一種固相製備核酸分子克隆的方法
2023-12-02 07:17:01
專利名稱：一種固相製備核酸分子克隆的方法
技術領域：
本發明涉及一種分子克隆技術，特別涉及一種固相製備核酸分子克隆的技術。
背景技術：
人類基因組(測序)計劃已經完成，後基因組計劃已步入實施。研究基因在生命過程中的功能，也就是功能基因組學，成為全世界生命科學工作者共同的課題。功能基因組研究的目的是要認識基因組中每個核酸的生物學含義，發現疾病易感基因。功能基因組的研究途徑是比較基因組學，即通過比較和分析不同表型個體之間基因組序列差異，解碼基因組中每個核酸的生物學意義，發現功能基因，識別與疾病相關的分子遺傳信息。進一步地，根據個體基因組信息，實現疾病的預測、預防和個體化治療。隨著功能基因組研究的發展以及人們對提高醫療健康水平的不懈追求，「個體化醫療」已開始進入人們的生活。為了真正實現「個體化醫療」這一目標，首先要對每個人的基因組進行再測序，找出不同個體在DNA序列上的差異與不同疾病、發育等的相關性。採用目前的測序技術進行大規模個體全基因組DNA的測序，即對大量的人類個體的基因組DNA(包含有30億鹼基)進行再測序，其成本仍太高。這嚴重地限制了功能基因組的研究進展，影響到人類基因組計劃的研究成果的應用。而對於目前的基因組測序成本而言，「個體化醫療」仍然是人類的一個遙遠的夢想。因此，快速、經濟地對大量個體全基因組進行測序成為當今挑戰科學家的一項重大課題，人們急需發展出一些快速、廉價的個體化基因信息檢測技術來解決目前所存在的問題。這有利於人們更加深入地從分子層次上認識生命過程的機理，從根本上認識疾病產生的根源，在分子層次上進行疾病的預測、診斷和治療，將會使醫學臨床實踐產生革命性的變化。
傳統的測序方法，如1998年推出的ABI Prism3700 DNA自動化測序儀以及ABI Prism3730 DNA測序儀，測序時間長花費大。主要有兩個原因，首先是模板製備。傳統的模板製備方法是將待測基因組分成許多片斷，然後將每個片斷插入克隆載體，轉化大腸桿菌後平板培養，挑取克隆，擴大培養後提取質粒，然後送測序儀測序。因為在挑取大腸桿菌克隆的過程中，每次挑取的克隆都很有限，而且操作煩瑣，需要投入大量的人力物力和財力。其次是測序過程。由於測序樣本都是單個克隆，每臺機器一次只能測序96個樣本，因此要測序30億鹼基的人類基因組序列，需要耗費大量的時間及測序用藥品試劑，從而導致人類基因組測序時間長、耗費大，無法實現個體化測序。有人統計，採用ABI Prism3730 DNA測序儀測序，平均每個鹼基的成本是0.008美元，完成一個30億鹼基的測序，需要150臺ABI Prism3730 DNA測序儀運轉一年，測序成本達到二千四百萬美元。
在對傳統基因測序方法進行改進的過程中，美國454公司首先推出了一種新的測序方法。該方法將DNA測序成本降至目前成本的100倍。該技術目前已成功進入市場化運作。該方法基於焦磷酸測序與高通量模板製備兩個重要技術，其中高通量模板的製備對於成本的降低及測序速度的提高起了重要的決定性作用。該公司將微球固定技術、linker-PCR與乳液PCR技術相結合，能夠通過一次PCR擴增，同時將大量的待測序模板克隆出來並固定在不同一個微球上，然後再將單個微球固定在一個凹槽內，形成高密度的微球陣列，然後進行高通量並行測序。該方法雖然將測序技術往前推進了一步，但仍然存在著一些問題，如模板製備較為煩瑣，條件較難控制，成本較高等。而且該技術離生物科學家們提出的一千美元人類基因組測序的目標還有相當大的差距。在改進454測序技術的過程中，許多科學家想到了應用生物晶片技術製備測序模板，如Solexa公司採用生物晶片上進行橋式PCR擴增，但這些技術都較難控制反應條件，而且對基片處理具有較高的要求。
