多肽在類似於 SEQ ID NO 2所示胺基酸序列位置85的相對位置上有精氨酸殘基。在進一步的實施方式中，單個N-末端三環域與天然人纖溶酶原的三環1或三環4 的胺基酸序列同一性，相對於與天然人纖溶酶原的三環5的序列同一性至少多一個殘基， 就與三環5作同一性比較目的而言，單個N-末端三環域相對於人纖溶酶原的三環1和三環 4的天然序列的保守取代不被認為與所述天然序列不同。例如，本發明描述的(TAL6003)-纖溶酶原利用了連接單個三環域和絲氨酸蛋白 酶的連接區域的胺基酸殘基修飾。這樣，兩個結構域之間的該連接更相近地類似於人纖溶 酶原的三環5結構域和絲氨酸蛋白酶結構域之間的天然發生的接合。在另一個實施方式中，本發明描述的(TAL6003)-纖溶酶原進一步包含天然樣 N-末端序列。重組生產的(TAL6003)-纖溶酶原可以在激活時被切割以提供同樣具有天然 樣N-末端的重組(TAL6003)-纖溶酶多肽。在特定實施方式中，(TAL6003)-纖溶酶原的單個N-末端三環域特定位置上的殘 基相對於天然人纖溶酶原三環1是保守的。這些可以是與二硫橋和賴氨酸結合相關的位置 上的殘基，分別包括 Cys84、Cysl05、Cysl33、Cysl45、Cysl57 和 Cysl62 以及Prol36_Prol40、 Prol43-Tyrl46和Argl53_Tyrl56 (位置按照如圖3所示進行編號)。此外，本發明具體的 實施方式可以相對於具有類似結構域成分(即，三環域_絲氨酸蛋白酶(K-SP)的小-纖 溶酶(原)進行化學上的定性(參見Sottrup-Jensen，L.，等人，Progress in Chemical Fibrinolysis andThrombolysis, Vol. 3, (Eds :J. F. Davidson,等 A )Raven 出版社， NewYork(1978))，但是，尤其在類似於SEQ ID NO 2所示胺基酸序列的位置85的相對位置 上缺少精氨酸(Arg)。在一些實施方式中，本發明的(TAL6003)-纖溶酶原包含單個N-末端 結構域，其在類似於SEQID NO :2所示胺基酸序列的位置85的相對位置上有Arg。類似於 SEQID NO :2所示胺基酸序列的位置85的相對位置的非限制性例子包括SEQ ID N0:4所示 胺基酸序列的 Arg (153)、Arg (234)、Arg (324)和 Arg (426)位置。
在其他實施方式中，指定殘基的特定位置可以稍微變化，但仍存在於多肽的結構 和功能類似位置上(即相對於N-末端結構域的三環域結構；見Chang，Y.，等人，如上文討 論的)。在一些實施方式中，(TAL6003)-纖溶酶(原)多肽的單個N-末端三環域與天然人 纖溶酶原的三環1或三環4天然的同一性百分比，比與天然人纖溶酶原三環5的同一性百 分比至少多一個殘基。進一步地，本發明具體實施方式
可以相對於小-纖溶酶(原)進行功能上的定性。 在優選的實施方式中，本發明的(TAL6003)-纖溶酶顯示出增加的被Ci2-抗纖溶酶抑制的 速率，例如，比小_纖溶酶的抑制速率快大約一個或兩個數量級。進一步地，在具體實施方 式中，(TAL6003)-纖溶酶結合固定化的賴氨酸(例如，賴氨酸-SEPHAR0SE)。將(TAL6003)-纖溶酶原的單個N-末端三環域描述為「N-末端」僅僅是指該結構 域存在於激活位點的N-末端，不意味著不存在此結構域本身N-末端的其他胺基酸殘基。進 一步地，纖溶酶原的單個N-末端三環域的多數C-末端半胱氨酸殘基(即，圖4所示的多數 C-末端Cys殘基)和激活位點之間放置的殘基數量和同一性可以變化，而不脫離本發明的 範圍。基於本文公開以及本文引用的用作關於三環1功能和結構的指導的參考文獻，本領 域技術人員無需過量實驗即可以確定達到本發明益處的這些變化(ω氨基羧酸的三環1樣 結合，缺失突變體大小沒有實質增加，也沒有引入潛在引起問題的糖基化位點)。因此，本發明涉及多聚核苷酸、多肽、用於生產所述多肽的重組方法、含有所述多 聚核苷酸的載體、用於生產所述多肽的表達系統以及包含這些表達系統的培養的宿主細 胞。如指出的，在一個方面，本發明涉及編碼本文公開的多肽的多聚核苷酸或具有其 保守胺基酸取代物的多肽。關於選擇「保守」胺基酸取代的指導在下文更詳細提供。在一 個實施方式中，多聚核苷酸是DNA。在另一方面，本發明涉及製備載體的方法，包括將本發明的多聚核苷酸插入載體。 在另一方面，本發明涉及由本發明的方法生產的載體。在另一方面，本發明涉及製備培養的宿主細胞的方法，包括將本發明載體引入培 養的宿主細胞。在另一方面，本發明涉及由本發明的方法生產的培養的宿主細胞。在另一方面，本發明涉及本發明分離的多肽，其通過包括下列步驟的方法生產 (a)將包含編碼所述多肽的多聚核苷酸的載體引入培養的宿主細胞；(b)培養宿主細胞；以 及(C)回收多肽。在另一方面，本發明涉及用於生產多肽的方法，其包括(a)在表達載體 的條件下培養本發明的宿主細胞；及(b)回收多肽。在另一個方面，本發明涉及含有至少一種本發明的多聚核苷酸的細胞。在一個實施方式中，多聚核苷酸包含如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列。在另一個 實施方式中，多聚核苷酸包含如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的核苷酸4-1032。在其他實 施方式中，多肽包含如SEQ IDNO 2所示胺基酸序列。多聚核苷酸本發明的多聚核苷酸包括具有取代、缺失和/或添加(可以涉及一種或多種核苷 酸)的變體。變體可以在編碼區域、非編碼區域或二者中有改變。編碼區域的改變能夠產 生保守或非保守的胺基酸取代、缺失或添加。這些之中尤其優選的是沉默的取代、添加和缺 失，其不改變(TAL6003)-纖溶酶(原)蛋白質或其部分的屬性和活性。就此而言尤其優選
