一種籠養水貂自咬症的分子標記診斷方法
2023-12-01 11:52:06 2
專利名稱：一種籠養水貂自咬症的分子標記診斷方法
技術領域：
本發明屬動物基因工程及分子標記技術領域，具體涉及一種利用隨機擴增多態性 DNA標記技術，快速篩選出自咬水貂群體與健康水貂群體的差異基因，並利用測序擴增區段標記技術對其進行進一步驗證的方法。
背景技術：
水貂皮已成為國際裘皮貿易的三大支柱產品之一。其具有針毛挺直、靈活華麗、絨毛豐厚、保暖性強、皮板輕薄、柔韌結實等諸多優點，因而成為小毛細毛類毛皮中的當家品。 近年來水貂的養殖在北方地區特別是東北三省呈現積極的養殖態勢。而對於種貂的個體鑑定，除繁殖方面的指標外，更重要的是要強調毛絨品質。留選毛絨品質較好的水貂，這對改善和提高全群貂皮質量很有好處。正所謂種瓜得瓜，種豆得豆，因此要獲得高質量的水貂皮必須選擇優良的水貂為基礎。自咬症是危害籠養水貂的一種慢性疾病，由於自咬症的發生，導致了水貂皮張的損壞、等級下降，已成為水貂養殖業中的突出問題之一。我國1967-1970年已有水貂自咬症發病的報導。國內每年水貂自咬症的發病率約為5% 10%。全世界每年僅水貂皮的生產量約為5000萬張，由於自咬症導致的等級下降的皮張在200萬 300萬張，給養貂業帶來了嚴重的經濟損失。目前，人們對自咬症的致病原因還不夠清楚，國內外學者眾說不一。但有研究發現，發生自咬症的個體其後代自咬症的發病率較高，自咬症的發病率與遺傳有顯著的相關性。趙元楷等報導水貂自咬症與遺傳有直接的關係，純種繁育的後代有半數發生自咬症現象。有養殖戶反映，自咬症具有隔代遺傳傾向。然而，目前自咬水貂在未出現臨床症狀之前是無法診斷的，人們對自咬水貂個體的診斷都是通過臨床觀察才診斷出來的。這樣就耗費了大量的人力、物力和財力，因此急需一種有效、快速的診斷方法來鑑別自咬水貂個體。
發明內容
本發明的目的在於提供一種利用隨機擴增多態性標記快速診斷出籠養水貂的自咬個體，並利用結合測序擴增區段標記技術進一步驗證差異標記基因是否為自咬水貂所特有的基因，為快速剔除籠養水貂自咬症個體提供簡便易行的方法。本發明包括下列步驟1.提取籠養水貂個體基因組DNA、建立不同基因池和篩選隨機引物，具體包括1. 1用酚/氯仿法提取健康水貂和自咬水貂基因組DNA，所記錄的OD26tZOD28tl比值在1. 6 1. 8之間的DNA質量，可滿足實驗要求，根據記錄的OD26tl數值及稀釋倍數，換算出待測DNA的濃度，並作相應的稀釋，以50ng/ μ L分裝，作為工作液，並在4°C條件下保存；1. 2將健康個體和自咬個體的基因組工作液分別取出20 μ L，混合構成一個總基因池DNA，再將上述健康水貂和自咬水貂兩組不同的池DNA各取10 μ L分別混合，製成兩組不同的DNA池；
1. 3隨機選取上海生工生物工程公司合成的D系列和S系列隨機引物各100條， 用混合成的總基因池做模板，篩選出多態性豐富且條帶清晰的引物，再進行同一條件的3-5 次重複，進一步篩選主帶重複性好的引物。2.獲取健康水貂和自咬水貂兩組基因池中差異標記基因，具體包括2. 1用篩選出來多態性豐富且條帶清晰、主帶重複性好的引物分別對健康水貂和自咬水貂兩組池DNA進行PCR擴增，每個反應至少3次重複，並設立不含模板的陰性對照；2. 2從PCR儀上取出0. 2mL的PCR管，每管取5 μ LPCR產物，加3 μ L的Loading Buffer混勻後上樣，用2%的含有EB的瓊脂糖凝膠，在100V的電壓下電泳；為使試驗誤差減到最低程度，操作過程中採用同一批號試劑，一次性混合分裝，在同一臺PCR儀上運行， 並使用相同規格的電泳槽和統一的電壓，另外每次PCR反應體系的分裝加樣在實驗室同一位置進行；2. 3對出現明顯的差異標記序列，再進行2次重複擴增分析、確認。3.克隆差異標記基因片段和分析SCAR轉化，具體包括3. 