DNA測序模板製備技術發展的歷史也是核酸分子克隆技術的發展史。本發明針對目前DNA測序模板製備存在的技術瓶頸，提出了一種固相製備核酸分子克隆的新技術。該發明改進了目前分子克隆的製備技術，可用於高密度基因晶片製作及全基因組測序模板的製備，具有十分重要的應用前景和使用價值。本發明不僅可用於高通量低成本測序模板的製備，同時還可以用於SNP檢測以及DNA甲基化檢測技術的改進，從而使人們能夠獲取大量的生物分子信息。
發明內容
針對上述現有技術中存在的問題，本發明提供了一種固相製備核酸分子克隆的技術。
本發明的技術解決方案為一種固相製備核酸分子克隆的技術，製備步驟為通過現有技術製備單鏈環形核酸待克隆模板；設計模板引物，引物5』端修飾有丙烯醯胺基團、氨基、醛基、或生物素等化學基團，這些修飾化學基團的引物可向生物技術公司(如英駿生物技術有限公司)訂購；根據模板引物5』端修飾的基團或下一步的用途，對基片的表面進行相應的矽烷化、氨基化、醛基化等處理、或親和素等修飾。基片部分具體的修飾方法見實施例。修飾後的基片有兩種用途，一種是直接用作固相載體，也就是修飾在基片上的基團與引物修飾基團發生化學或生物反應後，將引物牢固地固定在基片上。另一種基片是用來鋪上一層聚丙烯醯胺凝膠或瓊脂糖凝膠等網狀多孔的固相支持物，其中引物能夠直接與該凝膠固相支持物中的生物化學基團或埋在該支持物中的微球表面的生物化學基團發生反應，牢固地將引物固定在凝膠固相支持物中或微球表面；將所得模板和其他沒有固定的引物加入到固相支持物中，再加入相應的生物酶及相應的反應緩衝液和核酸單體等，利用超支滾環擴增法進行擴增，形成單一的核酸分子克隆；最後將互補自由鏈去除。
其中，該技術方案中使用的微球可以是由金屬及金屬氧化物製成，如磁珠。在微球表面修飾一層化學基團或生物基團，表面修飾有基團的磁珠可直接從Dynal Biotech公司購買。另外，該技術方案中使用的微球也可以是由塑料、橡膠、尼龍製成的固體微粒，微粒表面修飾一層化學基團或生物基團，如美國的Lumirex公司生產的聚苯乙烯微球顆粒，該公司提供表面上化學基團修飾的產品。
該技術的特點之一是固相分子克隆的製備，即模板的引物上的化學基團能夠與固相載體上的化學基團產生化學反應或生物反應，使全部引物或部分引物牢固地固定在固相載體上。從而使滾環的產物能夠固定在固體的基片上。
該技術方案採用了固相超支滾環擴增反應，同一模板的擴增產物都集中在一個點附近有限的範圍內，因而沒有其他克隆產物的汙染。本技術是將一條引物或多條引物牢固地固定在固相載體上，通過調整環狀核酸模板濃度將單個模板隨機均勻地分散在固相載體的不同部位，並與固定在載體上的引物復性，在恆溫及給定適合條件下發生擴增反應。在反應過程中，由於其中的一條鏈固定在固相載體中，而且是恆溫擴增，雙鏈無法發生解離，所以擴增產物也就無法移動，因此也就聚集在擴增部位。由於擴增產物不能移動，也不會出現克隆之間的產物汙染。在普通的微陣列晶片中由於在一個陣列點上要固定大量的同一核酸序列的片段作為檢測探針，這些核酸片段的純度，以及在製備過程中的汙染將會直接影響的該陣列點的檢測質量。在美國埃菲公司用微電子光刻工藝製備的高密度的核酸微陣列晶片，由於核酸原位化學合成的產率較低，在晶片的每個陣列點上將會有較多的合成錯誤的核酸探針，這將在很大的程度上影響該晶片雜交的檢測準確性。
通過調整擴增時間可以調整克隆分子拷貝數的多少，以及點陣中每個克隆點的大小。因為超支滾環擴增是非常高效的恆溫擴增，在有引物及其它條件具備的情況下，該擴增就可以一直進行下去。對於該項技術，可以通過兩種方法來調整拷貝數的大小。首先是擴增時間，擴增時間越長，拷貝數就會越高，每個克隆的直徑也會越大。另一個控制克隆大小的方法就是通過改變固相載體的大小和結構的方式來控制分子克隆擴增的區域。例如，將引物固定在一個微小的區域內，當擴增進行到一定程度，因為缺少引物就無法進一步滾環擴增下去，使該克隆的大小無法進一步擴大。