11的還有保守取代(見下文)。本發明的進一步實施方式包括核酸分子，其包含與以下序列具有至少90 %同一 性，更優選至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列的多聚核苷酸(￡1)編碼 具有SEQ ID NO 2的完整胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有SEQ ID NO 2的 胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；和(c)與上文(a)或(b)中任何核苷酸序列互補的核苷 酸序列。在一個實施方式中，本發明的核酸分子包括多聚核苷酸，其具有編碼具有SEQ ID NO :2所示胺基酸序列的多肽的核苷酸序列。在其他實施方式中，核酸分子包括多聚核苷 酸，其具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列或其簡併變體。在說到具有與編碼(TAL6003)-纖溶酶原的參考核苷酸序列具有例如至少95%的 「同一性」的核苷酸序列的多聚核苷酸，其表示所述多聚核苷酸的核苷酸序列與所述參考序 列是相同的，只不過所述多聚核苷酸序列在編碼(TAL6003)-纖溶酶原多肽的參考核苷酸 序列的每100個核苷酸中可以包括多至5個點突變。換句話說，為了獲得具有與參考核苷 酸序列至少95%同一性的核苷酸序列的多聚核苷酸，參考序列中多至5%的核苷酸可以缺 失或被其他核苷酸取代，或可以將數目多至參考序列總核苷酸5 %的核苷酸插入所述參考 序列。參考序列的這些突變可以發生在參考核苷酸序列的5』或3』末端位置，或位於兩個 末端位置之間的任何位置，單獨分散在參考序列的核苷酸之中或者在參考序列內的一個或 多個連續的組中。如上文所指出的，可以通過確定它們的百分比同一性來比較兩個或更多個多聚核 苷酸序列。同樣可以通過確定它們的百分比同一性比較兩個或更多個胺基酸序列。無論是 核酸還是肽序列，兩個序列的百分比同一性一般被描述為兩個比對序列之間完全匹配的數 目除以較短序列的長度並乘以100。核酸序列的近似比對是通過Smith和Waterman的局 部同源性算法提供的，見 Advances in AppliedMathematics 2:482-489(1981)。該算法可 以擴展到用於肽序列，採用由Dayhoff開發的評分矩陣，見Atlas of Protein Sequences andStructure, Μ. 0. Dayhoff ed.,5 suppl. 3 :353_358, National BiomedicalResearch Foundation, Washington, D. C. , USA,並且 通過 GribskovNucl. Acids Res. 14(6) 6745-6763(1986)進行標準化。這種算法對於核酸和肽序列的實施是由Genetics Computer Group (Madison, Wis.)在他們的BESTFIT應用程式中提供的。該方法的預設參數在以下 文獻中描述Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8(1995) (可以從 Genetics Computer Group, Madison, Wis.獲得)。例如，由於遺傳密碼的簡併性，本領域普通技術人員將直接意識到與SEQ ID NO 1 所示核酸序列具有至少90 %、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %同一性的大量核酸分子將編碼 (TAL6003)-纖溶酶原多肽。實際上，由於這些核苷酸序列的簡併變體都編碼相同的多肽， 所以這對於本領域技術人員來說是顯而易見的，不需要進行本文描述的任何功能分析或測 定。本領域進一步認識到，對於不是簡併變體的這類核酸分子來說，其中也會有合理數量的 核酸分子編碼具有(TAL6003)-纖溶酶原多肽活性的多肽。這是因為技術人員完全了解那 些不太可能或不可能顯著影響蛋白功能的胺基酸取代(例如，將一種脂肪族胺基酸取代為 另一種脂肪族胺基酸)。最近，在較長的多聚核苷酸序列的合成生產方面的進展已經能夠合成生產編碼顯
12著更長的多肽的核酸，而不使用傳統克隆技術。這些服務的商業提供者包括Blue Heron, Inc. ,Bothel 1,WA(http ://www· blueheronbio· com)。由 Blue Heron, Inc.所採用的技術披 露於美國專利號 6，664，112 ；6，623，928 ；6, 613, 508 ；6, 444, 422 ；6，312，893 ；4，652，639 ； 公開的美國專利申請號20020119456A1 ；20020077471A1 ；和公開的國際專利申請(公開 號)W003054232A3 ；W00194366A1 ；W09727331A2 ；和 W09905322A1 中，所有文獻皆通過引用 併入本文。當然，分子生物學，微生物學和重組核酸的傳統技術也可用於生產本發明 的多聚核苷酸。這些技術是眾所周知的，並且披露於以下文獻中，例如，Current Protocols in Molecular Biology, F. Μ. Ausebel, ed. , Vols.I, II and III (1997)； Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)； DNA Cloning :A PracticalApproach, D. N. Glover, ed. , Vols. I and 11 (1985); OligonucleotideSynthesis, M.L.Gait, ed. (1984) ；Nucleic Acid Hybridization, Hames 禾口 Higgins, eds. (1985) ；Transcription and Translation, Hames 禾口 Higgins, eds. (1984) ；Animal Cell Culture, R. I. Freshney, ed. (1986) ；Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press (1986) ；Perbal, " APractical Guide to Molecular Cloning 「； the series, Methods inEnzymology, Academic Press, Inc. (1984) ；Gene Transfer Vectors forMammalian Cells, J. H. Miller 禾口 Μ· P. Calos, eds. , Cold SpringHarbor Laboratory (1987)；禾口 Methods in Enzymology, Wu 禾口 Grossman 禾口 Wu, eds.,分另lj 見 Vols. 154和155，以上文獻皆通過引用併入本文。