1將最終確定的隨機擴增多態性差異標記片斷進行回收純化，將回收片斷連接到PMD-18T載體中，然後將連接液轉化到大腸桿菌(JM109)中進行克隆，克隆後的菌液或質粒送到生物公司進行測序；3. 2設計測序擴增區段標記特異引物根據測得的差異標記序列結果，分別在其兩端包括原隨機引物的10個bp在內，再延長8-12個bp，設計2-4對引物；3. 3利用SCAR標記技術，用設計的特異引物對健康水貂個體和自咬水貂個體分別進行特異性擴增，記錄擴增結果，驗證其是否為健康水貂和自咬水貂之間的差異標記。水貂作為一種特種經濟動物，其籠養狀態下常發生的自咬症目前尚無有效的治療辦法，自咬症的發生導致了水貂皮張的損壞、等級下降，已成為水貂養殖業中的突出問題之一，而養殖水貂的主要目的是獲得高質量的水貂皮，因此提高毛皮質量成了水貂飼養過程中最緊迫的因素。本發明用隨機擴增多態性DNA標記結合測序擴增區段標記技術方法篩選籠養水貂自咬群體，可在籠養水貂剛出生時即鑑別出健康與自咬個體，為自咬水貂的早期淘汰提供新方法。用本發明提供的籠養水貂自咬症的分子標記診斷方法鑑定水貂等毛皮動物是否健康時，可以在PCR產物中直接加入EB，然後在紫外燈下觀察有無螢光反應來判斷PCR擴增反應結果，同時可隨機抽取部分PCR擴增結果呈陽性的產物，進行電泳來檢驗快速判斷的正確性。因此，在實際生產中，可以用此簡化方法對水貂群體進行大規模鑑定，既快速簡便，又大幅度降低成本，本發明為初步建立籠養水貂自咬症基因診斷平臺、為快速清除自咬水貂群體、提高水貂的皮張等級數量奠定基礎，也為今後水貂的免疫育種、抗病育種和疾病預防提供指導依據。
具體實施例方式本發明包括下列步驟1.提取籠養水貂個體基因組DNA、建立不同基因池和篩選隨機引物，具體包括1. 1用酚/氯仿法提取健康水貂和自咬水貂基因組DNA，所記錄的0D26(1/0D28(1比值
4在1. 6 1. 8之間的DNA質量，可滿足實驗要求，根據記錄的OD26tl數值及稀釋倍數，換算出待測DNA的濃度，並作相應的稀釋，以50ng/ μ L分裝，作為工作液，並在4°C條件下保存；1. 2將健康個體和自咬個體的基因組工作液分別取出20 μ L，混合構成一個總基因池DNA ；再將上述健康水貂和自咬水貂兩組不同的池DNA各取10 μ L分別混合，製成兩組不同的DNA池；1. 3隨機選取上海生工生物工程公司合成的D系列和S系列隨機引物各100條， 用混合成的總基因池做模板，篩選出多態性豐富且條帶清晰的引物，再進行同一條件的3-5 次重複，進一步篩選主帶重複性好的引物。2.獲取健康水貂和自咬水貂兩組基因池中差異標記基因，具體包括2. 1用篩選出來多態性豐富且條帶清晰、主帶重複性好的引物分別對健康水貂和自咬水貂兩組池DNA進行PCR擴增，每個反應至少3次重複，並設立不含模板的陰性對照；2. 2從PCR儀上取出0. 2mL的PCR管，每管取5 μ LPCR產物，加3 μ L的Loading Buffer混勻後上樣，用2%的含有EB的瓊脂糖凝膠，在100V的電壓下電泳；操作過程中採用同一批號試劑，一次性混合分裝，在同一臺PCR儀上運行，並使用相同規格的電泳槽和統一的電壓，另外每次PCR反應體系的分裝加樣在實驗室同一位置進行；2. 3對出現明顯的差異標記序列，再進行2次重複擴增分析、確認。3.克隆差異標記基因片段和分析SCAR轉化，具體包括3. 1將最終確定的隨機擴增多態性差異標記片斷進行回收純化，將回收片斷連接到PMD-18T載體中，然後將連接液轉化到大腸桿菌(JM109)中進行克隆，克隆後的菌液或質粒送到生物公司進行測序；3. 2設計測序擴增區段標記特異引物根據測得的差異標記序列結果，分別在其兩端包括原隨機引物的10個bp在內，再延長8-12個bp，設計2-4對引物；3. 3利用SCAR標記技術，用設計的特異引物對健康水貂個體和自咬水貂個體分別進行特異性擴增，記錄擴增結果，驗證其是否為健康水貂和自咬水貂之間的差異標記。