該發明可以製備出高密度的單鏈分子克隆微陣列。由於超支滾環擴增的產物具有類似樹枝狀的特徵，通過控制擴增的過程容易控制其擴增範圍的大小。因此，每個擴增點的大小理論上可以減小到幾十到幾百個納米的範圍，這樣就大大提高了晶片單位面積上不同分子克隆的密度。而在現在的微陣列晶片上每個陣列點一般包含有數百至數百萬的核酸分子，目前每個陣列點的大小多在數微米和數百微米之間。例如，生物晶片的世界著名製造商美國埃菲公司用微電子光刻工藝製備的國際最高密度的核酸微陣列晶片，每個陣列點的直徑為5微米。用普通點樣法製備的微陣列晶片，其每個陣列點的直徑一般大於為50微米。用微噴頭製備的微陣列晶片，其每個陣列點的直徑一般大於為100微米。因此，本發明在原理上可以使核酸微陣列晶片可具有巨大的核酸微陣列的點陣密度，單位面積的核酸探針密度可以提高數萬倍。
該技術方案是一項恆溫高效而又簡單容易操作的克隆製備方法，非常適合高通量測序模板的製備。該項技術是基於超支滾環擴增發展起來的一項高通量克隆製備技術。超支滾環擴增是在恆溫條件下進行的，而且擴增效率極高，在相同時間內擴增產物量是PCR擴增產物的十幾倍甚至幾十倍，而PCR的擴增反應需要一個溫度循環過程，所以需要一個PCR儀這種特殊的裝置，而超支滾環擴增是在恆溫條件下進行，只要有一個恆溫的條件即可。由於PCR需要變性與復性反應過程，所以固相PCR擴增中容易擴散，造成克隆之間的汙染。而橋式PCR擴增條件要求非常苛刻，難以操作與控制。而本發明既發揚了固相PCR及橋式PCR的優點，又改進了其不足。因此，採用該項技術製備克隆時間短，方法簡單，成本低。
本技術方案提出的方法採用了超支滾環擴增技術，該方法對於不同的核酸片段具有較好的擴增平行性，這對於全基因組測序模板的製備是十分重要的。目前，測序的DNA分子克隆的模板製備都是採用PCR技術。眾所周知，PCR擴增技術對於不同序列的核酸模板其擴增效率有很大的偏差，這極大地影響被測序基因組的測序覆蓋率。而本發明採用的超支滾環擴增方法，對於不同的模板序列該方法已被證明沒有擴增的偏向性。
本技術方案中製備的分子克隆，能夠方便地製備出相應的單鏈分子克隆，可用於雜交、測序等應用。因為擴增產物的一條鏈是固定在固相載體上，另一條鏈則是與固定的一條鏈通過互補配對形成的雙鏈結構。另一條鏈可以通過變性電泳將其去除。通過變性電泳，未固定住的一條鏈則被去除，剩下一條單鏈，更加容易雜交與延伸檢測。目前，有些公司，如美國454公司，採用微球與乳液PCR相結合的方法進行克隆製備，由於這項技術需要把兩條引物都要進行固定，所以通過PCR反應後，微球上兩條鏈都被固定下來，這樣在延伸或雜交過程中難免會產生幹擾。
本技術方案採用的固相載體既可以是整塊基片，如膠膜、修飾了一些化學基團的玻片等，在整塊的基片表面上可以形成不同的結構，也可以是大量的微球等可分散固相載體。本發明可以採用鋪在基片上多孔網狀的整塊膠或者是修飾有一層化學基團的整塊基片作為反應載體。採用整塊膠或基片作為反應載體，製備出來的克隆隨機分布在整塊膠或基片上。該載體也可以是以點陣的形式分布在基片上，製備出來的克隆便可有規則的分布在陣列中的每個點上。同時我們也可以在微球體系中製備分子克隆。將不同的微球載體鋪展在基底表面形成高密度的微球陣列，再進行超支滾環擴增，在每個微球上形成單一克隆，製備成克隆微陣列。
本發明中被固定的引物的5』端修飾了活性化學基團(如醛基、氨基、丙烯醯胺基團等)；在固相載體中可進行雙引物、多引物或隨機引物等多種形式的滾環擴增，製備出核酸分子克隆。
本發明中用於克隆模板製備的核酸為DNA、RNA或其他人工核酸如PNA、LNA等。在一個反應體系中包含有若干陣列點或微球。在每個陣列點或微球中包含有不同的核酸模板。在一次反應中同時可以製備若干不同的核酸分子克隆。本發明中在固相載體中的非固定核酸產物，可以用電泳、加熱和流體衝洗等方法去除，以獲得單鏈的核酸分子克隆。