載體和培養的宿主細胞本發明還涉及包括本發明分離的核酸分子的載體，使用重組載體進行遺傳工程改 造的培養的宿主細胞，以及通過重組技術生產(TAL6003)-纖溶酶(原)多肽。可以使用公知技術(例如感染、轉導、轉染、轉位、電穿孔和轉化)將重組構建體導 入培養的宿主細胞。載體可以是例如噬菌體、質粒、病毒或逆轉錄病毒載體。逆轉錄病毒載 體可以是能複製的或複製缺陷型的。在後一種情況下，病毒繁殖通常只能在補償性培養的 宿主細胞中發生。所述多聚核苷酸可以與含有選擇標記的載體連接，以便在培養的宿主中繁殖。一 般地，將質粒載體導入沉澱物，如磷酸鈣沉澱物，或導入具有帶電荷的脂質的複合物。如果 載體是病毒的話，可以使用合適的包裝細胞系進行體外包裝，然後轉導進入培養的宿主細 胞。優選的是包含對感興趣的多聚核苷酸的順式作用控制區的載體。合適的反式作用 因子可以由培養的宿主提供，由互補載體提供或在導入培養的宿主後由載體本身提供。在這一方面的特定實施方案中，所述載體提供了特異性表達，它可以是可誘導和/ 或細胞類型特異性的。在這種載體中特別優選的是可以通過便於操縱的環境因素(如溫度 和營養添加劑)誘導的載體。可用於本發明的表達載體包括染色體_、附加體_和病毒-衍生的載體，例如，衍生 自細菌質粒、噬菌體、酵母附加體、酵母染色體元件、病毒(如杆狀病毒、乳多泡病毒、痘病 毒、腺病毒、禽痘病毒、偽狂犬病毒和逆轉錄病毒)的載體，以及衍生自它們的組合的載體，
13如粘粒和噬菌粒。DNA插入物應當可操作地連接到合適的啟動子，如噬菌體λ PL啟動子，大腸桿菌 lac、trp和tac啟動子，SV40早期和晚期啟動子和逆轉錄病毒LTR的啟動子(僅舉幾個例 子)。其他合適的啟動子為本領域技術人員所公知。表達構建體還包含轉錄起始位點、終止 位點，並且在轉錄區中還包含用於翻譯的核糖體結合位點。由所述構建體表達的成熟轉錄 物的編碼部分可以包括位於開始部分的翻譯起始和適當地位於要翻譯的多肽的末端的終 止密碼子(UAA、UGA或UAG)。正如所指出的，表達載體優選包括至少一種可選擇的標記，這類標記包括二 氫葉酸還原酶或新黴素抗性，用於真核細胞培養物；以及四環素或氨苄青黴素抗性基 因，用於在大腸桿菌(E.coli)和其他細菌中培養。合適的培養的宿主的代表性例子 包括但不限於細菌細胞，如大腸桿菌、鏈黴菌屬(Streptomyces)和鼠傷寒沙門氏菌 (Salmonellatyphimurium)細胞；真菌細胞，如酵母細胞；昆蟲細胞，如果蠅(Drosophila) S2和草地夜蛾(Spodoptera) Sf9細胞；動物細胞，如CH0、C0S和Bowes黑素瘤細胞；以及植 物細胞。用於上述培養的宿主細胞的合適的培養基和條件為本領域所公知。優選用於細菌的載體包括例如pET24b或pET22b(可獲自Novagen，Madison), WI (pET-24b(+)和 pET-22b(+)分別=pETExpression System 24b (Cat. No. 69750)和 22b (Cat. No. 70765), EMDBiosciences Inc., Novagen Brand, Madison, WI, JAL http:// www. emdbiosciences. com關於pET_24b和pET_22b的產品信息部分獲得關於載體的詳 細資料)，PQE70、pQE60 和 pQE_9(可以從 Qiagen Inc.，Valencia, CA 獲得)；pBS 載體、 PHAGESCRIPT 載體、BLUESCRIPT 載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(可以從 Stratagene， LaJolla, CA 獲得)；和 ptrc99a、pKK223-3、pKK233_3、pDR540、pRIT5 (可以從 Pharmacia (現 在是 Pfizer，Inc.，New York, NY)獲得)。優選的真核載體有 pWLNE0、pSV2CAT、p0G44、pXTl 和 pSG(可以從 Stratagene 獲得)；以及 pSVK3、pBPV、pMSG 和 pSVL(可以從 Pharmacia 獲 得)。其他合適的載體對本領域技術人員來說是顯而易見的。適用於本發明的細菌啟動子包括大腸桿菌IacI和IacZ啟動子、T3和T7啟動子、 gpt啟動子、Ara和PL啟動子和trp啟動子。合適的真核啟動子包括CMV立即早期啟動 子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、逆轉錄病毒LTR的啟動子(如勞氏肉瘤 病毒(RSV)的啟動子)和金屬硫蛋白啟動子(如小鼠金屬硫蛋白-I啟動子)。將載體構建體導入培養的宿主細胞可以通過磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的 轉染、陽離子型脂類介導的轉染、電穿孔、轉導、感染或其他方法實現。這樣的方法在很多 標準實驗室手冊中有描述，如 Davis et al.，Basic Methods In Molecular Biology, 2nd Edition(1995)。可以通過將增強子序列插入載體來增強高等真核生物對於編碼本發明多肽的DNA 的轉錄。增強子是DNA的順式作用元件，通常約10-300bp，它在給定類型的培養的宿主細 胞中提高啟動子的轉錄活性。增強子的例子包括SV40增強子(位於複製起點後側(late side) 100-270bp處)；巨細胞病毒早期啟動子增強子；位於複製起點後側的多瘤病毒增強 子；以及腺病毒增強子。