權利要求
1.一種籠養水貂自咬症的分子標記診斷方法，其特徵在於包括下列步驟(1)提取籠養水貂個體基因組DNA、建立不同基因池和篩選隨機引物；(2)獲取健康水貂和自咬水貂兩組基因池中差異標記基因；(3)克隆差異標記基因片段和分析SCAR轉化。
2.按權利要求1所述的籠養水貂自咬症的分子標記診斷方法，其特徵在於步驟(1)中所述的提取籠養水貂個體基因組DNA、建立不同基因池和篩選隨機引物包括下列步驟.1. 1用酚/氯仿法提取健康水貂和自咬水貂基因組DNA，所記錄的OD26tZOD28tl比值在 1. 6 1. 8之間的DNA質量，可滿足實驗要求，根據記錄的OD26tl數值及稀釋倍數，換算出待測DNA的濃度，並作相應的稀釋，以50ng/ μ L分裝，作為工作液，並在4°C條件下保存；1. 2將健康個體和自咬個體的基因組工作液分別取出20 μ L，混合構成一個總基因池 DNA,再將上述健康水貂和自咬水貂兩組不同的池DNA各取10 μ L分別混合，製成兩組不同的DNA池；.1.3隨機選取上海生工生物工程公司合成的D系列和S系列隨機引物各100條，用混合成的總基因池做模板，篩選出多態性豐富且條帶清晰的引物，再進行同一條件的3-5次重複，進一步篩選主帶重複性好的引物。
3.按權利要求1所述的籠養水貂自咬症的分子標記診斷方法，其特徵在於步驟O)中所述的獲取健康水貂和自咬水貂兩組基因池中差異標記基因包括下列步驟.2.1用篩選出來多態性豐富且條帶清晰、主帶重複性好的引物分別對健康水貂和自咬水貂兩組池DNA進行PCR擴增，每個反應至少3次重複，並設立不含模板的陰性對照；.2. 2從PCR儀上取出0. 2mL的PCR管，每管取5 μ LPCR產物，加3 μ L的Loading Buffer 混勻後上樣，用2%的含有EB的瓊脂糖凝膠，在100V的電壓下電泳；操作過程中採用同一批號試劑，一次性混合分裝，在同一臺PCR儀上運行，並使用相同規格的電泳槽和統一的電壓，另外每次PCR反應體系的分裝加樣在實驗室同一位置進行；.2.3對出現明顯的差異標記序列，再進行2次重複擴增分析、確認。
4.按權利要求1所述的籠養水貂自咬症的分子標記診斷方法，其特徵在於步驟(3)中所述的克隆差異標記基因片段和分析SCAR轉化包括下列步驟.3.1將最終確定的隨機擴增多態性差異標記片斷進行回收純化，將回收片斷連接到 PMD-18T載體中，然後將連接液轉化到大腸桿菌(JM109)中進行克隆，克隆後的菌液或質粒送到生物公司進行測序；.3. 2設計測序擴增區段標記特異引物根據測得的差異標記序列結果，分別在其兩端包括原隨機引物的10個bp在內，再延長8-12個bp，設計2-4對引物；.3. 3利用SCAR標記技術，用設計的特異引物對健康水貂個體和自咬水貂個體分別進行特異性擴增，記錄擴增結果，驗證其是否為健康水貂和自咬水貂之間的差異標記。
全文摘要
一種籠養水貂自咬症的分子標記診斷方法屬動物基因工程及分子標記技術領域，本發明包括1.提取籠養水貂個體基因組DNA、建立不同基因池和篩選隨機引物；2.獲得健康水貂和自咬水貂兩組基因池中差異標記基因；3.克隆差異標記基因片段和分析SCAR轉化。本發明可對水貂群體進行大規模鑑定，既快速簡便，又大幅度降低成本，同時本發明可為初步建立籠養水貂自咬症基因診斷平臺、快速清除自咬水貂群體、提高水貂的皮張等級數量奠定基礎，也為今後水貂的免疫育種、抗病育種和疾病預防提供指導依據。
文檔編號C12Q1/68GK102154457SQ20111000068
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月5日 優先權日2011年1月5日
發明者唐鴻宇, 姚紀元, 孫博興, 張晶, 房恆通, 李玉梅, 王鵬, 閆守慶 申請人:吉林大學