該分子克隆的製備技術具有製備簡單，擴增效率高、對於不同的DNA片斷的擴增平行性好等優點。特別是該分子克隆為固定化的，經過變性電泳後，可將被固定的一條鏈留下來，另一條互補鏈去除，形成單鏈分子克隆，以便進行下一步的雜交或延伸實驗。該技術可以在一個載體基片的不同位置製備不同的克隆，從而在一次擴增中可以製備極大量的分子克隆，實現高密度測序模板晶片的製備。這對於實現高通量、低成本人類全基因組的測序，提供了可行的模板製備技術。
四
圖1為整塊固相載體作為反應載體進行克隆製備滾環反應後的平面示意圖(A)與切面示意圖(B)，其中(1)隨機引物；(2)環形核酸模板；(3)正向引物；(5)滾環產物；(6)基片；(7)固相載體；(8)克隆。
圖2為以陣列作為反應載體製備克隆滾環反應後的平面示意圖(A)與切面示意圖(B)，其中(1)隨機引物；(2)環形核酸模板；(3)正向引物；(5)滾環產物；(6)基片；(7)固相載體；(8)克隆；(9)陣列。
圖3為實施例3反應前(A)與反應後(B)示意圖。其中(1)隨機引物；(2)環形核酸模板；(3)正向引物；(5)滾環產物；(6)基片；(7)固相載體；(8)克隆；(9)陣列；(10)單鏈滾環產物；(12)磁珠；(13)聚丙烯醯胺凝膠。
圖4為採用實施例1方案製備出來的核酸分子克隆掃描儀掃描結果圖。
圖5為採用實施例2方案製備出來的核酸分子克隆陣列掃描儀掃描結果圖。
圖6為採用實施例3方案製備出來的核酸分子克隆掃描儀掃描結果圖。
五具體實施例方式
實施例1.採用醛基化矽片製備核酸分子克隆該方法所採用的固相載體為醛基修飾後的矽片，也就是將需要固定的引物固定在醛基矽片上，然後在矽片上進行超支滾環擴地反應，進一步製備出核酸分子克隆。
單鏈環形基因組擴增模板的製備基因組DNA的超聲波處理選取功率適當的超聲波儀，將基因組DNA隨機打斷成200bp-600bp大小的基因片段。
基因組DNA片段的通用連接子連接將超聲波獲取的隨機片斷純化處理，去除一些小的和破碎的片斷，然後分別採用T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow大片段DNA聚合酶I以及Taq聚合酶處理，使隨機片段產生一個TA粘性末端，然後與一個通用連接子(linker15』-磷酸-GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGTCCAACT 3』linker25』-GTTGGACGTACGGCCGCCTTGGCCTCCGACT-3』)連接，形成一個雙鏈的環，在外切酶I和外切酶III的作用下，形成單鏈環2。
矽片的表面醛基化修飾(A)選擇大小合適的低螢光背景的矽片6，在80℃的piranha洗液(濃硫酸與30％的H2O2按體積比7∶3混合)超聲洗滌2小時，然後用洗滌劑徹底清洗；用去離子蒸餾水再次徹底清洗、烘乾備用；(B)矽烷化處理在上步洗滌乾淨的矽片置於含有2％APTES(3-Aminopro-pyltriethoxysilane)的丙酮溶液中浸泡5～10分鐘，用丙酮、乙醇、去離子蒸餾水徹底清洗各兩次，氮氣吹乾，180℃烘烤1～2小時。
(C)醛基化處理將矽烷化處理的矽片置於含5％的戊二醛(50％水溶液，Amresco)磷酸緩衝液(0.1M批H7.4)中浸泡2小時，用丙酮、乙醇、去離子蒸餾水徹底清洗各3次，氮氣吹乾，4℃保存備用。
(D)在矽片上固定親和素將醛基化處理的矽片置於含親和素蛋白質的溶液中浸泡，用去離子蒸餾水徹底清洗各3次，氮氣吹乾，4℃保存備用。