為了使翻譯的蛋白分泌進入內質網腔，進入壁膜間隙或進入細胞外環境，可以將 合適的分泌信號併入到所表達的多肽中。所述信號對多肽來說可以是內源的，或者它們可以是外源信號。多肽能夠以修飾的形式表達，如融合蛋白，並且不僅可以包括分泌信號，而且還包 括其他異源功能區。例如，可以將額外的胺基酸區域(特別是帶電荷的胺基酸)添加至多 肽的例如N-末端，以在純化期間或後續的處理和保存中改善在培養的宿主細胞中的穩定 性和持久性。另外，還可以將肽部分添加到多肽上以促進純化。可以在最終的多肽製備之 前將這些區域移除。向多肽上添加肽部分以引起分泌或排洩以便提高穩定性並促進純化等 等，這些是本領域熟知的和常規技術。優選的融合蛋白包含來自免疫球蛋白的異源區，其可 用於溶解蛋白。例如，EP 0 464 533 Al (加拿大的對應申請為2，045，869)公開了包含免疫 球蛋白分子的恆定區的不同部分與另一種人類蛋白或其部分的融合蛋白。在許多情況下， 融合蛋白中的Fc部分對於治療和診斷用途十分有益，並因此帶來例如改善了的藥物動力 學特性。另一方面，對某些用途來說，需要在以所描述的有益方式表達、檢測和純化融合蛋 白質之後能夠刪除Fc部分。當Fc部分被證實妨礙了治療和診斷上的應用時，是這種情況， 例如，當融合蛋白將被用作免疫接種的抗原時。例如，在藥物發現方面，已經將人類蛋白與 Fc部分融合，用於進行高通量篩選測定的目的(如hIL5-受體，以鑑定hIL-5的拮抗劑)。 參見 Bennett, D. , et al. , J. Molecular Recognition, 8 52~58 (1995)禾口 Johanson, K. et al.，J. Biol. Chem.，270 (16) :9459_9471 (1995)。可以通過熟知的方法(包括在本文的實施例中具體描述的那些)從重組細胞培養 物中回收和純化(TAL6003)-纖溶酶原。本發明的多肽包括天然純化的產物、化學合成程序 的產物、以及通過重組技術從原核或真核培養宿主生產的產物，所述宿主包括例如細菌、酵 母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞。另外，本發明的多肽還可以包括原始的經修飾的甲硫 氨酸殘基，在某些情況下是宿主介導的過程的結果。多月太本發明的多聚核苷酸包括編碼本發明多肽的變體和具體例子的那些。例如，取代 在 Bowie, J. U.等人，"Deciphering the Message inProtein Sequences :Tolerance to Amino Acid Substitutions，」 Science247 :1306_1310 (1990)中提供了有關如何製備表型 沉默胺基酸取代的指導，其中作者指出，蛋白驚人地耐受胺基酸取代。儘管本發明範圍內的 任何數量的取代都可以通過應用這種一般原則獲得，但是對於有關取代的具體指導，本領 域技術人員可以參考本文所引用的關於三環1結構域的結構和功能的參考文獻。可進一步理解的是，根據所採用的標準，(TAL6003)-纖溶酶原的三環、激活位點， 和絲氨酸蛋白酶結構域的確切「位置」或序列在本發明範圍內的具體變體中可略有不同。 例如，相對於激活位點，三環域的確切定位可略微變化和/或三環域結構域的N-末端的序 列的長度可以改變。因此，本發明包括(TAL6003)-纖溶酶原多肽的這樣的變體，其表現出 本文所公開的(TAL6003)-纖溶酶原多肽活性。這樣的變體包括缺失、插入、倒位、重複和 取代。如上文所指出的，關於哪些胺基酸變化可能是表型沉默的指導可以參見以下文獻 Bowie, J. U. , et al. , "Deciphering the Message in Protein Sequences Tolerance to AminoAcid Substitutions」，Science 247:1306-1310(1990)中找到。因此，SEQ ID NO 2的多肽的衍生物或類似物可以是⑴這樣的物質，其中一個或 多個胺基酸殘基(例如，3、5、8、10、15或20個殘基)被保守的或非保守的胺基酸殘基(優 選為保守的胺基酸殘基)取代。這樣的經取代的胺基酸殘基可以是或者不是由遺傳密碼編
15碼的，或(ii)這樣的物質，其中一個或多個胺基酸殘基包括取代基團(例如，3、5、8、10、15 或20)，或(iii)這樣的物質，其中成熟的多肽與另一種化合物融合，如能延長多肽半衰期 的化合物(例如，聚乙二醇)，或(iv)這樣的物質，其中附加的胺基酸與成熟的多肽融合， 如IgG Fc融合區肽或前導或分泌序列或用於純化成熟的多肽或前蛋白序列的序列。這樣 的片段、衍生物和類似物被視為在本領域技術人員通過閱讀本說明書可以了解的範圍內。如所指出的，改變優選是微小性質的，如不會顯著影響蛋白摺疊或活性的保守性 胺基酸取代。當然，技術人員可以進行的胺基酸取代的數目取決於很多因素，包括上面所描 述的因素。一般來說，對任何給定的(TAL6003)-纖溶酶原多肽的取代數目將不超過50、40、 30、25、20、15、10、5 或 3 個。本發明的(TAL6003)-纖溶酶原中對功能必需的胺基酸可以通過本領域公知 的方法確定，如定點誘變或丙氨酸-掃描誘變(Cunningham和Wells，Science 244 1081-1085(1989))。後一種程序在分子的每個殘基上導入單個的丙氨酸突變。然後測試所 得到的突變型分子的生物學活性，例如，如在本文提供的實施例中顯示的。對配體結合有關 鍵意義的位點還可以通過結構分析確定，如結晶、核磁共振或光親和標記(Smith，et al., J. Mol.Biol. 224 :399-904(1992)和 de Vos, et al. Science255 :306_312 (1992))。即使 從蛋白的N-末端刪除一個或多個胺基酸導致了蛋白的一種或多種生物學功能的改變或喪 失，其他生物學活性仍然可以得以保留。還可以預期的是，可以通過固相合成方法生產可用於生產本發明的「分離的多 月太」的多月太。參見 Houghten，R. Α.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :5131_5135 (1985)；和 Houghten等人的美國專利號4，631，211(1986)。本發明的多肽可以以分離的形式提供。「分離的多肽」意指從其天然環境中取出的 多肽。因此，對於本發明的目的而言，在重組培養的宿主細胞中生產和/或包含的多肽被認 為是分離的。「分離的多肽」還指已經從重組培養的宿主中部分或實質上純化的多肽。可以使用一些方法(包括計算機輔助的方法，如上文關於多聚核苷酸中指出的) 來確定具有與(TAL6003)-纖溶酶原多肽的參考胺基酸序列具有所標明的百分比同一性的 胺基酸序列的多肽按照上文關於核苷酸序列的討論進行多肽胺基酸序列的檢查和比較。本 領域技術人員將認識到，這樣的概念(如對多聚核苷酸所討論的分子端點)在考慮這樣的 方法和程序用於多肽分析的相應用途時將具有直接的類似物。例如，有關多聚核苷酸討論 的人工校正指的是核酸的5』和3』端點，不過，將認識到相同的討論適用於多肽的N-末端 和C-末端。本發明包括(TAL6003)-纖溶酶原多肽，其在翻譯期間或之後被差異性修飾，例 如，糖基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、通過已知的保護/封閉基團衍生化、蛋白酶切割、連 接至抗體分子或其他細胞配體等。多種化學修飾中的任何修飾都可以通過已知技術完 成，包括但不限於通過溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、金黃色葡萄球菌 (S. aureus) V8蛋白酶、NaBH4進行的特異性化學切割；乙醯化、甲醯化、氧化、還原；在存在 衣黴素的條件下進行代謝合成；等。本發明包括的其他翻譯後修飾包括，例如，N-連接的或0-連接的糖鏈、N-末端或 C-末端的加工、將化學部分連接至胺基酸骨架、N-連接的或0-連接的糖鏈的化學修飾，以 及為了改造載體和構建體以便在原核培養宿主細胞中表達(TAL6003)-纖溶酶原多肽而添加的N-末端甲硫氨酸殘基。多肽還可以通過可檢測的標記(如酶、螢光、同位素或親和標 記)修飾，以便可以檢測和分離蛋白質。藥用組合物和治療方法可以根據以下文獻中描述的方法和組合物配製(TAL6003)-纖溶酶(原)用 於治療用途美國專利申請號 10/143，112 ；和 Novokhatny，V.，et al.，J. Thromb. Haemost. 1 (5) 1034-41 (2003)，二者通過引用併入本文。例如，可以將低pH (大約2. 5-大 約4)，低緩衝力的緩衝液用於配製(TAL6003)-纖溶酶。另外，本領域技術人員所公知的其 他方法和製劑(如對於纖溶酶、小_纖溶酶、和/或微_纖溶酶的實踐)可用於配製本發明 的(TAL6003)-纖溶酶以用於治療性施用。(TAL6003)-纖溶酶(原)可用於治療多種血栓形成性疾病或病況，例如，根據以下 文獻中描述的方法進行美國專利號6，355，243,6, 964，764和6，969，515，皆通過引用併入 本文。同樣，正如可應用於(TAL6003)-纖溶酶的可能的藥物製劑，(TAL6003)-纖溶酶也可 以通過本領域公知的方法進行治療性施用，例如，目前以纖溶酶、小-纖溶酶、和/或微-纖 溶酶實施的方法。實施例 表達載體的設計(TAL6003)-纖溶酶原的胺基酸序列如SEQ ID NO :2所示。具有編碼(TAL6003)-纖 溶酶原的核苷酸序列的多聚核苷酸針對大腸桿菌表達和mRNA穩定性進行密碼子優化， 以產生如SEQ ID NO :1所示的DNA序列。將此多聚核苷酸克隆進入大腸桿菌表達載體 pET24b (+) (Novagen ；Madison, WI)的NdeI和BamHl位點，以便生產細胞溶質的蛋白質。如表1中闡述的，細菌(例如大腸桿菌)中的表達提供了重組(TAL6003)-纖溶酶 原，其具有SEQ ID NO :2所示的胺基酸序列(S卩，重組(TAL6003)-纖溶酶原有N-末端甲硫 氨酸(即，M1)，緊接著位於對應於SEQ ID NO :4所示的天然人纖溶酶原胺基酸序列的位置 70精氨酸(S卩，Rto)的精氨酸胺基酸殘基(即，R2)之前(另見，例如，圖3)。這樣的重組產 物對進一步切割敏感，產生具有不同N-末端的其他蛋白質，包括具有N-末端賴氨酸(即， K10)或纈氨酸(即，V11)(分別對應於天然人纖溶酶原位置78的賴氨酸(即，K78)或位置79 的纈氨酸(即，V79))的蛋白質。表1 天然纖溶酶原(例如，基於SEQ ID NO 4)和(TAL6003)-纖溶酶(原)(例 如，基於SEQ ID NO :2，或其變體)的N-末端
包含19個氨基!睃的先導序列的天然纖溶酶原(例如，基於seq id no 4) 丄 丄 丄丄m-19ehke …e0Y Y Y Y 1Plddy ... m69r7°dwlfekk78v79ylsec天然「 lys-纖洛f酶原」(sp，切割掉先導序列) 丄 丄丄Y Y Y E01Plddy · · · m69r7cidwlfekk78v79ylsec......(seq id no 5)
17 丨指示潛在的切割位點(TAL6003)-纖溶酶原的表達及純化將包含編碼(TAL6003)-纖溶酶原的DNA的表達載體轉化進入多種細胞，包括 BL21 (DE3)RIL(Stratagene, La Jolla，CA)、BL21 (DE3)(基因型ΓοπιρΤ hsdSB(rBi) gal dcm(DE3)) (EMB Biosciences, Inc.，San Diego, CA)及 BLR(DE3)(基因型ΓοπιρΤ hsdSB (rBV) gal dcm(DE3) Δ (srl-recA) 306 =TnlO (TetE))並且通過 SDS-PAGE 分析使用 ImM IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)誘導之後蛋白質的過表達。搖瓶中的表達估 計為至少大約250mg/L細胞培養物。細胞類型BL21 (DE3)RIL經過工程改造成表達編碼Arg、Ile和Leu的罕見的大腸 桿菌tRNA。進一步地，BL21(DE3)和BLR(DE3) 二者都為大腸桿菌B菌株，基於毒力及定居因 子的缺少，其被分類為對人和動物是非致病性的。