引物固定及單克隆測序模板的製備(A)引物固定針對上述模板設計一對引物，其中的一條與環形模板互補的引物5』端做生物素修飾3。將5』端做生物素修飾寡聚核苷酸引物用碳酸緩衝液(pH9.0)稀釋到終濃度為8pmol/μL，然後將引物溶液均勻地鋪於表面修飾有親和素的矽片6，7上。將矽片置於潮溼的密封盒中室溫過夜、37℃水浴2小時。然後用0.1％SDS充分清洗，去除未連接的寡聚核苷酸探針。最後用硼氫化鈉(NaBH4)溶液處理30分鐘後待用。
(B)在片超支滾環擴增將濃度為1pM的環形模板覆蓋在上述固定有引物的矽片上，95℃變性5分鐘，然後在水浴鍋內慢慢降到室溫。然後，無菌去離子雙蒸水衝洗2遍，去除未結合的模板環。配製超支滾環擴增溶液，其溶液包含濃度沒做修飾的反向引物(1μM)、Bst DNA大片段聚合酶(0.2單位/μL)、1×Bst DNA大片段聚合酶緩衝液、dNTP(800μM)，混勻後滴加到固定有模板環的矽片上，然後用矽烷處理過的蓋玻片蓋在溶液上，形成約5-20微米一薄層溶液。然後置於潮溼的雜交盒內，50℃條件下滾環20-24時。
(C)衝洗法去除互補自由鏈將固定了大量滾環擴增產物5的矽片取出後，置於0.1M的NaOH溶液中一分鐘，然後用去離子衝洗5遍後，氮氣吹乾後，4℃保存待用。
圖4為實施例1方案製備出來的核酸分子克隆，經過配對cy-3標記的探針雜交後，掃描儀掃描結果圖，該圖點的大小為實際結果放大十倍。其中一個點代表一個核酸分子克隆。
實施例2採用聚丙烯醯胺凝膠陣列製備核酸分子克隆聚丙烯醯胺凝膠是由丙烯醯胺和N，N』甲叉雙丙烯醯胺通過自由基引發聚合而成的大分子，無色透明，易觀察。凝膠中的網狀格子是帶有醯胺側鏈的碳-碳聚合物，沒有或很少帶有離子的側基，因而電滲作用比較小，不易和樣品相互作用。另外，由於聚丙烯醯胺凝膠是一種人工合成的物質，在聚合前可調節單體的濃度比，形成不同程度交鏈結構，其空隙度可在一個較廣的範圍內變化，而且又有比較好的機械性質。在一定濃度範圍聚丙烯醯胺對熱穩定。
該方法所採用的固相載體為聚丙烯醯胺凝膠。首先將玻片表面修飾一層丙烯醯胺基團，需要固定的引物5』端修飾一個丙烯醯胺基團，然後將修飾後的引物混合在丙烯醯胺溶液中，通過某種方法將凝膠溶液在修飾過的基片上形成點陣，經過丙烯醯胺凝集反應後，使凝膠牢固地固定在基片上，同時引物牢固地固定在凝膠中。然後進行超支滾環擴增，製備出核酸克隆。
單鏈環形基因組擴增模板的製備基因組DNA的超聲波處理選取功率適當的超聲波儀，將基因組DNA隨機打斷成200bp-600bp大小的基因片段。
基因組DNA片段的通用連接子連接將超聲波獲取的隨機片斷純化處理，去除一些小的和破碎的片斷，然後分別採用T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow大片段DNA聚合酶I以及Taq聚合酶處理，使隨機片段產生一個TA粘性末端，然後與一個通用連接子(linker15』-磷酸-GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGTCCAACT 3』linker25』-GTTGGACGTACGG CCGCCTTGGCCTCCGACT-3』)連接，形成一個雙鏈的環，在外切酶I和外切酶III的作用下，形成單鏈環。
基片的表面丙烯醯胺矽烷修飾基片清洗選擇大小合適的低螢光背景的全反射玻片，用洗衣粉清洗玻片的表面，然後用去離子水衝洗表面。將衝洗過的玻片置於盛有去離子水的燒杯，超聲清洗1-2小時。將超聲洗滌後的玻片放置在含有10％NaOH溶液的封閉的容器中浸泡30分鐘。最後用去離子蒸餾水再次徹底清洗、烘乾備用；矽烷化處理在上步洗滌乾淨的載玻片置於含有10％Alfa Aesar(3-methacryloxypropyltrimethoxysilane，γ-甲基丙烯醯氧基丙基三甲氧基矽烷)的丙酮溶液中浸泡1小時，用丙酮和去離子蒸餾水徹底清洗各兩次，氮氣吹乾，烘乾備用。