BLR(DE3)細胞缺少用於DNA重組的recA 基因，還沒有報導用這些細胞進行λ噬菌體的誘導。在Charles River實驗室(Malvern， PA)產生了 BLR(DE3)細胞中(TAL6003)-纖溶酶原構建體的研究細胞庫，並測試其純度、同 一性以及噬菌體的誘導。測試證實了研究細胞庫的同一性和純度，這些細胞通過了噬菌體 誘導測試，沒有觀察到噬菌體(數據未顯示)。(TAL6003)-纖溶酶原(即，基於SEQ ID NO 2)的生產在更大規模的表達中得到 證實，其中細胞被裂解，可溶性蛋白質和純化的包涵體均使用SDS-PAGE檢查。以下典型的操作流程用於(TAL6003)-纖溶酶原的表達將包含(TAL6003)-纖溶酶原載體的大腸桿菌細胞(例如，BL21 (DE3) RIL、 BL21 (DE3)或BLR(DE3)的單菌落用於接種5ml的LB/卡那黴素(30 μ g/ml)，並且在37°C在 搖床上培養8小時。此後，從培養的細菌懸浮液中取出50μ 1的等份樣品，用於在新鮮培養 基中進一步生長。16小時之後重複以上操作，使用6ml的細菌培養物和250ml的培養基。 培養物在37°C搖動生長，達到0D600nm為 1. 0，加入IPTG至ImM的最終濃度。讓培養物 再生長5小時。通過以5，OOOx g離心收穫細胞，並且將細胞沉澱物溶解在含有20mM EDTA 的20mMTris pH 8. 0中，並且在_80°C冷凍。為了純化(TAL6003)-纖溶酶原，將細胞沉澱物解凍，並且添加緩衝液，直到溶液體積約為原始細胞培養物體積的1/20。此後，添加溶菌酶至最終濃度為0. 5mg/ml，並且在 4°C快速攪拌細胞10-15分鐘。然後，添加Triton χ-100至1 %的最終濃度，並且再繼續攪 拌10分鐘。添加DNAse I (0. 05mg/ml)和MgCl2 (2. 5mM)，並且在4°C繼續攪拌30分鐘，或 直到溶液不再黏稠。最終的溶液在4°C以15，OOOx g離心30分鐘，並且丟棄上清液。用洗滌液(50mMTris_HCl，pH 7.4，含有 IOmM EDTA、1 % Triton-X-100 和 0· 5M 尿 素)洗滌細胞沉澱物3次，並且將最終的沉澱物溶解在40ml的提取緩衝液(PBS，pH 7. 4，含 有IOmM EDTA、20mM DTT和6M鹽酸胍)中，並且在4°C保存過夜。16小時之後，以15，OOOx g 將該溶液離心30分鐘以除去固體，並且將上清液緩慢添加到再摺疊溶液(50mM Tris-HCl, pH 8. 3，3. 5M 鹽酸胍，0. 5M 精氨酸 HC1，IOmM EDTA, 3mM GSH,0. 3mM GSSG)中，同時在 4°C攪 拌。再摺疊過程是在大約0. 29g/L的蛋白質濃度下進行的。將再摺疊溶液在4°C保持2天不受幹擾，然後針對8倍體積的含有IOmM EDTA、 0. 15M NaCl.O. 15M精氨酸-HCl的0. IM Tris-HClpH 8. 0透析8-10小時，經常更換緩衝溶液。然後從透析中取出蛋白質溶液，並且使用AMICON濾膜(膜截留分子量為IOkDa) 濃縮至大約10-20ml，並且針對100倍體積的含有10mMEDTA、0. 15M NaCl的0. IM Tris pH 8.0透析過夜。離心該材料以除去顆粒物，然後通過賴氨酸親和樹脂(賴氨酸-SEPHAR0SE 4B ；Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)。貞 ffi L 0· 2M ε M S fi Sl ( ε ACA)白勺 Tris-緩衝鹽水，pH 8. 0從樹脂上洗脫(TAL6003)-纖溶酶原。通常，從1升細胞培養物中可以分離出80mg的包涵體，並且在賴氨酸-SEPHAR0SE 層析步驟中可以洗脫40mg。(TAL6003)-纖溶酶原的特性通過對還原的(二硫蘇糖醇-處理的)和非還原的蛋白進行SDS-PAGE分析發現， 純化的(TAL6003)-纖溶酶原表現為在35-40kDa區域中的條帶。通過MALDI質譜法測定的 它的分子量為38，140Da，接近預期值。為了測定(TAL6003)-纖溶酶原被鏈激酶激活的速率，將lmg/ml重組 (TAL6003)-纖溶酶原與鏈激酶以1 100(TAL6003)_纖溶酶原比鏈激酶的比率混合併在室 溫PH 7溫育。在多個時間點取出樣品並以SDS-Page緩衝液淬滅，在還原型SDS-PAGE上分 析，隨後用密度計量學方法確定單鏈(TAL6003)-纖溶酶原分子向雙鏈(TAL6003)-纖溶酶 分子的轉換。根據SDS-PAGE確定全長的(TAL6003)-纖溶酶原隨著時間的消失，以此作為 鏈激酶激活(TAL6003)-纖溶酶原的百分率，結果顯示於圖6。為了證實三環1的功能性，我們測定了 TAL6003-纖溶酶原與賴氨酸-SEPHAR0SE 4B的結合。如圖7所示，(TAL6003)-纖溶酶原結合於賴氨酸-SEPHAR0SE並可以使用 0-20mM ε ACA梯度從柱子上將其洗脫在大約4mM時為單峰。重摺疊的(TAL6003)-纖溶酶 原結合賴氨酸-SEPHAR0SE的能力表示分子的三環域被恰當摺疊且賴氨酸-結合位點完全 有活性。為了進一步證實三環1的功能，通過監測蛋白螢光的相關變化測定eACA與 (TAL6003)-纖溶酶原的結合，如 Matsuka 等人，Eur. J. Biochem. 190 93~97 (1990))和 Douglas 等人 J.，Biochemistry 41 =3302-3310(2002)所述(皆通過引用併入本文)。ε ACA 與(TAL6003)-纖溶酶原的三環1的結合導致螢光的減弱，這可能是由於色氨酸殘基(其是
19賴氨酸_結合位點的一部分)的淬滅。為了監測這一過程，將4μ 1至16μ 1的ε ACA濃縮溶液的等份樣品添加到2ml 的溶解在含有20mM NaCl的50mM Tri s緩衝液中的5 μ M (TAL6003)-纖溶酶原中(ρΗ 8. 0,25°C )。在298nm的激發波長和340nm的發射波長下以FLU0R0MAX螢光分光光度計 (JobinYvon, Inc.，Edison, NJ)監測螢光；在每次添加ε ACA之後，讓溶液平衡直至觀察不 到螢光的進一步變化。將所得到的螢光值根據稀釋度進行校正，並且對於^ACA的濃度(範圍是 0-50uMeACA)作圖。通過非線性回歸擬合數據，獲得大約19 μ M的Kd。纖溶酶的一個特性是它結合纖維蛋白的能力。為了確定(TAL6003)-纖溶酶原是 否保留了與纖維蛋白相互作用的能力，通過微量滴定板測定測試了它的纖維蛋白結合特 性，其中，(TAL6003)-纖溶酶原與纖維蛋白的結合是通過隨後tPA對它的激活和所形成的 凝塊溶解來評估的。為此目的，在微量滴定板的每一個孔中使用凝血酶將100μ 1的5mg/ml 纖維蛋白原聚合化。將各種濃度的(TAL6003)-纖溶酶原添加到纖維蛋白凝塊的頂部，並且 在37°C溫育1小時。用PBS充分洗滌平板，同時纖維蛋白凝塊仍然保持完整並且附著於孔。 在洗滌之後，將0. lmg/ml tPA溶液添加到每一個孔中，並且在37°C溫育平板2小時。結果 是，某些凝塊被完全溶解，某些被部分溶解，同時具有極少量(TAL6003)-纖溶酶原的孔和 對照孔幾乎保持完整。將原始凝塊的殘餘物在IM NaOH中重構並在280nm測定其吸光度， 以此來監測纖維蛋白溶解的程度。將吸光度值作為(TAL6003)-纖溶酶原濃度的函數形式 作圖。如圖8所示，(TAL6003)-纖溶酶原與纖維蛋白的結合遵循典型的S形結合曲線。通 過這種測定，發現(TAL6003)-纖溶酶原和纖維蛋白結合的親和力與全長纖溶酶原的親和 力相當，並且該相互作用的C5tl( 0. 3μΜ)與全長纖溶酶原和纖維蛋白結合的Kd相當。這些實驗表明(TAL6003)-纖溶酶原能夠結合纖維蛋白。進一步地，至少 (TAL6003)-纖溶酶原與賴氨酸-Sijpharose的相互作用，其以預期的Kd與ε ACA結合的能 力，其結合纖維蛋白的能力，以及其能被纖溶酶原激活劑激活的能力均表明該分子在大腸 桿菌系統中是以完全功能性的形式生產的。(TAL6003)-纖溶酶的純化和製劑將SK添加到純化的(TAL6003)-纖溶酶原溶液中實現了(TAL6003)-纖溶酶原向 (TAL6003)-纖溶酶的轉化。蛋白質被濃縮到2mg/ml並以50%甘油1 1稀釋以產生25% 甘油中lmg/ml的溶液。將溶液置於室溫，並以SK (TAL6003)-纖溶酶原為1 100的摩 爾比添加鏈激酶。反應在室溫溫育4. 5小時，不攪拌。然後通過添加NaCl至0. 5M終濃度 而減慢反應。通過SDS-PAGE對激活進行分析表明激活蛋白有90%的產率。通過苯甲脒親和色譜純化激活的(TAL6003)-纖溶酶。苯甲脒親和色譜純化的 目的是分離未激活(TAL6003)-纖溶酶原與雜質，包括來自活性(TAL6003)-纖溶酶的 (TAL6003)-纖溶酶降解產物。將SK激活溶液應用於經平衡的苯甲脒-SEPHAR0SE 4 Fast Flow柱。截短的和完整的(TAL6003)-纖溶酶均被親和樹脂捕獲，而之前提到的雜質流過柱 子。用平衡緩衝液洗滌柱子直至280nm處的吸光度達到基線。然後使用低ρΗ的ε ACA步 驟洗脫結合的(TAL6003)-纖溶酶以從柱子上除去所有殘餘蛋白質。一般產率為75%，其中 蛋白質有95 %是活性的，如顯色纖溶酶效力測定所測。因為(TAL6003)-纖溶酶與全長纖溶酶類似，易於在生理ρΗ下自發降解，所以選擇PH 3. 6用於最終製劑(以醋酸鹽水進行酸化)。如Novokhatny等人，J Thromb Haemost.， 1(5) :1034-41(2003)(其通過引用併入本文)之前針對纖溶酶指出的，以及(TAL6003)-纖 溶酶的實驗證實的，這種低緩衝能力、低PH的製劑不僅使活性纖溶酶能夠安全儲存延長的 時間段，還與這些直接溶解血栓劑的非腸道施用是相容的。當與血漿或中性PH緩衝液混合 時，(TAL6003)-纖溶酶被迅速重新激活。(TAL6003)-纖溶酶的酶特性利用纖溶酶底物D-Val-Leu-Lys-對硝基苯胺(S-2251) (DiaPharma, West Chester, OH)檢驗(TAL6003)-纖溶酶的醯胺裂解活性。對於(TAL6003)-纖溶酶，在pH 7. 4，25°C在PBS緩衝液中，發現其對於S-2251的 Michaelis-Menten常數(Km)也為141 μ M(表3)。發現製備物的kcat為大約7251^1^。 通過4-硝基苯基4-胍基苯甲酸酯鹽酸鹽(pNPGB)滴定(Chase，Τ.和Ε. Shaw，Methods Enzymol. 197 :20_27 (1970))，發現功能性活性位點的百分比為67%。針對百分比活性位點 校正kcat，確定kcat為大約ΤΖδπ ιΓ1。該值非常接近用相同方法測定的全長纖溶酶的值， SZCH/jSmirr1，和微-纖溶酶(缺少所有五個三環)的值，ΤΟδ+ΛΖ^ ιΤ1。這些數據表明， 三環的存在或缺乏不會影響絲氨酸蛋白酶結構域的催化活性。表3 在25°C pH 7. 4的PBS緩衝液中，多種纖溶酶種類與底物S-2251的穩態動力 學參數 使用Wiman 禾口 Collen 的方法(Wiman，B.禾口 D. ColIen，Eur. J. Biochem. 84 573-578(1978))測定α 2-抗纖溶酶對(TAL6003)-纖溶酶的抑制速率為 1. 8士0. OexlO7M-1S-1,其中將纖溶酶和α 2-抗纖溶酶混合，然後在特定時間點分析S-2251 活性(表4)。該值與所報導的纖溶酶的值2. SxlO7M-1S-1 (來自Anonick等，Thrombosis Res. 59 449 (1990))相當。表4在22°C pH 7. 4的PBS緩衝液中測定各種纖溶酶種類和抑制劑的抑制速率。