聚丙烯醯胺溶液製備高通量陣列及其單克隆測序模板的製備丙烯醯胺溶液製備高通量陣列及其在片超支滾環擴增配製丙烯醯胺溶液，該溶液包含丙烯醯胺(3％)、N，N』甲叉雙丙烯醯胺(0.15％)、過硫酸銨(1％)、模板環(1PM)、5』端標記丙烯醯胺基團的正相引物(1μM)、30％甘油，混勻後灌注通過疏水感光膠製出的高通量陣列微孔(直徑為25微米)，然後將玻片置於一溼度及TEMED濃度達到飽合的真空環境中，凝集2小時。將玻片取出後置於潮溼的雜交盒內，並將適量的滾環溶液(沒做修飾的反向引物(1μM)、Bst DNA大片段聚合酶(0.2單位/μL)、1×Bst DNA大片段聚合酶緩衝液、dNTP(800μM))加在陣列9上，蓋上蓋玻片，50℃條件下滾環20-24小時。
電泳法去除互補自由鏈將固定大量滾環擴增產物5的玻片取出後，用去離子水衝洗幾遍後，置於變性電泳液(0.5*TBE，42％尿素)中電泳15分鐘，取出後使用洗液(Tris·HCL 10mM，PH7.5；KCL 50mM，EDTA 2mM，0.01％Triton X-100)衝洗2次，然後用去離子水衝洗2-4次，氮氣吹乾後，4℃保存待用。
圖5為實施例2方案製備出來的核酸分子克隆陣列，經過配對cy-3標記的探針雜交後，掃描儀掃描結果圖，該圖點的直徑為50微米。其中一個點代表一個核酸分子克隆。
實施例3採用磁珠固定與聚丙烯醯胺凝膠包埋製備核酸分子克隆該方法所採用的固相載體為表面修飾有親合素基團的磁珠。首先將玻片表面修飾一層丙烯醯胺基團，需要固定的引物5』端修飾一個生物素基團。將修飾後的引物首先與磁珠反應，使引物牢固地固定在磁珠表面。然後將磁珠混合在丙烯醯胺溶液中，並均勻地鋪在丙烯醯胺修飾過的玻片上，凝固後進行超支滾環擴增，製備出核酸克隆。
單鏈環形基因組擴增模板的製備基因組DNA的超聲波處理選取功率適當的超聲波儀，將基因組DNA隨機打斷成200bp-600bp大小的基因片段。
基因組DNA片段的通用連接子連接將超聲波獲取的隨機片斷純化處理，去除一些小的和破碎的片斷，然後分別採用T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow大片段DNA聚合酶I以及Taq聚合酶處理，使隨機片段產生一個TA粘性末端，然後與一個通用連接子(linker15』-磷酸-GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGTCCAACT 3』linker25』-GTTGGACGTACGG CCGCCTTGGCCTCCGACT-3』)連接，形成一個雙鏈的環，在外切酶I和外切酶III的作用下，形成單鏈環。
基片的表面丙烯醯胺矽烷修飾基片清洗選擇大小合適的低螢光背景的全反射玻片，用洗衣粉清洗玻片的表面，然後用去離子水衝洗表面。將衝洗過的玻片置於盛有去離子水的燒杯，超聲清洗1-2小時。將超聲洗滌後的玻片放置在含有10％NaOH溶液的封閉的容器中浸泡30分鐘。最後用去離子蒸餾水再次徹底清洗、烘乾備用；矽烷化處理在上步洗滌乾淨的載玻片置於含有10％ Alfa Aesar(3-methacryloxypropyltrimethoxysilane，γ-甲基丙烯醯氧基丙基三甲氧基矽烷)的丙酮溶液中浸泡1小時，用丙酮和去離子蒸餾水徹底清洗各兩次，氮氣吹乾，烘乾備用。
磁珠固定引物與聚丙烯醯胺凝膠包埋磁珠以及超支滾環擴增正向引物固定在磁珠表面將引物3的5』端修飾一個生物素的活性基團，然後與直徑為50微米以下修飾了鏈黴親合素的磁珠12結合，其反應條件為磁珠(1pM)與生物素標記的引物(1μM)在結合緩衝液(見Dynal Biotech公司磁珠產品說明書)中常溫條件下作用4-6小時，並有規律地輕輕搖動。結合反應結束後，採用衝洗液(見Dynal Biotech公司磁珠產品說明書)衝洗3次，每次5分鐘。固定有引物磁珠與1PM的模板環混勻，在PCR儀中加熱到90℃，5分鐘後關掉PCR儀，使其慢慢降到室溫。然後離心去除未結合在磁珠上的模板環。