對微-纖溶酶進行的相同的實驗顯示α 2-抗纖溶酶在兩個單獨的實驗中抑制速 率為1. SxlO5M-1S-1和3. IxlO5M-1S-10 α 2-抗纖溶酶抑制小-纖溶酶(小-纖溶酶結構域成 分，K5-SP)的速率確定為ZjxIO5M4iT1tj這些數據與微-和小-纖溶酶的文獻值具有合理 的一致性，且顯示(TAL6003)-纖溶酶被Ci2-抗纖溶酶抑制的速率比微-纖溶酶或小-纖 溶酶的抑制速率快40倍。因此，這些數據表明(TAL6003)-纖溶酶應當是由於其結構中存 在三環1而被α2-抗纖溶酶迅速抑制。總體上，本部分的數據顯示(TAL6003)-纖溶酶的 酶特性及抑制特性與全長纖溶酶是類似的。文獻值取自Anonick等人，Thrombosis Res. 59 449 (1990)。所有速率均根據 Anonick等人發表的方法測量。體外纖維蛋白溶解效力使用以下實驗操作流程，在凝塊裂解測定的體外模型上測試了(TAL6003)-纖溶 酶的纖維蛋白溶解效力。將(TAL6003)-纖溶酶與血漿衍生的纖溶酶的血栓溶解效力進行體外比較。將等 摩爾量的血漿衍生纖溶酶(0. 25mg/ml)與(TAL6003)-纖溶酶(0. llmg/ml)在試管中與血 凝塊混合，通過凝塊中釋放的材料的A280吸光度監測凝塊裂解的程度。在纖維蛋白和起始血塊裂解存在時克服血漿抑制劑所需的纖溶酶或 (TAL6003)-纖溶酶濃度顯示於圖9。
2權利要求
多聚核苷酸，其包含編碼如下多肽的核苷酸序列，該多肽具有a)與天然人纖溶酶原的三環域同源的單個N 末端三環域，其中三環域內最後四個胺基酸殘基為V、P、Q和C；和b)與人纖溶酶原中對應結構域同源的C 末端結構域激活位點和絲氨酸蛋白酶結構域；其中多肽結合於固定化的賴氨酸。
2.權利要求1的多聚核苷酸，其中單個N-末端三環域與天然人纖溶酶原的三環1或三 環4同源。
3.權利要求1的多聚核苷酸，其中編碼的多肽與SEQID NO :2所示序列具有至少90% 或95%，或98%的同一性。
4.權利要求1的多聚核苷酸，其中編碼的多肽與SEQID NO :2所示序列具有至少98% 的同一性。
5.權利要求1的多聚核苷酸，其中編碼的多肽是SEQID NO :2所示序列。
6.權利要求1的多聚核苷酸，其中多聚核苷酸的核苷酸序列是SEQID NO :1所示序列 或其簡併變體。
7.權利要求1的多聚核苷酸，其中單個N-末端三環域與天然人纖溶酶原的三環1或三 環4結構域具有至少90%的同一性；並且C-末端結構域與人纖溶酶原的激活位點及絲氨 酸蛋白酶結構域具有至少90%的同一性。
8.權利要求1的多聚核苷酸，其中固定化的賴氨酸是結合於固體支持基質的賴氨酸， 所述基質選自賴氨酸_瓊脂糖、賴氨酸水凝膠、賴氨酸_交聯瓊脂糖。
9.權利要求8的多聚核苷酸，其中固定化的賴氨酸是賴氨酸-交聯瓊脂糖。
10.權利要求1的多聚核苷酸，其中多肽顯示出比與小-纖溶酶的纖維蛋白原的結合親 和力低的與纖維蛋白原的結合親和力.
11.權利要求1的多聚核苷酸，其中多肽顯示出比與小-纖溶酶的部分切割纖維蛋白的 結合親和力高的與部分切割纖維蛋白的結合親和力。
12.權利要求1的多聚核苷酸，其中多肽比參考多肽具有降低的免疫原性，其中參考多 肽的一級胺基酸序列與所述多肽的一級胺基酸序列相同，條件是參考多肽的單個N-末端 三環域的最後四個胺基酸殘基不是V、P、Q和C。
13.多肽，其包含a)與天然人纖溶酶原的三環域同源的單個N-末端三環域，其中三環域內最後四個氨 基酸殘基為V、P、Q和C;和b)與人纖溶酶原中對應結構域同源的C-末端結構域激活位點和絲氨酸蛋白酶結構 域；其中多肽結合於固定化的賴氨酸。
14.權利要求13的多肽，其中單個N-末端三環域與天然人纖溶酶原的三環1或三環4 同源。
15.權利要求13的多肽，其中多肽顯示出纖維蛋白溶解活性，其被Ci2-抗纖溶酶抑制， 抑制速率是至少大約5倍快於α 2-抗纖溶酶對小_纖溶酶抑制纖維蛋白溶解活性的抑制 速率。
16.權利要求15的多肽，其中抑制速率是至少大約10-倍、20-倍、30-倍或40-倍快於 小-纖溶酶的抑制速率。
17.權利要求13的多肽，其中多肽與SEQID NO :2所示序列具有至少90%或95%，或 98%的同一性。
18.權利要求13的多肽，其中單個N-末端三環域與天然人纖溶酶原的三環1或三環4 結構域具有至少90%的同一性；並且C-末端結構域與人纖溶酶原的激活位點及絲氨酸蛋 白酶結構域具有至少90%的同一性。
19.權利要求13的多肽，其中單個N-末端三環域與天然人纖溶酶原的三環1或三環 4的胺基酸序列同一性，比與天然人纖溶酶原的三環5的胺基酸序列同一性多至少一個殘 基；並且其中就與三環5進行同一性比較的目的而言，單個N-末端三環域相對於人纖溶酶 原的三環1和三環4的天然序列的保守取代不被認為與天然序列不同。
20.權利要求13的多肽，其中多肽具有SEQID NO :2所示胺基酸序列及其保守取代物。
21.權利要求13的多肽，其中多肽在類似於SEQID NO :2所示胺基酸序列的位置85的 相對位置上有精氨酸殘基。
22.權利要求13的多肽，其中多肽比參考多肽具有降低的免疫原性，其中參考多肽一 級胺基酸序列與所述多肽的一級胺基酸序列相同，條件是參考多肽單個N-末端三環域的 最後四個胺基酸殘基不是V、P、Q和C。
23.表達載體，其包含權利要求1的多聚核苷酸。
24.培養的細胞，其包含權利要求23的表達載體。
25.用於製備一種或多種具有不同N-末端的重組纖溶酶多肽的方法，所述方法包括a)提供多肽，其具有與天然人纖溶酶原的三環域同源的單個N-末端三環域，其中三環 域內最後四個胺基酸殘基為V、P、Q和C ；以及與人纖溶酶原中對應結構域同源的C-末端結 構域激活位點和絲氨酸蛋白酶結構域；其中多肽結合於固定化的賴氨酸；b)將步驟a)中提供的多肽在足以切割一個或多個肽鍵的條件下與蛋白酶接觸，從而 形成一種或多種具有不同N-末端的重組纖溶酶多肽。
26.權利要求25的方法，其中多肽具有SEQID NO :2所示的胺基酸序列。
27.權利要求25的方法，其中提供包括在大腸桿菌中表達SEQIDNO :1所示的DNA序 列或其簡併變體。
全文摘要
本發明提供了涉及重組修飾的纖溶酶(原)分子的多聚核苷酸和多肽。纖溶酶(原)分子具有位於天然人纖溶酶原分子中的激活位點N-末端的單個三環域，其如此組合使得不存在外來序列，並顯示賴氨酸-結合以及與天然酶相關的顯著的酶特徵。
文檔編號C12N15/09GK101918548SQ200880123270
公開日2010年12月15日 申請日期2008年11月25日 優先權日2007年11月29日
發明者V·諾沃克哈特尼 申請人:泰勒克裡斯生物治療學公司