磁珠摻入丙烯醯胺溶液並鋪膠配製摻有磁珠的丙烯醯胺溶液，該溶液包含磁珠(1pM)、丙烯醯胺(6％)、N，N』甲叉雙丙烯醯胺(0.3％)、過硫酸銨(0.085％)、TEMED(0.085％)、沒做修飾的反向引物(1μM)、Bst DNA大片段聚合酶(0.2單位/μL)、1×Bst DNA大片段聚合酶緩衝液、dNTP(800μM)，其中，TEMED最後再加到溶液中，混勻後滴加到矽烷化處理的載玻片上，然後用排斥矽烷處理過的蓋玻片蓋在丙烯醯胺溶液上，形成約5-20微米一薄層溶液。然後將玻片置於一溼度達到飽合的真空環境中，凝集2小時，形成凝膠13。將玻片取出後置於潮溼的雜交盒內，50℃條件下滾環20-24小時。
電泳法去除互補自由鏈將滾環擴增後的玻片取出後，用去離子衝洗幾遍後，置於變性電泳液(0.5×TBE，42％尿素)中電泳15分鐘，取出後使用洗液(Tris·HCL 10mM，PH7.5；KCL 50mM，EDTA 2mM，0.01％Triton X-100)衝洗2次，然後用去離子水衝洗2～4次，氮氣吹乾後，4℃保存待用。
圖6為採用實施例3方案製備出來的核酸分子克隆，經過配對cy-3標記的探針雜交後，掃描儀掃描結果圖，該圖點的大小為實際結果放大40倍。其中一個點代表一個核酸分子克隆。
實施例4採用聚苯乙烯高分子微球固定與瓊脂糖凝膠包埋製備核酸分子克隆該方法所採用的固相載體為表面修飾有氨基基團的聚苯乙烯高分子微球。首先將玻片表面清洗乾淨，需要固定的引物5』端修飾一個醛基基團。將修飾後的引物首先與微球反應，使引物牢固地固定在微球表面。然後將微球混合在瓊脂糖溶液中，並均勻地鋪在乾淨的玻片上，凝固後進行超支滾環擴增，製備出核酸克隆。
單鏈環形基因組擴增模板的製備基因組DNA的超聲波處理選取功率適當的超聲波儀，將基因組DNA隨機打斷成200bp-600bp大小的基因片段。
基因組DNA片段的通用連接子連接將超聲波獲取的隨機片斷純化處理，去除一些小的和破碎的片斷，然後分別採用T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow大片段DNA聚合酶I以及Taq聚合酶處理，使隨機片段產生一個TA粘性末端，然後與一個通用連接子(linker15』-磷酸-GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGTACGTCCAACT 3』linker25』-GTTGGACGTACGG CCGCCTTGGCCTCCGACT-3』)連接，形成一個雙鏈的環，在外切酶I和外切酶III的作用下，形成單鏈環。
玻片清洗基片清洗選擇大小合適的玻片，用洗衣粉清洗玻片的表面，然後用去離子水衝洗表面。將衝洗過的玻片置於盛有去離子水的燒杯，超聲清洗1-2小時。將超聲洗滌後的玻片放置在含有去離子水中煮沸1小時。最後用去離子蒸餾水再次徹底清洗、烘乾備用。
瓊脂糖包裹聚微球鋪膠引物固定在塑料微球表面準備與環形通用連接子互補且5』端修飾有醛基基團的引物，以及準備表面修飾有氨基基團的微球(直徑為2.5微米)。適當條件下醛基基團與氨基基團發生縮水反應，並將引物牢固地固定在微球表面。離心衝洗去除未結合上去的引物。
環形模板與引物復性結合將一定量的1pM的環形模板與等量1μM的固定有引物的微球在75℃條件下變性10分鐘，然後加入與總量相等的2*雜交緩衝液，45℃條件下復性1小時，然後離心衝洗去除雜交液及未雜交上去的模板環。瓊脂糖包裹微球鋪膠將1pmol量載有引物與模板的微球溶解在4ml 1％的瓊脂糖溶液中，混勻後，將瓊脂糖均勻地鋪在上述處理好的玻片上，凝固後，4℃保存待用。
隨機引物1超支滾環擴增將玻片取出後置於潮溼的雜交盒內，並將適量的滾環溶液(沒做修飾的隨機引(每條引物濃度0.5μM)、Bst DNA大片段聚合酶(0.2單位/μL)、1×BstDNA大片段聚合酶緩衝液、dNTP(800μM))加在瓊脂糖凝膠上，蓋上蓋玻片，50℃條件下滾環20-24小時。
電泳法去除互補自由鏈將滾環擴增後的玻片取出後，用去離子水衝洗幾遍後，置於變性電泳液(0.5*TBE，42％尿素)中電泳15分鐘，取出後使用洗液(Tris·HCL 10mM，PH7.5；KCL 50mM，EDTA 2mM，0.01％ Triton X-100)衝洗2次，然後用去離子水衝洗2-4次，氮氣吹乾後，4℃保存待用。
權利要求
1.一種固相製備核酸分子克隆的方法，其特徵在於製備步驟為a.製備單鏈環形核酸模板；b.製備與上述模板相應的引物，其5』端核酸上修飾有化學基團丙烯醯胺基團、氨基、醛基或生物素；c.將步驟b所得的引物加入到有矽烷基、氨基、醛基或親和素的固相載體中，將引物經過化學反應，連接在固相載體上；d.將步驟a所得的模板、生物酶、核酸單體、以及擴增溶液加入到經步驟c處理完畢的固相載體中；e.利用超支滾環擴增法進行擴增，形成單一的核酸分子克隆；f.互補自由鏈的去除。
2.根據權利要求1所述的一種固相製備核酸分子克隆的方法，其特徵在於所述的固相載體為凝膠微粒中的瓊脂糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠。
3.根據權利要求1所述的一種固相製備核酸分子克隆的方法，其特徵在於所述的固相載體為無機微粒中的磁珠、金屬及金屬氧化物或高分子固體微粒中的塑料、橡膠、尼龍。。
4.根據權利要求1所述的一種固相製備核酸分子克隆的方法，其特徵在於所述的固相載體為需要進行矽烷化、氨基化或醛基化處理的矽片和玻片。
5.根據權利要求1所述的一種固相製備核酸分子克隆的方法，其特徵在於固相載體支持物為多聚丙烯醯胺或瓊脂糖凝膠，該支持物具有網狀多孔結構。
6.根據權利要求1所述的一種固相製備核酸分子克隆的方法，其特徵在於克隆模板為DNA、RNA或人工核酸PNA、LNA。
7.根據權利要求1所述的一種固相製備核酸分子克隆的方法，其特徵在於互補自由鏈，即固相載體中的非固定核酸產物，可以用電泳、加熱或流體衝洗方法去除。
8.根據權利要求1所述的一種固相製備核酸分子克隆的方法，其特徵在於固相載體中進行雙引物、多引物或隨機引物多種形式的滾環擴增，製備出核酸分子克隆。
9.根據權利要求5所述的一種固相製備核酸分子克隆的方法，其特徵在於所述固相載體支持物為陣列式，陣列中的每一個點可以製備出一個核酸分子克隆。
10.根據權利要求9所述的一種固相製備核酸分子克隆的方法，其特徵在於陣列中的每一個點包含有不同的核酸模板，在一次反應中同時可以製備不同的核酸分子克隆。
全文摘要
本發明提供了一種固相製備核酸分子克隆的方法，製備步驟為製備單鏈環形核酸模板；製備與上述模板相應的引物，其5』端核酸上修飾有化學基團丙烯醯胺基團、氨基、醛基或生物素；將所得的引物加入到固相載體中，將引物經過化學反應，連接在固相載體上；將所得的模板、生物酶、核酸單體、以及擴增溶液加入到經處理完畢的固相載體中；利用超支滾環擴增法進行擴增，形成單一的核酸分子克隆；互補自由鏈的去除。該技術具有製備簡單，擴增效率高、對於不同DNA片斷的擴增平行性好等優點。該技術可以在一個載體基片的不同位置製備不同的克隆，實現高密度測序模板晶片的製備。
文檔編號C12Q1/68GK1995369SQ200610098379
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月14日 優先權日2006年12月14日
發明者陸祖宏, 周東蕊 申請人:東南大學